TW202203966A - 用於防範ｃｏｖｉｄ－１９之以減毒的痘病毒載體為底質之疫苗 - Google Patents

用於防範ｃｏｖｉｄ－１９之以減毒的痘病毒載體為底質之疫苗 Download PDF

Info

Publication number
TW202203966A
TW202203966A TW110110868A TW110110868A TW202203966A TW 202203966 A TW202203966 A TW 202203966A TW 110110868 A TW110110868 A TW 110110868A TW 110110868 A TW110110868 A TW 110110868A TW 202203966 A TW202203966 A TW 202203966A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cov
sars
scv
polypeptide
composition
Prior art date
Application number
TW110110868A
Other languages
English (en)
Inventor
納塔莉 帕羅
保羅 豪利
塔瑪拉 庫柏
約翰 海巴爾
凱麗林 迪安納
劉亮
普利帝 艾迪
Original Assignee
澳大利亞商賽門蒂斯公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 澳大利亞商賽門蒂斯公司 filed Critical 澳大利亞商賽門蒂斯公司
Publication of TW202203966A publication Critical patent/TW202203966A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/24162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20071—Demonstrated in vivo effect
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明關於一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低冠狀病毒感染風險及降低疾病嚴重性之組成物。特別是，本發明關於用於提升動物的免疫反應以預防或降低由世界衛生組織命名為COVID-19之SARS-CoV-2疾病的風險之疫苗及/或免疫原性組成物。該組成物包含減毒的痘病毒，特別是痘瘡病毒，其中該減毒的痘病毒基因體包含冠狀病毒SARS-CoV-2核酸序列，該核酸序列編碼棘蛋白多肽及/或膜蛋白多肽及/或核鞘蛋白多肽及/或包膜蛋白多肽或彼等任一者之免疫原性或功能性部分。

Description

用於防範ＣＯＶＩＤ－１９之以減毒的痘病毒載體為底質之疫苗
本發明關於一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低冠狀病毒感染風險及降低疾病嚴重性之組成物。特別是，本發明關於用於提升動物的免疫反應以預防或降低由世界衛生組織命名為COVID-19之SARS-CoV-2疾病的風險之疫苗及/或免疫原性組成物。該組成物包含減毒的痘病毒，特別是痘瘡病毒，其中該減毒的痘病毒基因體包含冠狀病毒SARS-CoV-2核酸序列，該核酸序列編碼棘蛋白多肽及/或膜蛋白多肽及/或核鞘蛋白多肽及/或包膜蛋白多肽或彼等任一者之免疫原性或功能性部分。
本發明說明書中之參考文獻的詳細書目係列於本說明書最後。
在本說明書中所參照之任何先前發表文獻(或其衍生資訊)或任何已知事項並非且不應被視為確認或承認或以任何形式建議先前發表文獻(或其衍生資訊)或已知事項形成本說明書相關技術領域中之普通知識的一部分。
所有在本說明書提及之發表文獻全文以引用方式併入本文中。
痘病毒科包含二個亞科：脊索痘病毒亞科(Chordopoxvirinae )及昆蟲痘病毒亞科(Entomopoxvirinae )。脊索痘病毒亞科包含八個屬，包括正痘病毒屬(Orthopoxviridae )，其包含感染人類之種(例如天花病毒(天花之致病原)、牛痘病毒(形成1796年由Jenner報告之原始天花疫苗)、痘瘡病毒(用來作為第二代天花疫苗)及猴痘病毒)，也包括鳥類痘病毒屬(Avipoxviridae )病毒，其包含感染鳥類之種，諸如禽痘(fowlpox)及金絲雀痘病毒。除了彼等作為天花疫苗中之抗原的用途以外，更多關注在於使用以重組痘瘡病毒為底質之病毒及鳥類痘病毒作為「骨架」載體。作為細胞質內載體，正痘病毒屬尤其能夠誘導外來抗原在宿主細胞質中生產以被宿主免疫系統辨識。此類載體表現外來抗原在用於諸如AIDS、結核病、瘧疾及癌症之疾病的疫苗發展中受到廣泛研究，這些疾病經證實難以藉由其他免疫接種策略治療。
脊索痘病毒亞科具有線性雙股DNA基因體，該基因體大小自副痘病毒的130kb至鳥類痘病毒的超過300kb不等，且它們在宿主中的生命週期完全在宿主細胞細胞質中度過。痘病毒的操作大多不依賴它們的宿主細胞及宿主細胞分子，特別是涉及早期mRNA合成之過程。然而，宿主分子似乎用於起始或終止中期及晚期病毒轉錄。痘病毒生產結構多樣的「宿主範圍因子」，其特異性靶向及操作宿主傳訊途徑以允許讓病毒得以複製之細胞性條件。大部分痘病毒可結合及感染哺乳動物細胞，但後續感染是否為允許性(能夠生產感染性病毒粒子)或非允許性(實質上無法生產感染病毒粒子)則取決於涉及的特定痘病毒及特定細胞類型。有關宿主範圍基因的回顧文獻參照Werden et al. 2008(其全文併入本發明中)。
與彼等作為天花疫苗及後續作為病毒載體的用途相關之痘瘡病毒株已自1960年代早期被發表直到今天。某些痘瘡病毒株(包括經採用作為天花疫苗之毒株)能夠在人類細胞中增殖，且因此代表健康風險，諸如發展病毒性腦炎。為了發展更安全的疫苗，來自安卡拉(Ankara)之痘瘡病毒株(稱為「CVA」)在非人類細胞中繼代超過500次。在此過程期間，痘瘡基因體發生實質上變化，其涉及發展相較於原始CVA基因體至少六個主要刪除。經修飾之病毒因為在哺乳動物細胞中的複製缺陷而較不具致病性，但仍能夠導致保護性免疫反應。此減毒的痘瘡病毒稱為MVA(經修飾之痘瘡安卡拉)且亦藉由繼代編號分類，因為發現具有不同繼代編號之病毒在基因上及表型上獨特。然而，繼代編號515的MVA515被判定為基因穩定。在1990年代早期，觀察到MVA病毒株(諸如MVA572及其衍生物MVA F6)能夠在非允許性細胞(病毒無法在其中增殖)中表現高水準的痘瘡蛋白及異源性(重組)蛋白，使MVA得以發展作為受到關注異源性分子之載體，諸如該些編碼疫苗抗原或療法遞送者。MVA係最多研究之痘病毒疫苗載體系統，但已發展以類似方式發揮功能之其他痘病毒，諸如NYVAC、ALVAC及禽痘。
另一種由Sementis Ltd發展之痘瘡病毒係所謂的SCV(Sementis Copenhagen Vaccinia)痘瘡病毒載體。SCV已使用痘瘡之哥本哈根(Copenhagen)株產生且藉由刪除編碼必需病毒組成蛋白之D13L來工程改造，藉此使SCV無法複製及生產感染性後代。經SCV感染之細胞保留基因體擴增，因此允許疫苗抗原的晚期表現及產生抗插入抗原之強烈免疫反應。SCV相較於MVA具有一些優點，包括其具有複製勝任痘瘡之免疫原性且無法在測試之哺乳動物細胞中複製。SCV平台與MVA平台具有二個關鍵差異點，也就是(i)其經由靶向刪除D13L基因而具體工程改造為複製缺陷，因此更安全，同時維持單劑療效之效力及(ii)其亦經設計為在標準及可擴充商業細胞系中製造。
冠狀病毒係RNA病毒，其係由大約27至32千鹼基之正義單股RNA所組成。如名稱所指示，球形外部棘蛋白在電子顯微鏡下觀察時展示特徵皇冠形狀。病毒已知感染廣泛範圍之宿主，包括人類。經感染之宿主展現從無症狀到嚴重症狀不等的不同臨床病程。冠狀病毒屬於冠狀病毒科(Coronaviridae )，其分成四個屬：α、β、δ及γ冠狀病毒。CoV通常在許多動物物種中發現，包括蝙蝠、駱駝及人類。偶而，動物CoV可藉由在基因體複製期間的錯誤或重組機制獲得基因突變，此可進一步擴增彼等對人類的趨性。第一個人類CoV係在1960年中期發現。總共識別七種負責造成人類呼吸疾病的人類CoV類型，包括二種α CoV及五種β CoV。一般而言，這些CoV可造成從無症狀感染到嚴重急性呼吸疾病不等的各種臨床症狀，包括發燒、咳嗽及呼吸短促。亦報告其他症狀，諸如各種嚴重性的胃腸炎及神經性疾病。
冠狀病毒含有典型的四個主要結構蛋白組：棘(S)、膜(M)、包膜(E)蛋白及核鞘(N)蛋白。病毒粒子具有由基因體RNA及磷酸化核鞘(N)蛋白構成的核鞘。核鞘係埋在磷脂質雙層之內且被棘(S)蛋白包覆。膜(M)蛋白及包膜(E)蛋白係位於病毒包膜中的S蛋白之間。
棘蛋白係由突出病毒表面之跨膜三聚體糖蛋白構成，其決定冠狀病毒的多樣性及宿主趨性。棘包含二個功能性次單位；S1次單位，其含有受體結合域(RBD)且負責與宿主細胞受體結合；及S2次單位，其負責病毒及細胞膜的融合。
冠狀病毒粒子係由核鞘磷蛋白與病毒基因體RNA之交互作用所形成的螺旋核鞘結構組成，其周圍環繞其中有結構蛋白插入之脂質雙層。三跨膜糖蛋白M驅動冠狀病毒的組裝，其出芽至內質網-高基氏體中間隔室(ERGIC)的腔室中。膜蛋白係最豐富病毒蛋白，其分配要併入病毒粒子中之病毒組分。膜寡聚化允許在ERGIC膜處形成膜蛋白晶格。棘及包膜蛋白係經由與膜蛋白橫向交互作用而整合至晶格中，而核鞘及病毒RNA與暴露至胞質液之膜C端結構域交互作用。包膜蛋白係病毒孔蛋白，其形成離子通道且在病毒形態發生及出芽上扮演重要角色，然而此過程到目前為止尚未完全理解。SARS-CoV的研究顯示除盡冠狀病毒基因體之包膜基因強烈減少病毒生長及粒子形成。核鞘蛋白自我締合且包裹RNA基因體以併入病毒粒子內。
人類冠狀病毒係造成呼吸道感染的主要病原體之一。二種高度致病性病毒SARS-CoV及MERS-CoV在人類造成嚴重呼吸症候群，及四種其他人類冠狀病毒(HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoVHKU1)誘導輕微上呼吸道疾病。SARS-CoV在2002至03年造成涉及8422名患者的大爆發且擴散至全球29個國家。疫情在2003年七月當SARS-CoV在台灣的傳播鏈中斷後獲得控制，且自2004年五月之後就沒有人類病例的報告。MERS-CoV在2012年出現在中東國家，造成中東地區國家持續的地方性流行病，並散發擴散至中東地區以外的國家。在2019年末，第一起不明呼吸道感染的報告出現在中國武漢。感染來源係經快速識別為新型冠狀病毒，稱為SARS-CoV-2，且由此病毒造成的疾病被命名為COVID-19。世界衛生組織在2020年3月11日宣布為全球大流行。SARS-CoV-2具有從0.16%到1.60%不等的感染致死率，且到2021年二月中旬為止，SARS-CoV-2已在全球感染1億820萬人且造成230萬起死亡。SARS-CoV-2迫使世界大多採行封鎖政策，導致巨大經濟崩潰及人類苦難。
SARS-CoV-2係一種經包膜之非分段正義RNA病毒，其係包括於廣泛分布於人類及其他哺乳動物的正冠狀病毒亞科(Orthocoronavirinae )。作為沙貝病毒(sarbecovirus)屬的一部分，其直徑係約65至125 nm且含有單股RNA，在外表面上的棍棒形糖蛋白棘給予病毒皇冠樣或冠狀外觀。SARS-CoV-2係先前識別的導致肺衰竭及潛在致死性呼吸道感染之SARS-CoV及MERS-CoV之後的新型β冠狀病毒。WHO估計SARS-CoV-2的再生數(描述每個初次感染的人傳播至繼發性感染的人之能力)介於1.4至2.5之間不等。然而全球研究的整合分析估計再生數接近2.87。SARS-CoV-2的再生數比起先前的感染性冠狀病毒諸如SARS-CoV及MERS(分別為0.95及0.91)顯著較高。較高再生數的可能原因可為此病毒株之固有生物特徵。例如，人可藉由許多方式感染，諸如與感染者密切身體接觸、經由呼吸飛沫的環境傳播、傳染媒及空氣傳播。再者，SARS-CoV-2感染患者可能感染長達二週而不顯示症狀性特徵，此可使新感染的風險呈指數增加，因為感染者在無症狀期期間通常與其他人混居在社區中。來自九個患者的樣本之親源關係分析顯示SARS-CoV-2比起已知感染人類的冠狀病毒(包括造成2003年SARS爆發的病毒)更類似二種衍生自蝙蝠的冠狀病毒株。來自不同患者的序列幾乎為同一序列，具有大於99.9%的序列同一性，表明SARS-CoV-2在非常短的期間內源自單一來源。目前可得的資料表明SARS-CoV-2自蝙蝠貯槽感染人類族群且SARS-CoV-2可能藉由累積有利人類感染之基因變化而自蝙蝠冠狀病毒演變。顯示結構蛋白棘及膜具有廣泛突變變化，然而包膜及核鞘蛋白係保守的。仍不清楚是否有現行不明動物物種作為蝙蝠與人之間的中間宿主。
結構及功能分析顯示SARS-CoV-2之RBD與人類血管張力素轉換酶2(ACE2)受體強烈交互作用。ACE2表現在肺、心臟、迴腸、腎及膀胱最高。在肺，ACE2係高度表現於肺上皮細胞上。在SARS-CoV-2與ACE2受體結合之後，棘蛋白經歷蛋白酶切割。提議二步驟依序蛋白酶切割以活化SARS-CoV及MERS-CoV之棘蛋白作為模型，其係由用於預備之S1/S2切割位點切割及用於活化之S′2位點切割(相鄰於S2次單位內之融合肽的位置)所組成。在切割S1/S2切割位點之後，S1及S2次單位維持非共價結合且遠端S1次單位有助於膜錨定S2次單位在融合前狀態的穩定化。假定S′2位點的後續切割經由不可逆的構形變化活化棘以進行膜融合。在病毒中冠狀病毒棘係獨特的，因為各種不同的蛋白酶可切割及活化棘。在冠狀病毒中SARS-CoV-2所特有的特徵係在S1/S2位點處存在三呋喃基二氫咪唑切割位點(「RPPA」序列)。與不經切割即併入組成中的SARS-CoV棘相比，SARS-CoV-2的S1/S2位點在生物合成期間完全經受切割。雖然S1/S2位點亦經受其他蛋白酶諸如跨膜蛋白酶絲胺酸2(TMPRSS2)及組織蛋白酶L的切割，但三呋喃基二氫咪唑無所不在的表現亦可能有助於更有效地病毒複製導致增加毒性。在SARS-CoV-2中，病毒棘蛋白及特別是RBD係病毒演變的基因座。自2020年十月起，在歐洲、巴西、英國及南非偵測到識別為在RBD內之胺基酸變化的病毒演變。突變的累積導致每二週發生大約一個突變，如在UK、南非及巴西的新興變體所展現，其棘RBD分別具有8個突變、7個突變及10個突變以及刪除1ab開讀框(ORF)中的3個胺基酸。這些SARS-CoV-2變異株的特徵指示重複趨同演變成具有增強適應力的病毒物種。此現象的可能假設係這些突變自慢性COVID-19感染病例出現，在慢性COVID-19感染期間，免疫系統施加高度壓力給逃避免疫力的病毒且病毒藉由精進其浸潤細胞的機制來反應。因此翻譯成增加的病毒負荷量及較高傳播性，如UK突變株B.1.1.7所顯示。在未接觸過病毒(virus-naïve)族群中，天然免疫力選擇壓力係變體出現的主要驅動因子。然而，也有「疫苗選擇壓力」的可能性，其中突變可因疫苗相關原因造成。當疫苗誘發有限免疫反應時，諸如當疫苗係用於升高對抗僅單一抗原之免疫反應時，病毒可就抗原性方面演變。全體族群投予疫苗注射的時間延遲亦可潛在地影響病毒的適應性及誘導可幫助彼等逃脫或抵抗免疫反應之突變。逃避突變的現象強調疫苗需要有效作用以對抗新興受關切變體(VOC)。由於大部分有記錄的突變出現在棘蛋白，可採用其他病毒抗原誘導較廣泛寬度之免疫原性以確保適當預防性免疫反應。
中和抗體係結合且中和宿主細胞內之病毒的抗體，且作為預防性免疫接種的關鍵免疫力相關性。抗SARS及MERS棘糖蛋白之中和抗體扮演防範這些冠狀病毒之主要角色。到目前為止，在SARS-CoV-2感染之後，並不清楚需要多少量值的中和抗體才能達到保護或中和抗體的持久性為何。
亦可採用T細胞免疫力作為對抗SARS-CoV-2之保護的相關性。在感染的急性及記憶期皆有T細胞活化的報告，然而CD4及CD8 T細胞在疾病進展或保護中的確切角色仍待完全理解。抗原特異性CD8 T細胞直接靶向經病毒感染之細胞，而Th1極化CD4 T細胞具有活化CD8 T細胞及單核球以戰鬥組織中經病毒感染之細胞的潛力。此外，T濾泡性輔助細胞係生發中心反應及形成高品質體液性免疫反應所必需。與此一致的是，多個研究注意到結合抗體力價與CD4 T細胞反應之間的相關性。因此，T細胞可經由直接清除經感染之細胞及經由活化其他白血球及增強體液性免疫反應來具有保護功能。再者，與誘導強健的偏Th1反應一致的是，與Th2反應相關聯之疫苗相關增強呼吸疾病或抗體依賴性增強(ADE)不太可能發生。
本發明之疫苗係基於抗原之組合以產生較佳長期保護且防範抗體依賴性疾病增強的可能性。此係與僅包含棘抗原之經發展疫苗的主要區別。多種抗原的存在亦可處理逃避突變的現象，因為多種抗原可誘發較廣泛寬度的免疫反應，如此將使病毒較難以就抗原性方面演變且侵蝕身體防禦的有效性。
本發明之疫苗的抗原性序列包含SARS-CoV-2的棘蛋白、膜、核鞘及包膜蛋白。
免疫原性可藉由自痘病毒載體表現SARS-CoV-2棘多肽或棘多肽之S1受體結合域次單位達成。冠狀病毒的棘蛋白含有主要中和結構域，其係在病毒感染的急性期中和病毒所需且係刺激細胞媒介之免疫力所需。歷史上，冠狀病毒諸如SARS-CoV或MERS-CoV之棘蛋白被發現具有免疫原性，其誘發體液性免疫反應包括抑制病毒進入至宿主細胞中之中和抗體以及細胞媒介之免疫反應。
免疫原性可藉由自痘病毒載體表現SARS-CoV-2膜蛋白多肽達成。在SARS-CoV中，已顯示膜蛋白在病毒表面上豐富；再者，當用於免疫接種SARS患者時，膜蛋白誘導高力價的中和抗體。免疫原性及結構分析顯示能夠觸發強健細胞性免疫反應之T細胞表位叢聚存在於膜蛋白中。由於膜蛋白在許多病毒種中亦具高度保守性，因此其係用於誘導抗SARS-CoV-2之免疫反應的良好候選抗原。
免疫原性可藉由自痘病毒載體表現SARS-CoV-2核鞘蛋白多肽達成。近來發現SARS-CoV-2感染導致生產大多針對核鞘抗原之抗體。然而，N抗體被忽視因為N蛋白抗體無法阻斷病毒進入且因此被認為是「非中和」抗體。因此，抗N抗體無法藉由目前用於評估體液性免疫力之中和試驗測量。最近研究顯示進入細胞內之抗N抗體被抗體受體TRIM21辨識，其接著切碎相關N蛋白。接著展示N蛋白表位以被T細胞偵測。由於此免疫反應機制涉及最終將媒介免疫記憶之T細胞，因此抗核鞘蛋白之抗體可刺激防範未來感染之長期保護。
免疫原性可藉由在痘病毒載體內同時表現SARS-CoV-2棘蛋白或其部分、膜蛋白多肽、核鞘蛋白多肽及/或包膜蛋白多肽達成。在小鼠肝炎病毒、牛冠狀病毒、感染性支氣管炎病毒、傳染性胃腸炎病毒及SARS-CoV上的研究已建立棘、膜、核鞘及在一些情況下之包膜結構蛋白係經轉染之細胞有效組裝及釋放病毒樣粒子(VLP)所需。S、M及N及/或E多肽的存在可導致形成真實VLP，其為模擬冠狀病毒結構但缺乏具感染性遺傳物質之病毒空殼。VLP具有與真實病毒粒子類似的大小及形態特徵但不具感染性且無法複製。VLP不僅模擬天然病毒之形態學但亦可轉導允許性細胞。由於缺乏病毒遺傳物質，因此VLP在宿主細胞內不複製但可用來作為核酸、蛋白質或藥物之載劑。另外，曾探討使用VLP作為候選疫苗，因為它們的表面抗原重複暴露且它們的固有結構可仿真天然病毒且與免疫系統交互作用以誘導體液性及細胞性反應。這些蛋白質之組合免疫原性可引起更為強健的抗原特異性免疫反應。本發明涵蓋使用SARS-CoV-2棘蛋白或其部分及/或SARS-CoV-2膜及/或SARS-CoV-2核鞘蛋白或其部分及/或SARS-CoV-2包膜蛋白或其部分作為痘病毒載體疫苗中之抗原。
本發明涵蓋使用多種SARS-CoV-2蛋白以誘發廣泛範圍的免疫反應，包括體液性及細胞媒介之免疫力。在天然感染中，免疫系統以不同程度辨識構成SARS-CoV-2的所有蛋白質。藉由採用具有較低突變頻率之結構基因(諸如M、N及E)調配疫苗，所誘導之免疫反應的寬度可擴增以防範SARS-CoV-2之新興變體且減少逃避突變之機率。
在一實施態樣中，棘蛋白或其部分係用來作為單一痘病毒載體疫苗中之疫苗抗原。
在一實施態樣中，膜蛋白或其部分係用來作為單一痘病毒載體疫苗中之疫苗抗原。
在一實施態樣中，核鞘蛋白或其部分係用來作為單一痘病毒載體疫苗中之疫苗抗原。
在一實施態樣中，膜及核鞘蛋白或彼等之任一者的部分係用來作為單一痘病毒載體疫苗中之疫苗抗原。
在一實施態樣中，棘蛋白或其部分、膜蛋白或其部分及核鞘蛋白或其部分係用來作為單一痘病毒載體疫苗中之疫苗抗原。
在一實施態樣中，棘蛋白或其部分、膜及核鞘蛋白或彼等之任一者的部分及包膜蛋白或其部分係用來作為單一痘病毒載體疫苗中之疫苗抗原。
在一實施態樣中，棘蛋白或其部分及膜及核鞘蛋白或其部分係組合作為單一疫苗之混合物。
本發明人發現藉由採用減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，可獲得預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該減毒係藉由刪除至少一個編碼內源性必需組成或成熟蛋白之基因進行，且該痘病毒特別是痘瘡病毒經工程改造以使其基因體包含編碼SARS-CoV-2之棘蛋白多肽及/或膜蛋白多肽及/或核鞘蛋白多肽及/或包膜蛋白多肽或彼等之任一者的免疫原性或功能性部分之核酸序列。
因此，本發明之第一態樣提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼SARS-CoV-2之棘及/或膜及/或核鞘及/或包膜多肽或彼等之任一者的免疫原性或功能性部分之核酸序列，該核酸序列經取代至所選痘瘡病毒基因之開讀框中或經插入至基因間區中。
本發明之第二態樣提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分、在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
本發明之第三態樣提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在天然早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分、在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
本發明之第四態樣提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
本發明之第五態樣提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在天然早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
本發明之第六態樣提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
本發明之第七態樣提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽的S1受體結合域次單位之核酸序列。
本發明之第八態樣提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分、在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之包膜多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
本發明之第九態樣提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在天然早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分、在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分、在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之包膜多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
本發明之第十態樣提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽的S1受體結合域次單位及在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
本發明之第十一態樣提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽的S1受體結合域次單位及在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之包膜多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
本發明之第十二態樣提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
本發明之第十三態樣提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
本發明之第十四態樣提供一種誘導個體的保護性免疫反應以防範SARS-CoV-2病毒感染之方法，該方法包含向個體投予如上述任一者之組成物。
本發明之第十五態樣提供一種誘導個體的保護性免疫反應以防範SARS-CoV-2病毒感染之方法，該方法包含向個體投予本發明之第四及第六態樣之組成物。
本發明之第十六態樣提供一種誘導個體的保護性免疫反應以防範SARS-CoV-2病毒感染之方法，該方法包含向個體投予本發明之第五及第六態樣之組成物。
本發明之第十七態樣藉由模擬SARS-CoV-2病毒樣粒子提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物。
本發明之第十八態樣提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病及任何其他由基因類似SARS-CoV-2之冠狀病毒所造成之感染的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體包含編碼SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分及/或SARS-CoV-2之膜及核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分及/或SARS-CoV-2之包膜多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
本發明之第十九態樣提供本發明之第一至第十八態樣之組成物於製備用於誘導個體的中和抗體反應及/或保護性免疫反應以防範冠狀病毒感染之藥物的用途。
本發明亦包括：
一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2冠狀病毒疾病之風險之組成物，該組成物包含經基因工程改造之減毒的痘瘡病毒，其中該痘瘡病毒基因體包含核酸序列，該核酸序列編碼至少一種人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽，該至少一種人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽選自由棘蛋白多肽或其免疫原性部分、膜蛋白多肽或其免疫原性部分、核鞘蛋白多肽或其免疫原性部分及包膜蛋白多肽或其免疫原性部分所組成之群組，其中該減毒的痘瘡病毒包含刪除至少一個編碼內源性必需組成或成熟蛋白之基因。
如上之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒基因體包含編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2棘蛋白多肽或其免疫原性部分之核酸序列。
如上之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒基因體包含編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2膜蛋白多肽或其免疫原性部分之核酸序列。
如上之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒基因體包含編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2核鞘蛋白多肽或其免疫原性部分之核酸序列。
如上之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒基因體包含編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2膜蛋白多肽或其免疫原性部分及核鞘蛋白多肽或其免疫原性部分之核酸序列。
如上之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒基因體包含編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2之棘蛋白多肽或其免疫原性部分及膜蛋白多肽或其免疫原性部分及核鞘蛋白多肽或其免疫原性部分之核酸序列。
如上之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒基因體包含編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2棘多肽或其免疫原性部分及膜蛋白多肽或其免疫原性部分及核鞘蛋白多肽或其免疫原性部分及包膜蛋白多肽或其免疫原性部分之核酸序列。
如上之組成物，其中編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽之至少一種核酸序列係插入至一或多個免疫調節基因之經刪除之開讀框(ORF)中，該一或多個免疫調節基因選自包含COP-C23L、COP-B29R、COP-C3L、COP-N1L、COP-A35R、COP-A39R、COP-A41L、COP-A44R、COP-A46R、COP-B7R、COP-B8R、COP-B13R、COP-B16R及COP-B19R之群組。
如上之組成物，其中編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽之至少一種核酸序列係插入至該減毒的痘瘡病毒基因體之基因間區(IGR)中，其中該IGR係位於該痘瘡病毒基因體之二個相鄰ORF之間或與該二個相鄰ORF側接。
如上之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒基因體之該IGR係選自由下列所組成之群組：F9L-F10L、F12L-F13L、F17R-E1L、E1L-E2L、E8R-E9L、E9L-E10R、I1L-I2L、I2L-I3L、I5L-I6L、I6L-I7L、I7L-I8R、I8R-G1L、G1L-G3L、G3L-G2R、G2R-G4L、G4L-G5R、G5R-G5.5R、G5.5R-G6R、G6R-G7L、G7L-G8R、G8R-G9R、G9R-L1R、L1R-L2R、L2R-L3L、L3L-L4R、L4R-L5R、L5R-J1R、J3R-J4R、J4R-J5L、J5L-J6R、J6R-H1L、H1L-H2R、H2R-H3L、H3L-H4L、H4L-H5R、H5R-H6R、H6R-H7R、H7R-D1R、D1R-D2L、D2L-D3R、D3R-D4R、D4R-D5R、D5R-D6R、D6R-D7R、D9R-D10R、D10R-D11L、D11L-D12L、D12L-D13L、D13L-A1L、A1L-A2L、A2L-A2.5L、A2.5L-A3L、A3L-A4L、A4L-A5R、A5R-A6L、A6L-A7L、A7L-A8R、A8R-A9L、A9L-A10L、A10L-A11R、A11R-A12L、A12L-A13L、A13L-A14L、A14L-A14.5L、A14.5L-A15L、A15L-A16L、A16L-A17L、A17L-A18R、A18R-A19L、A19L-A21L、A21L-A20R、A20R-A22R、A22R-A23R、A23R-A24R、A28L-A29L及A29L-A30L及另外001L-002L、002L-003L、005R-006R、006L-007R、007R-008L、008L-009L、017L-018L、018L-019L、019L-02OL、020L-021L、023L-024L、024L-025L、025L-026L、028R-029L、03OL-031L、031L-032L、032L-033L、035L-036L、036L-037L、037L-038L、039L-040L、043L-044L、044L-045L、046L-047R、049L-050L、050L-051L、051L-052R、052R-053R、053R-054R、054R-055R、055R-056L、061L-062L、064L-065L、065L-066L、066L-067L、077L-078R、078R-079R、080R-081R、081R-082L、082L-083R、085R-086R、086R-087R、088R-089L、089L-090R、092R-093L、094L-095R、096R-097R、097R-098R、101R-102R、103R-104R、105L-106R、107R-108L、108L-109L、109L-110L、110L-111L、113L-114L、114L-115L、115L-116R、117L-118L、118L-119R、122R-123L、123L-124L、124L-125L、125L-126L、133R-134R、134R-135R、136L-137L、137L-138L、141L-142R、143L-144R、144R-145R、145R-146R、146R-147R、147R-148R、148R-149L、152R-153L、153L-154R、154R-155R、156R-157L、157L-158R、159R-160L、160L-161R、162R-163R、163R-164R、164R-165R、165R-166R、166R-167R、167R-168R、170R-171R、173R-174R、175R-176R、176R-177R、178R-179R、179R-180R、180R-181R、183R-184R、184R-185L、185L-186R、186R-187R、187R-188R、188R-189R、189R-190R、192R-193R，其中根據舊命名，ORF 006L對應C10L、019L對應C6L、020L對應N1L、021L對應N2L、023L對應K2L、028R對應K7R、029L對應F1L、037L對應F8L、045L對應F15L、050L對應E3L、052R對應E5R、054R對應E7R、055R對應E8R、056L對應E9L、062L對應I1L、064L對應I4L、065L對應I5L、081R對應L2R、082L對應L3L、086R對應J2R、087對應J3R、088R對應J4R、089L對應J5L、092R對應H2R、095R對應H5R、107R對應D10R、108L對應D11L、122R對應A11R、123L對應A12L、125L對應A14L、126L對應A15L、135R對應A24R、136L對應A25L、137L對應A26L、141L對應A30L、148R對應A37R、149L對應A38L、152R對應A40R、153L對應A41L、154R對應A42R、157L對應A44L、159R對應A46R、160L對應A47L、165R對應A56R、166R對應A57R、167R對應B1R、170R對應B3R、176R對應B8R、18OR對應B12R、184R對應B16R、185L對應B17L且187R對應B19R。
如上之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒包含刪除一或多個選自由痘瘡病毒A41L基因、痘瘡病毒D13L基因、痘瘡病毒B7R-B8R基因、痘瘡病毒A39R基因及痘瘡病毒C3L基因所組成之群組的基因。
如上之組成物，其中該至少一種編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽之核酸序列係插入至該一或多個基因之至少一個刪除位點中。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2棘蛋白多肽或其免疫原性部分係插入至痘瘡病毒A41L基因刪除位點中。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2膜蛋白多肽或其免疫原性部分及核鞘蛋白多肽或其免疫原性部分係插入至痘瘡病毒D13L基因刪除位點中。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2包膜蛋白多肽或其免疫原性部分係插入至痘瘡病毒B7R-B8R基因刪除位點中。
如上之組成物，其中編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽之至少一種核酸序列係插入至該減毒的痘瘡病毒基因體之基因間區(IGR)中，其中該IGR係位於該痘瘡病毒基因體之二個相鄰ORF之間或與該二個相鄰ORF側接。
如上之組成物，其中該人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽係由一或多個表現卡匣編碼，該一或多個表現卡匣具有選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8所組成之群組的核酸序列。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽係由具有如SEQ ID NO:1所示之核酸序列的表現卡匣及具有如SEQ ID NO:4所示之核酸序列的表現卡匣編碼。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽係由具有如SEQ ID NO:2所示之核酸序列的表現卡匣及具有如SEQ ID NO:4所示之核酸序列的表現卡匣編碼。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽係由具有如SEQ ID NO:1所示之核酸序列的表現卡匣編碼。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽係由具有如SEQ ID NO:2所示之核酸序列的表現卡匣編碼。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽係由具有如SEQ ID NO:5所示之核酸序列的表現卡匣編碼。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽係由具有如SEQ ID NO:3所示之核酸序列的表現卡匣編碼。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽係由具有如SEQ ID NO:4所示之核酸序列的表現卡匣編碼。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽係由具有如SEQ ID NO:1所示之核酸序列的表現卡匣及具有如SEQ ID NO:4所示之核酸序列的表現卡匣及具有如SEQ ID NO:8所示之核酸序列的表現卡匣編碼。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽係由具有如SEQ ID NO:2所示之核酸序列的表現卡匣及具有如SEQ ID NO:4所示之核酸序列的表現卡匣及具有如SEQ ID NO:8所示之核酸序列的表現卡匣編碼。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽係由具有如SEQ ID NO:3所示之核酸序列的表現卡匣及具有如SEQ ID NO:4所示之核酸序列的表現卡匣編碼。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽係由具有如SEQ ID NO:3所示之核酸序列的表現卡匣及具有如SEQ ID NO:4所示之核酸序列的表現卡匣及具有如SEQ ID NO:8所示之核酸序列的表現卡匣編碼。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽係由具有如SEQ ID NO:6所示之核酸序列的表現卡匣編碼。
如上之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽係由具有如SEQ ID NO:7所示之核酸序列的表現卡匣編碼。
如上之組成物，其包含醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。
如上之用於提升動物的免疫反應以降低冠狀病毒疾病之風險之組成物，該組成物包含經基因工程改造之減毒的痘瘡病毒摻合第二經基因工程改造之減毒的痘瘡病毒，其中該痘瘡病毒基因體包含核酸序列，該核酸序列編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2之棘蛋白多肽或其免疫原性部分，且其中該減毒的痘瘡病毒包含刪除至少一個編碼內源性必需組成或成熟蛋白之基因，其中該第二痘瘡病毒基因體包含核酸序列，該核酸序列編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2之膜蛋白多肽及核鞘蛋白多肽或彼等之免疫原性部分，且其中該第二減毒的痘瘡病毒包含刪除至少一個編碼內源性必需組成或成熟蛋白之基因。
如上之經基因工程改造之減毒的痘瘡病毒載體，其中該痘瘡病毒基因體包含核酸序列，該核酸序列編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2之棘蛋白多肽、膜蛋白多肽及核鞘蛋白多肽及/或包膜蛋白多肽，其中該減毒的痘瘡病毒載體表現該等前述多肽，該等前述多肽組裝成病毒樣粒子。
一種用於預防或降低SARS-CoV-2感染風險之方法，其包含向動物(包括人)投予有效誘發對抗SARS-CoV-2之免疫反應的量之包含減毒的痘瘡病毒之組成物，其中痘瘡病毒基因體包含核酸序列，該核酸序列編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2棘多肽或其免疫原性部分及膜蛋白多肽或其免疫原性部分及核鞘蛋白多肽或其免疫原性部分及可選地包膜蛋白多肽或其免疫原性部分。
如上之方法，其中對抗SARS-CoV-2抗原之免疫反應提供與基因類似SARS-CoV-2之冠狀病毒交叉反應之抗體。
如上任一者之組成物於製備用於誘導個體的保護性免疫反應以防範冠狀病毒感染之藥物的用途。
本發明不限於特定程序或藥劑、特定藥劑之調配物及各種醫學方法，因為這些可有所變化。本文所使用之用語僅係為了說明具體實施態樣，而無意加以限制。除非另行定義，此處所使用之所有技術及科學用語和本發明所屬技術領域中具有通常知識者所通常瞭解之意義相同。
任何材料及方法類似於或相當於該些在本文中描述者可用於實施或測試本發明。從業人員可具體參考：Sambrook et al.,(1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, N.Y.: Ausubel et al.(1999)Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47)John Wiley & Sons, New York；Murphy et al(1995)Virus Taxonomy Springer Verlag: 79-87, Mahy Brian WJ and Kangro O Hillar(Eds): Virology Methods Manual 1996, Academic Press；及Davison AJ and Eliott RM(Eds): Molecular Virology, A Practical Approach 1993, IRL Press at Oxford University Press；Perkus et al., Virology(1990)179(1): 276-86或所屬技術領域之定義及用語及所屬技術領域中具有通常知識者已知之其他方法。
雖然任何與本文描述之方法及材料類似或等效者均可用於實施或測試本發明，但描述較佳方法及材料。就本發明之目的而言，下列用語係定義如下。
在通篇說明書中，除非上下文另有需要，否則用語「包含(comprise/comprises/comprising)」將理解為表示包括所述步驟或元件或步驟或元件之群組，但不排除任何其他步驟或元件或步驟或元件之群組。因此，使用用語「包含」及類似物指示所列元件係必需或強制的，但其他元件係可選的且可存在或不存在。在減毒的正痘病毒載體之上下文中，主題載體係藉由包含刪除成熟或組成基因修飾以減毒，
然而進一步修飾諸如乘載抗原或其他蛋白亦涵蓋在內。
「由...組成(consisting of)」係指包括且限於接在用語「組成」前的任何事物。因此，用語「由...組成」指示所列元件係必需或強制的，且其他元件不可存在。「基本上由...組成(consisting essentially of)」係指包括接在該用語前的任何所列元件且限於不干擾或有助於所列元件在本揭露指明之活性或作用之其他元件。因此，用語「基本上由...組成(consisting essentially of)」指示所列元件係必需或強制的，但其他元件係可選的且取決於它們是否影響所列元件之作用活性而可存在或不存在。
此處所使用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數態樣，除非上下文另外清楚說明。因此，例如指涉「細胞(a cell)」包括單細胞以及二個或超過二個細胞；指涉「有機體(an organism)」包括一個有機體以及二個或超過二個有機體等等。在一些實施態樣中，「一」是指「一個或超過一個」。
如本文中所使用，「及/或(and/or)」係指且包含一或多個相關列示項目之任何及所有可能的組合，以及當解讀為替代性(或)時不包含組合。
如本文中所使用之「減毒(attenuation/ attenuated)」是指減少病毒載體毒性。毒性係定義為病毒在特定宿主中造成疾病的能力。無法生產感染性病毒之痘病毒載體起初可感染細胞但實質上無法在宿主內自行完全複製或增殖或造成病況。此係所欲因為載體遞送其蛋白質或核酸至宿主細胞細胞質中但不傷害個體。
「控制元件(control element)」或「控制序列(control sequence)」係指在特定痘病毒、載體、質體或細胞中表現可操作地連接之編碼序列所必需之核酸序列(例如DNA)。適用於真核細胞之控制序列包括轉錄控制序列諸如啟動子、多腺苷酸化信號、轉錄增強子、轉譯控制序列諸如轉譯增強子及內部核糖體結合位點(IRES)、調節mRNA穩定性之核酸序列以及將轉錄多核苷酸所編碼之產物靶向至細胞內的細胞內隔室或細胞外環境之靶向序列。
當提供序列時，亦涵蓋對應序列。所謂「對應(corresponds to/corresponding)」或「對應於 (corresponding to)」係指展示與參考核酸序列之實質序列同一性之核酸序列(例如與所有或一部分的參考核酸序列具有至少約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、96、98、99%或甚至高達100%序列同一性)或展示與參考胺基酸序列之實質序列類似性或同一性之胺基酸序列(例如與所有或一部分的參考胺基酸序列具有至少50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、96、98、99%或甚至高達100%序列類似性或同一性)。
所謂「有效量(effective amount)」，在治療或預防病況或用於調節對目標抗原或有機體之免疫反應的上下文中，係指向需要該治療或預防之個體投予單一劑量或作為一系列的一部分之一量的藥劑(例如本文所述之減毒的正痘病毒載體)或包含彼之組成物，該量用於預防招致該病況之症狀、控制該病況之症狀及/或治療該病況之既有症狀或用於調節對目標抗原或有機體之免疫反應係有效的。有效量將取決於欲治療之個體的健康和身體狀態、欲治療之個體的生物分類群組、組成物之調配、醫學情況的評估及其他相關因子而有所變化。預期該量將落入一個相當寬廣之範圍，該範圍可經由慣常之試驗加以決定。
如本文中所使用，用語「編碼(encode/ encoding)」及類似語係指核酸提供另一核酸或多肽的能力。例如，核酸序列若可經轉錄及/或轉譯以生產多肽或可經處理成可經轉錄及/或轉譯以生產多肽的形式，則該核酸序列被稱為「編碼」該多肽。該核酸序列可包括編碼序列或編碼序列及非編碼序列兩者。因此，用語「編碼」及類似語包括得自DNA分子轉錄之RNA產物、得自RNA分子轉譯之蛋白質、得自DNA分子轉錄以形成RNA產物及後續轉譯該RNA產物之蛋白質、或得自DNA分子轉錄以提供RNA產物、處理該RNA產物以提供經處理之RNA產物(例如mRNA)及後續轉譯該經處理之RNA產物之蛋白質。
用語「內源性(endogenous)」係指正常在宿主有機體中發現之基因或核酸序列或區段。
用語「可表現(expressible)」、「經表現(expressed)」及彼等之變化係指細胞將核苷酸序列轉錄成RNA及可選地轉譯mRNA以合成提供生物或生化功能之肽或多肽的能力。
如本文中所使用，用語「基因(gene)」包括能夠用於生產mRNA且可選地添加元件以協助此過程之核酸分子。基因能夠或不能夠用於生產功能性蛋白質。基因可包括編碼及非編碼區(例如內含子、調節元件、啟動子、增強子、終止序列及5’及3’非轉譯區)。
用語「異源性核酸序列(heterologous nucleic acid sequence)」、「異源性核苷酸序列(heterologous nucleotide sequence)」、「異源性多核苷酸(heterologous polynucleotide)」、「外來多核苷酸(foreign polynucleotide)」、「外源性多核苷酸(exogenous polynucleotide)」及類似語可互換使用以指任何藉由實驗操作導入至有機體之基因體中的核酸(例如包含IRES之核苷酸序列)且可包括在該有機體中發現的基因序列，只要經導入之基因相對於修飾前之病毒基因體序列含有一些修飾(例如點突變、刪除、取代或添加至少一個核苷酸、存在核酸內切酶切割位點、存在loxP位點等)。
用語「異源性多肽(heterologous polypeptide)」、「外來多肽(foreign polypeptide)」及「外源性多肽(exogenous polypeptide)」可互換使用以指由如上定義之「異源性核酸序列」、「異源性核苷酸序列」、「異源性多核苷酸」、「外來多核苷酸」及「外源性多核苷酸」編碼的任何肽或多肽。
在一實施態樣中，異源性DNA序列包含至少一個編碼序列。編碼序列係可操作地連接至轉錄控制元件。
在一實施態樣中，異源性DNA序列亦可包含連接至一或數個轉錄控制元件之二個或超過二個編碼序列。較佳地，編碼序列編碼一或多個蛋白質、多肽、肽、外來抗原或抗原性表位，特別是該些具有治療關注基因者。治療關注基因可衍生自或同源於造成疾病之病原體或感染性微生物之基因。治療關注基因係經呈現給有機體之免疫系統以影響(較佳地誘導)特異性免疫反應，藉以免疫或預防性保護該有機體以防範感染。
在一實施態樣中，異源性DNA序列係衍生自SARS-CoV-2且編碼棘蛋白及/或膜蛋白及/或核鞘蛋白及/或包膜蛋白或彼等之任一者的部分。
用語「保護性免疫反應(protective immune response)」是指預防或降低SARS-CoV-2感染之風險或降低冠狀病毒疾病之風險或嚴重性的免疫反應。
對抗SARS-CoV-2抗原之免疫反應可提供與基因類似SARS-CoV-2之冠狀病毒交叉反應之抗體。
用語「中和抗體反應(neutralizing antibody response)」是指誘發可中和病毒感染性之抗體的免疫反應。經由免疫接種產生中和抗體可為防範病毒感染所足夠且必需。中和抗體的存在係免疫接種後防範病毒感染之最佳保護的相關性。同樣地，彼等係免疫力的標記。
將理解在本發明中所考慮之誘導免疫反應包括誘發或刺激免疫反應及/或增強先前既有免疫反應。
在動物體內預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或冠狀病毒疾病的嚴重性之免疫反應可經由預防或減少SARS-CoV-2傳播媒介。
本發明之痘病毒載體較佳地在哺乳動物細胞中增殖。可用於本發明之哺乳動物細胞的細節係提供於PCT/AU2014/050330，其揭露藉由交互參照併入本發明中。
在一些實施態樣中，哺乳動物細胞係人類細胞、靈長動物細胞、倉鼠細胞或兔細胞。
細胞可為單細胞或可生長在組織培養中作為液體培養、單層或類似物。宿主細胞亦可直接或間接衍生自組織或可存在於有機體(包括動物)內。細胞可為已建立之細胞系，包括經修飾以表現泛素化之T細胞抗原之細胞系。
在一些實施態樣中，同源重組及/或病毒增殖在BC19A-12細胞系(一種衍生自表現D13L蛋白及牛痘宿主範圍蛋白(CP77)之GMP-CHO-S細胞系之SCV細胞基質)中進行。SCV疫苗平台在病毒基因體中併入靶向刪除D13L基因以預防病毒組成，藉此使SCV無法在正常允許性細胞系中產生感染性後代；然而，保留SCV基因體的擴增。CHO細胞係經工程改造以組成性表現D13及CP77，藉此允許病毒增殖。使用BC19A-12細胞系之病毒增殖方法的完整說明參照Eldi et al. 2017(其全文併入本發明中)。
在一些實施態樣中，同源重組及/或病毒增殖在SD07-1細胞系(一種組成性表現痘瘡病毒D13蛋白且可在無蛋白質或無血清培養基中生長之單株懸浮CHO細胞系)中進行。
如本文中所使用之用語「可操作地連接(operably connected/operably linked)」係指併接，其中所描述之組分的關係允許彼等以它們預期的方式發揮功能。例如，轉錄控制序列「可操作地連接」至編碼序列係指轉錄控制序列相對於編碼序列的位置及/或定向允許編碼序列在與轉錄控制序列相容的條件下表現。在另一實例中，IRES可操作地連接至正痘病毒編碼序列係指IRES相對於正痘病毒編碼序列的位置及/或定向允許正痘病毒編碼序列的帽蓋非依賴性轉譯。
如本文中所使用，用語「開讀框(open reading frame)」及「ORF」在本文中可互換使用以指在編碼序列之轉譯起始及終止密碼子之間編碼的胺基酸序列。用語「起始密碼子(initiation codon)」(例如ATG)及「終止密碼子(termination codon)」(例如TGA、TAA、TAG)係指在編碼序列中分別指明蛋白質合成(mRNA轉譯)的起始及鏈終止的三個相鄰核苷酸單位(「密碼子」)。
用語「多核苷酸(polynucleotide)」、「多核苷酸序列(polynucleotide sequence)」、「核苷酸序列(nucleotide sequence)」、「核酸(nucleic acid)」或「核酸序列(nucleic acid sequence)」在本文中用於指稱mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。該用語一般指稱至少10鹼基長度之核苷酸的聚合形式，不論是核糖核苷酸或去氧核苷酸或經修飾形式之任一類型的核苷酸。該用語包括單股及雙股形式之RNA或DNA。
「多肽(polypeptide)」、「肽(peptide)」、「蛋白質(protein)」及「蛋白質分子(proteinaceous molecule)」在本文中可互換使用以指包含胺基酸殘基之聚合物或由胺基酸殘基之聚合物組成之分子及彼之變體及合成的類似物。因此，該等用語適用於其中一或多個胺基酸殘基係合成的非天然存在胺基酸諸如對應天然存在胺基酸之化學類似物的胺基酸聚合物以及天然存在之胺基酸聚合物。
如本文中所使用，用語「重組(recombinant)」用於「核酸分子」、「多核苷酸」及類似語時應理解為意指可在宿主細胞或本文所述之不含細胞系統中轉錄及/或轉譯之人工核酸結構(即非複製cDNA或RNA；或複製子(自我複製cDNA或RNA))。重組核酸分子或多核苷酸可插入至載體中。可使用非病毒載體諸如質體表現載體或病毒載體。根據本發明之載體的種類及插入核酸建構體之技術係技藝人士已知。根據本發明之核酸分子或多核苷酸不以本發明所述之排列存在於天然中。換句話說，異源性核苷酸序列並非天然與親代病毒基因體之元件(例如啟動子、ORF、多腺苷酸化信號、核糖酶)組合。
如本文中所使用，用語「重組病毒 (recombinant virus)」將被理解為指涉包含至少一個異源性核酸序列之「親代病毒(parent virus)」。
如本文中所使用，用語「序列同一性(sequence identity)」係指在比較窗中核苷酸對核苷酸基礎或胺基酸對胺基酸基礎之情況下序列係同一的。因此，「序列同一性百分比(percentage of sequence identity)」的計算如下：在比較窗中比較二個最佳比對序列，判定兩個序列中存在同一核酸鹼基(例如A、T、C、G、I)或同一胺基酸殘基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys及Met)之位置的數量以產生匹配位置的數量，將該匹配位置的數量除以比較窗中位置的總數(即窗大小)，並將結果乘以100以產生序列同一性百分比。以本發明之目的而言，「序列同一性(sequence identity)」將被理解為意指由DNASIS電腦程式(版本2.5適用於windows；可得自Hiachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USA)使用軟體隨附之參考手冊中使用之標準預設所計算之「匹配百分比(match percentage)」。
用語「信號序列(signal sequence)」或「信號肽(signal peptide)」係指引導蛋白質自胞質液至某些胞器諸如例如核、粒線體基質及內質網之共轉譯或轉譯後運輸之短(長度大約3至約60個胺基酸)肽。具有靶向ER之信號肽之蛋白質而言，信號肽一般在蛋白質運送至ER之後藉由信號肽酶自前驅物形式切割，且所得蛋白質沿著分泌途徑移動至它們的細胞內(例如高基氏體、細胞膜或細胞壁)或細胞外位置。如本文中所使用之「靶向ER之信號肽(ER targeting signal peptide)」包括胺基端疏水性序列，其通常在部分或所有的蛋白質經由ER膜插入至ER之腔室中之後經酶催化性移除。因此，所屬技術領域中已知的是序列之信號前驅物形式可存在為蛋白質之前驅物形式的一部分，但通常不存在於蛋白質之成熟形式。
「類似性(similarity)」係指相同或如下表A定義之組成性保守取代之胺基酸的百分比數字。類似性可使用序列比較程式諸如GAP(Deveraux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12: 387-395)測定。在此方式中，與本發明引用之該些序列的長度類似或實質上不同之序列可藉由插入缺口至比對中來比較，該等缺口係例如藉由GAP所使用之比較演算法測定。
Figure 02_image001
用於比對比較窗之序列的最佳比對可藉由電腦執行演算法(Wisconsin遺傳學套裝軟體發行版本7.0中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA)或藉由目視檢查藉由各種選擇方法之任一者產生之最佳比對(即在比較窗中導致最高同源性百分比)進行。亦可參照BLAST程式家族例如Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389所揭示。序列分析之詳細討論可見Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15之Unit 19.3。
用語「個體(subject/individual)」、「患者(patient)」或「宿主(host)」在本文中可互換使用，係指欲治療或預防之任何個體，特別是脊椎動物個體及甚至更具體地哺乳動物個體。落入本發明之範圍內的合適脊椎動物包括但不限於脊索動物亞門之任何成員，包括靈長動物(例如人、猴及猿，且包括猴的物種諸如來自獼猴屬(Macaca )(例如食蟹獼猴諸如Macaca fascicularis 及/或恆河猴(Macaca mulatta ))及狒狒(Papio ursinus )以及絨猿(來自狨屬(Callithrix )之物種)、松鼠猴(來自松鼠猴屬(Saimiri )之物種)、雪貂(來自鼬屬(Mustela )之物種)及獠狨(來自獠狨屬(Saguinus )之物種)以及猿之物種諸如黑猩猩(Pan troglodytes ))、齧齒動物(例如小鼠、大鼠、天竺鼠)、兔類動物(例如兔、野兔)、牛(bovines)(例如牛(cattle))、綿羊(ovine)(例如綿羊(sheep))、山羊(caprine)(例如山羊(goat))、豬(porcine)(例如豬(pig))、馬(equine)(例如馬(horse))、犬(canine)(例如犬(dog))、貓(feline)(例如貓(cat))、禽類(例如雞、土雞、鴨、鵝、寵物鳥諸如金絲雀、虎皮鸚鵡等)、海洋哺乳動物(例如海豚、鯨魚)、爬蟲類(蛇、青蛙、蜥蜴等)及魚。較佳個體係需要治療或預防病況之人。然而，應理解前述用語不表示症狀存在。
在本發明中使用之用語「轉殖基因(transgene)」描述已經或要被人工導入至宿主有機體之基因體中且被傳遞至宿主後代之遺傳物質。在一些實施態樣中，其授予所欲性質至其所導入之哺乳動物細胞或正痘病毒載體中，或以其他方式導致所欲之治療或診斷結果。
如本文中所使用，用語「治療(treatment/ treating)」及類似語係指獲得所欲藥理學及/或生理學效應。該效應可為預防性，也就是完全或部分預防疾病或其症狀，及/或該效應可為治療性，也就是部分或完全治癒疾病及/或疾病帶來的不良影響。本文所使用之「治療」涵蓋對哺乳動物(特別是人)疾病之任何治療，且包括：(a)預防疾病在個體發生，該個體可為易發生該疾病但尚未被診斷為已有該疾病者；(b)抑制疾病，即停止疾病的發展；及(c)緩解疾病，即造成疾病消退。
關於有機體、多肽或核酸序列之用語「野生型(wild-type)」、「天然(natural/native)」及類似語係指該有機體、多肽或核酸序列係天然存在或可得於至少一個未經改變、突變或以其他方式人為操作之天然存在有機體中。
用語「病毒感染(viral infection)」是指病毒病原體感染個體的生物樣本。
用語「病毒樣粒子(virus-like particle)」或「VLP」係指就抗原性及形態方面模擬天然病毒之結構。
變體包括與參考分子或彼等之互補形式的所有或部分具有足夠類似性之核酸分子，以使選擇性雜交可在中或高嚴謹條件下達成，或其與定義參考痘病毒宿主範圍因子之核苷酸序列在包含至少約15個核苷酸之比較窗中具有約60%至90%或90%至98%序列同一性。較佳地雜交區的長度係約12至約18個或大於18個核鹼基。較佳地，特定核苷酸序列與參考序列之間的同一性百分比係至少約80%、或85%、或更佳的是約90%類似性或高於90%類似性，諸如約95%、96%、97%、98%、99%或高於99%。涵蓋介於80%與100%之間的同一性百分比。核苷酸序列的長度取決於其預期功能。涵蓋同源物。用語「同源物(homolog)」或「同源基因(homologous gene)」係泛指功能性及結構性相關分子，包括該些來自其他物種者。同源物及異種同源物(ortholog)係變體之實例。
核酸序列同一性可以下列方式測定。主題核酸序列係用於使用程式BLASTM版本2.1(基於Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Research 25:3389-3402)搜尋核酸序列資料庫，諸如GenBank資料庫(網站www.ncbi.nln.nih. gov/blast/)。程式係用於無缺口模式。預設過濾係用於移除因為低複雜性區域之序列同源性。使用BLASTM之預設參數。
胺基酸序列同一性可以下列方式測定。主題多肽序列係用於使用BLASTP程式搜尋多肽序列資料庫，諸如GenBank資料庫(網站www.ncbi.nln.nih.gov/blast/)。程式係用於無缺口模式。預設過濾係用於移除因為低複雜性區域之序列同源性。採用BLASTP之預設參數。可使用SEG程式過濾低複雜性序列。
較佳序列將在嚴謹條件下與參考序列或其互補序列雜交。用語「在嚴謹條件下雜交(hybridize under stringent conditions)」及其文法相等用語係指核酸分子在經定義之溫度及鹽濃度條件下與目標核酸分子(諸如固定在DNA或RNA墨點轉漬上之目標核酸分子，諸如南方墨點轉漬法或北方墨點轉漬法)雜交的能力。以大於約100個鹼基長度之核酸分子而言，典型嚴謹雜交條件係低於天然雙股之熔化溫度(Tm)不超過25℃至30℃(例如10℃)(通常見Sambrook et al.(同上)；Ausubel et al.,(1999))。大於約100個鹼基之核酸分子的Tm可藉由下式Tm=81.5+0.41%(G+C-log(Na+ ))計算。以小於100個鹼基長度之核酸分子而言，例示性嚴謹雜交條件係低於Tm 5℃至10℃。
在本發明中之用語「刪除(deletion)」係指移除目標基因之所有或部分的編碼區。用語亦涵蓋任何形式的突變或轉化，其廢除目標基因的基因表現或廢除或實質上下調經編碼之蛋白質的水準或活性。
指涉「基因」包括對應於基因之外顯子或開讀框的DNA。在本發明中指涉之「基因」亦包括：由轉錄及/或轉譯調節序列及/或編碼區及/或非轉譯序列(即內含子、5’-及3’-非轉譯序列)所組成之典型基因體基因；或對應於基因之編碼區(即外顯子)及5’-及3’-非轉譯序列之mRNA或cDNA。
「調節元件(regulatory element)」或「調節序列(regulatory sequence)」係指在特定宿主細胞中表現可操作地連接之編碼序列所必需之核酸序列(例如DNA)。適用於原核細胞之調節序列例如包括啟動子及可選地順式作用序列諸如操作子序列及核糖體結合位點。適用於真核細胞之控制序列包括啟動子、多腺苷酸化信號、轉錄增強子、轉譯增強子、調節mRNA穩定性之前導或尾隨序列以及將轉錄多核苷酸所編碼之產物靶向至細胞內的細胞內隔室或細胞外環境之靶向序列。
適用於致效本發明之經修飾之哺乳動物細胞的嵌合建構體包含編碼正痘病毒宿主範圍因子之核酸序列，其係可操作地連接至調節序列。調節序列合適地包含轉錄及/或轉譯控制序列，其將相容於在細胞中表現。一般而言，轉錄及轉譯調節控制序列包括但不限於啟動子序列、5’非編碼區、順式調節區諸如轉錄調節蛋白或轉譯調節蛋白之功能性結合位點、上游開讀框、核糖體結合序列、轉錄起始位點、轉譯起始位點及/或編碼前導序列、終止密碼子、轉譯終止位點及3’非轉譯區之核苷酸序列。考慮所屬技術領域中已知之組成性或誘導性啟動子。啟動子可為天然存在啟動子或組合元件或超過一個啟動子之雜交啟動子。
所考慮之啟動子序列可為對哺乳動物細胞為天然者或可衍生自替代來源，其中該區域在所選有機體中具功能性。啟動子的選擇將取決於預期宿主細胞而異。例如，可用於在哺乳動物細胞中表現之啟動子包括可回應於重金屬諸如鎘而誘導之金屬硫蛋白啟動子、β-肌動蛋白啟動子以及病毒啟動子諸如SV40大T抗原啟動子、人巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)啟動子、勞斯肉瘤病毒LTR啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、單純疱疹病毒啟動子及HPV啟動子特別是HPV上游調節區(URR)等其它者。所有這些啟動子在所屬技術領域中經詳細描述且可輕易取得。
有一些痘病毒啟動子類型係藉由彼等在病毒複製週期中活躍的時間期間區別。雖然早期啟動子亦可在感染晚期活躍，但晚期啟動子的活性侷限於晚期。第三種稱為中期啟動子的啟動子類型在早期轉變至晚期時活躍，且依賴病毒DNA複製。通常採用在痘病毒複製週期的早期及晚期皆活躍之啟動子以引導新抗原在痘病毒載體中之表現。緻密、合成的啟動子(prPs)已被廣泛使用以引導強烈的早期以及晚期基因表現。pr7.5啟動子係用於痘瘡病毒載體之重組基因表現的另一天然早期-晚期啟動子實例。
如本文中所使用，用語「早期/晚期啟動子(early/late promoter)」係指在病毒DNA複製發生之前及之後的病毒感染細胞中皆活躍之啟動子。特別較佳的是痘病毒早期/晚期啟動子，其包含合成的痘瘡早期/晚期啟動子(Ps)、天然痘瘡早期/晚期啟動子(p7.5)及禽痘早期/晚期啟動子(pE/L)。如本文中所使用之啟動子係痘瘡病毒啟動子，除非另外指明。
本發明亦可使用增強子元件以增加哺乳動物建構體的表現水準。實例包括SV40早期基因增強子(如例如Dijkema et al.(1985)EMBO J. 4:761所述)、衍生自勞斯肉瘤病毒長末端重複(LTR)之增強子/啟動子(如例如Gorman et al.,(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777所述)及衍生自人CMV之元件(如例如Boshart et al.(1985)Cell 41:521所述)諸如包括於CMV內含子A序列中之元件。
嵌合建構體亦可包含3’非轉譯序列。3’非轉譯序列係指包含含有多腺苷酸化信號及任何其他能夠致效mRNA處理或基因表現之調節信號的DNA區段之基因部分。多腺苷酸化信號之特徵為致效多腺苷酸段添加至mRNA前驅物之3’端。多腺苷酸化信號通常由存在典型形式5’ AATAAA-3’之同源性辨識，雖然變異不是不常見。3’非轉譯調節DNA序列較佳地包括約50至1,000 nts且除了多腺苷酸化信號及任何其他能夠致效mRNA處理或基因表現之調節信號以外可含有轉錄及轉譯終止序列。
在一些實施態樣中，嵌合建構體進一步含有可選擇標記基因以允許選擇含有建構體之細胞。選擇基因係所屬技術領域中廣知的且將相容於在受到關注細胞中表現。
在一實施態樣中，痘病毒結構或組成基因的表現係在啟動子之控制下。在一非限制性實施態樣中，啟動子係細胞性組成性啟動子，諸如人EF1 α(人伸長因子1α基因啟動子)、DHFR(二氫葉酸還原酶基因啟動子)或PGK(磷酸甘油酯激酶基因啟動子)，彼等引導足夠水準之CP77的表現以在對宿主細胞之顯著毒性效應不存在下維持病毒增殖。啟動子亦可為誘導性，諸如細胞性誘導性啟動子、MTH(來自金屬硫蛋白基因)病毒啟動子亦採用於哺乳動物細胞中，諸如CMV、RSV、SV-40及MoU3。
本發明提供一種用於預防性疫苗之組成物，該疫苗防範命名為嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒-2(SARS-CoV-2)之新型冠狀病毒，其係稱為冠狀病毒疾病19(COVID-19)之疾病的致病原。COVID-19被世界衛生組織(WHO)宣布為全球大流行且已影響全世界大量人口。SARS-CoV-2係正義單股RNA病毒。SARS-CoV-2基因體係約29,700個核苷酸長且與SARS-CoV具有79.5%序列類似性；其具有編碼15或16個非結構蛋白之5’端長ORF1ab多聚蛋白，而3’端基因體編碼四個主要結構蛋白(棘、核鞘、膜及包膜)。SARS-CoV-2與宿主細胞上表現之血管張力素受體轉換酶2(ACE2)結合以供病毒進入及最終致病機轉。SARS-CoV-2病毒主要影響呼吸系統，症狀包括發燒、乾咳、呼吸困難、頭痛、暈眩、全身無力、嘔吐及腹瀉。目前醫學處理大多係支持性，並無標靶療法可用。
RNA病毒(包括SARS-CoV-2)經由突變變化的固有趨勢在全球皆有記載且隨時間發生新的變體。雖然大部分新興突變對擴散不具有顯著影響，但授予選擇性優點給病毒之突變通常被保留，反映出來的是族群中變體的盛行率增加。在許多有記錄的SARS-CoV-2變體中，少數幾個具有公共衛生疑慮，因為它們的傳播性增加、造成較嚴重疾病的能力及/或在感染或免疫接種之後發展之躲避免疫反應的能力增加。在2021年，出現三種反映受關切變體(VOC)之特定病毒譜系：B.1.1.7、B.1.351及B.1.1.28.1。稱為D614G之突變係這三種受關切變體所共有。相較於其他主要病毒及無此突變的其他SARS-CoV-2株，其授予病毒增加的傳播性。
如本文中所使用，受關切變體係指B.1.1.17、B.1.351及B.1.1.28.1(特別是P.1譜系)。B.1.1.7變體起初在2020年9月在英國南部識別。此變體在棘蛋白之RBD的位置501具有突變，其中胺基酸天冬醯胺酸(N)經置換成酪胺酸(Y)，因此該突變稱為N501Y。B.1.1.7變體係與更有效且快速傳播相關聯，且相較於其他變體增加死亡風險。B1.1.351變體起初在2020年10月在南非識別。此變體在棘蛋白具有多個突變，包括K417N、E484K及N501Y。突變體E484K顯示影響多株及單株抗體之中和作用。B.1.1.28 變體特別是P.1支譜系起初在2021年1月在抵達日本的來自巴西之旅客身上識別。P.1譜系在棘蛋白RBD含有三個突變，包括K417T、E484K及N501Y。突變增加SARS-CoV-2的傳播性及抗原性特性。
如本文中所使用，SARS-CoV-2之棘蛋白之S1次單位在受體結合域區域內含有免疫優勢T細胞表位YNYLYRLF(SEQ ID NO:9)、VVLSFELL(SEQ ID NO:10)及VNFNFNGL(SEQ ID NO:11)。VVLSFELL(SEQ ID NO:10)及VNFNFNGL(SEQ ID NO:11)表位先前亦在SARS-CoV的小鼠研究中識別。所屬技術領域中具有通常知識者將理解這些表位在SARS-CoV與SARS-CoV-2之間保守可指示用於升高對SARS-CoV-2免疫反應之疫苗可與SARS-CoV交叉反應。
人冠狀病毒SARS-CoV-2株/單離株之基因序列可經由全球共享流感數據倡議組織(Global Initiative on Sharing All Influenza Data, GISAID)取得，且包括來自SARS-CoV-2之各種株/單離株的基因體序列資料，包括例如Wuhan/IVDC-HB-01/2019(GISAID編號：EPI_ISL_ 402119~121)。SARS-CoV-2之基因體序列對於設計及評估潛在介入選項(諸如COVID19疫苗)至關重要。
本發明提供一種包含用於表現異源性冠狀病毒抗原之減毒的痘病毒之組成物，該組成物可用來作為用於誘導防範冠狀病毒感染之免疫反應及/或中和抗體反應的疫苗。如本文中所使用之用語「減毒」是指減少病毒載體毒性。毒性一般而言係定義為病毒在特定宿主中造成疾病的能力。例如，無法生產感染性病毒之痘病毒起初可感染細胞但實質上無法在宿主或宿主細胞內自行完全複製或增殖或造成疾病或病況。此係所欲，因為痘病毒載體可遞送核酸至宿主或宿主細胞，但一般而言不傷害宿主或宿主細胞。
痘病毒科包含二個亞科：脊索痘病毒亞科及昆蟲痘病毒亞科。脊索痘病毒亞科包含八個屬，包括正痘病毒屬，其包含感染人類之種，而昆蟲痘病毒亞科感染昆蟲。正痘病毒屬包括例如天花病毒(其係天花之致病原)、牛痘病毒(其形成1796年由Jenner報告之原始天花疫苗)及痘瘡病毒(其用來作為第二代天花疫苗)。鳥類痘病毒屬病毒包含感染鳥類的種，諸如禽痘及金絲雀痘病毒。除了彼等作為天花疫苗中之抗原的用途以外，更多關注在於使用以重組痘瘡病毒為底質之病毒及鳥類痘病毒作為載體以用於遞送及/或表現受到關注之異源性基因。作為細胞質內載體，正痘病毒屬能夠遞送外來抗原至宿主細胞質及抗原處理途徑，該抗原處理途徑將抗原處理成肽以呈現在細胞表面上。此類表現外來抗原之載體適用於基因療法及發展用於廣泛範圍之病況及疾病之疫苗。
痘病毒構成一大家族的病毒，其特徵在於大型線性dsDNA基因體、細胞質增殖部位及複合病毒粒子形態學。痘瘡病毒係此病毒群組的代表性病毒且就病毒形態發生方面係最廣為研究者之一。痘瘡病毒的不同外觀狀似「磚塊形」或「卵形」膜結合粒子，其具有複雜的內部結構，該內部結構的特徵為與「側體」側接之帶壁雙凹核心。病毒粒子組成途徑涉及製造含有膜之新月體，該新月體發展成不成熟病毒粒子(IV)，接著演變成成熟病毒粒子(MV)。痘瘡病毒的病毒粒子內含有超過70種特定基因產物，其中在超過50種特定基因的突變對痘瘡病毒組成的效應現已描述。
合適的減毒的痘病毒將為所屬技術領域中具有通常知識者所知。例示實例包括減毒的經修飾之痘瘡安卡拉(MVA)、NYVAC、鳥類痘、金絲雀痘及禽痘。
在本發明揭示之一實施態樣中，減毒的痘病毒係減毒的痘瘡病毒。痘瘡病毒株之例示實例包括MVA、NYVAC、哥本哈根(COP)、Western Reserve(WR)、NYCBH、Wyeth株、ACAM2000、LC16m8及Connaught Laboratories(CL)。
如本文中所使用，用語「Sementis哥本哈根載體」或「SCV」係指以痘瘡病毒為底質之增殖缺陷疫苗載體技術平台，其允許在經修飾之CHO細胞中製造。
所屬技術領域中具有通常知識者將理解其他正痘病毒株可經修飾以生產減毒的痘病毒。在例示實例中，減毒的痘病毒可藉由修飾(例如刪除、取代或以其他方式破壞功能)來自痘病毒基因體之編碼內源性必需組成或成熟蛋白之基因生產。因此，在本發明揭示之一實施態樣中，減毒的痘病毒係經修飾之正痘病毒，其中該修飾包含刪除編碼內源性必需組成或成熟蛋白之基因。
在一實施態樣中，減毒的痘病毒係經修飾之痘瘡病毒，其中該修飾包含刪除痘瘡病毒基因體之基因(或以其他方式破壞其功能)，該基因編碼內源性組成或成熟蛋白，且其中該修飾將在宿主細胞(例如人類細胞)中增殖(或可增殖)之痘瘡載體轉化成在宿主細胞中實質上不複製之減毒的痘瘡載體。
在一實施態樣中，必需內源性組成或成熟基因係選自包含下列之群組：COP-A2.5L、COP-A3L、COP-A4L、COP-A7L、COP-A8R、COP-A9L、COP-A10L、COP-A11R、COP-A12L、COP-A13L、COP-A14L、COP-A14.5L、COP-A15L、COP-A16L、COP-A17L、COP-A21L、COP-A22R、COP-A26L、COP-A27L、COP-A28L、COP-A30L、COP-A32L、COP-D2L、COP-D3R、COP-D6R、COP-D8L、COP-D13L、COP-D14L、COP-E8R、COP-E10R、COP-E11L、COP-F10L、COP-F17R、COP-G1L、COP-G3L、COP-G4L、COP-G5R、COP-G7L、COP-H1L、COP-H2R、COP-H3L、COP-H4L、COP-H5R、COP-H6R、COP-I1L、COP-I2L、COP-I6L、COP-I7L、COP-I8R、COP-J1R、COP-J4R、COP-J6R、COP-L1R、COP-L3L、COP-L4R及COP-L5R。
所屬技術領域中具有通常知識者將理解其他正痘病毒株可經修飾以改變痘病毒之免疫原性。在例示實例中，具有增強免疫原性之痘病毒可藉由刪除編碼免疫調節蛋白之痘病毒基因體之基因生產。因此，在本發明揭示之一實施態樣中，減毒的痘病毒係經修飾之正痘病毒，其中該修飾包含刪除一或多個編碼免疫調節蛋白之基因。
在一實施態樣中，免疫調節基因包括該些選自包含下列之群組者：COP-C23L、COP-B29R、COP-C3L、COP-N1L、COP-A35R、COP-A39R、COP-A41L、COP-A44R、COP-A46R、COP-B7R、COP-B8R、COP-B13R、COP-B16R及COP-B19R。
所屬技術領域中具有通常知識者將理解其他正痘病毒株可經修飾以併入異源性DNA序列，該異源性DNA序列可穩定插入至痘瘡基因體特別是基因間區中，而不破壞或改變編碼序列，藉此保留病毒的典型特徵及基因表現。
在一實施態樣中，減毒的痘病毒係經修飾之痘瘡病毒，其中該修飾包含將外源性DNA序列(例如衍生自冠狀病毒株之DNA序列)插入至病毒基因體之基因間區中，其中該基因間區進而位於痘瘡基因體之二個相鄰開讀框(ORF)之間或與該二個相鄰ORF側接，且其中該開讀框對應保守基因。
在一實施態樣中，在二個相鄰ORF之間可插入異源性DNA序列的基因間區包括該些選自包含下列之群組者：001L-002L、002L-003L、005R-006R、006L-007R、007R-008L、008L-009L、017L-018L、018L-019L、019L-02OL、020L-021L、023L-024L、024L-025L、025L-026L、028R-029L、03OL-031L、031L-032L、032L-033L、035L-036L、036L-037L、037L-038L、039L-040L、043L-044L、044L-045L、046L-047R、049L-050L、050L-051L、051L-052R、052R-053R、053R-054R、054R-055R、055R-056L、061L-062L、064L-065L、065L-066L、066L-067L、077L-078R、078R-079R、080R-081R、081R-082L、082L-083R、085R-086R、086R-087R、088R-089L、089L-090R、092R-093L、094L-095R、096R-097R、097R-098R、101R-102R、103R-104R、105L-106R、107R-108L、108L-109L、109L-110L、110L-111L、113L-114L、114L-115L、115L-116R、117L-118L、118L-119R、122R-123L、123L-124L、124L-125L、125L-126L、133R-134R、134R-135R、136L-137L、137L-138L、141L-142R、143L-144R、144R-145R、145R-146R、146R-147R、147R-148R、148R-149L、152R-153L、153L-154R、154R-155R、156R-157L、157L-158R、159R-160L、160L-161R、162R-163R、163R-164R、164R-165R、165R-166R、166R-167R、167R-168R、170R-171R、173R-174R、175R-176R、176R-177R、178R-179R、179R-180R、180R-181R、183R-184R、184R-185L、185L-186R、186R-187R、187R-188R、188R-189R、189R-190R、192R-193R(亦見PCT/EP03/05045)。
根據舊命名，ORF 006L對應C10L、019L對應C6L、020L對應N1L,021L對應N2L、023L對應K2L、028R對應K7R、029L對應F1L、037L對應F8L、045L對應F15L、050L對應E3L、052R對應E5R、054R對應E7R、055R對應E8R、056L對應E9L、062L對應I1L、064L對應I4L、065L對應I5L、081R對應L2R、082L對應L3L、086R對應J2R、087對應J3R、088R對應J4R、089L對應J5L、092R對應H2R、095R對應H5R、107R對應D10R、108L對應D11L、122R對應A11R、123L對應A12L、125L對應A14L、126L對應A15L、135R對應A24R、136L對應A25L、137L對應A26L、141L對應A30L、148R對應A37R、149L對應A38L、152R對應A40R、153L對應A41L、154R對應A42R、157L對應A44L、159R對應A46R、160L對應A47L、165R對應A56R、166R對應A57R、167R對應B1R、170R對應B3R、176R對應B8R、18OR對應B12R、184R對應B16R、185L對應B17L且187R對應B19R。
在一實施態樣中，在二個相鄰ORF之間可插入異源性DNA序列的基因間區包括該些選自包含下列之群組者：F9L-F10L、F12L-F13L、F17R-E1L、E1L-E2L、E8R-E9L、E9L-E10R、I1L-I2L、I2L-I3L、I5L-I6L、I6L-I7L、I7L-I8R、I8R-G1L、G1L-G3L、G3L-G2R、G2R-G4L、G4L-G5R、G5R-G5.5R、G5.5R-G6R、G6R-G7L、G7L-G8R、G8R-G9R、G9R-L1R、L1R-L2R、L2R-L3L、L3L-L4R、L4R-L5R、L5R-J1R、J3R-J4R、J4R-J5L、J5L-J6R、J6R-H1L、H1L-H2R、H2R-H3L、H3L-H4L、H4L-H5R、H5R-H6R、H6R-H7R、H7R-D1R、D1R-D2L、D2L-D3R、D3R-D4R、D4R-D5R、D5R-D6R、D6R-D7R、D9R-D10R、D10R-D11L、D11L-D12L、D12L-D13L、D13L-A1L、A1L-A2L、A2L-A2.5L、A2.5L-A3L、A3L-A4L、A4L-A5R、A5R-A6L、A6L-A7L、A7L-A8R、A8R-A9L、A9L-A10L、A10L-A11R、A11R-A12L、A12L-A13L、A13L-A14L、A14L-A14.5L、A14.5L-A15L、A15L-A16L、A16L-A17L、A17L-A18R、A18R-A19L、A19L-A21L、A21L-A20R、A20R-A22R、A22R-A23R、A23R-A24R、A28L-A29L、A29L-A30L(亦見PCT/IB2007/004575)。
在一實施態樣中，修飾包含刪除A41L基因。
在一實施態樣中，修飾包含刪除A41L基因及/或D13L基因。
在一實施態樣中，修飾包含刪除A41L基因及/或D13L基因及/或B7R-B8R基因。
在一實施態樣中，修飾包含刪除A41L基因及/或D13L基因及/或B7R-B8R基因及/或C3L基因及/或A39R基因。
所屬技術領域中具有通常知識者將理解刪除A41L基因及/或D13L基因及/或B7R-B8R基因及/或C3L基因及/或A39R基因授予痘病毒有利特徵諸如減毒及增加免疫原性。
在一實施態樣中，修飾包含將異源性DNA序列插入至位於J2R與J3R基因之間的基因間區中。
所屬技術領域中具有通常知識者將理解將異源性DNA序列插入至基因間區中不破壞也不改變病毒的編碼序列。
在一實施態樣中，重組SCV載體表現組裝成VLP之一或多種結構蛋白及非結構蛋白。
在一實施態樣中，SARS-CoV-2抗原當表現時被組裝成病毒樣粒子(VLP)。
在一實施態樣中，載體表現形成VLP之蛋白且產生抗SARS-CoV-2抗原或其免疫原性片段之免疫反應。
在例示性實施態樣中，免疫反應係長期維持且持久，因此不需要重複追加，但在一或多個實施態樣中，提供一或多次投予本發明提供之組成物以追加初始的初免免疫反應。
在一實施態樣中，本發明提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分、在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
在一實施態樣中，本發明提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在天然早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分、在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
在一實施態樣中，本發明提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
在一實施態樣中，本發明提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在天然早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
如本文中所使用，棘蛋白之用途包括用於穩定棘蛋白之融合前構形的經工程改造之變體以預防結構重排及就抗原性方面暴露較佳表面以誘發優異免疫反應。這些修飾包括但不限於導入穩定突變及使用分子鉗。
在一實施態樣中，本發明提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
在一實施態樣中，本發明提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽的S1受體結合域次單位之核酸序列。
在一實施態樣中，本發明提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分、在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分、在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之包膜多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
在一實施態樣中，本發明提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在天然早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分、在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之包膜多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
在一實施態樣中，本發明提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽的S1受體結合域次單位及在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
在一實施態樣中，本發明提供一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽的S1受體結合域次單位及在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之包膜多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
在一實施態樣中，本發明提供一種誘導動物的保護性免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之方法，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之膜多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
在一實施態樣中，本發明提供一種誘導動物的保護性免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2感染之風險及/或降低COVID-19疾病的嚴重性之方法，該組成物包含減毒的痘病毒特別是痘瘡病毒，其中痘病毒基因體經修飾且包含編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
在一實施態樣中，本發明提供一種誘導個體的保護性免疫反應以防範SARS-CoV-2病毒感染之方法，該方法包含向個體投予混合的組成物，該混合的組成物包含等量的：包含減毒的痘病毒之組成物，其中該痘病毒基因體經修飾且包含編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列，及包含減毒的痘病毒之組成物，其中該痘病毒基因體經修飾且包含編碼SARS-CoV-2之膜及核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
在一實施態樣中，本發明提供一種誘導個體的保護性免疫反應以防範SARS-CoV-2病毒感染之方法，該方法包含向個體投予混合的組成物，該混合的組成物包含等量的：包含減毒的痘病毒之組成物，其中該痘病毒基因體經修飾且包含編碼在天然早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列，及包含減毒的痘病毒之組成物，其中該痘病毒基因體經修飾且包含編碼SARS-CoV-2之膜及核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
在第一態樣中，本發明提供一種誘導個體的保護性免疫反應以防範SARS-CoV-2病毒感染之方法，該方法包含向個體投予如上述任一者之組成物。
在第二態樣中，本發明藉由模擬SARS-CoV-2病毒樣粒子提供一種用於提升動物的免疫反應以降低SARS-CoV-2感染之風險之組成物。
在第三態樣中，本發明提供一種用於提升動物的免疫反應以降低SARS-CoV-2感染及任何其他由基因類似SARS-CoV-2之冠狀病毒所造成之感染之風險之組成物，該組成物包含減毒的痘病毒，其中痘病毒基因體包含編碼SARS-CoV-2之棘多肽或其免疫原性或功能性部分及/或SARS-CoV-2之膜及核鞘多肽或其免疫原性或功能性部分及/或SARS-CoV-2之包膜多肽或其免疫原性或功能性部分之核酸序列。
在第四態樣中，本發明提供在本文中設想之實施態樣之組成物於製備用於誘導個體的中和抗體反應及/或保護性免疫反應以防範冠狀病毒感染之藥物的用途。
免疫原性可藉由自痘病毒載體表現SARS-CoV-2棘多肽或棘多肽之S1受體結合域次單位達成。歷史上，冠狀病毒諸如SARS-CoV或MERS-CoV之棘蛋白被發現具有免疫原性，其誘發體液性免疫反應包括抑制病毒進入至宿主細胞中之中和抗體以及細胞媒介之免疫反應。免疫原性亦可藉由誘導棘特異性T細胞反應達成。由防範SARS-CoV-2病毒之SCV-COVID疫苗所誘導之棘特異性細胞性及體液性反應與由痘病毒載體所誘導之偏Th1生產抗體的互補可提供防範SARS-CoV-2感染的預防性保護。
免疫原性可藉由自痘病毒載體表現SARS-CoV-2膜蛋白多肽達成。在SARS-CoV中，已顯示膜蛋白在病毒表面上豐富；再者，當用於免疫接種SARS患者時，膜蛋白誘導高力價的中和抗體。免疫原性及結構分析顯示能夠觸發強健細胞性免疫反應之T細胞表位叢聚存在於膜蛋白中。由於膜蛋白在許多病毒種中亦具高度保守性，因此其係用於誘導抗SARS-CoV-2之免疫反應的良好候選抗原。由防範SARS-CoV-2病毒之SCV-COVID疫苗所誘導之膜特異性細胞性及體液性反應與由痘病毒載體所誘導之偏Th1生產抗體的互補可提供防範SARS-CoV-2感染的預防性保護。
免疫原性可藉由自痘病毒載體表現SARS-CoV-2核鞘蛋白多肽達成。近來發現SARS-CoV-2感染導致生產大多針對核鞘抗原之抗體。然而，N抗體被忽視因為N蛋白抗體無法阻斷病毒進入且因此被認為是「非中和」抗體。因此，抗N抗體無法藉由目前用於評估體液性免疫力之中和試驗測量。最近研究顯示進入細胞內之抗N抗體被抗體受體TRIM21辨識，其接著切碎相關N蛋白。接著展示N蛋白表位以被T細胞偵測。由於此免疫反應機制涉及最終將媒介免疫記憶之T細胞，因此抗核鞘蛋白之抗體可能刺激防範未來感染之長期保護。由防範SARS-CoV-2病毒之SCV-COVID疫苗所誘導之核鞘特異性細胞性及體液性反應與由痘病毒載體所誘導之偏Th1生產抗體的互補可提供防範SARS-CoV-2感染的預防性保護。
免疫原性可藉由在痘病毒載體內同時表現SARS-CoV-2棘蛋白或其部分、膜蛋白多肽、核鞘蛋白多肽及/或包膜蛋白多肽達成。結構蛋白之組合免疫原性可引起更為強健的抗原特異性免疫反應。另外，S、M及N及/或E多肽的存在可導致形成真實病毒樣粒子(VLP)，其為模擬冠狀病毒結構但缺乏具感染性遺傳物質之病毒空殼。由防範SARS-CoV-2病毒之SCV-COVID疫苗所誘導之抗原及VLP特異性細胞性及體液性反應與由痘病毒載體所誘導之偏Th1生產抗體的互補可提供防範COVID-19的預防性保護。由防範SARS-CoV-2病毒之SCV-COVID疫苗所誘導之VLP特異性細胞性及體液性反應與由痘病毒載體所誘導之偏Th1生產抗體的互補可提供防範COVID-19的預防性保護。
在本發明之較佳形式中，減毒的痘病毒係選自由下列所組成之群組：痘瘡病毒、NYVAC及SCV。較佳的是減毒的痘病毒係經修飾之正痘病毒，其中該修飾包含刪除編碼內源性必需組成或成熟蛋白之基因。進一步較佳的是修飾包含刪除D13L基因，且進一步較佳地包含刪除K1L基因。
在本發明中可行之各種實施態樣進一步由下列非限制性實例描述。實例 1 疫苗的建構
為了建構SCV-COVID19疫苗，使用靜默突變移除在抗原編碼序列內之早期轉錄終止信號，並藉由PCR自經合成之卡匣重新(de novo )合成或建構抗原性轉殖基因之表現卡匣。各卡匣係由與痘病毒啟動子之必要控制元件側接之轉殖基因及上游的Kozak序列及下游的痘病毒早期轉錄終止信號組成以使基因表現得以進行。亦可包括側接的核酸內切酶辨識位點以使分子操作得以進行。顯示SARS-CoV-2棘多肽與合成的早期/晚期啟動子(圖1A)、SARS-CoV-2棘多肽與天然早期/晚期啟動子(圖1B)、SARS-CoV-2棘多肽之S1受體結合域次單位與合成的早期/晚期啟動子(圖1C)、膜多肽與禽痘早期/晚期啟動子(圖1D)、核鞘多肽與合成的早期/晚期啟動子(圖1E)、膜多肽與禽痘早期/晚期啟動子及核鞘多肽與合成的早期/晚期啟動子(圖1F)、包膜多肽與合成的早期/晚期啟動子(圖1G)之表現卡匣的特定實例。
接著使用標準分子生物學方法將轉殖基因表現卡匣插入至能夠在細菌中增殖之適當同源重組(HR)質體中。HR質體含有HR卡匣，該HR卡匣係由與痘病毒基因體位點(轉殖基因位處該等痘病毒基因體位點之間)同源之側接重組臂(F1及F2)組成。相對於痘苗-COP基因體之同源重組位點係指示於圖2。轉殖基因表現卡匣係插入至重組臂之間且相鄰於額外痘病毒表現卡匣，該額外痘病毒表現卡匣含有使新重組病毒之正向選擇得以進行之基因(例如CP77、吉歐黴素(Zeocin)抗性或其他藥物選擇合併螢光報導蛋白諸如綠色或藍色螢光蛋白(GFP或BFP))。選擇基因係與150 bp的同一、非編碼DNA序列側接以使選擇基因刪除得以在一旦親代病毒被消除後進行。為了製備用於病毒建構之HR質體，使用限制核酸內切酶消化(例如Not I)以釋放HR卡匣。顯示下列HR卡匣之特定實例： ● 在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2棘多肽表現卡匣，該表現卡匣與F1及F2重組臂側接，該F1及F2重組臂與側接痘苗A41L ORF之序列同源(圖3A；SEQ ID NO:1)， ● 在天然早期/晚期啟動子轉錄控制下之SARS-CoV-2棘多肽表現卡匣，該表現卡匣與F1及F2重組臂側接，該F1及F2重組臂與側接痘苗A41L ORF之序列同源(圖3B；SEQ ID NO:2)， ● SARS-CoV-2棘多肽之S1次單位表現卡匣，該表現卡匣與F1及F2重組臂側接，該F1及F2重組臂與側接痘苗A41L ORF之序列同源(圖3C；SEQ ID NO:3)， ● SARS-CoV-2膜蛋白及核鞘蛋白表現卡匣，該表現卡匣與左及右組合臂側接，該左及右組合臂與側接痘苗D13L ORF之序列同源(圖3D，SEQ. NO. 4)，或與痘苗J2R及J3R ORF之序列同源使介於J2R與J3R之間的插入得以進行(圖2E，SEQ ID NO:5)， ● SARS-CoV-2膜蛋白表現卡匣，該表現卡匣與左及右組合臂側接，該左及右組合臂與側接痘苗C3L ORF之序列同源(圖3F；SEQ ID NO:6)， ● SARS-CoV-2核鞘蛋白表現卡匣，該表現卡匣與左及右組合臂側接，該左及右組合臂與側接痘苗D13L ORF之序列同源(圖3G；SEQ ID NO:7)， ● SARS-CoV-2包膜蛋白表現卡匣，該表現卡匣與左及右組合臂側接，該左及右組合臂與側接痘苗B7/B8R ORF之序列同源(圖3H；SEQ ID NO:8)。
簡言之，為了建構重組SCV-COVID19疫苗(圖4)，在BC19A-12細胞或SD07-1細胞中進行同源重組(其中需要CP77宿主範圍選擇)。細胞係經SCV-SMX06(衍生自哥本哈根株且具有D13L、A39R、B7/B8R及C3L ORF刪除之複製無法勝任痘瘡病毒)以0.01 pfu/細胞之感染複數(moi)感染1小時。接著使用轉染試劑諸如EFFECTENE® (Qiagen)，將經感染之細胞用經Not I消化之同源重組質體轉染。將經感染/轉染之細胞培育2至3天，直到螢光細胞可見。使用重複正向藥物選擇及基於螢光之單細胞分選，自親代病毒純化重組病毒。在達成親代病毒移除之後(藉由PCR證實)，將任何額外表現卡匣插入同源重組及純化之迭代中。在親代病毒不存在下，移除選擇壓力以在感染BC19A-12細胞期間允許經由150 bp重複之間的分子內重組刪除選擇基因。藉由基於螢光之單細胞分選及/或限制稀釋富集及純化不具選擇標記之病毒。一旦病毒族群無選擇標記之後，將候選殖株接著於BC19A-12細胞中擴增以產生病毒種子原液，該原液藉由PCR及DNA定序驗證轉殖基因位置及完整性，且藉由西方墨點轉漬法或其他免疫染色技術驗證轉殖基因表現。
建構策略摘要
SCV係衍生自痘瘡病毒之哥本哈根株，其經基因工程改造以刪除編碼必需病毒組成蛋白之基因D13L，以有效地使SCV病毒無法產生感染性病毒後代。
SCV-SMX06係具有額外基因刪除(具體為免疫調節基因A39R、B7/B8R及C3L)之SCV版本。基因使用如圖2所示之同源重組依序刪除，其中介於F1及F2重組臂之間的D13L、A39R、B7/B8R及C3L區域係經刪除。SCV-SMX06係用於建構SCV-COVID疫苗變異之基礎SCV病毒。當需要時，藉由使用相同F1及F2重組臂協助將轉殖基因插入刪除位點(圖3)。
另外，在其中SARS-CoV-2棘或其免疫原性部分經插入作為轉殖基因之變異中，A41L ORF在轉殖基因插入時刪除。在缺乏SARS-CoV-2棘或其免疫原性部分之變異中，A41L基因維持未經修飾。
建構SCV-COVID19病毒以提供單一載體疫苗。單一載體疫苗可經組合作為混合疫苗。
重組病毒SCV-COVID19A係藉由以編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2棘多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:1所定義之核苷酸序列的表現卡匣)取代SCV-SMX06之A41L ORF，且藉由將包含在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2膜多肽及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之核鞘多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:4所定義之核苷酸序列的表現卡匣)插入SCV-SMX06之D13L ORF刪除位點中來建構。
重組病毒SCV-COVID19B係藉由以編碼在天然早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2棘多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:2所定義之核苷酸序列的表現卡匣)取代SCV-SMX06之A41L ORF，且藉由將包含在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2膜多肽及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之核鞘多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:4所定義之核苷酸序列的表現卡匣)插入SCV-SMX06之D13L ORF刪除位點中來建構。
重組病毒SCV-COVID19C係藉由以編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2棘多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:1所定義之核苷酸序列的表現卡匣)取代SCV-SMX06之A41L ORF來建構。
重組病毒SCV-COVID19D係藉由以編碼在天然早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2棘多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:2所定義之核苷酸序列的表現卡匣)取代SCV-SMX06之A41L ORF來建構。
重組病毒SCV-COVID19E係藉由將編碼在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2膜多肽及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之核鞘多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:5所定義之核苷酸序列的表現卡匣)插入SCV-SMX06之J2R與J3R基因之間來建構。
重組病毒SCV-COVID19F係藉由以編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2棘多肽之S1受體結合域次單位之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:3所定義之核苷酸序列的表現卡匣)取代SCV-SMX06之A41L ORF來建構。
重組病毒SCV-COVID19G係藉由將編碼在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2膜多肽及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之核鞘多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:4所定義之核苷酸序列的表現卡匣)插入SCV-SMX06之D13L ORF刪除位點中來建構。
重組病毒SCV-COVID19H係藉由以編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2棘多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:1所定義之核苷酸序列的表現卡匣)取代SCV-SMX06痘瘡病毒株之A41L ORF，且將編碼在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2膜多肽及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之核鞘多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:4所定義之核苷酸序列的表現卡匣)插入SCV-SMX06之D13L ORF刪除位點中，且藉由將編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2包膜多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:8所定義之核苷酸序列的表現卡匣)插入SCV-SMX06之B7/B8R ORF刪除位點中來建構。
重組病毒SCV-COVID19I係藉由以編碼在天然早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2棘多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:2所定義之核苷酸序列的表現卡匣)取代SCV-SMX06痘瘡病毒株之A41L ORF，且藉由將編碼在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2膜多肽及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之核鞘多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:4所定義之核苷酸序列的表現卡匣)插入SCV-SMX06之D13L ORF刪除位點中，且藉由將編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2包膜多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:8所定義之核苷酸序列的表現卡匣)插入SCV-SMX06之B7/B8R ORF刪除位點中來建構。
重組病毒SCV-COVID19J係藉由以編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2棘多肽之S1受體結合域次單位之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:3所定義之核苷酸序列的表現卡匣)取代SCV-SMX06痘瘡病毒之A41L ORF，且藉由將編碼在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2膜多肽及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之核鞘多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:4所定義之核苷酸序列的表現卡匣)插入SCV-SMX06之D13L ORF刪除位點中來建構。
重組病毒SCV-COVID19K係藉由以編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2棘多肽之S1受體結合域次單位之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:3所定義之核苷酸序列的表現卡匣)取代SCV-SMX06痘瘡病毒株之A41L ORF，且藉由將編碼在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2膜多肽及在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之核鞘多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:4所定義之核苷酸序列的表現卡匣)插入SCV-SMX06之D13L ORF刪除位點中，且藉由將編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2包膜多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:8所定義之核苷酸序列的表現卡匣)插入SCV-SMX06之B7/B8R ORF刪除位點中來建構。
重組病毒SCV-COVID19L係藉由將編碼在禽痘早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2膜多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:6所定義之核苷酸序列的表現卡匣)插入SCV-SMX06之C3L ORF刪除位點中來建構。
重組病毒SCV-COVID19M係藉由將編碼在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2核鞘多肽之表現卡匣(例如具有SEQ ID NO:7所定義之核苷酸序列的表現卡匣)插入SCV-SMX06之D13L ORF刪除位點中來建構。
在SCV-COVID19病毒疫苗內之SARS-CoV-2抗原插入區係繪示於圖5。具體而言，在A41L ORF中在合成的早期/晚期啟動子下之SARS-CoV-2棘多肽(圖5A)、在A41L ORF中在天然早期/晚期啟動子下之SARS-CoV-2棘多肽(圖5B)、在A41L ORF中之棘多肽之SARS-CoV-2 S1次單位(圖5C)、在D13L ORF中之SARS-CoV-2膜及核鞘多肽(圖5D)、在J2R與J3R之間的基因間位點中之SARS-CoV-2膜及核鞘多肽(圖5E)、在B7/B8R ORF中之SARS-CoV-2包膜多肽(圖5F)、在C3L ORF中之SARS-CoV-2膜多肽(圖5G)及在D13L ORF中之SARS-CoV-2核鞘多肽(圖5H)。
表1總結在SCV-SMX06基因體內之SCV-COVID19插入及刪除位點。以包含棘或S1轉殖基因之SCV-COVID19物種而言，A41L基因係經刪除。J2↓J3R指示基因間插入位點，其中抗原係在不修飾相鄰J2R及J3R基因下插入。未經修飾之位點係藉由「+」指示，然而「-」指示基因之ORF已經刪除。
Figure 02_image003
另外，組合疫苗係藉由混合相等比例之二種單一載體疫苗(特別是SCV-COVID19C及SCV-COVID19G之疫苗)來製備，且經由單一注射器遞送。
另外，組合疫苗係藉由混合相等比例之二種單一載體疫苗(特別是SCV-COVID19D及SCV-COVID19G之疫苗)來製備，且經由單一注射器遞送。
另外，組合疫苗係藉由混合相等比例之二種單一載體疫苗(特別是SCV-COVID19C及SCV-COVID19E之疫苗)來製備，且經由單一注射器遞送。
另外，組合疫苗係藉由混合相等比例之二種單一載體疫苗(特別是SCV-COVID19D及SCV-COVID19E之疫苗)來製備，且經由單一注射器遞送。實例 2 SCV-COVID19D 之單一免疫接種在遠交及近交小鼠中產生中和 SARS-CoV-2 抗體及偏 Th1 抗體輪廓 實驗策略
6至9週齡雄性C57BL/6小鼠或ARC Swiss小鼠組(n=每組5隻小鼠)係經由肌肉內投予接種SCV-COVID19D(107 , 108 PFU)或載體對照SCV-SMX06。在免疫接種之前及之後21天獲得血液樣本。S1特異性IgG水準及SARS-CoV-2病毒特異性中和抗體水準係藉由終點ELISA及中和試驗判定。
使用二個研究世代的小鼠代表基因異型合子。第一研究世代使用近交小鼠品系C57BL/6以最小化表型或特質變異且因此改善再現性，而第二組採用遠交小鼠品系Swiss以代表基因多樣性且因此在族群中較普遍化的反應。病毒中和測試
使血清在56℃下熱去活化達30分鐘並儲存在-80℃下直到處理當天。亦培養含有Vero細胞之96孔板以確保在處理當天單層長滿。在中和試驗當天，以最低必需培養基(MEM)培養基製備血清之二倍連續稀釋並以由MEM及抗生素及胰蛋白酶構成之感染培養基洗滌Vero板。將每50 µl 100 TCID50 之SARS-CoV-2添加至預先製備之血清稀釋的各稀釋並在室溫下培育1小時(偶而搖晃)。接著將病毒:血清混合物添加至Vero細胞並在37℃及5% CO2 下培育，接著在程序後4天以顯微鏡監測並計分細胞病變效應。病毒中和力價係表現為仍抑制病毒複製之血清最高稀釋的倒數值。小鼠血清之酶連接免疫吸附測定
將MaxiSorp板(Nunc)在4℃下隔夜吸附塗佈於PBS中之S1(120 ng/孔)。將板於PBS/Tween(0.05% v/v)中洗滌並使用3%脫脂牛乳於PBS/Tween中在室溫下阻斷孔1 hr。添加連續稀釋的小鼠血清樣本並在室溫下培育2小時。在室溫下洗滌板並添加辣根過氧化酶共軛山羊抗小鼠IgG至所有孔達1 hr。在洗滌後，添加TMB液體受質(Sigma)並使用3M HCl停止反應。在450 nm下測量各孔的光學密度(OD)值。計算終點力價如下：log10 OD對log10 樣本稀釋係經作圖且此曲線之線性部分的迴歸分析允許計算終點力價。當OD讀數達到陰性血清樣本之平均吸光度值加三倍標準差時，計算終點力價。IgG亞型ELISA之結果使用OD值呈現。結果
在所有接種SCV-COVID19D之小鼠中偵測到病毒特異性中和抗體(圖6A)。在107 PFU劑量之免疫接種下，遠交Swiss小鼠及近交C57Bl/6小鼠所產生之中和抗體力價高於SCV-SMX06，其中在相同劑量下遠交與近交小鼠之間的中和抗體水準係可相比的。在用於Swiss小鼠之108 PFU劑量之免疫接種下，中和抗體力價增加。亦在遠交Swiss品系及C57BL/6小鼠兩者中偵測到對抗棘蛋白之S1次單位之總IgG力價(圖6B)。藉由ELISA分析IgG亞型顯示較高水準的S1特異性IgG2c相較於IgG1，指示免疫接種後主要為Th1反應(圖6C)。實例 3 SCV-COVID19D 之單一免疫接種產生棘特異性 CD8 T 細胞反應
T細胞係產生早期控制及廓清許多呼吸系統病毒感染的關鍵。最近基因轉殖小鼠模型研究提供在SARS-CoV-2感染之後T細胞用於病毒廓清及疾病緩解的證據。在本文中，我們定義SCV-COVID19D之免疫接種是否誘發早期T細胞反應，以具有減弱疾病嚴重性之潛在益處。實驗策略
6至9週齡雄性C57BL/6小鼠組(n=每組5隻小鼠)係經由肌肉內投予接種107 PFU劑量之SCV-COVID19D或載體對照SCV-SMX06。棘特異性T細胞反應(使用橫跨棘蛋白全長之肽)係在免疫接種後3個月藉由ELISpot及細胞內細胞介素染色(ICS)偵測。ELISpot 測定
鼠脾細胞之單一細胞懸浮液之稀釋係藉由使細胞在重懸於完全培養基中之前通過70 µM細胞過濾器及ACK裂解來製備。為了藉由ELISpot分析干擾素-γ(IFNγ)生產，PVDF ELISpot板(MabTech)係經抗小鼠IFNγ塗佈抗體培育隔夜，接著經細胞培養基阻斷。細胞稀釋係經橫跨整個棘蛋白之肽池(每肽2 µg/ml)於ELISpot板在37℃、5% CO2 之增濕培育箱中培育18至20小時。在刺激後，IFNγ斑點形成單位(SFU)係藉由將膜以抗小鼠IFNγ生物素偵測抗體及隨後的鏈黴抗生物素蛋白-鹼性磷酸酶染色且以BCIP/NBT受質套組(MabTech)呈色來偵測。代表細胞介素分泌T細胞之斑點的定量使用ELISpot讀取儀進行。細胞內細胞介素染色分析
為了補充及驗證ELISpot結果，實施IFNγ之細胞內細胞介素生產。使細胞在37℃下以橫跨整個棘蛋白(每肽2 µg/ml)之肽池連同蛋白運輸抑制劑布雷菲德菌素A(Brefeldin A)刺激6小時。將細胞的表面標記CD3及CD8染色，接著以4%聚甲醛固定。使用BD cytofix/perm緩衝劑將細胞通透化，並實施IFNγ細胞內染色。在FACS Aria 2(BD)上實施樣本採集並在FlowJo V10(TreeStar)中分析資料。藉由圈選雙重峰陰性活淋巴細胞、大小、CD3+ 、CD8+ 細胞及IFNγ細胞介素陽性來識別細胞介素分泌T細胞。結果
藉由ICS(圖7A)及ELISpot(圖7B)在SCV-COVID19D接種小鼠中偵測到相較於載體對照顯著增加的棘特異性IFNγ+ 生產T細胞反應。載體對照組具有低(＜100 SFU)或最小可偵測反應(圖15B)。結論
在本發明中之實例2及3指示以編碼SARS-CoV-2棘蛋白之SCV-COVID19疫苗免疫接種動物模型誘導細胞性及體液性反應，如生產S1特異性抗體、中和抗體及增加棘特異性IFNγ分泌CD8+ T細胞所示。這些表明SCV-COVID19疫苗可提供防範SARS-CoV-2(COVID-19之感染原)的預防性保護。實例 4 SCV-COVD19C 比起 SCV-COVID19D 及 SCV-COVID19F 誘發較佳棘特異性抗體
SCV-COVID19C及SCV-COVID19D疫苗的差異在於用於抗原表現之痘病毒啟動子的類型。SCV-COVID19C及SCV-COVID19F疫苗的差異在於經插入之轉殖基因的長度，其中SCV-COVID19C包含棘蛋白全長，而SCV-COVID19F僅包含棘蛋白之S1次單位。在本文中，我們藉由西方墨點轉漬法比較三種疫苗之抗原表現的效率且使用ELISA評估彼等誘導棘S1特異性抗體反應的能力。實驗策略
細胞系係經SCV-COVID19C、SCV- COVID19D及SCV-COVID19F感染，並藉由西方墨點轉漬法檢查棘蛋白或S1次單位之表現。6至9週齡雄性C57BL/6小鼠組(n=每組5隻小鼠)係經由肌肉內投予接種每小鼠107 pfu劑量之SCV-COVID19C、SCV-COVID19D、SCV-COVID19F或載體對照SCV-SMX06，並藉由ELISA評估棘S1特異性抗體反應。西方墨點轉漬法
將SCV-COVID19C、SCV-COVID19D及SCV-COVID19F濃縮物裂解於裝載緩衝劑中，並在10% SDS-聚丙醯胺凝膠上分離各樣本等同於8 ug之總蛋白質且轉移至硝基纖維素過濾膜上。將膜以經1:1000稀釋之兔SARS-CoV-2棘RBD mAb(Sino Biological 40592-T62)阻斷及培育。使用經辣根過氧化酶(HRP)共軛之抗兔IgG偵測經結合之抗體，隨後使用Clarity ECL及用於膜之TMB(Sigma)進行增強化學發光。用於 S1 特異性抗體終點力價之酶連接免疫吸附測定
將MaxiSorp板(Nunc)在4℃下隔夜吸附塗佈於PBS中之S1(120 ng/孔)。將板於PBS/Tween(0.05% v/v)中洗滌並使用3%脫脂牛乳於PBS/Tween中在室溫下阻斷孔1 hr。添加連續稀釋的小鼠血清樣本並在室溫下培育2小時。在室溫下洗滌板並添加辣根過氧化酶共軛山羊抗小鼠IgG至所有孔達1 hr。在洗滌後，添加TMB液體受質(Sigma)並使用3M HCl停止反應。在450 nm下測量各孔的光學密度(OD)值。計算終點力價如下：log10 OD對log10 樣本稀釋係經作圖且此曲線之線性部分的迴歸分析允許計算終點力價。當OD讀數達到陰性血清樣本之平均吸光度值加三倍標準差時，計算終點力價。結果
圖8A顯示藉由西方墨點轉漬法之細胞裂解物中SARS-CoV-2棘蛋白的表現。SCV-COVID19C及SCV-COVID19D兩者之裂解物顯示180 kDa條帶，反映全長棘蛋白的表現，而SCV-COVID19F之裂解物顯示80 kDa條帶，反映棘蛋白之S1次單位的表現。然而，SCV-COVID19C相較於SCV-COVID19D展現較強信號，指示在合成的早期/晚期啟動子下更有效的棘蛋白表現。在免疫接種後21天藉由ELISA比較S1特異性抗體反應證實SCV-COVID19C比起SCV-COVID19D或SCV-COVID19F誘導較高抗體力價(圖8B)。結論
實例4顯示，使棘蛋白在合成的早期/晚期啟動子控制下之SCV-COVID19C疫苗相較於SCV-COVID19D疫苗表現較高的棘蛋白水準。抗體力價顯示SCV-COVID19C相較於SCV-COVID19D或SCV-COVID19F較高量值的免疫原性。下列實例進一步探討SCV-COVID19C疫苗的有效性。實例 5 SCV-COVID19C 之單一免疫接種在近交及遠交小鼠中誘導抗體反應 實驗策略
6至9週齡雌性近交C57BL/6小鼠及ARC(s)小鼠組(n=每組5隻小鼠)係經由肌肉內投予接種每小鼠107 PFU劑量之SCV-COVID19C或僅載體對照SMX06。在免疫接種之前及免疫接種後第14天獲得血液樣本。棘(S1)蛋白特異性IgG水準及SARS-CoV-2病毒特異性中和抗體水準係藉由終點ELISA及偽中和試驗(cPass™; Genscript)判定。
使用二個研究世代的小鼠代表基因異型合子之變異。第一研究世代使用近交小鼠品系C57BL/6以最小化表型或特質變異且因此改善再現性，而第二研究世代採用遠交小鼠品系Swiss以代表基因多樣性且因此在族群中較普遍化的反應。用於 S1 特異性抗體終點力價之酶連接免疫吸附測定
將MaxiSorp板(Nunc)在4℃下隔夜吸附塗佈於PBS中之S1(120 ng/孔)。將板於PBS/Tween(0.05% v/v)中洗滌並使用3%脫脂牛乳於PBS/Tween中在室溫下阻斷孔1 hr。添加連續稀釋的小鼠血清樣本並在室溫下培育2小時。在室溫下洗滌板並添加辣根過氧化酶共軛山羊抗小鼠IgG至所有孔達1 hr。在洗滌後，添加TMB液體受質(Sigma)並使用3M HCl停止反應。在450 nm下測量各孔的光學密度(OD)值。計算終點力價如下：log10 OD對log10 樣本稀釋係經作圖且此曲線之線性部分的迴歸分析允許計算終點力價。當OD讀數達到陰性血清樣本之平均吸光度值加三倍標準差時，計算終點力價。cPass™ SARS-CoV-2 中和抗體偵測
cPass™ SARS-CoV-2中和抗體偵測套組(GenScript, USA)係一種阻斷式ELISA，預期用於定性直接偵測血清及血漿中對抗SARS-CoV-2之總中和抗體。感染SARS-CoV-2起始免疫反應，其包括在血液中生產抗體(或結合抗體)。使用經純化的受體結合域(RBD)、來自病毒棘(S)蛋白之蛋白及宿主細胞受體ACE2，該測試藉由在試管或ELISA板之孔中的直接蛋白質交互作用模擬病毒-宿主交互作用。接著高度特異性交互作用可以與習知病毒中和測試中相同的方式被中和。簡言之，樣本及對照係經樣本稀釋緩衝劑稀釋並與經HRD共軛之RBD預培育以允許循環中和抗體與HRP-RBD結合。接著將混合物添加至捕捉板，其係經ACE2蛋白預塗佈。未經結合之HRP-RBD以及與非中和抗體結合之HRP-RBD將被捕捉在板上，而循環中和抗體HRP-RBD複合物維持在上清液中且在洗滌期間經移除。在洗滌循環之後，添加TMB受質溶液，隨後添加停止溶液，接著將反應淬熄且顏色變成黃色。最終溶液的吸光度係於微量板讀取儀中在450 nm下讀取，且信號抑制百分比係使用下式判定： 信號抑制百分比=(1-樣本OD值/陰性對照組OD值)× 100%
信號抑制百分比係指SARS-CoV-2總中和抗體的定性偵測。cPass™套組已經食品藥物管理局(FDA)授權用於評估疫苗療效及評估群體免疫力。結果
圖9A顯示在免疫接種後第14天，在接種SCV-COVID19C相較於僅載體對照SMX06之二個小鼠研究世代中觀察到的S1特異性IgG水準。在近交及遠交小鼠中皆偵測到S1特異性IgG(圖9A)，且遠交小鼠相較於近交小鼠產生較高的抗體水準(圖9B)。與此一致的是，在遠交ARC(s)小鼠中藉由cPass測定偵測到相較於近交C57BL/6小鼠較高的中和抗體水準(圖9C)，且兩個研究世代相較於載體對照SMX06皆產生較高中和抗體。這些結果顯示，SCV-COVID19C在遠交小鼠(代表基因異型合子且因此代表人類族群)及近交小鼠中皆可誘導具有中和能力之棘特異性抗體。基於這些結果及C57BL/6的試劑可用性，選擇近交小鼠作為實驗模型以進一步探討疫苗媒介之免疫反應。實例 6 SCV-COVID19C 之單一免疫接種誘導強健的棘特異性 T 細胞反應
T細胞係產生早期控制及廓清許多呼吸系統病毒感染的關鍵。最近基因轉殖小鼠模型研究提供在SARS-CoV-2感染之後T細胞用於病毒廓清及疾病緩解的證據。在本文中，我們定義SCV-COVID19C之免疫接種是否誘發早期T細胞反應，以具有減弱疾病嚴重性之潛在益處。實驗策略
將雄性(n=每組3隻)及雌性(n=每組3隻)6至9週齡C57BL/6小鼠分成三組：(1)初始(naïve)小鼠/無疫苗、(2)接種僅載體對照SMX06之小鼠及(3)接種單一劑量SCV-COVID19C(107 PFU)之小鼠。方法
在免疫接種後第7天，收集並處理脾臟以經由流式細胞術進行單細胞表徵。來自脾臟之單細胞製劑係藉由標準方法單離。簡言之，使用小型注射器之柱塞，將脾臟擠壓通過70 μm細胞過濾器。將所得之單細胞懸浮液離心(300 × g, 5 min)，並重懸於1 mL之銨-氯化物-鉀(ACK)裂解緩衝液中5 min以清除紅血球。接著添加補充有10%胎牛血清(FBS)之RPMI培養基以中和裂解緩衝液。將脾細胞以PBS洗滌二次並以2×107 個細胞/mL重懸以準備用於多參數流式細胞術。
CD8及CD4 T細胞反應係使用如實例3所述之細胞內細胞介素染色評估。細胞內細胞介素染色係用於評估細胞介素IFN-γ、TNF-α及IL-2的生產，使用如圖10所示之圈選策略。顆粒溶解酶B(一種由效應物CD8 T細胞生產之關鍵細胞毒性效應分子)的生產亦經由流式細胞術測量。
包含橫跨SARS-CoV-2棘蛋白之S1及S2區的重疊肽之二個肽池係用於測量疫苗媒介之CD8 T及CD4 T細胞反應的特異性。棘池1包含15 AA長度肽且具有橫跨S1之全序列之重疊11元體，且棘池2包含15 AA長度肽且具有橫跨S2之全序列之重疊11元體。此外，肽混合物(pepmix)包含重疊肽池，該重疊肽池含有在S1之RBD區內的免疫優勢T細胞表位YNYLYRLF(SEQ ID NO:9)、VVLSFELL(SEQ ID NO:10)及VNFNFNGL(SEQ ID NO:11)。這些T細胞表位在先前的SARS-CoV中之CD8 T細胞活化的小鼠研究中識別。細胞在37℃下經每條件每肽2 µg/ml連同蛋白運輸抑制劑布雷菲德菌素A刺激6小時，且生產的細胞介素係藉由ICS分析。結果：棘特異性三重細胞介素陽性 CD8 T 細胞反應
在免疫接種後第7天的細胞內細胞介素染色顯示單一劑量之SCV-COVID19C(圖11A；下圖)導致棘特異性IFN-γ CD8 T細胞的數量顯著增加，然而來自初始(圖11A；上圖)及僅載體(圖11A；中圖)對照小鼠之CD8 T細胞生產最小IFN-γ水準。SCV-COVID19C之免疫接種後所誘導之棘特異性IFN-γ生產T細胞係多功能性且分泌額外細胞介素，其中超過半數亦生產TNF-α。約15%的細胞亦被分類為三重細胞介素生產細胞(IFN-γ、TNF-α及IL-2)且這些細胞被認為是T細胞反應品質良好的標誌(圖11A；下圖)。
圖11B係所有實驗小鼠組中具棘池1(S1)特異性(左圖)及棘池2(S2)特異性(中圖)及表位特異性(YNYLYRLF(SEQ ID NO:9)、VVLSFELL(SEQ ID NO:10)及VNFNFNGL(SEQ ID NO:11)；右圖)之單一、雙重及三重細胞介素生產IFN-γ CD8 T細胞的數量之圖示。結果：棘特異性顆粒溶解酶 B 生產 CD8 T 細胞反應
相較於初始小鼠，SCV-COVID19C在免疫接種後產生顆粒溶解酶B生產CD8 T細胞(圖11C)。結果：棘特異性 IFN-γ 生產 CD4 T 細胞反應
為了評估單一免疫接種SCV-COVID19C是否誘導抗原特異性CD4 T細胞反應，脾細胞係經橫跨SARS-CoV-2之S1(池1)及S2(池2)區之肽池再刺激。SCV-COVID19C之免疫接種誘導S1及S2特異性三重細胞介素生產CD4 T細胞且此係表示於圖11D。結論
單一免疫接種SCV-COVID19C產生具有細胞毒性潛力(顆粒溶解酶B生產)之CD8 T細胞及棘特異性多功能性CD8及CD4 T細胞。實例 7 既有免疫力不影響在投予單次劑量的 SCV-COVID19C 疫苗之後之棘特異性抗體反應的數量及品質
既有免疫力對病毒載體的影響係發展病毒載體疫苗的重大課題。使用以正痘病毒為底質之疫苗的潛在缺點在於有一比例的成人族群因為在1970年代中期以前所進行且最終導致天花根除的天花免疫接種活動而具有抗疫苗載體之免疫力。因此，吾人特別關注可導致疫苗免疫原性及療效減少之正痘病毒特異性既有免疫力對後續SCV-COVID19免疫接種的干擾。在本發明中，我們在臨床前小鼠模型中探討既有痘瘡病毒免疫力對單劑SCV-COVID19C或同源初免-追加相同疫苗之免疫原性的效應。實驗策略
將混合的雌性及雄性6至9週齡C57BL/6小鼠(n=每組5隻小鼠)分成二個治療組：(1)小鼠在經107 PFU/小鼠的劑量之SCV-COVID19C之免疫接種之前40天經投予痘瘡病毒以誘導抗痘病毒之既有免疫力的條件及(2)不具既有免疫力之初始小鼠係經接種107 PFU/小鼠的劑量之SCV-COVID19C。
使用在免疫接種後第28、44及80天獲得之血液樣本監測抗原特異性抗體反應之量值及長壽性。棘(S1)蛋白特異性IgG水準及SARS-CoV-2病毒特異性中和抗體水準係藉由終點ELISA及偽中和試驗(cPass™; Genscript)判定。方法
用於S1特異性抗體終點力價之酶連接免疫吸附測定及cPass™ SARS-CoV-2中和抗體偵測係如實例5所述。結果
單劑SCV-COVID19C在免疫接種後第28、44及80天誘導具有及不具既有免疫力之小鼠可相比的S1特異性抗體水準(圖12A)。與此資料一致的是，中和抗體水準(使用來自Genscript之cPass™套組測定)在二組小鼠之間亦為可相比的(圖12B)。既有免疫力不影響初免 - 追加免疫接種之後的抗體反應 實驗策略
將混合的雌性及雄性6至9週齡C57BL/6小鼠分成二個治療組：(1)小鼠在同源初免-追加策略(在第0及28天)的SCV-COVID19C之免疫接種之前40天經投予痘瘡病毒以誘導抗痘病毒之既有免疫力的條件及(2)不具既有免疫力之初始小鼠在同源初免-追加策略(在第0及28天)中接種SCV-COVID19C。
在第28天(追加前)及追加劑量後第14及50天獲得血液樣本以監測抗體反應之量值及長壽性。棘(S1)蛋白特異性IgG水準及SARS-CoV-2病毒特異性中和抗體水準係藉由終點ELISA及偽中和試驗(cPass™; Genscript)判定。方法
用於S1特異性抗體終點力價之酶連接免疫吸附測定及cPass™ SARS-CoV-2中和抗體偵測係如實例5所述。結果
在D28投予追加劑量之後觀察到棘(S1)特異性抗體反應顯著增加。既有免疫力不影響S1特異性抗體水準(圖13A)及中和抗體水準(圖13B)。結論
既有免疫力不影響單一劑量或同源初免-追加策略之SCV-COVID19C之免疫接種之後的抗原特異性抗體反應之品質、數量或動力學。實例 8 SCV-COVID19C 之單一免疫接種在老化小鼠中誘導抗原特異性抗體反應
年齡係SARS-CoV-2感染之後不良健康結果最顯著的風險因子，因此所欲的是任何新候選疫苗應誘發較老成年人的強健免疫反應。在本發明中，我們測試由單一劑量之SCV-COVID19C免疫接種在老化小鼠誘導的抗體反應。實驗策略
為了評估根據年齡的抗體反應之水準，6至9週齡雌性(n=10；稱為年輕小鼠)及9至10月齡雌性(n=20；稱為老化小鼠)C57BL/6小鼠組係經由肌肉內投予接種SCV-COVID19C(107 PFU/小鼠)。在免疫接種後第14及21天收集血液樣本並單離血清以分析抗體。棘(S1)蛋白特異性IgG水準及SARS-CoV-2病毒特異性中和抗體水準係藉由終點ELISA及偽中和試驗(cPass™; Genscript)判定。方法
用於S1特異性抗體終點力價之酶連接免疫吸附測定及cPass™ SARS-CoV-2中和抗體偵測係如實例5所述。結果
在免疫接種後第14天及第21天年輕及老化小鼠之間的S1特異性抗體之水準係可相比的(圖14A)。類似地，在免疫接種後第14天及第21天年輕及老化小鼠之間的中和抗體力價並未偵測到差異(圖14B)。結論
單一劑量之SCV-COVID19C在老化小鼠誘導之抗原特異性免疫反應與在年輕小鼠見到的水準係可相比的。實例 9 同源初免 - 追加導致免疫接種後維持長達 3 個月之顯著增強的抗體反應
為了測試初免-追加策略是否可增強年輕及老化小鼠的體液性反應，評估一種同源初免-追加方案。實驗策略
在接受第一劑(初免劑量)SCV-COVID19C (107 PFU)疫苗之後二十八(28)天，經由肌肉內注射年輕小鼠及老化小鼠投予追加的SCV-COVID19C(107 PFU)。在追加後21天，獲得血液樣本以評估S1特異性抗體水準及中和抗體力價。以長壽性研究而言，在追加後3週、9週及12週獲得血液樣本以評估S1特異性抗體力價及中和抗體的抑制百分比。方法
用於S1特異性抗體終點力價之酶連接免疫吸附測定及cPass™ SARS-CoV-2中和抗體偵測係如實例5所述。結果
在同源初免-追加免疫接種方案中投予追加劑量的SCV-COVID19C顯著增加追加後21天年輕及老化小鼠兩者之棘(S1)特異性抗體及中和抗體反應(圖15A、圖15B)。在追加後第21天並未注意到年輕及老化小鼠之間的中和抗體水準之統計差異。在追加後第3、9及12週分析中和抗體水準，且觀察到維持抗體水準，其中並未注意到年輕及老化小鼠的時間匹配比較的顯著差異(圖15C)。結論
棘特異性抗體反應的數量及品質藉由投予第二劑之SCV-COVID19C疫苗而顯著增強，其中抗體反應在追加後維持長達3個月(分析時)。實例 10 同源初免 - 追加 SCV-COVID19C 誘導長期 T 細胞反應
記憶CD8 T細胞的存在在因應病毒感染上特別重要，因為其藉由促進有效病原體廓清來與體液性反應互補。T細胞記憶在如果中和抗體的保護能力或量值受損時作為強大的二級防衛。最重要的，長期T細胞反應可指示由免疫接種所授予的免疫力可長期維持。實驗策略
將治療組分成二個研究世代：6至9週齡年輕小鼠及9至10月齡老化小鼠。在各研究世代內，小鼠係經單劑之SCV-COVID19C(107 PFU)、在初免後第28天投予之同源初免-追加第二劑(107 PFU, 107 PFU)或僅載體對照SMX06免疫。方法
多顏色流式細胞術係用於表徵記憶T細胞族群為短命效應細胞(TSLE ；由CD44、KLRG1之高表現及CD62L之低表現識別)、效應記憶細胞(TEM ；由CD44之高表現及KLRG1及CD62L之低表現識別)及中央記憶細胞(TCM ；由CD44及CD62L之高表現及KLRG1之低表現識別)(圖16)。
ELISpot測定(如前述)係用於定量IFN-γ生產T細胞，而細胞內細胞介素染色(如前述)係用於識別能夠生產細胞介素諸如IFN-γ、TNF-α及IL-2之細胞。
為了評估由SCV-COVID19C免疫接種所誘發之IFN-γ T細胞反應的特性，我們用橫跨下列區域之序列的三種不同肽池再刺激CD8 T細胞：無RBD之S1、RBD及RBD後之剩餘S1區及S2。結果：同源初免 - 追加擴增 CD8 效應 T 細胞族群
接種單一劑量或初免-追加之SCV-COVID19C的年輕及老化小鼠之效應記憶及中央記憶CD8 T細胞的總數係呈現於圖17A。結果顯示初免-追加免疫接種導致效應記憶細胞的短命效應細胞族群及效應記憶細胞族群兩者顯著增加。在年輕小鼠注意到中央記憶T細胞在投予追加劑量之後顯著增加，然而此差異並未在老化小鼠觀察到。結果：同源初免 - 追加增加 T 細胞記憶
在年輕及老化小鼠中，單劑之SCV-COVID19C疫苗相較於僅載體對照小鼠誘導顯著增加的棘特異性IFN-γ T細胞反應。投予追加劑量導致顯著增加的棘特異性IFN-γ T細胞且在年輕及老化小鼠皆觀察到(圖17B)。
進一步分析棘特異性T細胞反應為S1、RBD或S2特異性係藉由以橫跨S1區(無RBD；池1)、RBD及剩餘S1區(池2)及S2區(池3)之肽池再刺激細胞來進行。在年輕及老化小鼠中皆偵測到針對S1、RBD及S2區之IFN-γ T細胞反應，指示廣泛寬度之T細胞反應。IFN-γ生產T細胞反應主要係針對RBD區，其證據為藉由ELISpot之IFN-γ斑點形成單位(圖17C)、藉由細胞內細胞介素染色之IFN-γ生產CD8 T細胞之百分比(圖17D)及三重細胞介素陽性(IFN-γ、TNF-α、IL2)生產CD8 T細胞的數量(圖17E)。如預期地，在初免-追加方案觀察到相較於單次劑量免疫接種顯著增強的抗原特異性T細胞族群。結論
在單劑免疫接種方案之後，SCV-COVID19C之免疫接種在年輕及老化小鼠誘導針對棘蛋白之兩個次單位(S1及S2；主要針對S1次單位之RBD區)之多功能性CD8 T細胞反應。在同源初免-追加免疫接種策略之後，在年輕及老化小鼠皆觀察到抗原特異性IFN-γ生產T細胞反應及效應記憶族群的顯著增加。實例 11 同源初免 - 追加 SCV-COVID19C 可基於棘 RBD 中之 CD8 T 細胞表位潛在地與 SARS-CoV 交互作用 實驗策略
6至9週齡雌性小鼠及9至10月齡小鼠係藉由肌肉內投予經接種107 PFU/小鼠的劑量之SCV-COVID19C或僅載體對照且在免疫接種後第7天藉由ELISpot分析表位特異性T細胞反應。方法
ELISpot測定(如前述)及細胞內細胞介素染色(如前述)係用於在以RBD區中之二個在SARS-CoV與SARS-CoV-2之間係100%保守之CD8 T細胞表位(VVLSFELL(SEQ ID NO:10)及VNFNFNGL(SEQ ID NO:11))再刺激之後定量IFN-γ生產T細胞。結果
藉由ELISpot(圖18A)及ICS(圖18B)在SCV-COVID19C接種小鼠中偵測到相較於載體對照顯著增加的表位特異性IFN-γ生產T細胞反應。結論
在SCV-COVID19C之免疫接種之後產生針對CD8 T細胞表位VVLSFELL(SEQ ID NO: 10)及VNFNFNGL (SEQ ID NO:11)(在SARS-CoV與SARS-CoV-2之間係保守的)之IFN-γ生產T細胞反應表明疫苗能夠提供防範SARS-CoV及SARS-CoV-2兩者的預防性保護。實例 12 SCV-COVID19A 之單一免疫接種產生棘特異性及膜特異性 CD8 T 細胞反應 實驗策略
6至9週齡雄性C57BL/6小鼠組(n=每組5隻小鼠)係經由肌肉內投予接種SCV-COVID19A(107 PFU/小鼠)或載體對照SCV-SMX06。在免疫接種後21天收集血液樣本並藉由ELISpot偵測針對棘、膜及核鞘蛋白之T細胞反應。方法
ELISpot測定(如前述)係用於定量IFN-γ生產T細胞。為了評估由SCV-COVID19A免疫接種所誘發之IFN-γ T細胞反應的特性，我們用橫跨下列區域之序列的三種不同肽池再刺激CD8 T細胞：無RBD之S1、RBD及RBD後之剩餘S1區及S2。為了測定所產生的是靶向膜或核鞘之CD8 T細胞反應，以橫跨膜蛋白及核鞘蛋白之序列的肽池再刺激細胞。結果
在SCV-COVID19A接種小鼠中偵測到相較於載體對照顯著增加的跨S1、RBD及S2區之棘特異性IFNγ+ 生產T細胞反應(圖19A)。顯示膜特異性IFNγ+ 生產T細胞反應相較於載體對照顯著較高(圖19B)，而SCV-COVID19A接種小鼠與載體對照之間的核鞘特異性T細胞反應係可相比的(圖19C)。結論
單一劑量之SCV-COVID19免疫接種誘導廣泛寬度之T細胞反應，如棘特異性及膜特異性IFNγ分泌CD8+ T細胞的增加所示。實例 13 相等比例之 SCV-COVID19C 與 SCV-COVID19G 之單一免疫接種誘導針對棘蛋白及膜蛋白的棘特異性抗體反應及 CD8+ T 細胞反應 實驗策略
6至9週齡雄性C57BL/6小鼠組(n=每組5隻小鼠)係經由肌肉內投予接種含有相等比例之SCV-COVID19C (107 PFU/小鼠)及SCV-COVID19G(107 PFU/小鼠)之混合疫苗或載體對照SCV-SMX06。在免疫接種後21天收集血液樣本並單離血清以分析抗體。棘(S1)特異性抗體反應係藉由ELISA測定且針對棘及膜蛋白之T細胞反應係藉由ELISpot及ICS偵測。方法
S1特異性抗體水準之酶連接免疫吸附測定係如前述實施。ELISpot測定(如前述)係用於使用橫跨蛋白質全長之肽來識別棘及膜特異性IFN-γ生產T細胞反應。結果
S1特異性抗體反應係藉由ELISA在免疫接種後21天評估。免疫接種包含SCV-COVID19C及SCV-COVID19G之混合疫苗相較於僅載體SMX06對照產生顯著較高之S1特異性抗體反應(圖20A)。在單劑免疫接種混合疫苗之後由ICS偵測之棘特異性IFNγ+ 生產T細胞的水準相較於載體對照亦較高(圖20B)。免疫接種混合疫苗導致對抗橫跨棘及膜蛋白全長之肽的抗原特異性斑點形成單位(SFU)相較於載體對照顯著增加(圖20C)。結論
在本發明中之實例13指示以包含分別編碼SARS-CoV-2棘蛋白及SARS-CoV-2膜及核鞘蛋白之SCV-COVID19C及SCV-COVID19G之混合疫苗免疫接種動物模型誘導細胞性及體液性反應，如生產S1特異性抗體及增加棘特異性IFNγ分泌CD8+ T細胞所示。這些表明經混合之SCV-COVID19疫苗可提供防範SARS-CoV-2(COVID-19之感染原)的預防性保護。實例 14 測定自相同載體表現多種優勢抗原相較於自單一載體表現各優勢抗原是否不會危害刺激最佳免疫反應。
當組合不同的活減毒病毒疫苗時，病毒之間的競爭係最常觀察到的問題。其可藉由增加組合疫苗之劑量或調整各疫苗組分之劑量以克服優勢疫苗組分之競爭來迴避。
藉由「免疫干擾」之抗原競爭已在三價白喉-百日咳-破傷風疫苗的組分之間、在犬瘟熱死菌苗與活犬瘟熱病毒之間且當使用包台拉菌屬(Bordetella)作為活組合瘟熱病毒、第2型腺病毒、小病毒及副流感病毒疫苗之稀釋劑時報告。在一些情況下，接種多組分疫苗比起當組分係單獨投予時誘發較少抗體。在其他情況下，以對一種抗原之反應為主而對其他抗原之反應受到壓抑。在其他情況下，當發生相互競爭時，對所有組分之反應皆減少。
已顯示抗原競爭之程度取決於一些免疫接種參數，包括競爭抗原之相對接種位點、抗原投予之間的時間間隔及優勢抗原相對於壓抑抗原之劑量。
雖然上述可藉由自相同載體表現來自數種致病原(disease causing agent)之免疫抗原藉此確保各免疫抗原對免疫系統之相等代表性且以僅單一載體遞送抗原僅需要考慮載體的最佳免疫接種途徑來解決，仍可因抗原呈現細胞(諸如B細胞及樹突細胞)之優先抗原捕捉及MHC呈現而有發生抗原干擾之風險。具有優勢B細胞及/或T細胞表位之抗原比起具有次佳B細胞或T細胞表位之抗原將產生較強免疫反應。因此當接種表現來自多種致病原之多種抗原之單一載體時，此將導致對最優勢抗原的偏差免疫反應。
進行研究以判定表現來自多種致病病毒之多種優勢抗原是否將干擾彼此的免疫反應。表現來自相同載體之二種優勢抗原可干擾彼此刺激對彼等各別病毒之強效免疫反應的能力，即一種優勢抗原可較另一種更為強勢。
為了測定自相同載體表現多種優勢抗原相較於自單一載體表現各優勢抗原是否不會危害刺激最佳免疫反應，進行小鼠的免疫接種研究。實驗策略
野生型C57BL/6及干擾素受體缺乏小鼠(IFNAR)雌性小鼠或ACE-2缺乏小鼠係以每治療組6隻小鼠的組接種一次的重組病毒SCV-COVID19A或SCV-COVID19B、或SCV-COVID19C、SCV-COVID19D或SCV-COVID19E之混合物或空載體對照。所有治療組係經由腹膜內注射給予106 PFU/小鼠的疫苗且在免疫接種後2及4週採血。所有小鼠在免疫接種後6週接受挑戰。中和試驗
中和抗體的水準通常用來作為保護的相關性。因此在挑戰之前使用在Vero細胞上之標準微量中和試驗計算所有疫苗組的抗SARS-CoV-2之中和抗體的水準。簡言之，來自各小鼠之熱去活化(56℃達30 min)血清係經連續稀釋雙份於96孔板且經100 CCID150 單位的病毒在37℃下培育1 hr。在此中和步驟之後，將新鮮分瓶之Vero細胞(每孔104 個細胞)疊加在血清/病毒混合物上並培育5天直到在顯微鏡下觀測到細胞病變效應。使用結晶紫染色判定給出100%防範細胞病變效應之血清稀釋。結果
兩種表現SARS-CoV-2抗原之候選疫苗皆在疫苗單一投予之後誘導抗SARS-CoV-2病毒之中和抗體。在懷孕之前先經免疫接種重組 SCV-COVID19 病毒之 SARS-CoV-2 病毒感染小鼠母親對胎兒的保護。
本研究旨在顯示在懷孕之前先免疫接種雌性小鼠表現SARS-CoV-2抗原可提供保護防範彼等之未出生胎兒感染SARS-CoV-2病毒。
本研究係藉由以SCV-COVID19A、SCV-COVID19B或僅載體免疫接種雌性IFNAR-/-隨後與雄性IFNAR小鼠交配進行。懷孕小鼠接著感染SARS-CoV-2。實驗策略
6至8週IFNAR-/-在第0週係經由肌肉內途徑以106 PFU/小鼠之單一載體疫苗、SCV-COVID19A、SCV-COVID19B或僅載體接種一次。各組小鼠在免疫接種後4週採血以檢查疫苗的血清陽轉率。在免疫接種後6週，起始定時交配以誘導接種小鼠懷孕。每日檢查雌性小鼠成功懷孕的證據(陰道栓)。在胚齡6.5日，使懷孕小鼠經由皮下感染以104 CCID50 單位之SARS-CoV-2感染。在感染之後，懷孕小鼠在第1至5天之間每日採血以檢查病毒血症。在胚齡17.5日，將懷孕小鼠犧牲並收集材料以評估感染性SARS-CoV-2。結果
在懷孕之前先接種SCV-COVID19A或SCV-COVID19B之懷孕雌性小鼠能夠在SARS-CoV-2挑戰期間預防SARS-CoV-2病毒複製，如挑戰後無偵測到病毒血症所示。僅SCV載體接種小鼠無法預防SARS-CoV-2病毒的病毒複製。
在交配及懷孕之前先接種單劑之SCV- COVID19A或SCV-COVID19B疫苗的雌性小鼠顯示在挑戰後無可偵測水準之SARS-CoV-2病毒。免疫接種預防挑戰病毒感染胎盤，且藉由如此作阻斷SARS-CoV-2病毒繼續傳播至脆弱的胎兒。
然而，先前接種僅SCV載體雌性小鼠則非如此，其中在懷孕期間挑戰後一些胎盤受到感染且可發生傳播SARS-CoV-2病毒感染至胎兒。結論
先前接種單劑之SCV-COVID19A或SCV-COVID19B單一載體疫苗的懷孕雌性小鼠相較於顯示病毒血症結果之對照疫苗不受SARS-CoV-2挑戰之影響。
在懷孕之前免疫接種母親可藉由預防SARS-CoV-2病毒感染母親胎盤且阻斷繼續傳播至胎兒腦部以提供彼等之未出生胎兒的保護。
在懷孕之前先免疫接種母親阻斷SARS-CoV-2挑戰病毒繼續傳播至胎兒。實例 15 SCV-COVD19C 之單一免疫接種產生表位特異性細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTL) 活性
CD8細胞毒性T淋巴細胞(CTL)辨識第I型MHC相關肽，且在抗原依賴性刺激時藉由分泌顆粒溶解酶及穿孔素殺滅經病毒感染之細胞。病毒特異性CTL反應在侷限病毒血症扮演關鍵角色。穿孔素產生細胞膜孔，允許細胞內遞送顆粒溶解酶，導致切割及活化誘導細胞凋亡死亡之凋亡蛋白酶。在此實例中，我們使用放射性同位素51 鉻釋放顯示效應T細胞之活化以評估病毒特異性T細胞媒介之細胞毒性。實驗策略
C57BL/6小鼠係經由肌肉內投予接種每小鼠107 pfu劑量之SCV-COVID19C或載體對照SCV-SMX06。在免疫接種後第7天，收集脾臟並經由標準51 鉻(51 Cr)釋放測定效應細胞抗經肽決定簇脈衝之EL4目標細胞之直接離體溶細胞T淋巴細胞活性。溶細胞 T 淋巴細胞測定
使EL4(H-2b )細胞生長並經由肽脈衝及51 Cr標示製備用於測定。將EL4細胞洗滌並以代表SARS-CoV-2免疫優勢T細胞表位YNYLYRLF(SEQ ID NO:9)或VNFNFNGL (SEQ ID NO:11)之肽脈衝2小時。這二個表位係位於SARS-CoV-2棘蛋白之S1次單位的RBD區中。每20分鐘藉由輕拍將細胞混合。接著將經肽脈衝之EL4細胞洗滌二次以移除任何多餘肽且以20至50µCi之51 Cr標示45至60分鐘。將細胞洗滌二次以移除多餘51 Cr並以2×104 個經肽脈衝之放射標示目標細胞/100 µl體積重懸。
效應細胞係自經收集之接種動物的脾臟製備。脾細胞之單一細胞懸浮液之稀釋係藉由使細胞在重懸於完全培養基中之前通過70 µM細胞過濾器及ACK裂解來製備。將細胞以2×107 個細胞/ml重懸且以3倍連續稀釋分配至孔。
將目標細胞添加至含有效應細胞之孔中且培育6小時。以最大釋放對照而言，將100 µl之Triton X添加至孔以裂解細胞並完全釋放鉻至培養基中。在培育之後，將板以1200 rpm離心5分鐘並將30 µl之上清液轉移至Luma板以測量放射活性。允許板乾燥隔夜且隔天在Microbeta2板讀取儀上評估。各濃度之效應細胞的裂解百分比係使用下式判定：
特異性裂解百分比=[樣本51 Cr釋放(cpm)-自發釋放(cpm)]/[最大釋放(cpm)-自發釋放(cpm)]×100%。結果
結果顯示經肽YNYLYRLF(SEQ ID NO:9)及VNFNFNGL(SEQ ID NO:11)脈衝之目標細胞有特異性裂解(圖21A、B)，表明疫苗產生表位特異性細胞毒性T細胞。結果看起來具有表位特異性，其中對照小鼠及對照目標細胞(分別為SMX06接種小鼠及未經脈衝之目標細胞)未偵測到裂解(圖21C)。結論
單一免疫接種SCV-COVID19C產生SARS-CoV-2表位特異性溶細胞T淋巴細胞反應。書目
Figure 02_image005
Figure 02_image007
Figure 02_image009
[圖1]：痘病毒表現卡匣係經合成(A、B、F及G)或藉由PCR建構(C、D及E)以用於SARS-CoV-2 S、M、N及E。 A.包含在合成的早期/晚期啟動子(prPs)之轉錄控制下之SARS-CoV-2棘蛋白的表現卡匣。 B.包含在天然早期/晚期啟動子(pr7.5)之轉錄控制下之SARS-CoV-2棘蛋白的表現卡匣。 C.包含在合成的早期/晚期啟動子(prPs)之轉錄控制下之SARS-CoV-2棘蛋白之S1次單位的表現卡匣。 D.包含在禽痘早期/晚期啟動子(prE/L)之轉錄控制下之SARS-CoV-2膜蛋白的表現卡匣。 E.包含在合成的早期/晚期啟動子(prPs)之轉錄控制下之SARS-CoV-2核鞘蛋白的表現卡匣。 F.包含在禽痘早期/晚期啟動子(prE/L)之轉錄控制下之SARS-CoV-2膜蛋白及在合成的早期/晚期啟動子(prPs)之轉錄控制下之SARS-CoV-2核鞘蛋白的表現卡匣。 G.包含在合成的早期/晚期啟動子(prPs)之轉錄控制下之SARS-CoV-2包膜蛋白的表現卡匣。 [圖2]：由F1及F2重組臂指示之相對於痘瘡病毒哥本哈根株(VACV-COP)基因體之同源重組位點。 A.VACV-COP之A39R區與F1-A39R及F2-A39R同源重組臂，該等同源重組臂側接SCV-SMX06中經刪除之VACV-COP區且該等同源重組臂之間可插入SARS-CoV-2抗原。 B.VACV-COP之A41L區與F1-A41L及F2-A42L同源重組臂，該等同源重組臂側接SCV-SMX06中經刪除之VACV-COP區且該等同源重組臂之間可插入SARS-CoV-2抗原。 C.VACV-COP之B7/B8R區與F1-B7B8R及F2-B7B8R同源重組臂，該等同源重組臂側接SCV-SMX06中經刪除之VACV-COP區且該等同源重組臂之間可插入SARS-CoV-2抗原。 D.VACV-COP之C3L區與F1-C3L及F2-C3L同源重組臂，該等同源重組臂側接SCV-SMX06中經刪除之VACV-COP區且該等同源重組臂之間可插入SARS-CoV-2抗原。 E.VACV-COP之D13L區與F1-D13L及F2-D13L同源重組臂，該等同源重組臂側接SCV-SMX06中經刪除之VACV-COP區且該等同源重組臂之間可插入SARS-CoV-2抗原。 F.VACV-COP之J2R-J3R基因間區與側接VACV-COP區之F1-J2/J3R及F2-J2/J3R同源重組臂，該等同源重組臂之間可插入SARS-CoV-2抗原。 [圖3]：用於SARS-CoV-2轉殖基因之同源重組(HR)卡匣的詳細圖譜及元件。 A.用於A41L置換之HR卡匣，其包含prPs SARS-CoV-2棘表現卡匣。 B.用於A41L置換之HR卡匣，其包含pr7.5 SARS-CoV-2棘表現卡匣。 C.用於A41L置換之HR卡匣，其包含prPs SARS-CoV-2棘S1次單位表現卡匣。 D.用於D13L置換之HR卡匣，其包含prE/L SARS-CoV-2膜及prPs SARS-CoV-2核鞘表現卡匣。 E.用於插入至基因間位點J2/J3R中之HR卡匣，其包含prE/L SARS-CoV-2膜及prPs SARS-CoV-2核鞘表現卡匣。 F.用於C3L置換之HR卡匣，其包含prE/L SARS-CoV-2膜表現卡匣。 G.用於D13L置換之HR卡匣，其包含prPs SARS-CoV-2核鞘表現卡匣。 H.用於B7/B8R置換之HR卡匣，其包含prPs SARS-CoV-2包膜表現卡匣。 [圖4]：疫苗建構過程示意圖。 [圖5]：在SCV-COVID19疫苗內之SARS-CoV-2抗原插入區。 A.經取代至A41L ORF中之在合成的早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2棘轉殖基因。 B.經取代至A41L ORF中之在天然早期/晚期啟動子之轉錄控制下之SARS-CoV-2棘轉殖基因。 C.經取代至A41L ORF中之SARS-CoV-2棘轉殖基因之S1次單位。 D.置換D13L ORF之SARS-CoV-2膜及核鞘轉殖基因。 E.經插入至J2R與J3R ORF之間的基因間區中之SARS-CoV-2膜及核鞘轉殖基因。 F.置換B7/B8R ORF之SARS-CoV-2包膜轉殖基因。 G.置換C3L ORF之SARS-CoV-2膜轉殖基因。 H.置換D13L ORF之SARS-CoV-2核鞘轉殖基因。 [圖6]：SCV-COVID19D之單一免疫接種在遠交及近交小鼠中產生中和SARS-CoV-2抗體及偏Th1抗體輪廓。 A.在SCV-COVID19D單劑免疫接種之後第21天遠交ARC(s)及近交C57BL/6品系中之病毒特異性中和抗體的水準。 B.在SCV-COVID19D單劑免疫接種之後第21天遠交ARC(s)及近交C57BL/6品系中之S1特異性抗體的水準。 C.在SCV-COVID19D單劑免疫接種之後第21天遠交ARC(s)及近交C57BL/6品系中之IgG2c(Th1)及IgG1(Th2)抗體的水準。 [圖7]：SCV-COVID19D之單一免疫接種產生棘特異性CD8 T細胞反應。 A.在SCV-COVID19D單劑免疫接種之後藉由細胞內細胞介素染色(ICS)之棘特異性IFNγ+ CD8 T細胞的水準。 B.在SCV-COVID19D單劑免疫接種之後藉由ELISpot之棘特異性IFNγ+ CD8 T細胞的水準。 [圖8]：SCV-COVD19C比起SCV-COVID19D誘發較佳棘特異性抗體 A.藉由西方墨點轉漬法偵測經SCV-COVID19疫苗感染之細胞中的棘抗原表現。 B.在SCV-COVID19C、SCV-COVID19D及SCV- COVID19F單劑免疫接種之後第21天S1特異性抗體的水準。 [圖9]：SCV-COVID19C之單一免疫接種在近交及遠交小鼠中誘導抗體反應。 A.在SCV-COVID19C單劑免疫接種之後第14天遠交ARC(s)及近交C57BL/6品系中之S1特異性抗體的水準。 B.在SCV-COVID19C單劑免疫接種之後第14天遠交ARC(s)及近交C57BL/6品系中之S1特異性抗體的力價。 C.在SCV-COVID19C單劑免疫接種之後第14天遠交ARC(s)及近交C57BL/6品系中之中和抗體的水準。 [圖10]：用於識別三重細胞介素生產CD8 T細胞之圈選策略。 [圖11]：SCV-COVID19C之單一免疫接種誘導強健的棘特異性T細胞反應。 A.代表性流式細胞圖顯示在SCV-COVID19C單劑免疫接種之後偵測到棘特異性IFNγ+ CD8 T細胞。 B.在SCV-COVID19C單劑免疫接種之後具棘池1(S1)特異性(左)、棘池2(S2)特異性(中)及表位特異性(右)之單一、雙重及三重細胞介素生產IFNγ+ CD8 T細胞的總數圖形摘要。 C.在SCV-COVID19C單劑免疫接種之後顆粒溶解酶B生產CD8 T細胞之代表性流式細胞圖及圖形摘要。 D.在SCV-COVID19C單劑免疫接種之後S1及S2特異性三重細胞介素生產CD4 T細胞的總數。 [圖12]：既有免疫力不影響在投予單次劑量的SCV-COVID19C疫苗之後之棘特異性抗體反應的數量及品質。 A.在SCV-COVID19C單劑免疫接種之後第28、44及80天具有及不具既有免疫力小鼠之S1特異性抗體的水準。 B.在SCV-COVID19C單劑免疫接種之後第28、44及80天具有及不具既有免疫力小鼠之中和抗體的水準。 [圖13]：既有免疫力不影響在初免-追加免疫接種之後棘特異性抗體反應的數量及品質。 A.在SCV-COVID19C同源初免-追加免疫接種第28天(追加前)及追加劑量後第14及50天具有及不具既有免疫力之小鼠的S1特異性抗體水準。 B.在SCV-COVID19C同源初免-追加免疫接種第28天(追加前)及追加劑量後第14及50天具有及不具既有免疫力之小鼠的中和抗體水準。 [圖14]：SCV-COVID19C之單一免疫接種在老化小鼠中誘導抗原特異性抗體反應。 A.在SCV-COVID19C單劑免疫接種之後第14及21天年輕及老化小鼠之S1特異性抗體的水準。 B.在SCV-COVID19C單劑免疫接種之後第14及21天年輕及老化小鼠之中和抗體的水準。 [圖15]：同源初免-追加導致免疫接種後維持長達3個月之顯著增強的抗體反應。 A.在SCV-COVID19C單劑免疫接種之後第21天及在SCV-COVID19C同源初免-追加免疫接種之後追加後第21天年輕及老化小鼠之S1特異性抗體的水準。 B.在SCV-COVID19C單劑免疫接種之後第21天及在SCV-COVID19C同源初免-追加免疫接種之後追加後第21天年輕及老化小鼠之中和抗體的水準。 C.在SCV-COVID19C同源初免-追加免疫接種之後追加後第3、9及12週年輕及老化小鼠之中和抗體的水準。 [圖16]：使用細胞表面標記識別T細胞記憶細胞類型之流式細胞圈選策略。 [圖17]：同源初免-追加SCV-COVID19C誘導長期T細胞反應。 A.在年輕及老化小鼠的SCV-COVID19C單劑免疫接種3個月之後及SCV-COVID19C同源初免-追加免疫接種之後追加後3個月短命效應細胞(TSLE )、效應記憶(TEM )及中央記憶(TCM )CD8 T細胞的總數。 B.在年輕及老化小鼠的SCV-COVID19C單劑免疫接種3個月之後及SCV-COVID19C同源初免-追加免疫接種之後追加後3個月棘特異性IFNγ+ CD8 T細胞的水準。 C.在年輕及老化小鼠的SCV-COVID19C單劑免疫接種3個月之後及SCV-COVID19C同源初免-追加免疫接種之後追加後3個月藉由ELISpot偵測之S1、RBD及S2特異性IFNγ+ 斑點形成單位的水準。 D.在年輕及老化小鼠的SCV-COVID19C單劑免疫接種3個月之後及SCV-COVID19C同源初免-追加免疫接種之後追加後3個月藉由ICS偵測之S1、RBD及S2特異性IFNγ+ CD8 T細胞的百分比。 E.在年輕及老化小鼠的SCV-COVID19C單劑免疫接種3個月之後及SCV-COVID19C同源初免-追加免疫接種之後追加後3個月藉由ICS偵測之S1、RBD及S2特異性三重細胞介素生產CD8 T細胞的總數。 [圖18]：同源初免-追加SCV-COVID19C可基於棘RBD中之CD8 T細胞表位潛在地與SARS-CoV交互作用。 A.在SCV-COVID19C單劑免疫接種之後第7天藉由ELISpot之表位特異性IFNγ+ CD8 T細胞的水準。 B.代表性流式細胞圖顯示在SCV-COVID19C單劑免疫接種之後第7天藉由ICS之表位特異性IFNγ+ CD8 T細胞。 [圖19]：SCV-COVID19A之單一免疫接種產生棘特異性及膜特異性CD8 T細胞反應。 A.在SCV-COVID19A單劑免疫接種之後第21天S1、RBD及S2特異性IFNγ+ CD8 T細胞的水準。 B.在SCV-COVID19A單劑免疫接種之後第21天膜特異性IFNγ+ CD8 T細胞的水準。 C.在SCV-COVID19A單劑免疫接種之後第21天核鞘特異性IFNγ+ CD8 T細胞的水準。 [圖20]：相等比例之SCV-COVID19C與SCV- COVID19G之單一免疫接種誘導針對棘蛋白及膜蛋白的棘特異性抗體反應及CD8+ T細胞反應。 A.在以包含SCV-COVID19C及SCV-COVID19G之混合疫苗進行單劑免疫接種之後第21天S1特異性抗體的水準。 B.在以包含SCV-COVID19C及SCV-COVID19G之混合疫苗進行單劑免疫接種之後第21天S1特異性抗體的力價。 C.在以包含SCV-COVID19C與SCV-COVID19G之混合疫苗進行單劑免疫接種之後藉由細胞內細胞介素染色(ICS)之棘特異性IFNγ+ 生產T細胞反應的水準。 D.在以包含SCV-COVID19C與SCV-COVID19G之混合疫苗進行單劑免疫接種之後藉由ELISpot之棘及膜特異性IFNγ+ 生產T細胞反應的水準。 [圖21]：SCV-COVD19C之單一免疫接種產生表位特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性。 A.在免疫接種後第7天抗經肽YNYLYRLF(SEQ ID NO:9)脈衝之目標細胞之CTL反應。 B.在免疫接種後第7天抗經肽VNFNFNGL(SEQ ID NO:11)脈衝之目標細胞之CTL反應。 C.抗未經脈衝之目標細胞之CTL反應。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026

Claims (20)

  1. 一種用於提升動物的免疫反應以預防或降低SARS-CoV-2冠狀病毒疾病之風險之組成物，該組成物包含經基因工程改造之減毒的痘瘡病毒，其中該痘瘡病毒基因體包含核酸序列，該核酸序列編碼至少一種人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽，該至少一種人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽選自由棘蛋白多肽或其免疫原性部分、膜蛋白多肽或其免疫原性部分、核鞘蛋白多肽或其免疫原性部分及包膜蛋白多肽或其免疫原性部分所組成之群組，其中該減毒的痘瘡病毒包含刪除至少一個編碼內源性必需組成或成熟蛋白之基因。
  2. 如請求項1之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒基因體包含編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2棘蛋白多肽或其免疫原性部分之核酸序列。
  3. 如請求項1之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒基因體包含編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2膜蛋白多肽或其免疫原性部分之核酸序列。
  4. 如請求項1之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒基因體包含編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2核鞘蛋白多肽或其免疫原性部分之核酸序列。
  5. 如請求項1之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒基因體包含編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2膜蛋白多肽或其免疫原性部分及核鞘蛋白多肽或其免疫原性部分之核酸序列。
  6. 如請求項1之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒基因體包含編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2之棘蛋白多肽或其免疫原性部分及膜蛋白多肽或其免疫原性部分及核鞘蛋白多肽或其免疫原性部分之核酸序列。
  7. 如請求項1之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒基因體包含編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2棘多肽或其免疫原性部分及膜蛋白多肽或其免疫原性部分及核鞘蛋白多肽或其免疫原性部分及包膜蛋白多肽或其免疫原性部分之核酸序列。
  8. 如請求項1之組成物，其中編碼至少一種人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽之該核酸序列係插入至一或多個免疫調節基因之經刪除之開讀框(ORF)中，該一或多個免疫調節基因選自由COP-C23L、COP-B29R、COP-C3L、COP-N1L、COP-A35R、COP-A39R、COP-A41L、COP-A44R、COP-A46R、COP-B7R、COP-B8R、COP-B13R、COP-B16R及COP-B19R所組成之群組。
  9. 如請求項1之組成物，其中編碼至少一種人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽之該核酸序列係插入至該減毒的痘瘡病毒基因體之基因間區(IGR)中，其中該IGR係位於該痘瘡病毒基因體之二個相鄰ORF之間或與該二個相鄰ORF側接。
  10. 如請求項9之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒基因體之該IGR係選自由下列所組成之群組：F9L-F10L、F12L-F13L、F17R-E1L、E1L-E2L、E8R-E9L、E9L-E10R、I1L-I2L、I2L-I3L、I5L-I6L、I6L-I7L、I7L-I8R、I8R-G1L、G1L-G3L、G3L-G2R、G2R-G4L、G4L-G5R、G5R-G5.5R、G5.5R-G6R、G6R-G7L、G7L-G8R、G8R-G9R、G9R-L1R、L1R-L2R、L2R-L3L、L3L-L4R、L4R-L5R、L5R-J1R、J3R-J4R、J4R-J5L、J5L-J6R、J6R-H1L、H1L-H2R、H2R-H3L、H3L-H4L、H4L-H5R、H5R-H6R、H6R-H7R、H7R-D1R、D1R-D2L、D2L-D3R、D3R-D4R、D4R-D5R、D5R-D6R、D6R-D7R、D9R-D10R、D10R-D11L、D11L-D12L、D12L-D13L、D13L-A1L、A1L-A2L、A2L-A2.5L、A2.5L-A3L、A3L-A4L、A4L-A5R、A5R-A6L、A6L-A7L、A7L-A8R、A8R-A9L、A9L-A10L、A10L-A11R、A11R-A12L、A12L-A13L、A13L-A14L、A14L-A14.5L、A14.5L-A15L、A15L-A16L、A16L-A17L、A17L-A18R、A18R-A19L、A19L-A21L、A21L-A20R、A20R-A22R、A22R-A23R、A23R-A24R、A28L-A29L及A29L-A30L、001L-002L、002L-003L、005R-006R、006L-007R、007R-008L、008L-009L、017L-018L、018L-019L、019L-02OL、020L-021L、023L-024L、024L-025L、025L-026L、028R-029L、03OL-031L、031L-032L、032L-033L、035L-036L、036L-037L、037L-038L、039L-040L、043L-044L、044L-045L、046L-047R、049L-050L、050L-051L、051L-052R、052R-053R、053R-054R、054R-055R、055R-056L、061L-062L、064L-065L、065L-066L、066L-067L、077L-078R、078R-079R、080R-081R、081R-082L、082L-083R、085R-086R、086R-087R、088R-089L、089L-090R、092R-093L、094L-095R、096R-097R、097R-098R、101R-102R、103R-104R、105L-106R、107R-108L、108L-109L、109L-110L、110L-111L、113L-114L、114L-115L、115L-116R、117L-118L、118L-119R、122R-123L、123L-124L、124L-125L、125L-126L、133R-134R、134R-135R、136L-137L、137L-138L、141L-142R、143L-144R、144R-145R、145R-146R、146R-147R、147R-148R、148R-149L、152R-153L、153L-154R、154R-155R、156R-157L、157L-158R、159R-160L、160L-161R、162R-163R、163R-164R、164R-165R、165R-166R、166R-167R、167R-168R、170R-171R、173R-174R、175R-176R、176R-177R、178R-179R、179R-180R、180R-181R、183R-184R、184R-185L、185L-186R、186R-187R、187R-188R、188R-189R、189R-190R及192R-193R。
  11. 如請求項1之組成物，其中該減毒的痘瘡病毒包含刪除一或多個選自由痘瘡病毒A41L基因、痘瘡病毒D13L基因、痘瘡病毒B7R-B8R基因、痘瘡病毒A39R基因及痘瘡病毒C3L基因所組成之群組的基因。
  12. 如請求項11之組成物，其中該至少一種編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽之核酸序列係插入至該一或多個基因之至少一個刪除位點中。
  13. 如請求項12之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2棘蛋白多肽或其免疫原性部分係插入至痘瘡病毒A41L基因刪除位點中。
  14. 如請求項12之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2膜蛋白多肽或其免疫原性部分及核鞘蛋白多肽或其免疫原性部分係插入至痘瘡病毒D13L基因刪除位點中。
  15. 如請求項12之組成物，其中人冠狀病毒SARS-CoV-2包膜蛋白多肽或其免疫原性部分係插入至痘瘡病毒B7R-B8R基因刪除位點中。
  16. 如請求項12之組成物，其中該人冠狀病毒SARS-CoV-2多肽係由一或多個表現卡匣編碼，該一或多個表現卡匣具有選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8所組成之群組的核酸序列。
  17. 如請求項1之組成物，其包含醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。
  18. 一種用於提升動物的免疫反應以降低冠狀病毒疾病之風險之組成物，該組成物包含經基因工程改造之減毒的痘瘡病毒摻合第二經基因工程改造之減毒的痘瘡病毒，其中該痘瘡病毒基因體包含核酸序列，該核酸序列編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2之棘蛋白多肽或其免疫原性部分，且其中該減毒的痘瘡病毒包含刪除至少一個編碼內源性必需組成或成熟蛋白之基因，其中該第二痘瘡病毒基因體包含核酸序列，該核酸序列編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2之膜蛋白多肽及核鞘蛋白多肽或彼等之免疫原性部分，且其中該第二減毒的痘瘡病毒包含刪除至少一個編碼內源性必需組成或成熟蛋白之基因。
  19. 一種經基因工程改造之減毒的痘瘡病毒載體，其中該痘瘡病毒基因體包含核酸序列，該核酸序列編碼人冠狀病毒SARS-CoV-2之棘蛋白多肽、膜蛋白多肽及核鞘蛋白多肽及/或包膜蛋白多肽，其中該減毒的痘瘡病毒載體表現該等前述多肽，該等前述多肽組裝成病毒樣粒子。
  20. 一種用於預防或降低SARS-CoV-2感染風險之方法，其包含向動物(包括人)投予有效誘發對抗SARS-CoV-2之免疫反應的量之如請求項1之組成物。
TW110110868A 2020-03-31 2021-03-25 用於防範ｃｏｖｉｄ－１９之以減毒的痘病毒載體為底質之疫苗 TW202203966A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063003012P 2020-03-31 2020-03-31
US63/003,012 2020-03-31
US202063066927P 2020-08-18 2020-08-18
US63/066,927 2020-08-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202203966A true TW202203966A (zh) 2022-02-01

Family

ID=77855122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW110110868A TW202203966A (zh) 2020-03-31 2021-03-25 用於防範ｃｏｖｉｄ－１９之以減毒的痘病毒載體為底質之疫苗

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20210299245A1 (zh)
EP (1) EP4126037A4 (zh)
JP (1) JP2023520080A (zh)
KR (1) KR20230034933A (zh)
CN (1) CN115605225A (zh)
AU (1) AU2021245269A1 (zh)
BR (1) BR112022019949A2 (zh)
CA (1) CA3173795A1 (zh)
TW (1) TW202203966A (zh)
WO (1) WO2021195694A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114395017A (zh) * 2021-10-29 2022-04-26 中国科学院深圳先进技术研究院 SARS-CoV-2病毒样颗粒的制备方法及其应用
CN114032217A (zh) * 2021-11-02 2022-02-11 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心 基于dna载体和复制型痘苗病毒载体的新冠病毒复合型疫苗
WO2023092028A1 (en) * 2021-11-17 2023-05-25 City Of Hope Methods of preventing, treating, or reducing the severity of covid-19 in immunocompromised blood cancer patients
CN114605506B (zh) * 2022-04-08 2024-05-07 湖南大学 冠状病毒m蛋白胞外域多肽及其应用
CN114874999B (zh) * 2022-04-22 2023-04-21 中国医学科学院病原生物学研究所 一种基于痘苗病毒载体的新型冠状病毒病毒样颗粒疫苗
EP4316513A1 (en) * 2022-08-02 2024-02-07 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) New dna sars-cov-2 vaccine

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843456A (en) * 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
NZ536502A (en) * 2002-05-16 2005-10-28 Bavarian Nordic As Recombinant poxvirus expressing homologous genes inserted into the poxviral genome for inducing an immune response in a mammal
EP1678292A4 (en) * 2003-09-18 2008-05-07 Univ Emory IMPROVED MVA VACCINES
WO2006071250A2 (en) * 2004-04-05 2006-07-06 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Soluble fragments of the sars-cov spike glycoprotein
US20060286124A1 (en) * 2004-06-30 2006-12-21 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vaccine compositions and methods of treating coronavirus infection
AR110624A1 (es) * 2016-08-19 2019-04-17 Sementis Ltd Vacunas virales
GB201708444D0 (en) * 2017-05-26 2017-07-12 Univ Oxford Innovation Ltd Compositions and methods for inducing an immune response

Also Published As

Publication number Publication date
JP2023520080A (ja) 2023-05-15
US20210299245A1 (en) 2021-09-30
US20230381297A1 (en) 2023-11-30
BR112022019949A2 (pt) 2022-12-13
KR20230034933A (ko) 2023-03-10
CN115605225A (zh) 2023-01-13
EP4126037A1 (en) 2023-02-08
EP4126037A4 (en) 2024-06-19
CA3173795A1 (en) 2021-10-07
AU2021245269A1 (en) 2022-10-20
WO2021195694A1 (en) 2021-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW202203966A (zh) 用於防範ｃｏｖｉｄ－１９之以減毒的痘病毒載體為底質之疫苗
JP6818797B2 (ja) 強靭なｔ細胞用のｐｒ１３．５プロモータ及び抗体応答
US10588961B2 (en) Poxviral vaccines
KR20170048396A (ko) 재조합 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (mva) 필로바이러스 백신
US20210113684A1 (en) Vector-based attenuated poxvirus vaccines
US8623381B2 (en) Viral strains derived from the vaccinia virus Lister VACV-107 and uses thereof
Xia et al. Mpox virus mRNA-lipid nanoparticle vaccine candidates evoke antibody responses and drive protection against the Vaccinia virus challenge in mice
CN108503696B (zh) 一种酵母细胞表达的寨卡病毒亚单位疫苗
JP5584407B2 (ja) Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス
US20130177582A1 (en) Parapoxvirus expressing the vp60 major capsid protein of the rabbit haemorrhagic disease virus
KR20230022206A (ko) 코로나바이러스 질환에 대응하는 재조합적 변형된 우두증 바이러스 앙카라 (mva) 백신
RU2778312C2 (ru) Вирусные вакцины
JP6620111B2 (ja) Ｃ型肝炎の治療及び／又は予防用医薬組成物
García-Arriaza et al. MVA-based vaccine against COVID-19 expressing SARS-CoV-2 antigens
TW202334434A (zh) 對抗嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型之基於痘病毒的疫苗及使用該疫苗的方法
Mutungi Humoral immune responses against novel recombinant replication-competent poxvirus candidate vaccines expressing full length and chimeric lyssavirus glycoprotein genes
Evans Humoral immune responses against novel recombinant replication-competent poxvirus candidate vaccines expressing full length and chimeric lyssavirus glycoprotein genes