KR20230034933A - Covid-19에 대한 보호를 위한 약독화된 폭스바이러스 벡터 기반 백신 - Google Patents

Covid-19에 대한 보호를 위한 약독화된 폭스바이러스 벡터 기반 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코로나바이러스 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세계 보건 기구에 의해 COVID-19로 명명된 SARS-CoV-2 질환의 위험을 예방 또는 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 백신 및/또는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 조성물은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하며, 여기서 약독화된 폭스바이러스 게놈은 스파이크 단백질 폴리펩티드 및/또는 막 단백질 폴리펩티드 및/또는 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 및/또는 엔벨로프 단백질 폴리펩티드 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 코로나바이러스 SARS-CoV-2 핵산 서열을 포함한다.

Description

COVID-19에 대한 보호를 위한 약독화된 폭스바이러스 벡터 기반 백신
본 발명은 코로나바이러스 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세계 보건 기구에 의해 COVID-19로 명명된 SARS-CoV-2 질환의 위험을 예방 또는 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 백신 및/또는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 조성물은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하며, 여기서 약독화된 폭스바이러스 게놈은 스파이크 단백질 폴리펩티드 및/또는 막 단백질 폴리펩티드 및/또는 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 및/또는 엔벨로프 단백질 폴리펩티드 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 코로나바이러스 SARS-CoV-2 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서의 참고문헌에 대한 서지 세부사항은 본 명세서의 말미에 나열되어 있다.
본 명세서에서 임의의 이전 공개문 (또는 이로부터 나온 정보), 또는 공지된 임의의 문제에 대한 언급은, 이전 공개문 (또는 이로부터 나온 정보) 또는 공지된 문제가 본 명세서와 관련된 노력 분야에서 일반적인 상식의 일부를 형성한다는 것의 인정 또는 승인 또는 임의의 형태의 제안이 아니며 그렇게 받아들여져서도 안된다.
본 명세서에 언급된 모든 공개문은 전체가 참조로 본원에 포함된다.
폭스바이러스 과는 2개의 아과, 코르도폭스비리나에(Chordopoxvirinae) 및 엔토모폭스비리나에(Entomopoxvirinae)를 포함한다. 코르도폭스비리나에는 인간을 감염시키는 종을 포함하는 오르토폭스비리다에(Orthopoxviridae) (예를 들어, 천연두의 유발인자인 바리올라 바이러스, 카우폭스 바이러스 (1796년 제너(Jenner)에 의해 보고된 최초 천연두 백신 형성), 백시니아 바이러스 (제2 세대 천연두 백신으로 사용) 및 몽키폭스 바이러스), 및 조류를 감염시키는 종을 포함하는 아비폭스비리다에(Avipoxviridae) 바이러스, 예컨대 파울폭스 및 카나리폭스 바이러스를 포함하여 8개의 속을 포함한다. 천연두 백신에서 항원으로 사용하는 것 외에, 재조합 백시니아-기반 바이러스 및 아비폭스 바이러스를 "백본" 벡터로 사용하는데 많은 관심이 있다. 세포질내 벡터로서, 오르토폭스비리다에는 특히 숙주 면역계에 의한 인식을 위해 숙주 세포질에서 외래 항원의 생산을 유도할 수 있다. 외래 항원을 발현하는 이러한 벡터는 다른 백신접종 전략으로 치료하기 어려운 것으로 입증된 AIDS, 결핵, 말라리아, 암과 같은 질환에 대한 백신 개발에서 집중적으로 연구된다.
코르도폭스비리나에는 파라폭스바이러스의 경우 130 kb부터 아비폭스바이러스의 경우 300 kb를 초과하는 크기 범위의 선형 이중-가닥 DNA 게놈을 가지며, 숙주에서의 수명 주기는 전적으로 숙주 세포 세포질에서 소비된다. 폭스바이러스는 특히 초기 mRNA 합성에 수반된 프로세스에 대해 주로 숙주 세포 및 숙주 세포 분자와 독립적으로 작동한다. 그러나, 숙주 분자는 중간 및 후기 바이러스 전사의 개시 또는 종결에 사용되는 것으로 보이다. 폭스바이러스는 세포 조건이 바이러스 복제를 허용하는 것을 가능하게 하도록 숙주 신호전달 경로를 구체적으로 표적화하고 조작하는 구조적으로 다양한 "숙주 범위 인자"를 생산한다. 대부분의 폭스바이러스는 포유동물 세포에 결합하고 이를 감염시킬 수 있지만, 후속 감염이 허용적인지 (감염성 비리온 생산 가능) 또는 비-허용적인지 (감염 비리온 생산이 실질적으로 불가능)의 여부는 특정 폭스바이러스 및 수반된 특정 세포 유형에 따라 다르다. 숙주 범위 유전자에 대한 검토를 위해, 문헌 (Werden et al. 2008, 전체가 본원에 포함됨)을 참조한다.
천연두 백신으로 및 후속적으로 바이러스 벡터로의 사용과 관련된 백시니아 스트레인은 1960년대 초부터 현재까지 공개되었다. 천연두 백신으로 사용되는 스트레인을 포함하는 특정 백시니아 스트레인은 인간 세포에서 증식할 수 있으므로 바이러스성 뇌염의 발병과 같은 건강 위험을 나타낸다. 보다 안전한 백신을 개발하기 위해, 앙카라(Ankara)로부터의 백시니아 스트레인 ("CVA"로 지칭됨)은 비-인간 세포에서 500회 초과로 계대되었다. 이 프로세스 동안, 백시니아 게놈은 원래 CVA 게놈과 비교하여 적어도 6개의 주요 결실의 발생을 수반하여 실질적으로 변경되었다. 변형된 바이러스는 포유동물 세포에서의 복제 결핍으로 인해 덜 병원성이었지만, 여전히 보호 면역 반응을 일으킬 수 있었다. 이 약독화된 백시니아 바이러스는 MVA (변형된 백시니아 앙카라)로 지칭되며, 상이한 계대 번호를 갖는 바이러스가 유전적으로 및 표현형적으로 구별되는 것으로 밝혀졌기 때문에 계대 번호로 분류된다. 그러나, 계대 번호 515, MVA515가 유전적으로 안정적인 것으로 결정되었다. 1990년대 초, MVA572와 같은 MVA 스트레인 및 그의 유도체, MVA F6이 비-허용 세포 (바이러스가 증식하지 않을 세포)에서 높은 수준으로 백시니아 단백질 및 이종 (재조합) 단백질을 발현할 수 있다는 것이 관찰되었으며, 이는 백신 또는 요법 전달을 위한 항원을 코딩하는 것들과 같은 관심 이종 분자에 대한 벡터로서 MVA의 개발을 가능하게 한다. MVA는 폭스바이러스 백신 벡터 시스템 중에서 가장 많이 연구되었지만, NYVAC, ALVAC 및 파울폭스와 같은 다른 폭스바이러스도 유사한 방식으로 기능하도록 개발되었다.
세멘티스 리미티드(Sementis Ltd)에 의해 개발된 또 다른 백시니아 바이러스는 소위 SCV (세멘티스 코펜하겐 백시니아) 백시니아 바이러스 벡터이다. SCV는 백시니아의 코펜하겐 스트레인을 사용하여 생성되었으며, 필수 바이러스 어셈블리 단백질을 코딩하는 D13L의 결실에 의해 조작되었으므로 SCV는 복제 및 감염성 자손을 생성할 수 없다. 게놈 증폭은 SCV-감염된 세포에서 보존되어 백신 항원의 후기 발현 및 삽입된 항원에 대한 강력한 면역 반응의 생성을 허용한다. SCV는 복제 적격 백시니아의 면역원성을 보유하고 시험된 포유동물 세포에서 복제할 수 없다는 점에서 MVA에 비해 많은 이점을 보유한다. SCV 플랫폼은 MVA 플랫폼과 2가지 주요 차이점을 가지고 있다: 즉, (i) D13L 유전자의 표적화된 결실을 통해 복제-결핍이 되도록 특별히 조작되어 단일 샷 효능으로 효력을 유지하면서 더 안전하고, (ii) 또한 표준의 확장가능한 상용 세포주에서 제조되도록 설계된다.
코로나바이러스는 대략 27-32 킬로베이스의 포지티브-센스 단일-가닥 RNA로 이루어진 RNA 바이러스이다. 이름이 나타내는 바와 같이, 구형 외부 스파이크 단백질은 전자 현미경 하에서 관찰할 때 특징적인 크라운 형상을 나타낸다. 이 바이러스는 인간을 포함한 광범위한 숙주를 감염시키는 것으로 공지되어 있다. 감염된 숙주는 무증상에서 중증 증상에 이르기까지 상이한 임상 과정을 나타낸다. 코로나바이러스는 코로나비리다에(Coronaviridae) 과에 속하며, 알파, 베타, 델타, 및 감마-코로나바이러스의 4개 속으로 나뉜다. CoV는 일반적으로 박쥐, 낙타 및 인간을 포함한 많은 종의 동물에서 발견된다. 때때로, 동물 CoV는 게놈 복제 또는 재조합 메커니즘 동안 오류에 의해 유전적 돌연변이를 획득할 수 있으며, 이는 인간에 대한 친화성을 더욱 확장할 수 있다. 최초의 인간 CoV는 1960년대 중반에 발견되었다. 2개의 알파 CoV 및 5개의 베타 CoV를 포함하여 총 7개의 인간 CoV 유형이 인간 호흡기 질환을 유발하는데 책임이 있는 것으로 확인되었다. 전형적으로, 이러한 CoV는 무증상 감염에서 발열, 기침 및 숨가쁨을 포함하는 중증 급성 호흡기 질환에 이르는 다양한 임상 증상을 유발할 수 있다. 다양한 중증도의 위장염 및 신경계 질환과 같은 다른 증상도 보고되었다.
코로나바이러스는 스파이크 (S), 막 (M), 엔벨로프 (E) 단백질 및 뉴클레오캡시드 (N) 단백질의 4가지 주요 구조적 단백질의 표준 세트를 함유한다. 비리온은 게놈 RNA 및 인산화된 뉴클레오캡시드 (N) 단백질로 구성된 뉴클레오캡시드를 갖는다. 뉴클레오캡시드는 인지질 이중층 내부에 묻혀 있으며 스파이크 (S) 단백질로 덮여 있다. 막 (M) 단백질 및 엔벨로프 (E) 단백질은 바이러스 엔벨로프의 S 단백질 사이에 위치된다.
스파이크 단백질은 코로나바이러스의 다양성 및 숙주 친화성을 결정하는 바이러스 표면으로부터 돌출된 막횡단 트리메트릭 당단백질로 구성된다. 스파이크는 2개의 기능적 서브유닛을 포함한다: 수용체-결합 도메인 (RBD)을 함유하고 숙주 세포 수용체에 대한 결합을 담당하는 S1 서브유닛 및 바이러스 및 세포 막의 융합을 위한 S2 서브유닛.
코로나바이러스 입자는 구조적 단백질이 삽입되는 지질 이중층에 의해 둘러싸인, 뉴클레오캡시드 인단백질과 바이러스 게놈 RNA의 상호작용에 의해 형성된, 나선형 뉴클레오캡시드 구조로 이루어진다. 삼중-스패닝 막 당단백질 M은 소포체-골지 중간 구획 (ERGIC)의 루멘으로 버딩하는 코로나바이러스의 어셈블리를 구동시킨다. 막 단백질은 바이러스 성분을 분류하여 비리온에 통합시키는 가장 풍부한 바이러스 단백질이다. 막 올리고머화는 ERGIC 막에서 막 단백질의 격자의 형성을 가능하게 한다. 스파이크 및 엔벨로프 단백질은 막 단백질과의 측면 상호작용을 통해 격자로 통합되는 반면, 뉴클레오캡시드 및 바이러스 RNA는 시토졸에 노출된 막 C-말단 도메인과 상호작용한다. 엔벨로프 단백질은 이온 채널을 형성하고 바이러스 형태형성 및 버딩에 중요한 역할을 하는 비로포린이지만, 이 프로세스는 현재까지 완전히 이해되지 않는다. SARS-CoV에 대한 연구에 따라 코로나바이러스 게놈으로부터 엔벨로프 유전자가 고갈되면 바이러스 성장 및 입자 형성이 크게 감소하는 것으로 나타났다. 뉴클레오캡시드 단백질은 비리온 내 통합을 위해 RNA 게놈을 자가-회합하고 캡슐화한다.
인간 코로나바이러스는 호흡기 감염을 유발하는 주요 병원체 중 하나이다. 2가지의 고병원성 바이러스, SARS-CoV 및 MERS-CoV는 인간에게 중증 호흡기 증후군을 유발하고, 다른 4가지의 인간 코로나바이러스 (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoVHKU1)는 경증의 상부 호흡기 질환을 유발한다. SARS-CoV는 2002-03년 동안 8422명의 환자를 수반하는 주요 발병을 유발하였고 전 세계적으로 29개국으로 퍼졌다. 2003년 7월 대만에서 SARS-CoV의 전파망이 차단되어 2004년 5월 이후 더 이상 인간에 대한 사례가 보고되지 않아 전염병이 억제되었다. MERS-CoV는 2012년 중동 국가에서 발생하여 그 안에 있는 국가에서 지속적인 풍토병을 유발하고 있으며 중동 지역 이외의 국가로 산발적으로 확산되고 있다. 2019년 말, 미지의 호흡기 감염의 제1 보고가 중국 우한으로부터 발생하였다. 감염원은 SARS-CoV-2로 불리는 새로운 코로나바이러스로 빠르게 확인되었으며 COVID-19라는 이 바이러스에 의해 질환이 유발되었다. 세계 보건 기구는 2020년 3월 11일에 팬데믹을 선언하였다. SARS-CoV-2의 감염 치사율은 0.16% 내지 1.60%의 범위이며, 2021년 2월 중순까지 SARS-CoV-2는 전 세계적으로 108.2백만명을 감염시키고 2.3백만명 사망을 유발하였다. SARS-CoV-2는 세계의 대부분이 폐쇄 조치를 채택하게 하였으며, 이는 엄청난 경제적 손실 및 인간의 고통을 초래하였다.
SARS-CoV-2는 인간 및 다른 포유동물에 널리 분포하는 오르토코로나비리나에(Orthocoronavirinae) 아과에 포함되는 엔벨로프 보유, 비-절편화, 포지티브 센스 RNA 바이러스이다. 사르베코바이러스 속의 일부로서, 직경은 약 65 내지 125 nm이고 단일 가닥 RNA를 함유하며 외부 표면에 클럽 형상의 당단백질 스파이크가 있어 바이러스에 크라운-유사 또는 코로나 모양을 제공한다. SARS-CoV-2는 이전에 확인된 SARS-CoV 및 MERS-CoV 이후의 새로운 β-코로나바이러스이며, 이는 폐부전 및 잠재적으로 치명적인 호흡기 감염을 초래하였다. 1차 감염자 1인당 2차 감염자에게 전파되는 능력을 나타내는 SARS-CoV-2의 번식 수는 WHO에 따르면 1.4 내지 2.5명 범위로 추정된다. 그러나, 글로벌 연구의 메타-분석은 번식 수를 2.87에 가깝게 추정한다. SARS-CoV-2의 번식 수는 각각 SARS-CoV 및 MERS와 같은 이전 감염성 코로나바이러스(0.95 및 0.91)보다 상당히 높다. 더 높은 번식 수에 대한 가능한 이유는 이 바이러스 스트레인의 고유한 생물학적 특색일 수 있다. 예를 들어, 인간은 호흡기 비말, 매개체, 공기 중 전파를 통한 환경 전파를 통해 감염된 인간과의 밀접한 신체 접촉과 같은 다양한 방법으로 감염될 수 있다. 또한, SARS-CoV-2 감염 환자는 최대 감염 2주까지 증상 특징을 나타내지 않을 수 있으며, 이는 감염자가 일반적으로 무증상 단계 동안 공동체에서 다른 사람들과 혼동되기 때문에 새로운 감염의 위험을 기하급수적으로 증가시킬 수 있다. 9명의 환자 샘플의 계통발생학적 분석에 따르면 SARS-CoV-2는 2003년 SARS 발병을 유발한 바이러스를 포함하여 공지된 인간-감염 코로나바이러스에 대한 것보다 2개의 박쥐-유래된 코로나바이러스 스트레인과 더 유사한 것으로 나타났다. 상이한 환자로부터의 서열은 99.9% 초과의 서열 동일성으로 거의 동일하였으며, 이는 SARS-CoV-2가 매우 짧은 기간 내에 단일 공급원으로부터 유래되었음을 시사한다. 현재 이용가능한 데이터는 SARS-CoV-2가 박쥐 저장소로부터 인간 집단을 감염시켰고 SARS-CoV-2가 인간 감염에 유리한 유전적 변화를 축적함으로써 박쥐 코로나바이러스로부터 진화했을 수 있음을 시사한다. 구조적 단백질 스파이크 및 막은 광범위한 돌연변이 변화를 갖는 것으로 나타난 반면, 엔벨로프 및 뉴클레오캡시드 단백질은 보존되었다. 현재 미지의 동물 종이 박쥐와 인간 사이의 중간 숙주 역할을 하는지의 여부는 불분명하다.
구조적 및 기능적 분석은 SARS-CoV-2의 RBD가 인간 안지오텐신-전환 효소 2 (ACE2) 수용체와 강력하게 상호작용함을 나타내었다. ACE2 발현은 폐, 심장, 회장, 신장 및 방광에서 가장 높았다. 폐에서, ACE2는 폐 상피 세포에서 높게 발현되었다. SARS-CoV-2가 ACE2 수용체에 결합한 후, 스파이크 단백질은 프로테아제 절단을 겪는다. 프라이밍을 위한 S1/S2 절단 부위에서의 절단 및 S2 서브유닛 내의 융합 펩티드에 인접한 위치인 S'2 부위에서의 활성화를 위한 절단으로 이루어진, SARS-CoV 및 MERS-CoV의 스파이크 단백질을 활성화시키기 위한 2단계 순차적 프로테아제 절단이 모델로 제안되었다. S1/S2 절단 부위에서 절단 후, S1 및 S2 서브유닛은 비-공유 결합 상태로 유지되고, 원위 S1 서브유닛은 예비융합 상태에서 막-고정된 S2 서브유닛의 안정화에 기여한다. S'2 부위에서의 후속 절단은 아마도 돌이킬 수 없는 구조적 변화를 통해 막 융합을 위한 스파이크를 활성화할 것이다. 코로나바이러스 스파이크는 다양한 상이한 프로테아제가 이를 절단하고 활성화할 수 있기 때문에 바이러스 중에서 독특하다. 코로나바이러스 중 SARS-CoV-2에 특이적인 특징은 S1/S2 부위에 푸린 절단 부위 ("RPPA" 서열)가 존재한다는 것이다. SARS-CoV-2의 S1/S2 부위는 절단 없이 어셈블리에 통합된 SARS-CoV 스파이크와 달리 생합성 동안 완전히 절단되었다. S1/S2 부위가 막횡단 프로테아제 세린 2 (TMPRSS2) 및 카텝신 L과 같은 다른 프로테아제에 의해 절단되기도 했지만, 푸린의 편재적 발현은 또한 증가된 병독성을 야기하는 보다 효율적인 바이러스 복제에 기여할 가능성이 있다. SARS-CoV-2에서, 바이러스 스파이크 단백질, 특히 RBD는 바이러스 진화에 대한 궤적이다. 2020년 10월부터 유럽, 브라질, 영국, 남아프리카에서 RBD 내 아미노산 변화로 확인된 바이러스의 진화가 검출되었다. 돌연변이의 축적으로 인해, 스파이크 RBD에 각각 8개의 돌연변이, 7개의 돌연변이 및 10개의 돌연변이 뿐만 아니라 1ab 오픈 리딩 프레임 (ORF)에서 3개의 아미노산의 결실을 갖는 영국, 남아프리카 및 브라질에서 발생하는 변이체에서 나타난 바와 같이, 2주마다 대략 1개의 돌연변이가 초래되었다. 이러한 SARS-CoV-2 변이 스트레인의 특징은 적응도가 향상된 바이러스 종으로 반복된 수렴 진화를 나타낸다. 이 현상에 대한 가능한 가설은, 만성 COVID-19 감염 동안 면역계가 면역을 회피하도록 바이러스에 큰 압력을 가하고 세포 침윤 메커니즘을 개선하여 바이러스가 반응하는 경우에 이러한 돌연변이가 발생한다는 것이다. 따라서, 이는 영국 돌연변이 스트레인 B.1.1.7에 의해 입증된 바와 같이 증가된 바이러스 부하 및 더 높은 전염성으로 해석된다. 바이러스-나이브 집단에서, 자연 면역 선택 압력은 변이체 출현의 주요 구동인자이다. 그러나, 백신-관련된 이유로 돌연변이가 잉태될 수 있는 '백신 선택 압력'의 가능성도 있다. 백신이 단일 항원에 대해서만 면역 반응을 일으키도록 지시되는 경우와 같이 백신이 제한된 면역 반응을 도출할 때 바이러스는 항원적으로 진화할 수 있다. 전체 집단에 걸쳐 백신 샷을 투여하는 시간 지연은 또한 잠재적으로 바이러스의 적응력에 영향을 미치고 면역 반응을 피하거나 저항하는데 도움이 될 수 있는 돌연변이를 유도할 수 있다. 회피 돌연변이체의 현상은 관심 변이체 (VOC) 출현에 대해 효과적으로 작용하는 백신에 대한 필요성을 강조한다. 기록된 돌연변이의 대부분이 스파이크 단백질에서 발생하기 때문에, 적절한 예방적 면역 반응을 보장하기 위해 더 넓은 범위의 면역원성을 유도하기 위해 다른 바이러스 항원을 활용할 수 있다.
중화 항체는 숙주 세포 내에서 바이러스에 결합하고 이를 중화시키며 예방 백신접종을 위한 면역의 주요 상관물로 작용하는 항체이다. SARS 및 MERS 스파이크 당단백질에 대한 중화 항체는 이러한 코로나바이러스에 대한 보호에서 주된 역할을 한다. 현재까지, SARS-CoV-2 감염 후 보호를 위해 어느 정도의 중화 항체가 필요한지, 또는 중화 항체의 내구성이 어느 정도인지는 알려지지 않았다.
T 세포 면역은 또한 SARS-CoV-2에 대한 보호의 상관물로 활용될 수 있다. T 세포 활성화는 감염의 급성 및 기억 단계 둘 다에서 보고되었지만, 질환 진행 또는 보호에서 CD4 및 CD8 T 세포 둘 다의 정확한 역할은 아직 완전히 이해되지 않았다. 항원-특이적 CD8 T 세포는 바이러스-감염된 세포를 직접적으로 표적화하는 반면, Th1 극성화된 CD4 T 세포는 조직에서 바이러스-감염된 세포와 싸우기 위해 CD8 T 세포 및 단핵구를 활성화시킬 가능성이 있다. 또한, T 소포 헬퍼 세포는 배 중심 반응 및 고품질 체액성 면역 반응의 형성에 필요하다. 이와 일치하게, 여러 연구에서 결합 항체 역가와 CD4 T 세포 반응 사이의 상관관계에 주목하였다. 따라서, T 세포는 감염된 세포를 직접 제거하는 것 및 다른 백혈구를 활성화시키고 체액성 면역 반응을 향상시는 것 둘 다를 통해 보호 기능을 가질 수 있다. 또한, 강건한 Th1-편향된 반응의 유도는 Th2 반응과 연관된 백신-연관된 증강된 호흡기 질환 또는 항체-의존적 증강 (ADE)의 희박한 발생과 일치한다.
본 발명의 백신은 더 우수한 장기간 보호를 생성하고 질환의 항체-의존적 증강 대한 가능성이 생기지 않도록 경계하기 위해 항원의 조합에 기초한다. 이는 스파이크 항원만 포함하는 개발 중인 백신과의 주요 차이점이다. 다수의 항원의 존재는 또한 다수의 항원이 더 넓은 범위의 면역 반응을 도출할 수 있기 때문에 회피 돌연변이체의 현상을 해결할 수 있으며, 이는 바이러스가 항원적으로 진화하고 신체 방어의 유효성을 약화시키는 것을 더 어렵게 만들 것이다.
본 발명의 백신에 대한 항원 서열은 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질, 막, 뉴클레오캡시드, 및 엔벨로프 단백질을 포함한다.
면역원성은 폭스바이러스 벡터로부터 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드 또는 스파이크 폴리펩티드의 S1 수용체 결합 도메인 서브유닛을 발현함으로써 달성될 수 있다. 코로나바이러스의 스파이크 단백질은 바이러스 감염의 급성기 동안 필요한 바이러스를 중화시키는데 필수적인 주요 중화 도메인을 함유하며 세포-매개된 면역을 자극하는데 필요하다. 역사적으로, SARS-CoV 또는 MERS-CoV와 같은 코로나바이러스의 스파이크 단백질은 면역원성으로 숙주 세포로의 바이러스 진입을 억제하는 중화 항체를 포함하는 체액성 면역 반응 뿐만 아니라 세포-매개된 면역 반응을 도출하는 것으로 밝혀졌다.
면역원성은 폭스바이러스 벡터로부터 SARS-CoV-2 막 단백질 폴리펩티드를 발현함으로써 달성될 수 있다. SARS-CoV에서, 막 단백질은 바이러스 표면에 풍부한 것으로 나타났으며; 또한, SARS를 갖는 환자의 면역화에 사용될 때 막 단백질은 중화 항체의 높은 역가를 유도하였다. 면역원성 및 구조적 분석은 강건한 세포성 면역 반응을 촉발할 수 있는 T-세포 에피토프 클러스터가 막 단백질에 존재함을 입증하였다. 막 단백질은 또한 많은 바이러스 종에서 고도로 보존되어 있기 때문에 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하기에 우수한 항원 후보이다.
면역원성은 폭스바이러스 벡터로부터 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드를 발현함으로써 달성될 수 있다. 최근에 SARS-CoV-2 감염이 대부분 뉴클레오캡시드 항원에 대해 지시되는 항체의 생산을 야기한다는 것이 발견되었다. 그러나, N 단백질 항체는 바이러스 진입을 차단할 수 없고 '비-중화' 항체로 간주되기 때문에, N 항체는 간과되어 왔다. 따라서, 현재 체액성 면역을 평가하기 위해 사용되는 중화 검정으로는 항-N 항체를 측정할 수 없다. 최근 연구에 따르면 세포 내부로 들어가는 항-N 항체는 항체 수용체 TRIM21에 의해 인식되어 연관된 N 단백질을 쪼개는 것으로 나타났다. 이어서, N 단백질 에피토프는 T 세포에 의해 검출되도록 디스플레이된다. 이 면역 반응 메커니즘은 결국 면역학적 기억을 매개할 T 세포를 수반하므로, 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 항체는 미래의 감염에 대한 장기적인 보호를 자극할 수 있다.
면역원성은 폭스바이러스 벡터 내에서 SARS-CoV-2 스파이크 단백질, 또는 그의 부분, 막 단백질 폴리펩티드, 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드, 및/또는 엔벨로프 단백질 폴리펩티드를 동시에 발현함으로써 달성될 수 있다. 마우스 간염 바이러스, 소 코로나바이러스, 감염성 기관지염 바이러스, 전염성 위장염 바이러스 및 SARS-CoV에 대한 연구에 따르면 스파이크, 막, 뉴클레오캡시드 및 일부 경우에서 엔벨로프 구조적 단백질이 형질감염된 세포에 의한 바이러스 유사 입자 (VLP)의 효율적인 어셈블리 및 방출에 필요하다는 것이 확인되었다. S, M, N 및/또는 E 폴리펩티드의 존재는 코로나바이러스 구조를 모방하지만 감염성인 유전 물질이 결여된 빈 바이러스 껍질인 진정한 VLP의 형성을 야기할 수 있다. VLP는 진정한 비리온과 유사한 크기 및 형태학적 특색을 공유하지만 감염성이 없고 복제할 수 없다. VLP는 천연 바이러스의 형태를 모방할 뿐만 아니라 허용 세포를 형질도입할 수 있다. 바이러스 유전 물질이 없는 VLP는 숙주 세포 내에서 복제되지 않지만 핵산, 단백질 또는 약물에 대한 캐리어로 사용될 수 있다. 또한, VLP는 표면 항원의 반복적인 노출 및 고유한 구조가 천연 바이러스를 모방하고 면역계와 상호작용하여 체액성 및 세포성 반응을 유도할 수 있기 때문에 백신 후보로 사용하기 위해 조사되었다. 이들 단백질의 조합된 면역원성은 보다 강건한 항원-특이적 면역 반응을 야기할 수 있다. 본 발명은 폭스바이러스-벡터화된 백신에서 항원/항원들로서의, SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 그의 부분, 및/또는 SARS-CoV-2 막 및/또는 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 또는 그의 부분, 및/또는 SARS-CoV-2 엔벨로프 단백질 또는 그의 부분의 사용을 포괄한다.
본 발명은 체액성 및 세포-매개된 면역을 포함하는 광범위한 면역 반응을 도출하기 위한 다수의 SARS-CoV-2 단백질의 사용을 포괄한다. 자연 감염에서, 면역계는 SARS-CoV-2를 포함하는 모든 단백질을 다양한 정도로 인식한다. M, N, E와 같이 돌연변이 빈도가 적은 구조적 유전자를 백신 제형에 활용함으로써 유도되는 면역 반응의 폭을 확장하여 SARS-CoV-2의 부상하는 변이체로부터 보호하고 회피 돌연변이체의 가능성을 줄일 수 있다.
한 실시양태에서, 스파이크 단백질 또는 그의 부분은 단일 폭스바이러스-벡터화된 백신에서 백신 항원으로서 사용된다.
한 실시양태에서, 막 단백질 또는 그의 부분은 단일 폭스바이러스-벡터화된 백신에서 백신 항원으로서 사용된다.
한 실시양태에서, 뉴클레오캡시드 단백질 또는 그의 부분은 단일 폭스바이러스-벡터화된 백신에서 백신 항원으로서 사용된다.
한 실시양태에서, 막 및 뉴클레오캡시드 단백질 또는 임의의 것의 부분은 단일 폭스바이러스-벡터화된 백신에서 백신 항원으로 사용된다.
한 실시양태에서, 스파이크 단백질 또는 그의 부분, 막 단백질 또는 그의 부분, 및 뉴클레오캡시드 단백질 또는 그의 부분은 단일 폭스바이러스-벡터화된 백신에서 백신 항원으로서 사용된다.
한 실시양태에서, 스파이크 단백질 또는 그의 부분, 막 및 뉴클레오캡시드 단백질 또는 임의의 것의 일부, 및 엔벨로프 단백질 또는 그의 부분은 단일 폭스바이러스-벡터화된 백신에서 백신 항원으로서 사용된다.
한 실시양태에서, 스파이크 단백질 또는 그의 부분 및 막 및 뉴클레오캡시드 단백질 또는 그의 부분은 단일 백신의 혼합물로서 조합된다.
본 발명자들은, 내인성 필수 어셈블리 또는 성숙 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 결실에 의해 약독화되고 게놈이 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 폴리펩티드 및/또는 막 단백질 폴리펩티드 및/또는 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 및/또는 엔벨로프 단백질 폴리펩티드, 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하도록 조작된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 활용함으로써, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 조성물이 수득될 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 제1 측면에서 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 선택된 백시니아 바이러스 유전자의 오픈 리딩 프레임으로 치환되거나 또는 유전자간 영역에 삽입된 SARS-CoV-2의 스파이크 및/또는 막 및/또는 뉴클레오캡시드 및/또는 엔벨로프 폴리펩티드 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 또는 기능적 부분 또는 부분들을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제2 측면에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제3 측면에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 천연 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제4 측면에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제5 측면에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 천연 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제6 측면에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제7 측면에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드의 S1 수용체-결합 도메인 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제8 측면에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제9 측면에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 천연 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제10 측면에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드의 S1 수용체-결합 도메인 서브유닛, 및 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제11 측면에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드의 S1 수용체-결합 도메인 서브유닛, 및 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제12 측면에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제13 측면에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제14 측면에서, 본 발명은 대상체에게 상기한 것 중 임의의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대해 대상체에서 보호 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
제15 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본 발명의 제4 및 제6 측면의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대해 대상체에서 보호 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
제16 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본 발명의 제5 및 제6 측면의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대해 대상체에서 보호 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
제17 측면에서, 본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스-유사 입자를 닮음으로써 SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공한다.
제18 측면에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환 및 SARS-CoV-2와 유전적 유사성을 갖는 코로나바이러스에 의해 유발되는 임의의 다른 감염의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및/또는 SARS-CoV-2의 막 및 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및/또는 SARS-CoV-2의 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제19 측면에서, 본 발명은 코로나바이러스 감염에 대해 대상체에서 중화 항체 반응 및/또는 보호 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 제1 내지 제18 측면의 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 하기를 포함한다:
유전자 조작된 약독화된 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 코로나바이러스 질환의 위험을 예방 또는 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물로서, 여기서 백시니아 바이러스 게놈은 스파이크 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 막 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 및 엔벨로프 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 약독화된 백시니아 바이러스는 내인성 필수 어셈블리 또는 성숙 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 결실을 포함하는 것인 조성물,
약독화된 백시니아 바이러스 게놈이 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물,
약독화된 백시니아 바이러스 게놈이 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 막 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물,
약독화된 백시니아 바이러스 게놈이 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물,
약독화된 백시니아 바이러스 게놈이 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 막 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분 및 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물,
약독화된 백시니아 바이러스 게놈이 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 및 막 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분 및 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물,
약독화된 백시니아 바이러스 게놈이 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 및 막 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 및 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 및 엔벨로프 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열이 COP-C23L, COP-B29R, COP-C3L, COP-N1L, COP-A35R, COP-A39R, COP-A41L, COP-A44R, COP-A46R, COP-B7R, COP-B8R, COP-B13R, COP-B16R, 및 COP-B19R로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 면역 조정 유전자의 결실된 ORF에 삽입되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열이 약독화된 백시니아 바이러스 게놈의 유전자간 영역 (IGR)에 삽입되며, 여기서 IGR은 백시니아 바이러스 게놈의 2개의 인접한 ORF 사이에 위치되거나 또는 그에 의해 플랭킹되는 것인 조성물,
약독화된 백시니아 바이러스 게놈의 IGR이 F9L-F10L, F12L-F13L, F17R-E1L, E1L-E2L, E8R-E9L, E9L-E10R, I1L-I2L, I2L-I3L, I5L-I6L, I6L-I7L, I7L-I8R, I8R-G1L, G1L-G3L, G3L-G2R, G2R-G4L, G4L-G5R, G5R-G5.5R, G5.5R-G6R, G6R-G7L, G7L-G8R, G8R-G9R, G9R-L1R, L1R-L2R, L2R-L3L, L3L-L4R, L4R-L5R, L5R-J1R, J3R-J4R, J4R-J5L, J5L-J6R, J6R-H1L, H1L-H2R, H2R-H3L, H3L-H4L, H4L-H5R, H5R-H6R, H6R-H7R, H7R-D1R, D1R-D2L, D2L-D3R, D3R-D4R, D4R-D5R, D5R-D6R, D6R-D7R, D9R-D10R, D10R-D11L, D11L-D12L, D12L-D13L, D13L-A1L, A1L-A2L, A2L-A2.5L, A2.5L-A3L, A3L-A4L, A4L-A5R, A5R-A6L, A6L-A7L, A7L-A8R, A8R-A9L, A9L-A10L, A10L-A11R, A11R-A12L, A12L-A13L, A13L-A14L, A14L-A14.5L, A14.5L-A15L, A15L-A16L, A16L-A17L, A17L-A18R, A18R-A19L, A19L-A21L, A21L-A20R, A20R-A22R, A22R-A23R, A23R-A24R, A28L-A29L 및 A29L-A30L, 및 또한 001L-002L, 002L-003L, 005R-006R, 006L-007R, 007R-008L, 008L-009L, 017L-018L, 018L-019L, 019L-02OL, 020L-021L, 023L-024L, 024L-025L, 025L-026L, 028R-029L, 03OL-031L, 031L-032L, 032L-033L, 035L-036L, 036L-037L, 037L-038L, 039L-040L, 043L-044L, 044L-045L, 046L-047R, 049L-050L, 050L-051L, 051L-052R, 052R-053R, 053R-054R, 054R-055R, 055R-056L, 061L-062L, 064L-065L, 065L-066L, 066L-067L, 077L-078R, 078R-079R, 080R-081R, 081R-082L, 082L-083R, 085R-086R, 086R-087R, 088R-089L, 089L-090R, 092R-093L, 094L-095R, 096R-097R, 097R-098R, 101R-102R, 103R-104R, 105L-106R, 107R-108L, 108L-109L, 109L-110L, 110L-111L, 113L-114L, 114L-115L, 115L-116R, 117L-118L, 118L-119R, 122R-123L, 123L-124L, 124L-125L, 125L-126L, 133R-134R, 134R-135R, 136L-137L, 137L-138L, 141L-142R, 143L-144R, 144R-145R, 145R-146R, 146R-147R, 147R-148R, 148R-149L, 152R-153L, 153L-154R, 154R-155R, 156R-157L, 157L-158R, 159R-160L, 160L-161R, 162R-163R, 163R-164R, 164R-165R, 165R-166R, 166R-167R, 167R-168R, 170R-171R, 173R-174R, 175R-176R, 176R-177R, 178R-179R, 179R-180R, 180R-181R, 183R-184R, 184R-185L, 185L-186R, 186R-187R, 187R-188R, 188R-189R, 189R-190R, 192R-193R로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 이전 명명법에 따르면 ORF 006L은 C10L에 상응하고, 019L은 C6L, 020L은 N1L에, 021L은 N2L에, 023L은 K2에L, 028R은 K7R에, 029L은 F1L에, 037L은 F8L에, 045L은 F15L에, 050L은 E3L에, 052R은 E5R에, 054R은 E7R에, 055R은 E8R에, 056L은 E9L에, 062L은 I1L에, 064L은 I4L에, 065L은 I5L에, 081R은 L2R에, 082L은 L3L에, 086R은 J2R에, 087은 J3R에, 088R은 J4R에, 089L은 J5L에, 092R은 H2R에, 095R은 H5R에, 107R은 D10R에, 108L은 D11L에, 122R은 A11R에, 123L은 A12L에, 125L은 A14L에, 126L은 A15L에, 135R은 A24R에, 136L은 A25L에, 137L은 A26L에, 141L은 A30L에, 148R은 A37R에, 149L은 A38L에, 152R은 A40R에, 153L은 A41L에, 154R은 A42R에, 157L은 A44L에, 159R은 A46R에, 160L은 A47L에, 165R은 A56R에, 166R은 A57R에, 167R은 B1R에, 170R은 B3R에, 176R은 B8R에, 18OR은 B12R에, 184R은 B16R에, 185L은 B17L에, 그리고 187R은 B19R에 상응하는 것인 조성물,
약독화된 백시니아 바이러스가 백시니아 바이러스 A41L 유전자, 백시니아 바이러스 D13L 유전자, 백시니아 바이러스 B7R-B8R 유전자, 백시니아 바이러스 A39R 유전자 및 백시니아 바이러스 C3L 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 결실을 포함하는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열이 하나 이상의 유전자의 적어도 하나의 결실 부위에 삽입되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분이 백시니아 바이러스 A41L 유전자 결실 부위에 삽입되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 막 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 및 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분이 백시니아 바이러스 D13L 유전자 결실 부위에 삽입되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 엔벨로프 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분이 백시니아 바이러스 B7R-B8R 유전자 결실 부위에 삽입되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열이 약독화된 백시니아 바이러스 게놈의 유전자간 영역 (IGR)에 삽입되며, 여기서 IGR은 백시니아 바이러스 게놈의 2개의 인접한 ORF 사이에 위치되거나 또는 그에 의해 플랭킹되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 갖는 하나 이상의 발현 카세트에 의해 코딩되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:1에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트 및 SEQ ID NO:4에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트에 의해 코딩되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트 및 SEQ ID NO:4에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트에 의해 코딩되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:1에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트에 의해 코딩되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트에 의해 코딩되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:5에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트에 의해 코딩되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:3에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트에 의해 코딩되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:4에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트에 의해 코딩되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:1에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트 및 SEQ ID NO:4에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트 및 SEQ ID NO:8에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트에 의해 코딩되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트 및 SEQ ID NO:4에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트 및 SEQ ID NO:8에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트에 의해 코딩되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:3에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트 및 SEQ ID NO:4에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세에 의해 코딩되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:3에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트 및 SEQ ID NO:4에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트 및 SEQ ID NO:8에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트에 의해 코딩되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:6에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트에 의해 코딩되는 것인 조성물,
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:7에 제시된 핵산 서열을 갖는 발현 카세트에 의해 코딩되는 것인 조성물,
제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물,
유전자 조작된 약독화된 백시니아 바이러스를 포함하는, 코로나바이러스 질환의 위험을 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물로서, 여기서 백시니아 바이러스 게놈은 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 약독화된 백시니아 바이러스는, 제2의 유전자 조작된 약독화된 백시니아 바이러스와 혼합된, 내인성 필수 어셈블리 또는 성숙 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 결실을 포함하고, 여기서 제2의 백시니아 바이러스 게놈은 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2의 막 단백질 폴리펩티드 및 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분 또는 부분들을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 제2의 약독화된 백시니아 바이러스는 내인성 필수 어셈블리 또는 성숙 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 결실을 포함하는 것인 조성물,
유전자 조작된 약독화된 백시니아 바이러스 벡터로서, 여기서 백시니아 바이러스 게놈은 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 폴리펩티드, 막 단백질 폴리펩티드 및 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드, 및/또는 엔벨로프 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 약독화된 백시니아 바이러스 벡터는 바이러스-유사 입자로 어셈블링하는 상기 언급된 폴리펩티드를 발현하는 것인 벡터.
약독화된 백시니아 바이러스를 포함하는 조성물을 SARS-CoV-2에 대해 지시되는 면역 반응을 도출하기에 효과적인 양으로 인간을 포함한 동물에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 백시니아 바이러스 게놈은 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 및 막 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 및 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 및 임의적으로 엔벨로프 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키는 방법,
SARS-CoV-2 항원에 대해 지시된 면역 반응이 SARS-CoV-2와 유전적으로 유사한 코로나바이러스에 대해 교차-반응하는 항체를 제공하는 것인 방법,
코로나바이러스 감염에 대해 대상체에서 보호 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 약제의 제조에서의 상기 중 임의의 것과 같은 조성물의 용도.
도 1: 폭스바이러스 발현 카세트를 SARS-CoV-2 S, M, N 및 E에 대해 합성하거나 (A, B, F 및 G) 또는 PCR에 의해 구축하였다 (C, D 및 E).
A. 합성 초기/후기 프로모터 (prPs)의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 포함하는 발현 카세트.
B. 천연 초기/후기 프로모터 (pr7.5)의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 포함하는 발현 카세트.
C. 합성 초기/후기 프로모터 (prPs)의 전사 제어 하에 있는 스파이크 단백질의 SARS-CoV-2 S1 서브유닛을 포함하는 발현 카세트.
D. 파울폭스 초기/후기 프로모터 (prE/L)의 전사 조절 하에 SARS-CoV-2 막 단백질을 포함하는 발현 카세트.
E. 합성 초기/후기 프로모터 (prPs)의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 발현 카세트.
F. 파울폭스 초기/후기 프로모터 (prE/L)의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 막 단백질 및 합성 초기/후기 프로모터 (prPs)의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 발현 카세트.
G. 합성 초기/후기 프로모터 (prPs)의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 엔벨로프 단백질을 포함하는 발현 카세트.
도 2: 백시니아 바이러스 코펜하겐 스트레인 (VACV-COP) 게놈에 관하여 F1 및 F2 재조합 아암에 의해 표시되는 상동성 재조합 부위.
A. SCV-SMX06에서 결실되고 사이에 SARS-CoV-2 항원이 삽입될 수 있는, VACV-COP 영역을 플랭킹하는 F1-A39R 및 F2-A39R 상동성 재조합 아암에 관한, VACV-COP의 A39R 영역.
B. SCV-SMX06에서 결실되고 사이에 SARS-CoV-2 항원이 삽입될 수 있는, VACV-COP 영역을 플랭킹하는 F1-A41L 및 F2-A42L 상동성 재조합 아암에 관한, VACV-COP의 A41L 영역.
C. SCV-SMX06에서 결실되고 사이에 SARS-CoV-2 항원이 삽입될 수 있는, VACV-COP 영역을 플랭킹하는 F1-B7B8R 및 F2-B7B8R 상동성 재조합 아암에 관한, VACV-COP의 B7/B8R 영역.
D. SCV-SMX06에서 결실되고 사이에 SARS-CoV-2 항원이 삽입될 수 있는, VACV-COP 영역을 플랭킹하는 F1-C3L 및 F2-C3L 상동성 재조합 아암에 관한, VACV-COP의 C3L 영역.
E. SCV-SMX06에서 결실되고 사이에 SARS-CoV-2 항원이 삽입될 수 있는, VACV-COP 영역을 플랭킹하는 F1-D13L 및 F2-D13L 상동성 재조합 아암에 관한, VACV-COP의 D13L 영역.
F. 사이에 SARS-CoV-2 항원이 삽입될 수 있는, VACV-COP 영역을 플랭킹하는 F1-J2/J3R 및 F2-J2/J3R 상동성 재조합 아암에 관한, VACV-COP의 J2R-J3R 유전자간 영역.
도 3: SARS-CoV-2 트랜스진에 대한 상동성 재조합 (HR) 카세트의 상세한 맵 및 요소.
A. prPs SARS-CoV-2 스파이크 발현 카세트를 포함하는 A41L을 대체하기 위한 HR 카세트.
B. pr7.5 SARS-CoV-2 스파이크 발현 카세트를 포함하는 A41L을 대체하기 위한 HR 카세트.
C. 스파이크 발현 카세트의 prPs SARS-CoV-2 S1 서브유닛을 포함하는 A41L을 대체하기 위한 HR 카세트.
D. prE/L SARS-CoV-2 막 및 prPs SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 발현 카세트를 포함하는 D13L을 대체하기 위한 HR 카세트.
E. prE/L SARS-CoV-2 막 및 prPs SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 발현 카세트를 포함하는 유전자간 부위 J2/J3R에 삽입하기 위한 HR 카세트.
F. prE/L SARS-CoV-2 막 발현 카세트를 포함하는 C3L을 대체하기 위한 HR 카세트.
G. prPs SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 발현 카세트를 포함하는 D13L을 대체하기 위한 HR 카세트.
H. prPs SARS-CoV-2 엔벨로프 발현 카세트를 포함하는 B7/B8R을 대체하기 위한 HR 카세트.
도 4: 백신 구축 프로세스의 개략도.
도 5: SCV-COVID19 백신 내 SARS-CoV-2 항원 삽입 영역.
A. A41L ORF로 치환된 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 트랜스진.
B. A41L ORF로 치환된 천연 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 트랜스진.
C. A41L ORF로 치환된 스파이크 트랜스진의 SARS-CoV-2 S1 서브유닛.
D. D13L ORF를 대체한 SARS-CoV-2 막 및 뉴클레오캡시드 트랜스진.
E. J2R과 J3R ORF 사이의 유전자간 영역에 삽입된 SARS-CoV-2 막 및 뉴클레오캡시드 트랜스진.
F. B7/B8R ORF를 대체한 SARS-CoV-2 엔벨로프 트랜스진
G. C3L ORF를 대체한 SARS-CoV-2 막 트랜스진.
H. D13L ORF를 대체한 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 트랜스진.
도 6: SCV-COVID19D를 사용한 단일 백신접종은 비근교계 및 근교계 마우스에서 중화 SARS-CoV-2 항체 및 Th1-편향된 항체 프로파일을 생성한다.
A. SCV-COVID19D 단일 샷 백신접종 후 제21일에 비근교계 ARC(s) 및 근교계 C57BL/6 스트레인에서 바이러스-특이적 중화 항체의 수준.
B. SCV-COVID19D 단일 샷 백신접종 후 제21일에 비근교계 ARC(s) 및 근교계 C57BL/6 스트레인에서 S1-특이적 항체의 수준.
C. SCV-COVID19D 단일 샷 백신접종 후 제21일에 비근교계 ARC(s) 및 근교계 C57BL/6 스트레인에서 IgG2c (Th1) 및 IgG1 (Th2) 항체의 수준.
도 7: SCV-COVID19D를 사용한 단일 백신접종은 스파이크-특이적 CD8 T 세포 반응을 생성한다.
A. SCV-COVID19D 단일 샷 백신접종 후 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의한 스파이크-특이적 IFNγ+ CD8 T 세포의 수준.
B. SCV-COVID19D 단일 샷 백신접종 후 ELISpot에 의한 스파이크-특이적 IFNγ+ CD8 T 세포의 수준.
도 8: SCV-COVD19C는 SCV-COVID19D보다 더 우수한 스파이크-특이적 항체를 도출한다.
A. SCV-COVID19 백신으로 감염된 세포에서 스파이크 항원 발현의 웨스턴 블롯에 의한 검출.
B. SCV-COVID19C, SCV-COVID19D, 및 SCV-COVID19F 단일 샷 백신접종 후 제21일에 S1-특이적 항체의 수준.
도 9: SCV-COVID19C를 사용한 단일 백신접종은 근교계 및 비근교계 마우스에서 항체 반응을 유도한다.
A. SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 제14일에 비근교계 ARC(s) 및 근교계 C57BL/6 스트레인에서 S1-특이적 항체의 수준.
B. SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 제14일에 비근교계 ARC(s) 및 근교계 C57BL/6 스트레인에서 S1-특이적 항체의 역가.
C. SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 제14일에 비근교계 ARC(s) 및 근교계 C57BL/6 스트레인에서 중화 항체의 수준.
도 10: 삼중-시토카인-생산 CD8 T 세포의 확인을 위한 게이팅 전략
도 11: SCV-COVID19C를 사용한 단일 백신접종은 강건한 스파이크-특이적 T 세포 반응을 유도한다.
A. SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 스파이크-특이적 IFNγ+ CD8 T 세포의 검출을 나타내는 대표적인 유동 세포측정 플롯.
B. SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 스파이크 풀 1 (S1)-특이적 (좌측), 스파이크 풀 2 (S2)-특이적 (중간), 및 에피토프-특이적 (우측)인 단일, 이중, 및 삼중-시토카인-생산 IFNγ+ CD8 T 세포의 총 수의 그래픽 요약.
C. SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 그랜자임-B-생산 CD8 T 세포의 대표적인 유동 세포측정 플롯 및 그래픽 요약.
D. SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 S1- 및 S2-특이적 삼중-시토카인-생산 CD4 T 세포의 총 수.
도 12: 기존 면역은 SCV-COVID19C 백신의 단일-용량의 투여 후 스파이크-특이적 항체 반응의 양 및 질에 영향을 미치지 않는다.
A. SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 제28일, 제44일 및 제80일에 기존 면역이 있는 마우스 및 없는 마우스에 대한 S1-특이적 항체의 수준
B. SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 제28일, 제44일 및 제80일에 기존 면역이 있는 마우스 및 없는 마우스에 대한 중화 항체의 수준.
도 13: 기존 면역은 프라임-부스트 백신접종 후 스파이크-특이적 항체 반응의 양 및 질에 영향을 미치지 않는다.
A. SCV-COVID19C 동종 프라임-부스트 백신접종에서 제28일 (부스트 전) 및 부스터 투약 후 제14일 및 제50일에 기존 면역이 있는 마우스 및 없는 마우스에 대한 S1-특이적 항체의 수준.
B. SCV-COVID19C 동종 프라임-부스트 백신접종에서 제28일 (부스트 전) 및 부스터 투약 후 제14일 및 제50일에 기존 면역이 있는 마우스 및 없는 마우스에 대한 중화 항체의 수준.
도 14: SCV-COVID19C를 사용한 단일 백신접종은 노령 마우스에서 항원-특이적 항체 반응을 유도한다.
A. SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 제14일 및 제21일에 어린 마우스 및 노령 마우스에서 S1-특이적 항체의 수준.
B. SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 제14일 및 제21일에 어린 마우스 및 노령 마우스에서 중화 항체의 수준.
도 15: 동종 프라임-부스트는 백신접종 후 최대 3개월 동안 유지되는 항체 반응의 유의한 부스팅을 야기한다.
A. SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 제21일 및 SCV-COVID19C 동종 프라임-부스트 백신접종에 따른 부스트 후 제21일에 어린 마우스 및 노령 마우스에서 S1-특이적 항체의 수준.
B. SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 제21일 및 SCV-COVID19C 동종 프라임-부스트 백신접종에 따른 부스트 후 제21일에 어린 마우스 및 노령 마우스에서 중화 항체의 수준.
C. SCV-COVID19C 동종 프라임-부스트 백신접종에 따른 부스트 후 제3주, 제9주, 및 제12주에 어린 마우스 및 노령 마우스에서 중화 항체의 수준.
도 16: 세포 표면 마커를 사용한 T 세포 기억 세포 유형의 유동 세포측정 확인을 위한 게이팅 전략.
도 17: SCV-COVID19C의 동종 프라임-부스트는 장기간 T 세포 반응을 유도한다.
A. 어린 마우스 및 노령 마우스에서 SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 3개월 및 SCV-COVID19C 동종 프라임-부스트 백신접종에 따른 부스트 후 3개월에 단수명 이펙터 (TSLE), 이펙터 기억 (TEM), 및 중심 기억 (TCM) CD8 T 세포의 총 수.
B. 어린 마우스 및 노령 마우스에서 SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 3개월 및 SCV-COVID19C 동종 프라임-부스트 백신접종에 따른 부스트 후 3개월에 스파이크-특이적 IFNγ+ CD8 T 세포의 수준.
C. 어린 마우스 및 노령 마우스에서 SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 3개월 및 SCV-COVID19C 동종 프라임-부스트 백신접종에 따른 부스트 후 3개월에 ELISpot에 의해 검출되는 S1-, RBD-, 및 S2-특이적 IFNγ+ 스폿-형성 단위의 수준.
D. 어린 마우스 및 노령 마우스에서 SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 3개월 및 SCV-COVID19C 동종 프라임-부스트 백신접종에 따른 부스트 후 3개월에 ICS에 의해 검출되는 S1-, RBD-, 및 S2-특이적 IFNγ+ CD8 T 세포의 백분율.
E. 어린 마우스 및 노령 마우스에서 SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 3개월 및 SCV-COVID19C 동종 프라임-부스트 백신접종에 따른 부스트 후 3개월에 ICS에 의해 검출되는 S1-, RBD-, 및 S2-특이적 삼중-시토카인-생산 CD8 T 세포의 총 수.
도 18: SCV-COVID19C의 동종 프라임-부스트는 스파이크 RBD 내 CD8 T 세포 에피토프를 기반으로 하는 SARS-CoV와 잠재적으로 교차-반응할 수 있다.
A. SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 제7일에 ELISpot에 의한 에피토프-특이적 IFNγ+ CD8 T 세포의 수준.
B. SCV-COVID19C 단일 샷 백신접종 후 제7일에 ICS에 의한 에피토프-특이적 IFNγ+ CD8 T 세포를 나타내는 대표적인 유동 세포측정 패널.
도 19: SCV-COVID19A를 사용한 단일 백신접종은 스파이크- 및 막-특이적 CD8 T 세포 반응을 생성한다.
A. SCV-COVID19A 단일 샷 백신접종 후 제21일에 S1-, RBD- 및 S2-특이적 IFNγ+ CD8 T 세포의 수준.
B. SCV-COVID19A 단일 샷 백신접종 후 제21일에 막-특이적 IFNγ+ CD8 T 세포의 수준.
C. SCV-COVID19A 단일 샷 백신접종 후 제21일에 뉴클레오캡시드-특이적 IFNγ+ CD8 T 세포의 수준.
도 20: 동등한 비율의 SCV-COVID19C 및 SCV-COVID19G를 사용한 단일 백신접종은 스파이크 및 막 단백질에 대해 지시된 스파이크-특이적 항체 반응 및 CD8+ T 세포 반응을 유도한다.
A. SCV-COVID19C 및 SCV-COVID19G를 포함하는 혼합 백신을 사용한 단일 샷 백신접종 후 제21일에 S1-특이적 항체의 수준.
B. SCV-COVID19C 및 SCV-COVID19G를 포함하는 혼합 백신을 사용한 단일 샷 백신접종 후 제21일에 S1-특이적 항체의 역가.
C. SCV-COVID19C 및 SCV-COVID19G를 포함하는 혼합 백신을 사용한 단일 샷 백신접종 후 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의한 스파이크-특이적 IFNγ+ 생산 T 세포 반응의 수준.
D. SCV-COVID19C 및 SCV-COVID19G를 포함하는 혼합 백신을 사용한 단일 샷 백신접종 후 ELISpot에 의한 스파이크 및 막-특이적 IFNγ+ 생산 T 세포 반응의 수준.
도 21: SCV-COVD19C를 사용한 단일 백신접종은 에피토프-특이적 세포독성 T 림프구 (CTL) 활성을 생성한다.
A. 백신접종 후 제7일에 펩티드 YNYLYRLF (SEQ ID NO:9)로 펄싱된 표적 세포에 대한 CTL 반응.
B. 백신접종 후 제7일에 펩티드 VNFNFNGL (SEQ ID NO:11)로 펄싱된 표적 세포에 대한 CTL 반응.
C. 비-펄싱된 표적 세포에 대한 CTL 반응.
본 발명은 특정한 절차 또는 작용제, 작용제의 특정 제형 및 다양한 의학적 방법론에 제한되지 않으며, 이는 다양할 수 있다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 설명하기 위해 사용된 것으로 한정하려는 의도가 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 물질 및 방법을 이용하여 본 발명을 실시하거나 시험할 수 있다. 실무자는 특히 문헌 (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, N.Y.: Ausubel et al. (1999) Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47) John Wiley & Sons, New York; Murphy et al (1995) Virus Taxonomy Springer Verlag: 79-87, Mahy Brian WJ and Kangro O Hillar (Eds): Virology Methods Manual 1996, Academic Press; and Davison AJ and Eliott RM (Eds): Molecular Virology, A Practical Approach 1993, IRL Press at Oxford University Press; Perkus et al., Virology (1990) 179(1): 276-86) 또는 관련 기술분야의 정의 및 용어 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 방법을 따른다.
본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기재된다. 본 발명의 목적 상, 하기 용어가 하기에 정의된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다", "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 그룹을 포함하고 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계들 또는 요소들의 그룹을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 용어 "포함하는" 등의 사용은 나열된 요소가 요구되거나 필수적이고 다른 요소는 임의적이고 존재할 수도 있고 없을 수도 있음을 나타낸다. 약독화된 오르토폭스 벡터의 맥락에서, 본 벡터는 약독화를 위해 결실을 포함함으로써 변형된다.
그러나, 성숙 또는 어셈블리 유전자, 추가 변형, 예컨대 벡터 항원 또는 다른 단백질이 포괄된다.
"로 이루어진"은 어구 "로 이루어진" 뒤에 오는 모든 것을 포함하고 이에 제한되는 것을 의미한다. 따라서, 어구 "로 이루어진"은 나열된 요소가 요구되거나 필수적이며 다른 요소가 존재할 수 없음을 나타낸다. "로 본질적으로 이루어진"은 어구 뒤에 나열된 임의의 요소를 포함하는 것을 의미하고, 나열된 요소에 대한 개시내용에 명시된 활성 또는 작용을 방해하거나 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다. 따라서, 어구 "로 본질적으로 이루어진"은 나열된 요소가 요구되거나 필수적이고 다른 요소는 임의적이며 나열된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지의 여부에 따라 존재할 수도 있고 없을 수도 있음을 나타낸다.
본원에 사용된 단수 형태는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 측면을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 단일 세포 뿐만 아니라 2개 이상의 세포를 포함하고; "유기체"에 대한 언급은 하나의 유기체 뿐만 아니라 2개 이상의 유기체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단수 형태는 "하나 또는 하나 초과"를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "및/또는"은 연관된 나열된 항목 중 하나 이상의 항목의 임의의 모든 가능한 조합 뿐만 아니라 대안적 (또는)으로 해석될 때 조합의 결여를 지칭하고 이를 포괄한다.
본원에 사용된 "약독화" 또는 "약독화된"은 바이러스 벡터 병독성의 감소를 의미한다. 병독성은 특정한 숙주에 질환을 유발하는 바이러스의 능력으로 정의된다. 감염성 바이러스를 생산할 수 없는 폭스바이러스 벡터는 초기에 세포를 감염시킬 수 있지만 실질적으로 자체를 완전히 복제하거나 숙주 내에서 증식하거나 병태를 유발할 수 없다. 이는 벡터가 숙주 세포 세포질에 그의 단백질 또는 핵산을 전달하지만 대상체에 해를 끼치지 않기 때문에 바람직하다.
"제어 요소" 또는 "제어 서열"은 특정한 폭스바이러스, 벡터, 플라스미드 또는 세포에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 핵산 서열 (예를 들어, DNA)을 의미한다. 진핵 세포에 적합한 제어 서열은 전사 제어 서열, 예컨대 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 전사 인핸서, 번역 제어 서열, 예컨대 번역 인핸서 및 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), mRNA 안정성을 조정하는 핵산 서열 뿐만 아니라 전사된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 산물을 세포 내의 세포내 구획 또는 세포외 환경으로 표적화하는 표적화 서열을 포함한다.
서열이 제공되는 경우, 상응하는 서열이 포괄된다. "에 상응한다" 또는 "상응하는" 또는 "에 상응하는"은 참조 핵산 서열에 대해 실질적인 서열 동일성 (예를 들어, 참조 핵산 서열의 전체 또는 일부에 대해 적어도 약 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83m 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 96, 98, 99% 또는 심지어 최대 100% 서열 동일성)을 나타내는 핵산 서열 또는 참조 아미노산 서열에 대해 실질적인 서열 유사성 또는 동일성 (예를 들어, 참조 아미노산 서열의 전체 또는 일부에 대해 적어도 약 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83m 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 96, 98, 99% 또는 심지어 최대 100% 서열 유사성 또는 동일성)을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.
병태를 치료 또는 예방하는 맥락에서 또는 표적 항원 또는 유기체에 대한 면역 반응을 조정하기 위한 "유효량"은 이러한 치료 또는 예방이 필요한 개체에게, 단일 용량으로 또는 시리즈의 부분으로, 증상 발생 예방, 이러한 증상 억제 및/또는 기존 증상 치료에, 또는 표적 항원 또는 유기체에 대한 면역 반응의 조정에 효과적인 작용제 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 약독화된 오르토폭스 벡터) 또는 이를 포함하는 조성물의 소정량의 투여를 의미한다. 유효량은 치료될 개체의 건강 및 신체 상태, 치료될 개체의 분류학적 그룹, 조성물의 제형, 의학적 상황의 평가, 및 다른 관련 요인에 따라 달라질 것이다. 양은 통상적인 시도를 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것으로 예상된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "코딩하다", "코딩하는" 등은 또 다른 핵산 또는 폴리펩티드를 제공하는 핵산의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 핵산 서열은 전사 및/또는 번역되어 폴리펩티드를 생성할 수 있는 경우 또는 전사 및/또는 번역되어 폴리펩티드를 생산할 수 있는 형태로 프로세싱리될 수 있는 경우 폴리펩티드를 "코딩"한다고 한다. 이러한 핵산 서열은 코딩 서열 또는 코딩 서열 및 비-코딩 서열 둘 다를 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "코딩하다", "코딩하는" 등은 DNA 분자의 전사로부터 초래되는 RNA 산물, RNA 분자의 번역으로부터 초래되는 단백질, RNA 산물을 형성하기 위한 DNA 분자의 전사 및 RNA 산물의 후속적 번역으로부터 초래되는 단백질, 또는 RNA 산물을 제공하기 위한 DNA 분자의 전사, 프로세싱된 RNA 산물 (예를 들어, mRNA)를 제공하기 위한 RNA 산물의 프로세스 및 프로세싱된 RNA 산물의 후속적 번역으로 초래되는 단백질을 포함한다.
용어 "내인성"은 숙주 유기체에서 정상적으로 발견되는 유전자 또는 핵산 서열 또는 절편을 지칭한다.
용어 "발현가능한", "발현된" 및 그의 변형은 뉴클레오티드 서열을 RNA로 전사하고 임의적으로 mRNA를 번역하여 생물학적 또는 생화학적 기능을 제공하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 합성하는 세포의 능력을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 임의적으로 mRNA 생산 프로세스를 보조하기 위한 요소의 추가와 함께 mRNA를 생산하는데 사용될 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 유전자는 기능적 단백질을 생산하는데 사용될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 유전자는 코딩 영역 및 비-코딩 영역 (예를 들어, 인트론, 조절 요소, 프로모터, 인핸서, 종결 서열 및 5' 및 3' 비번역 영역) 둘 다를 포함할 수 있다.
용어 "이종 핵산 서열", "이종 뉴클레오티드 서열", "이종 폴리뉴클레오티드", "외래 폴리뉴클레오티드", "외인성 폴리뉴클레오티드" 등은 실험적 조작에 의해 유기체의 게놈에 도입되는 임의의 핵산 (예를 들어, IRES를 포함하는 뉴클레오티드 서열)을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되며, 도입된 유전자가 변형 전 바이러스 게놈 서열과 비교하여 일부 변형 (예를 들어, 점 돌연변이, 결실, 치환 또는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 추가, 엔도뉴클레아제 절단 부위의 존재, loxP 부위의 존재 등)을 함유하는 한 해당 유기체에서 발견되는 유전자 서열을 포함할 수 있다.
용어 "이종 폴리펩티드", "외래 폴리펩티드" 및 "외인성 폴리펩티드"는 상기 정의된 바와 같이 "이종 핵산 서열", "이종 뉴클레오티드 서열", "이종 폴리뉴클레오티드", "외래 폴리뉴클레오티드" 및 "외인성 폴리뉴클레오티드"에 의해 코딩되는 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
한 실시양태에서, 이종 DNA 서열은 적어도 하나의 코딩 서열을 포함한다. 코딩 서열은 전사 제어 요소에 작동가능하게 연결된다.
한 실시양태에서, 이종 DNA 서열은 또한 하나 또는 여러개의 전사 제어 요소에 연결된 2개 이상의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 코딩 서열은 하나 이상의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 외래 항원 또는 항원성 에피토프, 특히 치료학적으로 관심을 끄는 유전자의 것들을 코딩한다. 치료학적으로 관심을 끄는 유전자는 질환을 유발하는 병원체 또는 감염성 미생물의 유전자로부터 유래되거나 상동적일 수 있다. 치료학적으로 관심을 끄는 유전자는 특정 면역 반응에 영향을 미치고, 바람직하게는 이를 유도하고, 이에 의해 감염에 대해 유기체를 백신접종하거나 예방적으로 보호하기 위해 유기체의 면역계에 제공된다.
한 실시양태에서, 이종 DNA 서열은 SARS-CoV-2로부터 유래되고, 스파이크 단백질, 및/또는 막 단백질, 및/또는 뉴클레오캡시드 단백질, 및/또는 엔벨로프 단백질 또는 임의의 것의 부분 또는 부분들을 코딩한다.
용어 "보호 면역 반응"은 SARS-CoV-2 감염 위험을 예방 또는 감소시키거나 코로나바이러스 질환의 중증도 위험을 감소시키는 면역 반응을 의미한다.
SARS-CoV-2 항원에 대해 지시된 면역 반응은 SARS-CoV-2와 유전적으로 유사한 코로나바이러스에 대해 교차-반응성인 항체를 제공할 수 있다.
용어 "중화 항체 반응"은 바이러스 감염성을 중화시킬 수 있는 항체가 도출되는 면역 반응을 의미한다. 백신접종을 통해 중화 항체를 생성하는 것은 바이러스 감염에 대한 보호에 충분하면서 또한 필요할 수 있다. 중화 항체의 존재는 백신접종 후 바이러스 감염으로부터 보호하는 최상의 상관물이다. 마찬가지로, 이들은 면역의 마커이다.
본원에서 고려되는 면역 반응을 유도하는 것은 면역 반응을 도출 또는 자극하는 것 및/또는 기존의 면역 반응을 향상시키는 것을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
SARS-CoV-2 감염 위험 및/또는 코로나바이러스 질환의 중증도를 예방 또는 감소시키는 동물에서의 면역 반응은 SARS-CoV-2 전파의 예방 또는 감소를 통해 매개될 수 있다.
본 발명의 폭스 바이러스 벡터는 바람직하게는 포유동물 세포에서 증식된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 포유동물 세포의 세부사항은 PCT/AU2014/050330에 제공되며, 그의 개시내용은 상호 참조로 본원에 포함된다.
일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 인간 세포, 영장류 세포, 햄스터 세포 또는 토끼 세포이다.
세포는 단세포일 수 있거나 조직 배양에서 액체 배양, 단층 등으로 성장될 수 있다. 숙주 세포는 또한 조직으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유래될 수 있거나 동물을 포함하는 유기체 내에 존재할 수 있다. 세포는 유비퀴틴화된 T 세포 항원을 발현하도록 변형된 세포주를 포함하는 확립된 세포주일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상동성 재조합 및/또는 바이러스 증식은 D13L 단백질 및 카우폭스 숙주-범위 단백질 (CP77)을 발현하는 GMP-CHO-S 세포주로부터 유래되는 SCV 세포 기질인 BC19A-12 세포주에서 수행된다. SCV 백신 플랫폼은 바이러스 게놈에서 D13L 유전자의 표적화된 결실을 통합하여 바이러스 어셈블리를 방지함으로써 SCV가 정상적으로 허용되는 세포주에서 감염성 자손을 생성할 수 없도록 하지만; SCV 게놈의 증폭은 유지된다. CHO 세포는 D13 및 CP77을 구성적으로 발현하도록 조작되어 바이러스 증식이 가능하다. BC19A-12 세포주를 사용한 바이러스 증식 방법에 대한 완전한 설명은 문헌 (Eldi et al. 2017, 전체가 본원에 포함됨)을 참조한다.
일부 실시양태에서, 상동성 재조합 및/또는 바이러스 증식은 백시니아 바이러스 D13 단백질을 구성적으로 발현하고 단백질 또는 무혈청 배지에서 성장할 수 있는 모노클로날 현탁액 CHO 세포주인 SD07-1 세포주에서 수행된다.
본원에 사용된 용어 "작동가능하게 결합된" 또는 "작동가능하게 연결된"은 이렇게 기재된 성분들이 의도된 방식으로 기능할 수 있는 관계에 있는 병치를 지칭한다. 예를 들어, 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 전사 제어 서열은 전사 제어 서열에 맞는 조건 하에 코딩 서열을 발현하도록 코딩 서열에 대한 전사 제어 서열의 위치지정 및/또는 배향을 지칭한다. 또 다른 예에서, 오르토폭스 바이러스 코딩 서열에 작동가능하게 결합된 IRES는 오르토폭스 바이러스 코딩 서열을 캡-독립적으로 번역하도록 오르토폭스 바이러스 코딩 서열에 대한 IRES의 위치지정 및/또는 배향을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "오픈 리딩 프레임" 및 "ORF"는 코딩 서열의 번역 개시 코돈과 종결 코돈 사이에 코딩된 아미노산 서열을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "개시 코돈" (예를 들어, ATG) 및 "종결 코돈" (예를 들어, TGA, TAA, TAG)은 각각 단백질 합성 (mRNA 번역)의 개시 및 쇄 종결을 지정하는 코딩 서열에서 3개의 인접한 뉴클레오티드 ('코돈')의 단위를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 서열", "뉴클레오티드 서열", "핵산" 또는 "핵산 서열"은 mRNA, RNA, cRNA, cDNA, 또는 DNA를 지정한다. 이 용어는 전형적으로 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태인 적어도 10개 염기 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 이 용어는 RNA 또는 DNA의 단일 및 이중 가닥 형태를 포함한다.
"폴리펩티드", "펩티드", "단백질" 및 "단백질성 분자"는 아미노산 잔기의 중합체 및 그의 변이체 및 합성 유사체를 포함하거나 이로 이루어진 분자를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 이들 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 합성 비-자연 발생 아미노산인 아미노산 중합체, 예컨대 상응하는 자연 발생 아미노산의 화학적 유사체 뿐만 아니라 자연-발생 아미노산 중합체에 적용된다.
"핵산 분자", "폴리뉴클레오티드" 등에 적용되는 본원에 사용된 용어 "재조합체"는 본원에 기재된 숙주 세포 또는 무세포 시스템에서 전사 및/또는 번역될 수 있는 인공 핵산 구조 (즉, 비-복제 cDNA 또는 RNA; 또는 레플리콘, 자가-복제 cDNA 또는 RNA)를 의미하는 것으로 이해된다. 재조합 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 벡터에 삽입될 수 있다. 비-바이러스 벡터, 예컨대 플라스미드 발현 벡터 또는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 벡터의 종류 및 핵산 구축물의 삽입 기술은 기술자에게 공지되어 있다. 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 의해 기재된 배열에서 자연적으로 발생하지 않는다. 다시 말해, 이종 뉴클레오티드 서열은 모 바이러스 게놈의 요소 (예를 들어, 프로모터, ORF, 폴리아데닐화 신호, 리보자임)와 자연적으로 조합되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 바이러스"는 적어도 하나의 이종 핵산 서열을 포함하는 "모 바이러스"에 대한 언급으로 이해될 것이다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성"은 서열이 비교 창에 걸쳐 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 기준 또는 아미노산 대 아미노산 기준으로 동일한 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성 백분율"은 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 일치하는 위치의 수를 산출하기 위해 동일한 핵산 염기 (예를 들어, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기 (예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 두 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 결정하고, 일치된 위치의 수를 비교 창의 총 위치의 수 (즉, 창 크기)로 나누며, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 계산된다. 본 발명의 목적을 위해, "서열 동일성"은 소프트웨어와 함께 제공되는 참조 매뉴얼에 사용된 표준 디폴트를 사용하여 DNASIS 컴퓨터 프로그램 (윈도우용 버전 2.5; 히타치 소프트웨어 엔지니어링 캄파니, 리미티드(Hitachi Software engineering Co., Ltd., 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)로부터 입수가능)에 의해 계산된 "일치 백분율"을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
용어 "신호 서열" 또는 "신호 펩티드"는 시토졸로부터, 예컨대 핵, 미토콘드리아 매트릭스 및 소포체와 같은 특정 소기관으로 단백질의 번역과 동시에 또는 번역 후 수송을 지시하는 짧은 (대략 3 내지 약 60개 아미노산 길이) 펩티드를 지칭한다. ER 표적화 신호 펩티드를 갖는 단백질의 경우, 신호 펩티드는 전형적으로 단백질이 ER로 수송된 후 신호 펩티다제에 의해 전구체 형태로부터 절단되고, 생성된 단백질은 분비 경로를 따라 세포내 (예를 들어, 골지체, 세포막 또는 세포벽) 또는 세포외 위치로 이동한다. 본원에 사용된 "ER 표적화 신호 펩티드"는 ER 막을 통해 단백질의 일부 또는 전부가 ER의 루멘에 삽입된 후 일반적으로 효소적으로 제거되는 아미노-말단 소수성 서열을 포함한다. 따라서, 서열의 신호 전구체 형태는 단백질의 전구체 형태의 일부로는 존재할 수 있지만 일반적으로 단백질의 성숙한 형태에는 없을 것이라는 것이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
"유사성"은 하기 표 A에 정의된 바와 같이 동일하거나 구성적으로 보존된 치환인 아미노산 수의 백분율을 지칭한다. 유사성은 GAP (Deveraux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12: 387-395)와 같은 서열 비교 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 이러한 방식으로, 본원에 인용된 것들과 유사하거나 실질적으로 상이한 길이의 서열은 갭을 정렬에 삽입함으로써 비교될 수 있으며, 이러한 갭은, 예를 들어, GAP에 의해 사용되는 비교 알고리즘에 의해 결정된다.
표 A: 예시적인 보존적 아미노산 치환
Figure pct00001
비교 창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 알고리즘(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 릴리즈 7.0(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0) (제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, 미국 위스콘신주 사이언스 드라이브 매디슨 575))의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)의 컴퓨터화 구현에 의해 또는 검사 및 선택된 다양한 방법 중 임의의 것에 의해 생성되는 최상의 정렬 (즉, 비교 창에 걸쳐 가장 높은 상동성 백분율을 초래함)에 의해 수행될 수 있다. 참조는 또한, 예를 들어 문헌 (Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389. A detailed discussion of sequence analysis can be found in Unit 19.3 of Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15)에 의해 개시되는 바와 같이 BLAST 계열 프로그램에 대해 이루어질 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "대상체", "환자", "숙주" 또는 "개체"는 요법 또는 예방이 필요한 임의의 대상체, 특히 척추동물 대상체, 훨씬 더 특히 포유동물 대상체를 지칭한다. 본 발명의 범위에 속하는 적합한 척추동물은 영장류 (예를 들어, 인간, 원숭이 및 유인원)를 포함한 코르다타(Chordata) 아문의 임의의 구성원을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 마카카(Macaca) 속 (예를 들어, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) 및/또는 붉은털원숭이 (마카카 물라타(Macaca mulatta))) 및 개코 원숭이 (파피오 우라시누스(Papio ursinus))로부터의 원숭이의 종 뿐만 아니라 마모셋 (칼리트릭스(Callithrix) 속의 종), 다람쥐 원숭이 (사이미리(Saimiri) 속의 종), 흰족제비 (무스텔라(Mustela) 속의 종) 및 타마린 (사구이누스(Saguinus) 속의 종) 뿐만 아니라 침팬지 (판 트로글로디테스(Pan troglodytes)와 같은 유인원 종, 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트, 기니피그), 토끼목 (예를 들어, 토끼, 헤어), 소과 (예를 들어, 소), 양류 (예를 들어, 양), 염소류 (예를 들어, 염소), 돼지류 (예를 들어, 돼지), 말류 (예를 들어, 말), 개과 (예를 들어, 개), 고양이과 (예를 들어, 고양이), 조류 (예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 반려 새, 예컨대 카나리아, 잉꼬 등), 해양 포유동물 (예를 들어, 돌고래, 고래), 파충류 (뱀, 개구리, 도마뱀 등) 및 어류를 포함한다. 바람직한 대상체는 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 인간이다. 그러나, 상기 언급된 용어는 증상이 있음을 의미하지 않는다는 것을 이해할 것이다.
용어 "트랜스진"은 숙주 유기체의 게놈에 인공적으로 도입되었거나 막 도입되어 그 숙주의 자손에게 전달되는 유전 물질을 설명하기 위해 본원에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 이는 포유동물 세포 또는 이것이 도입되는 오르토폭스 벡터에 원하는 특성을 부여하거나, 달리 원하는 치료 또는 진단 결과를 야기한다.
본원에 사용된 용어 "치료", "치료하는" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고/거나 질환 및/또는 질환에 기인하는 유해 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 포유동물, 특히 인간의 질환의 임의의 치료를 포괄하며, (a) 질환에 걸리기 쉬우나 아직 질환을 갖는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 방지하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 질환의 발달을 저지하는 것; 및 (c) 질환을 경감시키는 것, 즉 질환의 퇴행을 유발하는 것을 포함한다.
유기체, 폴리펩티드, 또는 핵산 서열과 관련하여 용어 "야생형", "자연", "천연" 등은 자연 발생적이거나 인간에 의해 변화, 돌연변이, 또는 달리 조작되지 않는 적어도 하나의 자연 발생 유기체에서 이용가능하다.
용어 "바이러스 감염"은 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 바이러스 병원체에 의한 감염을 의미한다.
용어 "바이러스-유사 입자" 또는 "VLP"는 항원적으로 및 형태학적으로 천연 바이러스를 닮은 구조를 지칭한다.
변이체는 중간 또는 높은 엄격성의 조건 하에서 선택적 하이브리드화가 달성될 수 있도록 참조된 분자 또는 그의 전체 또는 일부에 대한 상보적 형태와 충분히 유사하거나 적어도 약 15개의 뉴클레오티드를 포함하는 비교 창에 걸쳐 참조된 폭스바이러스 숙주 범위 인자를 정의하는 뉴클레오티드 서열에 대해 약 60% 내지 90% 또는 90% 내지 98% 서열 동일성을 갖는 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게는, 하이브리드화 영역은 길이가 약 12 내지 약 18개 또는 그 초과의 핵염기이다. 바람직하게는, 특정한 뉴클레오티드 서열과 참조 서열 사이의 퍼센트 동일성은 적어도 약 80%, 또는 85%, 보다 바람직하게는 약 90% 또는 그 초과, 예컨대 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과이다. 80% 내지 100%의 퍼센트 동일성이 포괄된다. 뉴클레오티드 서열의 길이는 제안된 기능에 따라 다르다. 상동체가 포괄된다. 용어 "상동체" "상동성 유전자" 또는 "상동체"는 다른 종의 것들을 포함하여 기능적으로 및 구조적으로 관련된 분자를 광범위하게 지칭한다. 상동체 및 오르톨로그는 변이체의 예이다.
핵산 서열 동일성은 하기 방식으로 결정될 수 있다. 대상 핵산 서열은 프로그램 BLASTM 버전 2.1 (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402)을 이용하여 진뱅크(GenBank) 데이터베이스 (웹사이트 www.ncbi.nln.nih.gov/blast/에서 접근가능)와 같은 핵산 서열 데이터베이스를 검색하는데 이용된다. 프로그램은 갭이 없는 모드에서 사용된다. 디폴트 필터링은 복잡성이 낮은 영역에 기인한 서열 상동성을 제거하는데 사용된다. BLASTM의 디폴트 파라미터가 사용된다.
아미노산 서열 동일성은 하기 방식으로 결정될 수 있다. 대상 폴리펩티드 서열은 BLASTP 프로그램을 이용하여 진뱅크 데이터베이스 (웹사이트 www.ncbi.nln.nih.gov/blast/에서 접근가능)와 같은 폴리펩티드 서열 데이터베이스를 검색하는데 사용된다. 프로그램은 갭이 없는 모드에서 이용된다. 디폴트 필터링은 복잡성이 낮은 영역에 기인한 서열 상동성을 제거하는데 사용된다. BLASTP의 디폴트 파라미터가 활용된다. 복잡성이 낮은 서열에 대한 필터링은 SEG 프로그램을 이용할 수 있다.
바람직한 서열은 엄격한 조건 하에서 참조 서열 또는 그의 상보체에 하이브리드화할 것이다. 용어 "엄격한 조건 하에서 하이브리드화한다" 및 그의 문법적 등가물은 온도 및 염 농도의 정의된 조건 하에서 표적 핵산 분자 (예를 들어, 서던 블롯 또는 노던 블롯과 같은 DNA 또는 RNA 블롯에 고정된 표적 핵산 분자)에 하이브리드화하는 핵산 분자의 능력을 지칭한다. 길이가 약 100개 염기보다 큰 핵산 분자와 관련하여, 전형적인 엄격한 하이브리드화 조건은 천연 듀플렉스의 용융 온도 (Tm) 미만인 25℃ 이하 내지 30℃ 이하 (예를 들어, 10℃)이다 (일반적으로 문헌 (Sambrook et al., (상기 참조); Ausubel et al., (1999)) 참조). 약 100개 초과 염기의 핵산 분자에 대한 Tm은 수학식 Tm=81.5+0.41% (G+C-log (Na+))에 의해 계산될 수 있다. 100개 미만 염기의 길이를 갖는 핵산 분자와 관련하여, 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 Tm보다 5℃ 내지 10℃ 낮다.
본 문맥에서 용어 "결실"은 표적 유전자의 코딩 영역의 전부 또는 일부의 제거를 지칭한다. 이 용어는 또한 표적 유전자의 유전자 발현을 제거하거나 코딩된 단백질의 수준 또는 활성을 제거하거나 실질적으로 하향조절하는 임의의 형태의 돌연변이 또는 형질전환을 포괄한다.
"유전자"에 대한 언급은 유전자의 엑손 또는 오픈 리딩 프레임에 상응하는 DNA를 포함한다. 본원에서 "유전자"에 대한 언급은 또한 하기를 포함하는 것으로 간주된다: 전사 및/또는 번역 조절 서열 및/또는 코딩 영역 및/또는 비-번역 서열(즉, 인트론, 5'- 및 3'- 비번역 서열)로 이루어진 고전적인 게놈 유전자; 또는 유전자의 코딩 영역 (즉, 엑손) 및 5' 및 3' 비-번역 서열에 상응하는 mRNA 또는 cDNA.
"조절 요소" 또는 "조절 서열"은 특정한 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 핵산 서열 (예를 들어, DNA)을 의미한다. 예를 들어, 원핵 세포에 적합한 조절 서열은 프로모터, 및 임의적으로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위와 같은 시스-작용 서열을 포함한다. 진핵 세포에 적합한 제어 서열은 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 전사 인핸서, 번역 인핸서, mRNA 안정성을 조정하는 리더 또는 트레일링 서열 뿐만 아니라 전사된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 산물을 세포 내의 세포내 구획으로 또는 세포외 환경으로 표적화하는 표적화 서열을 포함한다.
본 발명의 변형된 포유동물 세포에 영향을 미치기에 적합한 키메라 구축물은 조절 서열에 작동가능하게 연결된 오르토폭스 숙주 범위 인자를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 조절 서열은 적합하게는 세포에서의 발현에 적합할 전사 및/또는 번역 제어 서열을 포함한다. 전형적으로, 전사 및 번역 조절 조절 서열은 프로모터 서열, 5' 비-코딩 영역, 시스-조절 영역, 예컨대 전사 조절 단백질 또는 번역 조절 단백질에 대한 기능적 결합 부위, 업스트림 오픈 리딩 프레임, 리보솜-결합 서열, 전사 개시 부위, 번역 개시 부위, 및/또는 리더 서열, 종결 코돈, 번역 정지 부위 및 3' 비-번역 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 관련 기술분야에 공지된 구성적 또는 유도성 프로모터가 고려된다. 프로모터는 자연 발생 프로모터, 또는 요소 또는 하나 초과의 프로모터를 조합하는 하이브리드 프로모터일 수 있다.
고려되는 프로모터 서열은 포유동물 세포에 고유할 수 있거나, 영역이 선택된 유기체에서 기능적인 대안적 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터의 선택은 의도된 숙주 세포에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 포유동물 세포에서 발현을 위해 사용될 수 있는 프로모터는 특히 카드뮴과 같은 중금속에 반응하여 유도될 수 있는 메탈로티오네인 프로모터, β-액틴 프로모터 뿐만 아니라 SV40 대형 T 항원 프로모터와 같은 바이러스 프로모터, 인간 시토메갈로바이러스 (CMV) 즉시 초기 (IE) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 LTR 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 LTR 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (Ad MLP), 단순 포진 바이러스 프로모터, 및 HPV 프로모터, 특히 HPV 업스트림 조절 영역 (URR)을 포함한다. 이러한 모든 프로모터는 널리 기재되어 있으며 관련 기술분야에서 쉽게 이용가능하다.
활성인 바이러스 복제 주기 내의 기간에 의해 구별되는 다수의 폭스바이러스 프로모터 유형이 있다. 초기 프로모터는 감염 후기에도 활성적일 수 있지만 후기 프로모터의 활성은 후기 단계에 제한된다. 중간 프로모터로 명명되는 제3 부류의 프로모터는 초기 단계에서 후기 단계로의 전환에서 활성적이며 바이러스 DNA 복제에 의존한다. 폭스바이러스 복제 주기의 초기 및 후기 단계 둘 다에서 활성적인 프로모터는 일반적으로 폭스바이러스 벡터에서 신생항원의 발현을 지시하는데 사용된다. 조밀한 합성 프로모터 (prPs)는 강력한 초기 및 후기 유전자 발현을 지시하기 위해 널리 사용되어 왔다. pr7.5 프로모터는 백시니아 바이러스 벡터에 의한 재조합 유전자 발현에 사용되는 천연 초기-후기 프로모터의 또 다른 예이다.
본원에 사용된 용어 "초기/후기 프로모터"는 바이러스 DNA 복제가 발생하기 전 및 후에 바이러스 감염된 세포에서 활성적인 프로모터를 지칭한다. 합성 백시니아 초기/후기 프로모터 (Ps), 천연 백시니아 초기/후기 프로모터 (p7.5), 및 파울폭스 초기/후기 프로모터 (pE/L)를 포함하는 폭스바이러스 초기/후기 프로모터가 특히 바람직하다. 본원에 사용된 프로모터는 달리 명시되지 않는 한 백시니아 바이러스 프로모터이다.
인핸서 요소는 또한 포유동물 구축물의 발현 수준을 증가시키기 위해 본원에서 사용될 수 있다. 예는, 예를 들어 문헌 (Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761)에 기재된 바와 같은 SV40 초기 유전자 인핸서, 예를 들어 문헌 (Gorman et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777)에 기재된 바와 같은 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복부 (LTR)로부터 유래되는 인핸서/프로모터, 및 문헌 (Boshart et al. (1985) Cell 41:521)에 기재된 바와 같은 인간 CMV로부터 유래되는 요소, 예컨대 CMV 인트론 A 서열에 포함된 요소를 포함한다.
키메라 구축물은 또한 3' 비-번역 서열을 포함할 수 있다. 3' 비-번역 서열은 폴리아데닐화 신호 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 임의의 다른 조절 신호를 함유하는 DNA 절편을 포함하는 유전자 부분을 지칭한다. 폴리아데닐화 신호는 mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 트랙을 추가하는 것을 특징으로 한다. 변형이 드물지 않지만, 폴리아데닐화 신호는 일반적으로 표준 형태 5' AATAAA-3'에 대한 상동성의 존재에 의해 인식된다. 3' 비-번역 조절 DNA 서열은 바람직하게는 약 50 내지 1,000 nt를 포함하고, 폴리아데닐화 신호 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 임의의 다른 조절 신호 외에 전사 및 번역 종결 서열을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키메라 구축물은 구축물을 함유하는 세포의 선택을 허용하는 선택가능한 마커 유전자를 추가로 함유한다. 선택 유전자는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 관심 세포에서의 발현에 적합할 것이다.
한 실시양태에서, 폭스바이러스 구조적 또는 어셈블리 유전자의 발현은 프로모터의 제어 하에 있다. 한 비제한적 실시양태에서, 프로모터는 숙주 세포에 대한 유의한 독성 영향의 부재 하에서 바이러스 증식을 유지하기에 충분한 수준의 CP77의 발현을 지시하는 인간 EF1 알파 (인간 신장 인자 1 알파 유전자 프로모터), DHFR (디히드로폴레이트 리덕타제 유전자 프로모터) 또는 PGK (포스포글리세레이트 키나제 유전자 프로모터)와 같은 세포성 구성적 프로모터이다. 세포성 유도성 프로모터와 같은 프로모터도 유도성일 수 있으며, MTH (메탈로티오네인 유전자 유래) 바이러스 프로모터도 CMV, RSV, SV-40, 및 MoU3과 같은 포유동물 세포에서 사용된다.
본 발명은 코로나바이러스 질환 19 (COVID-19)로 불리는 질환의 유발인자인 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스-2 (SARS-CoV-2)로 불리는 신규 코로나바이러스에 대한 예방 백신용 조성물을 제공한다. COVID-19는 세계 보건 기구 (WHO)에 의해 팬데믹으로 선언되었으며 전 세계적으로 많은 사람들에게 영향을 미치고 있다. SARS-CoV-2는 포지티브-센스 단일-가닥 RNA 바이러스이다. SARS-CoV-2 게놈은 길이가 약 29,700개의 뉴클레오티드이며 SARS-CoV와 79.5%의 서열 유사성을 가지고 있으며; 15개 또는 16개의 비-구조적 단백질을 코딩하는 5' 말단 긴 ORF1ab 폴리단백질은 갖고, 3' 말단 게놈은 4가지 주요 구조적 단백질 (스파이크, 뉴클레오캡시드, 막 및 엔벨로프)을 코딩한다. SARS-CoV-2는 바이러스 진입 및 최종 발병기전을 위해 숙주 세포에서 발현되는 안지오텐신 수용체 전환 효소 2 (ACE2)에 결합한다. SARS-CoV-2 바이러스는 주로 발열, 마른 기침, 호흡곤란, 두통, 현기증, 전신 쇠약, 구토 및 설사를 포함한 증상과 함께 호흡기에 영향을 미친다. 현재의 의료 관리는 이용가능한 표적화된 요법이 없어 대체로 지지적이다.
돌연변이를 통해 변화하는 SARS-CoV-2를 포함하는 RNA 바이러스의 고유한 경향은 시간이 지남에 따라 발생하는 새로운 변이체와 함께 전 세계적으로 문서화되었다. 대부분의 부상하는 돌연변이는 확산에 유의한 영향을 미치지 않을 것이지만, 바이러스에 선택적인 이점을 부여하는 돌연변이는 일반적으로 집단에서 변이체의 증가된 유병률에서 반영되는 바와 같이 유지된다. 기록된 많은 SARS-CoV-2 변이체 중 선택된 일부는 전염성 증가, 보다 심각한 질환을 일으킬 수 있는 능력 및/또는 감염 또는 백신접종 후 발생하는 면역 반응을 회피하는 능력 증가로 인해 공중 보건 문제가 된다. 2021년에, 관심 변이체 (VOC)을 반영하는 3가지 특정 바이러스 계통이 출현하였다: B.1.1.7, B.1.351, 및 B.1.1.28.1. D614G로 지칭되는 돌연변이는 관심 변이체 3개에서 공유된다. 이는 다른 우세한 바이러스 및 이 돌연변이가 없는 다른 SARS-CoV-2 스트레인에 비해 증가된 전염성을 바이러스에 부여한다.
본원에 사용된 바와 같이, 관심 변이체는 B.1.1.17, B.1.351, 및 B.1.1.28.1, 특히 P.1 계통을 지칭한다. B.1.1.7 변이체는 2020년 9월 영국 남부에서 처음 확인되었다. 이 변이체는 위치 501에서 스파이크 단백질의 RBD에 돌연변이가 있으며, 여기서 아미노산 아스파라긴 (N)이 티로신 (Y)으로 대체되었으며, 따라서 돌연변이는 N501Y로 지칭된다. B.1.1.7 변이체는 다른 변이체에 비해 더 효율적이고 신속한 전파 및 사망 위험 증가와 관련이 있다. B1.1.351 변이체는 2020년 10월 남아프리카에서 처음 확인되었다. 이 변이체는 K417N, E484K 및 N501Y를 포함하여 스파이크 단백질에 다수의 돌연변이가 있다. 돌연변이 E484K는 폴리클로날 및 모노클로날 항체에 의한 중화에 영향을 미치는 것으로 나타났다. B.1.1.28 변이체, 특히 이 계통의 P.1 브랜치는 2021년 1월 일본에 도착한 브라질 여행자에게서 처음 확인되었다. P.1 계통은 K417T, E484K, 및 N501Y를 포함하여 스파이크 단백질 RBD에 3개의 돌연변이를 함유한다. 돌연변이는 SARS-CoV-2의 전염성 및 항원 프로파일을 증가시킨다.
본원에서 사용된 바와 같이, SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 S1 서브유닛은 수용체 결합 도메인 영역 내에 면역우세 T 세포 에피토프 YNYLYRLF (SEQ ID NO:9), VVLSFELL (SEQ ID NO:10), 및 VNFNFNGL (SEQ ID NO:11)을 함유한다. VVLSFELL (SEQ ID NO:10) 및 VNFNFNGL (SEQ ID NO:11) 에피토프는 이전에 SARS-CoV의 마우스 연구에서도 확인되었다. SARS-CoV와 SARS-CoV-2 사이에 보존된 이러한 에피토프는 SARS-CoV-2에서 면역 반응을 일으키도록 지시된 백신이 SARS-CoV에 대해 교차-반응성일 수 있음을 나타낼 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 스트레인/단리물의 유전자 서열은 모든 인플루엔자 데이터 공유에 관한 글로벌 이니셔티브 (GISAID: Global Initiative on Sharing All Influenza Data)를 통해 이용가능하게 되며, 예를 들어, Wuhan/IVDC-HB-01/2019 (GISAID 수탁 ID: EPI_ISL_402119~121)를 포함하여 SARS-CoV-2의 다양한 스트레인/단리물로부터의 게놈 서열 데이터를 포함한다. SARS-CoV-2의 게놈 서열은 COVID19에 대한 백신과 같은 잠재적 개입 옵션을 설계하고 평가하는데 중요하다.
본 발명은 코로나바이러스 감염에 대한 면역 반응 및/또는 중화 항체 반응을 유도하기 위한 백신으로 사용될 수 있는 이종 코로나바이러스 항원을 발현하기 위한 약독화된 폭스바이러스를 포함하는 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "약독화", "약독화된" 등은 바이러스 벡터 병독성의 감소를 의미한다. 병독성은 전형적으로 특정한 숙주에서 질환을 유발하는 바이러스의 능력으로 정의된다. 예를 들어, 감염성 바이러스를 생산할 수 없는 폭스바이러스는 초기에 세포를 감염시킬 수는 있지만 실질적으로 자체를 완전히 복제하거나 숙주 또는 숙주 세포 내에서 증식하거나 질환 또는 병태를 유발할 수 없다. 이는 폭스바이러스 벡터가 핵산을 숙주 또는 숙주 세포에 전달할 수는 있지만 전형적으로 숙주 또는 숙주 세포에 해를 끼치지 않기 때문에 바람직하다.
폭스바이러스 과는 2개의 아과, 코르도폭스비리나에 및 엔토모폭스비리나에를 포함한다. 코르도폭스비리나에는 인간을 감염시키는 종을 포함하는 오르토폭스비리다에를 포함하여 8개의 속을 포함하는 반면 엔토모폭스비리나에는 곤충을 감염시킨다. 오르토폭스비리다에는, 예를 들어, 천연두의 유발인자인 바리올라 바이러스, 1796년 제너에 의해 보고된 최초의 천연두 백신을 형성한 카우폭스 바이러스, 및 2세대 천연두 백신으로 사용되어온 백시니아 바이러스를 포함한다. 아비폭스비리다에 바이러스는 파울폭스 및 카나리폭스 바이러스와 같은 조류를 감염시키는 종을 포함한다. 천연두 백신에서 항원으로 사용하는 것 외에도, 관심 이종 유전자를 전달 및/또는 발현하기 위한 벡터로서 재조합 백시니아-기반 바이러스 및 아비폭스 바이러스의 사용에 많은 관심이 있다. 세포질내 벡터로서 오르토폭스비리다에는 외래 항원을 숙주 세포질 및 항원을 세포 표면에 제시하기 위해 펩티드로 프로세싱하는 항원 프로세싱 경로로 전달할 수 있다. 외래 항원을 발현하는 이러한 벡터는 유전자 요법 및 광범위한 병태 및 질환에 대한 백신 개발에 사용하기에 적합하다.
폭스바이러스는 큰 선형 dsDNA 게놈, 증식의 세포질 부위 및 복잡한 비리온 형태를 특징으로 하는 바이러스의 큰 계열을 구성한다. 백시니아 바이러스는 이러한 그룹의 바이러스 중 대표적인 바이러스이며, 바이러스 형태형성 측면에서 가장 많이 연구된 바이러스 중 하나이다. 백시니아 바이러스는 복잡한 내부 구조를 갖는 "벽돌 형상의" 또는 "난형" 막-결합된 입자로 다양하게 나타나며, "측면체"에 의해 플랭킹된 벽으로 둘러싸인 양면 오목 중심부를 특징으로 한다. 비리온 어셈블리 경로는 미성숙 비리온 (IV)으로 발달한 후 성숙한 비리온 (MV)으로 진화하는 크레센트를 함유하는 막의 제작을 수반한다. 백시니아 바이러스 비리온에는 70개 초과의 특정 유전자 산물이 함유되어 있으며, 여기서 백시니아 바이러스 어셈블리에 대한 50개 초과의 특정 유전자 돌연변이의 영향이 이제 설명된다.
적합한 약독화된 폭스바이러스는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 예시적인 예는 약독화된 변형된 백시니아 앙카라 (MVA), NYVAC, 아비폭스, 카나리폭스 및 파울폭스를 포함한다.
본원에 개시된 실시양태에서, 약독화된 폭스바이러스는 약독화된 백시니아 바이러스이다. 백시니아 바이러스 스트레인의 예시적인 예는 MVA, NYVAC, 코펜하겐 (COP), 웨스턴 리저브 (WR), NYCBH, 와이어스(Wyeth) 스트레인, ACAM2000, LC16m8 및 코노트 래보러토리즈(Connaught Laboratories: CL)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세멘티스 코펜하겐 벡터" 또는 "SCV"는 변형된 CHO 세포에서 제조가능한 백시니아-바이러스 기반의 증식-결함된 백신 벡터 기술 플랫폼을 지칭한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 다른 오르토폭스바이러스 스트레인이 약독화된 폭스바이러스를 생산하도록 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 예시적인 예에서, 약독화된 폭스바이러스는 폭스바이러스 게놈으로부터 내인성 필수 어셈블리 또는 성숙 단백질을 코딩하는 유전자를 변형 (예를 들어, 결실, 치환 또는 달리 기능 파괴)함으로써 생산될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 실시양태에서, 약독화된 폭스바이러스는 변형된 오르토폭스바이러스이며, 여기서 변형은 내인성 필수 어셈블리 또는 성숙 단백질을 코딩하는 유전자의 결실을 포함한다.
한 실시양태에서, 약독화된 폭스바이러스는 변형된 백시니아 바이러스이며, 여기서 변형은 내인성 어셈블리 또는 성숙 단백질을 코딩하는 백시니아 바이러스 게놈의 유전자의 결실 (또는 달리 기능 파괴)을 포함하며, 여기서 변형은 숙주 세포 (예를 들어, 인간 세포)에서 증식하는 (또는 증식할 수 있는) 백시니아 벡터를 숙주 세포에서 실질적으로 비-복제성인 약독화된 백시니아 벡터로 전환시킨다.
한 실시양태에서, 필수 내인성 어셈블리 또는 성숙 유전자는 COP-A2.5L, COP-A3L, COP-A4L, COP-A7L, COP-A8R, COP-A9L, COP-A10L, COP-A11R, COP-A12L, COP-A13L, COP-A14L, COP-A14.5L, COP-A15L, COP-A16L, COP-A17L, COP-A21L, COP-A22R, COP-A26L, COP-A27L, COP-A28L, COP-A30L, COP-A32L, COP-D2L, COP-D3R, COP-D6R, COP-D8L, COP-D13L, COP-D14L, COP-E8R, COP-E10R, COP-E11L, COP-F10L, COP-F17R, COP-G1L, COP-G3L, COP-G4L, COP-G5R, COP-G7L, COP-H1L, COP-H2R, COP-H3L, COP-H4L, COP-H5R, COP-H6R, COP-I1L, COP-I2L, COP-I6L, COP-I7L, COP-I8R, COP-J1R, COP-J4R, COP-J6R, COP-L1R, COP-L3L, COP-L4R 및 COP-L5R로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 오르토폭스바이러스 스트레인이 폭스바이러스의 면역원성을 변경하도록 변형될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 예시적인 예에서, 향상된 면역원성을 갖는 폭스바이러스는 면역조정 단백질을 코딩하는 폭스바이러스 게놈으로부터 유전자를 결실시킴으로써 생산될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 실시양태에서, 약독화된 폭스바이러스는 변형된 오르토폭스바이러스이며, 여기서 변형은 면역조절 단백질/단백질들을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 결실을 포함한다.
한 실시양태에서, 면역 조정 유전자 또는 유전자들은 COP-C23L, COP-B29R, COP-C3L, COP-N1L, COP-A35R, COP-A39R, COP-A41L, COP-A44R, COP-A46R, COP-B7R, COP-B8R, COP-B13R, COP-B16R, 및 COP-B19R로 이루어진 군으로부터 선택된 것들을 포함한다.
다른 오르토폭스바이러스 스트레인은 코딩 서열에 대한 파괴 또는 변경 없이 이에 따라 바이러스의 전형적인 특징 및 유전자 발현을 유지하면서 특히 유전자간 영역에서 백시니아 게놈에 안정적으로 삽입될 수 있는 이종 DNA 서열을 통합하도록 변형될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
한 실시양태에서, 약독화된 폭스바이러스는 변형된 백시니아 바이러스이며, 여기서 변형은 바이러스 게놈의 유전자간 영역에 삽입된 외인성 DNA 서열, 예를 들어 코로나바이러스 스트레인로부터 유래된 DNA 서열을 포함하며, 여기서 유전자간 영역은 차례로 백시니아 게놈의 2개의 인접한 오픈 리딩 프레임 (ORF) 사이에 위치되거나 또는 그에 의해 플랭킹되며, 여기서 오픈 리딩 프레임은 보존된 유전자에 상응한다.
한 실시양태에서, 이종 DNA 서열이 삽입될 수 있는 2개의 인접한 ORF 사이에 있는 유전자간 영역 또는 영역들은 001L-002L, 002L-003L, 005R-006R, 006L-007R, 007R-008L, 008L-009L, 017L-018L, 018L-019L, 019L-02OL, 020L-021L, 023L-024L, 024L-025L, 025L-026L, 028R-029L, 03OL-031L, 031L-032L, 032L-033L, 035L-036L, 036L-037L, 037L-038L, 039L-040L, 043L-044L, 044L-045L, 046L-047R, 049L-050L, 050L-051L, 051L-052R, 052R-053R, 053R-054R, 054R-055R, 055R-056L, 061L-062L, 064L-065L, 065L-066L, 066L-067L, 077L-078R, 078R-079R, 080R-081R, 081R-082L, 082L-083R, 085R-086R, 086R-087R, 088R-089L, 089L-090R, 092R-093L, 094L-095R, 096R-097R, 097R-098R, 101R-102R, 103R-104R, 105L-106R, 107R-108L, 108L-109L, 109L-110L, 110L-111L, 113L-114L, 114L-115L, 115L-116R, 117L-118L, 118L-119R, 122R-123L, 123L-124L, 124L-125L, 125L-126L, 133R-134R, 134R-135R, 136L-137L, 137L-138L, 141L-142R, 143L-144R, 144R-145R, 145R-146R, 146R-147R, 147R-148R, 148R-149L, 152R-153L, 153L-154R, 154R-155R, 156R-157L, 157L-158R, 159R-160L, 160L-161R, 162R-163R, 163R-164R, 164R-165R, 165R-166R, 166R-167R, 167R-168R, 170R-171R, 173R-174R, 175R-176R, 176R-177R, 178R-179R, 179R-180R, 180R-181R, 183R-184R, 184R-185L, 185L-186R, 186R-187R, 187R-188R, 188R-189R, 189R-190R, 192R-193R을 포함하는 군으로부터 선택된 것들을 포함한다 (또한 PCT/EP03/05045 참조).
이전 명명법에 따르면, ORF 006L은 C10L에 상응하고, 019L은 C6L, 020L은 N1L에, 021L은 N2L에, 023L은 K2에L, 028R은 K7R에, 029L은 F1L에, 037L은 F8L에, 045L은 F15L에, 050L은 E3L에, 052R은 E5R에, 054R은 E7R에, 055R은 E8R에, 056L은 E9L에, 062L은 I1L에, 064L은 I4L에, 065L은 I5L에, 081R은 L2R에, 082L은 L3L에, 086R은 J2R에, 087은 J3R에, 088R은 J4R에, 089L은 J5L에, 092R은 H2R에, 095R은 H5R에, 107R은 D10R에, 108L은 D11L에, 122R은 A11R에, 123L은 A12L에, 125L은 A14L에, 126L은 A15L에, 135R은 A24R에, 136L은 A25L에, 137L은 A26L에, 141L은 A30L에, 148R은 A37R에, 149L은 A38L에, 152R은 A40R에, 153L은 A41L에, 154R은 A42R에, 157L은 A44L에, 159R은 A46R에, 160L은 A47L에, 165R은 A56R에, 166R은 A57R에, 167R은 B1R에, 170R은 B3R에, 176R은 B8R에, 18OR은 B12R에, 184R은 B16R에, 185L은 B17L에, 그리고 187R은 B19R에 상응한다.
한 실시양태에서, 이종 DNA 서열이 삽입될 수 있는 2개의 인접한 ORF 사이의 유전자간 영역 또는 영역들은 F9L-F10L, F12L-F13L, F17R-E1L, E1L-E2L, E8R-E9L, E9L-E10R, I1L-I2L, I2L-I3L, I5L-I6L, I6L-I7L, I7L-I8R, I8R-G1L, G1L-G3L, G3L-G2R, G2R-G4L, G4L-G5R, G5R-G5.5R, G5.5R-G6R, G6R-G7L, G7L-G8R, G8R-G9R, G9R-L1R, L1R-L2R, L2R-L3L, L3L-L4R, L4R-L5R, L5R-J1R, J3R-J4R, J4R-J5L, J5L-J6R, J6R-H1L, H1L-H2R, H2R-H3L, H3L-H4L, H4L-H5R, H5R-H6R, H6R-H7R, H7R-D1R, D1R-D2L, D2L-D3R, D3R-D4R, D4R-D5R, D5R-D6R, D6R-D7R, D9R-D10R, D10R-D11L, D11L-D12L, D12L-D13L, D13L-A1L, A1L-A2L, A2L-A2.5L, A2.5L-A3L, A3L-A4L, A4L-A5R, A5R-A6L, A6L-A7L, A7L-A8R, A8R-A9L, A9L-A10L, A10L-A11R, A11R-A12L, A12L-A13L, A13L-A14L, A14L-A14.5L, A14.5L-A15L, A15L-A16L, A16L-A17L, A17L-A18R, A18R-A19L, A19L-A21L, A21L-A20R, A20R-A22R, A22R-A23R, A23R-A24R, A28L-A29L, A29L-A30L (또한 PCT/IB2007/004575 참조)을 포함하는 군으로부터 선택된 것들을 포함한다.
한 실시양태에서, 변형은 A41L 유전자의 결실을 포함한다.
한 실시양태에서, 변형은 A41L 유전자 및/또는 D13L 유전자의 결실을 포함한다.
한 실시양태에서, 변형은 A41L 유전자 및/또는 D13L 유전자 및/또는 B7R-B8R 유전자의 결실을 포함한다.
한 실시양태에서, 변형은 A41L 유전자 및/또는 D13L 유전자 및/또는 B7R-B8R 유전자, 및/또는 C3L 유전자, 및/또는 A39R 유전자의 결실을 포함한다.
A41L 유전자 및/또는 D13L 유전자 및/또는 B7R-B8R 유전자, 및/또는 C3L 유전자, 및/또는 A39R 유전자의 결실이 폭스바이러스에 대해 약독화 및 증가된 면역원성과 같은 유리한 특징을 제공한다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
한 실시양태에서, 변형은 J2R 및 J3R 유전자 사이에 위치된 유전자간 영역에 이종 DNA 서열의 삽입을 포함한다.
유전자간 영역에 이종 DNA 서열의 삽입은 바이러스의 코딩 서열을 파괴하지 않고 변경하지도 않는다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
한 실시양태에서, 재조합 SCV 벡터는 VLP로 어셈블링하는 하나 이상의 구조적 단백질 및 비-구조적 단백질을 발현한다.
한 실시양태에서, SARS-CoV-2 항원은 발현 시 바이러스-유사 입자 (VLP)로 어셈블링한다.
한 실시양태에서, 벡터는 VLP를 형성하고 SARS-CoV-2 항원 또는 그의 면역원성 단편에 대한 면역 반응을 생성하는 단백질을 발현한다.
예시적인 실시양태에서, 면역 반응은 반복된 부스터가 필요하지 않도록 오래 지속되고 내구성이 있지만, 하나 이상의 실시양태/실시양태들에서, 본원에 제공된 조성물의 하나 이상의 투여는 초기 프라이밍된 면역 반응을 부스팅하기 위해 제공된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 천연 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 천연 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 스파이크 단백질의 사용은 스파이크 단백질을 예비융합 형태로 안정화시키고, 구조적 재배열을 방지하고, 우월한 면역 반응을 도출하기 위해 항원적으로 바람직한 표면을 노출시키도록 지시된 조작된 변이체를 포함한다. 이러한 변형은 안정화 돌연변이 도입 및 분자 클램프 사용을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드의 S1 수용체-결합 도메인 서브유닛을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 천연 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드의 S1 수용체-결합 도메인 서브유닛, 및 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드의 S1 수용체-결합 도메인 서브유닛, 및 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 보호 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 조성물은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 막 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키고/거나 COVID-19 질환의 중증도를 감소시키는 동물에서의 보호 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 조성물은 약독화된 폭스바이러스, 특히 백시니아 바이러스를 포함하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 약독화된 폭스바이러스를 포함하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물 및 약독화된 폭스바이러스를 포함하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 SARS-CoV-2의 막 및 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분 또는 부분들을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물의 동등한 양을 포함하는 혼합 조성물을 투여하는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대해 대상체에서 보호 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 약독화된 폭스바이러스를 포함하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 천연 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물 및 약독화된 폭스바이러스를 포함하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 변형되었고 SARS-CoV-2의 막 및 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분 또는 부분들을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물의 동등한 양을 포함하는 혼합 조성물을 투여하는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대해 대상체에서 보호 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
제1 측면에서, 본 발명은 대상체에게 상기 중 임의의 것과 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대해 대상체에서 보호 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
제2 측면에서, 본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스-유사 입자를 닮음으로써 SARS-CoV-2 감염의 위험을 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 약독화된 폭스바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 감염 및 SARS-CoV-2와 유전적 유사성을 갖는 코로나바이러스에 의해 유발되는 임의의 다른 감염의 위험을 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 폭스바이러스 게놈은 SARS-CoV-2의 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및/또는 SARS-CoV-2의 막 및 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분, 및/또는 SARS-CoV-2의 엔벨로프 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 또는 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
제4 측면에서, 본 발명은 코로나바이러스 감염에 대해 대상체에서 중화 항체 반응 및/또는 보호 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서의 본원에서 고려되는 실시양태의 조성물의 용도를 제공한다.
면역원성은 폭스바이러스 벡터로부터 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드 또는 스파이크 폴리펩티드의 S1 수용체 결합 도메인 서브유닛을 발현함으로써 달성될 수 있다. 역사적으로, SARS-CoV 또는 MERS-CoV와 같은 코로나바이러스의 스파이크 단백질은 면역원성인 것으로 밝혀져 세포-매개된 면역 반응 뿐만 아니라 숙주 세포로의 바이러스 진입을 억제하는 중화 항체를 포함한 체액성 면역 반응을 도출한다. 면역원성은 스파이크-특이적 T 세포 반응을 유도함으로써 달성될 수도 있다. SARS-CoV-2 바이러스에 대한 SCV-COVID 백신에 의해 유도되는 스파이크-특이적 세포성 및 체액성 반응은 폭스바이러스 벡터에 의해 유도되는 Th1-편향된 항체 생산으로 보완되어 SARS-CoV-2 감염에 대한 예방적 보호를 제공할 수 있다.
면역원성은 폭스바이러스 벡터로부터 SARS-CoV-2 막 단백질 폴리펩티드를 발현함으로써 달성될 수 있다. SARS-CoV에서, 막 단백질은 바이러스 표면에 풍부한 것으로 나타났으며; 또한, SARS를 갖는 환자의 면역화에 사용될 때 막 단백질은 중화 항체의 높은 역가를 유도하였다. 면역원성 및 구조적 분석은 강건한 세포성 면역 반응을 촉발할 수 있는 T-세포 에피토프 클러스터가 막 단백질에 존재함을 입증하였다. 막 단백질은 또한 많은 바이러스 종에서 고도로 보존되어 있기 때문에 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 우수한 항원 후보이다. SARS-CoV-2 바이러스에 대한 SCV-COVID 백신에 의해 유도되는 막-특이적 세포성 및 체액성 반응은 폭스바이러스 벡터에 의해 유도되는 Th1-편향된 항체 생산으로 보완되어 SARS-CoV-2 감염에 대한 예방적 보호를 제공할 수 있다.
면역원성은 폭스바이러스 벡터로부터 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드를 발현함으로써 달성될 수 있다. 최근에 SARS-CoV-2 감염이 대부분 뉴클레오캡시드 항원에 대해 지시된 항체의 생산을 야기한다는 것이 발견되었다. 그러나, N 단백질 항체는 바이러스 진입을 차단할 수 없고 '비-중화' 항체로 간주되기 때문에, N 항체는 간과되어 왔다. 따라서, 현재 체액성 면역을 평가하기 위해 사용되는 중화 검정으로는 항-N 항체를 측정할 수 없다. 최근 연구에 따르면 세포 내부로 들어가는 항-N 항체는 항체 수용체 TRIM21에 의해 인식되어 연관된 N 단백질을 쪼개는 것으로 나타났다. 이어서, T 세포에 의한 검출을 위해 N 단백질 에피토프가 디스플레이된다. 이 면역 반응 메커니즘은 결국 면역학적 기억을 매개할 T 세포를 수반하므로, 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 항체는 미래의 감염에 대한 장기적인 보호를 자극할 수 있다. SARS-CoV-2 바이러스에 대한 SCV-COVID 백신에 의해 유도되는 뉴클레오캡시드-특이적 세포성 및 체액성 반응은 폭스바이러스 벡터에 의해 유도되는 Th1-편향된 항체 생산으로 보완되어 SARS-CoV-2 감염에 대한 예방적 보호를 제공할 수 있다.
면역원성은 폭스바이러스 벡터 내에서 SARS-CoV-2 스파이크 단백질, 또는 그의 부분, 막 단백질 폴리펩티드, 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드, 및/또는 엔벨로프 단백질 폴리펩티드를 동시에 발현함으로써 달성될 수 있다. 구조적 단백질의 조합된 면역원성은 보다 강건한 항원-특이적 면역 반응을 일으킬 수 있다. 또한, S, M, N 및/또는 E 폴리펩티드의 존재는 코로나바이러스 구조를 모방하지만 감염성인 유전 물질이 결여된 빈 바이러스 껍질인 진정한 바이러스 유사 입자 (VLP)의 형성을 야기할 수 있다. SARS-CoV-2 바이러스에 대한 SCV-COVID 백신에 의해 유도되는 항원- 및 VLP-특이적 세포성 및 체액성 반응은 폭스바이러스 벡터에 의해 유도되는 Th1-편향된 항체 생산으로 보완되어 COVID-19에 대한 예방적 보호를 제공할 수 있다. SARS-CoV-2 바이러스에 대한 SCV-COVID 백신에 의해 유도되는 VLP-특이적 세포성 및 체액성 반응은 폭스바이러스 벡터에 의해 유도되는 Th1-편향된 항체 생산으로 보완되어 COVID-19에 대한 예방적 보호를 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 형태에서, 약독화된 폭스바이러스는 백시니아 바이러스, NYVAC, 및 SCV로 이루어진 군으로부터 선택된다. 약독화된 폭스바이러스는 변형이 내인성 필수 어셈블리 또는 성숙 단백질을 코딩하는 유전자의 결실을 포함하는 변형된 오르토폭스바이러스인 것이 바람직하다. 변형이 D13L 유전자의 결실을 포함하고 바람직하게는 K1L 유전자의 결실을 추가로 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
본원에서 가능하게 된 다양한 실시양태는 하기의 비제한적인 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예 1
백신의 구축
SCV-COVID19 백신을 구축하기 위해, 침묵 돌연변이를 이용하여 항원 코딩 서열 내의 초기 전사 종결 신호를 제거하고, 항원 트랜스진에 대한 발현 카세트를 드 노보 합성하거나 합성된 카세트로부터 PCR에 의해 구축하였다. 각각의 카세트는 폭스바이러스 프로모터 및 코작 서열 업스트림의 필수 제어 요소에 의해 플랭킹된 트랜스진 및 유전자 발현을 가능하게 하는 폭스바이러스 초기 전사 종결 신호 다운스트림으로 이루어진다. 분자 조작을 가능하게 하기 위해 플랭킹 엔도뉴클레아제 인식 부위가 포함될 수도 있다. 발현 카세트의 특정 예는 합성 초기/후기 프로모터를 갖는 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드 (도 1A), 천연 초기/후기 프로모터를 갖는 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드 (도 1B), 합성 초기/후기 프로모터를 갖는 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드의 S1 수용체-결합 도메인 서브유닛 (도 1C), 파울폭스 초기/후기 프로모터를 갖는 막 폴리펩티드 (도 1D), 합성 초기/후기 프로모터를 갖는 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 (도 1E), 파울폭스 초기/후기 프로모터를 갖는 막 폴리펩티드 및 합성 초기/후기 프로모터를 갖는 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 (도 1F), 합성 초기/후기 프로모터를 갖는 엔벨로프 폴리펩티드 (도 1G)에 대해 표시된다.
이어서, 트랜스진 발현 카세트를 표준 분자 생물학 방법을 이용하여 박테리아에서 증식될 수 있는 적절한 상동성 재조합 (HR) 플라스미드에 삽입하였다. HR 플라스미드는 사이에 트랜스진이 위치되는 폭스바이러스 게놈 부위와 상동성인 플랭킹 재조합 아암 (F1 및 F2)으로 이루어진 HR 카세트를 함유한다. 백시니아-COP 게놈과 관련된 상동성 재조합 부위는 도 2에 나타나 있다. 트랜스진 발현 카세트는 새로운 재조합 바이러스의 양성 선택 (예를 들어, CP77, 제오신 내성 또는 녹색 또는 청색 형광 단백질 (GFP 또는 BFP)과 같은 형광 리포터 단백질과 조합된 다른 약물 선택)을 가능하게 하는 유전자를 함유하는 추가의 폭스바이러스 발현 카세트에 인접한 재조합 아암 사이에 삽입된다. 선택 유전자는 모 바이러스가 제거되면 선택 유전자 결실을 가능하게 하는 150 bp의 동일한 비-코딩 DNA 서열에 의해 플랭킹된다. 바이러스 구축을 위한 HR 플라스미드를 제조하기 위해, 제한 엔도뉴클레아제 분해 (예를 들어, Not I)를 이용하여 HR 카세트를 방출한다. HR 카세트의 특정 예는 하기에 대해 표시된다:
Figure pct00002
백시니아 A41L ORF를 플랭킹하는 서열에 대해 상동성인 F1 및 F2 재조합 아암에 의해 플랭킹된 합성 초기/후기 프로모터 발현 카세트의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드 (도 3A, SEQ ID NO:1),
Figure pct00003
백시니아 A41L ORF를 플랭킹하는 서열에 대해 상동성인 F1 및 F2 재조합 아암에 의해 플랭킹된 천연 초기/후기 프로모터 발현 카세트의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드 (도 3B, SEQ ID NO:2),
Figure pct00004
백시니아 A41L ORF의 측면에 배치된 서열에 대해 상동성인 F1 및 F2 재조합 아암이 측면에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드 발현 카세트의 S1 서브유닛 (도 3C, SEQ ID NO:3),
Figure pct00005
백시니아 D13L ORF (도 3D, SEQ ID NO:4) 또는 J2R과 J3R 사이의 삽입을 가능하게 하는 백시니아 J2R 및 J3R ORF (도 2E, SEQ ID NO:5)를 플랭킹하는 서열에 대해 상동성인 좌측 및 우측 조합 아암에 의해 플랭킹된 SARS-CoV-2 막 및 뉴클레오캡시드 단백질 발현 카세트,
Figure pct00006
백시니아 C3L ORF를 플랭킹하는 서열에 대해 상동성인 좌측 및 우측 조합 아암에 의해 플랭킹된 SARS-CoV-2 막 단백질 발현 카세트 (도 3F, SEQ ID NO:6),
Figure pct00007
백시니아 D13L ORF를 플랭킹하는 서열에 대해 상동성인 좌측 및 우측 조합 아암에 의해 플랭킹된 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 발현 카세트 (도 3G; SEQ ID NO:7).
Figure pct00008
백시니아 B7/B8R ORF를 플랭킹하는 서열에 대해 상동성인 좌측 및 우측 조합 아암에 의해 플랭킹된 SARS-CoV-2 엔벨로프 단백질 발현 카세트 (도 3H; SEQ ID NO:8).
간략하게, 재조합 SCV-COVID19 백신을 구축하기 위해 (도 4), 상동성 재조합이 BC19A-12 세포 또는 SD07-1 세포 (CP77 숙주 범위 선택이 필요한 경우)에서 수행된다. 세포를 D13L, A39R, B7/B8R, 및 C3L ORF가 결실된 코펜하겐 스트레인으로부터 유래된 복제-부적격 백시니아 바이러스인 SCV-SMX06으로 0.01 pfu/세포의 감염 다중도 (moi)로 1시간 동안 세포를 감염시켰다. 이어서, 감염된 세포를 이펙텐(EFFECTENE)® (퀴아젠(Qiagen))과 같은 형질감염 시약을 사용하여 Not I 분해된 상동성 재조합 플라스미드로 형질감염시켰다. 감염된/형질감염된 세포를 형광 세포가 보일 때까지 2-3일 동안 인큐베이션한다. 재조합 바이러스를 반복된 양성 약물 선택 및 형광-기반 단일 세포 분류를 이용하여 모 바이러스로부터 정제하였다. 모 바이러스 제거가 달성된 후 (PCR에 의해 확인됨), 상동성 재조합 및 정제의 반복으로 임의의 추가의 발현 카세트를 삽입하였다. 모 바이러스의 부재 하에, BC19A-12 세포의 감염 동안 150 bp 반복부 사이의 분자내 재조합을 통해 선택 유전자의 결실을 허용하도록 선택 압력을 제거하였다. 선택 마커가 없는 바이러스는 형광-기반 단일 세포 분류 및/또는 제한 희석에 의해 농축 및 정제되었다. 바이러스 집단에 선택 마커가 없으면, 후보 클론을 BC19A-12 세포에서 증폭시켜 트랜스진 위치 및 통합에 대한 PCR 및 DNA 시퀀싱, 트랜스진 발현에 대한 웨스턴 블롯 또는 다른 면역염색 기술에 의해 검증된 바이러스 시드 스톡을 생성하였다.
구축 전략의 요약
SCV는 필수적인 바이러스 어셈블리 단백질을 코딩하는 유전자인 D13L을 결실시켜 사실상 SCV 바이러스를 감염성 바이러스 자손을 생성할 수 없도록 유전자 조작된 백시니아 바이러스의 코펜하겐 스트레인로부터 유래된다.
SCV-SMX06은 추가의 유전자 결실, 특히 면역 조정 유전자 A39R, B7/B8R, 및 C3L의 결실을 갖는 SCV 버전이다. 유전자는 F1과 F2 재조합 아암 사이의 D13L, A39R, B7/B8R 및 C3L 영역이 결실된 도 2에 예시된 바와 같이 상동성 재조합을 이용하여 순차적으로 결실되었다. SCV-SMX06은 SCV-COVID 백신의 변이체를 구축하는데 사용되는 기본 SCV 바이러스이다. 결실 부위에 트랜스진의 삽입은 필요한 경우 동일한 F1 및 F2 재조합 아암을 사용함으로써 촉진되었다 (도 3).
또한, SARS-CoV-2 스파이크 또는 그의 면역원성 부분이 트랜스진로서 삽입되는 변이에서, A41L ORF는 트랜스진가 삽입됨에 따라 결실된다. SARS-CoV-2 스파이크 또는 그의 면역원성 부분이 결여된 변이에서, A41L 유전자는 변형되지 않은 채로 남아 있다.
SCV-COVID19 바이러스는 단일 벡터화된 백신을 제공하도록 구축된다. 단일 벡터화된 백신은 혼합 백신으로 조합될 수 있다.
재조합 바이러스 SCV-COVID19A는 SCV-SMX06의 A41L ORF를 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:1에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)로 치환하고, 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 막 폴리펩티드 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 뉴클레오캡시드 폴리펩티드를 포함하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:4에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)를 SCV-SMX06의 D13L ORF 결실 부위에 삽입함으로써 구축된다.
재조합 바이러스 SCV-COVID19B는 SCV-SMX06의 A41L ORF를 천연 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:2에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)로 치환하고, 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 막 폴리펩티드 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 뉴클레오캡시드 폴리펩티드를 포함하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:4에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)를 SCV-SMX06의 D13L ORF 결실 부위에 삽입함으로써 구축된다.
재조합 바이러스 SCV-COVID19C는 SCV-SMX06의 A41L ORF를 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:1에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)로 치환함으로써 구축된다.
재조합 바이러스 SCV-COVID19D는 SCV-SMX06의 A41L ORF를 천연 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:2에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)로 치환함으로써 구축된다.
재조합 바이러스 SCV-COVID19E는 SCV-SMX06의 J2R과 J3R 유전자 사이에 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 막 폴리펩티드 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 뉴클레오캡시드 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:5에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)를 삽입함으로써 구축된다.
재조합 바이러스 SCV-COVID19F는 SCV-SMX06의 A41L ORF를 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드의 S1 수용체-결합 도메인 서브유닛을 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:3에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)로 치환함으로써 구축된다.
재조합 바이러스 SCV-COVID19G는 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 막 폴리펩티드 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 뉴클레오캡시드 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:4에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)를 SCV-SMX06의 D13L ORF 결실 부위에 삽입함으로써 구축된다.
재조합 바이러스 SCV-COVID19H는 SCV-SMX06 백시니아 바이러스 스트레인의 A41L ORF를 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:1에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)로 치환하고, 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 막 폴리펩티드 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 뉴클레오캡시드 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:4에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)를 SCV-SMX06의 D13L ORF 결실 부위에 삽입하고, 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 엔벨로프 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:8에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)를 SCV-SMX06의 B7/B8R ORF 결실 부위에 삽입함으로써 구축된다.
재조합 바이러스 SCV-COVID19I는 SCV-SMX06 백시니아 바이러스 스트레인의 A41L ORF를 천연 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:2에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)로 치환하고, 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 막 폴리펩티드 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 뉴클레오캡시드 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:4에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)를 SCV-SMX06의 D13L ORF 결실 부위에 삽입하고, 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 엔벨로프 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:8에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)를 SCV-SMX06의 B7/B8R ORF 결실 부위에 삽입함으로써 구축된다.
재조합 바이러스 SCV-COVID19J는 SCV-SMX06 백시니아 바이러스 스트레인의 A41L ORF를 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드의 S1 수용체-결합 도메인 서브유닛을 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:3에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)로 치환하고, 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 막 폴리펩티드 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 뉴클레오캡시드 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:4에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)를 SCV-SMX06의 D13L ORF 결실 부위에 삽입함으로써 구축된다.
재조합 바이러스 SCV-COVID19K는 SCV-SMX06 백시니아 바이러스 스트레인의 A41L ORF를 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드의 S1 수용체-결합 도메인 서브유닛을 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:3에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)로 치환하고, 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 막 폴리펩티드 및 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 뉴클레오캡시드 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:4에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)를 SCV-SMX06의 D13L ORF 결실 부위에 삽입하고, 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 엔벨로프 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:8에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)를 SCV-SMX06의 B7/B8R ORF 결실 부위에 삽입함으로써 구축된다.
재조합 바이러스 SCV-COVID19L은 파울폭스 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 막 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:6에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)를 SCV-SMX06의 C3L ORF 결실 부위에 삽입함으로써 구축된다.
재조합 바이러스 SCV-COVID19M은 합성 초기/후기 프로모터의 전사 제어 하에 있는 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트 (예를 들어, SEQ ID NO:7에 정의된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트)를 SCV-SMX06의 D13L ORF 결실 부위에 삽입함으로써 구축된다.
SCV-COVID19 바이러스 백신 내의 SARS-CoV-2 항원 삽입 영역은 도 5에 예시되어 있다. 구체적으로, A41L ORF에서 합성 초기/후기 프로모터 하의 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드 (도 5A), A41L ORF에서 천연 초기/후기 프로모터 하의 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드 (도 5B), A41L ORF에서 스파이크 폴리펩티드의 SARS-CoV-2 S1 서브유닛 (도 5C), D13L ORF에서 SARS-CoV-2 막 및 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 (도 5D), J2R과 J3R 사이의 유전자간 부위에 있는 SARS-CoV-2 막 및 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 (도 5E), B7/B8R ORF에서 SARS-CoV-2 엔벨로프 폴리펩티드 (도 5F), C3L ORF에서 SARS-CoV-2 막 폴리펩티드 (도 5G), 및 D13L ORF에서 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 폴리펩티드 (도 5H).
표 1은 SCV-SMX06 게놈 내의 SCV-COVID19 삽입 및 결실 부위를 요약한다. 스파이크 또는 S1 트랜스진를 포함하는 SCV-COVID19 종의 경우, A41L 유전자가 결실된다. J2↓J3R은 인접한 J2R 및 J3R 유전자에 변형 없이 항원이 삽입되는 유전자간 삽입 부위를 나타낸다. 비변형된 부위는 '+'로 나타내는 반면, '-'는 유전자의 ORF가 삭제되었음을 나타낸다.
표 1. 예시적인 SCV-COVID19 삽입 및 결실 부위의 요약
Figure pct00009
또한, 조합 백신은 2개의 단일-벡터화된 백신, 특히 SCV-COVID19C 및 SCV-COVID19G를 동등한 비율로 혼합하여 제조되고 단일 시린지를 통해 전달된다.
또한, 혼합 백신은 2개의 단일-벡터화된 백신, 특히 SCV-COVID19D 및 SCV-COVID19G를 동등한 비율로 혼합하여 제조되고 단일 시린지를 통해 전달된다.
또한, 혼합 백신은 2개의 단일-벡터화된 백신, 특히 SCV-COVID19C 및 SCV-COVID19E를 동등한 비율로 혼합하여 제조되고 단일 시린지를 통해 전달된다.
또한, 혼합 백신은 2개의 단일-벡터화된 백신, 특히 SCV-COVID19D 및 SCV-COVID19E를 동등한 비율로 혼합하여 제조되고 단일 시린지를 통해 전달된다.
실시예 2
SCV-COVID19D를 사용한 단일 백신접종은 비근교계 및 근교계 마우스에서 중화 SARS-CoV-2 항체 및 Th1-편향된 항체 프로파일을 생성한다
실험적 전략
6-9주령 수컷 C57BL/6 마우스 또는 ARC 스위스 마우스의 그룹 (그룹당 n=5마리 마우스)에 SCV-COVID19D (107, 108 PFU) 또는 벡터 대조군 SCV-SMX06을 근육내 투여하여 백신접종하였다. 백신접종 전 및 백신접종 후 21일에 혈액 샘플을 채취하였다. S1-특이적 IgG 수준 및 SARS-CoV-2 바이러스-특이적 중화 항체 수준의 수준은 종점 ELISA 및 중화 검정에 의해 결정되었다.
2개의 마우스 코호트를 사용하여 유전적 이형접합성을 설명하였다. 제1 코호트는 표현형적 또는 특성 가변성을 최소화하기 위해 근교계 마우스 스트레인 C57BL/6을 사용하여 재현성을 개선한 한편, 제2 그룹은 유전적 다양성을 나타내기 위해 비근교계 마우스 스트레인 스위스를 활용하여 집단 전반에 걸친 반응의 일반화가능성을 높였다.
바이러스 중화 시험
혈청을 56℃에서 30분 동안 열-불활성화시키고, 프로세싱 당일까지 -80℃에서 저장하였다. 베로 세포를 함유하는 96-웰 플레이트도 프로세싱 당일에 단층 합류를 보장하기 위해 배양되었다. 중화 검정일에, 최소 필수 배지 (MEM) 배양 배지에서 혈청의 2배 연속 희석액을 제조하고, 베로 플레이트를 MEM 및 항생제 및 트립신으로 구성된 감염 배지로 세척하였다. 50 μl의 SARS-CoV-2당 100 TCID50을 사전-제조된 혈청 희석액의 각각의 희석액에 첨가하고, 가끔씩 흔들어주면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 바이러스:혈청 혼합물을 베로 세포에 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션한 다음, 현미경으로 모니터링하고, 절차 후 4일에 세포변성 효과에 대해 점수화하였다. 바이러스 중화 역가는 여전히 바이러스 복제를 억제하는 혈청의 최고 희석의 역수 값으로서 표현되었다.
마우스 혈청에 대한 효소-결합된 면역흡착 검정
맥시소르프(MaxiSorp) 플레이트 (눈크(Nunc))를 4℃에서 밤새 흡착을 위해 PBS 중의 S1 (120 ng/웰)으로 코팅하였다. 플레이트를 PBS/트윈(Tween) (0.05% v/v)으로 세척하고, PBS/트윈 중의 3% 탈지유를 사용하여 실온에서 1시간 동안 웰을 차단하였다. 연속 희석된 마우스 혈청 샘플을 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 IgG를 실온에서 1시간 동안 모든 웰에 첨가하였다. 세척 후 TMB 액체 기질 (시그마(Sigma))을 첨가하고, 3 M HCl을 사용하여 반응을 정지시켰다. 각각의 웰에 대한 광학 밀도 (OD) 값을 450 nm에서 측정하였다. 종점 역가는 하기와 같이 계산되었다: log10 샘플 희석에 대한 log10 OD를 플롯팅하고, 이 곡선의 선형 부분의 회귀 분석으로 종점 역가를 계산하였다. 종점 역가는 OD 판독값이 음성 혈청 샘플의 평균 흡광도 값에 표준 편차의 3배를 더한 값에 도달했을 때 계산되었다. IgG 아부류 ELISA의 결과는 OD 값을 사용하여 제시된다.
결과
바이러스-특이적 중화 항체는 SCV-COVID19D로 백신접종된 모든 마우스에서 검출되었다 (도 6A). 107 PFU 용량의 백신접종에서, 비근교계 스위스 마우스 및 근교계 C57Bl/6 마우스에 의해 생성된 중화 항체 역가는 SCV-SMX06보다 높았으며, 중화 항체 수준은 동일한 용량에서 비근교계 마우스와 근교계 마우스 간에 유사하였다. 스위스 마우스에 대한 108 PFU 용량의 백신접종에서, 중화 항체 역가가 증가하였다. 총 IgG 역가는 또한 비근교계 스위스 스트레인 및 C57BL/6 마우스 둘 다에서 스파이크 단백질의 S1 서브유닛에 대해 검출되었다 (도 6B). ELISA에 의한 IgG 아부류의 프로파일링은 IgG1에 비해 더 높은 수준의 S1-특이적 IgG2c를 나타내었으며, 이는 백신접종 후 주로 Th1 반응을 나타낸다 (도 6C).
실시예 3
SCV-COVID19D를 사용한 단일 백신접종은 스파이크-특이적 CD8 T 세포 반응을 생성한다
T 세포는 호흡기계의 많은 바이러스 감염의 조기 제어 및 제거를 생성하는데 중요하다. 트랜스제닉 마우스 모델에서 최근 연구는 T 세포가 SARS-CoV-2 감염 후 바이러스 제거 및 질환 해결에 활용된다는 증거를 제공하였다. 본 실시예에서 본 발명자들은 SCV-COVID19D를 사용한 면역화가 질환 중증도를 줄이는데 잠재적으로 도움이 될 조기 T 세포 반응을 도출하는지의 여부를 정의한다.
실험적 전략
6-9주령 수컷 C57BL/6 마우스의 그룹 (그룹당 n=5마리 마우스)에 107 PFU의 용량으로 SCV-COVID19D 또는 벡터 대조군 SCV-SMX06을 근육내 투여하여 백신접종하였다. 스파이크-특이적 T 세포 반응 (스파이크 단백질의 전장에 걸친 펩티드 사용)은 백신접종 후 3개월에 ELISpot 및 세포내 시토카인 염색 (ICS)에 의해 검출되었다.
ELISpot 검정
뮤린 비장세포의 단일 세포 현탁액의 희석액은 완전한 배지에 재현탁시키기 전에 세포를 70 μM 세포 스트레이너를 통과시키고 ACK 용해에 의해 제조하였다. ELISpot에 의한 인터페론-감마 (IFNγ) 생산의 분석을 위해, PVDF ELISpot 플레이트 (맵테크(MabTech))를 항-마우스 IFNγ 코팅 항체와 밤새 인큐베이션한 다음 세포 배양 배지로 차단하였다. 세포 희석액을 5% CO2를 갖는 37℃ 가습 인큐베이터 내의 ELISpot 플레이트에서 18 내지 20시간 동안 전체 스파이크 단백질에 걸쳐 있는 펩티드 풀 (펩티드당 2 μg/ml)과 함께 인큐베이션하였다. 자극 후, 항-마우스 IFNγ 비오틴 검출 항체에 이어 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제로 막을 염색하고 BCIP/NBT 기질 키트 (맵테크)로 발색하여 IFNγ 스폿 형성 단위 (SFU)를 검출하였다. 시토카인-분비 T 세포를 나타내는 스폿을 ELISpot 판독기를 사용하여 정량화하였다.
세포내 시토카인 염색 분석
ELISpot 결과를 보완하고 검증하기 위해, IFNγ의 세포내 시토카인 생산을 수행하였다. 세포를 단백질 수송 억제제 브레펠딘 A와 함께 전체 스파이크 단백질에 걸쳐 있는 펩티드 풀 (펩티드당 2 μg/ml)로 37℃에서 6시간 동안 자극하였다. 세포를 표면 마커 CD3 및 CD8에 대해 염색한 다음 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 세포를 BD 시토픽스/펌(cytofix/perm) 버퍼를 사용하여 투과화하고 IFNγ에 대한 세포내 염색을 수행하였다. 팩스 아리아 2(FACS Aria 2, BD)에서 샘플 획득을 수행하고 플로우조 V10(FlowJo V10) (트리스타(TreeStar))에서 데이터를 분석하였다. 시토카인-분비 T 세포는 더블릿 음성 생 림프구, 크기, CD3+, CD8+ 세포 및 IFNγ 시토카인 양성에 대한 게이팅에 의해 확인되었다.
결과
스파이크-특이적 IFNγ+ 생산 T 세포 반응의 유의한 증가가 ICS (도 7A) 및 ELISpot (도 7B) 둘 다에 의해 벡터 대조군과 비교하여 SCV-COVID19D 백신접종된 마우스에서 검출되었다. 벡터 대조군 그룹은 낮거나 (<100 SFU) 최소한의 검출가능한 반응을 가졌다 (도 15B).
결론
본원의 실시예 2 및 3은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 코딩하는 SCV-COVID19 백신으로 동물 모델의 면역화가 S1-특이적 항체, 중화 항체의 생산 및 스파이크-특이적 IFNγ-분비 CD8+ T 세포의 증가에 의해 나타나는 바와 같이 세포성 및 체액성 반응을 유도함을 나타낸다. 이는 SCV-COVID19 백신이 COVID-19에 대한 감염제인 SARS-CoV-2에 대한 예방적 보호를 제공할 수 있음을 시사한다.
실시예 4
SCV-COVD19C는 SCV-COVID19D 및 SCV-COVID19F보다 더 우수한 스파이크-특이적 항체를 도출한다
SCV-COVID19C 및 SCV-COVID19D 백신은 항원 발현에 사용되는 폭스바이러스 프로모터의 유형이 상이하다. SCV-COVID19C 및 SCV-COVID19F 백신은 삽입된 트랜스진의 길이가 상이하며, 여기서 SCV-COVID19C는 스파이크 단백질의 전체 길이를 포함하고, SCV-COVID19F는 스파이크 단백질의 S1 서브유닛만 포함한다. 본 실시예에서 본 발명자들은 웨스턴 블롯에 의해 3가지 백신의 항원 발현 효율을 비교하고, ELISA를 이용하여 스파이크 S1-특이적 항체 반응을 유도하는 능력을 평가하였다.
실험적 전략
세포주를 SCV-COVID19C, SCV-COVID19D, 및 SCV-COVID19F로 감염시키고, 스파이크 단백질, 또는 S1 서브유닛의 발현을 웨스턴 블롯에 의해 조사하였다. 6-9주령 수컷 C57BL/6 마우스 그룹 (그룹당 n=5마리 마우스)에 마우스당 107 pfu의 용량으로 SCV-COVID19C, SCV-COVID19D, SCV-COVID19F 또는 벡터 대조군 SCV-SMX06을 근육내 투여하여 백신접종하였으며, 스파이크 S1-특이적 항체 반응을 ELISA로 평가하였다.
웨스턴 블롯
SCV-COVID19C, SCV-COVID19D, 및 SCV-COVID19F 농축물을 로딩 버퍼에서 용해시키고, 각각의 샘플에 대해 8 ug의 총 단백질의 등가물을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고, 니트로셀룰로오스 필터 막으로 옮겼다. 막을 차단하고 1:1000으로 희석된 SARS-CoV-2 스파이크 RBD (시노 바이올로지칼(Sino Biological) 40592-T62)에 대한 토끼 mAb와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 항-토끼 IgG에 이어 막에 대해 클래리티 ECL 및 TMB (시그마)을 사용하는 향상된 화학발광을 이용하여 검출하였다.
S1-특이적 항체 종점 역가에 대한 효소-결합된 면역흡착 검정
맥시소르프 플레이트 (눈크)를 4℃에서 밤새 흡착을 위해 PBS 중의 S1 (120 ng/웰)으로 코팅하였다. 플레이트를 PBS/트윈 (0.05% v/v)으로 세척하고, PBS/트윈 중의 3% 탈지유를 사용하여 실온에서 1시간 동안 웰을 차단하였다. 연속 희석된 마우스 혈청 샘플을 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 IgG를 실온에서 1시간 동안 모든 웰에 첨가하였다. 세척 후 TMB 액체 기질 (시그마)을 첨가하고, 3M HCl을 사용하여 반응을 정지시켰다. 각각의 웰에 대한 광학 밀도 (OD) 값은 450 nm에서 측정되었다. 종점 역가는 하기와 같이 계산되었다: log10 샘플 희석에 대한 log10 OD를 플롯팅하고, 이 곡선의 선형 부분의 회귀 분석으로 종점 역가를 계산하였다. 종점 역가는 OD 판독값이 음성 혈청 샘플의 평균 흡광도 값에 표준 편차의 3배를 더한 값에 도달했을 때 계산되었다.
결과
도 8A는 웨스턴 블롯에 의한 세포 용해물에서 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 발현을 나타낸다. SCV-COVID19C 및 SCV-COVID19D 둘 다에 대한 용해물은 180 kDa에서 밴드를 나타내어 전장 스파이크 단백질의 발현을 반영한 반면, SCV-COVID19F에 대한 용해물은 스파이크 단백질의 S1 서브유닛의 발현을 반영하는 80 kDa에서 밴드를 나타내었다. 그러나, SCV-COVID19C는 SCV-COVID19D에 비해 더 강한 신호를 나타내었으며, 이는 합성 초기/후기 프로모터 하에서 스파이크 단백질의 보다 효율적인 발현을 나타낸다. 면역화 후 제21일에 ELISA에 의한 S1-특이적 항체 반응의 비교로 SCV-COVID19D 또는 SCV-COVID19F보다 SCV-COVID19C에 의해 유도된 더 높은 항체 역가를 확인하였다 (도 8B).
결론
실시예 4는 합성 초기/후기 프로모터의 제어 하에 있는 스파이크 단백질을 갖는 SCV-COVID19C 백신이 SCV-COVID19D 백신과 비교하여 더 높은 수준의 스파이크 단백질을 발현한다는 것을 입증한다. 항체 역가는 SCV-COVID19D 또는 SCV-COVID19F에 비해 SCV-COVID19C에 대한 더 높은 크기의 면역원성을 입증한다. 하기 실시예는 SCV-COVID19C 백신의 유효성을 추가로 조사하였다.
실시예 5
SCV-COVID19C를 사용한 단일 백신접종은 근교계 및 비근교계 마우스에서 항체 반응을 유도한다
실험적 전략
6-9주령 암컷 근교계 C57BL/6 마우스 및 ARC(s) 마우스의 그룹 (그룹당 n=5마리 마우스)에 SCV-COVID19C 또는 벡터-단독 대조군 SMX06을 마우스당 107 PFU의 용량으로 근육내 투여하여 백신접종하였다. 백신접종 전 및 백신접종 후 제14일에 혈액 샘플을 수득하였다. 스파이크 (S1)-단백질 특이적 IgG 수준 및 SARS-CoV-2 바이러스-특이적 중화 항체 수준의 수준은 종점 ELISA 및 슈도-중화 검정 (씨패스(cPass)™; 진스크립트(Genscript))에 의해 결정되었다.
2개의 마우스 코호트를 사용하여 유전적 이형접합성의 변이를 설명하였다. 제1 코호트는 표현형적 또는 특성 가변성을 최소화하기 위해 근교계 마우스 스트레인 C57BL/6을 사용하여 재현성을 개선한 한편, 제2 코호트는 유전적 다양성을 나타내기 위해 비근교계 마우스 스트레인 스위스를 활용하여 집단 전반에 걸친 반응의 일반화가능성을 높였다.
S1-특이적 항체 종점 역가에 대한 효소-결합된 면역흡착 검정
맥시소르프 플레이트 (눈크)를 4℃에서 밤새 흡착을 위해 PBS 중의 S1 (120 ng/웰)으로 코팅하였다. 플레이트를 PBS/트윈 (0.05% v/v)으로 세척하고, PBS/트윈 중의 3% 탈지유를 사용하여 실온에서 1시간 동안 웰을 차단하였다. 연속 희석된 마우스 혈청 샘플을 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 IgG를 실온에서 1시간 동안 모든 웰에 첨가하였다. 세척 후 TMB 액체 기질 (시그마)을 첨가하고, 3 M HCl을 사용하여 반응을 정지시켰다. 각각의 웰에 대한 광학 밀도 (OD) 값은 450 nm에서 측정되었다. 종점 역가는 하기와 같이 계산되었다: log10 샘플 희석에 대한 log10 OD를 플롯팅하고, 이 곡선의 선형 부분의 회귀 분석으로 종점 역가를 계산하였다. 종점 역가는 OD 판독값이 음성 혈청 샘플의 평균 흡광도 값에 표준 편차의 3배를 더한 값에 도달했을 때 계산되었다.
씨패스™ SARS-CoV-2 중화 항체 검출
씨패스™ SARS-CoV-2 중화 항체 검출 키트 (진스크립트, USA)는 혈청 및 혈장에서 SARS-CoV-2에 대한 총 중화 항체의 정성적 직접 검출을 위한 차단 ELISA이다. SARS-CoV-2에 감염되면 혈액에서 항체 또는 결합 항체의 생산을 포함하는 면역 반응이 개시된다. 정제된 수용체 결합 도메인 (RBD), 바이러스 스파이크 (S) 단백질로부터의 단백질 및 숙주 세포 수용체 ACE2를 사용하여, 시험은 시험관 또는 ELISA 플레이트의 웰에서 직접적인 단백질-단백질 상호작용에 의한 바이러스-숙주 상호작용을 모방한다. 이어서, 통상적인 바이러스 중화 시험과 동일한 방식으로 고도로 특이적인 상호작용을 중화시킬 수 있다. 간단히 말해서, 샘플 및 대조군을 샘플 희석 버퍼로 희석시키고 HRD-접합된 RBD와 함께 사전-인큐베이션하여 순환 중화 항체를 HRP-RBD에 결합시켰다. 이어서, 혼합물을 ACE2 단백질로 사전-코팅된 포획 플레이트에 첨가한다. 비결합된 HRP-RBD 뿐만 아니라 및 비-중화 항체에 결합된 HRP-RBD는 플레이트에 포획되는 반면, 순환 중화 항체 HRP-RBD 복합체는 상층액에 남아 세척 동안 제거된다. 세척 주기 후, TMB 기질 용액에 이어 정지 용액을 첨가한 다음 반응을 켄칭하면 색상이 노란색으로 변한다. 최종 용액의 흡광도는 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm에서 판독되고 퍼센트 신호 억제는 하기 수학식을 이용하여 결정된다:
퍼센트 신호 억제 = (1 - 샘플의 OD 값 / 음성 대조군의 OD 값) x 100%
퍼센트 신호 억제는 SARS-CoV-2 총 중화 항체의 정성적 검출을 지칭한다. 씨패스™ 키트는 백신 효능 평가 및 집단 면역 평가에서의 사용을 위해 식품의약청 (FDA)에 의해 승인되었다.
결과
도 9A는 백신접종 후 제14일에 벡터-단독 대조군 SMX06과 비교하여 SCV-COVID19C로 백신접종된 마우스의 2개 코호트에서 관찰된 S1-특이적 IgG 수준을 나타낸다. S1-특이적 IgG는 근교계 및 비근교계 마우스 둘 다에서 검출되었으며 (도 9A), 비근교계 마우스가 근교계 마우스에 비해 더 높은 수준의 항체를 생성하였다 (도 9B). 이와 일치하여, 근교계 C57BL/6 마우스에 비해 비근교계 ARC(s) 마우스에서 씨패스 검정에 의해 더 높은 수준의 중화 항체가 검출되었으며 (도 9C), 두 코호트 모두는 벡터 대조군 SMX06에 비해 더 높은 중화 항체를 생성하였다. 이러한 결과는 SCV-COVID19C가 비근교계 마우스 (유전적 이형접합성을 나타내며, 따라서 인간 집단으로의 번역) 및 근교계 마우스 둘 다에서 중화 능력을 갖는 스파이크-특이적 항체를 유도할 수 있음을 입증한다. 이러한 결과 및 C57BL/6에 대한 시약 이용가능성을 기반으로, 근교계 마우스를 백신-매개된 면역 반응의 추가 조사를 위한 실험 모델로 선택하였다.
실시예 6
SCV-COVID19C를 사용한 단일 백신접종은 강건한 스파이크-특이적 T 세포 반응을 유도한다
T 세포는 호흡기계의 많은 바이러스 감염의 조기 제어 및 제거를 생성하는데 중요하다. 트랜스제닉 마우스 모델에 대한 최근 연구는 T 세포가 SARS-CoV-2 감염 후 바이러스 제거 및 질환 해결에 활용된다는 증거를 제공하였다. 본 실시예에서 본 발명자들은 SCV-COVID19C를 사용한 면역화가 질환 중증도를 줄이는데 잠재적으로 도움이 될 조기 T 세포 반응을 도출하는지의 여부를 정의한다.
실험적 전략
수컷 (그룹당 n=3) 및 암컷 (그룹당 n=3) 6-9주령 C57BL/6 마우스를 3가지로 분류하였다: (1) 나이브 마우스/백신 없음, (2) 벡터-단독 대조군 SMX06으로 백신접종된 마우스, 및 (3) SCV-COVID19C의 단일 용량 (107 PFU)으로 백신접종된 마우스.
방법
백신접종 후 제7일에, 비장을 수집하고, 유동 세포측정을 통한 단일 세포 특징규명을 위해 프로세싱하였다. 비장으로부터의 단일 세포 제제를 표준 방법에 의해 단리하였다. 간단히 말해서, 비장을 작은 시린지의 플런저를 사용하여 70 μm 세포 스트레이너를 통해 분쇄하였다. 생성된 단일 세포 현탁액을 회전시키고 (300 × g, 5분), 적혈구를 제거하기 위해 1 mL의 암모늄-클로라이드-칼륨 (ACK) 용해 버퍼에 5분 동안 재현탁시켰다. 이어서, 10% 태아 소 혈청 (FBS)이 보충된 RPMI 배양 배지를 첨가하여 용해 버퍼를 중화시켰다. 비장세포를 PBS로 2회 세척하고, 다중 파라미터 유동 세포측정을 위한 제제에 2 x 107개 세포/mL로 재현탁시켰다.
CD8 및 CD4 T 세포 반응을 실시예 3에 기재된 바와 같이 세포내 시토카인 염색을 이용하여 평가하였다. 세포내 시토카인 염색을 이용하여 도 10에 나타낸 게이팅 전략으로 시토카인 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2의 생산을 평가하였다. 이펙터 CD8 T 세포에 의해 생산되는 주요 세포독성 이펙터 분자인 그랜자임 B의 생산도 유동 세포측정을 통해 측정하였다.
SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 S1 및 S2 영역에 걸쳐 있는 중첩 펩티드로 구성된 2개의 펩티드 풀을 백신-매개된 CD8 T 및 CD4 T 세포 반응의 특이성을 측정하는데 사용하였다. 스파이크 풀 1은 S1의 전체 서열에 걸쳐 있는 중첩 11mer를 갖는 15개 AA 길이 펩티드로 구성되었고, 스파이크 풀 2는 S2의 전체 서열에 걸쳐 있는 중첩 11mer를 갖는 15개 AA 길이 펩티드로 구성되었다. 또한, 펩티드 믹스 (펩믹스)는 S1의 RBD 영역 내의 면역우세 T 세포 에피토프 YNYLYRLF (SEQ ID NO:9), VVLSFELL (SEQ ID NO:10), 및 VNFNFNGL (SEQ ID NO:11)을 함유하는 중첩 펩티드 풀을 포함한다. 이러한 T 세포 에피토프는 이전에 SARS-CoV에서 CD8 T 세포 활성화에 대한 마우스 연구에서 확인되었다. 세포를 단백질 수송 억제제 브레펠딘 A와 함께 조건당 2 μg/ml/펩티드로 6시간 동안 37℃에서 자극하고, 생산된 시토카인을 ICS로 분석하였다.
결과: 스파이크-특이적 삼중 시토카인-양성 CD8 T 세포 반응
백신접종 후 제7일의 세포내 시토카인 염색은 단일 용량의 SCV-COVID19C (도 11A; 하단 패널)가 스파이크-특이적 IFN-γ CD8 T 세포의 수의 유의한 증가를 야기하는 반면, 나이브 (도 11A, 상단 패널) 및 벡터-단독 (도 11A, 중간 패널) 대조군 마우스로부터의 CD8 T 세포는 최소 수준의 IFN-γ를 생산한다는 것을 나타내었다. SCV-COVID19C를 사용한 백신접종 후 유도된 스파이크-특이적 IFN-γ-생산 T 세포는 다기능적이었고 추가 시토카인을 분비하였으며 또한 절반 초과가 TNF-α를 생산하였다. 세포의 약 15%는 또한 삼중-시토카인 생산자 (IFN-γ, TNF-α 및 IL-2)로 분류되며, 이러한 세포는 양질의 T 세포 반응의 특징으로 간주된다 (도 11A, 하단 패널).
도 11B는 실험된 마우스의 모든 그룹에서 스파이크 풀 1 (S1)-특이적 (좌측 패널) 및 스파이크 풀 2 (S2)-특이적 (중간 패널) 및 에피토프-특이적 (YNYLYRLF (SEQ ID NO:9), VVLSFELL (SEQ ID NO:10), 및 VNFNFNGL (SEQ ID NO:11); 우측 패널)인 단일, 이중 및 삼중-시토카인 생산 IFN-γ CD8 T 세포의 수를 그래프로 나타낸 것이다.
결과: 스파이크-특이적 그랜자임-B-생산 CD8 T 세포 반응
나이브 마우스와 비교하여, SCV-COVID19C는 백신접종 후 그랜자임-B-생산 CD8 T 세포를 생성하였다 (도 11C).
결과: 스파이크-특이적 IFN-γ-생산 CD4 T 세포 반응
SCV-COVID19C의 단일 백신접종이 항원-특이적 CD4 T 세포 반응을 유도하는지의 여부를 평가하기 위해, SARS-CoV-2의 S1 (풀 1) 및 S2 (풀 2) 영역에 걸쳐 있는 펩티드 풀로 비장세포를 재자극하였다. SCV-COVID19C를 사용한 백신접종은 S1- 및 S2-특이적 삼중-시토카인-생산 CD4 T 세포를 유도하며, 이는 도 11D에 나타나 있다.
결론
SCV-COVID19C의 단일 백신접종은 세포독성 가능성 (그랜자임-B-생산)를 갖는 CD8 T 세포 및 스파이크-특이적 다기능적 CD8 및 CD4 T 세포를 생성한다.
실시예 7
기존 면역은 SCV-COVID19C 백신의 단일-용량의 투여 후 스파이크-특이적 항체 반응의 양 및 질에 영향을 미치지 않는다
바이러스 벡터에 대한 기존 면역의 영향은 바이러스 벡터화된 백신의 개발에 대한 주요 문제이다. 1970년대 중반까지 실시된 천연두 백신접종 캠페인으로 인해 성인 집단의 일부가 백신 벡터에 대한 면역을 갖고 궁극적으로 천연두 박멸로 이어졌다는 점에서 오르토폭스바이러스-기반 백신 사용에 대해 잠재적인 단점이 있다. 따라서, 오르토폭스바이러스-특이적 기존 면역이 후속 SCV-COVID19 백신접종과 간섭하여 감소된 백신 면역원성 및 효능을 초래할 수 있다는 상당한 우려가 있다. 본 실시예에서 본 발명자들은 전임상 마우스 모델에서 SCV-COVID19C의 단일 샷 또는 동일한 백신의 동종 프라임-부스트의 면역원성에 대한 기존 백시니아 바이러스 면역의 영향을 조사하였다.
실험적 전략
암컷 및 수컷 6-9주령 C57BL/6 마우스의 믹스 (그룹당 n=5마리 마우스)을 2개의 처리 그룹으로 나누었다: (1) 폭스바이러스에 대한 기존 면역 상태를 유도하기 위해 107 PFU/마우스의 용량으로 SCV-COVID19C 백신접종 40일 전에 백시니아 바이러스가 투여된 마우스, 및 (2) 107 PFU/마우스의 용량으로 SCV-COVID19C를 사용하여 백신접종된 기존 면역이 없는 나이브 마우스.
항원-특이적 항체 반응의 크기 및 수명은 백신접종 후 제28일, 제44일 및 제80일에 수득된 혈액 샘플을 사용하여 모니터링되었다. 스파이크 (S1)-단백질 특이적 IgG 수준 및 SARS-CoV-2 바이러스-특이적 중화 항체 수준의 수준은 종점 ELISA 및 슈도-중화 검정 (씨패스™; 진스크립트)에 의해 결정되었다.
방법
실시예 5에 기재된 바와 같은 S1-특이적 항체 종점 역가 및 씨패스™ SARS-CoV-2 중화 항체 검출을 위한 효소-결합된 면역흡착 검정.
결과
SCV-COVID19C의 단일 샷은 백신접종 후 제28일, 제44일 및 제80일에 기존 면역이 있는 마우스 및 없는 마우스에 대해 유사한 수준의 S1-특이적 항체를 유도하였다 (도 12A). 이 데이터와 일치하게, 중화 항체의 수준 (진스크립트로부터의 씨패스™ 키트를 사용하여 검정됨)도 두 그룹의 마우스 간에 유사하였다 (도 12B).
기존 면역은 프라임-부스트 백신접종 후 항체 반응에 영향을 미치지 않는다
실험적 전략
암컷 및 수컷 6-9주령 C57BL/6 마우스의 믹스를 2개의 처리 그룹으로 나누었다: (1) 폭스바이러스에 대한 기존 면역 상태를 유도하기 위해 동종 프라임-부스트 전략 (제0일 및 제28일)에서 SCV-COVID19C를 사용하여 백신접종하기 40일 전에 백시니아 바이러스가 투여된 마우스, (2) 동종 프라임-부스트 전략 (제0일 및 제28일)에서 SCV-COVID19C를 사용하여 백신접종된 기존 면역이 없는 나이브 마우스.
항체 반응의 크기 및 수명을 모니터링하기 위해 제28일 (부스트 전) 및 부스터 투약 후 제14일 및 제50일에 혈액 샘플을 수득하였다. 스파이크 (S1)-단백질 특이적 IgG 수준 및 SARS-CoV-2 바이러스-특이적 중화 항체 수준의 수준은 종점 ELISA 및 슈도-중화 검정 (씨패스™; 진스크립트)에 의해 결정되었다.
방법
실시예 5에 기재된 바와 같은 S1-특이적 항체 종점 역가 및 씨패스™ SARS-CoV-2 중화 항체 검출을 위한 효소-결합된 면역흡착 검정.
결과
스파이크 (S1)-특이적 항체 반응의 유의한 증가가 D28에서 부스터 용량의 투여 후에 관찰되었다. 기존 면역은 S1-특이적 항체 수준 (도 13A) 및 중화 항체 수준 (도 13B)에 영향을 미치지 않았다.
결론
기존 면역은 단일 용량 또는 동종 프라임-부스트 전략으로 SCV-COVID19C를 사용한 백신접종 후 항원-특이적 항체 반응의 질, 양 또는 동역학에 영향을 미치지 않는다.
실시예 8
SCV-COVID19C를 사용한 단일 백신접종은 노령 마우스에서 항원-특이적 항체 반응을 유도한다
나이는 SARS-CoV-2 감염 후 좋지 않은 건강 결과에 대한 가장 유의한 위험 인자 중 하나이므로, 임의의 새로운 백신 후보가 노인에서 강건한 면역 반응을 도출해야만 하는 것이 바람직하다. 본 실시예에서 본 발명자들은 노령 마우스에서 SCV-COVID19C 백신접종의 단일 용량에 의해 유도되는 항체 반응을 시험하였다.
실험적 전략
나이에 따른 항체 반응의 수준을 평가하기 위해, 6-9주령 암컷 (n=10; 어린 마우스로 지칭됨) 및 9-10개월령 암컷 (n=20, 노령 마우스로 지칭됨) C57BL/6 마우스의 그룹에 SCV-COVID19C (107 PFU/마우스)를 근육내 투여하여 백신접종하였다. 백신접종 후 제14일 및 제21일에 혈액 샘플을 수집하고, 항체 분석을 위해 혈청을 분리하였다. 스파이크 (S1)-단백질 특이적 IgG 수준 및 SARS-CoV-2 바이러스-특이적 중화 항체 수준의 수준은 종점 ELISA 및 슈도-중화 검정 (씨패스™; 진스크립트)에 의해 결정되었다.
방법
실시예 5에 기재된 바와 같은 S1-특이적 항체 종점 역가 및 씨패스™ SARS-CoV-2 중화 항체 검출을 위한 효소-결합된 면역흡착 검정.
결과
S1-특이적 항체의 수준은 백신접종 후 제14일 및 제21일에 어린 마우스와 노령 마우스 사이에서 유사하였다 (도 14A). 유사하게, 중화 항체 역가의 차이는 백신접종 후 제14일 및 제21일에 어린 마우스와 노령 마우스 사이에서 검출되지 않았다 (도 14B).
결론
SCV-COVID19C의 단일 용량은 어린 마우스에서 보이는 수준과 유사하게 노령 마우스에서 항원-특이적 면역 반응을 유도한다.
실시예 9
동종 프라임-부스트는 백신접종 후 최대 3개월 동안 유지되는 항체 반응의 유의한 부스팅을 야기한다
프라임-부스트 전략이 어린 마우스 및 노령 마우스에서 체액성 반응을 향상시킬 수 있는지의 여부를 시험하기 위해, 동종 프라임-부스트 접근법을 평가하였다.
실험적 전략
SCV-COVID19C (107 PFU) 백신의 제1 샷 (프라임 용량)을 받은 후 28일에, SCV-COVID19C (107 PFU)의 부스트를 어린 마우스 및 노령 마우스에 근육내 주사를 통해 투여하였다. 부스트 후 21일에, S1-특이적 항체 수준 및 중화 항체 역가의 평가를 위해 혈액 샘플을 수득하였다. 수명 연구를 위해, 부스트 후 3주, 9주 및 12주에 S1-특이적 항체 역가 및 중화 항체의 퍼센트 억제의 평가를 위해 혈액 샘플을 수득하였다.
방법
실시예 5에 기재된 바와 같은 S1-특이적 항체 종점 역가 및 씨패스™ SARS-CoV-2 중화 항체 검출을 위한 효소-결합된 면역흡착 검정.
결과
동종 프라임-부스트 백신접종 요법에서 SCV-COVID19C의 부스터 용량의 투여는 부스트 후 21일에 어린 마우스 및 노령 마우스 둘 다에서 스파이크 (S1)-특이적 항체 및 중화 항체 반응을 유의하게 증가시킨다 (도 15A,B). 부스트 후 제21일에 어린 마우스와 노령 마우스 사이의 중화 항체 수준에서 통계적 차이가 나타나지 않았다. 중화 항체 수준은 부스트 후 제3주, 제9주 및 제12주에 분석되었으며, 항체 수준은 어린 마우스 및 노령 마우스의 시간-일치 비교에서 유의한 차이 없이 유지되는 것으로 관찰되었다 (도 15C).
결론
스파이크-특이적 항체 반응의 양 및 질은 SCV-COVID19C 백신의 제2 용량의 투여에 의해 유의하게 부스팅되었고, 항체 반응은 (분석 시점에) 부스트 후 최대 3개월까지 유지되었다.
실시예 10
SCV-COVID19C의 동종 프라임-부스트는 장기간 T 세포 반응을 유도한다
기억 CD8 T 세포의 존재는 효과적인 병원체 제거를 촉진함으로써 체액성 반응을 보완하기 때문에 바이러스 감염에 반응하는데 특히 중요하다. T 세포 기억은 중화 항체의 보호 능력 또는 크기가 손상된 경우 강력한 2차 방어 역할을 한다. 가장 중요하게도, 장기간 T 세포 반응은 백신접종에 의해 부여된 면역이 오래 지속될 수 있음을 나타낼 수 있다.
실험적 전략
처리 그룹을 6-9주령의 어린 마우스 및 9-10개월령의 노령 마우스의 2개 코호트로 나눈다. 각각의 코호트 내에서, 마우스는 SCV-COVID19C (107 PFU)의 단일 샷, 프라임 후 제28일에 투여되는 제2 샷으로의 동종 프라임-부스트 (107 PFU, 107 PFU), 또는 벡터-단독 대조군 SMX06로 면역화되었다.
방법
다색 유동 세포측정을 이용하여 기억 T 세포 집단을 단수명 이펙터 세포 (TSLE; CD44, KLRG1의 높은 발현 및 CD62L의 낮은 발현으로 확인됨), 이펙터 기억 세포 (TEM; CD44의 높은 발현 및 KLRG1 및 CD62L의 낮은 발현으로 확인됨) 및 중심 기억 세포 (TCM; CD44 및 CD62L의 높은 발현 및 KLRG1의 낮은 발현으로 확인됨)로 특징규명하였다 (도 16).
ELISpot 검정 (이전에 기재됨)을 이용하여 IFN-γ-생산 T 세포를 정량화하는 한편, 세포내 시토카인 염색 (이전에 기재됨)을 이용하여 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2와 같은 시토카인을 생산할 수 있는 세포를 확인하였다.
SCV-COVID19C 백신접종에 의해 도출되는 IFN-γ T 세포 반응의 특성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 하기 영역의 서열에 걸쳐 있는 3개의 상이한 펩티드 풀로 CD8 T 세포를 재자극하였다: RBD이 없는 S1, RBD 및 RBD 후 나머지 S1 영역, 및 S2.
결과: 동종 프라임-부스트는 CD8 이펙터 T 세포 집단을 확장시킨다
SCV-COVID19C의 단일 용량 또는 프라임-부스트를 사용하여 백신접종된 어린 마우스 및 노령 마우스에서 이펙터 기억 및 중심 기억 CD8 T 세포의 총 수가 도 17A에 제시되어 있다. 결과는 프라임-부스트 백신접종이 단수명 이펙터 세포 집단 및 이펙터 기억 세포 집단 둘 다에서 이펙터 기억 세포의 유의한 증가를 초래하였음을 입증한다. 부스터 용량의 투여 후 중심 기억 T 세포의 유의한 증가가 어린 마우스에서는 관찰되었지만 이러한 차이가 노령 마우스에서는 관찰되지 않았다.
결과: 동종 프라임-부스트는 T 세포 기억을 증가시킨다
어린 마우스 및 노령 마우스 둘 다에서, SCV-COVID19C 백신의 단일 샷은 벡터 단독 대조군 마우스와 비교하여 스파이크-특이적 IFN-γ T 세포 반응의 유의한 증가를 유도한다. 부스터 용량의 투여는 스파이크-특이적 IFN-γ T 세포의 유의한 증가를 초래하였고, 이는 어린 마우스 및 노령 마우스 둘 다에서 관찰되었다 (도 17B).
S1-, RBD- 또는 S2-특이적인 스파이크 특이적 T 세포 반응의 추가 프로파일링은 S1 영역 (RBD 부재, 풀 1), RBD 및 나머지 S1 영역 (풀 2) 및 S2 영역 (풀 3)에 걸쳐 있는 펩티드 풀로 세포를 재자극함으로써 수행되었다. S1, RBD 및 S2 영역에 대해 지시되는 IFN-γ T 세포 반응은 어린 마우스 및 노령 마우스 둘 다에서 검출되었으며, 이는 광범위한 T 세포 반응을 나타낸다. IFN-γ 생산 T 세포 반응은 ELISpot에 의한 IFN-γ 스폿-형성 단위 (도 17C), IFN-γ 생산 CD8 T 세포의 백분율 (도 17D) 및 세포내 시토카인 염색에 의한 삼중 시토카인 양성 (IFN-γ, TNF-α, IL2) 생산 CD8 T의 수 (도 17E)에 의해 입증되는 바와 같이 주로 RBD 영역에 대한 것이었다. 예상대로, 항원-특이적 T 세포 집단의 유의한 부스트가 단일-용량 백신접종과 비교하여 프라임-부스트 요법에서 관찰되었다.
결론
SCV-COVID19C를 사용한 백신접종은 단일 샷 백신접종 요법 후 어린 마우스 및 노령 마우스 둘 다에서 스파이크 단백질의 서브유닛 둘 다 (S1 및 S2; 주로 S1 서브유닛의 RBD 영역에 대해 지시됨)에 대해 지시된 다기능적 CD8 T 세포 반응을 유도한다. 항원-특이적 IFN-γ-생산 T 세포 반응 및 이펙터 기억 집단의 유의한 증가가 동종 프라임-부스트 백신접종 전략에 따라 어린 마우스 및 노령 마우스 둘 다에서 관찰되었다.
실시예 11
SCV-COVID19C의 동종 프라임-부스트는 스파이크 RBD 내 CD8 T 세포 에피토프를 기반으로 하는 SARS-CoV와 잠재적으로 교차-반응할 수 있다
실험적 전략
6-9주령 암컷 마우스 및 9-10개월령 마우스에 107 PFU/마우스의 용량으로 근육내 투여에 의해 SCV-COVID19C 또는 벡터 단독 대조군을 백신접종하고, 백신접종 후 제7일에 에피토프-특이적 T 세포 반응을 ELISpot으로 분석하였다.
방법
SARS-CoV와 SARS-CoV-2 (VVLSFELL (SEQ ID NO:10) 및 VNFNFNGL (SEQ ID NO:11)) 사이에 100% 보존된 RBD 영역의 2개의 CD8 T 세포 에피토프로 재자극한 후 ELISpot 검정 (이전에 기재됨) 및 세포내 시토카인 염색 (이전에 기재됨)을 이용하여 IFN-γ-생산 T 세포를 정량화하였다.
결과
에피토프-특이적 IFN-γ 생산 T 세포 반응의 유의한 증가가 벡터 대조군과 비교하여 ELISpot (도 18A) 및 ICS (도 18B) 둘 다에 의해 SCV-COVID19C 백신접종된 마우스에서 검출되었다.
결론
SCV-COVID19C로 백신접종한 후 CD8 T 세포 에피토프 VVLSFELL (SEQ ID NO: 10) 및 VNFNFNGL (SEQ ID NO:11) (SARS-CoV와 SARS-CoV-2 사이에 보존됨)에 대해 지시된 IFN-γ 생산 T 세포 반응의 생성은 백신이 SARS-CoV 및 SARS-CoV-2 둘 다에 대한 예방적 보호를 제공할 수 있음을 시사한다.
실시예 12
SCV-COVID19A를 사용한 단일 백신접종은 스파이크- 및 막-특이적 CD8 T 세포 반응을 생성한다
실험적 전략
6-9주령 수컷 C57BL/6 마우스 그룹 (그룹당 n=5마리 마우스)에 SCV-COVID19A (107 PFU/마우스) 또는 벡터 대조군 SCV-SMX06을 근육내 투여를 통해 백신접종하였다. 백신접종 후 21일에 혈액 샘플을 수집하고, 스파이크, 막 및 뉴클레오캡시드 단백질에 대해 지시된 T 세포 반응을 ELISpot에 의해 검출하였다.
방법
ELISpot 검정 (이전에 기재됨)을 이용하여 IFN-γ-생산 T 세포를 정량화하였다. SCV-COVID19A 백신접종에 의해 도출되는 IFN-γ T 세포 반응의 특성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 하기 영역의 서열에 걸쳐 있는 3개의 상이한 펩티드 풀로 CD8 T 세포를 재자극하였다: RBD가 없는 S1, RBD 및 RBD 후 나머지 S1 영역, 및 S2. 막 또는 뉴클레오캡시드를 표적화하는 CD8 T 세포 반응이 생성되었는지의 여부를 결정하기 위해, 세포를 막 단백질 및 뉴클레오캡시드 단백질의 서열에 걸쳐 있는 펩티드 풀로 재자극하였다.
결과
스파이크-특이적 IFNγ+ 생산 T 세포 반응의 유의한 증가가 벡터 대조군과 비교하여 SCV-COVID19A 백신접종된 마우스에서 S1, RBD 및 S2 영역에 걸쳐 검출되었다 (도 19A). 막-특이적 IFNγ+ 생산 T 세포 반응은 벡터 대조군과 비교하여 유의하게 더 높은 것으로 나타난 반면 (도 19B), 뉴클레오캡시드-특이적 T 세포 반응은 SCV-COVID19A 백신접종 마우스와 벡터 대조군 사이에서 유사하였다 (도 19C).
결론
SCV-COVID19 백신접종의 단일 용량은 스파이크-특이적 및 막-특이적 IFNγ-분비 CD8+ T 세포의 증가에 의해 나타난 바와 같이 광범위한 T 세포 반응을 유도한다.
실시예 13
동등한 비율의 SCV-COVID19C 및 SCV-COVID19G를 사용한 단일 백신접종은 스파이크 및 막 단백질에 대해 지시된 스파이크-특이적 항체 반응 및 CD8 + T 세포 반응을 유도한다.
실험적 전략
6-9주령 수컷 C57BL/6 마우스의 그룹 (그룹당 n=5마리)에 동등한 비율의 SCV-COVID19C (107 PFU/마우스) 및 SCV-COVID19G (107 PFU/마우스) 또는 벡터 대조군 SCV-SMX06을 함유하는 혼합 백신을 근육내 투여를 통해 백신접종하였다. 백신접종 후 21일에 혈액 샘플을 수집하고, 항체 분석을 위해 혈청을 분리하였다. 스파이크 (S1)-특이적 항체 반응은 ELISA에 의해 결정되고 스파이크 및 막 단백질에 대해 지시된 T 세포 반응을 ELISpot 및 ICS에 의해 검출되었다.
방법
S1-특이적 항체 수준에 대한 효소-결합된 면역흡착 검정을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. ELISpot 검정 (이전에 기재됨)을 이용하여 단백질의 전체 길이에 걸쳐 있는 펩티드를 사용하여 스파이크 및 막 특이적 IFN-γ 생산 T 세포 반응을 확인하였다.
결과
S1-특이적 항체 반응을 면역화 후 21일에 ELISA에 의해 평가하였다. SCV-COVID19C 및 SCV-COVID19G로 구성된 혼합 백신을 사용한 백신접종은 벡터 단독 SMX06 대조군과 비교하여 유의하게 더 높은 S1-특이적 항체 반응을 생성하였다 (도 20A). 단일 샷 백신접종 후 ICS에 의해 검출된 스파이크-특이적 IFNγ+ 생산 T 세포의 수준은 또한 벡터 대조군과 비교하여 더 높았다 (도 20B). 혼합 백신을 사용한 백신접종은 벡터 대조군과 비교하여 스파이크 및 막 단백질의 전체 길이에 걸쳐 있는 펩티드에 대한 항원-특이적 스폿 형성 단위 (SFU)의 유의한 증가를 초래하였다 (도 20C).
결론
본원의 실시예 13은 각각 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 및 SARS-CoV-2 막 및 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 SCV-COVID19C 및 SCV-COVID19G로 구성된 혼합 백신을 사용한 동물 모델의 면역화가 S1-특이적 항체의 생산에 의해 나타난 바와 같이 세포성 및 체액성 반응을 유도하고 스파이크-특이적 IFNγ-분비 CD8+ T 세포를 증가시킨다는 것을 나타낸다. 이는 혼합 SCV-COVID19 백신이 COVID-19의 감염제인 SARS-CoV-2에 대한 예방적 보호를 제공할 수 있음을 시사한다.
실시예 14
동일한 벡터로부터 다수의 우세한 항원을 발현하는 것이 단일 벡터로부터 각각의 우세한 항원을 발현하는 것과 비교하여 최적의 면역 반응을 자극하는데 해롭지 않은지를 결정
상이한 생 약독화된 바이러스 백신을 조합할 때, 바이러스 간의 경쟁이 가장 흔히 관찰되는 문제이다. 이는 조합 백신의 용량을 늘리거나 각각의 백신 성분의 용량을 조정하여 우세한 백신(들) 성분과의 경쟁을 극복함으로써 할 수 있다.
'면역학적 간섭'에 의한 항원 경쟁은 3가 디프테리아-백일해-파상풍 백신 성분 사이, 개 디스템퍼 박테린과 생 개 디스템퍼 바이러스 사이 및 보르데텔라가 생 조합 디스템퍼 바이러스, 아데노바이러스 유형 2, 파르보바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 백신에 대한 희석제로 사용될 때 보고되었다. 일부 경우에서, 다성분 백신을 접종하면 성분을 단독으로 투여할 때보다 항체가 더 적게 도출된다. 다른 경우에서, 한 항원에 대한 반응은 우세하고 다른 항원에 대한 반응은 억제된다. 다른 경우에서, 상호 경쟁이 발생하면 모든 성분에 대한 반응이 감소된다.
항원 경쟁의 정도는 경쟁 항원의 상대적 접종 부위, 항원 투여 사이의 시간 간격 및 억제된 항원에 대비 우세한 항원의 용량을 포함하는 다수의 백신접종 파라미터에 의존하는 것으로 나타났다.
상기의 문제는 동일한 벡터로부터 여러 질환 유발 인자로부터의 면역화 항원을 발현하여 면역계에 각각의 면역화 항원의 동등한 제시를 보장함으로써 해결될 수 있고 항원 전달을 위한 단일 벡터로 벡터에 대한 최적의 백신접종 경로만 고려할 필요가 있음에도 불구하고, B 세포 및 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포에 의한 우선적인 항원 포획 및 MHC 제시에 의해 항원 간섭이 발생할 위험이 있다. 우세한 B 세포 및/또는 T 세포 에피토프를 갖는 항원은 차선의 B-세포 또는 T-세포 에피토프를 갖는 항원보다 더 강한 면역 반응을 생성할 것이다. 따라서, 이는 다수의 질환 유발 인자로부터 다수의 항원을 발현하는 단일 벡터로 백신접종할 때 가장 우세한 항원에 대한 편향된 면역 반응을 야기할 것이다.
다수의 질환 유발 바이러스로부터 다수의 우세한 항원의 발현이 서로의 면역 반응을 간섭할 것인지를 결정하기 위한 연구가 수행된다. 동일한 벡터로부터 2개의 우세한 항원을 발현하는 것은 각각의 바이러스에 대한 강력한 면역 반응을 자극하는 서로의 능력을 간섭할 수 있으며, 즉 하나의 우세한 항원이 다른 항원보다 더 우세할 수 있다.
동일한 벡터로부터 다수의 우세한 항원을 발현하는 것이 단일 벡터로부터 각각의 우세한 항원을 발현하는 것과 비교하여 최적의 면역 반응을 자극하는데 해롭지 않은지를 결정하기 위해, 마우스에서 백신접종 연구가 수행된다.
실험적 전략
야생형 C57BL/6 및 인터페론 수용체 결핍 마우스 (IFNAR) 암컷 마우스 또는 ACE-2 결핍 마우스에 처리 그룹당 6마리 마우스의 그룹으로 재조합 바이러스 SCV-COVID19A 또는 SCV-COVID19B, 또는 SCV-COVID19C, SCV-COVID19D, 또는 SCV-COVID19E의 혼합물, 또는 빈 벡터 대조군을 1회 백신접종한다. 모든 처리 그룹에 복강내 주사를 통해 106 PFU/마우스 백신을 투여하고 백신접종 후 2주 및 4주에 채혈한다. 모든 마우스는 백신접종 후 6주에 챌린지된다.
중화 검정
중화 항체의 수준은 종종 보호의 상관물로서 사용된다. 따라서, 중화 항체의 수준은 SARS-CoV-2에 대한 베로 세포에서의 표준 미세중화 검정을 이용하여 모든 백신 그룹에서 챌린지 전에 계산되었다. 간단히 말해서, 혈청은 열 불활성화되고 (30분 동안 56℃), 각각의 마우스로부터의 혈청은 96 웰 플레이트에서 이중으로 연속 희석되고, 37℃에서 1시간 동안 100 CCID150 단위의 바이러스와 함께 인큐베이션된다. 이 중화 단계 후, 새로 분할된 베로 세포를 혈청/바이러스 혼합물에 중첩하고 (웰당 104개 세포) 세포변성 효과가 현미경 하에 시각화될 때까지 5일 동안 인큐베이션한다. 세포변성 효과에 대한 100% 보호를 제공하는 혈청 희석은 크리스탈 바이올렛 염색을 이용하여 결정된다.
결과
SARS-CoV-2 항원을 발현하는 백신 후보 둘 다는 단일 백신 투여 후 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 중화 항체를 유도한다.
임신 전에 재조합 SCV-COVID19 바이러스를 사용하여 이전에 백신접종된 SARS-CoV-2 바이러스 감염 모체로부터 마우스 태아 보호
이 연구의 목적은 임신 전에 SARS-CoV-2 항원을 발현하는 암컷 마우스의 이전 백신접종이 태어나지 않은 태아의 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대한 보호를 제공할 수 있음을 나타내는 것이다.
이 연구는 암컷 IFNAR -/-에 SCV-COVID19A, SCV-COVID19B, 또는 벡터 단독을 백신접종한 후 수컷 IFNAR 마우스와 짝짓기함으로써 수행된다. 이어서, 임신한 마우스는 SARS-CoV-2로 감염된다.
실험적 전략
6-8주령 IFNAR -/-에 단일-벡터화된 백신, SCV-COVID19A, SCV-COVID19B, 또는 벡터 단독을 제0주에 106 PFU/마우스로 근육내 경로를 통해 1회 백신접종한다. 백신으로의 혈청전환을 체크하기 위해 백신접종 후 4주에 마우스 그룹을 채혈한다. 백신접종 후 6주에, 백신접종된 마우스에서 임신을 유도하기 위해 정기의 짝짓기가 개시된다. 암컷 마우스에서 성공적인 임신의 증거 (질 마개)를 매일 체크한다. 배아 제6.5일에, 임신한 마우스는 피하 감염을 통해 104 CCID50 단위의 SARS-CoV-2로 감염된다. 감염 후, 임신한 마우스는 바이러스혈증을 체크하기 위해 제1일 내지 제5일에 매일 채혈된다. 배아 제17.5일에, 임신한 마우스를 추려내고 감염성 SARS-CoV-2를 평가하기 위해 물질을 수거한다.
결과
임신 전에 SCV-COVID19A 또는 SCV-COVID19B로 이전에 백신접종된 임신한 암컷 마우스는 챌린지 후 바이러스혈증이 검출되지 않는 것으로 나타나는 바와 같이 SARS-CoV-2로의 챌린지 동안 SARS-CoV-2 바이러스 복제를 방지할 수 있다. SCV 벡터 단독으로 백신접종된 마우스는 SARS-CoV-2 바이러스에 의한 바이러스 복제를 방지할 수 없다.
짝짓기 및 임신 전에 SCV-COVID19A 또는 SCV-COVID19B 백신의 단일 샷으로 이전에 백신접종된 암컷 마우스는 챌린지 후 검출가능한 수준의 SARS-CoV-2 바이러스가 나타나지 않는다. 백신접종은 챌린지 바이러스가 태반을 감염시키는 것을 방지하고 이로써 취약한 태아로의 SARS-CoV-2 바이러스의 이어지는 전파를차단한다.
그러나, SCV 벡터 단독으로 이전에 백신접종된 암컷 마우스에 대해서는 그렇지 않으며, 이 경우 임신 동안 챌린지 후에 태반의 일부가 감염될 수 있고 SARS-CoV-2 바이러스 감염이 태아로 전파될 수 있다.
결론
SCV-COVID19A 또는 SCV-COVID19B 단일 벡터화된 백신의 단일 샷으로 이전에 백신접종된 임신한 암컷 마우스는 바이러스혈증 결과에 의해 나타나는 대조군 백신과 비교하여 SARS-CoV-2 챌린지로부터 보호된다.
임신 전 모체의 백신접종은 SARS-CoV-2 바이러스가 모체의 태반을 감염시키는 것을 방지하고 태어나지 않은 태아 뇌로의 이어지는 전파를 차단함으로써 태아를 보호할 수 있다.
태아로의 SARS-CoV-2 챌린지 바이러스의 이어지는 전파는 임신 전 모체의 사전 백신접종에 의해 차단된다.
실시예 15
SCV-COVD19C를 사용한 단일 백신접종은 에피토프-특이적 세포독성 T 림프구 (CTL) 활성을 생성한다
CD8 세포독성 T 림프구 (CTL)는 부류 I MHC-연관된 펩티드를 인식하고, 항원-의존적 자극 시 그랜자임 및 퍼포린을 분비하여 바이러스-감염된 세포를 사멸시킨다. 바이러스-특이적 CTL 반응은 바이러스혈증을 함유하는데 중요한 역할을 한다. 퍼포린은 세포막 기공을 생성하여 그랜자임의 세포내 전달을 허용함으로써 아폽토시스 사멸을 유도하는 카스파제의 절단 및 활성화를 야기한다. 본 실시예에서 본 발명자들은 방사성 동위원소 51크롬 방출을 이용하여 이펙터 T 세포의 활성화를 입증하여 바이러스-특이적 T 세포-매개된 세포독성을 평가한다.
실험적 전략
C57BL/6 마우스에 마우스당 107 pfu의 용량으로 SCV-COVID19C 또는 벡터 대조군 SCV-SMX06을 근육내 투여를 통해 백신접종하였다. 백신접종 후 제7일에, 비장을 수거하고, 이펙터 세포를 표준 51크롬 (51Cr)-방출을 통해 펩티드 결정자-펄싱된 EL4 표적 세포에 대한 직접적인 생체외 세포용해성 T 림프구 활성에 대해 분석하였다.
세포용해성 T 림프구 검정
EL4 (H-2b) 세포를 성장시키고, 펩티드 펄싱 및 51Cr 표지화를 통한 검정을 준비하였다. EL4 세포를 세척하고, SARS-CoV-2 면역우세 T 세포 에피토프, YNYLYRLF (SEQ ID NO:9) 또는 VNFNFNGL (SEQ ID NO:11)을 나타내는 펩티드로 2시간 동안 펄싱하였다. 이들 2개의 에피토프는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 S1 서브유닛의 RBD 영역에 위치된다. 세포를 부드럽게 두드려서 20분마다 혼합하였다. 이어서, 펩티드 펄싱된 EL4 세포를 2회 세척하여 임의의 과량의 펩티드를 제거하고, 45-60분 동안 20-50 μCi의 51Cr로 표지하였다. 세포를 2회 세척하여 과량의 51Cr을 제거하고, 2 x 104개의 펩티드 펄싱되고 방사성 표지된 표적 세포/100 μl 부피로 재현탁시켰다.
이펙터 세포를 백신접종된 동물의 수거된 비장으로부터 제조하였다. 비장세포의 단일 세포 현탁액의 희석액은 완전한 배지에 재현탁하기 전에 세포를 70 μM 세포 스트레이너를 통과시키고 ACK 용해에 의해 제조하였다. 세포를 2 x 107개 세포/ml로 재현탁시키고, 3배 연속 희석액으로 웰에 분배하였다.
표적 세포를 이펙터 세포를 함유하는 웰에 첨가하고, 6시간 동안 인큐베이션하였다. 최대 방출 제어를 위해, 100 μl의 트리톤(Triton) X를 웰에 첨가하여 세포를 용해시키고, 배지로 크롬을 완전히 방출시켰다. 인큐베이션 후, 플레이트를 1200 rpm에서 5분 동안 회전시키고, 30 μl의 상층액을 방사능 측정을 위해 루나(Luma) 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 밤새 건조시키고, 다음날 마이크로베타2(Microbeta2) 플레이트 판독기에서 평가하였다. 이펙터 세포의 각각의 농도에 대한 퍼센트 용해는 하기 수학식을 이용하여 결정된다:
퍼센트 비용해 = [샘플 51Cr 방출 (cpm) - 자연 방출 (cpm)]/[최대 방출 (cpm) - 자연 방출 (cpm)] x 100%.
결과
결과는 펩티드 YNYLYRLF (SEQ ID NO:9) 및 VNFNFNGL (SEQ ID NO:11)로 펄싱된 표적 세포에 대해 비용해가 있음을 나타내며 (도 21A,B), 이는 백신이 에피토프-특이적 세포독성 T 세포를 생성함을 시사한다. 이 결과는, 대조군 마우스 및 대조군 표적 세포 (각각 SMX06 백신접종된 마우스 및 비-펼싱된 표적 세포)에 대해서는 검출된 용해 없이, 에피토프-특이적인 것으로 보인다 (도 21C).
결론
SCV-COVID19C의 단일 백신접종은 SARS-CoV-2 에피토프 특이적 세포용해성 T 림프구 반응을 생성한다.
Figure pct00010
Figure pct00011
SEQUENCE LISTING <110> SEMENTIS LIMITED <120> ATTENUATED POXVIRUS VECTOR BASED VACCINE FOR PROTECTION AGAINST COVID-19 <130> SEMENTIS 2 PCT <150> US 63/003,012 <151> 2020-03-31 <150> US 63/066,927 <151> 2020-08-18 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6418 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> EXPRESSION CASSETTE <400> 1 gcggccgccc tgcaggccat caaaaatata agtgcggtat gagttctcgc tataacgatc 60 ggagatacag gggcgtaccc agtaagcaac tccatagcat acgtgttctc atccattaga 120 gagttagtat atacaataca atatttctga ccaataagag gttttagaat attacgatta 180 gtgatgagag gaataatttc acccggatta atcttggcaa atgttctgtt aggaatagca 240 gctagaacat tctttgtagt cttgtaatca acgatggcgg catcctcgaa cttattattt 300 tttgagatat cctcgataat tttatgccat tcagccattg ttatttatta tatatgtttt 360 ttaataagac atctattgga ataaacttga cattagcatt ttattcttat tacaaaatat 420 aaaatataaa atataaaata aaatatacaa tccaatactc acataatcca actcactcga 480 acactatttt tccaattacg ataacaatat tgcagacctg caggtagtaa cccttaattt 540 tattaaaata accgcaattt 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tagttaatag cgtacttctt tttcttgctt 2100 tcgtggtatt cttgctagtt acactagcca tccttactgc gcttcgattg tgtgcgtact 2160 gctgcaatat tgttaacgtg agtcttgtaa aaccttcttt ttacgtttac tctcgtgtta 2220 aaaatctgaa ttcttctaga gttcctgatc ttctggtcta atttttatta aatttaaatg 2280 cgatcgccta aatattcata actaattttt attaatgata caaaaacgaa ataaaactgc 2340 atattataca ctggttaacg cccttatagg ctctaaccat tttcaagatg aggtccctga 2400 ttatagtcct tctgttcccc tctatcatct actccatgtc tattagacga tgtgagaaga 2460 ctgaagagga aacatgggga ttgaaaatag ggttgtgtat aattgccaaa gatttctatc 2520 ccgaaagaac tgattgcagt gttcatctcc caactgcaag tgaaggattg ataactgaag 2580 gcaatggatt cagggatata cgaaacaccg ataaattata aaaaaagcaa tgtgtccgct 2640 gtttccgtta ataatactat tttcgtaact ggcggattat tcataaataa ctctaatagc 2700 acgatcgtgg ttaacaatat ggaaaaactt gacatttata aagacaaaca atggtcgatt 2760 atagaaatgc ctatggctag ggtatatgcg atcgcgcggc cgc 2803 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> CORONAVIRUS <400> 9 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> CORONAVIRUS <400> 10 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> CORONAVIRUS <400> 11 Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu 1 5

Claims (20)

  1. 유전자 조작된 약독화된 백시니아 바이러스를 포함하는, SARS-CoV-2 코로나바이러스 질환의 위험을 예방 또는 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물로서, 여기서 백시니아 바이러스 게놈은 스파이크 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 막 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 및 엔벨로프 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 약독화된 백시니아 바이러스는 내인성 필수 어셈블리 또는 성숙 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 결실을 포함하는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 약독화된 백시니아 바이러스 게놈이 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 약독화된 백시니아 바이러스 게놈이 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 막 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 약독화된 백시니아 바이러스 게놈이 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 약독화된 백시니아 바이러스 게놈이 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 막 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분 및 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 약독화된 백시니아 바이러스 게놈이 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 및 막 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분 및 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 약독화된 백시니아 바이러스 게놈이 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 스파이크 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 및 막 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 및 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 및 엔벨로프 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 COP-C23L, COP-B29R, COP-C3L, COP-N1L, COP-A35R, COP-A39R, COP-A41L, COP-A44R, COP-A46R, COP-B7R, COP-B8R, COP-B13R, COP-B16R, 및 COP-B19R로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 면역 조정 유전자의 결실된 ORF에 삽입되는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 약독화된 백시니아 바이러스 게놈의 유전자간 영역 (IGR)에 삽입되며, 여기서 IGR은 백시니아 바이러스 게놈의 2개의 인접한 ORF 사이에 위치되거나 또는 그에 의해 플랭킹되는 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 약독화된 백시니아 바이러스 게놈의 IGR이 F9L-F10L, F12L-F13L, F17R-E1L, E1L-E2L, E8R-E9L, E9L-E10R, I1L-I2L, I2L-I3L, I5L-I6L, I6L-I7L, I7L-I8R, I8R-G1L, G1L-G3L, G3L-G2R, G2R-G4L, G4L-G5R, G5R-G5.5R, G5.5R-G6R, G6R-G7L, G7L-G8R, G8R-G9R, G9R-L1R, L1R-L2R, L2R-L3L, L3L-L4R, L4R-L5R, L5R-J1R, J3R-J4R, J4R-J5L, J5L-J6R, J6R-H1L, H1L-H2R, H2R-H3L, H3L-H4L, H4L-H5R, H5R-H6R, H6R-H7R, H7R-D1R, D1R-D2L, D2L-D3R, D3R-D4R, D4R-D5R, D5R-D6R, D6R-D7R, D9R-D10R, D10R-D11L, D11L-D12L, D12L-D13L, D13L-A1L, A1L-A2L, A2L-A2.5L, A2.5L-A3L, A3L-A4L, A4L-A5R, A5R-A6L, A6L-A7L, A7L-A8R, A8R-A9L, A9L-A10L, A10L-A11R, A11R-A12L, A12L-A13L, A13L-A14L, A14L-A14.5L, A14.5L-A15L, A15L-A16L, A16L-A17L, A17L-A18R, A18R-A19L, A19L-A21L, A21L-A20R, A20R-A22R, A22R-A23R, A23R-A24R, A28L-A29L 및 A29L-A30L, 001L-002L, 002L-003L, 005R-006R, 006L-007R, 007R-008L, 008L-009L, 017L-018L, 018L-019L, 019L-02OL, 020L-021L, 023L-024L, 024L-025L, 025L-026L, 028R-029L, 03OL-031L, 031L-032L, 032L-033L, 035L-036L, 036L-037L, 037L-038L, 039L-040L, 043L-044L, 044L-045L, 046L-047R, 049L-050L, 050L-051L, 051L-052R, 052R-053R, 053R-054R, 054R-055R, 055R-056L, 061L-062L, 064L-065L, 065L-066L, 066L-067L, 077L-078R, 078R-079R, 080R-081R, 081R-082L, 082L-083R, 085R-086R, 086R-087R, 088R-089L, 089L-090R, 092R-093L, 094L-095R, 096R-097R, 097R-098R, 101R-102R, 103R-104R, 105L-106R, 107R-108L, 108L-109L, 109L-110L, 110L-111L, 113L-114L, 114L-115L, 115L-116R, 117L-118L, 118L-119R, 122R-123L, 123L-124L, 124L-125L, 125L-126L, 133R-134R, 134R-135R, 136L-137L, 137L-138L, 141L-142R, 143L-144R, 144R-145R, 145R-146R, 146R-147R, 147R-148R, 148R-149L, 152R-153L, 153L-154R, 154R-155R, 156R-157L, 157L-158R, 159R-160L, 160L-161R, 162R-163R, 163R-164R, 164R-165R, 165R-166R, 166R-167R, 167R-168R, 170R-171R, 173R-174R, 175R-176R, 176R-177R, 178R-179R, 179R-180R, 180R-181R, 183R-184R, 184R-185L, 185L-186R, 186R-187R, 187R-188R, 188R-189R, 189R-190R 및 192R-193R로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 약독화된 백시니아 바이러스가 백시니아 바이러스 A41L 유전자, 백시니아 바이러스 D13L 유전자, 백시니아 바이러스 B7R-B8R 유전자, 백시니아 바이러스 A39R 유전자 및 백시니아 바이러스 C3L 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 결실을 포함하는 것인 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열이 하나 이상의 유전자의 적어도 하나의 결실 부위에 삽입되는 것인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분이 백시니아 바이러스 A41L 유전자 결실 부위에 삽입되는 것인 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 막 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분, 및 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분이 백시니아 바이러스 D13L 유전자 결실 부위에 삽입되는 것인 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 엔벨로프 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분이 백시니아 바이러스 B7R-B8R 유전자 결실 부위에 삽입되는 것인 조성물.
  16. 제12항에 있어서, 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 갖는 하나 이상의 발현 카세트에 의해 코딩되는 것인 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  18. 유전자 조작된 약독화된 백시니아 바이러스를 포함하는, 코로나바이러스 질환의 위험을 감소시키는 동물에서의 면역 반응을 일으키기 위한 조성물로서, 여기서 백시니아 바이러스 게놈은 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 약독화된 백시니아 바이러스는, 제2의 유전자 조작된 약독화된 백시니아 바이러스와 혼합된, 내인성 필수 어셈블리 또는 성숙 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 결실을 포함하고, 여기서 제2의 백시니아 바이러스 게놈은 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2의 막 단백질 폴리펩티드 및 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 부분 또는 부분들을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 제2의 약독화된 백시니아 바이러스는 내인성 필수 어셈블리 또는 성숙 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 결실을 포함하는 것인 조성물.
  19. 유전자 조작된 약독화된 백시니아 바이러스 벡터로서, 여기서 백시니아 바이러스 게놈은 인간 코로나바이러스 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 폴리펩티드, 막 단백질 폴리펩티드 및 뉴클레오캡시드 단백질 폴리펩티드, 및/또는 엔벨로프 단백질 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 약독화된 백시니아 바이러스 벡터는 바이러스-유사 입자로 어셈블링하는 상기 언급된 폴리펩티드를 발현하는 것인 벡터.
  20. 제1항의 조성물을 SARS-CoV-2에 대해 지시되는 면역 반응을 도출하기에 효과적인 양으로 인간을 포함한 동물에게 투여하는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 감염의 위험을 예방 또는 감소시키는 방법.
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