RU2778312C2 - Вирусные вакцины - Google Patents
Вирусные вакцины Download PDFInfo
- Publication number
- RU2778312C2 RU2778312C2 RU2019107582A RU2019107582A RU2778312C2 RU 2778312 C2 RU2778312 C2 RU 2778312C2 RU 2019107582 A RU2019107582 A RU 2019107582A RU 2019107582 A RU2019107582 A RU 2019107582A RU 2778312 C2 RU2778312 C2 RU 2778312C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- infection
- chikungunya
- poxvirus
- sequence
- Prior art date
Links
- 229960004854 VIRAL VACCINES Drugs 0.000 title 1
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 claims abstract description 88
- 241001502567 Chikungunya virus Species 0.000 claims abstract description 79
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 claims abstract description 75
- 108050006987 Poxvirus Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 52
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims abstract description 43
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 claims abstract description 41
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 36
- 230000002238 attenuated Effects 0.000 claims abstract description 34
- 102000011587 Polyproteins Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000001681 protective Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 58
- 101710006307 MVA110L Proteins 0.000 claims description 31
- 101710041887 vBCL2 Proteins 0.000 claims description 31
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 claims description 17
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 17
- 101710042050 A43R Proteins 0.000 claims description 16
- 102220435179 CLIC5 A39R Human genes 0.000 claims description 16
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 claims description 16
- 101710005553 VACWR159 Proteins 0.000 claims description 16
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 claims description 12
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 claims description 7
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 6
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 claims description 6
- 101710036968 HR Proteins 0.000 claims description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K Aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K Aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J Potassium alum Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 2
- 229940103272 aluminum potassium sulfate Drugs 0.000 claims description 2
- HUSUHZRVLBSGBO-UHFFFAOYSA-L calcium;dihydrogen phosphate;hydroxide Chemical compound O.[Ca+2].OP([O-])([O-])=O HUSUHZRVLBSGBO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 201000009182 chikungunya Diseases 0.000 abstract description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 102
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 78
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 description 76
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 69
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 62
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 53
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 52
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 52
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 52
- 101700073965 CP77 Proteins 0.000 description 30
- 101710031584 fil Proteins 0.000 description 30
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 28
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 26
- 101710029045 46 Proteins 0.000 description 24
- 210000002845 Virion Anatomy 0.000 description 24
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 24
- VBJHPXDIVMXHJU-UHFFFAOYSA-N Zeocin Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(=O)NCCCCN=C(N)N)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1[N]C=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C VBJHPXDIVMXHJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 22
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 19
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 17
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 15
- 108010061543 Neutralizing Antibodies Proteins 0.000 description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 14
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 13
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 13
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 13
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 13
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 13
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 12
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 11
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 11
- 208000001455 Zika Virus Infection Diseases 0.000 description 11
- 108091005938 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 11
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 11
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 101710030378 IFNAR1 Proteins 0.000 description 9
- 102100016263 IFNAR1 Human genes 0.000 description 9
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 9
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 9
- 241000947772 Strawberry crinkle virus Species 0.000 description 8
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 8
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 7
- 101710024107 PRNP Proteins 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 description 7
- 101700075700 putR Proteins 0.000 description 7
- 210000002472 Endoplasmic Reticulum Anatomy 0.000 description 6
- 210000003754 Fetus Anatomy 0.000 description 6
- 210000002826 Placenta Anatomy 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic Effects 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 6
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 6
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 6
- 210000003719 B-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 5
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 5
- 241000700628 Chordopoxvirinae Species 0.000 description 5
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 5
- 210000000805 Cytoplasm Anatomy 0.000 description 5
- 206010066919 Epidemic polyarthritis Diseases 0.000 description 5
- 229920000970 Repeated sequence (DNA) Polymers 0.000 description 5
- 229940083538 Smallpox Vaccine Drugs 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 241000256173 Aedes albopictus Species 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 101700001323 IRF3 Proteins 0.000 description 4
- 102100013275 IRF3 Human genes 0.000 description 4
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 4
- 241000710942 Ross River virus Species 0.000 description 4
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral Effects 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- -1 cRNA Polymers 0.000 description 4
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic Effects 0.000 description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 4
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 4
- 230000001665 lethal Effects 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 4
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 3
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 3
- 241000700572 Entomopoxvirinae Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 3
- 206010040872 Skin infection Diseases 0.000 description 3
- 229920000401 Three prime untranslated region Polymers 0.000 description 3
- 101700021629 VEMP Proteins 0.000 description 3
- 101700054919 VGE Proteins 0.000 description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 206010047461 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 3
- 201000001084 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 3
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 3
- 230000023298 conjugation with cellular fusion Effects 0.000 description 3
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic Effects 0.000 description 3
- 230000002354 daily Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003899 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 3
- 230000002045 lasting Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 3
- 101710026800 lyc Proteins 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 229920001894 non-coding RNA Polymers 0.000 description 3
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 3
- 101700003508 pgtE Proteins 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002633 protecting Effects 0.000 description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 3
- 102000003995 transcription factors Human genes 0.000 description 3
- 108090000464 transcription factors Proteins 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000021037 unidirectional conjugation Effects 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 210000000628 Antibody-Producing Cells Anatomy 0.000 description 2
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 210000000234 Capsid Anatomy 0.000 description 2
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 2
- 102000018251 EC 2.4.2.8 Human genes 0.000 description 2
- 108010091358 EC 2.4.2.8 Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 229920000665 Exon Polymers 0.000 description 2
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 2
- 229940047124 Interferons Drugs 0.000 description 2
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 description 2
- 108020004391 Introns Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 102100005410 LINE-1 retrotransposable element ORF2 protein Human genes 0.000 description 2
- 229920001320 Leader sequence (mRNA) Polymers 0.000 description 2
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 208000004141 Microcephaly Diseases 0.000 description 2
- 229920002332 Noncoding DNA Polymers 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 2
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 2
- 210000001550 Testis Anatomy 0.000 description 2
- 229960005454 Thioguanine Drugs 0.000 description 2
- 208000007089 Vaccinia Diseases 0.000 description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 2
- 210000003501 Vero Cells Anatomy 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 230000001488 breeding Effects 0.000 description 2
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002498 deadly Effects 0.000 description 2
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 101710034616 gVIII-1 Proteins 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 2
- 108009000345 mRNA Processing Proteins 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000002085 persistent Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000002522 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 2
- POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N (2S)-1-[2-[[(2S)-2-amino-3-carboxypropanoyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- PABVKUJVLNMOJP-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-[(1-carboxy-2-sulfanylethyl)amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CS)C(O)=O PABVKUJVLNMOJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 229940047395 ACAM2000 Drugs 0.000 description 1
- 101700033661 ACTB Proteins 0.000 description 1
- 102100011550 ACTB Human genes 0.000 description 1
- 101710032514 ACTI Proteins 0.000 description 1
- 101710013860 AT59 Proteins 0.000 description 1
- 206010000565 Acquired immunodeficiency syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 240000000800 Allium ursinum Species 0.000 description 1
- 210000000612 Antigen-Presenting Cells Anatomy 0.000 description 1
- 241000269350 Anura Species 0.000 description 1
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 206010003246 Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010003399 Arthropod bite Diseases 0.000 description 1
- QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N Asn-Gln Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O QCWJKJLNCFEVPQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 101710013859 At1g04680 Proteins 0.000 description 1
- 101710013837 At1g67750 Proteins 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 101710010587 CASP13 Proteins 0.000 description 1
- 241000712083 Canine morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000004671 Cell-Free System Anatomy 0.000 description 1
- 241000251556 Chordata Species 0.000 description 1
- 229920002839 Cis-regulatory element Polymers 0.000 description 1
- 208000001590 Congenital Abnormality Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 210000000172 Cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 101710007887 DHFR Proteins 0.000 description 1
- 102100005838 DHFR Human genes 0.000 description 1
- 108009000097 DNA Replication Proteins 0.000 description 1
- 210000004443 Dendritic Cells Anatomy 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 241000710829 Dengue virus group Species 0.000 description 1
- 206010013023 Diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 EC 2.7.7.49 Proteins 0.000 description 1
- 101710038747 EEF1A1 Proteins 0.000 description 1
- 101710038764 EEF1A1P5 Proteins 0.000 description 1
- 101710038745 EEF1A2 Proteins 0.000 description 1
- 206010014612 Encephalitis viral Diseases 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000001362 Fetal Growth Retardation Diseases 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 206010070531 Foetal growth restriction Diseases 0.000 description 1
- 102100014497 GOLPH3 Human genes 0.000 description 1
- 101710008339 GOLPH3 Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- SXGAGTVDWKQYCX-BQBZGAKWSA-N Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SXGAGTVDWKQYCX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 210000002288 Golgi Apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N His-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- WSDOHRLQDGAOGU-UHFFFAOYSA-N Histidinyl-Asparagine Chemical compound NC(=O)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 WSDOHRLQDGAOGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 101700086956 IFNG Proteins 0.000 description 1
- 102100016020 IFNG Human genes 0.000 description 1
- 101710004181 INTS2 Proteins 0.000 description 1
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 229940065638 Intron A Drugs 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N L-serine Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N L-tyrosyl-L-tyrosine Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 241000283953 Lagomorpha Species 0.000 description 1
- 241000283986 Lepus Species 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 101710005211 MRPL13 Proteins 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000721578 Melopsittacus Species 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101710017500 MitHPPK/DHPS Proteins 0.000 description 1
- 241000700627 Monkeypox virus Species 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101700062818 NP Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 Organelles Anatomy 0.000 description 1
- 241000283898 Ovis Species 0.000 description 1
- 101710043203 P23p89 Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241000700639 Parapoxvirus Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- PYOHODCEOHCZBM-RYUDHWBXSA-N Phe-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 PYOHODCEOHCZBM-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- IEHDJWSAXBGJIP-RYUDHWBXSA-N Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=CC=C1 IEHDJWSAXBGJIP-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 108020004454 Phosphoglycerate kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000011755 Phosphoglycerate kinases Human genes 0.000 description 1
- 241000232219 Platanista Species 0.000 description 1
- 206010036030 Polyarthritis Diseases 0.000 description 1
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 229920000320 RNA (poly(A)) Polymers 0.000 description 1
- 102100012146 RPL13 Human genes 0.000 description 1
- 101710004275 RPL13 Proteins 0.000 description 1
- 101710036096 RPL13B Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 229920001914 Ribonucleotide Polymers 0.000 description 1
- 241000724205 Rice stripe tenuivirus Species 0.000 description 1
- 241000288961 Saguinus imperator Species 0.000 description 1
- 241000282695 Saimiri Species 0.000 description 1
- 210000000582 Semen Anatomy 0.000 description 1
- UJTZHGHXJKIAOS-WHFBIAKZSA-N Ser-Gln Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O UJTZHGHXJKIAOS-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 241000287231 Serinus Species 0.000 description 1
- LZLREEUGSYITMX-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(CO)N)C(O)=O)=CNC2=C1 LZLREEUGSYITMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 206010049771 Shock haemorrhagic Diseases 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920000978 Start codon Polymers 0.000 description 1
- 229920001630 Subgenomic mRNA Polymers 0.000 description 1
- 101710005270 TEF1 Proteins 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N Tyrosyl-Serine Chemical compound OCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710015310 VI Proteins 0.000 description 1
- 241000700622 Vaccinia virus Copenhagen Species 0.000 description 1
- JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 102000016350 Viral Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000001877 Whooping Cough Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 1
- 231100000494 adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic Effects 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- 108091005941 blue fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 1
- 101700053531 chxR Proteins 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccines Drugs 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000000056 copulatory Effects 0.000 description 1
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 1
- 238000003235 crystal violet staining Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase family Human genes 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase family Proteins 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structures Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 108091006031 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034387 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 102000034448 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006088 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 125000000267 glycino group Chemical group [H]N([*])C([H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 238000010808 iTaq universal SYBR Green Supermix Kit Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing Effects 0.000 description 1
- 101710017890 large T Proteins 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000002101 lytic Effects 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial Effects 0.000 description 1
- 241000609532 mosquito-borne viruses Species 0.000 description 1
- 101700045377 mvp1 Proteins 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 201000005702 pertussis Diseases 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 108010084572 phenylalanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000009021 pre-vaccination Methods 0.000 description 1
- 108020001589 prmA Proteins 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000069 prophylaxis Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative Effects 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002033 ribozyme Polymers 0.000 description 1
- 101710036031 rpl1602 Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained Effects 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 201000002498 viral encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- XITLYYAIPBBHPX-UHFFFAOYSA-N γ-glutamyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O XITLYYAIPBBHPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Группа изобретений относится к области медицины, а именно к инфектологии и иммунологии, и предназначена для индуцирования у пациента защитного иммунного ответа на инфицирование чикунгуньей, натуральной оспой и вирусом Зика. Композиция, которая индуцирует у пациента защитный иммунный ответ на инфицирование чикунгуньей, натуральной оспой и вирусом Зика, содержит фармацевтически приемлемый носитель и аттенуированный поксвирус. Геном поксвируса содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую субгеномный полипротеин 26S вируса чикунгуньи, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипротеин PrME вируса Зика. Аттенуированный поксвирус представляет собой модифицированный поксвирус, причем модификация включает делецию по меньшей мере одного гена, кодирующего эндогенный незаменимый белок сборки или созревания. Также представлено применение указанной композиции для индуцирования у пациента защитного иммунного ответа на инфицирование чикунгуньей, натуральной оспой и вирусом Зика. Использование группы изобретений позволяет снизить риск инфицирования чикунгуньей, вирусом Зика и натуральной оспой. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 табл., 9 ил., 3 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[001] Настоящее изобретение относится к аттенуированной вакцине на основе поксвирусного вектора для защиты от чикунгуньи и натуральной оспы, вируса Зика и натуральной оспы и/или чикунгуньи, вируса Зика и натуральной оспы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[002] Библиографические сведения о ссылках в рассматриваемом описании изобретения приведены в конце описания изобретения.
[003] Ссылка в настоящем описании изобретения на любую предыдущую публикацию (или информацию, полученную из нее) или на любой известный объект не является и не должна восприниматься как подтверждение или допущение или любая форма предложения о том, что эта предыдущая публикация (или информация, полученная из нее) или известный объект являются частью общих знаний в области деятельности, к которой относится это описание изобретения.
[004] Все публикации, упомянутые в этом описании изобретения, полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
[005] Семейство поксвирусов включает два подсемейства, Chordopoxvirinae и Entomopoxvirinae. Chordopoxvirinae включает восемь родов, включая Orthopoxviridae, к которым относятся виды, которые инфицируют человека (например, вирус вариолы, возбудитель натуральной оспы, вирус коровьей оспы (из которого сформирована оригинальная противооспенная вакцина, о которой сообщил Дженнер в 1796 г.), вирус осповакцины (используемый в качестве противооспенной вакцины второго поколения) и вирус оспы обезьян), и вирусы Avipoxviridae, к которым относятся виды, которые инфицируют птиц, такие как вирусы оспы птиц и оспы канареек. Помимо их использования в качестве антигенов в противооспенных вакцинах, очень интересно использование рекомбинантных вирусов на основе вируса осповакцины и авипоксвирусов в качестве "базовых" векторов. Как внутрицитоплазматические векторы Orthopoxviridae могут, помимо прочего, доставлять чужеродные антигены в цитоплазму хозяина и пути процессирования антигена, в которых происходит процессирование антигенов в пептиды для презентации на клеточной поверхности. Такие векторы, экспрессирующие чужеродные антигены, используют при разработке вакцин для таких заболеваний, как СПИД, туберкулез, малярия и рак, которые трудно поддаются лечению с помощью других стратегий вакцинации.
[006] Chordopoxvirinae имеют линейные двухцепочечные ДНК-геномы с размерами в диапазоне от 130 п.о. у парапоксвирусов до более 300 п.о. у авипоксвирусов, и их жизненный цикл в хозяине проходит полностью в цитоплазме клетки-хозяина. Поксвирусы работают по существу независимо от их клетки-хозяина и молекул клетки-хозяина, особенно что касается процессов раннего синтеза мРНК. Однако оказывается, что молекулы хозяина используются для инициирования или прекращения средней и поздней вирусной транскрипции. Поксвирусы продуцируют структурно разнообразные "факторы круга хозяев", которые специфически воздействуют и управляют сигнальными путями хозяина для обеспечения клеточных условий, делающих возможной вирусную репликацию. Большинство поксвирусов могут связываться с клетками млекопитающих и инфицировать их, но то, является или нет последующее инфицирование пермиссивным (способным продуцировать инфекционные вирионы) или не пермиссивным (по существу неспособным продуцировать инфекционные вирионы), зависит от конкретного поксвируса и конкретного типа клеток. В настоящее время существует относительно слабое понимание взаимодействий поксвирус-хозяин на молекулярном уровне, в частности генов круга хозяев, и того, какие факторы необходимы для модуляции взаимосвязи для облегчения как вирусного, так и клеточного размножения. Для обзора генов круга хозяев можно сослаться на документ Werden et al. 2008, полностью включенный в настоящее описание.
[007] Наблюдения за штаммами вируса осповакцины в отношении их применения в качестве противооспенных вакцин, а затем и в качестве вирусных векторов, публиковались с начала 1960-х годов до настоящего времени. Некоторые штаммы вируса осповакцины, включая штаммы, используемые в качестве противооспенных вакцин, способны размножаться в человеческих клетках и поэтому представляют риски для здоровья, такие как развитие вирусного энцефалита. С целью разработки более безопасной вакцины штамм вируса осповакцины из Анкары (называемый "CVA") пассировали более 500 раз в нечеловеческих клетках. Во время этого процесса происходит существенное изменение генома вируса осповакцины, включая возникновение по меньшей мере шести значительных делеций по сравнению с исходным геномом CVA. Модифицированный вирус является менее патогенным для человека, но все же способен вызывать защитный иммунный ответ. Этот аттенуированный вирус осповакцины называется MVA (модифицированный вирус осповакцины Анкара) и также классифицируется по количеству пассажей, поскольку оказалось, что вирусы с различными количествами пассажей генетически и фенотипически отличаются. Однако было признано, что MVA515 с количеством пассажей 515 является генетически стабильным. В начале 1990-х годов обнаружили, что штаммы MVA, такие как MVA572 и его производное MVA F6, способны экспрессировать белки вируса осповакцины и гетерологичные (рекомбинантные) белки на высоком уровне в непермиссивных клетках (в которых вирус не размножается), что обеспечивает разработку MVA в качестве вектора для представляющих интерес гетерологичных молекул, таких как кодирующие антигены для доставки вакцин или препаратов.
[008] Недавно были предприняты попытки создания модифицированного вируса осповакцины с качествами MVA путем введения шести известных больших делеций MVA в CVA. Интересно, что это не привело к вирусу с аттенуированными качествами MVA. Было высказано предположение, что причиной наблюдаемой аттенуации может быть отсутствие генов круга хозяев, однако это не было подтверждено (смотри, например, Meyer et al., Journal of General Virology (1991) 72:1031-1038).
[009] Поксвирусы образуют большое семейство вирусов, отличающихся большим линейным дцДНК-геномом, цитоплазматическим местом размножения и сложной морфологией вириона. Вирус осповакцины является типичным вирусом этой группы вирусов и наиболее изученным в отношении вирусного морфогенеза. Вирионы вируса осповакцины выглядят как имеющие форму "бруска" или "яйца" мембрано-связанные частицы со сложной внутренней структурой с имеющим оболочку двояковогнутым кором, окаймленным "боковыми телами". Путь сборки вирионов включает производство мембраны, содержащей полумесяцы, которые развиваются в незрелые вирионы (IV), а затем эволюционируют в зрелые вирионы (MV). В вирионе вируса осповакцины содержится более 70 специфических генных продуктов, причем в настоящее время описано влияние мутаций на сборку вируса осповакцины в более чем 50 специфических генах.
[0010] Вирус осповакцины проникает в клетки путем слияния своих поверхностных мембран с плазматической мембраной клетки-хозяина, высвобождая кор (и боковые тела) в цитоплазму и активируя транскрипционную программу вируса. Коры вирионов содержат полный комплемент кодируемых вирусом ферментов, требующихся для синтеза и модификации ранней мРНК. Ранние гены кодируют ферменты, требующиеся для размножения ДНК, и поэтому при достижения пика экспрессии ранних генов в цитоплазматических сайтах, называемых "фабриками", происходит размножение вирусной ДНК. Ранние гены также кодируют средние факторы транскрипции, а средние гены в свою очередь кодируют поздние факторы транскрипции, так что средние и поздние гены экспрессируются последовательно, обязательно после начала размножения вирусной ДНК. Таким образом, полный комплемент вирусных генов транскрибируется во временном каскаде, причем ранние, средние и поздние классы различаются по класс-специфическим транскрипционным промоторам и кодируемым вирусом факторам транскрипции. Кроме того, только размноженные геномы являются компетентными матрицами для средней и поздней транскрипции. Эти два класса генов вместе кодируют структурные белки вирионов, ферменты вирионов и факторы сборки и необходимы для сборки новых дочерних вирусных частиц.
[0011] Вскоре после захвата и ранней экспрессии вируса внутри клетки образуются специфические для инфекции цитоплазматические домены, которые имеют однородную плотность и иногда окружены цистернами, происходящими из эндоплазматического ретикулума (ER), размер которых увеличивается со временем. Эти домены представляют участки размножения вирусной ДНК и часто называются "вирусными фабриками".
[0012] Вирусная сборка начинается с формирования жестких структур в виде полумесяцев (куполов в трех измерениях) внутри вирусных фабрик. На электронно-микроскопических снимках высокого разрешения внешний слой этих структур в виде полумесяцев состоит из регулярно расположенных выступов, называемых "спикулами". Полумесяцы заметно растут в длину, сохраняя ту же кривизну, пока не станут замкнутыми кругами (сферами в трех измерениях), называемыми незрелыми вирионами (IV). IV заполнены материалом "вироплазмой", который является однородным по плотности, но заметно более электронноплотным, чем окружающая фабрика. По мере формирования IV также происходит захват инкапсидированной ДНК: его видно на электронно-микроскопических снимках как электронноплотный круглый или яйцевидный субдомен внутри IV, называемый "нуклеоидом". IV, которые содержат нуклеоиды конденсированной ДНК, часто называют "IVN". Для морфогенеза IVN до зрелых вирионов (MV) требуется созревание нескольких предшественников вирионных белков посредством протеолитического расщепления. Большинство зрелых вирионов находятся за пределами фабрик и могут существовать в кластерах или на периферии фабрики, или явно отдельно, на значительном расстоянии от ближайшей фабрики.
[0013] Вирионы поксвирусов существуют в трех инфекционных формах: зрелые вирионы (MV), вирионы в оболочке (WV) и внеклеточные вирионы (EV). MV, простейшая форма вируса, представляют собой покрытые мембраной частицы, содержащие двояковогнутый ДНК-содержащий кор, окаймленный боковыми телами, которые заполняют вогнутости кора. MV обычно обнаруживаются исключительно внутри клеток и высвобождаются только путем лизиса клеток. WV состоят из MV, которые окружены двумя дополнительными липидными бислоями, происходящими из цистерн транс-Гольджи. WV, чьи наружные мембраны содержат характерные вирусные белки, являются предшественниками EV и также находятся внутри клетки. EV состоят из WV, которые подверглись экзоцитозу путем слияния самой внешней мембраны WV с плазматической мембраной, из-за чего MV оказываются завернуты в одну дополнительную мембрану. Фракция EV оказывается прикреплена к клеточной поверхности, тогда как ее часть свободно находится в внеклеточной среде. Считается, что EV важны для распространения вируса в организме.
[0014] Чикунгунья представляет собой инфекцию, вызываемую вирусом чикунгуньи. Она характеризуется внезапной лихорадкой, обычно продолжающейся от двух до семи дней и болями в суставах, обычно продолжающимися неделями или месяцами, а иногда годами. Смертность составляет чуть менее 1 на 1000, при этом чаще всего умирают пожилые люди.
[0015] Вирус передается человеку комарами. К резервуарным животным относятся обезьяны, птицы, крупный рогатый скот и грызуны. Этим от отличается от денге, для которого хозяевами являются только приматы.
[0016] Наилучшим средством профилактики является общий контроль численности комаров и предотвращение укусов комаров в странах, где распространено это заболевание. Однако вакцина, которая обеспечила бы защиту от этого заболевания, была бы очень желательна.
[0017] Вирус Зика (ZIKV) является членом рода Flavivurus семейства Flaviviridae и представляет собой положительный одноцепочечный РНК-вирус с плюс-цепью, который передается главным образом комаром Aedes aegypti, который также переносит вирусы денге и чикунгуньи. В меньшей степени вирус Зика может также распространять Aedes albopictus, распространение которого простирается далеко в зоны умеренного климата.
[0018] Вирус Зика был впервые обнаружен у обезьян в лесу Зика в Уганде в 1947 году, и до недавнего времени этот вирус представлял только научный интерес. По-видимому, около 80% инфицированных не проявляют никаких симптомов, а у остальных наблюдается не более чем легкое заболевание, которое проходит в течение нескольких дней. Первоначально проявлявшийся только небольшими вспышками в Африке и Азии, этот вирус распространился в Тихом океане в 2007 году на остров Яп в Микронезии. В 2013 году вспышка во Французской Полинезии вызвала 28000 заражений. Считается, что нынешняя вспышка в Америке происходит из Полинезии. Вирус, возможно, был завезен в Бразилию во время чемпионата мира FIFA 2014 года или гонки на каноэ, в которой участвовали полинезийские спортсмены. С тех пор этот вирус распространился по нескольким латиноамериканским странам, включая Колумбию, Мексику, Парагвай и Венесуэлу.
[0019] До сих пор были описаны две генетические линии ZIKV, африканская и азиатская. Штаммы, выделенные из образцов в Бразилии в период между 2015 и 2016 годами, напоминали азиатские штаммы, в частности штамм из Французской Полинезии [[Baronti et al., 2014, Complete coding sequence of Zika virus from a French Polynesia outbreak in 2013. Genome Announc 2: e00500-e00514; Brasil et al., 2016, Zika virus outbreak in Rio de Janeiro, Brazil: Clinical characterization, epidemiological and virological aspects. PLoS Negl Trop Dis 10:e0004636; Faria et al., 2016, Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science 352:345-349; Giovanetti et al., 2016, Zika virus complete genome from Salvador, Bahia, Brazil. Infect Genet Evol.].
[0020] Эталонный штамм ZIKV африканской линии MR766 отличается от азиатской линии тем, что в нем удален консервативный сайт гликозилирования в ASN 153/154 белка оболочки (смотри фиг. 3 в документе Sirohi et al 2016, The 3.8 Å resolution cryo-EM structure of Zika virus. Science, 352 (6284): 467-70), что приводит к негликозилированию белка E в штамме MR766. Такое отсутствие гликозилирования, по-видимому, не влияет на инфекционность вируса Зика, но может играть роль в вирулентности и может быть причиной того, что азиатские штаммы кажутся более вирулентными, чем MR766, однако на сегодняшний день это не доказано.
[0021] При разработке вакцин на основе SCV антигенные последовательности для этих вакцин получали на основе азиатской линии. В качестве вакцинного антигена вакцины использовали последовательность полипротеина PrME (prMembrane и оболочка).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0022] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что при использовании аттенуированного поксвируса, который сконструирован таким образом, что его геном содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую субгеномный полипротеин 26S вируса чикунгуньи и/или PrME вируса Зика, может быть получена композиция, которая снижает риск инфицирования чикунгуньей и натуральной оспой, инфицирования вирусом Зика и натуральной оспой и/или инфицирования чикунгуньей, вирусом Зика и натуральной оспой.
[0023] Соответственно, в первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции для повышения иммунного ответа у животного, которая снижает риск инфицирования чикунгуньей и натуральной оспой, причем данная композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и аттенуированный поксвирус, причем геном поксвируса содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую субгеномный полипротеин 26S вируса чикунгуньи.
[0024] Во втором аспекте настоящее изобретение относится к композиции для повышения иммунного ответа у животного, которая снижает риск инфицирования вирусом Зика и инфицирования натуральной оспой, причем данная композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и аттенуированный поксвирус, причем геном поксвируса содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипротеин PrME вируса Зика.
[0025] В третьем аспекте настоящее изобретение относится к композиции для повышения иммунного ответа у животного, которая снижает риск инфицирования чикунгуньей, вирусом Зика и натуральной оспой, причем данная композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и аттенуированный поксвирус, причем геном поксвируса содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую субгеномный полипротеин 26S вируса чикунгуньи, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипротеин PrME вируса Зика.
[0026] В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к способу индуцирования у пациента защитного иммунного ответа на инфицирование чикунгуньей и натуральной оспой, натуральной оспой и вирусом Зика и/или инфицирование чикунгуньей, натуральной оспой и вирусом Зика, включающему введение пациенту композиции в соответствии с первым, вторым или третьим аспектами настоящего изобретения.
[0027] В пятом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции в соответствии с первым, вторым или третьим аспектами настоящего изобретения в получении лекарственного средства для индуцирования у пациента защитного иммунного ответа на инфицирование чикунгуньей и натуральной оспой, натуральной оспой и вирусом Зика и/или инфицирование чикунгуньей, натуральной оспой и вирусом Зика.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0028] Фигура 1. Кассета гомологичной рекомбинации SCV301A.
[0029] Фигура 2. Мишени F1 и F2 для гомологичной рекомбинации в геноме VACV-COP.
[0030] Фигура 3. Сайт вставки CHIKV-26S в SCV301A.
[0031] Фигура 4. Удаление Ecogpt и EGFP с помощью гомологичной рекомбинации.
[0032] Фигура 5. Плазмидные карты pTC29.
[0033] Фигура 6. HR-кассета делеции.
[0034] Фигура 7. HR-кассета делеции B7R-B8R.
[0035] Фигура 8. Способ действия гомологичной рекомбинации с трансдоминантной селекцией.
[0036] Фигура 9. HR-кассета ZIKR.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0037] Рассматриваемое изобретение не ограничено конкретными процедурами или средствами, конкретными композициями средств и различными медицинскими методологиями, так как они могут изменяться. Терминология, используемая в настоящем описании, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют значения, хорошо понятные специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение.
[0038] Все материалы и способы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем описании, можно использовать для осуществления на практике или тестирования настоящего изобретения. Практикующим врачам следует конкретно рассмотреть Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, N.Y.; Ausubel et al. (1999) Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York; Murphy et al. (1995) Virus Taxonomy Springer Verlag:79-87, Mahy Brian WJ and Kangro O Hillar (Eds): Virology Methods Manual 1996, Academic Press; Davison AJ and Elliott RM (Eds): Molecular Virology, A practical Approach 1993, IRL Press at Oxford University Press; Perkus et al., Virology (1990) 179(1):276-86 или определения и термины данной области техники и другие способы, известные специалисту в данной области техники.
[0039] Хотя для осуществления на практике или тестирования настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем описании, описаны предпочтительные способы и материалы. Для целей настоящего изобретения следующие термины определены ниже.
[0040] Во всем тексте описания, если контекст не требует иного, слова "содержать", "содержит" и "содержащий" следует понимать как подразумевающие включение указанного этапа или элемента или группы этапов или элементов, но не исключение какого-либо другого этапа или элемента или группы этапов или элементов. Таким образом, использование термина "содержащий" и т.п. указывает на то, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными, но другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не присутствовать. В контексте аттенуированных ортопоксвирусных векторов данные векторы модифицированы для аттенуации благодаря тому, что они содержат делецию незаменимого гена созревания или сборки, но также включены и дополнительные модификации, например направленные на антиген или другой белок.
[0041] "Состоит из" обозначает включает и ограничен тем, что следует за оборотом "состоит из". Таким образом, оборот "состоит из" указывает на то, что перечисленные элементы необходимы или обязательны, и что не могут присутствовать никакие другие элементы. "Состоит по существу из" обозначает включает любые элементы, перечисленные после данного оборота, и ограничен другими элементами, которые не препятствуют или не вносят вклад в активность или действие, указанные в раскрытии для перечисленных элементов. Таким образом, оборот "состоит по существу из" указывает на то, что перечисленные элементы необходимы или обязательны, но другие элементы необязательны и могут присутствовать или не присутствовать в зависимости от того, влияют ли они на активность или действие перечисленных элементов.
[0042] В рамках изобретения формы единственного числа включают множественное число, если контекст прямо не требует обратного. Таким образом, например, ссылка на "клетку" включает одну клетку, а также две или более клетки; ссылка на "организм" включает один организм, а также два или более организма; и т.д. В некоторых вариантах осуществления единственное число обозначает "один или больше один".
[0043] В рамках изобретения "и/или" относится и охватывает любые возможные комбинации одного или нескольких соответствующих перечисленных элементов, а также отсутствие комбинаций при альтернативной интерпретации (или).
[0044] "Аттенуация" или "аттенуированный", в рамках изобретения, обозначает снижение вирулентности вирусного вектора. Вирулентность определяется как способность вируса вызывать заболевание у конкретного хозяина. Поксвирусный вектор, который не способен продуцировать инфекционные вирусы, может первоначально инфицировать клетки, но по существу не способен полностью реплицироваться или размножаться в хозяине или вызывать состояние. Это желательно, поскольку вектор доставляет свой белок или нуклеиновую кислоту в цитоплазму клетки-хозяина, но не наносит вреда пациенту.
[0045] "Контрольный элемент" или "контрольная последовательность" означают последовательности нуклеиновой кислоты (например, ДНК), необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном поксвирусе, векторе, плазмиде или клетке. Контрольные последовательности, которые подходят для эукариотических клеток, включают последовательности контроля транскрипции, такие как промоторы, сигналы полиаденилирования, энхансеры транскрипции, последовательности контроля трансляции, такие как энхансеры трансляции и внутренние сайты связывания рибосом (IRES), последовательности нуклеиновой кислоты, которые модулируют стабильность мРНК, а также направляющие последовательности, которые направляют продукт, кодируемый транскрибируемым полинуклеотидом, во внутриклеточный компартмент внутри клетки или во внеклеточную среду.
[0046] Там, где приводятся последовательности, включены соответствующие последовательности. "Соответствует", "соответствуя" или "соответствующий" означают последовательность нуклеиновой кислоты, которая демонстрирует существенную идентичность последовательности с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты (например, идентичность последовательности со всей или части эталонной последовательности нуклеиновой кислоты по меньшей мере приблизительно 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или даже вплоть до 100%), или аминокислотную последовательность, которая демонстрирует существенные сходство или идентичность последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью (например, сходство или идентичность последовательности со всей или частью эталонной аминокислотной последовательности по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или даже вплоть до 100%).
[0047] "Эффективное количество" в контексте лечения или профилактики некоторого состояния или для модулирования иммунного ответа на целевой антиген или организм обозначает введение количества средства (например, аттенуированного ортопоксвирусного вектора, как описано в настоящем описании) или содержащей его композиции нуждающемуся в таком лечении или профилактике индивидууму, или в виде одной дозы, или как части серии, которое эффективно для предупреждения возникновения симптома, контроля таких симптомов и/или лечения существующих симптомов этого состояния или для модулирования иммунного ответа на целевой антиген или организм. Эффективное количество будет варьироваться в зависимости от состояния здоровья и физического состояния подлежащего лечению индивидуума, таксономической группы подлежащего лечению индивидуума, состава композиции, оценки медицинской ситуации и других соответствующих факторов. Ожидается, что данное количество будет попадать в относительно широкий диапазон, который может быть определен с помощью рутинных испытаний.
[0048] В рамках изобретения, термины "кодируют", "кодирующий" и т.п. относятся к способности нуклеиновой кислоты предоставлять другую нуклеиновую кислоту или полипептид. Например, говорят, что последовательность нуклеиновой кислоты "кодирует" полипептид, если она может быть транскрибирована и/или транслирована с получением этого полипептида, или если она может быть процессирована в форму, которая может быть транскрибирована и/или транслирована с получением этого полипептида. Такая последовательность нуклеиновой кислоты может включать в себя кодирующую последовательность или как кодирующую последовательность, так и некодирующую последовательность. Таким образом, термины "кодируют", "кодирующий" и т.п. включают РНК-продукт, получаемый в результате транскрипции молекулы ДНК, белок, получаемый в результате трансляции молекулы РНК, белок, получаемый в результате транскрипции молекулы ДНК с образованием РНК-продукта и последующей трансляции РНК-продукта, или белок, получаемый в результате транскрипции молекулы ДНК с получением РНК-продукта, процессирования РНК-продукта с получением процессированного РНК-продукта (например, мРНК) и последующей трансляции процессированного РНК-продукта.
[0049] Термин "эндогенный" относится к гену или последовательности нуклеиновой кислоты или сегменту, которые обычно можно обнаружить в организме-хозяине.
[0050] Термины "экспрессируемый", "экспрессированный" и их варианты относятся к способности клетки транскрибировать нуклеотидную последовательность в РНК и, необязательно, транслировать мРНК для синтеза пептида или полипептида, которые обеспечивают биологическую или биохимическую функцию.
[0051] В рамках изобретения, термин "ген" включает молекулу нуклеиновой кислоты, которую можно использовать для получения мРНК, необязательно при добавлении элементов, способствующих этому процессу. Гены могут быть или не быть использованы для получения функционального белка. Гены могут включать в себя как кодирующие, так и некодирующие области (например, интроны, регуляторные элементы, промоторы, энхансеры, последовательности терминации и 5' и 3'-нетранслируемые области).
[0052] Термины "гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты", "гетерологичная нуклеотидная последовательность", "гетерологичный полинуклеотид", "чужеродный полинуклеотид", "экзогенный полинуклеотид" и т.п. используют взаимозаменяемо для обозначения любой нуклеиновой кислоты (например, нуклеотидной последовательности, содержащей IRES), которую вводят в геном организма с помощью экспериментальных манипуляций, и которая может включать в себя генные последовательности, обнаруживаемые в этом организме, при условии, что введенный ген содержит некоторую модификацию (например, точечную мутацию, делецию, замену или добавление по меньшей мере одного нуклеотида, наличие сайта расщепления эндонуклеазой, наличие сайта loxP и т.д.) по сравнению с вирусной геномной последовательностью до модификации.
[0053] Термины "гетерологичный полипептид", "чужеродный полипептид" и "экзогенный полипептид" используют взаимозаменяемо для обозначения любого пептида или полипептида, который кодируется "гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты", "гетерологичной нуклеотидной последовательностью", "гетерологичным полинуклеотидом", "чужеродным полинуклеотидом" и "экзогенным полинуклеотидом", как определено выше.
[0054] Термин "защитный иммунный ответ" обозначает иммунный ответ, который предотвращает или снижает риск или тяжесть инфицирования чикунгуньей и/или натуральной оспой.
[0055] Поксвирусный вектор согласно настоящему изобретению, предпочтительно, размножается в клетке млекопитающего. Подробности о клетках млекопитающих, которые можно использовать в настоящем изобретении, представлены в документе PCT/AU2014/050330, раскрытие которого включено в настоящее описаниее посредством перекрестной ссылки.
[0056] В некоторых вариантах осуществления клетка млекопитающего представляет собой клетку человека, клетку примата, клетку хомяка или клетку кролика.
[0057] Клетки могут быть одноклеточными или могут быть выращены в тканевой культуре в виде жидких культур, монослоев и т.п. Клетки-хозяева также могут быть получены непосредственно или опосредованно из тканей или могут существовать в организме, включая животных.
[0058] Следует понимать, что "индуцирование" иммунного ответа, как рассматривается в настоящем описании, включает вызывание или стимуляцию иммунного ответа и/или усиление уже существующего иммунного ответа.
[0059] Термин "функционально соединенный" или "функционально связанный", в рамках изобретения, относится к сопоставлению, в котором компоненты, описанные таким образом, находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать надлежащим образом. Например, контрольная последовательность транскрипции, "функционально связанная" с кодирующей последовательностью, относится к позиционированию и/или ориентации контрольной последовательности транскрипции по отношению к кодирующей последовательности для обеспечения экспрессии кодирующей последовательности в условиях, совместимых с контрольной последовательностью транскрипции. В другом примере, IRES, функционально соединенный с кодирующей последовательностью ортопоксвируса, относится к позиционированию и/или ориентации IRES по отношению к кодирующей последовательности ортопоксвируса для обеспечения кэп-независимой трансляции кодирующей последовательности ортопоксвируса.
[0060] В рамках изобретения, термины "открытая рамка считывания" и "ORF" используют взаимозаменяемо для обозначения аминокислотной последовательности, кодируемой между кодонами инициации и терминации трансляции кодирующей последовательности. Термины "инициирующий кодон" (например, ATG) и "терминирующий кодон" (например, TGA, TAA, TAG) относятся к блоку из трех смежных нуклеотидов ("кодону") в кодирующей последовательности, который определяет инициацию и терминацию цепи, соответственно, при синтезе белка (трансляция мРНК).
[0061] Термины "полинуклеотид", "полинуклеотидная последовательность", "нуклеотидная последовательность", "нуклеиновая кислота" или "последовательность нуклеиновой кислоты", в рамках изобретения, обозначают мРНК, РНК, кРНК, кДНК или ДНК. Этот термин обычно относится к полимерной форме нуклеотидов длиной по меньшей мере 10 оснований, или рибонуклеотидов, или дезоксинуклеотидов, или модифицированной формы нуклеотидов любого типа. Термин включает одно- и двухцепочечные формы РНК или ДНК.
[0062] "Полипептид", "пептид", "белок" и "белковая молекула" используют взаимозаменяемо в настоящем описании для обозначения молекулы, содержащей или состоящей из полимера аминокислотных остатков, и ее вариантов и синтетических аналогов. Таким образом, эти термины применяются к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются синтетическими не встречающимися в природе аминокислотами, такими как химический аналог соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также к встречающимся в природе аминокислотным полимерам.
[0063] В рамках изобретения, термин "рекомбинантный" применительно к "молекулам нуклеиновой кислоты", "полинуклеотидам" и т.п. следует понимать как обозначающий искусственные структуры нуклеиновой кислоты (т.е. нереплицирующиеся кДНК или РНК; или репликоны, самореплицирующиеся кДНК или РНК), которые могут быть транскрибированы и/или транслированы в клетках-хозяевах или бесклеточных системах, описанных в настоящем описании. В вектор могут быть введены рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты или полинуклеотиды. Можно использовать невирусные векторы, такие как плазмидные векторы экспрессии, или вирусные векторы. Специалисту известны тип векторов и методика введения конструкций нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением. Молекула нуклеиновой кислоты или полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением не встречаются в природе в конфигурации, описанной в настоящем изобретении. Другими словами, гетерологичная нуклеотидная последовательность не объединяется в природе с элементами родительского вирусного генома (например, промотором, ORF, сигналом полиаденилирования, рибозимом).
[0064] В рамках изобретения, термин "рекомбинантный вирус" следует понимать как ссылку на "родительский вирус", содержащий по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты.
[0065] Термин "идентичность последовательностей", в рамках изобретения, относится к той степени, в которой последовательности идентичны по нуклеотидам или по аминокислотам в окне сравнения. Таким образом, "процентную величину идентичности последовательностей" рассчитывают путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей по окну сравнения, определения количества положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты (например, A, T, C, G, I) или идентичный аминокислотный остаток (например, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys и Met) встречается в обеих последовательностях, для получения количества совпадающих положений, деления количества совпадающих положений на общее количество положений в окне сравнения (т.е. на размер окна) и умножения результата на 100 для получения процентной величины идентичности последовательностей. Для целей настоящего изобретения под "идентичностью последовательностей" следует понимать "процентную величину совпадений", рассчитанную с помощью компьютерной программы DNASIS (версия 25 для Windows; доступна от Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, Калифорния, США) с использованием стандартных значений по умолчанию, используемых в справочном руководстве, прилагаемом к программному обеспечению.
[0066] Термины "сигнальная последовательность" или "сигнальный пептид" относятся к короткому (длиной от приблизительно 3 до приблизительно 60 аминокислот) пептиду, который направляет ко- или посттрансляционный транспорт белка из цитозоля к определенным органеллам, таким как, например, ядро, митохондриальный матрикс и эндоплазматический ретикулум. Для белков с нацеленными на ER сигнальными пептидами сигнальные пептиды обычно отщепляются от формы-предшественника сигнальной пептидазой после того, как белки транспортируются в ER, и полученные белки перемещаются по секреторному пути к их внутриклеточному (например, аппарат Гольджи, клеточная мембрана или клеточная стенка) или внеклеточному местоположению. "Нацеленные на ER сигнальные пептиды", в рамках изобретения, включают аминоконцевые гидрофобные последовательности, которые обычно ферментативно удаляются после введения части или всего белка через мембрану ER в просвет ER. Таким образом, в данной области техники известно, что сигнальная форма-предшественник последовательности может присутствовать как часть формы-предшественника белка, но обычно отсутствует в зрелой форме белка.
[0067] "Сходство" относится к процентному количеству аминокислот, которые являются идентичными или представляют собой консервативные замены, как определено в таблице A ниже. Сходство можно определять с помощью программ сравнения последовательностей, таких как GAP (Deveraux et al. 1984, Nucleic Acids Research, 12: 387-395). Таким образом, последовательности, аналогичные или существенно отличающиеся по длине от указанных в настоящем описании, можно сравнивать путем вставки в выравнивание промежутков, причем такие промежутки определяют, например, с помощью алгоритма сравнения, используемого GAP.
Таблица A: Примеры консервативных аминокислотных замен
| Исходный остаток | Примеры замен |
| Ala | Ser |
| Arg | Lys |
| Asn | Gln, His |
| Asp | Glu |
| Cys | Ser |
| Gln | Asn |
| Glu | Asp |
| Gly | Pro |
| His | Asn, Gln |
| Ile | Leu, Val |
| Leu | Ile, Val |
| Lys | Arg, Gln, Glu |
| Met | Leu, Ile, |
| Phe | Met, Leu, Tyr |
| Ser | Thr |
| Thr | Ser |
| Trp | Tyr |
| Tyr | Trp, Phe |
| Val | Ile, Leu |
[0068] Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения может быть проведено с помощью компьютерных реализаций алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package Release 70, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, США) или путем рассмотрения и наилучшего выравнивания (т.е. приводящего к наивысшей процентной гомологии в окне сравнения), генерируемого с помощью любого из различных выбранных способов. Можно также упомянуть семейство программ BLAST, раскрытое, например, в документе Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res.25:3389. Подробное обсуждение анализа последовательности можно найти в разделе 19.3 документа Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15.
[0069] Термины "пациент", "хозяин" или "индивидуум", используемые взаимозаменяемо в настоящем описании, относятся к любому пациенту, конкретно к пациенту-позвоночному, и даже более конкретно к пациенту-млекопитающему, для которого желательна терапия или профилактика. Подходящие позвоночные животные, которые подпадают под объем настоящего изобретения, включают, но без ограничения, всех членов подтипа Chordata, включая приматов (например, людей, мартышек и обезьян), и включают виды обезьян, например из рода Macaca (например, яванских макак, таких как Macaca fascicularis и/или макак-резус (Macaca mulatta)) и павиана (Papio ursinus), а также мармозеток (виды из рода Callithrix), беличьих обезьян (виды из рода Saimiri) и тамаринов (виды из рода Saguinus), а также такие виды обезьян, как шимпанзе (Pan troglodytes)), грызунов (например, мышей, крыс, морских свинок), зайцеобразных (например, кроликов, зайцев), бычьих (например, крупный рогатый скот), баранов (например, овец), козьих (например, коз), свиней (например, домашних свиней), лошадиных (например, лошадей), собачьих (например, собак), кошачьих (например, кошек), птиц (например, кур, индеек, уток, гусей, домашних птиц, таких как канарейки, волнистые попугайчики и т.д.), морских млекопитающих (например, дельфинов, китов), рептилий (змей, лягушек, ящериц и т.д.) и рыб. Предпочтительным пациентом является человек, нуждающийся в лечении или профилактике некоторого состояния. Однако следует понимать, что вышеупомянутые термины не подразумевают наличия симптомов.
[0070] Термин "трансген" используется в настоящем описании для описания генетического материала, который был или будет искусственно введен в геном организма-хозяина, и который передается потомству этого хозяина. В некоторых вариантах осуществления он придает желаемое свойство клетке млекопитающего или ортопоксвирусному вектору, в который он введен, или иным образом приводит к желаемому терапевтическому или диагностическому результату.
[0071] В рамках изобретения, термины "лечение", "лечить" и т.п. относятся к получению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим в смысле полного или частичного предотвращения заболевания или его симптома и/или может быть терапевтическим в смысле частичного или полного излечения от заболевания и/или неблагоприятного эффекта, связанного с заболеванием. "Лечение", в рамках изобретения, охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего, особенно у человека, и включает: (a) предотвращение возникновения заболевания у пациента, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого оно еще не было диагностировано; (b) ингибирование заболевания, т.е. прекращение его развития; и (c) облегчение заболевания, т.е. вызывание регресса заболевания.
[0072] Термины "дикого типа", "природный", "нативный" и т.п. по отношению к организму, полипептиду или последовательности нуклеиновой кислоты означают, что организм, полипептид или последовательность нуклеиновой кислоты встречаются в природе или доступны по меньшей мере в одном встречающемся в природе организме, который не был изменен, подвергнут мутации или иному воздействию человека.
[0073] Варианты включают молекулы нуклеиновой кислоты, в достаточной степени сходные с эталонной молекулой, или формы, комплементарные им полностью или частично, так что может быть достигнута селективная гибридизация в условиях умеренной или высокой жесткости, или те, которые имеют идентичность последовательности приблизительно от 60% до 90% или от 90 до 98% с нуклеотидными последовательностями, определяющими фактор круга хозяев эталонного поксвируса в окне сравнения, содержащем по меньшей мере приблизительно 15 нуклеотидов. Предпочтительно, длина области гибридизации составляет от приблизительно 12 до приблизительно 18 нуклеиновых оснований или больше. Предпочтительно, процентная идентичность между конкретной нуклеотидной последовательностью и эталонной последовательностью составляет по меньшей мере приблизительно 80% или 85%, или, более предпочтительно, сходство составляет приблизительно 90% или больше, например приблизительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше. Включены значения процентной идентичности между 80% и 100%. Длина нуклеотидной последовательности зависит от ее предполагаемой функции. Включены гомологи. Термины "гомолог" "гомологичные гены" или "гомологи" в широком смысле относятся к функционально и структурно родственным молекулам, в том числе из других видов. Гомологи и ортологи являются примерами вариантов.
[0074] Идентичность последовательностей нуклеиновой кислоты может быть определена следующим образом. Рассматриваемая последовательность нуклеиновой кислоты используется для поиска в базе данных последовательностей нуклеиновой кислоты, такой как база данных GenBank (доступная на веб-сайте http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/), с использованием программы BLASTM версии 21 (на основании документа Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402). Программа используется в режиме без промежутков. Для удаления гомологий последовательностей из-за областей низкой сложности используется фильтрация по умолчанию. Используются параметры BLASTM по умолчанию.
[0075] Идентичность аминокислотных последовательностей can может быть определена следующим образом. Рассматриваемая полипептидная последовательность используется для поиска в базе данных полипептидных последовательностей, такой как база данных GenBank (доступная на веб-сайте http://www.ncbi.nln.nih.gov/blast/), с использованием программы BLASTP. Программа используется в режиме без промежутков. Для удаления гомологий последовательностей из-за областей низкой сложности используется фильтрация по умолчанию. Используются параметры BLASTP. Фильтрация для последовательностей низкой сложности может использовать программу SEG.
[0076] Предпочтительные последовательности будут гибридизоваться в жестких условиях с эталонной последовательностью или ее комплементом. Термин "гибридизоваться в жестких условиях" и его грамматические эквиваленты относятся к способности молекулы нуклеиновой кислоты гибридизоваться с целевой молекулой нуклеиновой кислоты (такой как целевая молекула нуклеиновой кислоты, иммобилизованная на ДНК или РНК-блоте, таком как Саузерн-блот или нозерн-блот) при определенных условиях температуры и концентрации соли. Что касается молекул нуклеиновой кислоты, длина которых превышает приблизительно 100 оснований, типичными жесткими условиями гибридизации является температура не более чем на 25°C-30°C (например, 10°C) ниже температуры плавления (Tm) нативного дуплекса (смотри в общем Sambrook et al., (выше); Ausubel et al., (1999)). Tm для молекул нуклеиновой кислоты длиннее приблизительно 100 оснований может быть рассчитана по формуле Tm=81,5+0,41% (G+C-log(Na+)). Что касается молекул нуклеиновой кислоты, имеющих длину менее 100 оснований, типичными жесткими условиями гибридизации является температура на 5°C-10°C ниже Tm.
[0077] Термин "делеция" в настоящем контексте означает удаление всей или части кодирующей области целевого гена. Термин также охватывает все формы мутаций или трансформаций, которые уничтожают экспрессию целевого гена или уничтожают или по существу понижающе регулируют уровень или активность кодируемого белка.
[0078] Ссылка на "ген" включает ДНК, соответствующую экзонам или открытой рамке считывания гена. В настоящем описании также считается, что ссылка на "ген" включает: классический геномный ген, состоящий из последовательностей регуляции транскрипции и/или трансляции, и/или кодирующей области, и/или нетранслируемых последовательностей (т.е. интронов, 5'- и 3'- нетранслируемых последовательностей); или мРНК или кДНК, соответствующие кодирующим областям (т.е. экзонам) и 5'- и 3'- нетранслируемым последовательностям гена.
[0079] "Регуляторный элемент" или "регуляторная последовательность" означают последовательности нуклеиновой кислоты (например, ДНК), необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретной клетке-хозяине. Регуляторные последовательности, которые подходят для прокариотических клеток, например, включают в себя промотор и, необязательно, цис-действующую последовательность, такую как операторная последовательность и сайт связывания рибосомы. Контрольные последовательности, которые подходят для эукариотических клеток, включают в себя промоторы, сигналы полиаденилирования, энхансеры транскрипции, энхансеры трансляции, лидерные или хвостовые последовательности, которые модулируют стабильность мРНК, а также направляющие последовательности, которые направляют продукт, кодируемый транскрибируемым полинуклеотидом, во внутриклеточный компартмент внутри клетки или во внеклеточную среду.
[0080] Химерные конструкции, подходящие для создания модифицированных клеток млекопитающих настоящего изобретения, содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фактор круга хозяев ортопоксвируса, который функционально связан с регуляторной последовательностью. Регуляторная последовательность соответствующим образом содержит контрольные последовательности транскрипции и/или трансляции, которые совместимы с экспрессией в клетке. Как правило, регуляторные контрольные последовательности транскрипции и/или трансляции включают в себя, но без ограничения, последовательность промотора, 5'-некодирующую область, цис-регуляторную область, такую как функциональный сайт связывания для транскрипционного регуляторного белка или трансляционного регуляторного белка, вышележащую открытую рамку считывания, связывающие рибосомы последовательности, сайт начала транскрипции, сайт начала трансляции и/или нуклеотидную последовательность, которая кодирует лидерную последовательность, терминирующий кодон, сайт окончания трансляции и 3'-нетранслируемую область. Рассматриваются конститутивные или индуцируемые промоторы, известные в данной области техники. Промоторы могут представлять собой или встречающиеся в природе промоторы, или гибридные промоторы, которые объединяют элементы более чем одного промотора.
[0081] Рассматриваемые последовательности промоторов могут быть нативными для клеток млекопитающих или могут быть получены из альтернативного источника, если данная область является функциональной в выбранном организме. Выбор промотора будет отличаться в зависимости от предполагаемой клетки-хозяина. Например, промоторы, которые можно использовать для экспрессии в клетках млекопитающих, включают промотор металлотионеинов, который можно индуцировать в ответ на тяжелые металлы, такие как кадмий, промотор β-актина, а также вирусные промоторы, такие как промотор большого Т-антигена SV40, промотор немедленно-ранних (IE) генов цитомегаловируса человека (CMV), LTR-промотор вируса саркомы Рауса, LTR-промотор вируса опухоли молочной железы мышей, главный поздний промотор аденовируса (Ad MLP), промотор вируса простого герпеса и промотор HPV, в частности верхней регуляторной области (URR) HPV, и другие. Все эти промоторы хорошо описаны и легко доступны в данной области техники.
[0082] В настоящем описании для повышения уровней экспрессии конструкций млекопитающих могут быть также использованы энхансерные элементы. Примеры включают в себя энхансер раннего гена SV40, как описано, например, в документе Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761, энхансер/промотор из длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса, как описано, например, в документе Gorman et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777, и элементы из CMV человека, как описано, например, в документе Boshart et al. (1985) Cell 41:521, такие как элементы, включенные в последовательность интрона A CMV.
[0083] Химерная конструкция может также содержать 3'-нетранслируемую последовательность. 3'-нетранслируемая последовательность относится к части гена, содержащей сегмент ДНК, который содержит сигнал полиаденилирования и любые другие регуляторные сигналы, способные вызывать процессирование мРНК или экспрессию гена. Сигнал полиаденилирования характеризуется тем, что добавляет тракты полиадениловой кислоты к 3'-концу мРНК-предшественника. Сигналы полиаденилирования обычно распознаются по наличию гомологии с канонической формой 5'-AATAAA-3', хотя не редки варианты. 3'-нетранслируемая регуляторная последовательность ДНК, предпочтительно, включает приблизительно от 50 до 1000 нуклеотидов и может содержать последовательности терминации транскрипции и трансляции в дополнение к сигналу полиаденилирования и любым другим регуляторным сигналам, способным вызывать процессирование мРНК или экспрессию гена.
[0084] В некоторых вариантах осуществления химерная конструкция дополнительно содержит селективный маркерный ген, обеспечивающий отбор клеток, содержащих данную конструкцию. Селективные гены хорошо известны в данной области техники и совместимы с экспрессией в представляющей интерес клетке.
[0085] В одном варианте осуществления экспрессия структурного гена или гена сборки ортопоксвируса находится под контролем промотора. В одном неограничивающем варианте осуществления изобретения промотор представляет собой клеточный конститутивный промотор, такой как человеческий EF1-альфа (промотор гена фактора элонгации-1-альфа человека), DHFR (промотор гена дигидрофолатредуктазы) или PGK (промотор гена фосфоглицераткиназы), который направляет экспрессию достаточного уровня CP77 для поддержания размножения вируса в отсутствие значительного токсического воздействия на клетку-хозяина. Промоторы также могут быть индуцируемыми, такими как индуцируемый клеточный промотор, вирусные промоторы MTH (из гена металлотионеина) также используются в клетках млекопитающих, таких как CMV, RSV, SV-40 и MoU3.
[0086] Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей аттенуированный поксвирус, который может быть использован в качестве вакцины для индуцирования защиты от инфицирования вирусами чикунгуньи и натуральной оспы. Термины "аттенуация", "аттенуированный" и т.п., в рамках изобретения, означают снижение вирулентности вирусного вектора. Вирулентность обычно определяется как способность вируса вызывать заболевание у конкретного хозяина. Например, поксвирус, который не способен продуцировать инфекционные вирусы, может первоначально инфицировать клетки, но по существу не способен полностью реплицироваться или размножаться в хозяине или клетке-хозяине или вызывать заболевание или состояние. Это желательно, поскольку поксвирусный вектор может доставлять нуклеиновую кислоту хозяину или клетке-хозяину, но обычно не наносит вреда хозяину или клетке-хозяину.
[0087] Семейство поксвирусов включает два подсемейства, Chordopoxvirinae и Entomopoxvirinae. Chordopoxvirinae включает восемь родов, включая Orthopoxviridae, к которым относятся виды, которые инфицируют человека, тогда как Entomopoxvirinae инфицируют насекомых. Orthopoxviridae включает, например, вирус вариолы, который является возбудителем натуральной оспы, вирус коровьей оспы, из которого сформирована оригинальная противооспенная вакцина, о которой сообщил Дженнер в 1796 г., и вирус осповакцины, который используют в качестве противооспенной вакцины второго поколения. К вирусам Avipoxviridae относятся виды, которые инфицируют птиц, такие как вирусы оспы птиц и оспы канареек. Помимо их использования в качестве антигенов в противооспенных вакцинах, очень интересно использование рекомбинантных вирусов на основе вируса осповакцины и авипоксвирусов в качестве векторов для доставки и/или экспрессии представляющих интерес гетерологичных генов. Как внутрицитоплазматические векторы Orthopoxviridae могут доставлять чужеродные антигены в цитоплазму хозяина и пути процессирования антигена, в которых происходит процессирование антигенов в пептиды для презентации на клеточной поверхности. Такие векторы, экспрессирующие чужеродные антигены, подходят для применения в генной терапии и разработке вакцин для широкого диапазона состояний и заболеваний.
[0088] Поксвирусы образуют большое семейство вирусов, отличающихся большим линейным дцДНК-геномом, цитоплазматическим местом размножения и сложной морфологией вириона. Вирус осповакцины является типичным вирусом этой группы вирусов и одним из наиболее изученных в отношении вирусного морфогенеза. Вирионы вируса осповакцины выглядят как имеющие форму "бруска" или "яйца" мембрано-связанные частицы со сложной внутренней структурой с имеющим оболочку двояковогнутым кором, окаймленным "боковыми телами". Путь сборки вирионов включает производство мембраны, содержащей полумесяцы, которые развиваются в незрелые вирионы (IV), а затем эволюционируют в зрелые вирионы (MV). В вирионе вируса осповакцины содержится более 70 специфических генных продуктов, причем в настоящее время описано влияние мутаций на сборку вируса осповакцины в более чем 50 специфических генах.
[0089] Подходящие аттенуированные поксвирусы известны специалистам в данной области техники. Иллюстративные примеры включают аттенуированный модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA), NYVAC, авипоксвирус, вирус оспы канареек и вирус оспы птиц. Таким образом, в варианте осуществления, раскрытом в настоящем описании, аттенуированный поксвирус выбирают из группы, состоящей из модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), NYVAC, авипоксвируса, вируса оспы канареек и вируса оспы птиц. В варианте осуществления аттенуированный поксвирус представляет собой аттенуированный вирус осповакцины. Иллюстративные примеры штаммов вируса осповакцины включают Copenhagen (COP), Western Reserve (WR), Wyeth, ACAM2000, LC16m8 и Connaught Laboratories (CL).
[0090] Специалистам в данной области техники понятно, что другие штаммы ортопоксвирусов могут быть модифицированы для получения аттенуированного поксвируса. В иллюстративном примере аттенуированный поксвирус может быть получен путем модификации (например, делеции, замены или иного нарушения функции) гена из генома поксвируса, который кодирует эндогенный незаменимый белок сборки или созревания. Таким образом, в варианте осуществления, раскрытом в настоящем описании, аттенуированный поксвирус представляет собой модифицированный ортопоксвирус, причем модификация содержит делецию гена, кодирующего эндогенный незаменимый белок сборки или созревания.
[0091] В варианте осуществления аттенуированный поксвирус представляет собой модифицированный вирус осповакцины, причем модификация содержит делецию гена генома вируса осповакцины, кодирующего эндогенный белок сборки или созревания (или иначе нарушает его функцию), и причем модификация трансформирует вектор на основе вируса осповакцины, который размножается (или который может размножаться) в клетке-хозяине (например, человеческой клетке), в аттенуированный вектор на основе вируса осповакцины, который по существу не реплицируется в клетке-хозяине. В варианте осуществления незаменимый эндогенный ген сборки или созревания выбирают из группы, состоящей из COP-A25L, COP-A3L, COP-A4L, COP-A7L, COP-A8R, COP-A9L, COP-A10L, COP-A11R, COP-A12L, COP-A13L, COP-A14L, COP-A145L, COP-A15L, COP-A16L, COP-A17L, COP-A21L, COP-A22R, COP-A26L, COP-A27L, COP-A28L, COP-A30L, COP-A32L, COP-D2L, COP-D3R, COP-D6R, COP-D8L, COP-D13L, COP-E8R, COP-E10R, COP-E11L, COP-F10L, COP-F17R, COP-G1L, COP-G3L, COP-G4L, COP-G5R, COP-G7L, COP-G7L, COP-H1L, COP-H2R, COP-H3L, COP-H4L, COP-H5R, COP-H6R, COP-I1L, COP-I2L, COP-I6L, COP-I7L, COP-I8R, COP-J1R, COP-J4R, COP-J6R, COP-L1R, COP-L3L, COP-L4R и COP-L5R.
[0092] В предпочтительном варианте осуществления модификация содержит делецию гена D13L, и/или гена K1L, и/или гена A39R, и/или генов B7R-B8R.
[0093] В еще одном предпочтительном варианте осуществления модификация содержит делецию гена D13L, гена A39R и генов B7R-B8R.
[0094] В первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции для повышения иммунного ответа у животного, которая снижает риск инфицирования чикунгуньей и натуральной оспой, причем эта композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и аттенуированный поксвирус, причем геном поксвируса содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую субгеномный полипротеин 26S вируса чикунгуньи.
[0095] Во втором аспекте настоящее изобретение относится к композиции для повышения иммунного ответа у животного, которая снижает риск инфицирования вирусом Зика и инфицирования натуральной оспой, причем эта композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и аттенуированный поксвирус, причем геном поксвируса содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипротеин PrME вируса Зика.
[0096] В третьем аспекте настоящее изобретение относится к композиции для повышения иммунного ответа у животного, которая снижает риск инфицирования чикунгуньей, вирусом Зика и натуральной оспой, причем эта композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и аттенуированный поксвирус, причем геном поксвируса содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую субгеномный полипротеин 26S вируса чикунгуньи, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипротеин PrME вируса Зика.
[0097] В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к способу индуцирования у пациента защитного иммунного ответа на инфицирование чикунгуньей и натуральной оспой, натуральной оспой и вирусом Зика и/или инфицирование чикунгуньей, натуральной оспой и вирусом Зика, включающему введение пациенту композиции в соответствии с первым, вторым или третьим аспектами настоящего изобретения.
[0098] В пятом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции в соответствии с первым, вторым или третьим аспектами настоящего изобретения в получении лекарственного средства для индуцирования у пациента защитного иммунного ответа на инфицирование чикунгуньей и натуральной оспой, натуральной оспой и вирусом Зика и/или инфицирование чикунгуньей, натуральной оспой и вирусом Зика.
[0099] В предпочтительных формах настоящего изобретения аттенуированный поксвирус выбирают из группы, состоящей из вируса осповакцины, вируса коровьей оспы, модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), NYVAC, авипоксвируса, вируса оспы канареек и вируса оспы птиц. Предпочтительно, чтобы аттенуированный поксвирус представлял собой модифицированный ортопоксвирус, причем модификация содержит делецию гена, кодирующего эндогенный незаменимый белок сборки или созревания. Также предпочтительно, чтобы модификация содержала делецию гена D13L и, предпочтительно, дополнительно содержала делецию гена K1L.
[0100] В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель содержит адъювант. Предпочтительно, чтобы адъювант был выбран из группы, состоящей из гидроксида алюминия, фосфата алюминия, сульфата алюминия-калия, гидроксида-фосфата кальция, полного адъюванта Фрейнда, Montanide®, неполного адъюванта Фрейнда, искомов, матрицы иском, адъюванта ISCOMATRIX™, адъюванта Matrix M™, адъюванта Matrix C™, адъюванта Matrix Q™, адъюванта AbISCO®-100, адъюванта AbISCO®-300, ISCOPREP™, производного ISCOPREP™, адъюванта, содержащего ISCOPREP™ или производное ISCOPREP™, QS-21, производного QS-21 и адъюванта, содержащего QS-21 или производное QS21.
[0101] Различные варианты осуществления, возможные в настоящем описании, далее описаны с помощью следующих неограничивающих примеров.
ПРИМЕР 1
Краткое изложение стратегий конструирования
[0102] Три вируса SCV были сконструированы до конструирования SCV1002, одновекторной вакцины от CHIK/ZIKA. SCV301C конструировали путем замены ORF A39R штамма Copenhagen вируса осповакцины на кассету экспрессии CHIKV-26S вместе с кассетами экспрессии EGFP и Ecogpt. SCV302 создавали путем удаления кассет EGFP и Ecogpt из SCV301C. Затем SCV305, вакцину от SCV-CHIK, создавали путем удаления ORF B7R-B8R и ORF D13L из SCV302. Наконец, SCV1002, вакцину от SCV-CHIK/ZIKA, создавали путем замены ORF B7R-B8R SCV302 на кассету экспрессии ZIKV-prME и удаления ORF D13L.
Конструирование SCV301C (VACV-CHIK)
Описание
[0103] Кассета экспрессии вакцинного антигена чикунгуньи в SCV301C (CHIKV-26S) состоит из следующих элементов в линейном расположении:
- ранний/поздний промотор вируса осповакцины,
- кодирующая белок CHIKV последовательность для субгеномного полипротеина 26S вирулентного реюньонского штамма 06_21 поксвируса
- и последовательность ранней остановки транскрипции поксвируса.
[0104] Субгеномный полипротеин 26S CHIKV при экспрессии процессируется в отдельные структурные гены, необходимые для формирования вирусных частиц. Поскольку весь геном CHIKV отсутствует, и субгеномная РНК не будет содержать 5'-НТО и 3'-НТО, транскрибируемая вирусная РНК будет упакована во вновь образованные вирусные частицы - по сути, экспрессия только субгеномного полипротеина 26S приведет к вирусоподобным частицам (VLP), лишенным вирусной геномной РНК. Экспрессия in vivo субгеномного полипротеина, приводящего к образованию VLP после вакцинации, будет благоприятной для нейтрализации стимуляции антител - ключевой коррелят иммунитета для профилактической вакцинации от CHIKV.
[0105] Аминокислотную последовательность субгеномного полипротеина 26S в кассете экспрессии CHIKV-26S брали из вирулентного реюньонского штамма, который был генетически изменен для расширения его круга хозяев для нового комариного вектора (Genbank, номер доступа: AM258992). Во время эпидемии в Реюньоне между 2005 и 2006 годами вирус мутировал с расширением круга хозяев его вектора до азиатского тигрового комара (Aedes albopictus). Азиатский тигровый комар является самым быстро распространяющимся комаром в мире. Чрезвычайно хорошо приспособлен для жизни среди людей и известен путешествиями в использованных шинах. Его находят в сельских и зеленых городских районах почти во всем мире, и он агрессивно кусает днем людей, домашних и диких животных и птиц. Этот комар обладает потенциалом распространения чикунгуньи по всему миру. Итоговую конструкцию нуклеотидной последовательности кодирующей последовательности белка CHIKV-26S подвергали скринингу в отношении раннего транскрипционного мотива поксвируса "TTTTTNT" - ничего не было найдено. Добавили последовательность ранней остановки транскрипции поксвируса TTTTTAT непосредственно после стоп-кодона. Последовательность кассеты экспрессии CHIKV-26S, описанная выше, приведена в SEQ ID NO:1.
[0106] Для создания SCV301C в GeneArt GmbH синтезировали кассету гомологичной рекомбинации, которая состояла из кассеты экспрессии CHIKV-26S, кассеты экспрессии усиленного зеленого флуоресцентного белка, кассеты экспрессии Ecogpt, причем все они фланкированы левым и правым плечами гомологичной рекомбинации, которые нацелены на вышележащую и нижележащую последовательности ORF A39R VACV-COP для гомологичной рекомбинации, как показано на фигурах 1 и 2 ниже. В таблице 1 приведены элементы кассеты гомологичной рекомбинации SCV301A, а последовательность подробно приведена в SEQ ID NO:2.
Таблица 1: Таблица элементов кассеты гомологичной рекомбинации SCV301C
| Элемент | Описание | Размер |
| Плечо A39R-F1 | Плечо 1 гомологичной рекомбинации, нацеленное выше ORF A39R | 501 п.о. |
| prPs | Ранний/поздний промотор вируса осповакцины | 44 п.о. |
| EGFP | Кодирующая белок последовательность усиленного зеленого флуоресцентного белка | 720 п.о. |
| T5NT | Последовательность ранней остановки транскрипции вируса осповакцины | 7 п.о. |
| prPs | Ранний/поздний промотор вируса осповакцины | 44 п.о. |
| Ecogpt | Кодирующая последовательность белка гуанинфосфорибозилтрансферазы E. coli | 459 п.о. |
| T5NT | Последовательность ранней остановки транскрипции вируса осповакцины | 7 п.о. |
| prPs | Ранний/поздний промотор вируса осповакцины | 44 п.о. |
| CHIKV 26S | Кодирующие белок последовательности полипротеина CHIKV 26S, состоящего из капсида, E3, E2, gp6K и E1. Последовательность получена из Genbank, номер доступа: AM258992. | 3747 п.о. |
| T5NT | Последовательность ранней остановки транскрипции вируса осповакцины | 7 п.о. |
| Плечо A39R-F2 | Плечо 2 гомологичной рекомбинации, нацеленное ниже ORF A39R | 501 п.о. |
[0107] SCV301A конструировали путем вставки кассеты гомологичной рекомбинации CHIKV-26S в штамм Copenhagen вируса осповакцины (VACV-COP) путем замены ORF A39R с помощью гомологичной рекомбинации между F1 и F2 и их гомологичными последовательностями в геноме VACV-COP, как показано на фигуре 2 выше, что приводит к конфигурации вставки, показанной на фигуре 3.
Методология
[0108] SCV301C (VACV-CHIKV) конструировали путем гомологичной рекомбинации для замены ORF A39R в VACV на кассету гомологичной рекомбинации CHIKV-26S, которая была синтезирована в GeneArt GmbH, содержащей поксвирусную кассету экспрессии, экспрессирующую структурный полипротеин CHIKV 26S (Genbank, номер доступа: AM258992) под контролем промоторов VACV (Chakrabarti etal, 1997) вместе с поксвирусной кассетой экспрессии для экспрессии гуанинфосфорибозилтрансферазы E. coli (Ecogpt). Гомологичную рекомбинация и положительную селекцию рекомбинантных вирусов, содержащих одновременную вставку кассеты экспрессии Ecogpt, проводили, как описано в протоколе 6 в документе Smith (1993) и опубликовано в документах Falkner et al (1988) и Boyle et al (1988), причем плечи гомологичной рекомбинации, фланкирующие кассеты экспрессии CHIKV-26S и Ecogpt, были сконструированы так, чтобы они были гомологичны с последовательностями, фланкирующими ORF A39R. Кратко говоря, гомологичную рекомбинацию проводили в клетках BHK21, которые были инфицированы VACV-COP при MOI 0,01 БОЕ на клетку в течение 1 часа с последующей трансфекцией кассетой гомологичной рекомбинации CHIKV-26S. Затем инфицированные/трансфицированные клетки инкубировали в течение 2-3 дней до тех пор, пока не наблюдали заметные цитопатические эффекты, за чем следовали сбор и клеточный лизис для получения вирусного экстракта. Осуществляли положительную селекцию SCV301C путем селекции Ecogpt по препарату с использованием обработки клеток BHK21 с помощью MXHAT, как описано в протоколе 6 документа Smith (1993), за исключением того, что были проведены 20 циклов очистки бляшек путем ограниченного разбавления в 48WP для устранения следов родительского VACV-COP по оценке с помощью специфического к A39R ПЦР-анализа. Затем клон-кандидат амплифицировали в клетках BHK21 без обработки MXHAT для получения вирусного посевного материала, из которого получали партии SCV301C для исследований вакцинации. Последовательность генома SCV301C приведена в SEQ ID NO:3.
Ссылки:
Chakrabarti, S, Sisler, JR, and Moss, B (1997). Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. Biotechniques 23: 1094-1097.
Smith, GL (1993)In: Davison, AJ and Elliotand, RM (eds). Expression of genes by vaccinia virus vectors in "Molecular Virology a Practical Approach". IRL Press at Oxford University Press.
Falkner, FG, and Moss, B (1988). Escherichia coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors. J Virol 62: 1849-1854.
Boyle, DB, and Coupar, BE (1988). A dominant selectable marker for the construction of recombinant poxviruses. Gene 65: 123-128.
Конструирование SCV305 (SCV-CHIK)
Удаление репортерной кассеты EGFP/Ecogpt для создания SCV302
Описание
[0109] Для конструирования SCV305 кассеты экспрессии EGFP и Ecogpt, которые должны быть удалены из SCV301C для создания SCV302, рекомбинантного штамма Copenhagen вируса осповакцины, который содержит только кассету экспрессии полипротеина чикунгуньи 26S, вставленную в ORF A39R. Этот вирус конструировали путем удаления репортерных кассет экспрессии Ecogpt/EGFP из SCV301C путем гомологичной рекомбинации с pTC29 и противоселекции вирусов с функциональной экспрессией Ecogpt, как показано ниже на фигуре 4.
Описание pTC29
[0110] pTC29 представляет собой клон плазмиды, который содержит плечи гомологичной рекомбинации, A39R-F1 и SCV301C-F2, требующиеся для удаления кассет экспрессии EGFP и Ecogpt из SCV301C путем гомологичной рекомбинации, как показано на фигуре 4. Последовательность pTC29 подробно приведена в SEQ ID NO:4, а карта плазмиды показана на фигуре 5.
Методология
[0111] Кассеты экспрессии Ecogpt и EGFP удаляли из SCV301C путем гомологичной рекомбинации и противоселекции экспрессии Ecogpt, как описано в протоколе 7 документа Smith (1993) и опубликовано в документе Isaacs et al (1990), причем плечи гомологичной рекомбинации были сконструированы так, чтобы они были гомологичны последовательностям, фланкирующим кассеты экспрессии Ecogpt и EGFP в рекомбинантном геноме VACV-CHIK. После гомологичной рекомбинации SCV302 дополнительно очищали от бляшек в клеточной линии hrpt - в присутствии 6-тиогуанина (6-TG) для противоселекции примесного вируса, экспрессирующего Ecogpt, т.е. исходного SCV301C.
Ссылки
Smith, G.L. (1993). Expression of genes by vaccinia virus vectors. In Molecular Virology a Practical Approach, A.J. Davison and R.M. Elliotand, eds. (IRL Press at Oxford University Press), pp. 257-283.
Isaacs, S.N., Kotwal, G.J., and Moss, B. (1990). Reverse guanine phosphoribosyltransferase selection of recombinant vaccinia viruses. Virology 178, 626-630.
Удаление B7R-B8R и D13L для создания SCV305
Описание
[0112] SCV305 конструировали путем одновременного удаления ORF D13L и B7R-B8R из SCV302 в одной реакции гомологичной рекомбинации с D13L-делеционной кассетой гомологичной рекомбинации (HR) (делеция D13L с трансдоминантной селекцией CP77/DsRed) и B7R-B8R-делеционной кассетой гомологичной рекомбинации (HR) (делеция B7R-B8R с трансдоминантной селекцией Cyan/зеоцин). Детали конфигурации каждой кассеты показаны на фигурах 6 и 7, а последовательность подробно приведена в SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6.
Таблица 2: Таблица элементов D13L-делеционной HR-кассеты
| Элемент | Описание | Размер |
| D13L-F1 | Плечо гомологичной рекомбинации для делеции D13L-F1 | 1000 п.о. |
| prCP77 | Промотор CPXV-BR A25L (ранний промотор) | 136 п.о. |
| CP77 | Белок круга хозяев коровьей оспы CHO (ORF BR-A25L) | 2007 п.о. |
| T5NT | Последовательность ранней остановки транскрипции вируса осповакцины | 7 п.о. |
| prPs | Ранний/поздний промотор вируса осповакцины | 44 п.о. |
| DsRed | Кодирующая белок DsRed-Express2 последовательность | 678 п.о. |
| T5NT | Последовательность ранней остановки транскрипции вируса осповакцины | 7 п.о. |
| F1-Rpt | Последовательность 3'-повтора плеча D13L-F1 | 251 п.о. |
| D13L-F2 | Плечо гомологичной рекомбинации для делеции D13L-F2 | 1000 п.о. |
Таблица 3: Таблица элементов B7R-B8R-делеционной HR-кассеты
| Элемент | Описание | Размер |
| B7R-F1 | Плечо гомологичной рекомбинации для делеции D7R-F1 | 1000 п.о. |
| prPs | Ранний/поздний промотор вируса осповакцины | 40 п.о. |
| AmCyanZeo | Кодирующая последовательность слияния флуоресцентного белка AmCyan с белком резистентности к зеоцину | 1059 п.о. |
| T5NT | Последовательность ранней остановки транскрипции вируса осповакцины | 7 п.о. |
| F1-Rpt | Последовательность 3'-повтора плеча B7R-F1 | 305 п.о. |
| B8R-F2 | Плечо гомологичной рекомбинации для делеции B8R-F2 | 1000 п.о. |
[0113] Для селекции вируса с делецией D13L использовали клеточные линии, экспрессирующие белок D13: CHO+D13 (клеточная линия CHO, экспрессирующая белок D13) и CHO+D13+CP77 (клеточная линия CHO, экспрессирующий белок D13 и белок CP77). Причиной использования двух таких клеточных линий является то, что экспрессия CP77 вирусом обеспечивает размножение в клетках CHO, и поэтому ее использовали в качестве инструмента положительной селекции. Замена ORF D13L на кассету экспрессии CP77/DsRed обеспечивает амплификацию вируса с делецией D13L в клетках CHO-D13, что может быть подтверждено красной флуоресценцией инфицированных клеток. Для удаления репортерной кассеты CP77/DsRed после подтверждения делеции D13L была разработана внутримолекулярная рекомбинация для удаления этой кассеты, когда больше не требовалась вирусная экспрессия CP77. Это было сделано путем амплификации вируса с делецией D13L в CHO+D13+CP77, которые не только экспрессируют белок D13, но также белок CP77, что делает вирусно экспрессируемый CP77 избыточным, и позволяет его удаление путем внутримолекулярной рекомбинации, как показано на фигуре 4.
[0114] Для селекции вируса с делецией B7R-B8R использовали репортерную кассету резистентности к зеоцину и голубой флуоресценции для замены этих ORF путем гомологичной рекомбинации. Осуществляли положительную селекцию кассеты зеоцин/Cyan путем культивирования клеток в зеоцине во время инфицирования и селекции клеток с голубой флуоресценцией. После подтверждения делеции B7R-B8R инициировали удаление этого репортера путем внутримолекулярной рекомбинации в отсутствие зеоцина во время инфицирования, как показано на фигуре 8.
[0115] Экспериментальная стратегия одновременного удаления D13L и B7R-B8R была реализована путем (i) гомологичной рекомбинации SCV302 с D13L-делеционной HR-кассетой и B7R-B8R HR-кассетой в клетках CHO+D13, (ii) амплификации SCV305 в клетках CHO+D13, обработанных зеоцином, (iii) выделения индивидуально инфицированных клеток, которые одновременно давали голубую и красную флуоресценцию, до выделения чистого двойного нокаут-клона и затем (iv) инициирования удаления обеих репортерных кассет путем инфицирования клеток CHO+D13+CP77 без обработки зеоцином и выделения нефлуоресцентных (голубым и красным) инфицированных клеток.
[0116] Клоны, идентифицированые как свободные от примесей вирусных промежуточных продуктов с удаленными целевыми ORF, подтверждали с помощью ПЦР и секвенирования. Наличие кассеты экспрессии CHIKV-26S в ORF A39R дополнительно подтверждали с помощью ПЦР и секвенирования, а экспрессию белков CHIKV подтверждали с помощью вестерн-блота. Общую аттенуацию SCV305 верифицировали с помощью исследования инфекционности в пермиссивных к вирусу осповакцины клеточных линиях.
Методология
[0117] Как D13-делеционная HR, так и B7R-B8R-делеционная HR-кассеты были синтезированы GeneArt GmbH. Для создания SCV305 (SCV-CHIK) ORF D13L и ORF B7R-B8R удаляли из SCV302 путем гомологичной рекомбинации, при которой проводили положительную селекцию успешных делеций путем инфицирования клеток CHO, экспрессирующих только белок D13 (CHO-D13), в присутствии зеоцина. Поскольку CHO являются непермиссивными к инфицированию VACV, положительной селекции вируса с делецией D13L достигали путем замены ORF D13L на кассету экспрессии, кодирующую белок круга хозяев вируса коровьей оспы CHO CP77. Конструировали плазмиду гомологичной рекомбинации, которая состояла из кассеты экспрессии CP77 и кассеты экспрессии флуоресцентного белка dsRed, фланкированной левым и правым плечами рекомбинации, которые гомологичны последовательностям, фланкирующим ORF D13L в SCV302. Кассету экспрессии dsRed добавляли потому, что VACV, экспрессирующий CP77, не образует литических бляшек в CHO; поэтому инфицирование контролировали по наличию красной флуоресценции. Для помощи в удалении кассет экспрессии CP77 и dsRed, которые заменили ORF D13L, и кассеты экспрессии AmCyanZeo, которая заменила ORF B7R-B8R, последовательность повтора левого плеча гомологичной рекомбинации помещали ниже кассет экспрессии CP77 и dsRed и ниже кассеты экспрессии AmCyanZeo, но выше правого плеча гомологичной рекомбинации в обеих кассетах гомологичной рекомбинации. Гомологичную рекомбинацию проводили путем трансфекции удаляющих D13L и B7R-B8R кассет гомологичной рекомбинации в CHO-D13, ранее инфицированные VACV-CHIK при MOI 0,01 БОЕ на клетку. SCV305 обогащали после инфицирования гомологичной рекомбинации путем амплификации вируса в CHO-D13, обработанных зеоцином, с последующим инфицированием свежего набора клеток CHO-D13, обработанных зеоцином, амплифицированным вирусом. Эти инфицированные клетки извлекали и превращали в суспензию отдельных клеток с помощью расщепления TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific), а затем поклеточно сортировали, так что одну клетку с красной и голубой флуоресценцией высевали в 1 лунку 96-луночного планшета, содержащего культивированные клетки CHO-D13, обработанные зеоцином, с использованием проточного цитометра FACSAria Fusion (BD Biosciences). Затем 96-луночный планшет, засеянный клетками с красной/голубой флуоресценцией, инкубировали при 37°C/5% CO2, пока не удавалось увидеть красные и голубые флуоресцентные очаги инфекции в какой-либо из лунок 96-луночного планшета. Лунки, содержащие один очаг инфицирования, собирали и ресуспендировали в виде суспензий отдельных клеток до поклеточной сортировки и высевания на 96-луночные планшеты со свежими клетками CHO-D13, обработанными зеоцином. Этот процесс поклеточной сортировки повторяли пять раз для удаления следовых примесей исходного SCV302 и получения клонального SCV305. Ряд клонально очищенных кандидатов SCV305 амплифицировали в клетках CHO-D13, обработанных зеоцином, и затем тестировали с помощью ПЦР-анализа на присутствие примесного SCV302 и для подтверждения замены D13L кассетами экспрессии CP77 и dsRed и замены B7R-B8R на кассету экспрессии AmCyanZeo. Затем наилучший клон амплифицировали в линии CHO+D13+CP77 (экспрессирующей как белок CP77, так и белок D13) для стимуляции внутримолекулярной рекомбинации между левыми последовательностями гомологичной рекомбинации и последовательностями повтора, поскольку зависимость от вирусной экспрессии CP77 больше не нужна, и необходимость в экспрессии белка резистентности к зеоцину больше не нужна в отсутствие зеоцина, что приводит к удалению из SCV305 кассет экспрессии CP77 и dsRed и кассеты экспрессии AmCyanZeo. Инфицированные клетки CHO+D13+CP77 вводили в суспензию отдельных клеток путем расщепления с помощью TrypLE Select, клетки сортировали с использованием проточного цитометра FACSAria Fusion, в котором нефлуоресцентные клетки были массово отсортированы, и сохраняли. Вирус SCV305 дополнительно амплифицировали для получения посевного материала путем инфицирования клеток CHO+D13+CP77 с последовательным масштабированием. Вся геномная последовательность SCV305 приведена в SEQ ID NO:7.
Конструирование SCV1002 (SCV-CHIK/ZIKA)
Описание
[0118] SCV1002 представляет собой одновекторную поливалентную вакцину от чикунгуньи и вируса Зика, которая имеет следующие особенности:
- Замена ORF A39R на кассету экспрессии SCV-CHIKV-(субгеномный 26S) (CHIKV-26S)
- Замена ORF B7R-B8R на кассету экспрессии SCV-ZIKV-prME
- Удаление ORF D13
[0119] SCV1002 конструировали путем замены ORF B7R-B8R SCV302 на кассету экспрессии полипротеина prME вируса Зика и удаления ORF D13L. Последовательность кассеты экспрессии prME вируса Зика подробно приведена в SEQ ID NO:8, причем взяли последовательность prME происхождением из бразильского штамма ZikaSPH2015 (Genbank: KU321639). Кассета гомологичной рекомбинации (HR) ZIKV-prME была синтезирована в GeneArt, как показано на фигуре 10, причем последовательность подробно приведена в SEQ ID NO:9.
Таблица 4: Таблица элементов HR-кассеты ZIKV prME
| Элемент | Описание | Размер |
| Плечо B7-F1 | Плечо гомологичной рекомбинации, фланкирующее ORF B7R | 1000 п.о. |
| T5NT | Последовательность ранний остановки транскрипции поксвируса кассеты экспрессии BFPzeo | 7 п.о. |
| BFPzeo | Кодирующая белок последовательность белка слияния синего флуоресцентного белка и инактивирующего зеоцин фермента | 1071 п.о. |
| prPs | Ранний/поздний промотор вируса осповакцины кассеты экспрессии BFPzeo | 40 п.о. |
| Плечо F1-Rpt | Последовательность повтора плеча F1 | 301 п.о. |
| prPs | Ранний/поздний промотор вируса осповакцины | 40 п.о. |
| Полипротеин prME | Кодирующая белок последовательность последовательности полипротеина prME. Последовательность получали из Genbank: KU321639 (бразильский штамм ZikaSPH2015) | 2076 п.о. |
| T5NT | Последовательность ранней остановки транскрипции поксвируса кассеты экспрессии ZIKV-PrME | 7 п.о. |
| Плечо B8-F2 | Плечо гомологичной рекомбинации, фланкирующее ORF B8R | 1000 п.о. |
Методология
[0120] SCV1002 (SCV-CHIK/ZIKA) конструировали путем замены ORF B7R-B8R на поксвирусную кассету экспрессии для ZIKV prME (бразильский изолят ZikaSPH2015, Genbank: KU321639) и удаления ORF D13L путем гомологичной рекомбинации. Для вставки кассеты экспрессии ZIKV prME путем замены ORF B7R-B8R была синтезирована в GeneArt GmbH кассета гомологичной рекомбинации, состоящая из следующих элементов: (i) последовательности, нацеленные на гомологичную рекомбинацию F1 выше гена B7R, (ii) кассета экспрессии, состоящая из раннего/позднего промотора вируса осповакцины, функционально связанного с кодирующей белок последовательностью слияния синего флуоресцентного белка с белком резистентности к зеоцину (BFPzeo), и заканчивающаяся последовательностью ранней остановки транскрипции поксвируса, (iii) повтор плеча F1 гомологичной рекомбинации, (iv) кассета экспрессии, состоящая из раннего/позднего промотора вируса осповакцины, функционально связанного с кодирующей белок последовательностью ZIKV prME, за которой следует последовательность ранней остановки транскрипции поксвируса, и, наконец, (v) последовательности, нацеленные на гомологичную рекомбинацию F2 ниже гена B8R. ORF D13L удаляли, как описано в конструировании SCV305 (SCV-CHIK).
[0121] Гомологическую рекомбинацию проводили путем трансфекции как ZIKV prME HR-кассеты, так и HR-кассеты делеции D13L в клетки CHO+D13, ранее инфицированные SCV302 при MOI 0,01 БОЕ на клетку. Полученный SCV1002 обогащали после инфицирования гомологичной рекомбинации путем амплификации вируса в клетках CHO+D13 в присутствии зеоцина (ThermoFisher Scientific) с последующим вторым инфицированием свежего набора клеток CHO+D13 в присутствии зеоцина амплифицированным вирусом. Эти инфицированный клетки извлекали и превращали в суспензию отдельных клеток с помощью расщепления TrypLE Select, а затем поклеточно сортировали, так что одну клетку с синей и красной флуоресценцией высевали в одну лунку 96-луночного планшета, содержащего клетки CHO+D13, с использованием проточного цитометра FACSAria Fusion (BD Biosciences). После инкубации в присутствии зеоцина лунки, содержащие один синий и красный флуоресцентный очаг инфицирования, собирали и ресуспендировали в виде суспензий отдельных клеток до поклеточной сортировки и высевания на 96-луночные планшеты со свежими клетками CHO+D13. Эту поклеточную сортировку и культивирование в присутствии зеоцина повторяли пять раз для удаления следовых примесей исходного SCV302 и получения клонального SCV1002. Несколько клонально очищенных SCV1002 амплифицировали в клетках CHO+D13+CP77 в отсутствие зеоцина, а затем подвергали ПЦР-анализу для подтверждения вставки ZIKV prME в локус B7R-B8R, сохранения кассеты экспрессии CHIK в локусе A39R и отсутствия примесного SCV302. Клоны амплифицировали в клетках CHO+D13+CP77 в отсутствие зеоцина для стимуляции внутримолекулярной рекомбинации между последовательностью гомологичной рекомбинации F1 и последовательностью повтора F1, что приводит к удалению обеих кассет экспрессии BFPzeo и DsRed/CP77. Суспензии отдельных клеток этих культур массово сортировали (FACSAria), и сохраняли нефлуоресцентные клетки. ПЦР повторяли для подтверждения сохранения вставок и потери BFPzeo, DsRed/CP77 и удаления ORF D13L. Получали запасы вакцины SCV1002 в клетках CHO-D13+CP77, и титровали их. Последовательность всего генома SCV1002 приведена в SEQ ID NO:10.
Пример 2
Вакцинации SCV305 защищают от ECTV
[0122] Группы самок мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель (n=5 мышей на группу) вакцинировали и/п SCV305 (105, 106, 107 БОЕ) или мнимо вакцинировали ФСБ. Уровни специфического IgG против вируса осповакцины определяли с помощью ELISA конечной точки. Было установлено, что вакцинация SC305 обеспечивает существенные титры специфического вирусного антитела против вируса осповакцины, которые были аналогичны получаемым при вакцинации аналогичной дозой вируса осповакцины (VACV).
[0123] Через четыре недели мышей заражали летальной дозой (50 LD50) вируса мышиной оспы, Ectromalia (ECTV). ECTV очень инфекционен для мышей и вызывает те же симптомы у мышей, что и натуральная оспа у людей.
[0124] Мыши, вакцинированные 107, 106, и 105 БОЕ SCV305 или 105 БОЕ VACV, демонстрировали аналогичные уровни защиты от потери веса, клинических симптомов и смертности. Распространение ECTV на несколько органов также было предотвращено у всех вакцинированных мышей. Эти результаты показывают, что однократная вакцинация SCV305 обеспечивает полную защиту от заражения смертельным поксвирусом, что позволяет предположить, что SCV сохраняет свою полезность в качестве противооспенной вакцины.
Однократная вакцинация SCV305 дает устойчивые и длительные ответы антител против вируса чикунгуньи
[0125] Антитела считаются существенно важными для защиты от вируса от чикунгуньи (CHIKV), причем человеческие и мышиные антитела направлены на поверхностный гликопротеин E2 CHIKV, который, как было показано, опосредует защиту. Мышам вводили однократную дозу вакцины (105, 106 и 107 БОЕ SCV-CHIK), и исследовали ответы специфических к E2 CHIKV IgG с помощью ELISA. Наблюдали зависящее от дозы и времени повышение уровней CHIKV-E2-специфических IgG, причем мыши, которые получили 107 БОЕ, демонстрировали кинетику и величину выработки антител, сходную с индуцированной у мышей, вакцинированных репликационно-компетентным VACV-CHIK. Это показывает, что дефектная по размножению вакцина SCV305 способна генерировать выработку антител на рекомбинантный иммуноген, сравнимую с компетентной по размножению вакциной VACV-CHIK.
[0126] Выработку нейтрализующих антител детектировали у 4/6 мышей, получавших 105 БОЕ вакцины SCV305, тогда как все 6 мышей, получавших 106 БОЕ и 107 БОЕ вакцины SCV305, вырабатывали нейтрализующие антитела.
[0127] Исследовали уровни CHIKV-специфических IgG1 и IgG2c в сыворотке мышей на 30 день после вакцинации для получения показателя "баланса Th1/Th2" выработки антител. При 107 БОЕ SCV305 стимулировала выработку IgG2c, сравнимую с индуцируемой VACV-CHIK. Однако SCV305 индуцировала более высокую выработку IgG1, чем VACV-CHIK, что говорит о генерации SCV-CHIK более сбалансированного по Th1 (IgG2c)/Th2 (IgG1) ответа, со смещением у VACV-CHIK с сторону Th1.
[0128] Для анализа долговечности выработки антител, индуцируемой вакциной от SCV-CHIK, исследовали выработку анти-CHIKV антител через 4 недели, 6 месяцев и 1 год после вакцинации. За это время наблюдали ограниченное падение уровней анти-CHIKV антител, причем уровни антител оставались сравнимыми у мышей, вакцинированных SCV305 и VACV-CHIK. Кроме того, детектировали секретирующие CHIKV E2-специфические антитела клетки (ASC) и продуцирующие CHIKV E2/E1 и капсид-специфический IFN-γ клетки через 1 год после вакцинации у вакцинированных SCV305 и VACV-CHIK мышей.
[0129] Модель вакцинации и заражения CHIKV была выведена из демонстрации того, что мыши, вакцинированные VACV-CHIK (107 БОЕ) и зараженные CHIKV (изолят острова Реюньон; LR2006-OPY1, 104 CCID50) были полностью защищены от виремии и артралгии. Поскольку вакцина от SCV-CHIK индуцировала выработку нейтрализующих антител, сравнимую с VACV-CHIK в той же дозе 107 БОЕ, защитную эффективность вакцины SCV305 оценивали при более низких дозах (105 и 106 БОЕ). Мыши, вакцинированные SCV305 при 106 БОЕ и зараженные через 40 дней (изолятом острова Реюньон; LR2006-OPY1, 104 CCID50), не продемонстрировали детектируемой виремии или припухлости стопы. Мыши, вакцинированные в 10 раз более низкой дозой (105 БОЕ) были практически защищены с уменьшением виремии приблизительно 4-log и значительно сниженной припухлостью стопы по сравнению с контрольными VACV-инфицированными мышами. Продолжительные исследования подтвердили, что вакцинированные SCV305 мыши защищены от заражения CHIKV через год после вакцинации.
[0130] Персистенцию геномной РНК CHIKV, в частности в тканях суставов, связывают с хроническим артритическим заболеванием после инфицирования CHIKV у людей и в модели на мышах. Через 30 дней после заражения мыши, вакцинированные 106 БОЕ вакцины SCV305, продемонстрировали значительное снижение уровня персистирующей вирусной РНК до фоновых уровней, что показывает, что вакцинация SCV305 может предотвращать сохранение персистирующей РНК CHIKV в тканях суставов.
[0131] В совокупности эти результаты демонстрируют способность вакцина SCV305 вызвать надежную, сбалансированную и продолжительную выработку CHIKV-специфических антител и обеспечить защиту от виремии, острого артрита и персистенции вирусной РНК после заражения CHIKV.
ПРИМЕР 3
Вакцинация SCV1002
[0132] При комбинировании различных живых аттенуированных вирусных вакцин наиболее часто наблюдаемой проблемой является конкуренция между вирусами. Ее можно обойти, увеличив дозу комбинированной вакцины или скорректировав дозировку каждого компонента вакцины, чтобы преодолеть конкуренцию со стороны доминирующих компонентов вакцины.
[0133] Сообщалось об конкуренции антигенов путем "иммунологического взаимовлияния" между компонентами трехвалентной вакцины против дифтерии, коклюша и столбняка, между бактеринами чумы собак и живым вирусом чумы собак и при использовании бордетеллы в качестве разбавителя для живых комбинированных вакцин от вируса чумы, аденовируса типа 2, парвовируса и вируса парагриппа (Hunt et al, 2001). В этих примерах прививка многокомпонентной вакциной вызывает меньше антител, чем когда компоненты вводят отдельно. В некоторых случаях ответ на один антиген доминирует, тогда как ответы на другие подавляются. В других случаях, если происходит взаимная конкуренция, уменьшается ответ на все компоненты.
[0134] Как было показано, степень антигенной конкуренции, зависит от ряда параметров вакцинации, включая относительные места прививки конкурирующих антигенов, интервал времени между введением антигенов и дозу доминирующего антигена по отношению к подавляемому антигену.
[0135] Несмотря на то, что вышеуказанное может быть решено путем экспрессии иммунизирующих антигенов нескольких вызывающих заболевание агентов из одного и того же вектора, что обеспечивает равное представление каждого иммунизирующего антигена иммунной системе, причем с одним вектором для доставки антигенов нужно рассматривать оптимальный способ вакцинации только для этого вектора, существует риск того, что может иметь место взаимовлияние антигенов путем захвата и ГКГ-презентации антигенпрезентирующими клетками, такими как B-клетки и дендритные клетки, преимущественного антигена. Антиген с доминантными В-клеточными и/или Т-клеточными эпитопами будет вызывать более сильный иммунный ответ, чем антиген, имеющий субоптимальные В-клеточные и/или Т-клеточные эпитопы. Следовательно, это может приводить к смещенному иммунному ответу на наиболее доминирующий антиген при вакцинации одним вектором, который экспрессирует множество антигенов от множества вызывающих заболевание агентов. Можно ожидать, что антиген, экспрессируемый из вектора, который также экспрессирует другие антигены от других заболеваний, например антиген чикунгуньи, экспрессируемый вместе с антигенами вируса Зика, может не давать столь же сильный иммунный ответ, что и иммунизирующий вектор, который экспрессирует только антиген чикунгуньи.
[0136] Было проведено исследование для определения, будет ли экспрессия нескольких доминирующих антигенов от нескольких вызывающих заболевание вирусов мешать иммунным ответам на них. Например, белок E2 чикунгуньи очень эффективен для стимуляции выработки очень хороших нейтрализующих антител, которые могут нейтрализовать инфицирование чикунгуньей. Аналогично, белок Е вируса Зика также стимулирует мощную выработку нейтрализующих антител для нейтрализации инфицирования вирусом Зика. Однако экспрессия этих двух доминирующих антигенов из одного и того же вектора может влиять на их способность стимулировать мощный иммунный ответ на их соответствующие вирусы, т.е. один доминирующий антиген может получить доминирование над другим.
[0137] Для определения, не является ли экспрессия нескольких доминирующих антигенов из одного и того же вектора вредной для стимуляции оптимальных иммунных ответов по сравнению с экспрессией каждого доминирующего антигена из отдельного вектора, провели исследование вакцинации на мышах со сравнением SCV1002 (вакцина от CHIK/ZIKA) с SCV305 (вакцина от CHIK) в отношении стимуляции специфических для чикунгуньи нейтрализующих антител.
Стратегия вакцинации:
[0138] Самок мышей C57BL/6 дикого типа и дефицитных по интерфероновому рецептору (IFNAR) вакцинировали однократно одновекторной вакциной от CHIKV/ZIKV (SCV1002), только от CHIKV (SCV305) или пустым контрольным вектором (SCV105) в группах по 6 мышей на лечбную группу. Все лечебные группы получали 106 БОЕ вакцины на мышь посредством интраперитонеальных инъекций, и через 2 и 4 недели после вакцинации у них брали кровь. Всех мышей заражали через 6 недель после вакцинации.
Анализ нейтрализации:
[0139] Уровни нейтрализующих антител часто используются в качестве коррелята защиты. Поэтому во всех группах вакцинации, ZIKV/CHIKV (SCV1002), только CHIKV (SCV305) или пустой контрольный вектор (SCV105), рассчитывали уровни нейтрализующих антител до заражения с использованием стандартного анализа микронейтрализации на клетках Vero на реюньонском штамме чикунгуньи. Кратко говоря, сыворотки инактивированли теплом (56°C в течение 30 мин), сыворотку от каждой мыши последовательной разводили в двух повторностях в 96-луночных планшетах и инкубировали с 100 CCID50 единицами вируса, инкубируя в течение 1 ч при 37°C. После этого этапа нейтрализации свежеразделенные клетки Vero накладывали (104 клеток на лунку) на смесь сыворотка/вирус и инкубировали в течение 5 дней до визуализации цитопатических эффектов под микроскопом. Разведение сыворотки, обеспечивающее 100% защиту от цитопатического эффекта, определяли с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым.
Результаты
[0140] Обе вакцины-кандидата, экспрессирующие антигены CHIKV, индуцировали нейтрализующие антитела к вирусу чикунгуньи после однократного введения вакцины.
[0141] Однако однократное введение одновекторной вакцины от CHIK/ZIKA индуцировало гораздо более высокие уровни CHIKV нейтрализующих антител, несмотря на эквивалентные дозы, используемые для вакцинации.
Вывод
[0142] Это исследование вакцинации продемонстрировало, что когда мышей вакцинируют однократным введением эквивалентных доз SCV305 (вакцина только от CHIK) и SCV1002 (одновекторная вакцина от CHIK/ZIKA), одновекторная вакцина (SCV1002) приводит к лучшей выработке чикунгунья-специфических нейтрализующих антител. Это было неожиданно, поскольку считалось, что экспрессия другого доминирующего антигена, т.е. белка E вируса Зика, будет создавать конкуренцию при иммунном ответе и, таким образом, ослабит или даже уничтожит иммунный ответ на доминирующие антигены как чикунгуньи (мишень для нейтрализующих антител антиген E2), так и вируса Зика (мишень нейтрализующих антител антиген E). Похоже, что это не так, и можно предположить, что экспрессия антигена вируса Зика имеет адъювантный эффект, помогая повысить иммунный ответ на антигены чикунгуньи, который ожидается для VLP чикунгуньи после вакцинации.
Защита плодов мышей от инфицирования вирусом Зика матерей, которые заранее были вакцинированы SCV1002 до беременности
[0143] Основными осложнениями продолжающейся вспышки вируса Зика в Америке и Азии являются врожденные дефекты, вызванные способностью вируса проникать через плаценту и инфицировать мозг плода. Setoh et al (2017, De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case. mSphere 2:e00190-17. https://doi.org/101128/mSphereDirect.00190-17) описывает модель на мышах, в которой штамм ZIKV-Natal может быть использован для создания модели инфекции мозга плода у мышей IFNAR -/- (включая задержку внутриутробного развития), не вызывая симптоматических инфекций у самок.
[0144] Цель данного исследования состояла в том, чтобы показать, что предпринятая заранее вакцинация самок мышей SCV1002 (одновекторная от ZIKA/CHIK) до беременности может обеспечить защиту от инфицирования вирусом Зика их нерожденных плодов.
[0145] Это исследование было проведено путем вакцинации самок IFNAR -/- или SCV1002 (одновекторная вакцина от CHIK/ZIKA), или SCV105 (только вектор) с последующим скрещиванием с самцами мышей IFNAR. Беременных мышей затем инфицировали штаммом Natal вируса Зика, как описано Setoh et al (2017).
График вакцинации:
- Шести-восьминедельных дефицитных по рецептору интерферона самок мышей (IFNAR -/-) вакцинировали однократно внутримышечным путем или одновекторной вакциной от ZIKV/CHIKV (SCV1002), или пустой контрольной вакциной (SCV105) на неделе 0 по 106 на мышь
- У групп мышей брали кровь через 4 недели после вакцинации для проверки на сероконверсию к вакцине
- Через 6 недель после вакцинации были инициированы синхронные спаривания для вызывания беременности у вакцинированных мышей. Самок мышей ежедневно проверяли на наличие признаков успешной беременности (копулятивные пробки)
- В возрасте эмбрионов 6,5 дня беременных мышей инфицировали штаммом Zika Natal по 104 CCID50 единиц посредством подкожного инфицирования
- После инфицирования у беременных мышей брали кровь ежедневно с 1 по 5 день для проверки на виремию
- В возрасте эмбрионов 17,5 дня беременных мышей сортировали, материнскую плаценту и головки плода собирали для оценки на инфекционный ZIKV, как описано Setoh etal (2017).
Результаты
[0146] Беременные самки мышей, заранее вакцинированные SCV1002 (вакцина от CHIK/ZIKA) до того, как они забеременели, могли препятствовать репликации вируса Зика во время заражения штаммом Natal вируса Зика, что видно из отсутствия детектирования виремии после заражения. Однако, как и ожидалось, мыши, вакцинированные SCV105 (только вектор SCV), не могли препятствовать вирусной репликации вируса Зика, что видно из высокого уровня виремии, наблюдаемого в первые 5 дней после заражения.
[0147] Самки мышей, заранее вакцинированные одной дозой SCV1002 (вакцина от CHIK/ZIKA) до спаривания и беременности, не демонстрировали детектируемых уровней вируса Зика после заражения в своих плацентах и в головном мозге плодов. Вакцинация препятствовала инфицирование плаценты заражающим вирусом и тем самым блокировала дальнейшую передачу вируса Зика незащищенным плодам.
[0148] Однако все выглядело иначе у самок мышей, заранее вакцинированных только вектором SCV, у которых после заражения во время беременности некоторые плаценты были инфицированы, и происходила передача инфицирования вирусом Зика в головной мозг части плодов.
Выводы
[0149] Беременные самки мышей, заранее вакцинированные одной дозой одновекторной вакцины от CHIK/ZIKA, оказались защищены от заражения ZIKV по сравнению с вакцинированными контрольной вакциной, как показывают результаты виремии.
[0150] Вакцинация матерей до беременности обеспечивает защиту их нерожденных плодов посредством препятствования инфицирования материнской плаценты заражающим вирусом Зика и блокирования дальнейшей передачи в головной мозг плода.
[0151] Эти результаты демонстрируют в этой доклинической модели, что дальнейшая передача заражения вирусом Зика плодам может быть заблокирована путем предварительной вакцинации матери до беременности.
SCV1002 обеспечивает защиту мышей от смертельного заражения вирусом Росс-ривер
[0152] Чикунгунья (CHIKV) принадлежит к группе альфавирусов, а другим членом этой группы является вирус Росс-ривер (RRV). RRV эндемичен для северной и центральной частей Австралии, а также тихоокеанских регионов. RRV и CHIKV переносятся комарами и могут вызывать полиартрит и приводить к персистирующим инфекциям у людей. Однако комарами-переносчиками вируса чикунгуньи являются Aedes aegypti и Aedes albopictus, тогда как главными комарами-переносчиками вируса Росс-ривер являются два болотных комара Aedes camptorhynchus и Aedes vigilax и пресноводный комар Culex annulirostris.
[0153] Проводили исследование вакцинации на линии мышей (нокаут IRF3/7), которые летально восприимчивы к RRV, для определения, могут ли антигены вакцины от чикунгуньи из SCV1002 обеспечивать полную защиту от летального заражения RRV через шесть недель после вакцинации SCV1002 (вакцина от CHIK/ZIKA).
Схема эксперимента
[0154] Это исследование вакцинации и заражения проводили на мышах с нокаутом IRF3/7, которые восприимчивы к инфицированию как чикунгуньей, так и вирусом Росс-ривер, причем инфицирование этими вирусами летально для этой линии мышей.
[0155] Два группы мышей IRF3/7-/- вакцинировали или одной дозой 106 БОЕ на мышь SCV1002 (одновекторная вакцина от CHIK/ZIKA), или SCV105 (только вектор SCV) внутримышечным путем.
[0156] Через 6 недель после вакцинации всех мышей заряжали 104 CCID50 вируса Росс-ривер (штамм TT) подкожным путем в верхнюю часть стопы, как описано Rudd et al (2012).
[0157] За выживанием после заражения наблюдали в течение 30 дней после заражения. Мышей умерщвляли, когда клинические симптомы достигали этически определенных конечных точек (как описано в документе Rudd et al (2012) Interferon Response Factors 3 and 7 Protect against Chikungunya Virus Hemorrhagic Fever and Shock. J. Virol., 86 (18): 9888-9898)).
Результаты
[0158] Было обнаружено, что вакцинация IRF3/7-/- SCV1002, но не SCV105 обеспечивает полную защиту от летальности заражения RRV. Это демонстрирует, что вакцина от SCV-CHIK/ZIKV (SCV1002) обладает перекрестной защитой от других вирусов рода альфавирусов.
Вакцинированных SCV1002 мышей IFNAR
-/-
заражали ZIKV, а затем CHIKV
[0159] Группам по 6 взрослых самок мышей старше 6 недель инъецировали по 106 БОЕ на мышь SCV1002, SCZ305 или SCV105 (пустой вектор SCV) посредством интраперитонеальной инъекции. Мышей контролировали на предмет любых побочных эффектов после вакцинации.
[0160] Через шесть недель после вакцинации группы мышей заражали 103 CCID50 на мышь адаптированного для мышей африканского штамма вируса Зика MR766 посредством подкожной инъекции в основание хвоста.
[0161] Через шесть недель после заражения вирусом Зика выжившие группы мышей заражали 104 CCID50 на мышь реюньонского штамма вируса чикунгуньи (LR2006-OPY1) посредством подкожной инъекции в верхнюю часть стопы.
Результаты
[0162] Вакцинированные SCV1002 (одновекторная вакцина от CHIK+ZIK) мыши оказались полностью защищены от заражения вирусом Зика, однако все вакцинированные SCV305 (вакцина только от CHIK) и SCV105 (только вектор) мыши умерли от инфицирования вирусом Зика инфекция к 9 дню после инфицирования.
[0163] Вакцинированные SCV1002 (одновекторная вакцина от CHIK+ZIK) мыши IFNAR-/-, которые сначала были заражены ZIKV и выжили, были защищены частично, т.е. с эффективностью 33%, от чрезвычайно летального заражения CHIKV, которое оказалось способно убить всех невакцинированных мышей к 3 дню после заражения.
Выводы
[0164] Вакцинация мышей INFAR-/ - однократной дозой SCV1002 по 106 БОЕ на мышь обеспечивала полную защиту от летального заражения адаптированным для мышей штаммом вируса Зика.
[0165] Последующее заражение выживших мышей чрезвычайно летальной дозой CHIKV показало частичную защиту, т.е. вакцина SCV1002 оказалась эффективна на 33% в этой модели на мышах в отношении инфицирования CHIKV в дозе 104 инфекционных единиц на мышь. Заражающая доза 104 инфекционных единиц оказалась слишком высокой для этой модели на мышах с ослабленным иммунитетом, у которых отсутствуют рецепторы интерферона, и поэтому они не могут реагировать на интерферон противовирусным образом. Продуцирование противовирусных интерферонов обычно контролирует первоначальную инфекцию, пока адаптивный иммунный ответ успевает отреагировать на инвазивную вирусную инфекцию. Ретроспективно, эта доза для заражения CHIKV в этой модели на мышах оказалась слишком высокой, поскольку она убила всех невакцинированных мышей за 3 дня - слишком короткий период времени для выработки противовирусный анамнестических антител, для того чтобы контролировать и устранить инвазивную вирусную инфекцию. В естественной ситуации противовирусные интерфероны будут контролировать первоначальную вирусную инфекцию достаточно долго для того, чтобы адаптивный иммунный ответ пришел им на смену и нейтрализовал и удалил инфекцию из хозяина. Несмотря на неестественно высокий уровень вирулентности CHIKV для мышей IFNAR, когда невакцинированные мыши умерли к 3 дню после инфицирования дозой 104 инфекционных единиц, вакцинация SCV1002 неожиданно смогла обеспечить некоторую защиту в этих экстремальных условиях, что подчеркивает высокую иммуногенную активность этой вакцины.
Инфицирование CHIKV после вакцинации SCV1002
[0166] Целью данного исследования была оценка антигенного взаимовлияния или антигенного стимула в контексте естественного инфицирования. Повлияет ли предыдущее естественное инфицирование вирусом чикунгуньи на индукцию иммунного ответа на вирус Зика, при том что имеет место индуцированый вакциной вторичный ответ на чикунгунью после вакцинации SCV1002 (вакцина от SCV-CHIK/ZIKA).
[0167] Мышей C57BL/6 дикого типа инфицировали вирусом чикунгуньи, допускали уничтожение вируса, а затем стимулировали одновекторной вакциной от CHIKV/ZIKV. У мышей брали кровь до введения вакцины и через 4 недели после вакцинации для оценки уровней выработки анти-CHIKV и анти-ZIKV антител.
[0168] Группам по 6 взрослых самок мышей старше 6 недель инъецировали по 104 CCID50 на мышь реюньонского штамма вируса чикунгуньи (LR2006-OPY1) посредством подкожной инфекции в верхнюю часть стопы. Мышей контролировали на предмет любых побочных эффектов после инфицирования и брали у них кровь через 8 недель после инфицирования до вакцинации.
[0169] Через восемь недель после инфицирования мышей стимулировали одновекторной вакциной от CHIKV/ZIKV (SCV1002) по 106 БОЕ на мышь, вводимой интраперитонеально. Мышей контролировали на предмет любых побочных эффектов после вакцинации и через четыре недели после вакцинации, у мышей снова брали кровь для сравнения уровней анти-CHIKV и анти-ZIKV антител до и после вакцинации.
[0170] Было обнаружено, что вакцинация SCV1002 мышей дикого типа, ранее подвергшихся воздействию инфекции CHIKV, индуцирует анти-ZIKV антитела на уровнях, аналогичных наблюдаемым ранее без инфицирования CHIKV.
[0171] Антигенный стимул представляет собой явление, при котором воздействие одного антигена может ингибировать способность второго антигена индуцировать защитный иммунный ответ. Предполагается, что в механизм, лежащий в основе этой концепции, включены B-клетки, примированные первым антигеном, которые запрограммированы отвечать только на первый антиген. Когда вводится второй антиген, эти B-клетки по существу удаляют второй антиген до того, как может возникнуть продуктивный иммунный ответ, что приводит к очень низкому или плохому иммунитету. В этом исследовании проверяли эту концепцию.
[0172] Однако поскольку мыши, ранее инфицированные вирусом чикунгуньи, а затем вакцинированные вакциной от CHIKV/ZIKV, способны индуцировать продуктивный иммунный ответ на CHIKV и ZIKV, аналогичный наблюдаемому без предварительного инфицирования CHIKV, антигенный стимул не играет роли в этих условиях. Это скорее всего обусловлено тем, что CHIKV и ZIKV являются очень разными вирусами, происходящими из двух разных семейств вирусов. Эти данные позволяют предположить, что двойная вакцина могла бы использоваться в странах с известным предшествующим распространением CHIKV.
Защита от инфицирования вирусом Зика у самцов мышей
[0173] Вирус Зика остается единственным вирусом, передаваемым комарами, который также может передаваться половым путем. Вирус Зика может передаваться от мужчины к женщине или от мужчины к мужчине, и было показано, что вирус сохраняется в сперме в течение нескольких месяцев после появления симптомов.
[0174] Цель данного исследования состояла в том, чтобы показать, что вакцинация SCV1002 (одновекторная от ZIKA/CHIK) может обеспечивать защиту от инфицирования вирусом Зика у самцов мышей.
[0175] Это исследование было проведено путем вакцинации самцов IFNAR-/- или SCV1002 (одновекторная вакцина от CHIK/ZIKA), или SCV105 (только вектор) с последующим инфицированием штаммом Natal вируса Зика, как описано в документе Setoh et al (2017) (De Novo Generation and Characterization of New Zika Virus Isolate Using Sequence Data from a Microcephaly Case. mSphere 2:e00190-17. https://doi.org/10.1128/mSphereDirect.00190-17).
[0176] Самцов дефицитных по рецептору интерферона мышей (IFNAR -/-) в возрасте 6-8 недель вакцинировали внутримышечным путем или одновекторной вакциной от ZIKV/CHIKV (SCV1002), или пустой контрольной вакциной (SCV105) на неделе 0 по 106 БОЕ на мышь.
[0177] У групп мышей брали кровь через 4 недели после вакцинации для проверки на сероконверсию к вакцине. Через 6 недель после вакцинации самцов мышей инфицировали штаммом Natal вируса Зика по 104 CCID50 единиц посредством подкожного инфицирования. После инфицирования у мышей брали кровь ежедневно с 1 по 5 день для проверки на виремию.
[0178] На 21 день после инфекции мышей сортировали, собирали семенники для оценки РНК ZIKV с использованием количественной ПЦР в реальном времени с использованием праймеров, нацеленных на ген prM. Экстрагировали РНК с использованием тризола (Life Technologies), следуя инструкциям производителя. Синтезировали кДНК с использованием Biorad Iscript Reverse Transcriptase Supermix, следуя инструкциям производителя. Количественный анализ в реальном времени проводили с использованием набора Biorad iTaq Universal Sybr green supermix. Результаты ПЦР в реальном времени определяли количественно по отношению к уровням конститутивного гена RPL13.
[0179] Самцы мышей, вакцинированные SCV1002 (вакцина от CHIK/ZIKA) не были способны к репликации вируса Зика после заражения штаммом Natal вируса Зика, что показывает минимальное детектирование виремии после заражения. Однако, как и ожидалось, вакцинированные SCV105 (только вектор SCV) мыши были способны к репликации вируса Зика, что показывает высокий уровень виремии, наблюдаемый в первые 3 дня после заражения.
[0180] Вакцинация SCV1002 (CHIK/ZIKA) также смогла снизить количество вирусной РНК, наблюдаемой в семенниках на 21 день, по сравнению мышами, вакцинированными контрольной вакциной SCV105.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402
Ausubel et al. (1999) Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York
Boshart et al. (1985) Cell 41:521
Brooks et al. (1995) J. Virol. 69(12):7688-7698
Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761
Drillien R, et al. (1978) J Virol. 28(3):843-50
Gorman et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777
Ham RG. (1965) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53: 288-293
Hsiao JC, et al. (2006) J. Virol. 80(15):7714-28
Kibler et al. (2011) PLOSONE 6(11)
Meisinger-Henschel et al. (2007) J. Gen. Virol. 88(12):3249-3259
Murphy et al. (1995) Virus Taxonomy Springer Verlag:79-87
Puck TT, et al. (1958) J. Exp. Med. 108:945-956
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, N.Y.
Shisler et al. (2004) J. Virol. 78(7):3553-3560
Spehner D, et al. (1988) J Virol., 62(4):1297-1304
Werden SJ, et al. (2008) Chapter 3: Poxvirus Host Range Genes. In: Advances in Virus Research, 71
Claims (11)
1. Композиция, которая индуцирует у пациента защитный иммунный ответ на инфицирование чикунгуньей, натуральной оспой и вирусом Зика, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и аттенуированный поксвирус, причем геном поксвируса содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую субгеномный полипротеин 26S вируса чикунгуньи, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипротеин PrME вируса Зика; и причем аттенуированный поксвирус представляет собой модифицированный поксвирус, причем модификация включает делецию по меньшей мере одного гена, кодирующего эндогенный незаменимый белок сборки или созревания.
2. Композиция по п. 1, в которой аттенуированный поксвирус выбирают из группы, состоящей из вируса осповакцины, модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), NYVAC, авипоксвируса, вируса оспы канареек и вируса оспы птиц.
3. Композиция по п. 2, в которой аттенуированный поксвирус представляет собой модифицированный ортопоксвирус.
4. Композиция по любому из пп. 1-3, в которой модификация содержит делецию гена D13L.
5. Композиция по любому из пп. 1-4, в которой модификация содержит делецию гена K1L.
6. Композиция по любому из пп. 1-5, в которой модификация содержит делецию гена A39R.
7. Композиция по любому из пп. 1-6, в которой модификация содержит делецию генов B7R-B8R.
8. Композиция по любому из пп. 1-7, в которой модификация содержит делецию гена D13L, гена A39R и генов B7R-B8R.
9. Композиция по любому из пп. 1-8, в которой фармацевтически приемлемый носитель содержит адъювант.
10. Композиция по п. 9, в которой адъювант выбирают из группы, состоящей из гидроксида алюминия, фосфата алюминия, сульфата алюминия-калия, гидроксида-фосфата кальция, полного адъюванта Фрейнда, неполного адъюванта Фрейнда, искомов и искоматрикса.
11. Применение композиции по любому из пп. 1-10 для применения в индуцировании у пациента защитного иммунного ответа на инфицирование чикунгуньей, натуральной оспой и вирусом Зика.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AU2016903295A AU2016903295A0 (en) | 2016-08-19 | Viral Vaccines | |
| AU2016903295 | 2016-08-19 | ||
| PCT/AU2017/050879 WO2018032057A1 (en) | 2016-08-19 | 2017-08-18 | Viral vaccines |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019107582A RU2019107582A (ru) | 2020-09-21 |
| RU2019107582A3 RU2019107582A3 (ru) | 2021-03-31 |
| RU2778312C2 true RU2778312C2 (ru) | 2022-08-17 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2811948C1 (ru) * | 2023-03-07 | 2024-01-19 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии имени Н.И. Вавилова | Инактивированная вакцина против бруцеллеза из штамма brucella abortus 82 на основе адъюванта биогидроксиапатита кальция для крупного рогатого скота |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010037402A1 (en) * | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
| WO2016086980A1 (en) * | 2014-12-02 | 2016-06-09 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Vaccine composition |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010037402A1 (en) * | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
| WO2016086980A1 (en) * | 2014-12-02 | 2016-06-09 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Vaccine composition |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GARCIA-ARRIAZA J et al. A Novel Poxvirus-Based Vaccine, MVA-CHIKV, Is Highly Immunogenic and Protects Mice against Chikungunya Infection. JOURNAL OF VIROLOGY, 2014, vol. 88, no. 6, p. 3527 - 3547. LAROCCA RA et al. Vaccine protection against Zika virus from Brazil. NATURE, 01.08.2016, vol. 536, no. 7617, p. 474 - 478. MUTHUMANI K et al. Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against Chikungunya virus. Vaccine, 2008, 26(40), р. 5128-34. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2811948C1 (ru) * | 2023-03-07 | 2024-01-19 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии имени Н.И. Вавилова | Инактивированная вакцина против бруцеллеза из штамма brucella abortus 82 на основе адъюванта биогидроксиапатита кальция для крупного рогатого скота |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3826055B2 (ja) | 組換えアビポックスウイルスによる免疫方法 | |
| JP7544399B2 (ja) | Ｃｏｖｉｄ－１９に対する保護のための弱毒化されたポックスウイルスベクターをベースとするワクチン | |
| US20210113684A1 (en) | Vector-based attenuated poxvirus vaccines | |
| JP2007105040A (ja) | 組換体ポックスウイルス−ネコ感染性腹膜炎ウイルス、その組成物およびそれらの製造および使用方法 | |
| JP2020039340A (ja) | ウイルスベクターの作製 | |
| RU2778312C2 (ru) | Вирусные вакцины | |
| US20230233670A1 (en) | A Recombinant Modified Vaccinia Virus (MVA) Vaccine Against Coronavirus Disease | |
| WO2007115385A2 (en) | Transfer plasmidic vector and recombinant canarypox virus | |
| Zanotto et al. | Construction of a recombinant avipoxvirus expressing the env gene of Zika virus as a novel putative preventive vaccine | |
| BR112019003181B1 (pt) | Composição para aumentar uma resposta imune em animal, método para induzir uma resposta imune protetora em um sujeito, e, uso da composição na preparação de um medicamento | |
| NO331305B1 (no) | Levende rekombinant leporipox-virus, dets anvendelse, samt vaksine omfattende viruset | |
| JP7240029B2 (ja) | フラビウイルスとリッサウイルスとのキメラワクチン | |
| Joshi | Development of Parapoxvirus ORFV Virus as a Vaccine Delivery Platform for Use in Swine | |
| WO2014185784A1 (en) | Vaccines for diseases caused by viruses of the family of reoviridae | |
| AU769221B2 (en) | Recombinant poxvirus-feline infectious peritonitis virus, compositions thereof and methods for making and using them | |
| Elahi | Recombinant adenovirus and fowlpox: new approach in bovine viral diarrhea virus vaccination | |
| Mutungi | Humoral immune responses against novel recombinant replication-competent poxvirus candidate vaccines expressing full length and chimeric lyssavirus glycoprotein genes | |
| IE60309B1 (en) | Recombinant viruses, vaccines containing them and in vitro cell cultures thereof |