TW202334434A - 對抗嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型之基於痘病毒的疫苗及使用該疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種重組痘病毒載體，其用於個體接種疫苗對抗SARS-CoV-2。本發明也提供一種使用該重組痘病毒載體的疫苗接種方案，該方案賦予對抗SARS-CoV-2的保護性免疫力。

Description

對抗嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型之基於痘病毒的疫苗及使用該疫苗的方法

相關申請案。本申請案依據35 U.S.C. §119主張在2021年7月21日提出申請之美國臨時申請案第63/224,212號的權益，該臨時申請案的全部內容以引用方式併入本文。

本發明涉及一種重組痘病毒載體，其用於個體接種疫苗對抗SARS-CoV-2。本發明也提供一種使用該重組痘病毒載體的疫苗接種方案，其賦予對抗SARS-CoV-2的保護性免疫力。

嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型（SARS-CoV-2），身為β冠狀病毒家族的一員，正造成全球大流行病，且截至2021年4月為止，已感染全世界超過1.4億人，並導致300萬人死亡（https://covid19.who.int/）（1、2）。相較其他兩種高致病力的冠狀病毒，SARS-CoV（3）及中東呼吸道症候群冠狀病毒（MERS-CoV）（4），已證明SARS-CoV-2更難以控制（5）。因此，迫切需要一種阻止SARS-CoV-2傳播的有效疫苗。

SARS-CoV-2是一種包膜單股正向RNA病毒，其病毒顆粒表面的棘突蛋白（S）媒介病毒進入靶細胞（6-8）。棘突蛋白具有S1及S2成分，且與其他1型病毒融合蛋白相似，S1次單元含有與其宿主細胞受體（血管收縮素轉化酶2，ACE2）結合的受體結合結構域（RBD）（9），而S2次單元媒介膜融合（10）。在細胞進入期間，一些SARS-CoV-2菌株的S蛋白需要被細胞絲胺酸蛋白酶（TMPRSS2）裂解（8、11）。來自恢復期患者的中和抗體可識別S蛋白，使其成為良好的疫苗標靶（12、13）。S蛋白也為T細胞對SARS-CoV-2反應的主要標靶（14、15）。儘管已使用mRNA技術（16-18）及腺病毒載體（19-21）開發若干SARS-CoV-2疫苗，但這些疫苗在預防病毒在人類之間傳播的功效仍有待充分確立。另外，疫苗接種後的不良反應已引起人們顧慮（22-24），這意味著有必要對現行可用的SARS-CoV-2疫苗進行改進，且需要持續的疫苗開發。

本發明至少部分基於對抗SARS-CoV-2的重組痘病毒載體的開發，用於個體接種疫苗。重組痘病毒載體成功地賦予對抗SARS-CoV-2的保護性免疫力，使用單一劑量或初免-加強注射（prime-boost）組合，至少包括誘發對抗SARS-CoV-2的中和抗體及T _H1偏向免疫反應及效應子記憶CD8+ T細胞反應，並減少由SARS-CoV-2感染引起的器官或組織損傷。

因此，在第一方面，本發明提供一種重組痘病毒載體，包含併入於痘病毒載體中編碼SARS-CoV-2棘突蛋白的多核苷酸，用於個體接種疫苗對抗SARS-CoV-2。

在一些具體實施例中，痘病毒載體為正痘病毒載體。

在一些具體實施例中，正痘病毒載體選自由駱駝痘病毒載體、牛痘病毒載體、猴痘病毒載體、天花病毒載體、及痘苗病毒載體組成的群組。

在一些具體實施例中，痘苗病毒載體為經修飾的疫苗安卡拉（MVA）或v-NY。

在一些具體實施例中，重組痘病毒載體缺乏功能性胸苷激酶基因。

在一些具體實施例中，多核苷酸可操作地連接到啟動子。

在一些具體實施例中，啟動子為痘病毒啟動子，例如，痘苗病毒早期及晚期雙重啟動子。

在一些具體實施例中，SARS-CoV-2棘突蛋白包含SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的胺基酸序列或其功能性變體。

在另一方面，本發明提供一種對抗SARS-CoV-2之免疫原性組合物，該組合物包含有效量的如本文所述之重組痘病毒載體，及生理學上可接受的載劑。

在一些具體實施例中，免疫原性組合物進一步包含佐劑。

也提供一種如本文所述的重組痘病毒載體或其免疫原性組合物之用途，其係用於製備用於個體接種疫苗對抗SARS-CoV-2的藥物。

本發明進一步提供一種用於個體接種疫苗對抗SARS-CoV-2之方法，其包含向個體施用有效量之如本文所述的重組痘病毒載體或其免疫原性組合物。

在一些具體實施例中，重組痘病毒載體或免疫原性組合物經由選自由肌內注射、皮下注射、鼻內施用、皮內注射、皮膚劃痕、及口服施用、以及其任意組合組成的群組的途徑施用。

在一些具體實施例中，重組痘病毒載體或免疫原性組合物向個體施用一次或多於一次。

在一些具體實施例中，本發明的方法包含第一次施用，隨後第二次施用重組痘病毒載體或免疫原性組合物。

在一些具體實施例中，第一次施用及第二次施用為肌內注射。

在一些具體實施例中，第一次施用為皮膚劃痕，且第二次施用為肌內注射。

在一些具體實施例中，第二次施用是在第一次施用後約4周。

在一些具體實施例中，在第一次施用及第二次施用中給予相同的劑量。

在一些具體實施例中，在第一次施用中給予較第二次施用中更高的劑量。

在一些具體實施例中，本發明的方法有效地誘發在個體中特異性對抗SARS-CoV-2的中和抗體及T _H1偏向免疫反應及效應子記憶CD8+ T細胞。

在一些具體實施例中，本發明的方法在個體中有效地減少由SARS-CoV-2感染引起的疾病或病況。

在一些具體實施例中，疾病或病況包括個體中器官或組織的損傷，該等器官或組織選自由肺、胃腸道、心臟、腎、肝、腎上腺、及/或睪丸組成的群組。

在一些具體實施例中，疾病或病況包括肺中的病理狀況，該病理狀況選自由瀰漫性鬱血、肺泡收縮、出血、免疫細胞浸潤、及其任意組合組成的群組。

在一些具體實施例中，重組痘病毒載體包含v-NY-S（寄存編號BCRC970077或CNCM I-5857）及/或MVA-S。

下面描述闡述本發明一或多個具體實施例的細節。本發明其他特徵或優點將從以下若干具體實施例的詳細描述以及所附申請專利範圍變得顯而易見。

下面的描述僅僅是為了說明本發明的各種具體實施例。因此，本文所討論的具體實施例或修飾不應解釋作對本發明的範圍的限制。對本發明所屬技術領域中具有通常知識者顯而易見的是，在不背離本發明的範圍的情況下可進行各種改變或等同替換。

為了清楚與容易理解本發明，首先定義某些用語。在整個詳細描述中闡述其他定義。除非另有定義，否則本文所用的所有技術及科學用語具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者一般理解的相同含義。

如本文所用，除非上下文另外明確指出，否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數指稱物件。因此，例如提及「一種組分」，其包括複數個該組分及本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的等同物。

「包含（comprise）」或「包含（comprising）」等詞大體上以包括/包括（include/including）的意義使用，其是指能存在一或多種特徵、成分或組分。「包含（comprise）」或「包含（comprising）」等詞涵蓋「由…組成（consists）」或「由…組成（consisting of）」等詞。

如本文所用，「核酸」或「多核苷酸」等詞可涉及由核苷酸單元組成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，諸如去氧核糖核酸（「DNA」）及核糖核酸（「RNA」），以及核酸類似物，其包括具有非天然存在的核苷酸的那些。可例如使用自動DNA合成儀來合成多核苷酸。應理解到，當核苷酸序列由DNA序列（即A、T、G、C）表示時，這也包括其中「U」取代「T」的RNA序列（即A、U、G、C）。「cDNA」乙詞涉及與mRNA互補或相同的單股或雙股形式的DNA。

如本文所用，「多肽」乙詞涉及經由肽鍵連接的胺基酸殘基組成的聚合物。「蛋白」乙詞通常涉及相對大的多肽。「肽」乙詞通常涉及相對短的多肽（例如含有高達100、90、70、50、30、20或10個胺基酸殘基）。

如本文所用，「編碼」乙詞涉及多核苷酸（例如基因、cDNA或mRNA）中特定核苷酸序列的天然性質，該多核苷酸用作生物過程合成其他聚合物及大分子的模板，其具有給定的RNA轉錄物（即rRNA、tRNA及mRNA）序列或給定的胺基酸序列以及由此產生的生物學特性。因此，若由基因生產的mRNA的轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中生產蛋白，則該基因編碼蛋白。如本文所用，「編碼序列」或「編碼」表現產物（諸如RNA或多肽）的序列是當表現時導致生產該RNA或多肽的核苷酸序列，即該核苷酸序列編碼該多肽的胺基酸序列。蛋白的編碼序列可包括起始密碼子（通常為ATG）及終止密碼子。本發明所屬技術領域中具有通常知識者應理解到，由於基因密碼的退化性，因此許多不同的多核苷酸及核酸可編碼相同的多肽。也應理解到，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可使用典型技術進行不影響由本文所述多核苷酸編碼的多肽序列的核苷酸取代，以反映其中待表現多肽的任何特定宿主有機體的密碼子使用。因此，除非另有說明，否則「編碼胺基酸序列的核苷酸序列」涵蓋彼此為退化的且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。

一般來說，多肽的功能性變體與參考序列基本上相同，例如當兩個序列比對時，胺基酸序列同一性超過80%，具體而言約85%到95%或更高，諸如至少約95%、96%、97%、98%、99%或更高。為了判定兩個序列的同一性百分比，可比對序列以獲得最佳比較目的。在計算同一性百分比時，通常會計算完全匹配。可使用本領域已知的數學演算法（諸如BLAST及Gapped BLAST程式、NBLAST及XBLAST程式、或ALIGN程式）來判定兩個序列之間的同源性或同一性百分比。

SARS-CoV-2棘突蛋白為SARS-CoV-2病毒顆粒膜的特徵性結構成分，其在病毒表面形成大的突出棘突蛋白。其含有S1及S2次單元，其中S1次單元含有結合作為SARS-CoV-2的宿主細胞受體的血管收縮素轉化酶2（ACE2）的受體結合結構域（RBD），而S2次單元媒介膜融合。在一個具體實施例中，本文所述的SARS-CoV-2棘突蛋白包括來自武漢-Hu-1變體的SARS-CoV-2棘突蛋白（SEQ ID NO: 1；YP009724390.1）。在其他具體實施例中，本文所述的SARS-CoV-2棘突蛋白包括來自某些變體的那些，包括但不限於α變體（B.1.1.7）（SEQ ID NO: 2；QWB50088.1）、β變體（B.1.351）（SEQ ID NO: 3；QWA53303.1）、γ變體（P.1）（SEQ ID NO: 4；QWB58007.1）、以及δ變體（B.1.617.2）（SEQ ID NO: 5；QWB15066.1）。

「重組」乙詞用於描述具有非天然連接在一起的序列的多核苷酸或核酸。重組核酸可用構築體的形式存在。本文所用的「構造」乙詞可能含有給定感興趣的核苷酸序列，以及表現該感興趣的核苷酸序列所需的一些序列，諸如調節序列。構築體可用於表現給定的核苷酸序列或維持給定的核苷酸序列，以便對其複製、操控或在不同位置之間（例如在不同有機體之間）轉移。可使構築體引入合適的宿主細胞用於上述目的。通常，在構築體中，給定的核苷酸序列可操作地連接到調節序列，使得當構築體引入宿主細胞時，給定的核苷酸序列可在調節序列的控制下在宿主細胞中表現。調節序列可包含，例如但不限於，啟動子序列、起始密碼子、複製起點、強化子、操縱子序列、分泌訊號序列、以及其他控制序列（例如終止序列）。較佳地，構築體可進一步含有用於隨後篩選步驟的標記序列（例如抗生素抗性標記序列）。

「病毒載體」為包含病毒序列的核酸分子，其可被包裝到病毒顆粒中，並能夠使外來核酸引入個體的細胞中。本文所用的「重組病毒載體」涉及包含病毒基因體及異源多核苷酸（例如編碼外來蛋白）的重組病毒構築體。「重組」乙詞可包括對於其天然形式或結構的多核苷酸或蛋白的任何修飾、改變或改造。多核苷酸或蛋白的修飾、改變或改造可包括但不限於：一或多個核苷酸或胺基酸的缺失、整個基因的缺失、基因的密碼子最佳化、胺基酸的保守取代、以及一或多個異源多核苷酸的插入。如本文所用，「痘病毒載體」乙詞涉及來自痘病毒科的病毒成員的病毒載體。痘病毒科的特徵在於雙股DNA的基因體。較佳地，痘病毒載體屬於正痘病毒載體，且選自由駱駝痘病毒載體、牛痘病毒載體、猴痘病毒載體、天花病毒載體、及痘苗病毒載體組成的群組。痘苗病毒已在全世界成功地用於根除天花（25、26）。痘苗病毒載體的一個實例為經修飾的痘苗安卡拉（MVA）。MVA菌株在哺乳動物細胞中生長受限，且臨床前與臨床試驗已證明其為對抗病毒性疾病（諸如HIV、MERS-CoV及SARS-CoV）的相當安全的疫苗載體（27-30）。或者，v-NY菌株為有複製能力的病毒，其衍生自紐約市衛生局病毒菌株天花疫苗，與標準天花疫苗（Dryvax®）相比表現出較低的毒力。v-NY菌株已被描述為構築重組痘苗病毒的載體，例如在澳洲專利號AU608205B2中，其相關揭示出於本文引用的目的或主題在此引入併入本文。

如本文所用，「免疫原性組合物」乙詞涉及當對個體施用時能夠誘發免疫反應（諸如抗體或細胞免疫反應）的組合物。在判定感興趣的抗原或免疫源的免疫活性方面，本發明所述技術領域中具有通常知識者可藉由典型檢驗來判定免疫原性反應。較佳地，免疫原性組合物被配製為可預防、改善、減輕或消除個體的疾病/感染的疫苗。

本發明至少部分基於包含編碼SARS-CoV-2棘突蛋白的多核苷酸的重組痘病毒載體的開發，該載體用於個體接種疫苗對抗SARS-CoV-2。令人驚訝地發現，這種重組痘病毒載體賦予對抗SARS-CoV-2的保護性免疫力。具體而言，如本文所述的重組痘病毒載體包含痘病毒基因體序列，其具有啟動子以及可操作地連接到編碼SARS-CoV-2棘突蛋白的該啟動子的異源多核苷酸。

根據本發明的重組痘病毒載體可藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何技術製備。具體而言，其可藉由痘病毒和質體之間的同源重組來製備，該質體尤其攜帶編碼SARS-CoV-2棘突蛋白的多核苷酸。在感染該病毒並使質體轉染到合適的細胞株中後發生同源重組。

在某些具體實施例中，如本文所述的重組痘病毒載體為編碼SARS-CoV-2棘突蛋白的重組MVA載體（MVA-S）。

在某些具體實施例中，如本文所述的重組痘病毒載體為編碼SARS-CoV-2棘突蛋白的重組v-NY載體（v-NY-S）（2021年7月14日寄存在台灣新竹市的財團法人食品工業發展研究所（FIRDI），登記號：BCRC970077；且2022年7月13日寄存在法國巴黎的國立微生物培養寄存中心（CNCM），登記號：CNCM I-5857）。

對於施用，有效量的重組痘病毒載體可與生理學上可接受的載體一起配製成用於傳遞及吸收目的之合適形式組合物。較佳地，有效量的重組痘病毒載體配製為免疫原性組合物，其誘發一或多個對抗SARS-CoV-2的免疫反應。如本文所用，「生理學上可接受的」是指載體與組合物中的活性成分相容，且較佳可穩定該活性成分並對接受個體是安全的。這種生理學上可接受的載體在本領域是眾所周知的。在一些具體實施例中，經純化的病毒載體被配製並作為無菌溶液施用，同時也可利用凍乾製劑。無菌溶液可凍乾或填充到藥物劑量容器中。溶液的pH大體上在pH 3.0到9.5，例如pH 5.0到7.5的範圍內。病毒載體通常在具有合適的醫藥上可接受的緩衝液的溶液中。在某些具體實施例中，病毒載體可被配製成可注入式製劑。這些配方含有有效量的病毒載體，為無菌液體溶液、液體懸浮液或凍乾形式，且任選地含有穩定劑或賦形劑。病毒載體疫苗也可被霧化用於鼻內施用。

本文所用的「有效量」乙詞涉及在治療的個體或細胞中賦予所欲生物效應的活性成分的量。有效量可根據各種原因而改變，諸如施用途徑及頻率、接受該藥品的個體的體重及種類、以及施用目的。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可基於本文的揭示內容、已建立的方法、及其自身經驗來判定每種情況下的劑量。在一些具體實施例中，本文所用的有效量可為有效誘發對抗SARS-CoV-2的保護性免疫力的量，諸如誘發對抗SARS-CoV-2的體液及/或中和抗體及/或T _H1偏向免疫反應及效應子記憶CD8+ T細胞反應，並減少由SARS-CoV-2感染引起的器官或組織損傷。特定而言，如本文所述的重組痘病毒載體或其組合物可用每劑約至少約10 ⁵pfu到約10 ⁹pfu，舉例約10 ⁶pfu到約10 ⁸pfu，例如每劑約10 ⁷pfu的量施用於個體或感染或轉染到細胞中。

在某些具體實施例中，包含病毒載體的組合物可進一步包含一或多個佐劑。「佐劑」及「免疫刺激劑」等詞可互換使用，並定義為一或多個引起免疫系統刺激的物質。在某些具體實施例中，本發明的組合物包含鋁作為佐劑，例如以氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鋁鉀或其組合的形式呈現。一個實例為氫氧化鋁濕凝膠懸浮液，諸如2% Alhydrogel（Invitrogen公司）。

可使用標準施用途徑進行重組痘病毒載體及其組合物的施用。示例性施用包括肌內注射、皮下注射、鼻內施用、皮內注射、皮膚劃痕及口服施用。

例如，可使根據本發明的重組痘病毒載體以單劑量或初免注射（第一次施用）及加強注射（第二次施用）施用於個體。初免注射和加強注射之間的時間段大體上為1周、2周、4周、6周或8周，較佳為4周或8周。也可進行一次以上的加強注射，其中後續加強注射在前次加強注射後2周、4周、6周、8周或12周施用。較佳地，兩個加強注射之間的間隔為4周、8周或12周。

在一些具體實施例中，重組痘病毒載體或免疫原性組合物向個體施用一次或多於一次，諸如兩次、三次、四次、五次、六次或更多次。

在一些具體實施例中，本發明的方法包含第一次（初免注射）施用，隨後第二次（加強注射）施用重組痘病毒載體或免疫原性組合物。加強注射施用可根據需要進行額外的加強注射施用。

在一些具體實施例中，第一次施用及第二次施用為肌內注射。

在一些具體實施例中，第一次施用為皮膚劃痕，且第二次施用為肌內注射。

在一些具體實施例中，第二次施用是在第一次施用後約4周。

在一些具體實施例中，在第一次施用及第二次施用中給予相同的劑量。

在一些具體實施例中，在第一次施用中給予較第二次施用中更高的劑量。例如，第一次施用的劑量為第二次施用的劑量的約為1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或10倍。

在一些具體實施例中，在第一次施用中給予的重組痘病毒載體與在第二次施用中給予的重組痘病毒載體是相同或不同的。

在一些具體實施例中，所用的重組痘病毒載體包括MVA-S及/或v-NY-S。

在一些具體實施例中，首先施用有效量的v-NY-S，並隨後施用有效量的MVA-S。在某些實例中，初免注射施用時v-NY-S的劑量高於加強注射施用時MVA-S的劑量。例如，v-NY-S的劑量約為MVA-S的劑量的5倍。在一些具體實施例中，在第一次施用中經由皮膚劃痕給予v-NY-S，並在第二次施用中經由肌內注射給予MVA-S。

藉由本文所述方法治療的個體可為哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物包括但不限於農場動物、運動動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠、及大鼠。需要治療的人類個體可為患有、有風險患有、或懷疑患有目標疾病/病症（具體而言為SARS-CoV-2感染症）的人類患者。

藉由以下實施例進一步說明本發明，提供這些實施例是為了說明而非限制。根據本文揭示，本發明所屬技術領域中具有通常知識者應當理解，可在所揭示的特定具體實施例中進行許多改變，且在不脫離本發明精神及範圍下仍可獲得相同或相似結果。

實施例

痘苗病毒已在全世界成功地用於根除天花（25、26）。在此，吾人使用MVA菌株以及v-NY菌株生成SARS-CoV-2疫苗，該v-NY菌株先前被用作FDA核准臨床試驗中使用的第一重組痘苗病毒（HIVAC-1e）（44-48），吾人將此兩種菌株改造以表現SARS-CoV-2 S蛋白。不同於MVA，v-NY菌株為有複製能力的病毒，其衍生自紐約市衛生局病毒菌株天花疫苗（44-47），與標準天花疫苗（Dryvax®）相比表現出較低的毒力。由於這兩種痘苗病毒菌株的不同特徵，吾人測試兩種疫苗的不同初免-加強注射組合，以建立在C57BL/6小鼠中免疫活化的有效方案。吾人最終選擇兩個初免-加強注射方案。第一個方案為在倉鼠中肌內初免注射5x10 ⁷PFU的MVA-S病毒，等待四周，並以10 ⁷PFU的MVA-S病毒肌內加強注射這些經初免注射的動物。第二個方案為使用皮膚劃痕使10 ⁷PFU（或5x10 ⁷PFU）的v-NY-S引入倉鼠，等待四週，接著以10 ⁷PFU的MVA-S病毒肌內加強注射這些經初免注射的動物。加強注射後兩周，用SARS-CoV-2病毒以1x10 ⁵TCID ₅₀劑量激發這些經疫苗接種的倉鼠並測量動物的體重，且在感染後（p.i.）3天判定肺中的SARS-CoV-2病毒力價。另外，吾人證明吾人的疫苗接種方案在小鼠中生成抗體及T細胞反應，並保護敘利亞倉鼠免於受SARS-CoV-2感染。

1. 材料及方法

1.1 化學品、細胞、病毒及動物

使用以下抗體：SARS-CoV-2抗RBD抗體（40592-T62，Sino Biological）；SARS-CoV-2抗棘突蛋白S2小鼠mAb（GTX632604，GeneTex）；兔單株抗SARS-CoV/SARS-CoV-2核殼蛋白（NP）抗體（40143-R001，Sino Biological）；FITC共軛的山羊抗兔IgG Ab（F1262，Sigma）；HRP山羊抗小鼠IgG Ab（31430，Pierce Biotechnology）；HRP山羊抗倉鼠IgG Ab（PA1-28823，Invitrogen）；Cy5-山羊抗小鼠IgG Ab（115-175-146，Jackson ImmunoResearch）；FITC-山羊抗倉鼠IgG Ab（11-4211-85，eBioscience）；HRP共軛的IgG2C（PAI-29288，Invitrogen）；HRP共軛的IgG1（PAI-74421，Invitrogen）及抗CD3-PE/Cyanine7（#100220，BioLegend）、抗CD4-FITC（#100510，BioLegend）、抗CD8-Pacific blue（#100725，BioLegend）、抗CD44-PE（#103008，Biolegend）、以及抗CD62L-APC（#104412，Biolegend）。

使BSC40細胞在補充有10%胎牛血清（FBS）（Gibco）及1%青黴素-鏈黴菌蛋白（PS）（Gibco）的DMEM中培養。使BHK21細胞在補充有10% FBS及1% PS的RPMI培養基中培養。使HuTK-143細胞在補充有10% FBS及1% PS的MEM培養基中培養。如前所述，痘苗病毒的v-NY菌株在BSC40或HuTK-143細胞上生長（69-74）。痘苗病毒的MVA菌株（VR-1508，ATCC）在BHK21細胞上生長。SARS-CoV-2 TCDC#4（hCoV-19/台灣/4/2020）為局部分離株且其在Vero-E6細胞上繁殖。八周齡雌性C57BL/6小鼠（Charles River菌株）購自台灣BioLASCO公司。八周齡雄性及雌性敘利亞倉鼠（Mesocricetus auratus）購自台灣國家實驗動物中心。所有動物方案均獲得中央研究院實驗動物照護及使用委員會的核准，並嚴格按照台灣國家研究委員會關於動物使用及照護的指南進行。

1.2 重組痘苗病毒的構築

為了生成表現SARS-CoV-2 S蛋白（NCBI參考序列NC_045512）的重組痘苗病毒，使編碼全長SARS-CoV-2 S蛋白的人類密碼子最佳化的開放閱讀框（ORF）插入pSC11質體，並在早期及晚期p7.5k啟動子的調控下獲得pSC11-S質體（75）。使pSC11-S質體轉染到以野生型v-NY病毒菌株感染的HuTK-143細胞。接著收集溶胞產物，用於在25 μg/ml 5-溴-2’-去氧尿苷（BrdU）的存在下在HuTK-143上對命名為v-NY-S的重組病毒進行多輪溶菌斑純化，如前所述（73）。除了使用BHK21細胞及在X-gal（150 g/ml）存在下進行溶菌斑純化外，如對v-NY-S所述生成表現SARS-CoV-2 S蛋白的重組MVA菌株（MVA-S）。MVA-S及v-NY-S隨後在滾瓶中擴增，且使用36%蔗糖梯度來部分純化病毒原液並在使用前滴定，如前所述（76）。

1.3 細胞表面 S 蛋白的免疫螢光染色

BHK21及BSC40細胞分別以MVA-S或v-NY-S用5 PFU/細胞的感染複數（MOI）感染1小時，以PBS洗滌，接著在生長培養基中再培養12小時。然後以PBS洗滌細胞，並以4%三聚甲醛固定，接著以SARS-CoV-2抗RBD抗體（40592-T62）在室溫下以1:500的稀釋度免疫染色1小時。接著，以PBS洗滌細胞，並在室溫下以二級抗體FITC共軛的山羊抗兔IgG Ab（F1262，1:500稀釋）染色1小時，隨後以DAPI（5 μg/ml，D21490，Molecular Probe）染色5分鐘，並以Vectashield封片溶液（H-1000，Vector Laboratories）封片。如前所述，使用具有63x物鏡的Zeiss LSM 710共軛焦顯微鏡拍攝影像（77）。

1.4 小鼠及倉鼠的初免 - 加強注射免疫方案

在疫苗接種實驗之前，八周齡雌性C57BL/6小鼠以及八周齡雄性與雌性敘利亞倉鼠在台灣台北中央研究院的動物實驗室中圈養至少3天。吾人使用兩種劑量初免/加強注射免疫的三個方案（圖2A中所示）：（1）MVA/MVA：以5x10 ⁷PFU/動物的劑量使MVS-S肌內接種在右後肢，接著在4周後以1x10 ⁷PFU/動物的劑量肌內加強注射MVA-S病毒；（2）vNY1/MVA：以1x10 ⁷PFU/動物的劑量進行v-NY-S的尾巴劃痕（t.s），接著在4周後以1x10 ⁷PFU/動物的劑量肌內加強注射MVA-S病毒到右後肢中；以及（3）vNY5/MVA：以5x10 ⁷PFU/動物的劑量進行v-NY-S的尾巴劃痕，接著在4周後以1x10 ⁷PFU/動物的劑量肌內加強注射MVA-S病毒到右後肢中。作為免疫對照組，PBS緩衝液用作初免注射及加強注射的安慰劑疫苗。如前所述，在初免注射後4周及加強注射後2周，從免疫小鼠的臉頰及倉鼠的牙齦靜脈收集血液（78、79）。從血液製備血清，並在-80℃下保存直至使用。

1.5 免疫墨點法

為了測量感染重組病毒的細胞中的SARS-CoV-2 S蛋白表現，分別以v-NY-S及MVA-S，用5 PFU/細胞的MOI感染BSC40及BHK21細胞（5x10 ⁵），並在細胞收集前培養12小時。以樣品緩衝液溶解細胞，並藉由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白。接著使用濕轉移設備（Bio-Rad）使蛋白轉移到硝化纖維素膜（BioRad）。使膜在室溫下在5%脫脂乳溶液中封閉1小時，並在4℃下與SARS-CoV-2棘突蛋白S2小鼠mAb（GTX632604，1:1000稀釋）培養隔夜。接著以PBST（含有0.1% Tween-20的PBS）洗滌印漬3次，在室溫下與HRP山羊抗小鼠IgG Ab（31430，1:20,000）培養1小時，並根據製造商的方案使用Western Lightening Enhanced Chemiluminescence試劑盒（PerkinElmer）顯影。

為了測試免疫小鼠及倉鼠血清對SARS-CoV-2棘突蛋白的反應性，在HEK 293細胞中表現殘基14到1209的棘突蛋白的細胞外結構域（其由S1及S2組成，但並無跨膜結構域），並隨後純化。經純化的棘突蛋白含有人類複合型聚醣，並在SDS-PAGE（單體）上以表觀分子量170到235 kDa之間的三聚體存在於溶液中，且在Superose 6粒徑篩析層析法上以~600 kDa（三聚體）存在。經純化的棘突蛋白（20 ng/孔）藉由SDS-PAGE分離，轉移到硝化纖維素膜，並在室溫下在5%脫脂乳溶液中封閉，如上所述。使膜分成多個條帶，並使每個條帶在4℃下與從免疫小鼠（1:100稀釋）或倉鼠（1:50）收集的個體血清培養隔夜。接著以PBST洗滌這些印漬3次，在室溫下與HRP山羊抗小鼠抗體（31430，1:20,000）或HRP山羊抗倉鼠（PA1-28823，1:5,000）抗體培養1小時，隨後根據製造商的方案使用Western Lightning Enhanced Chemiluminescence試劑盒（PerkinElmer）顯影。

1.6 細胞表面 SARS-CoV-2 S 蛋白表現的流式細胞術分析

為了偵測感染MVA-S或v-NY-S的細胞表面上的棘突蛋白表現，分別以v-NY-S及MVA-S，用在5 PFU/細胞的MOI下感染BSC40及BHK21細胞（5x10 ⁵）並培養12小時，接著經由PBS中的2 mM EDTA處理而分離。細胞與SARS-CoV-2抗RBD抗體（40592-T62，1:500）在4℃下培養1小時。接著以FACS緩衝液（含有2% FBS的PBS）洗滌細胞，以FITC共軛的山羊抗兔IgG Ab（F1262，1:500）在4℃下染色1小時，以FACS緩衝液洗滌，並藉由流式細胞術（BD LSR-II，BD Biosciences）分析。

為了偵測免疫小鼠及倉鼠血清中的抗棘突蛋白抗體，以野生型桿狀病毒（WT-BAC）或重組桿菌病毒（S-BAC）感染SF9昆蟲細胞，該重組桿菌病毒表現嵌合SARS-CoV-2 S-gp64蛋白，其中S蛋白的跨膜及C-末端區域被桿狀病毒GP64的跨膜及C-末端區域替代，使得S-gp64融合蛋白在昆蟲細胞表面上表現。使這些細胞培養48小時，接著在冰上與FACS緩衝液中的小鼠（1:100稀釋）或倉鼠（1:20稀釋）血清培養1小時。以FACS緩衝液洗滌兩次後，使細胞與Cy5-山羊抗小鼠IgG Ab（115-175-146，1:500）或FITC-山羊抗倉鼠IgG Ab（11-4211-85，1:100）在冰上培養30分鐘，洗滌兩次，再懸浮在含有碘化丙啶的FACS緩衝液中，接著藉由流式細胞術（BD LSR-II）分析。

1.7 假病毒中和檢驗

由台灣台北中央研究院的國立RNA技術平台與基因操控核心設施生成並滴定以SARS-CoV-2 S蛋白假型化的慢病毒載體。如前所述，假型化病毒的中和檢驗是藉由相同的核心設施所進行（80），但稍加修改。簡言之，使1,000單位的具有SARS-CoV-2 S蛋白的假型化慢病毒與連續稀釋的從接種動物獲得的血清在37℃下培養1小時。接著使混合物加入到表現人類ACE2受體的HEK-293T細胞（96孔盤的10 ⁴細胞/孔），並在37℃下培養24小時。接著以100 μl新鮮DMEM加10% FBS替代此細胞培養物，並在進行螢光素酶檢驗之前使細胞再培養48小時。藉由測量螢光素酶強度來評估病毒感染抑制50%所需的血清稀釋度的倒數（ND ₅₀）。

1.8  SARS-CoV-2 中和檢驗

使來自免疫小鼠或倉鼠的連續稀釋抗體在37℃下與100 TCID ₅₀SARS-CoV-2 TCDC#4（hCoV-19/台灣/4/2020）培養1小時。接著使混合物加入到預先接種的Vero E6細胞，培養4天。以10%甲醛固定細胞，並以0.5%結晶紫染色20分鐘。以自來水洗滌培養盤，並記錄感染。根據Reed & Muench方法計算50%保護力價（81）。

1.9  SARS-CoV-2 S 特異性抗體的免疫球蛋白 ELISA

如前所述進行免疫球蛋白ELISA（17），但進行一些修改。使重組SARS-CoV-2 S蛋白（10 ng/孔）塗覆到96孔盤（Costar檢驗盤，Corning，3369）上，在4℃下進行24小時。接著以PBST洗滌培養盤，並以1% BSA的PBS溶液封閉1小時，隨後以PBST洗滌。經塗覆的培養盤與已在含有1% BSA的PBS中進行系列稀釋的血清在室溫下培養1小時，接著以PBST洗滌，並與HRP共軛的IgG2C（PA1-29288，1:15000）或HRP共軛的IgG1（PA1-74421，1:6000）二級抗體在室溫下培養1小時。以5x PBST洗滌培養盤，並與市售TMB基質培養以進行顯色（Clinical Science Products公司）。為了終止反應，加入2N H ₂SO ₄，並使用ELISA讀取儀在450 nm的光密度下讀取培養盤。如前所述，終點力價的計算為血清稀釋物發出的光密度（O.D）大於背景濃度（僅有二級抗體）的四倍（17）。

1.10 小鼠脾細胞的 ELISpot 檢驗

基本上如前所述進行ELISpot檢驗，監測以SARS-CoV-2棘突肽池刺激的脾細胞中的細胞激素程度（82、83）。簡言之，在疫苗加強注射後四周從免疫小鼠收集脾臟。吾人在100 μl培養基（RPMI + 10% FBS + 1% PS）中使4x10 ⁵脾細胞與1 μg/ml濃度的SARS-CoV-2 S蛋白序列的肽池（Miltenyi Biotech，130-126-700）混合，接著在預先塗覆IFN-γ（3321-4AST-2）、IL-2（3441-4APW-2）、IL-4（3311-4APW-2）、IL-6（3361-4APW-2）或TNF-α（3511-4APW-2）的ELISpot培養盤（MABTECH）中在37℃下培養24小時。接著以5x PBS洗滌細胞，且根據製造商的方案顯影ELIspot，並使用AID vSpot機器定量。

1.11      T 效應子記憶（ Tem ）細胞的分析

如前所述，對Tem細胞進行流式細胞術分析（16），但稍加修改。在疫苗加強注射後四周從免疫小鼠分離脾細胞。在以氯化銨鉀（ACK）溶解緩衝液消耗紅血球後，在37℃下以1 μg/ml的SARS-CoV-2棘突蛋白特異性肽池（Miltenyi Biotech，130-126-700）在培養基（RPMI + 10% FBS + 1% PS）中刺激脾細胞2小時。隨後以FACS緩衝液洗滌細胞兩次，接著在冰上與包括抗CD3-PE/Cyanine7、抗CD4-FITC、抗CD8-Pacific blue、抗CD44-PE、以及抗CD62L-APC的抗體混合物培養15分鐘。接著，細胞進行螢光活化的細胞分類（FACS），由此首先從總脾細胞中圈選CD4 ⁺或CD8 ⁺次族群，隨後進一步圈選CD44 ⁺CD62L ^-作為Tem細胞。以eFluor 506存活力染料（eBioscience）對死細胞染色。使用BD LSR II（BD Biosciences）流式細胞儀獲取細胞，並使用FlowJo 8.7軟體進行數據分析。

1.12 敘利亞倉鼠激發實驗

根據上述三個初免-加強注射疫苗接種方案之一對敘利亞倉鼠進行免疫，以Zoletil-50（50 mg/kg）麻醉，接著以125 μl體積的1x10 ⁵PFU SARS-CoV-2 TCDC#4（hCoV-19/台灣/4/2020，GISAID登錄號：EPI_ISL_411927）（批號：IBMS20200819，8x10 ⁵PFU/ml）鼻內激發。所有動物在SARS-CoV-2激發之後每天稱重。在感染後3天及7天（感染後天數，d.p.i.），收集肺用於SARS-CoV-2病毒力價判定、病毒RNA定量、以及組織病理學檢查。使用雙尾未配對學生t檢定對動物實驗組之間的體重差異進行統計學分析。

1.13 藉由細胞培養感染檢驗定量肺組織中的病毒力價

使用均質機使在以SARS-CoV-2激發後3天及7天倉鼠的中、下及後腔葉，在4 ml含有2% FBS及1% PS的DMEM中進行均勻化。使組織均質物以15,000 rpm離心5分鐘，並收集上清液用於活病毒滴定。簡言之，使各樣品的10倍連續稀釋液一式四份加入Vero E6細胞單層上並培養4天。接著以10%甲醛固定細胞，並以0.5%結晶紫染色20分鐘。以自來水洗滌培養盤，並記錄感染。根據Reed & Muench方法（81）計算50%的組織培養感染劑量(TCID ₅₀)/ml。

1.14 用於 SARS-CoV-2 RNA 定量的即時 RT-PCR

為了測量SARS-CoV-2的RNA程度，使用靶向SARS-CoV-2包膜（E）基因的第26,141到26,253位核苷酸的特異性引體進行即時RT-PCR，如前所述（84），使用前置引子E-Sarbeco-F1(5’-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3’)（SEQ ID NO: 6），反置引子E-Sarbeco-R2(5’-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’)（SEQ ID NO: 7）、探針E-Sarbeco-P1(5’-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ-3’)（SEQ ID NO: 8）。使用RNeasy Mini試劑盒（QIAGEN，德國），根據製造商的操作說明，從每個樣品中收集總共30 μl RNA溶液。使RNA樣品（5 μl）加入到Superscript III一步法RT-PCR系統與Platinum Taq Polymerase（Thermo Fisher Scientific，美國）的總共25 μl混合物。最終反應混合物含有400 nm的前置及反置引子、200 nM探針、1.6 mM去氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、4 mM硫酸鎂、50 nM ROX參考染料、以及1 μl酶混合物。使用一步法PCR方案進行循環條件：在55℃下10分鐘合成第一股cDNA，接著在94℃下3分鐘，以及在94℃下15秒和58℃下30秒進行45個擴增循環。使用Applied Biosystems 7500即時PCR系統（Thermo Fisher Scientific）評估數據。合成的113個鹼基對的寡核苷酸片段用作qPCR標準以估計病毒基因體的拷貝數。寡核苷酸由Genomics BioSci & Tech公司（台北，台灣）合成。

1.15 組織病理學

在以SARS-CoV-2激發後3天及7天，取出每個倉鼠的左肺，並在4%三聚甲醛中固定1周。接著使肺樣品包埋、切片，並以蘇木精及伊紅（H&E）染色，隨後進行顯微鏡檢查。以單株兔抗SARS-CoV/SARS-CoV-2核殼蛋白（NP）抗體（1:1000，40143-R001，Sino Biological）進行免疫組織化學染色，隨後與Dako EnVision ^TM+ System HRP培養。隨後加入3,3’-二胺基聯苯胺（DAB）產生褐色訊號，並以蘇木精複染。使用具有4x及20x物鏡的Zeiss Axioimager-Z1顯微鏡拍攝影像。

1.16 統計學分析

使用Prism（第9版）軟體（GraphPad）中的學生t檢定進行統計學分析。統計學顯著性表示為 P值， P值小於0.05被認為是顯著的。

2. 結果

吾人生成表現SARS-CoV-2棘突蛋白的兩種不同的重組痘苗病毒株。v-NY-S病毒（BCRC970077）在哺乳動物細胞中具有複製能力，而MVA-S菌株則為複製受限的。吾人在小鼠中建立三個具有不同的初免-加強注射組合的疫苗接種方案，並示出所有三個方案均生成阻斷SARS-CoV-2感染的高力價的中和抗體。這些疫苗接種方案也生成T _H1偏向免疫反應及效應子記憶CD8+ T細胞。最後，當隨後以SARS-CoV-2病毒激發時，這些疫苗接種方案保護敘利亞倉鼠。

2.1 表現全長 SARS-CoV-2 S 蛋白的重組 v-NY-S 及 MVA-S 病毒的生成。

藉由使編碼全長SARS-CoV-2 S蛋白（NC_0455512）的ORF分別插入痘苗病毒株MVA及v-NY的 tk基因座中，生成重組痘苗病毒MVA-S及v-NY-S（圖1A）。如藉由流式細胞術（圖1B）及免疫螢光顯微術（圖1C）分析所揭示的，以MVA-S及v-NY-S感染的細胞在細胞表面上表現高程度的SARS-CoV-2 S蛋白。在免疫墨點法中偵測到S蛋白的全長及加工形式（圖1D），證實MVA-S及v-NY-S病毒穩定表現及加工SARS-CoV-2 S蛋白。

2.2  v-NY-S 及 MVA-S 初免 - 加強注射疫苗接種方案在免疫的 C57BL/6 小鼠中生成中和抗體。

吾人設計三個MVA-S及v-NY-S病毒的初免-加強注射疫苗接種方案（圖2A）。對照組小鼠單獨以PBS緩衝液進行初免注射及加強注射。對於第一個方案（MVA/MVA），以5x10 ⁷PFU/動物的劑量的MVA-S病毒肌內初免注射小鼠，並以1x10 ⁷PFU/動物的劑量的MVA-S加強注射。對於第二個方案（v-NY1/MVA），藉由尾巴劃痕以1x10 ⁷PFU/動物的劑量用v-NY-S初免注射小鼠，接著以1x10 ⁷PFU/動物的劑量的MVA-S肌內加強注射。對於第三個方案（v-NY5/MVA），藉由尾巴劃痕以更高力價的5x10 ⁷PFU/小鼠的劑量用v-NY-S初免注射小鼠，接著以1x10 ⁷PFU/動物的劑量的MVA-S肌內加強注射。對於每個方案，在第0天初免注射小鼠，並在4周後收集初級（1°）血清。接著使這些小鼠休眠3天，加強注射，接著在2周後抽取二次（2°）血清。在一些實驗中，在加強注射後4周後收集脾臟用於T細胞及細胞激素分析。疫苗接種小鼠的尾巴劃痕部位癒合良好，且小鼠保持健康，無任何體重損失（圖8）。從小鼠收集1°及2°血清，且流式細胞術揭示其識別從重組S-BAC桿狀病毒表現的SARS-CoV-2 S蛋白（圖2B）。定量（圖2C）證實初次免疫後特異性生成抗棘突蛋白抗體，且疫苗加強注射後抗體力價顯著增強。與以MVA-S初免注射的小鼠相比，以v-NY-S初免注射的小鼠呈現更高程度的抗棘突蛋白抗體（圖2C）。免疫墨點分析（圖1D）也揭示對重組S蛋白的抗棘突蛋白抗體反應性，與吾人的FACS數據一致（圖2C）。吾人使用假型化SARS-CoV-2感染系統（圖2E，圖i）及SARS-CoV-2病毒感染系統（圖2E，圖ii）來測試2°血清的中和活性。中和活性表示為病毒感染抑制50%所需的血清稀釋度的倒數（ND ₅₀）。吾人的結果示出，所有三個方案都成功地生成抑制SARS-CoV-2 S蛋白媒介的病毒進入兩個感染系統的高力價的中和抗體。最後，吾人藉由比較在MVA/MVA及vNY1/MVA方案後0.5個月及4.5個月收集的小鼠血清，來測試吾人的初免-加強注射疫苗接種方案是否誘發抗體反應。如FACS分析所揭示（圖2F），加強注射後4.5個月取得的血清仍然含有60到80%的棘突特異性抗體，且假型化SARS-CoV-2病毒感染檢驗證明其在0.5個月時保留對血清相當的中和活性（圖2G），表明這兩個疫苗接種方案可引起長期的抗棘突蛋白抗體反應，這些抗體反應已證明與對抗SARS-CoV-2的保護相關。

2.3  v-NY-S 及 MVA-S 免疫在小鼠中生成 T _H1 偏向免疫反應。

產生IFN-γ的T _H1細胞促進B細胞類別轉換為IgG2a/IgG2c，而產生IL-4的T _H2細胞則促進類別轉換為IgG1（49、50）。因此，IgG2c（或IgG2a）與IgG1＞1的比率為T _H1偏向免疫反應的良好指示，這對於病原體清除是重要的。因此，吾人使用ELISA來測量疫苗接種方案後收集的C57BL/6小鼠血清中抗棘突蛋白抗體的IgG2c及IgG1同型的程度（圖3A）。所有三個疫苗接種方案均誘發產生IgG2c及IgG1同型（圖3A），且IgG2c/IgG1比率＞1（圖3B），表明其已引發T _H1偏向免疫反應。吾人進一步在體外刺激來自疫苗接種SARS-CoV-2棘突肽池的小鼠的脾細胞，接著計算分泌T _H1細胞激素（IL-2、IFN-γ及TNF-α）以及T _H2細胞激素（IL-4及IL-6）的細胞數目（圖3C）（51、52）。一致地，吾人發現更多的細胞分泌TNF-α及IFN-γ而非IL-4及IL-6，這支持吾人的三個疫苗接種方案觸發T _H1偏向反應。另外，吾人研究吾人的免疫方案是否生成T效應子記憶（Tem）細胞，已知該等T效應子記憶細胞在對抗肺組織中的繼發性病毒感染的免疫保護方面扮演重要角色（53）。疫苗接種方案後4周，從小鼠分離的脾細胞與SARS-CoV-2棘突肽池培養2小時，接著藉由流式細胞術分析（圖3D、3E），這揭示所有三個方案都導致脾組織中 圖 7F（圖3D）的數目顯著增加，而CD4 ⁺Tem細胞（圖3E）則沒有。

2.4  v-NY-S 及 MVA-S 免疫在免疫的敘利亞倉鼠中生成中和抗體。

C57BL/6小鼠對SARS-CoV-2感染不敏感，而敘利亞倉鼠用作SARS-CoV-2在人類中呼吸道感染的合適動物模型（54-65）。吾人對敘利亞倉鼠進行與對小鼠施加的（圖2A）相同的初免-加強注射疫苗接種方案，即MVA/MVA、vNY1/MVA及vNY5/MVA（圖4A），不同的是吾人對倉鼠使用皮膚劃痕接種方法。在免疫部位形成的小疤痕在兩周內癒合（圖9a），且免疫倉鼠保持健康，並無表現出重量損失（圖9B）。從這些免疫倉鼠收集的初級及二次血清特異性識別在細胞表面上表現的SARS-CoV-2 S蛋白（圖4B）。藉由FACS定量所有倉鼠血清證明加強注射增強抗棘突蛋白抗體力價（圖4C），其藉由免疫墨點法證實（圖4D）。重要的是，所有三個疫苗接種方案都生成在假病毒（圖4E，圖i）及SARS-CoV-2病毒感染檢驗（圖4E，圖ii）中具有高中和活性的抗棘突蛋白抗體。總之，這些數據示出，如對小鼠所觀察到的，吾人的疫苗接種方案在倉鼠中生成中和SARS-CoV-2感染的高抗體力價。

2.5  v-NY-S 及 MVA-S 免疫減少經 SARS-CoV-2 感染的敘利亞倉鼠的肺病理學。

接著，吾人在疫苗加強注射後2周在倉鼠中進行激發實驗，藉由鼻內接種1x10 ⁵PFU/動物的劑量的SARS-CoV-2疫苗到每個倉鼠中，接著在3及7 d.p.i時測量體重的變化。（圖5A）。對照組倉鼠（以PBS安慰劑免疫）在3 d.p.i時呈現輕微但可偵測到的重量減輕，而接受吾人疫苗接種方案的那些則呈現無明顯的重量減輕（圖5B）。先前研究已表明，敘利亞倉鼠的SARS-CoV-2感染導致肺組織中的病毒複製，且病毒力價通常在2到4 d.p.i時達到峰值，並在7 d.p.i時逐漸清除（54、66、67）。因此，吾人在3 d.p.i時犧牲倉鼠，接著測量其肺中的SARS-CoV-2病毒力價（圖5C）。接種MVA/MVA或vNY1/MVA的倉鼠在其肺組織中都沒有呈現可偵測到的SARS-CoV-2病毒程度，而在安慰劑組的肺中偵測到高達4x10 ⁶TCID ₅₀的病毒力價（圖5C）。另外，在9隻vNY5/MVA免疫的倉鼠中並未偵測到病毒，且僅有一隻這樣的動物呈現殘留的病毒量（小於安慰劑組的平均病毒力價的0.1%）（圖5C）。

吾人進一步探討吾人的MVA/MVA方案在7 d.p.i時的影響。安慰劑組的重量減輕在7 d.p.i時較在3 d.p.i時更為顯著（~10到15%），而MVA/MVA免疫的倉鼠保持不變（圖5D）。當吾人在7 d.p.i時從免疫的或安慰劑倉鼠收集肺並測量SARS-CoV-2病毒力價與病毒RNA程度，吾人發現在任何倉鼠中都未偵測到病毒（數據未示出），但在安慰劑組的肺中偵測到~10 ⁶拷貝的病毒RNA，而在MVA/MVA免疫的倉鼠中僅檢偵測到~10 ²拷貝（圖5E）。

為了進一步驗證吾人的發現，吾人在3及7 d.p.i時取出實驗倉鼠的肺，並對他們進行組織學檢查（圖6）。安慰劑感染的倉鼠的肺在3 d.p.i時表現出瀰漫性鬱血、肺泡收縮、出血、以及單核細胞浸潤。另外，也觀察到細支氣管上皮液泡形成、壞死及炎性滲出物，且存在顯著的血管炎及/或內皮炎，其涉及免疫浸潤混合物破壞的中血管及小血管。以抗SARS-CoV-2核殼蛋白（NP）的抗體進行免疫染色，揭示一些細支氣管周圍免疫反應性區域，其主要在肺細胞中，而較少見的是在細支氣管上皮細胞中（圖6A）。有趣的是，儘管藉由H&E染色觀察到嚴重的內皮破壞，但吾人使用的SARS-CoV-2 NP抗體在這些安慰劑感染的倉鼠的血管中並未檢測到任何陽性病毒-蛋白訊號。與在安慰劑感染的倉鼠中觀察到的顯著的支氣管間質性肺炎相比，在接受三個疫苗接種方案的倉鼠組中在3 d.p.i時僅有最小到輕微的肺炎，且幾乎偵測不到SARS-CoV-2 NP蛋白訊號（圖6B、圖6C、圖6D）。

吾人也在7 d.p.i時檢查安慰劑及MVA/MVA組的倉鼠的肺組織。（圖6E、圖6F）。安慰劑感染組觀察到嚴重的II型肺細胞增生，伴有輕度到中度嗜中性浸潤以及大量以阻塞的細支氣管為中心的巨核細胞。免疫組織化學揭示，在安慰劑感染的倉鼠的以細支氣管為中心的損傷周圍的肺細胞中，抗NP抗體訊號微弱但呈陽性（圖6E）。相比之下，MVA/MVA感染組的肺在7 d.p.i時呈現炎性較低的表現型且幾乎偵測不到的抗NP訊號。因此，吾人的初免-加強注射疫苗接種方案防止SARS-CoV-2病毒在肺組織中傳播，並減少發炎及肺病理學。

2.6 以 v-NY-S 單次免疫部分保護敘利亞倉鼠免受 SARS-CoV-2 感染。

吾人希望證明以重組v-NY-S病毒的單劑量免疫是否可在敘利亞倉鼠中提供保護來對抗SARS-CoV-2。以PBS（安慰劑）或1x10 ⁷或5x10 ⁷PFU/動物劑量的v-NY-S藉由皮膚劃痕化對倉鼠進行免疫，接著在2周後收集血清（圖7A）。對血清進行SARS-CoV-2假病毒中和檢驗，該檢驗示出單獨用v-NY-S初免注射以劑量依賴性的方式生成對抗SARS-CoV-2病毒的中和抗體（圖7B）。接著，吾人進行激發實驗，並在3 d.p.i時監測肺中的SARS-CoV-2病毒力價。（圖7C）。安慰劑感染組中病毒力價為~10 ⁶PFU/動物的劑量，但在用v-NY-S以任一劑量（1x10 ⁷或5x10 ⁷PFU/動物的劑量）單次免疫的倉鼠中病毒力價低於100倍，其示出單次免疫已提供對抗SARS-CoV-2感染的部分保護。在取出肺進行組織學檢查時，吾人觀察到安慰劑感染組呈現嚴重的病理表現型，包括瀰漫性鬱血、肺泡收縮、出血、以及單核細胞浸潤（圖7D）。另外，對SARS-CoV-2 NP蛋白的免疫染色也揭示安慰劑組肺中廣泛的支氣管周圍免疫反應性（圖7D）。相比之下，vNY1感染（圖7E）及vNY5感染（圖7F）組的肺病理學比安慰劑感染組觀察到的溫和得多，顯示出較低的免疫細胞浸潤、罕見的上皮變性、以及無血管炎/內皮炎。相對於安慰劑組，在vNY1及vNY5組中，肺組織中的病毒NP免疫訊號也顯著較低（圖7E及圖7F中的最右邊的圖）。

3. 討論

在此研究中，吾人在臨床前模型中證明表現SARS-CoV-2病毒棘突蛋白的重組痘苗病毒的安全性及免疫原性。所有三個以v-NY-S及MVA-S重組體進行的初免-加強注射疫苗接種方案都引起強且持久的對抗SARS-CoV-2的中和抗體反應，並生成T _H1偏向T細胞反應，這有益於病原體清除。重要的是，吾人已證明吾人的疫苗接種方案保護敘利亞倉鼠（代表SARS-CoV-2誘發的人類呼吸道疾病的合適動物模型）免受重量減輕，引起SARS-CoV-2病毒的快速清除，並降低肺組織中的免疫浸潤。吾人的研究進一步探究可複製v-NY菌株的效用，揭示其可證明在處理SARS-CoV-2方面與MVA菌株一樣有前景。

在哺乳動物細胞中生長受限的MVA菌株由於其安全特徵而已廣泛用於疫苗臨床研究。v-NY菌株具有相似於其親代病毒，即紐約市衛生局的天花疫苗菌株的體外及體內特徵（44-47）。v-NY菌株各方面的特徵已被廣泛描述，包括溶菌斑形態、痘苗特異性單株及多株抗血清中和、以及其神經毒性（44）。其已用於構築表現HIV-1包膜醣蛋白（HIVAC-1e）的重組病毒，該病毒已進行FDA核准的早期臨床試驗（44）。表現SARS-CoV-2 S蛋白的重組MVA及v-NY病毒的可用性能讓研究判定病毒載體的基因特性是否可調節疫苗功效。

除了使用單次免疫的Ad26疫苗之外（55），目前市面上大多數SARS-CoV-2疫苗都需要兩種劑量初免-加強注射疫苗接種程序，以生成足夠的保護性免疫力（綜述於（23）以及其中的參考文獻中）。仍不清楚這些疫苗是否足以控制COVID大流行病。由於目前可獲得的COVID疫苗的穩定性取決於儲存及運輸的「冷鏈」的不同程度，因此僅依賴這些疫苗進行全球接種可能是困難的。在這種情況下，凍乾的天花疫苗（v-NY載體衍生自其）的穩定性可能具有某些優點。因此，吾人在初免-加強注射疫苗接種方案中使用重組v-NY-S及MVA-S疫苗候選物的發現可能代表一種非常有用對付全世界SARS-CoV-2感染的方法。 微生物的寄存重組痘苗病毒v-NY-S已在2021年7月14日寄存在台灣新竹市的財團法人食品工業發展研究所（FIRDI），且被分配到以下編號：BCRC970077；以及也在2022年7月13日寄存在法國巴黎的國立微生物培養寄存中心（CNCM），編號：CNCM I-5857）。 序列資訊 SEQ ID NO: 1 ；武漢 -Hu-1- YP_009724390.1 棘突蛋白 a.a. 序列1 mfvflvllpl vssqcvnltt rtqlppaytn sftrgvyypd kvfrssvlhs tqdlflpffs 61 nvtwfhaihv sgtngtkrfd npvlpfndgv yfasteksni irgwifgttl dsktqslliv 121 nnatnvvikv cefqfcndpf lgvyyhknnk swmesefrvy ssannctfey vsqpflmdle 181 gkqgnfknlr efvfknidgy fkiyskhtpi nlvrdlpqgf saleplvdlp iginitrfqt 241 llalhrsylt pgdsssgwta gaaayyvgyl qprtfllkyn engtitdavd caldplsetk 301 ctlksftvek giyqtsnfrv qptesivrfp nitnlcpfge vfnatrfasv yawnrkrisn 361 cvadysvlyn sasfstfkcy gvsptklndl cftnvyadsf virgdevrqi apgqtgkiad 421 ynyklpddft gcviawnsnn ldskvggnyn ylyrlfrksn lkpferdist eiyqagstpc 481 ngvegfncyf plqsygfqpt ngvgyqpyrv vvlsfellha patvcgpkks tnlvknkcvn 541 fnfngltgtg vltesnkkfl pfqqfgrdia dttdavrdpq tleilditpc sfggvsvitp 601 gtntsnqvav lyqdvnctev pvaihadqlt ptwrvystgs nvfqtragcl igaehvnnsy 661 ecdipigagi casyqtqtns prrarsvasq siiaytmslg aensvaysnn siaiptnfti 721 svtteilpvs mtktsvdctm yicgdstecs nlllqygsfc tqlnraltgi aveqdkntqe 781 vfaqvkqiyk tppikdfggf nfsqilpdps kpskrsfied llfnkvtlad agfikqygdc 841 lgdiaardli caqkfngltv lpplltdemi aqytsallag titsgwtfga gaalqipfam 901 qmayrfngig vtqnvlyenq klianqfnsa igkiqdslss tasalgklqd vvnqnaqaln 961 tlvkqlssnf gaissvlndi lsrldkveae vqidrlitgr lqslqtyvtq qliraaeira 1021 sanlaatkms ecvlgqskrv dfcgkgyhlm sfpqsaphgv vflhvtyvpa qeknfttapa 1081 ichdgkahfp regvfvsngt hwfvtqrnfy epqiittdnt fvsgncdvvi givnntvydp 1141 lqpeldsfke eldkyfknht spdvdlgdis ginasvvniq keidrlneva knlneslidl 1201 qelgkyeqyi kwpwyiwlgf iagliaivmv timlccmtsc csclkgccsc gscckfdedd 1261 sepvlkgvkl hyt SEQ ID NO: 2 ； α （ B.1.1.7 ） - QWB50088.1 棘突蛋白 a.a. 序列1 mfvflvllpl vssqcvnltt rtqlppaytn sftrgvyypd kvfrssvlhs tqdlflpffs 61 nvtwfhaisg tngtkrfdnp vlpfndgvyf asteksniir gwifgttlds ktqsllivnn 121 atnvvikvce fqfcndpflg vyhknnkswm esefrvyssa nnctfeyvsq pflmdlegkq 181 gnfknlrefv fknidgyfki yskhtpinlv rdlpqgfsal eplvdlpigi nitrfqtlla 241 lhrsyltpgd sssgwtagaa ayyvgylqpr tfllkyneng titdavdcal dplsetkctl 301 ksftvekgiy qtsnfrvqpt esivrfpnit nlcpfgevfn atrfasvyaw nrkrisncva 361 dysvlynsas fstfkcygvs ptklndlcft nvyadsfvir gdevrqiapg qtgkiadyny 421 klpddftgcv iawnsnnlds kvggnynyly rlfrksnlkp ferdisteiy qagstpcngv 481 egfncyfplq sygfqptygv gyqpyrvvvl sfellhapat vcgpkkstnl vknkcvnfnf 541 ngltgtgvlt esnkkflpfq qfgrdiddtt davrdpqtle ilditpcsfg gvsvitpgtn 601 tsnqvavlyq gvnctevpva ihadqltptw rvystgsnvf qtragcliga ehvnnsyecd 661 ipigagicas yqtqtnshrr arsvasqsii aytmslgaen svaysnnsia ipinftisvt 721 teilpvsmtk tsvdctmyic gdstecsnll lqygsfctql nraltgiave qdkntqevfa 781 qvkqiyktpp ikdfggfnfs qilpdpskps krsfiedllf nkvtladagf ikqygdclgd 841 iaardlicaq kfngltvlpp lltdemiaqy tsallagtit sgwtfgagaa lqipfamqma 901 yrfngigvtq nvlyenqkli anqfnsaigk iqdslsstas algklqdvvn qnaqalntlv 961 kqlssnfgai ssvlndilar ldkveaevqi drlitgrlqs lqtyvtqqli raaeirasan 1021 laatkmsecv lgqskrvdfc gkgyhlmsfp qsaphgvvfl hvtyvpaqek nfttapaich 1081 dgkahfpreg vfvsngthwf vtqrnfyepq iitthntfvs gncdvvigiv nntvydplqp 1141 eldsfkeeld kyfknhtspd vdlgdisgin asvvniqkei drlnevaknl neslidlqel 1201 gkyeqyikwp wyiwlgfiag liaivmvtim lccmtsccsc lkgccscgsc ckfdeddsep 1261 vlkgvklhyt SEQ ID NO: 3 ； β （ B.1.351 ） - QWA53303.1 棘突蛋白 a.a. 序列1 mfvflvllpl vssqcvnltt rtqlppaytn sftrgvyypd kvfrssvlhs tqdlflpffs 61 nvtwfhaihv sgtngtkrfa npvlpfndgv yfasteksni irgwifgttl dsktqslliv 121 nnatnvvikv cefqfcndpf lgvyyhknnk swmesefrvy ssannctfey vsqpflmdle 181 gkqgnfknlr efvfknidgy fkiyskhtpi nlvrglpqgf saleplvdlp iginitrfqt 241 lhrsyltpgd sssgwtagaa ayyvgylqpr tfllkyneng titdavdcal dplsetkctl 301 ksftvekgiy qtsnfrvqpt esivrfpnit nlcpfgevfn atrfasvyaw nrkrisncva 361 dysvlynsas fstfkcygvs ptklndlcft nvyadsfvir gdevrqiapg qtgniadyny 421 klpddftgcv iawnsnnlds kvggnynyly rlfrksnlkp ferdisteiy qagstpcngv 481 kgfncyfplq sygfqptygv gyqpyrvvvl sfellhapat vcgpkkstnl vknkcvnfnf 541 ngltgtgvlt esnkkflpfq qfgrdiadtt davrdpqtle ilditpcsfg gvsvitpgtn 601 tsnqvavlyq gvnctevpva ihadqltptw rvystgsnvf qtragcliga ehvnnsyecd 661 ipigagicas yqtqtnsprr arsvasqsii aytmslgven svaysnnsia iptnftisvt 721 teilpvsmtk tsvdctmyic gdstecsnll lqygsfctql nraltgiave qdkntqevfa 781 qvkqiyktpp ikdfggfnfs qilpdpskps krsfiedllf nkvtladagf ikqygdclgd 841 iaardlicaq kfngltvlpp lltdemiaqy tsallagtit sgwtfgagaa lqipfamqma 901 yrfngigvtq nvlyenqkli anqfnsaigk iqdslsstas algklqdvvn qnaqalntlv 961 kqlssnfgai ssvlndilsr ldkveaevqi drlitgrlqs lqtyvtqqli raaeirasan 1021 laatkmsecv lgqskrvdfc gkgyhlmsfp qsaphgvvfl hvtyvpaqek nfttapaich 1081 dgkahfpreg vfvsngthwf vtqrnfyepq iittdntfvs gncdvvigiv nntvydplqp 1141 eldsfkeeld kyfknhtspd vdlgdisgin asvvniqkei drlnevaknl neslidlqel 1201 gkyeqyikwp wyiwlgfiag liaivmvtim lccmtsccsc lkgccscgsc ckfdeddsep 1261 vlkgvklhyt SEQ ID NO: 4 ； γ （ P.1 ） - QWB58007.1 棘突蛋白 a.a. 序列1 mfvflvllpl vssqcvnftn rtqlpsaytn sftrgvyypd kvfrssvlhs tqdlflpffs 61 nvtwfhaihv sgtngtkrfd npvlpfndgv yfasteksni irgwifgttl dsktqslliv 121 nnatnvvikv cefqfcnypf lgvyyhknnk swmesefrvy ssannctfey vsqpflmdle 181 gkqgnfknls efvfknidgy fkiyskhtpi nlvrdlpqgf saleplvdlp iginitrfqt 241 llalhrsylt pgdsssgwta gaaayyvgyl qprtfllkyn engtitdavd caldplsetk 301 ctlksftvek giyqtsnfrv qptesivrfp nitnlcpfge vfnatrfasv yawnrkrisn 361 cvadysvlyn sasfstfkcy gvsptklndl cftnvyadsf virgdevrqi apgqtgtiad 421 ynyklpddft gcviawnsnn ldskvggnyn ylyrlfrksn lkpferdist eiyqagstpc 481 ngvkgfncyf plqsygfqpt ygvgyqpyrv vvlsfellha patvcgpkks tnlvknkcvn 541 fnfngltgtg vltesnkkfl pfqqfgrdia dttdavrdpq tleilditpc sfggvsvitp 601 gtntsnqvav lyqgvnctev pvaihadqlt ptwrvystgs nvfqtragcl igaeyvnnsy 661 ecdipigagi casyqtqtns prrarsvasq siiaytmslg aensvaysnn siaiptnfti 721 svtteilpvs mtktsvdctm yicgdstecs nlllqygsfc tqlnraltgi aveqdkntqe 781 vfaqvkqiyk tppikdfggf nfsqilpdps kpskrsfied llfnkvtlad agfikqygdc 841 lgdiaardli caqkfngltv lpplltdemi aqytsallag titsgwtfga gaalqipfam 901 qmayrfngig vtqnvlyenq klianqfnsa igkiqdslss tasalgklqd vvnqnaqaln 961 tlvkqlssnf gaissvlndi lsrldkveae vqidrlitgr lqslqtyvtq qliraaeira 1021 sanlaaikms ecvlgqskrv dfcgkgyhlm sfpqsaphgv vflhvtyvpa qeknfttapa 1081 ichdgkahfp regvfvsngt hwfvtqrnfy epqiittdnt fvsgncdvvi givnntvydp 1141 lqpeldsfke eldkyfknht spdvdlgdis ginasfvniq keidrlneva knlneslidl 1201 qelgkyeqyi kwpwyiwlgf iagliaivmv timlccmtsc csclkgccsc gscckfdedd 1261 sepvlkgvkl hyt SEQ ID NO: 5 ； δ （ B.1.617.2 ） - QWB15066.1 棘突蛋白 a.a. 序列1 mfvflvllpl vssqcvnlrt rtqlppaytn sftrgvyypd kvfrssvlhs tqdlflpffs 61 nvtwfhaihv sgtngtkrfd npvlpfndgv yfasteksni irgwifgttl dsktqslliv 121 nnatnvvikv cefqfcndpf ldvyyhknnk swmesgvyss annctfeyvs qpflmdlegk 181 qgnfknlref vfknidgyfk iyskhtpinl vrdlpqgfsa leplvdlpig initrfqtll 241 alhrsyltpg dsssgwtaga aayyvgylqp rtfllkynen gtitdavdca ldplsetkct 301 lksftvekgi yqtsnfrvqp tesivrfpni tnlcpfgevf natrfasvya wnrkrisncv 361 adysvlynsa sfstfkcygv sptklndlcf tnvyadsfvi rgdevrqiap gqtgkiadyn 421 yklpddftgc viawnsnnld skvggnynyr yrlfrksnlk pferdistei yqagskpcng 481 vegfncyfpl qsygfqptng vgyqpyrvvv lsfellhapa tvcgpkkstn lvknkcvnfn 541 fngltgtgvl tesnkkflpf qqfgrdiadt tdavrdpqtl eilditpcsf ggvsvitpgt 601 ntsnqvavly qgvnctevpv aihadqltpt wrvystgsnv fqtragclig aehvnnsyec 661 dipigagica syqtqtnsrr rarsvasqsi iaytmslgae nsvaysnnsi aiptnftisv 721 tteilpvsmt ktsvdctmyi cgdstecsnl llqygsfctq lnraltgiav eqdkntqevf 781 aqvkqiyktp pikdfggfnf sqilpdpskp skrsfiedll fnkvtladag fikqygdclg 841 diaardlica qkfngltvlp plltdemiaq ytsallagti tsgwtfgaga alqipfamqm 901 ayrfngigvt qnvlyenqkl ianqfnsaig kiqdslssta salgklqnvv nqnaqalntl 961 vkqlssnfga issvlndils rldkveaevq idrlitgrlq slqtyvtqql iraaeirasa 1021 nlaatkmsec vlgqskrvdf cgkgyhlmsf pqsaphgvvf lhvtyvpaqe knfttapaic 1081 hdgkahfpre gvfvsngthw fvtqrnfyep qiittdntfv sgncdvvigi vnntvydplq 1141 peldsfkeel dkyfknhtsp dvdlgdisgi nasvvniqke idrlnevakn lneslidlqe 1201 lgkyeqyikw pwyiwlgfia gliaivmvti mlccmtsccs clkgccscgs cckfdeddse 1261 pvlkgvklhy t

變體	棘突蛋白中的突變（S ）	備註*
WT	NA	-
α（B.1.1.7）	69del, 70del, 144del, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H	VOC
β（B.1.351）	D80A, D215G, 241del, 242del, 243del, K417N, E484K, N501Y, D614G, A701V	VOC
γ（P.1）	L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I	VOC
δ（B.1.617.2）	T19R,（G142D）, 156del, 157del, R158G, L452R, T478K, D614G, P681R, D950N	VOI

VOC：關注的變體；VOI：感興趣的變體 *依據CDC網址（https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/variants/variant-info.html）

SARS-CoV-2 病毒菌株	棘突蛋白（NCBI ID ）
武漢-Hu-1	YP_009724390.1
α（B.1.1.7）	QWB50088.1
β（B.1.351）	QWA53303.1
γ（P.1）	QWB58007.1
δ（B.1.617.2）	QWB15066.1

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無

當結合附圖閱讀時，將更好理解前面發明內容及以下本發明的詳細描述。為了說明本發明，附圖中示出目前較佳的具體實施例。然而，應理解到本發明不限於所示出的精確配置及手段。

在圖式中：

圖 1A 到 1D 包括圖表，顯示 v-NY-S 及 MVA-S 的生成及特性分析。（圖 1A ）。MVA-S及v-NY-S的病毒基因體中 tk基因座的示意圖。紅色框代表編碼SARS-CoV-2 S蛋白的ORF，而藍色框代表 lacZORF。小三角代表驅動基因轉錄的病毒啟動子（ 圖 1B） 。從MVA-S及v-NY-S表現的SARS-CoV-2 S蛋白的表面偵測。分別以MVA-S（藍線）或v-NY-S（紅線）感染BHK21及BSC40細胞，在感染後12小時（感染後小時，hpi）收集，以抗RBD抗體染色，接著藉由流式細胞術分析。 （圖 1C ）。感染MVA-S及v-NY-S的細胞中SARS-CoV-2 S蛋白的免疫螢光染色。用5的MOI以MVA-S或v-NY-S感染BHK21及BSC40細胞，並在12 hpi時以4%三聚甲醛固定，以抗RBD抗體（綠色）染色，接著拍照。以DAPI（藍色）染色細胞核。 （圖 1D ）。由MVA-S及v-NY-S表現的SARS-CoV-2 S蛋白的免疫墨點法。以MVA或MVA-S感染BHK21細胞；分別以v-NY或v-NY-S感染BSC40細胞，並在12 hpi時收集以使用抗S2抗體進行免疫墨點分析。痘苗D8蛋白用作對照組。

圖 2A 到 2G 包括圖表，顯示初免 - 加強注射 MVA/MVA 、 vNY1/MVA 及 vNY5/MVA 疫苗接種方案在 C57BL/6 小鼠中引發 SARS-CoV-2 S 蛋白特異性中和抗體。（圖 2A ）。三個初免-加強注射疫苗接種方案及分析的總結與時間軸。 （圖 2B ）。來自免疫小鼠的初級及二次血清識別細胞表面上的SARS-CoV-2 S蛋白。使用感染S-BAC（紅線）或WT-BAC（黑線）的SF9細胞，藉由流式細胞術評估在初免注射後4周（1°血清）及加強注射後2周（2°血清）所收集的小鼠血清的SARS-CoV-2特異性IgG抗體。 （圖 2C ）。使用來自FACS的平均螢光強度（MFI）值，定量來自小鼠1°及2°血清中的抗棘突蛋白抗體力價（如 圖 2B中所示）。1°及2°血清收集的小鼠數量是相同的：PBS相對於PBS/PBS對照組（n=3）；MVA相對於MVA/MVA（n=5）；vNY1相對於vNY1/MVA（n=5）；以及vNY5相對於v-NY5/MVA（n=5）。數據以平均值±SD表示。 （圖 2D ）。使用來自免疫小鼠的1°及2°血清（1:100）進行重組SARS-CoV-2 S蛋白的免疫墨點分析。 （圖 2E ）。使用（i）假病毒及（ii）SARS-CoV-2病毒感染，從疫苗接種的小鼠所收集的2°血清的中和檢驗：PBS/PBS對照組（n=3）；MVA/MVA（n=5）；vNY1/MVA（n=5）；以及vNY5/MVA（n=5）。虛線表示檢驗的偵測極限。 （圖 2F ）。使用感染WT-BAC或S-BAC的SF9細胞，定量在疫苗接種方案後0.5及4.5個月所收集的小鼠血清中的抗棘突蛋白抗體。 （圖 2G ）。使用在疫苗接種方案後0.5個月及4.5個月所收集的小鼠血清中的假病毒中和檢驗：PBS/PBS對照組（n=3）；MVA/MVA（n=5）；以及vNY1/MVA（n=5）。ns：不顯著的。虛線表示檢驗的偵測極限。

圖 3A 到 3E 包括圖表，顯示 MVA/MVA 、 vNY1/MVA 及 vNY5/MVA 疫苗接種方案誘發 T _H1 偏向免疫反應。（圖 3A ）。在疫苗接種方案後2周所收集的小鼠血清中SARS-CoV-2棘突蛋白特異性IgG2C及IgG1抗體的終點力價。 （圖 3B ）。根據（A）的數據所計算的終點力價IgG2C/IgG1比率（每組n=5）。 （圖 3C ）。在疫苗接種方案後4周所收集的小鼠脾細胞的ELISpot分析，分析其IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL4及IL6細胞激素的表現（每組n=5）。數據以平均值±SEM表示。SFC：斑點形成細胞。 （圖 3D 、圖 3E ）。藉由流式細胞術偵測脾細胞中的SARS-CoV-2棘突蛋白特異性CD8 ⁺（在 圖 3D中）及CD4 ⁺（在 圖 3E中）T效應子記憶細胞（CD44 ⁺CD62L ^-）（每組n=5）。數據以平均值±SD表示。ns：不顯著的。

圖 4A 到 4E 包括圖表，顯示 MVA/MVA 、 vNY1/MVA 及 vNY5/MVA 初免 - 加強注射疫苗接種方案在敘利亞倉鼠中生成 SARS-CoV-2 棘突蛋白特異性中和抗體。（圖 4A ）。倉鼠免疫及血清收集的時間軸。 （圖 4B ）。來自免疫倉鼠的初級及二次血清識別細胞表面上的SARS-CoV-2 S蛋白。使用感染S-BAC（紅線）或WT-BAC（黑線）的SF9細胞，藉由流式細胞術評估在初免注射後4周（1°血清）及加強注射後2周（2°血清）所收集的倉鼠血清的SARS-CoV-2特異性IgG抗體。 （圖 4C ）。使用來自FACS的平均螢光強度（MFI）值，定量來自B中倉鼠的1°及2°血清中的抗棘突蛋白抗體力價。1°及2°血清收集的倉鼠數量是相同的：PBS相對於PBS/PBS對照組（n=15）；MVA相對於MVA/MVA（n=10）；vNY1相對於vNY1/MVA（n=10）；以及vNY5相對於v-NY5/MVA（n=10）。數據以平均值±SD表示。 （圖 4D ）。使用重組SARS-CoV-2 S蛋白對來自免疫倉鼠的1°及2°血清（1:20）進行免疫墨點法。 （圖 4E ）。使用（i）假病毒及（ii）SARS-CoV-2病毒感染，從疫苗接種的倉鼠所收集的2°血清的中和檢驗：PBS對照組（n=12）；MVA/MVA（n=10）；vNY1/MVA（n=10）；以及vNY5/MVA（n=10）。虛線表示檢驗的偵測極限。

圖 5A 至 5E 包括圖表，顯示經受 MVA/MVA 、 vNY1/MVA 或 v-NY5/MVA 疫苗接種方案的倉鼠被保護免受鼻內施用的 SARS-CoV-2 感染。（圖 5A ）。免疫及激發（challenge）實驗的時間軸。在3或7 d.p.i.收集肺之前，以三個初免-加強注射疫苗接種方案（MVA/MVA、vNY1/MVA或vNY5/MVA）之一或安慰劑（PBS）作為對照組而免疫的倉鼠被以1x10 ⁵PFU SARS-CoV-2病毒進行鼻內激發。 （圖 5B ）。在SARS-CoV-2激發3天內倉鼠的體重變化。數據以平均值±SEM表示。 （圖 5C ）。在SARS-CoV-2激發後，在3 d.p.i時倉鼠肺組織中SARS-CoV-2的TCID ₅₀值：PBS/PBS對照組（n=12）；MVA/MVA（n=5）；vNY1/MVA（n=10）；以及vNY5/MVA（n=10）。 （圖 5D ）。在SARS-CoV-2激發7天內倉鼠的體重變化：PBS/PBS對照組（n=3）；以及MVA/MVA（n=5）。數據以平均值±SEM表示。 （圖 5E ）。在SARS-CoV-2激發後，在7 d.p.i時經MVA/MVA免疫的倉鼠的肺中SARS-CoV-2基因體RNA：PBS/PBS對照組（n=3）；以及MVA/MVA（n=5）。除非另有說明，否則數據以平均值±SD表示。虛線表示檢驗的偵測極限。

圖 6A 到 6F 包括圖表，顯示 SARS-CoV-2 激發後倉鼠的肺病理學及免疫組織化學。（圖 6A ）。在3 d.p.i時安慰劑（PBS/PBS）感染的倉鼠組的肺的H&E及免疫組織化學染色。H&E染色示出嚴重的支氣管間質性肺炎，其具有由於水腫、微血管鬱血及可變的免疫細胞浸潤而增厚的肺泡壁。SARS-CoV-2 NP蛋白的免疫組織化學揭示顯著的細支氣管周圍染色，其中血管內皮經常被免疫浸潤破壞。 （圖 6B 、圖 6C 、圖 6D ）。在3 d.p.i時vNY1/MVA（ 圖 6B）、vNY5/MVA（ 圖 6C）及MVA/MVA（ 圖 6D）倉鼠組的肺的H&E及免疫組織化學染色。與安慰劑（PBS/PBS）感染的倉鼠組相比，肺結構得到更好的保護，當中免疫細胞浸潤少得多，且幾乎偵測不到SARS-CoV-2 NP染色訊號。 （圖 6E ）。在7 d.p.i時安慰劑（PBS/PBS）感染的倉鼠組的肺的H&E及免疫組織化學染色。H&E染色揭示顯著的II型肺細胞增生，其中具有不同的免疫細胞浸潤。SARS-CoV-2 NP蛋白的免疫組織化學偵測到再生性病灶邊緣的彌散陽性訊號。 （圖 6F ）。在7 d.p.i時經MVA/MVA免疫的倉鼠表現出最小的肺病理學及很少的SARS-CoV NP免疫標記。H&E及免疫組織化學染色區域的放大圖以紅色框標記。比例尺代表50 μm。

圖 7A 到 7F 包括圖表，顯示單劑量 vNY1 或 vNY5 疫苗接種部分保護倉鼠免受鼻內施用的 SARS-CoV-2 感染。（圖 7A ）。時間軸示出免疫及激發實驗。以單劑量的vNY1、vNY5或安慰劑（PBS）免疫的倉鼠以1x10 ⁵PFU SARS-CoV-2病毒進行鼻內激發，接著在3 d.p.i時收集肺。 （圖 7B ）。在倉鼠疫苗初免注射後2周收集的1°血清的假病毒中和檢驗。PBS對照組（n=4）；vNY1（n=5）；以及vNY5（n=5）。數據以平均值±SD表示。虛線表示檢驗的偵測極限。 （圖 7C ）。在SARS-CoV-2激發後，在3 d.p.i時安慰劑（PBS）、vNY1及vNY5組的倉鼠的肺的TCID ₅₀值（每組n=5）。數據以平均值±SD表示。虛線表示檢驗的偵測極限。 （圖 7D ）。在3 d.p.i時安慰劑（PBS）感染的倉鼠組的肺的H&E及免疫組織化學染色。H&E染色揭示與圖6A中所示相同的病理學，其揭示嚴重的支氣管間質性肺炎，其中肺泡壁由於水腫、微血管鬱血及可變的免疫細胞浸潤而增厚。SARS-CoV-2 NP蛋白的免疫組織化學揭示顯著的細支氣管周圍染色，其中血管內皮經常被免疫浸潤破壞。 （圖 7E 及圖 7F ）。在3 d.p.i.時，以vNY1（ 圖 7E）或vNY5（ 圖 7F）初免注射的倉鼠肺的H&E及免疫組織化學染色。肺結構被大量保存，相對於安慰劑感染組，顯示出免疫細胞浸潤減少，且SARS-CoV-2 NP蛋白幾乎無法藉由免疫組織化學偵測到。

圖 8 顯示以三個方案之一免疫後 C57BL/6 小鼠的重量變化。

圖 9A 到 9B 包括圖表，顯示動物皮膚劃痕及重量變化。（圖 9A ）。在初次免疫後第5、10天及第15天敘利亞倉鼠的皮膚劃痕影像。（ 圖 9B）以三個方案之一免疫後之敘利亞倉鼠的重量變化。

無

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Claims (30)

1. 一種重組痘病毒載體，其包含在痘病毒載體中編碼SARS-CoV-2棘突蛋白的多核苷酸，用於個體接種疫苗對抗SARS-CoV-2。
2. 如請求項1之重組痘病毒載體，其中該痘病毒載體為正痘病毒載體。
3. 如請求項2之重組痘病毒載體，其中該正痘病毒載體選自由駱駝痘病毒載體、牛痘病毒載體、猴痘病毒載體、天花病毒載體、及痘苗病毒載體組成的群組。
4. 如請求項3之重組痘病毒載體，其中該痘苗病毒載體為經修飾的疫苗安卡拉（MVA）或v-NY。
5. 如請求項1之重組痘病毒載體，其中該重組痘病毒載體缺乏功能性胸苷激酶基因。
6. 如請求項1之重組痘病毒載體，其中該多核苷酸可操作地連接到啟動子。
7. 如請求項6之重組痘病毒載體，其中該啟動子為痘病毒啟動子。
8. 如請求項7之重組痘病毒載體，其中該啟動子為痘苗病毒早期及晚期雙重啟動子。
9. 如請求項1之重組痘病毒載體，其中該SARS-CoV-2棘突蛋白包含SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的胺基酸序列或其功能性變體。
10. 如請求項1之重組痘病毒載體，其為v-NY-S（寄存編號BCRC970077或CNCM I-5857）。
11. 一種對抗SARS-CoV-2之免疫原性組合物，其包含有效量的如請求項1至10中任一項之重組痘病毒載體，及生理學上可接受的載劑。
12. 如請求項11之免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。
13. 一種如請求項1至10中任一項之重組痘病毒載體或如請求項11或12之免疫原性組合物之用途，其係用於製備用於個體接種疫苗對抗SARS-CoV-2的藥物。
14. 一種用於個體接種疫苗對抗SARS-CoV-2之方法，其包含向該個體施用有效量的如請求項1至10中任一項之重組痘病毒載體或如請求項11或12之免疫原性組合物。
15. 如請求項14之方法，其中該重組痘病毒載體或該免疫原性組合物經由選自由肌內注射、皮下注射、鼻內施用、皮內注射、皮膚劃痕、及口服施用、以及其任意組合組成的群組的途徑施用。
16. 如請求項14之方法，其中該重組痘病毒載體或該免疫原性組合物向該個體施用一次或多於一次。
17. 如請求項14之方法，其包含第一次施用，隨後第二次施用該重組痘病毒載體或該免疫原性組合物。
18. 如請求項17之方法，其中該第一次施用及該第二次施用為肌內注射。
19. 如請求項17之方法，其中該第一次施用為皮膚劃痕，且該第二次施用為肌內注射。
20. 如請求項17之方法，其中該第二次施用是在該第一次施用後約4周。
21. 如請求項17之方法，其中在該第一次施用及該第二次施用中給予相同的劑量。
22. 如請求項17之方法，其中在該第一次施用中給予較該第二次施用中更高的劑量。
23. 如請求項14之方法，其中該重組痘病毒載體包含v-NY-S及/或MVA-S。
24. 如請求項23之方法，其包含先向該個體施用有效量的v-NY-S，以及之後施用有效量的MVA-S。
25. 如請求項24之方法，其中v-NY-S是經由皮膚劃痕施用，以及MVA-S是經由肌內注射施用。
26. 如請求項23之方法，其包含先向該個體經由皮膚劃痕施用第一量的v-NY-S，以及在v-NY-S的該施用的至少四周後，經由肌內注射施用第二量的MVA-S，其中該第二量高於該第一量。
27. 如請求項14之方法，其中該方法有效地誘發在該個體中對抗SARS-CoV-2的中和抗體及特異性T _H1偏向免疫反應及效應子記憶CD8+ T細胞。
28. 如請求項14之方法，其中該方法在該個體中有效地減少由SARS-CoV-2感染引起的疾病或病況。
29. 如請求項28之方法，其中該疾病或病況包括個體中器官或組織的損傷，該等器官或組織選自由肺、胃腸道、心臟、腎、肝、腎上腺、及/或睪丸組成的群組。
30. 如請求項28之方法，其中該疾病或病況包括肺中的病理狀況，該病理狀況選自由瀰漫性鬱血、肺泡收縮、出血、免疫細胞浸潤、及其任意組合組成的群組。