EA007811B1 - Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva) - Google Patents

Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva) Download PDF

Info

Publication number
EA007811B1
EA007811B1 EA200401507A EA200401507A EA007811B1 EA 007811 B1 EA007811 B1 EA 007811B1 EA 200401507 A EA200401507 A EA 200401507A EA 200401507 A EA200401507 A EA 200401507A EA 007811 B1 EA007811 B1 EA 007811B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
sequence
mua
sequences
heterologous
genome
Prior art date
Application number
EA200401507A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200401507A1 (ru
Inventor
Пол Хоули
Соня Леирер
Original Assignee
Бавариан Нордик А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Бавариан Нордик А/С filed Critical Бавариан Нордик А/С
Publication of EA200401507A1 publication Critical patent/EA200401507A1/ru
Publication of EA007811B1 publication Critical patent/EA007811B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к новым инсерционным сайтам, которые могут быть использованы для интеграции экзогенных ДНК-последовательностей в геном модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA). Настоящее изобретение также относится к плазмидным векторам для встраивания чужеродной ДНК в геном MVA. Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантному MVA, который содержит экзогенную ДНК-последовательность, встроенную в указанный новый инсерционный сайт, и который может быть использован в качестве лекарственного средства или вакцины.

Description

Настоящее изобретение относится к новым инсерционным сайтам, которые могут быть использованы для интеграции экзогенных ДНК-последовательностей в геном МУЛ.
Предшествующий уровень техники
Модифицированный вирус коровьей оспы Анкара (МУА) представляет собой член семейства ортопоксвирусов и был генерирован посредством проведения примерно 570 серийных пассажей штамма Анкара вируса коровьей оспы (СУА) на фибробластах куриного эмбриона (для обзора см. Мауг А. е! а1. (1975), 1п£гс!юп 3, 6-14). В результате таких пассажей полученный вирус МУА содержит геномную информацию, на 31 тысячу пар оснований, меньшую, чем СУА, и имеет в высокой степени ограниченный круг клеток-хозяев (Меуег Н. е! а1., 1. Оеп. У1го1. 72, 1031-1038 (1991)). МУА характеризуется своей исключительно высокой степенью аттенюации, а именно пониженной вирулентностью или инфекционностью, но при этом он обладает превосходной иммуногенностью. При тестировании на различных животных моделях было подтверждено, что вирус МУА является невирулентным даже у индивидов с низким иммунитетом. Еще более важно отметить, что превосходные свойства штамма МУА были продемонстрированы при проведении широкомасштабных клинических испытаний (Мауг е! а1., ΖΝ. Вак!. Нуд. I., АЫ. Огд. В 167, 375-390 (1987)). В этих испытаниях, проводимых с участием свыше 120000 человек, включая пациентов с высоким риском инфицирования, не наблюдалось каких-либо побочных эффектов (8йск1 е! а1., ЩзсЬ. теа. \\'кс1и. 99, 2386-2392 (1974)).
Кроме того, было обнаружено, что МУА блокируется на поздней стадии цикла репликации вируса в клетках млекопитающих (8и!!ег О. & Мокк В. (1992) Ргос. №111. Асаа. 8с1. И8А 89, 10847-10851). В соответствии с этим можно утверждать, что МУА полностью реплицирует свою ДНК, синтезирует ранние, промежуточные и поздние генные продукты, но он не способен к сборке зрелых инфекционных вирионов, которые могут высвобождаться из инфицированной клетки. По этой причине, а именно из-за ограниченной репликации, было высказано предположение, что МУА служит в качестве вектора для экспрессии генов.
Совсем недавно МУА был использован для генерирования рекомбинантных вакцин, экспрессирующих антигенные последовательности, встроенные либо в сайт гена тимидинкиназы (!к) (патент США 5185146), либо в сайт природной делеции в геноме МУА (РСТ/ЕР96/02926).
Хотя инсерционный локус 1к широко используется для генерирования рекомбинантных поксвирусов, а в частности, для генерирования рекомбинантных вирусов коровьей оспы (Маске!! е! а1. (1982) РИА8 И8А 79, 7415-7419), однако, эта технология не может быть применена для МУА. 8сйей1тдег и др. показали, что МУА является гораздо более чувствительным к модификациям генома, чем другие поксвирусы, которые могут быть использованы для генерирования рекомбинантных поксвирусов. В частности, 8сйей1тдет и др. показали, что один из сайтов, который наиболее часто используется для интеграции гетерологичной ДНК в геномы поксвирусов, а именно локус гена тимидинкиназы (!к), не может быть использован для генерирования рекомбинантного МУА. Было установлено, что все полученные !к(-) рекомбинантные МУА являются в высокой степени нестабильными, и после очистки у них сразу делетируется инсертированная ДНК вместе с частями геномной ДНК МУА (ЗскеШтдет е! а1. (1996), Агс11. У1го1. 141: рр 663-669).
Такая нестабильность, а, следовательно, и высокая вероятность геномной рекомбинации является известной проблемой, с которой сталкиваются вирусологи, работающие с поксвирусами. Действительно, МУА продуцируется в процессе длительного пассирования, и этот факт указывает на то, что вирусный геном СУА является нестабильным при его размножении ίη νίίτο в клетках культивированных тканей. Из генома этого МУА было делетировано несколько тысяч нуклеотидов (31 т.п.н.), а поэтому он отличается от исходного генома СУА 6-тью крупными и многочисленными мелкими делециями.
Недавно была описана геномная организация МУА (Ап!оте е! а1. (1998), У1го1оду 244, 365-396). Геном МУА размером 178 т.п.н. является плотно упакованным и содержит 193 отдельных открытых рамки считывания (ОРС), которые кодируют белки длиной по меньшей мере в 63 аминокислоты. По сравнению с высокоинфекционным вирусом натуральной оспы, а также с прототипом вируса коровьей оспы, а именно штаммом Копенгаген, большинство ОРС МУА являются фрагментированными или усеченными (Ап!оте е! а1. (1998), У1го1оду 244, 365-396). Однако все ОРС, за очень редким исключением, включая фрагментированные и усеченные ОРС, транскрибируются и транслируются в белки. В нижеследующем описании используется номенклатура Антуана и др., а там, где это необходимо, также используется номенклатура, основанная на гидролизе рестриктирующим ферментом НшаШ.
До настоящего времени продуцирование стабильных рекомбинантных МУА осуществлялось путем инсерции экзогенной ДНК лишь в природные делеционные сайты генома МУА (РСТ/ЕР96/02926). К сожалению, в геноме МУА имеется лишь ограниченное число природных делеционных сайтов. Кроме того, было показано, что другие инсерционные сайты, такие, например, как локус гена !к, почти не пригодны для генерирования рекомбинантного МУА (ЗсйеШтдет е! а1. (1996), Агс11. У1го1. 141:рр.663-669).
Цели настоящего изобретения
Целью настоящего изобретения является идентификация дополнительных инсерционных сайтов генома МУА и получение инсерционных векторов, направляющих инсерцию экзогенных ДНКпоследовательностей в указанные только что идентифицированные инсерционные сайты генома МУА.
- 1 007811
Другой целью настоящего изобретения является получение рекомбинантного МУЛ, который содержит экзогенные ДНК-последовательности, стабильно интегрированные в новые инсерционные сайты указанного генома МУА.
Подробное описание настоящего изобретения
Авторы настоящего изобретения идентифицировали новые сайты для инсерции экзогенных ДНКпоследовательностей в геном модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (МУА). Новые инсерционные сайты локализуются в межгенных областях (ЮК) вирусного генома, где указанные ЮК, в свою очередь, локализуются между двумя смежными открытыми рамками считывания (ОРС) генома МУА или фланкированы этими рамками считывания.
В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к рекомбинантному МУА, содержащему гетерологичную ДНК-последовательность, встроенную в ЮК вирусного генома. В соответствии с настоящим изобретением одна или несколько экзогенных ДНК-последовательностей может быть встроена в одну или несколько ЮК.
Было неожиданно обнаружено, что экзогенные ДНК-последовательности действительно остаются стабильными при их встраивании в ЮК генома МУА. Как уже указывалось выше, считается, что геном МУА является крайне нестабильным. Очевидно, что гены или ДНК-последовательности, не имеющие важного значения для размножения вируса, делетируются или фрагментируются. Хотя было обнаружено - и также неожиданно - что стабильные рекомбинантные МУА продуцируются в том случае, когда гетерологичные ДНК-последовательности встраиваются в природные делеционные сайты генома МУА (РСТ/ЕР96/02926), однако, с другой стороны, было также обнаружено, что гены определенного круга хозяев, как, например, локус 1к. широко используемые для генерирования других рекомбинантных поксвирусов, не являются подходящими инсерционными сайтами в МУА. Тот факт, что Уего-МУА имеет одну дополнительную геномную делецию (РСТ/ЕР01/02703), также дает основание предполагать, что указанный геном является динамичным в том смысле, что в нем легко делетируются гены, которые не требуются для размножения. Поэтому можно сделать вывод, что гетерологичные ДНКпоследовательности, встраивающиеся в область между ОРС и не играющие важной роли для размножения вируса, должны также делетироваться вирусом.
Хотя нуклеотидные последовательности ОРС кодируют аминокислотную последовательность, образующую пептид, полипептид или белок, однако, ЮК, расположенные между двумя ОРС, не обладают кодирующей способностью, но могут включать регуляторные элементы, сайты связывания, промоторные и/или энхансерные последовательности, играющие важную роль в регуляции транскрипции экспрессии вирусного гена, или участвующие в такой регуляции. Таким образом, ЮК может участвовать в регуляции жизненного цикла вируса. Однако авторы настоящего изобретения также показали, что новые инсерционные сайты имеют неожиданное преимущество, заключающееся в том, что экзогенные ДНКпоследовательности могут быть стабильно встроены в геном МУА, и такое встраивание не оказывает никакого негативного влияния на обычные свойства и экспрессию гена МУА и не приводит к изменению его свойств и экспрессии. Новые инсерционные сайты являются особенно ценными, поскольку они не влияют ни на ОРС, ни на кодирующую последовательность МУА.
Кроме того, было неожиданно обнаружено, что уровень экспрессии чужеродного гена, встроенного в ЮК, превышает уровень экспрессии чужеродного гена, встроенного в делеционный сайт генома МУА (см. также пример 1).
Нуклеотидная последовательность ОРС обычно начинается с инициирующего кодона и заканчивается стоп-кодоном. В зависимости от ориентации двух смежных ОРС, ЮК, т.е. область между этими ОРС, фланкируется либо двумя стоп-кодонами двух смежных ОРС, либо двумя инициирующими кодонами двух смежных ОРС, либо стоп-кодоном первой ОРС и инициирующим кодоном второй ОРС, либо инициирующим кодоном первой ОРС и стоп-кодоном второй ОРС.
В соответствии с этим, сайт инсерции экзогенной ДНК-последовательности в ЮК может быть расположен ниже или со стороны З'-конца от стоп-кодона первой ОРС. В случае если имеется смежная ОРС, также называемая второй ОРС, то она имеет такую же ориентацию, как и первая ОРС, и этот инсерционный сайт, расположенный ниже стоп-кодона первой ОРС, находится выше или со стороны 5'-конца от инициирующего кодона второй ОРС.
В случае если вторая ОРС имеет противоположную ориентацию по отношению к первой ОРС, при которой эти две смежных ОРС направлены навстречу друг к другу, то инсерционный сайт расположен ниже стоп-кодонов обеих ОРС.
В качестве третьей альтернативы рассматривается случай, где две смежных ОРС считываются в противоположном направлении, но ориентированы так, что эти смежные ОРС направлены в противоположные стороны по отношению друг к другу, и такая ориентация аналогична расположению, характеризующемуся тем, что инициирующие кодоны двух ОРС являются смежными друг с другом, и в этом случае экзогенную ДНК встраивают в область, расположенную выше этих двух инициирующих кодонов.
ОРС в геноме МУА находится в двух кодирующих направлениях. Следовательно, полимеразная активность направлена слева направо, то есть в прямом направлении, и, соответственно, справа налево (в обратном направлении). Такая практика является общепринятой в поксвирусологии, и она лежит в осно
- 2 007811 ве стандартной классификации вирусов коровьей оспы, используемой для идентификации ОРС по их ориентации и положению на различных рестрикционных ИтдШ-фрагментах генома. В соответствии с номенклатурой, различные ИтдШ-фрагменты обозначаются заглавными буквами с нижними выносными элементами в соответствии со снижением их размера. ОРС пронумерованы слева направо на каждом НтбШ-фрагменте, и ориентация ОРС показана заглавными буквами Ь (что означает, что транскрипция происходит справа налево) или К (что означает, что транскрипция происходит слева направо). Кроме того, в более поздних публикациях, посвященных структуре генома МУЛ, где используется другая номенклатура, ОРС просто пронумерованы слева направо до конца генома, а их ориентация показана заглавными буквами Ь или К (Ап1оте е1 а1. (1998), У1го1оду 244, 365-396). В качестве примера, ОРС 14Ь, согласно старой номенклатуре, соответствует ОРС 0641, по номенклатуре А1Поте е1 а1. Если не оговорено особо, в настоящем изобретении используется номенклатура Лп1оте е1 а1.
В соответствии с настоящим изобретением гетерологичные ДНК-последовательности могут быть встроены в одну или в несколько ЮК между двумя смежными ОРС, выбранными из группы, включающей в себя
001Ь-002Ъ, 0О2Б-003Б, 005К-006Н, 006Б-007Н, 007К-008Б, 008Ь-009Ь, 0171,-01813, 0181.-01913, 01913-02013, 02013-02113, 02313-0241., 02413-02513, 025Ь-026Ь, 028К-029Б, ОЗОЬ-ОЗПЗ, 031Ι.-03213, 03213-0331., 03513-0361., 03613-03713, 03713-0381., 03913-04013, 04313-0441., 04413-0451., 046Ь-047К, 04913-05013, 050Ь-051Ь, 051Б-052К, 052К-053К, 053К-054Н, 054К-055К, 055П-05613, 0611.-06213, 0641,-0651., 065Ь-066Ь, 066Ι3-067Ι,, 077Ι3-078Κ, 078К-079К, 080Н-081К, 081Я-082Б, 082Б-083К, 085К-086К, 086К-087К, 088К-089Ь, 089Ь-090К, 092К-093Б, 094Ι.-095Κ, 096К-097Н, 097Я-098К, 101Н-102К, 103К-104К, 105Σ.-106Κ, 107К-108Б, 1081,-10913, 10933-11013, 110Ь-111Ь, 1131.-11413, 1141.-11513, 115Б-116В, 117Ь-118Ь, 118Ь-119К, 122Н-123Б, 12313-12411, 124Ь-125Ь, 12513-1261,, 133Н-134К, 134Я-135К, 13613-1371., 137Ь-138Ь, 1411.-142П, 143Ι3-144Η, 144Н-145К, 145К-146К, 146К-147В, 147К-148К, 148К-149Ь, 152К-153Б, 153Ι3-154Β, 154К-155К, 156Н-157Б, 157Ι3-158Β, 159Н-160Д, 160П-161К, 162К-163Н, 163К-164К, 164К-165К, 165К-166К, 166К.-167К, 167К-168К, 170К-171К, 173К-174К, 175К-176К, 176К-177К, 178К-179К, 179Н-180К, 180Н-181К, 183Н-184Е, 184К-18513, 185Ь-186К, 186Н-187Н, 187Н-188К, 188Н-189К, 189К-190К, 192К-193Н.
В соответствии со старой номенклатурой ОРС 006Б соответствует С10Б, 019Б соответствует С6Ь, 020Б соответствует Ν1Ε, 021Ь соответствует Ν2Ε, 023Б соответствует К2Ь, 028К соответствует К7К, 029Б соответствует Р1Ь, 037Б соответствует Р8Ь, 045Б соответствует Р15Б, 050Б соответствует Е3Ь, 052К соответствует Е5К, 054К соответствует Е7К, 055К соответствует Е8К, 056Б соответствует Е9Ь, 062Б соответствует 11Ь, 064Б соответствует 14Ь, 065Б соответствует 15Ь, 081К соответствует Ь2К, 082Б соответствует 1,31,, 086К соответствует 12К, 088К соответствует 14К, 0891, соответствует 45Е, 092К соответствует Н2К, 095К соответствует Н5К, 107К соответствует Ό10Κ, 108Б соответствует ЭНЬ, 122К соответствует А11К, 123Б соответствует А12Б, 125Б соответствует А14Б, 126Б соответствует А15Б, 135К соответствует Л24К, 136Б соответствует А25Б, 137Б соответствует А26Б, 141Б соответствует А30Б, 148К соответствует А37К, 149Б соответствует А38Б, 152К соответствует А40К, 153Б соответствует А411,, 154К соответствует А42К, 157Б соответствует А44Б, 159К соответствует А46К, 160Б соответствует А47Б, 165К соответствует А56К, 166К соответствует А57К, 167К соответствует В1К, 170К соответствует В3К, 176К соответствует В8К, 180К соответствует В12К, 184К соответствует В16К, 185Б соответствует В17Б и 187К соответствует В19К.
Предпочтительно гетерологичную последовательность встраивают в ЮК, фланкированную двумя смежными ОРС, выбранными из группы, включающей в себя 007К-008Б, 018Е-019Б, 044Е-045Б, 064Б065Б, 136Е-137Б, 148К-149Б.
Гетерологичными или экзогенными ДНК-последовательностями являются последовательности, которые в природе обычно не ассоциированы с поксвирусом, используемым в соответствии с настоящим изобретением. В соответствии с другим вариантом настоящего изобретения экзогенная ДНК
- 3 007811 последовательность содержит по меньшей мере одну кодирующую последовательность. Указанная кодирующая последовательность функционально присоединена к транскрипционному регуляторному элементу, а предпочтительно, к поксвирусному транскрипционному регуляторному элементу. Кроме того, могут быть также использованы комбинации поксвирусных транскрипционных регуляторных элементов и, например, внутренних сайтов связывания с рибосомой.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения экзогенная ДНКпоследовательность может также содержать две или несколько кодирующих последовательностей, присоединенных к одному или нескольким транскрипционным регуляторным элементам. Предпочтительно, чтобы такая кодирующая последовательность кодировала один или несколько белков, полипептидов, пептидов, чужеродных антигенов или антигенных эпитопов, и, в частности, чтобы она содержала гены, представляющие интерес с терапевтической точки зрения.
Такими представляющими терапевтический интерес генами согласно изобретению могут быть гены, происходящие от генов патогенных или инфекционных микроорганизмов, которые вызывают заболевание, или от генов, гомологичных указанным генам. В соответствии с этим, в контексте настоящего изобретения, такие представляющие терапевтический интерес гены презентируются иммунной системе организма для воздействия на специфическую иммунную систему, а предпочтительно, для индуцирования специфического иммунного ответа и, тем самым, для вакцинации или профилактической защиты организма от инфицирования микроорганизмом. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения представляющие терапевтический интерес гены выбирают из генов инфекционных вирусов, таких как, не ограничиваясь ими, вирус денге, вирус японского энцефалита, вирус гепатита В или С или вирусы иммунодефицита, такие как ВИЧ.
Генами, происходящими от вируса денге, предпочтительно, являются гены N81 и РгМ, где указанные гены могут происходить от одного, двух, трех или всех четырех серотипов вируса денге. Ген N81 предпочтительно происходит от серотипа 2 вируса денге и предпочтительно встраивается в ЮК между ОРС 064Г-065Г (14Г-15Ь). Гены РгМ, предпочтительно происходящие от всех 4 серотипов вируса денге, предпочтительно встраивают в ЮК между ОРС, выбранными из 007К-008Б, 044Г-045Ь, 136Г-137Ь, 148К-149Б. Более предпочтительно, чтобы ген РгМ, происходящий от серотипа 1 вируса денге (РгМ1), был встроен в ЮК 148К-149Б, РгМ2 был встроен в ЮК ОРС 007К-008Б; РгМЗ был встроен в ЮК ОРС 044Г-045Ь, а РгМ4 был встроен в ЮК 136Г-137Ь.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения гетерологичная ДНК-последовательность происходит от ВИЧ и кодирует епу ВИЧ, где указанный ген епу ВИЧ, предпочтительно встраивают в ЮК между ОРС 007К-008Б.
Кроме того, представляющие терапевтический интерес гены согласно изобретению также включают в себя ассоциированные с заболеванием гены, которые оказывают терапевтическое действие на пролиферативные расстройства, рак или болезни обмена веществ. Так, например, представляющий терапевтический интерес ген, ассоциированный с раком, может быть раковым антигеном, который обладает способностью индуцировать специфическую противораковую иммунную реакцию.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, кодирующая последовательность включает в себя по меньшей мере один маркерный или селективный ген.
Селективные гены сообщают клетке резистентность к конкретному веществу, что позволяет осуществлять конкретный метод отбора. Специалистам-практикам известны различные селективные гены, которые могут быть использованы в поксвирусной системе. Такими генами, среди прочих, являются ген резистентности к неомицину (ΝΡΤ) или ген фосфорибозилтрансферазы (§ρΐ).
Маркерные гены индуцируют цветовую реакцию в трансдуцированных клетках и могут быть использованы для идентификации трансдуцированных клеток. Специалистам-практикам известны различные маркерные гены, которые могут быть использованы в поксвирусной системе. Такими генами, среди прочих, являются ген, кодирующий, например, β-галактозидазу (в-да1), β-глюкозидазу (β-βΐυ). зеленый флуоресцирующий белок (Е6РР) или синий флуоресцирующий белок.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения экзогенная ДНКпоследовательность содержит спейсерную последовательность, которая отделяет поксвирусный транскрипционный регуляторный элемент и/или кодирующую последовательность в экзогенной ДНКпоследовательности от стоп-кодона и/или инициирующего кодона смежных ОРС. Эта спейсерная последовательность, расположенная между стоп/старт-кодонами смежной ОРС и инсертированной кодирующей последовательностью в экзогенной ДНК, имеет то преимущество, что она стабилизирует инсертированную экзогенную ДНК, а следовательно, и любой полученный рекомбинантный вирус. Размер спейсерной последовательности варьируется, если только данная последовательность не имеет собственных кодирующих или регуляторных функций.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения спейсерная последовательность, отделяющая поксвирусный транскрипционный регуляторный элемент и/или кодирующую последовательность в экзогенной ДНК-последовательности от стоп-кодона смежной ОРС, имеет длину по меньшей мере в один нуклеотид.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения спейсерная последовательность,
- 4 007811 отделяющая поксвирусный транскрипционный регуляторный элемент и/или кодирующую последовательность в экзогенной ДНК-последовательности от инициирующего кодона смежной ОРС, имеет длину по меньшей мере в 30 нуклеотидов. В частности, в случае, когда типичный промоторный элемент вируса коровьей оспы идентифицирован выше инициирующего кодона, инсерция экзогенной ДНК не может отделять промоторный элемент от инициирующего кодона смежной ОРС. Типичный промоторный элемент вируса коровьей оспы может быть идентифицирован путем сканирования, например, последовательности ТАААТ на поздние промоторы (Наукой & Мокк, 1. Μοί. ΒίοΙ. 1989; 210: 771-784) и А/Тбогатый домен на ранние промоторы. Спейсерная последовательность, состоящая примерно из 30 нуклеотидов, предпочтительно должна иметь такую длину, чтобы она не оказывала негативного влияния на поксвирусный промотор, расположенный выше инициирующего кодона ОРС. Кроме того, в соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения, расстояние между инсертированной экзогенной ДНК и инициирующем кодоном смежной ОРС должно составлять примерно 50 нуклеотидов, а более предпочтительно, примерно 100 нуклеотидов.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения указанная спейсерная последовательность включает в себя дополнительный поксвирусный транскрипционный регуляторный элемент, способный регулировать транскрипцию смежной ОРС.
Типичным штаммом МУЛ, который может быть использован в соответствии с настоящим изобретением для генерирования рекомбинантного МУА, является МУА-575, который был депонирован в Европейской коллекции клеточных культур животных под номером депозита ЕСАСС У00120707.
Другим предпочтительным штаммом МУА является МУА-Уего или его производное. Штаммы МУА-Уего были депонированы в Европейской коллекции клеточных культур животных под номерами депозитов ЕСАСС У99101431 и 01021411. Безопасность МУА-Уего обусловлена его биологическими, химическими и физическими свойствам, описанными в Международной патентной заявке РСТ/ЕР01/02703. По сравнению с другими штаммами МУА, штамм МУА-Уего включает в себя одну дополнительную геномную делецию.
В еще одном варианте более предпочтительным штаммом МУА является штамм МУА-ΒΝ. МУАΒΝ был депонирован в Европейской коллекции клеточных культур животных под номером депозита ЕСАСС У00083008. Вирус МУА-ΒΝ является в высокой степени аттенюированным вирусом, который также происходит от модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (см. также РСТ/ЕР01/13628).
Используемый в настоящем изобретении термин производные вируса означает потомство вирусов, обладающих такими же отличительными признаками, что и родительский вирус, но обнаруживающие различия в одном или нескольких частях его генома. Термин производное МУА означает вирус, обладающий такими же функциональными свойствами, что и МУА. Так, например, производное МУАΒΝ обладает свойствами МУА-ΒΝ. Одним из таких свойств МУА-ΒΝ или его производных является его аттенюация и неспособность реплицироваться в человеческих клетках НаСа1.
Рекомбинантный МУА согласно изобретению может быть использован в качестве лекарственного средства или вакцины. То есть, в соответствии с настоящим изобретением, он может быть использован для введения экзогенной кодирующей последовательности в клетку-мишень, где указанная последовательность является либо гомологичной, либо гетерологичной геному клетки-мишени.
Введение экзогенной кодирующей последовательности в клетку-мишень может быть осуществлено ίη уйго для продуцирования белков, полипептидов, пептидов, антигенов или антигенных эпитопов. Этот метод предусматривает инфицирование клетки-хозяина рекомбинантным МУА согласно изобретению, культивирование инфицированной клетки-хозяина в подходящих условиях и выделение полипептида, пептида, белка, антигена, эпитопа и/или вируса, продуцируемых указанной клеткой-хозяином, и/или обогащение ими данной клетки.
Кроме того, способ введения одной или нескольких гомологичных или одной или нескольких гетерологичных последовательностей в клетки может быть использован для ίη уйго и ίη у1уо терапии. Для ίη уйго терапии выделенные клетки, которые были предварительно (ех у1уо) инфицированы рекомбинантным МУА согласно изобретению, вводят в живой организм животного для воздействия на его иммунную систему, а предпочтительно для индуцирования иммунного ответа. Для ίη у1уо терапии рекомбинантный поксвирус согласно изобретению непосредственно вводят в живой организм животного для воздействия на его иммунную систему, предпочтительно для индуцирования иммунного ответа. В этом случае клетки, окружающие участок инокуляции, а также клетки, в которые транспортируется вирус, например, через кровоток, непосредственно инфицируют ίη у1уо рекомбинантным МУА согласно изобретению. После инфицирования эти клетки синтезируют белки, пептиды или антигенные эпитопы терапевтических генов, которые кодируются экзогенными кодирующими последовательностями, а затем презентируют их или их части на клеточной поверхности. Специализированные клетки иммунной системы распознают презентированные таким образом гетерологичные белки, пептиды или эпитопы и запускают вырабатывание специфического иммунного ответа.
Поскольку МУА весьма ограничен в своем росте и поэтому он является в высокой степени аттенюированным, этот вирус может быть использован для лечения млекопитающих широкого ряда, включая человека, а также включая животных или человека с нарушением иммунной системы. Настоящее
- 5 007811 изобретение также относится к фармацевтическим композициям и вакцинам для индуцирования иммунного ответа в живом организме животного, включая человека.
В общих чертах, фармацевтическая композиция может содержать один или несколько фармацевтически приемлемых и/или апробированных носителей, добавок, антибиотиков, консервантов, адъювантов, разбавителей и/или стабилизаторов. Такими добавками могут быть вода, физиологический раствор, глицерин, этанол, смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-забуферивающие вещества или т.п. Подходящими носителями обычно являются крупные молекулы с замедленным метаболизмом, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты или т.п.
Для получения вакцин рекомбинантный поксвирус согласно изобретению превращают в его физиологически приемлемую форму. Это может быть осуществлено исходя из опыта изготовления вакцин на основе поксвируса, используемых для вакцинации против натуральной оспы (как описано 8(1ск1 Н. с1 а1., [1974] Э15с11. шсб. ЭДхсйг. 99, 2386-2392). Так, например, очищенный вирус хранят при -80°С с титром 5х108 ТС1Э51/мл. полученным примерно в 10 мМ трис, 140 мМ ЫаС1, рН 7,4. Например, для приготовления вакцинных препаратов для инъекций, 102-108 частиц вируса лиофилизуют в 100 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (РВ8) в присутствии 2% пептона и 1% человеческого альбумина в ампуле, предпочтительно в стеклянной ампуле. Альтернативно, вакцинные препараты для инъекций могут быть приготовлены путем постадийной лиофилизации указанного вируса в данном препарате. Такой препарат может содержать другие добавки, такие как маннит, декстран, сахар, глицин, лактозу или поливинилпирролидон или другие добавки, такие как антиоксиданты или инертный газ, стабилизаторы или рекомбинантные белки (например, альбумин человеческой сыворотки), подходящие для ίη νίνο введения. Затем стеклянную ампулу герметично закрывают и эта ампула может храниться в течение нескольких месяцев при температуре в пределах от 4°С до комнатной температуры. Однако, если нет необходимости в хранении при этих температурах, то такую ампулу предпочтительно хранить при температуре ниже -20°С.
Для вакцинации или терапии лиофилизат может быть растворен в 0,1-0,5 мл водного раствора, предпочтительно, физиологического раствора или трис-буфера, и введен либо системно, либо местно, то есть парентерально, подкожно, внутримышечно, путем скарификации или любым другим способом введения, известным практикующему врачу. Способ введения, доза и частота введения могут быть оптимизированы методами, известными специалистам. Однако в большинстве случаев пациенту вводят повторную инъекцию через определенный промежуток времени примерно от 1 месяца до 6 недель после первой вакцинации.
Кроме того, настоящее изобретение относится к плазмидным векторам, которые могут быть использованы для генерирования рекомбинантного МУЛ настоящего изобретения, а также оно относится к некоторым ДНК-последовательностям.
Обычно, ЮК, локализованная между двумя смежными ОРС или фланкированная этими двумя смежными ОРС, включает нуклеотидные последовательности, в которые может быть встроена нужная экзогенная ДНК-последовательность. В соответствии с этим, плазмидный вектор настоящего изобретения включает ДНК-последовательность, происходящую от последовательности генома МУА или от гомологичной ей последовательности, где указанная ДНК-последовательность включает полный или неполный фрагмент последовательности ЮК, локализованный между двумя смежными ОРС вирусного генома, или фланкированный этими двумя смежными ОРС. Предпочтительно, чтобы плазмидный вектор содержал инсертированный в указанную последовательность, происходящую от ЮК, по крайней мере, один сайт клонирования для инсерции нужной экзогенной ДНК-последовательности, а предпочтительно для инсерции поксвирусного транскрипционного регуляторного элемента, функционально присоединенного к указанной гетерологичной ДНК-последовательности. Плазмидный вектор может содержать, но необязательно, кассету репортерных генов и/или селективных генов. Такой плазмидный вектор также предпочтительно содержит последовательности двух смежных ОРС, фланкирующих указанный полный или неполный фрагмент последовательности ЮК.
Были идентифицированы некоторые ЮК, которые не включают нуклеотидные последовательности. В этих случаях плазмидный вектор включает ДНК-последовательности, фланкирующие ЮК, то есть ДНК-последовательности двух смежных ОРС. При этом предпочтительно, чтобы сайт клонирования для инсерции гетерологичной ДНК-последовательности был встроен в ЮК. ЮК-фланкирующие ДНКпоследовательности используют для направления инсерции экзогенных ДНК-последовательностей в соответствующую ЮК в геноме МУА. Такой плазмидный вектор может, кроме того, включать полный или неполный фрагмент последовательности ЮК, который содержит сайт клонирования для инсерции гетерологичной ДНК-последовательности и, необязательно, кассету репортерных и/или селективных генов.
ЮК-ДНК-последовательности, а также ЮК-фланкирующие последовательности двух смежных ОРС, предпочтительно, выбирают, соответственно, из ЮК и ОРС, выбранных из группы, содержащей
- 6 007811
0011ι-002ΐ», 00211-0031», 005Н-006К, 0061-007К, 007К.-0081,
0081»-009Ь, 01711-0181», 01811-0191», 0191-0201, 02 01- 0211,
0231»-0241», 0241-0251., 0251-0261, 028Н-0291, 03011-0311»,
0311-0321,, 0321-0331, 0351-0361, 0361-0371, 03711-03811,
0391-0401, 0431,-0441, 04411-0451», 046Ь-047Н, 0491,-0501,,
0501-0511», 0511-052Я, 052Н-053Н, 053Н-054К, 054Н-055К,
055Н-0561, 06111-0621», 0641-0651», 06511-0661), 0ббЬ-0б7Ь,
077Ь-078Н, 078К-079Я, 080К-081Н, 081К-082Ц, 082Ι/-083Η,
085Н-086П, 086К-087Н, 088Η-089Ι», 0891)-090Н, 092Κ-093Ι),
0941-095К, 096К-097К, 097К-098К, 101К-102К, 103К-104К,
1О51»-1О6Н, 107Η-108Ι», 1081,-1091., 1091)-1101), 11011-1111),
1131-1141, 1141-1151., 1151-116К, 1171-1181, 1181-119Н,
122Н-123Б, 1231-1241, 1241-1251, 1251)-1261), 133К-134К,
134Я-135Н, 136Ь-137Ь, 1371-138Ь, 1411-142К, 1431-144Н,
144Ю145К, 145К-146Н, 152П-153Б, 153Ц-154К, 146Я-147К, 154К-155К, 147К-148К, 156Η-157Ι», 148Н-149Б, 157Ι1-158Η,
159Κ-160Ι), 160Ι1-161Η, 162К-163Н, 163Н-164К, 164К-165К,
165Н-166К, 166К-167К, 167Н-168Н, 170К-171К, 173К-174К,
175Н-176В, 176К-177К, 178К-179В, 179Н-180К, 180К-181К,
183Н-184Я, 184К-1851, 1851-186К, 186К-187К, 187К-188Н,
188Ю189В, 189Н-190Я, 192Я-193К.
Более предпочтительно эти последовательности выбирают, соответственно, из ЮК и ОРС, выбранных из группы, включающей 007К-008Б, 018Б-019Б, 044Б-045Б, 064Б-065Б, 136Б-137Б, 148Б-149Б. Происходящие от ЮК последовательности предпочтительно выбирают из группы, содержащей нуклеотидные последовательности:
527-608 последовательности 8ец ΙΌ Νο. 32;
299-883 последовательности 8ец ΙΌ Νο. 33; 339-852 последовательности 8ец ΙΌ Νο. 34; 376-647 последовательности 8ец ΙΌ Νο. 35; 597-855 последовательности 8ец ΙΌ Νο. 36; 400-607 последовательности 8ец ΙΌ Νο. 37.
ЮК-фланкирующие последовательности двух смежных ОРС, предпочтительно, выбирают из группы, содержащей следующие нуклеотидные последовательности
1-525 и 609-1190 последовательности 8ец ΙΌ Νο. 32; 101-298 и 884-1198 последовательности 8ец ΙΌ Νο. 33; 1-338 и 853-1200 последовательности 8ец ΙΌ Νο. 34; 1-375 и 648-1200 последовательности 8ец ΙΌ Νο. 35; 1-596 и 856-1200 последовательности 8ец ΙΌ Νο. 36; 1-399 и 608-1081 последовательности 8ец ΙΌ Νο. 37.
Эти ДНК-последовательности, предпочтительно, происходят от последовательности генома МУЛ или от гомологичной ей последовательности, депонированой в ЕСАСС под номером депозита У00083008.
Для генерирования плазмидного вектора согласно изобретению, последовательности выделяют и клонируют в стандартный клонирующий вектор, такой как рВ1ие8спр1 (81га!адепе), где эти последовательности фланкируют экзогенную ДНК, встроенную в геном МУА. Такой плазмидный вектор может содержать, но необязательно, кассету селективных или репортерных генов, которая может быть делетирована из конечного рекомбинантного вируса благодаря включенной в указанную кассету повторяющейся последовательности.
Способы введения экзогенных ДНК-последовательностей в геном МУА посредством плазмидного вектора и методы получения рекомбинантного МУА хорошо известны специалистам, и кроме того, они могут быть найдены в нижеследующих руководствах:
в руководстве Μοίβ^ίατ Οίοηΐη^: (А кЮгаЮгу тапиа1. Весок! Εάΐΐΐοη. Ву I. ΒαιηΒΐ'οοΙκ, ЕгЮЪ, Е.Е. & МатаЮ Т., Οοίά Врпие ΗπγΒογ ^аЪο^аΐο^у Ргезз, 1989) описаны методы и ноу-хау для стандартных методов молекулярной биологии, таких как клонирование ДНК, выделение РНК, Вестерн-блот-анализ, ОТПЦР и ПЦР-амплификация;
в руководстве νίΐ'οίομν МеДюсЬ Мапиа1 (Ебйеб Ъу Впап Α..Ι. Мапу & НШаг О. Капдго. Асабетю
- 7 007811
Рге88. 1996) описаны методы обработки и модификации вирусов;
в руководстве Мо1еси1аг У1го1оду (А Ргасйса1 АрргоасЬ. Ебйеб Ьу А.Е Ωανίδοη & К.М. ЕШой. ТЬе Ргасбса1 АрргоасЬ 8епез. 1КЬ Ргезз а! ОхГогб Ишуегзйу Ргезз. ОхГогб 1993. СЬар!ег 9) описана экспрессия генов векторами вируса коровьей оспы;
в руководстве Сиггеп! Рго!осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду. (РиЬЬзйег: 1оЬп \УПеу апб 8оп 1пс. 1998. СЬар1ег 16, зес!юп 1У: Ехргеззюп оГ рго!етз ίη таттайап себе изтд Уасаша У1га1 уесЮг) описаны методы и ноу-хау для обработки, модификации и генной инженерии МУА.
МУА настоящего изобретения, а предпочтительно МУА, депонированный в ЕСАСС под номером депозита У00083008, может быть продуцирован путем трансфекции клетки плазмидным вектором настоящего изобретения, инфицирования указанной трансфицированной клетки вирусом МУА, а затем идентификации, выделения и, необязательно, очистки МУА настоящего изобретения.
ДНК-последовательности настоящего изобретения могут быть использованы для идентификации или выделения МУА или его производных согласно изобретению, а также для идентификации клеток или индивидуумов, инфицированных МУА настоящего изобретения. Эти ДНК-последовательности, например, используются для генерирования ПЦР-праймеров, гибридизационных зондов, либо они используются в технологии создания массивов.
Краткое описание графического материала
Фиг. 1: рестрикционная карта векторных конструкций рВЫХ39 (фиг. 1а), рВЫХ70 (фиг. 1Ь) и рВЫ84 (фиг. 1с), содержащих примерно 600 п.н. последовательностей МУА, фланкирующих сайт инсерции, находящийся за 14Ь ОРС. Эти плазмиды, кроме того, включают экзогенную ДНК (Есодр! и ЬВЕР, соответственно), находящуюся под транскрипционным контролем поксвирусного промотора Р, между фланкирующими последовательностями Е1апк 1 (Е1 14Б-15Б) и Е1апк 2 (Е2 14Б-15Б). Е1гр! означает повторяющуюся последовательность Е1апк 1, позволяющую делетировать репортерную кассету из полученного рекомбинантного вируса. рВЫ84 (фиг. 1с), кроме того, кодирует белок N81 вируса денге (N81 ЭЕИ). Далее используются следующие сокращения: АтрК = ген резистентности к ампициллину; п.н. пары нуклеотидов.
Фиг. 2: рестрикционная карта векторных конструкций рВЫХ51 (фиг. 2а), рВЫХ67 (фиг. 2Ь) и рВ№7 (фиг. 2с), содержащих примерно 600 п.н. последовательностей МУА, фланкирующих сайт инсерции, находящийся за 137Ь ОРС (Е1апк 1: Е1136-137 соответствует положению 129340-129930 генома МУА; Е1апк 2: Е2136-137 соответствует положению 129931-130540 генома МУА). Вектор рВЫХ67 (фиг. 2Ь), кроме того, включает экзогенную ДНК (ген ИРТП = ген резистентности к неомицину), находящуюся под транскрипционным контролем поксвирусного промотора Р между фланкирующими последовательностями. Е2гр! означает повторяющуюся последовательность Е1апк 2, позволяющую делетировать репортерную кассету из полученного рекомбинантного вируса. рВ№7 (фиг. 2с), кроме того, кодирует белок РгМ4 вируса денге, находящийся под транскрипционным контролем поксвирусного промотора. Далее используются следующие сокращения: АтрК = ген резистентности к ампициллину; п. н. - пары нуклеотидов, 1КЕ8 = внутренний сайт связывания с рибосомой; ЕСЕР = ген-усилитель для белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра.
Фиг. 3: рестрикционная карта векторных конструкций рВЫХ79 (фиг. 3а), рВЫХ86 (фиг. 3Ь) и рВNX88 (фиг. 3с), рВМ34 (фиг. 3б) и рВ№6 (фиг. 3е), содержащих примерно 600 п.н. последовательностей МУА, фланкирующих сайт инсерции, находящийся между ОРС 007К и 008Ь (Е1апк 1: Е1 1СК 07-08 начинается в положении 12200 генома МУА; Е1апк 2: Е2 1СК 07-08 заканчивается в положении 13400 генома МУА). Е2гр! означает повторяющуюся последовательность Е1апк 2, позволяющую делетировать репортерную кассету из полученного рекомбинантного вируса. Кроме того, векторы рВЫХ88 (фиг. 3с) и рВЫХ86 (фиг. 3Ь) содержат экзогенную ДНК (ВЕР + др! и ЫРТП + ЕСЕР, соответственно), находящуюся под транскрипционным контролем поксвирусного промотора Р между фланкирующими последовательностями. Е2гр! означает повторяющуюся последовательность Е1апк 2, позволяющую делетировать репортерную кассету из полученного рекомбинантного вируса. рВ№6 (фиг. 3е), кроме того, кодирует белок епу ВИЧ-1, а рВМ34 (фиг. 3б), содержит кодирующую последовательность РгМ2 вируса денге, находящуюся под контролем поксвирусного промотора. Далее используются следующие сокращения: АтрК = ген резистентности к ампициллину; п.н. пары нуклеотидов.
Фиг. 4: рестрикционная карта векторных конструкций рВNX80 (фиг. 4а), рВNX87 (фиг. 4Ь) и рВ№7 (фиг. 4с), содержащих примерно 600/640 п.н. последовательностей МУА, фланкирующих сайт инсерции, находящийся между ОРС 0044Б и 045Ь (Е1апк 1: Е1 1СК 44-45 начинается в положении 36730 генома МУА; Е1апк 2: Е2 1СК 44-45 заканчивается в положении 37970 генома МУА). Вектор рВNX87 (фиг. 4Ь), кроме того, содержит экзогенную ДНК (ген ΝΓΤΙΙ + ЕСЕР), находящуюся под транскрипционным контролем поксвирусного промотора Р между фланкирующими последовательностями. Е2гр! означает повторяющуюся последовательность Е1апк 2, позволяющую делетировать репортерную кассету из полученного рекомбинантного вируса. рВ№7 (фиг. 4с), кроме того, кодирует РгМ3 вируса денге, находящийся под контролем поксвирусного промотора. Далее используются следующие сокращения: АтрК = ген резистентности к ампициллину; п.н. пары нуклеотидов.
Фиг. 5: рестрикционная карта векторных конструкций рВЫХ90 (фиг. 5а), рВЫХ92 (фиг. 5Ь) и
- 8 007811 ρΒΝ54 (фиг. 5с), содержащих примерно 596/604 п.н. последовательностей МУЛ, фланкирующих сайт инсерции, находящийся между ОРС 148В и 149Ь (Р1аик 1: Р1 ЮК 148-149 начинается в положении 136900 генома МУА; Р1аик 2: Р2 ЮК 148-14 9 заканчивается в положении 138100 генома МУА). Вектор ρΒΝΧ92 (фиг. 5Ь), кроме того, содержит экзогенную ДНК (§ρΐ + ΒΡΡ), находящуюся под транскрипционным контролем поксвирусного промотора Р между фланкирующими последовательностями. ρΒΝ54 (фиг. 5с), кроме того, кодирует РгМ1 вируса денге. Ρ2ιρΐ означает повторяющуюся последовательность Р1аик 2, позволяющую делетировать репортерную кассету из полученного рекомбинантного вируса. Далее используются следующие сокращения: АифК = ген резистентности к ампициллину; п.н. - пары нуклеотидов.
Фиг. 6: схематическое представление межгенных сайтов инсерции МУА (СепЬаик № И94848).
Фиг. 7: ПЦР-анализ ЮК 14Ь-15Ь в рекомбинантном МУА с геном N81 вируса денге, встроенным в ЮК 14Ь-15Ь. Дорожка ΒΝ соответствует ПЦР-продукту, полученному с использованием пустого вектора МУА-ΒΝ. С использованием рекомбинантного N81-МУА был детектирован фрагмент более крупного размера (1, 2, 3, 4: различные концентрации ДНК). М = маркер молекулярной массы, Н2О = негативный контроль (вода).
Фиг. 8; 8а: ПЦР-анализ ЮК 136-137 в рекомбинантном МУА с геном РгМ4 вируса денге, встроенным в ЮК 136-137. Дорожка ΒΝ соответствует ПЦР-продукту, полученному с использованием пустого вектора МУА-ΒΝ. С использованием рекомбинантного РгМ4-МУА был детектирован фрагмент более крупного размера (тΒN23, 1/10, 1/100: различные концентрации ДНК). М = маркер молекулярной массы, Н2О = негативный контроль (вода), ρΒΝ27 = плазмида позитивного контроля.
Фиг. 8Ь: кривая многостадийного роста для пустого вектора МУА-ΒΝ и рекомбинантный МУА с геном РгМ4 вируса денге, встроенным в ЮК 136-137 (МУΑ-тΒN23).
Фиг. 9; 9а: ПЦР-анализ ЮК 07-08 в рекомбинантном МУА с геном РгМ2 вируса денге, встроенным в ЮК 07-08. Дорожка 3 соответствует ПЦР-продукту, полученному с использованием пустого вектора МУА-ΒΝ. С использованием рекомбинантного РгМ2-МУА был детектирован фрагмент более крупного размера (дорожка 2). М = маркер молекулярной массы, дорожка 1 = негативный контроль (вода).
Фиг. 9Ь: кривая многостадийного роста для пустого вектора МУА-ΒΝ и рекомбинантный МУА с геном РгМ2 вируса денге, встроенным в ЮК 07-08 (МУΑ-тΒN25).
Фиг. 10: ПЦР-анализ ЮК 07-08 в рекомбинантном МУА с геном еиу вируса ВИЧ, встроенным в ЮК 07-08. Дорожка ΒΝ соответствует ПЦР-продукту, полученному с использованием пустого вектора МУА-ΒΝ. С использованием рекомбинантного РгМ2-МУА был детектирован фрагмент более крупного размера (дорожки 1, 2, 3). М = маркер молекулярной массы, - = негативный контроль (вода), + = плазмида позитивного контроля.
Фиг. 11; 11а: ПЦР-анализ ЮК 44-45 в рекомбинантном МУА с геном РгМ3 вируса денге, встроенным в ЮК 44-45. Дорожка ΒΝ соответствует ПЦР-продукту, полученному с использованием пустого вектора МУА-ΒΝ. С использованием рекомбинантного РгМ3-МУА был детектирован фрагмент более крупного размера (дорожки 1-4, различные концентрации ДНК). М = маркер молекулярной массы, - = негативный контроль (вода).
Фиг. 11Ь: кривая многостадийного роста для пустого вектора МУА-ΒΝ и рекомбинантный МУА с геном РгМ3 вируса денге, встроенным в ЮК 44-45 (МУА-шН№8).
Фиг. 12; 12а: ПЦР-анализ ЮК 148-149 в рекомбинантном МУА с геном РгМ1 вируса денге, встроенным в ЮК 148-149. Дорожка ΒΝ соответствует ПЦР-продукту, полученному с использованием пустого вектора МУА-ΒΝ. С использованием рекомбинантного РгМ1-МУА был детектирован фрагмент более крупного размера (дорожка 1). М = маркер молекулярной массы, - = негативный контроль (вода), + = плазмида позитивного контроля.
Фиг. 12Ь: кривая многостадийного роста для пустого вектора МУА-ΒΝ и рекомбинантный МУА с геном РгМ1 вируса денге, встроенным в ЮК 44-45 (МУА-шН№3).
Настоящее изобретение подробно проиллюстрировано на нижеследующих примерах. Для каждого специалиста очевидно, что приведенные ниже примеры не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения. Объем настоящего изобретения не должен выходить за рамки объема прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1. Инсерционные векторы ρΒΝΧ39, ρΒΝΧ70 и ρΒΝ84.
Для инсерции экзогенных последовательностей в межгенную область, смежную с 065Ь ОРС (этот инсерционный сайт находится в положении генома 56760) МУА, конструировали вектор, содержащий примерно 1200 п. н. фланкирующих последовательностей, смежных с указанным инсерционным сайтом. Эти фланкирующие последовательности были разделены на два фланга, где на одном фланге присутствует примерно 610 п.н. 065Ь ОРС (альтернативная номенклатура: 14Ь ОРС), а на другом фланге присутствует примерно 580 п.н. межгенной области, находящейся за 065Ь ОРС, а также части ближайшей ОРС. Между этими фланкирующими последовательностями находится, соответственно, ген Есодэ! (§ρΐ означает ген фосфорибозилтрансферазы, выделенный из Е.соН) и ген ΒΡΡ (ген белка, флуоресцирующего в синем диапазоне спектра), находящиеся под транскрипционным контролем поксвирусного промотора. Кроме того, там присутствует по крайней мере один сайт клонирования для инсерции дополнительных генов или последовательностей, встраиваемых в межгенную область, находящуюся за 14Ь ОРС. Приме
- 9 007811 ры векторных конструкций настоящего изобретения описаны на фиг. 1 а) и Ь) (ρΒΝΧ39, ρΒΝΧ70). В векторе ρΒΝ84 (фиг. 1с), кодирующая область для N81 вируса денге встроена в сайт клонирования ρΒΝΧ70 (фиг. 1Ь).
Генерирование рекомбинантного МУЛ посредством гомологичной рекомбинации
Чужеродные гены могут быть встроены в геном МУА посредством гомологичной рекомбинации. Для этой цели нужный чужеродный ген клонируют в плазмидный вектор, описанный выше.
Этот вектор трансфицируют в МУА-инфицированные клетки. Рекомбинация происходит в цитоплазме инфицированных и трансфицированных клеток. С помощью селективной и/или репортерной кассеты, которая также содержится в инсерционном векторе, были идентифицированы и выделены клетки, содержащие рекомбинантные вирусы.
Для гомологичной рекомбинации, клетки ВНК (почек детеныша хомячка) или клетки СЕР (первичные фибробласты куриного эмбриона) высевали в 6-луночные планшеты с использованием ЭМЕМ (модифицированной по способу Дульбекко среды Игла, С1Ьсо ΒΚΕ) + 10% фетальная телячья сыворотка (РС8) или УР-8РМ (С1Ьсо ΒΚΕ) + 4 ммоль/л Ь-глутамина для осуществления продуцирования в бессывороточной среде.
Клетки должны находиться еще в фазе роста, а поэтому они должны достигать 60-80% конфлюентности на день трансфекции. Перед посевом клетки подсчитывали, поскольку для определения множественности заражения (т.о.1.) при инфицировании необходимо знать число клеток.
Для инфицирования маточный раствор МУА разводили в среде ИМЕМ/РС8 или в среде УР-8ЕМ/Ьглутамин так, чтобы разведение 500 мкл содержало соответствующее количество вируса, которое давало бы ш.о.1.= 0,1-1,0. Предполагается, что клетки начинают делиться сразу после посева. Затем среду удаляли из клеток и эти клетки инфицировали 500 мкл разведенного вируса в течение 1 ч в шейкере при комнатной температуре. Инокулят удаляли и клетки промывали ИМЕМ/УР-8РМ. Инфицированные клетки оставляли в 1,6 мл ИМЕМ/РС8 и УР-8РМ/Ь-глутамин, соответственно, для запуска реакции трансфекции (Οίαβοη ЕГГсс1спс Κίΐ).
Для осуществления трансфекции использовали трансфекционный набор ЕГГсс1спс (Οία^οη). Смесь для трансфекции приготавливали из 1-2 мкг линеаризованного инсерционного вектора (общее количество для множественной трансфекции) с добавлением буфера ЕС до конечного объема 100 мкл. После этого добавляли 3,2 мкл энхансера, интенсивно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем, после интенсивного встряхивания пробирки с маточным раствором, добавляли 10 мкл ЕГГсс1спс. и раствор тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. После этого добавляли 600 мкл ЭМЕМ/ЕС8 и УР-8РМ/Ь-глутамин, соответственно, и смесь перемешивали, после чего всю смесь для трансфекции добавляли к клеткам, которые были уже покрыты средой. Для перемешивания реакционной смеси для трансфекции чашки слегка покачивали. Инкубирование проводили при 37°С в присутствии 5% СО2 в течение ночи. На следующий день среду удаляли и заменяли свежей средой ЭМЕМ/ЕС8 или средой УР-8ЕМ/Ь-глутамин. Инкубирование продолжали вплоть до дня 3.
Для сбора клеток эти клетки соскабливали в среду, а затем клеточную суспензию переносили в подходящую пробирку и замораживали при -20°С для кратковременного хранения или при -80°С для длительного хранения.
Встраивание Есодц! в инсерционный сайт 14Ь МУА
В первом раунде клетки инфицировали МУА в соответствии с вышеописанным протоколом, и, кроме того, их трансфицировали инсерционным вектором ρΒΝΧ39 (фиг. 1а), содержащим ген Есодц! (Есодц! или ген, укороченный до βρΕ представляют собой ген фосфорибозилтрансферазы) в качестве репортерного гена. Полученные рекомбинантные вирусы очищали путем проведения 3 раундов очистки методом бляшек посредством отбора на метаболическое действие фосфорибозилтрансферазы при добавлении микофеноловой кислоты, ксантина и гипоксантина. Микофеноловая кислота (МРА) ингибирует инозин-монофосфат-дегидрогеназу, что приводит к блокированию синтеза пурина и ингибированию репликации вируса в большинстве клеточных линий. Такое блокирование может быть предотвращено путем экспрессии Есодц! с конститутивного промотора и продуцирования субстратов ксантина и гипоксантина.
Полученные рекомбинантные вирусы идентифицировали с помощью стандартных ПЦР-анализов с использованием пары праймеров, селективно амплифицирующих предполагаемый инсерционный сайт. Для амплификации инсерционного сайта 14Ь использовали пару праймеров ΒΝ499 (САА СТС ТСТ ТСТ ТСА ТТА СС, 8ЕС ГО ΝΟ: 1) и ΒΝ500 (ССА ТСА ААС ТСА АТС ТАТ С, 8ЕС ГО ΝΟ: 2). В случае амплификации ДНК вируса МУА в пустом векторе, предполагаемый ПЦР-фрагмент имеет длину в 328 нуклеотидов (нк), а в случае амплификации рекомбинантного МУА, который имеет встроенную экзогенную ДНК в инсерционном сайте 14Ь, этот фрагмент соответственно увеличивается.
Встраивание Ν81 в инсерционный сайд 1СК.064Е-065Ь (14Е-15Ь) МУА
В первом раунде клетки инфицировали МУА в соответствии с вышеописанным протоколом, и, кроме того, их трансфицировали инсерционным вектором ρΒΝ84 (фиг. 1с), содержащим ген Есодц! для отбора и ген ΒЕР (ген белка, флуоресцирующего в синем диапазоне спектра) в качестве репортерного
- 10 007811 гена. Полученные рекомбинантные вирусы очищали путем проведения 7 раундов очистки методом бляшек посредством отбора на метаболическое действие фосфорибозилтрансферазы при добавлении микофеноловой кислоты, ксантина и гипоксантина. Микофеноловая кислота (МРА) ингибирует инозинмонофосфат-дегидрогеназу, что приводит к блокированию синтеза пурина и ингибированию репликации вируса в большинстве клеточных линий. Такое блокирование может быть предотвращено путем экспрессии Есодр! с конститутивного промотора и продуцирования субстратов ксантина и гипоксантина.
Полученные рекомбинантные вирусы идентифицировали с помощью стандартных ПЦР-анализов с использованием пары праймеров, селективно амплифицирующих предполагаемый инсерционный сайт. Для амплификации инсерционного сайта 14Ь использовали пару праймеров ΒΝ499 (САА СТС ТСТ ТСТ ТСЛ ТТА СС, 8ЕЕ) ГО N0: 1) и ΒΝ500 (ССА ТСА ААС ТСА АТС ТАТ С, 8ЕЕ) ГО N0: 2). В случае амплификации ДНК вируса МУА в пустом векторе, предполагаемый ПЦР-фрагмент имеет длину в 328 нуклеотидов (нк), а в случае амплификации рекомбинантного МУА с N81, который имеет встроенную кодирующую область гена N81 вируса денге в инсерционном сайте 14Ь, этот фрагмент, предположительно, имеет длину 1683 п.н. Результаты ПЦР, представленные на фиг. 7, ясно указывают на стабильную инсерцию N81 в инсерционном сайте 14Ь после проведения 17 раундов амплификации вируса.
Тестирование гесМУА, включающего N81 (МУА-В№2) ίη νίίτο
Колбу Т25, содержащую монослои клеток ВНК примерно с 80%-ной конфлюентностью, инокулировали 100 мкл вирусного штамма, разведенного 1х107 в среде МЕМа с 1% ЕС8, и покачивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем в каждую колбу добавляли 5 мл МЕМа с 3% ЕС8 и инкубировали при 30°С в С02-инкубаторе. Через 48 ч содержимое колбы собирали. После этого из колбы удаляли супернатант и центрифугировали при 260 х д в течение 10 мин при 4°С. Супернатанты хранили в аликвотах при -80°С. Осадок 2 раза промывали 5 мл 1хРВ8, а затем ресуспендировали в 1 мл гипотонического буфера Даунса с 1% ТХ100. Клеточные лизаты собирали и центрифугировали в течение 5 мин при 16000 х д, после чего супернатанты хранили в микроцентрифужных пробирках при -80°С.
Колбы инокулировали МУА, включающем СЕР, и МУА, включающем ген N81 в делеционном сайте (МУА-ВМ)7). а ложноинфицированные колбы обрабатывали аналогичным образом, как описано выше.
Клеточный/вирусный лизат и супернатант обрабатывали в невосстанавливающем/восстанавливающем буфере для образцов при нагревании/без нагревания. Белки разделяли с помощью электрофореза в 10% ПААГ с ДСН и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Блоты зондировали в течение ночи сывороткой, взятой у выздоравливающих пациентов (РРС8) при разведении 1:500. После 3-кратной промывки 1Х РВ8 блоты инкубировали с ПХ-конъюгированными антителами против человеческих 1дС ГОАК0) в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки блотов вышеописанным способом проявляли окраску с использованием 4-хлор-1-нафтола.
Результаты Вестерн-блот-анализа показали, что N81 в МУА-В№2 экспрессировался в больших количествах. N81 экспрессировался в нужной конформации, в виде димера - без нагревания, и в виде мономера - при нагревании.
Экспрессию N81 сравнивали с экспрессией МУА-ВШ2 и МУА-ВМ17. Клетки ВНК инокулировали теми же б.о.е. и собирали через 48 ч. Результаты показали, что уровень экспрессии N81 в В№2 значительно превышает уровень экспрессии в ВМ)7. Результаты Вестерн-блот-анализов также показали, что в супернатанте с конструкцией ВМ2 секретировалось большее количество N81, чем в супернатанте с ВМ)7.
Эти результаты также показали, что N81, экспрессированный в инфицированных клетках В№2, является антигенным и распознается сывороткой, полученной от выздоравливающих пациентов.
Отсюда следует вывод, что N81 экспрессируется в больших количествах и в правильной конформации в В№2-инфицированных клетках ВНК. И димер, и мономер являются антигенными и распознаются сывороткой, взятой у выздоравливающих пациентов.
Пример 2. Инсерционный вектор рΒNX67 и рВ№7.
Последовательности МУА, смежные с новым инсерционным сайтом (в положении генома 129940) и расположенные между ОРС 136Б и 137Б, выделяли путем стандартной ПЦР-амплификации нужной последовательности с использованием следующих праймеров:
оВ№43 (ТССССССССАСАССССТААААСТТАААТТАСАТ; 81Т) ГО N0: 3) и оВ№44 (ТСАТСТАСААТСССТССТАААААСТССССАССТ; 81Т) ГО N0: 4) для выделения Е1апк 1; оВ№78 (ССССТССАСТТСАССТТСАСССТТСАТСС; 81Т) ГО N0: 5) и оВ№79 (СССССССССТАТТТТСТАТААТАТСТССТААС; 8ЕЕ) ГО N0: 6) для выделения Е1апк 2;
ПЦР-фрагмент, включающий Е1апк 1, обрабатывали рестриктирующими ферментами 8ас11 и ХЬа1 и лигировали в 8ас11/ХЬа1-гидролизованный и дефосфорилированный основной вектор, такой как рВ1ие8спр1 (8!га!адепе).
Полученную плазмиду гидролизовали ферментами Х1ю1/АраЕ дефосфорилировали и лигировали в ХМ/АраБгидролизованный ПЦР-фрагмент, содержащий Е1апк 2.
Необязательно, повторяющуюся последовательность Е1апк 2, которая была выделена посредством
- 11 007811
ПЦР с использованием праймеров ΟΒΝ545 (ССССТССАСССТАССТТСАССТТСАСССТТСАТСС; 8Еф ГО N0: 7) и ΟΒΝ546 (СССААССТТТАТАТССТТТАССАТАТТСТСТТТТ; 8Еф ГО N0: 8), и которая была гидролизована ферментами ΗίηάΙΙΙ/ΡδίΙ, встраивали в НтбШ/РЩ-сайт полученного вектора. Этот вектор (ρΒΝΧ51) показан на фиг. 2а.
Репортерная кассета, содержащая синтетический промотор, ген ΝΡΈΙΙ (ген резистентности к неомицину), область ро1у-А, ΙΡΕ8. ген Е6ЕР, (Рк-ОТТП-роуА-ТОЕ^-ЕбЕР), гидролизовали ферментами Εο1136ΙΙ/Χ1ιοΙ и встраивали в ΗίπάΙΙΙ/ΧΙιοΙ-сайт указанного инсерционного вектора, где ΗίηάΙΙΙ-сайт затупляли по концам ДНК-полимеразой Т4 (Восйе). Рестрикционная карта векторной конструкции, проиллюстрированной в этом примере, представлена на фиг. 2й (ρΒΝΧ67).
Для конструирования ρΒΝ27 (фиг. 2с), РгМ серотипа 4 вируса денге встраивали в одиночный ΡαοΙсайт ρΒΝΧ67.
Создание рекомбинантного МУА посредством гомологичной рекомбинации
Вектор ρΒΝΧ67 (фиг. 2й) может быть использован в целях генерирования рекомбинантного МУА в соответствии с вышеупомянутым протоколом, например, с использованием ρΒΝ27 (фиг. 2с) для гомологичной рекомбинации, в результате чего может быть получен рекомбинантный МУА, несущий РгМ4 вируса денге в межгенной области между двумя смежными ОРС.
Встраивание РгМ4 в инсерционный сайт ЮВ136-137 МУА
В первом раунде клетки инфицировали МУА в соответствии с вышеописанным протоколом и, кроме того, их трансфицировали инсерционным вектором ρΒΝ27 (фиг. 2с), содержащим ген ΝΡΪ для отбора и ЕСЕР (ген-усилитель белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра) в качестве репортерного гена. Полученные рекомбинантные вирусы очищали путем проведения 4 раундов очистки методом бляшек посредством отбора на С418.
Полученные рекомбинантные вирусы идентифицировали с помощью стандартных ПЦР-анализов с использованием пары праймеров для селективной амплификации предполагаемого инсерционного сайта. Для амплификации инсерционного сайта ЮВ136-137 использовали пару праймеров, ΒΝ900 (сдйсдса1дддйасс1сс, 8Еф ГО Ν0: 9) и ΒΝ901 (дасдса1дааддс1даас, 8Еф ГО Ν0: 10). В случае амплификации ДНК вируса МУА в пустом векторе предполагаемый ПЦР-фрагмент имеет длину в 88 нуклеотидов (нк), а в случае амплификации рекомбинантного МУА с РгМ4, который имеет встроенную кодирующую область РгМ4 вируса денге в инсерционном сайте ЮВ136-137, этот фрагмент предположительно имеет длину 880 п.н. Результаты ПЦР, представленные на фиг. 8а, ясно указывают на стабильную инсерцию РгМ4 в инсерционном сайте ЮВ136-137 после проведения 22 раундов амплификации вируса. Рекомбинантный МУА обнаруживал такую же способность к росту, как и МУА-ΒΝ. Он реплицировался в фибробластах куриного эмбриона (в клетках СЕЕ), но становился аттенюированным в клетках млекопитающих (фиг. 8й).
Пример 3. Инсерционный вектор ρΒΝΧ79, ρΒΝΧ86, ρΒΝΧ88, ρΒΝ34 и ρΒΝ56.
Последовательности МУА, смежные с новым инсерционным сайтом (в положении генома 12800) и расположенные между ОРС 007В и 008Ь выделяли путем стандартной ПЦР-амплификации нужной последовательности с использованием следующих праймеров:
ЮВ 07/08 ΕΠιρ (ССССАССТСААТААААААААСТТТТАС; 8Еф ГО Ν0: 11) и
ЮВ 07/08 Е1епС (АССССССССАТССАТСТТАТССААААТАТ; 8Еф ГО Ν0: 12) для выделения Е1апк 1;
ЮВ 07/08 Ε2υρ (ССССТССАССССССАТСССААТАТАТСССАТАСААС; 8Еф ГО Ν0: 13) и
ЮВ 07/08 Е2епС (САССССССТСТСАТСССТТТСАТС; 8Еф ГО Ν0: 14) для выделения Е1апк 2.
ПЦР-фрагмент, включающий Е1апк 1, обрабатывали рестриктирующими ферментами 8асП и ЗаЛ и лигировали в ЗасП/ЗасЕгидролизованный и дефосфорилированный основной вектор, такой как ρΒ1ικ3^ίρΐ (З1га1адепе).
Полученную плазмиду гидролизовали ферментами XйоI/АρаI, дефосфорилировали и лигировали в XйоI/АρаI-гидролизованный ПЦР-фрагмент, содержащий Е1апк 2.
Необязательно, повторяющуюся последовательность Е1апк 2, которая была выделена посредством ПЦР с использованием праймеров ЮВ 07/08 Ε2υρ (ССССТССАССССССАТСССААТАТАТСССАТАСААС; ЗЕЕ) ГО Ν0: 13) и ЮВ 07/08 Е2шЦ (ТТТСТССАСТСАТАТТТАТССААТАСТА; ЗЕф ГО Ν0: 15), и которая была гидролизована ферментами ΒηιηΗΙ/ΡδίΕ встраивали в ΒαιηΗΙ/ΡδίΙ^ηίίτ полученного вектора.
Любой репортерный или терапевтический ген, содержащийся в кассете, имеющей, например, поксвирусный промотор, маркерный ген, область ροΕ-Λ, необязательно элемент ГВЕ8, и дополнительный ген, например, экспрессирующий терапевтически активное вещество или генный продукт, может быть затуплен по концам ДНК-полимеразой Т4 (Восйе) после гидролиза рестриктирующими ферментами, и встроен в подходящий сайт клонирования плазмидного вектора. Рестрикционная карта векторной конструкции, проиллюстрированной в этом примере, представлена на фиг. 3 а (ρΒΝΧ79). В результате встраивания кассеты для отбора на NΡТ/ЕСЕΡ получали вектор ρΒΝΧ86 (фиг. 3й), а в результате встраивания кассеты для отбора на βρΙ/ΒΕΡ получали вектор ρΒΝΧ88 (фиг. 3с), соответственно. Принимая за терапевтический ген экспрессионную единицу, содержащую терапевтический ген и функционально присоединенный промотор, эту экспрессионную единицу встраивали в ΡηοΕο8ηγ. Для конструирования ρΒΝ34
- 12 007811 (фиг. 36), РгМ2 вируса денге клонировали в ρΒΝΧ88 (фиг. 3с), а для синтеза ρΒΝ56 (фиг. 3е), кодирующую область епу ВИЧ клонировали в Рас1-сайт в ρΒΝΧ86 (фиг. 3Ь).
Создание рекомбинантного МУЛ посредством гомологичной рекомбинации
Векторы ρΒΝΧ86 (фиг. 3Ь) и ρΒΝΧ88 (фиг. 3с), соответственно, могут быть использованы в целях генерирования рекомбинантного МУА в соответствии с вышеупомянутым протоколом. С использованием ρΒΝ34 (фиг. 36) для гомологичной рекомбинации получали рекомбинантный МУА, несущий РгМ2 вируса денге в межгенной области между двумя смежными ОРС. Рекомбинация ρΒΝ56 (фиг. 3е) с геномом МУА-ΒΝ приводила к получению рекомбинантного МУА, который содержит ген епу ВИЧ в соответствующей ЮК.
Встраивание РгМ2 в инсерционный сайт ЮК07-08 МУА
В первом раунде клетки инфицировали МУА в соответствии с вышеописанным протоколом и, кроме того, их трансфицировали инсерционным вектором ρΒΝ34 (фиг. 36), содержащим ген §ρΐ для отбора и ген ΒΡΡ в качестве репортерного гена. Полученные рекомбинантные вирусы очищали путем проведения 3 раундов очистки методом бляшек посредством отбора в присутствии микофеноловой кислоты, как описано в примере 1.
Полученные рекомбинантные вирусы идентифицировали с помощью стандартных ПЦР-анализов с использованием пары праймеров для селективной амплификации предполагаемого инсерционного сайта. Для амплификации инсерционного сайта ЮК07-08 использовали пару праймеров, ΒΝ902 (с1дда1ааа1асдаддасд1д, 8Еф ΙΌ ΝΟ: 16) и ΒΝ903 (дасаайа1ссдасдсассд, 8Еф ΙΌ ΝΟ: 17). В случае амплификации ДНК вируса МУА в пустом векторе предполагаемый ПЦР-фрагмент имеет длину в 190 нуклеотидов (нк), а в случае амплификации рекомбинантного МУА для РгМ2, который имеет встроенную кодирующую область РгМ2 вируса денге в инсерционном сайте ЮК07-08, этот фрагмент предположительно имеет длину 950 п.н. Результаты ПЦР, представленные на фиг. 9а, ясно указывают на стабильную инсерцию РгМ2 в инсерционном сайте ЮК07-08 после проведения 20 раундов амплификации вируса. Рекомбинантный МУА обнаруживал такую же способность к росту, как и МУА-ΒΝ. Он реплицировался в фибробластах куриного эмбриона (в клетках СЕР) , но становился аттенюированным в клетках млекопитающих (фиг. 9Ь).
Встраивание епу ВИЧ в инсерционный сайт ЮК07-08 МУА
В первом раунде клетки инфицировали МУА в соответствии с вышеописанным протоколом и, кроме того, их трансфицировали инсерционным вектором ρΒΝ56 (фиг. 3е), содержащим ген ΝΡΤ для отбора и ген ЕСРР в качестве репортерного гена. Полученные рекомбинантные вирусы очищали путем проведения 6 раундов очистки методом бляшек посредством отбора на С418.
Полученные рекомбинантные вирусы идентифицировали с помощью стандартных ПЦР-анализов с использованием пары праймеров для селективной амплификации предполагаемого инсерционного сайта. Для амплификации инсерционного сайта ЮК07-08, использовали пару праймеров, ΒΝ902 (с!дда1ааа1асдаддасд1д, 8Еф ΙΌ ΝΟ: 16) и ΒΝ903 (дасаайа1ссдасдсассд, 8Еф ΙΌ ΝΟ: 17). В случае амплификации ДНК вируса МУА в пустом векторе предполагаемый ПЦР-фрагмент имеет длину в 190 нуклеотидов (нк), а в случае амплификации рекомбинантного МУА с епу, который имеет встроенную кодирующую область епу ВИЧ в инсерционном сайте ЮК07-08, этот фрагмент предположительно имеет длину 2,6 т.п.н. Результаты ПЦР, представленные на фиг. 10, ясно указывают на стабильную инсерцию епу в инсерционном сайте ЮК07-08 после проведения 20 раундов амплификации вируса.
Пример 4. Инсерционный вектор ρΒΝΧ80, ρΒΝΧ87 и ρΒΝ47.
Последовательности МУА, смежные с новым инсерционным сайтом (в положении генома 37330) и расположенные между ОРС 044Ь и 045Ь выделяли путем стандартной ПЦР-амплификации нужной последовательности с использованием следующих праймеров:
ЮК 44/45 Ρ1υρ (ССССАССТСАТТТСТТАССТАСАСТСАТА, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 18) и
ЮК 44/45 Р1еп6 (АССССССССАСТСАААССТАСАСАССС, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 19) для выделения Р1апк 1;
ЮК 44/45 Ρ2υρ (ССССТССАССССССАТССТАААСТСТАТССАТТАТТ, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 20) и
ЮК 44/45 Р2еп6 (САССССССТАААТССССТТСТСААТ, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 21) для выделения Р1апк 2.
ПЦР-фрагмент, включающий Р1апк 1, обрабатывали рестриктирующими ферментами 8асП и 8ас! и лигировали в 8асII/8асI-гидролизованный и дефосфорилированный основной вектор, такой как ρΒ1ικ8^ίρΐ (81гайщепе).
Полученную плазмиду гидролизовали ферментами XйοI/АρаI, дефосфорилировали и лигировали в XйοI/АρаI-гидролизованный ПЦР-фрагмент, содержащий Р1апк 2.
Необязательно, повторяющуюся последовательность Р1апк 2, которая была выделена с помощью ПЦР с использованием праймеров ЮК 44/45 Ρ2υρ (ССССТССАССССССАТССТАААСТСТАТССАТТАТТ, 8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 20) и ЮК 44/45 Р2т16 (ТТТСТССАСССТТССТСССТТТСТАТТААСС, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 22), и которая была гидролизована ферментами ΒатΗI/Ρ8ίI, встраивали в ΒатΗI/Ρ8ΐI-сайт полученного вектора.
Любой репортерный или терапевтический ген, содержащийся в кассете, имеющей, например, поксвирусный промотор, маркерный ген, область ρο1γ-Ά, необязательно элемент ГКЕ8 и дополнительный ген, например, экспрессирующий терапевтически активное вещество или генный продукт, может быть
- 13 007811 затуплен по концам ДНК-полимеразой Т4 (Косйе) после гидролиза рестриктирующими ферментами, и встроен в подходящий сайт клонирования плазмидного вектора. Что касается кассеты репортерных генов, то предпочтительными сайтами клонирования являются сайты рестриктирующих ферментов ЕсоВ1. ЕсоКУ, ΗίηάΙΙΙ, Ауа1 или Х1юЕ расположенные между Е1аик 2 и Е1аик 2-повторами. Для конструирования ρΒΝΧ87 (фиг. 4Ь) кассету для отбора на ИРТ/ЕСЕР встраивали в ρΒΝΧ80 (фиг. 4а). Принимая за терапевтический ген экспрессионную единицу, содержащую терапевтический ген и функционально присоединенный промотор, эту экспрессионную единицу встраивали в Рас1-сайт.
Рестрикционная карта векторной конструкции, проиллюстрированной в этом примере, представлена на фиг. 4а и Ь (ρΒΝΧ80, ρΒΝΧ87).
Этот вектор был использован для генерирования, в соответствии с вышеупомянутым протоколом, рекомбинантного МУ А, несущего экзогенную последовательность в межгенной области между двумя смежными ОРС. Для конструирования ρΒΝ47 (фиг. 4с), РгМ серотипа 3 вируса денге клонировали в ρΒΝΧ87 (фиг. 4Ь).
Встраивание РгМЗ в инсерционный сайт 1СК44-45 МУА
В первом раунде клетки инфицировали МУА в соответствии с вышеописанным протоколом и, кроме того, их трансфицировали инсерционным вектором ρΒΝ47 (фиг. 4с), содержащим ген ΝΡΤ для отбора и ген ЕСЕР в качестве репортерного гена. Полученные рекомбинантные вирусы очищали путем проведения 3 раундов очистки методом бляшек посредством отбора на С418.
Полученные рекомбинантные вирусы идентифицировали с помощью стандартных ПЦР-анализов с использованием пары праймеров для селективной амплификации предполагаемого инсерционного сайта. Для амплификации инсерционного сайта ЮК44-45 использовали пару праймеров, ΒΝ904 (сдйадаасаасасассдасда!дд, БЕР ΙΌ ΝΟ: 23) и ΒΝ905 (сдда!даааааШйддаад, БЕР ΙΌ ΝΟ: 24). В случае амплификации ДНК вируса МУА в пустом векторе предполагаемый ПЦР-фрагмент имеет длину в 185 нуклеотидов (нк), а в случае амплификации рекомбинантного МУА с РгМЗ, который имеет встроенную кодирующую область РгМЗ вируса денге в инсерционном сайте ЮК44-45, этот фрагмент, предположительно, имеет длину 850 п.н. Результаты ПЦР, представленные на фиг. 11а, ясно указывают на стабильную инсерцию РгМЗ в инсерционном сайте ЮК.44-45 после проведения 19 раундов амплификации вируса. Рекомбинантный МУА обнаруживал такую же способность к росту, как и МУА-ΒΝ. Он реплицировался в фибробластах куриного эмбриона (в клетках СЕЕ), но становился аттенюированным в клетках млекопитающих (фиг. 11Ь).
Пример 5. Инсерционный вектор ρΒΝΧ90, ρΒΝΧ92 и ρΒΝ54.
Последовательности МУА, смежные с новым инсерционным сайтом (в положении генома 137496) и расположенные между ОРС 148К и 149Ь выделяли путем стандартной ПЦР-амплификации нужной последовательности с использованием следующих праймеров:
ЮК 148/149 Ε1υρ (ТССССССССССАСТСАТАСАТТАТССАСС, БЕС) ΙΌ ΝΟ: 25) и
ЮК 148/149 Е1 епс) (СТАСТСТАСАСТАСТСТАТТААТССАСАСАААТАС, БЕС) ΙΌ ΝΟ: 26) для выделения Е1аик 1;
ЮК 148/149 Ε2υρ (СССААССТТСССССССАТССССТТТСТАСТАТССССАТС, БЕС) ΙΌ ΝΟ: 27) и
ЮК 148/149 Е2еий (ТАСССССССТТАТТСССАТСАТАСАС, БЕС) И) ΝΟ: 28) для выделения Е1аик 2.
ПЦР-фрагмент, включающий Е1аик 1, обрабатывали рестриктирующими ферментами БасП и ΧЬаI и лигировали в БасII/ΧЬаI-гидролизованный и дефосфорилированный основной вектор, такой как ρΒ1иеБс^^ρΐ (Б!та!адеие).
Полученную плазмиду гидролизовали ферментами НшйШМра!, дефосфорилировали и лигировали в Η^ηάIII/АρаΕгидролизованный ПЦР-фрагмент, содержащий Е1аик 2.
Необязательно, повторяющуюся последовательность Е1аик 2, которая была выделена с помощью ПЦР с использованием праймеров ЮК 148/149 Ε2υρ (СССААССТТСССССССАТССССТТТСТАСТАТССССАТС, БЕР ΙΌ ΝΟ: 27) и ЮК 148/149 Е2т1й (ТТТСТССАСТСТАТААТАССАССАСС, БЕС) ΙΌ ΝΟ: 29), и которая была гидролизована ферментами ΒатΗI/Ρ8ίI, встраивали в РатНЕР^Н-сайт полученного вектора.
Любой репортерный или терапевтический ген, содержащийся в кассете, имеющей, например, поксвирусный промотор, маркерный ген, область ροΕ-Λ, необязательно элемент ГКЕБ и дополнительный ген, например, экспрессирующий терапевтически активное вещество или генный продукт, может быть затуплен по концам ДНК-полимеразой Т4 (Кос1 е) после гидролиза рестриктирующими ферментами, и встроен в подходящий сайт клонирования плазмидного вектора. Для конструирования ρΒΝΧ92 (фиг. 5Ь) экспрессирующую кассету, содержащую §ρΐ/ΒΕΡ, встраивали в указанный сайт клонирования. Что касается кассеты репортерных генов, то предпочтительными сайтами клонирования являются сайты рестриктирующих ферментов ΡδίΙ, ЕсоКЕ ΒсοКУ и ΗίηάΙΙΙ, расположенные между Е1аик 2 и Е1аик 2-повторами. Принимая за терапевтический ген экспрессионную единицу, содержащую терапевтический ген и функционально присоединенный промотор, эту экспрессионную единицу встраивали в РасЕсайт. Для конструирования ρΒΝ54 (фиг. 5с) в указанный РасЕсайт встраивали РгМ1 вируса денге.
Рестрикционная карта векторной конструкции, проиллюстрированной в этом примере, представлена на фиг. 5а) и Ь) (ρΒΝΧ90, ρΒΝΧ92).
- 14 007811
Этот вектор был использован для генерирования, в соответствии с вышеупомянутым протоколом, рекомбинантного МУА, несущего экзогенную последовательность в межгенной области между двумя смежными ОРС. При конструировании рекомбинантного МУА, экспрессирующего ген РгМ1 вируса денге (фиг. 5с), использовали рВЫ54 (фиг. 5с) для гомологичной рекомбинации.
Встраивание РгМ1 в инсерционный сайт ЮН148-149 МУА
В первом раунде клетки инфицировали МУА в соответствии с вышеописанным протоколом и, кроме того, их трансфицировали инсерционным вектором рВЫ54 (фиг. 5с), содержащим ген др! для отбора и ген ВЕР в качестве репортерного гена. Полученные рекомбинантные вирусы очищали путем проведения 3 раундов очистки методом бляшек посредством отбора в присутствии микофеноловой кислоты.
Полученные рекомбинантные вирусы идентифицировали с помощью стандартных ПЦР-анализов с использованием пары праймеров для селективной амплификации предполагаемого инсерционного сайта. Для амплификации инсерционного сайта ЮК148-149 использовали пару праймеров, ΕΝ960 (с!д!а!адд!а!д!сс!с!дсс, 8Е0 ΙΌ N0: 30) и ΕΝ961 (дс!ад!адасд!ддаада, 8Е0 ΙΌ N0: 31). В случае амплификации ДНК вируса МУА в пустом векторе, предполагаемый ПЦР-фрагмент имеет длину в 450 нуклеотидов (нк), а в случае амплификации рекомбинантного МУА с РгМ1, который имеет встроенную кодирующую область РгМ1 вируса денге в инсерционном сайте ЮК148-149, этот фрагмент, предположительно, имеет длину 1200 п.н. Результаты ПЦР, представленные на фиг. 12а, ясно указывают на стабильную инсерцию РгМ1 в инсерционном сайте ЮН 148-149 после проведения 23 раундов амплификации вируса. Рекомбинантный МУА обнаруживал такую же способность к росту, как и МУА-βΝ. Он реплицировался в фибробластах куриного эмбриона (в клетках СЕЕ), но становился аттенюированным в клетках млекопитающих (фиг. 12Ь).
- 15 007811
Международная заявка №
Регистрационный номер дела заявителя или агента
УКАЗАНИЯ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К ДЕПОНИРОВАННОМУ МИКРООРГАНИЗМУ (Правило РСТ ГЗЫз)
А. Ниже приводятся указания, относящиеся к микроорганизму, рассматриваемому в данном описании страница ,строка
В ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДЕПОЗИТА Другие депозиты идентифицированы на другом листе Ц
Названия учреждения-депозитария: ЕСАСС
Европейская коллекция клеточных культур
Адрес учреждения-депозитария (включая почтовый индекс и страну) Сеп(ге £ог АррНеб М1сгоЬю1о§у & Везеагсй
ЗаИзЬигу
ПГ1Х-1-!___ппл г\тп νν лишне огч νυν ипйеб Кт§бот
Дата депонирования: Регистрационный номер:
7 декабря 2000 00120707
С. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ УКАЗАНИЯ Продолжение информации на другом листе О
(оставить пустое место, если такие указания
отсутствуют)
Для всех указанных стран, в которых возможно осуществление такой процедуры и в той степени, в которой это юридически разрешено в соответствии с законом, действующим в названной стране, требуется, чтобы в указанной стране доступ к образцу депонированного микроорганизма был разрешен только по решению независимого эксперта в соответствии с существующим патентным законодательством, например, Правилом ЕРС 28(4); Правилами выдачи патентов в Великобритании 1995, Приложение 2, Параграф 3; Сводом законов Австралии 3.25(3); Патентным законом Дании: Разделы 22 и 33(3) и, в общих чертах, эти условия аналогичны, с учетом соответствующих изменений, для любой другой указанной страны.
В. НАЗВАНИЯ СТРАН, ДЛЯ КОТОРЫХ СДЕЛАНЫ УКАЗАНИЯ (если эти указания сделаны не для всех названных стран)
Е. СПЕЦИАЛЬНЫЕ УКАЗАНИЯ (оставить пустое место, если такие указания отсутствуют)
Указания, приведенные ниже, будут затем представлены на рассмотрение в Международное Бюро (представить общие данные, например, Регистрационный номер депозита)
Только для Международного бюро
Только для получающего ведомства
г-? Этот лист получен вместе с Международной заявкой рп. Этот лист получен Международным Бюро
Должностное лицо Должностное лицо
- 16 007811
ПРИЛОЖЕНИЕ 3 страница 14
БУДАПЕШТСКИЙ ДОГОВОР О МЕЖДУНАРОДНОМ ПРИЗНАНИИ ДЕПОНИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ПАТЕНТНОЙ ПРОЦЕДУРЫ МЕЖДУНАРОДНАЯ ФОРМА
ΒΑΥΑΡΙΑΝ ΝΟΗϋΙΟ КЕЗЕАКСН тмпгптттттп ηχκηττ ххчо а х л ν а а сгшп
ЕКАЦЫНОЕЕКЗТКАЗЗЕ 18В ϋ-82152 ΜΑΚΤΙΝ3ΚΙΕΏ
ΟΕΕΜΑΝΥ
ИМЯ И АДРЕС ДЕПОНЕНТА
I. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМА
Идентификационный номер, предоставленный депонентом ΜΥΑ-575 Регистрационный номер, присвоенный Международным депозитарием Υ00120707
II. НАУЧНОЕ ОПИСАНИЕ И/ИЛИ ПРЕДЛОЖЕННОЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ ОБОЗНАЧЕНИЕ
Для микроорганизма, идентифицированного выше в п.1, представлены: 13 Научное описание П Предложенное таксономическое обозначение (Отметить крестиком, там, где это необходимо)
III. КВИТАНЦИЯ И РАСПИСКА 0 ПРИНЯТИИ НА ДЕПОНИРОВАНИЕ
Международный депозитарий принимает данный микроорганизм, идентифицированный выше в п.1, который был получен 7-го декабря 2000 (дата предварительного депонирования)1
IV. УВЕДОМЛЕНИЕ 0 ТРЕБОВАНИИ ЗАМЕНЫ
Микроорганизм, идентифицированный выше в п.1, был получен Международным депозитарием (дата предварительного депонирования) и Требование о замене первоначального депозита на депозит, соответствующий Будапештскому договору, было получено депонентом (дата получения требования о замене)
IV. МЕЖДУНАРОДНЫЙ ДЕПОЗИТАРИЙ
Имя: ϋΓ. Р. Л. Раскег Адрес: ЕСАСС САМЕ Рогбоп ϋονζη ЗаИзЬигу ЗР4 ОЛЗ ' Подпись(и) лица(лиц), имеющего(их) право представлять Международный депозитарий или уполномоченного лица Дата:
1 Там где применяется Правило 6.4(ά), такой датой является дата приобретения статуса депозита Международного депозитария.
- 17 007811
ПРИЛОЖЕНИЕ 3 страница 24
БУДАПЕШТСКИЙ ДОГОВОР О МЕЖДУНАРОДНОМ ПРИЗНАНИИ ДЕПОНИРОВАНИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ПАТЕНТНОЙ ПРОЦЕДУРЫ
МЕЖДУНАРОДНАЯ ФОРМА
ΒΑνΑΚΙΑΝ ΝΟΚϋΙΟ КЕЗЕАКСН ίΝδτιτυτΕ омвн РВАЦЫНОРЕКЗТКАЗЗЕ 18В ϋ-82152 ΜΑΚΤΙΝδΚΙΕϋ ΟΕΚΜΑΝΥ
ИМЯ И АДРЕС ЛИЦА, КОТОРОМУ ВЫДАНО ПОДТВЕРЖДЕНИЕ О ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ МИКРООРГАНИЗМА
ПОДТВЕРЖДЕНИЕ, ВЫДАННОЕ МЕЖДУНАРОДНЫМ ДЕПОЗИТАРИЕМ, СОГЛАСНО ПРАВИЛУ 10.2
О ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ МИКРООРГАНИЗМА, ИДЕНТИФИЦИРОВАННОГО НА СЛЕДУЮЩЕЙ СТРАНИЦЕ
I. ДЕПОНЕНТ II. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМА
Имя: ΒΑνΑΚΙΑΝ ΝΟΚϋΙΟ КЕЗЕАКСН ΙΝ3ΤΙΤυΤΕ СМВН Адрес: ЕКАЦЦНОРЕКЗТКАЗЗЕ 18В ϋ-82152 ΜΑΚΤΙΝ8ΚΙΕΌ (3ΕΚΜΑΝΥ Регистрационный номер, присвоенный МЕЖДУНАРОДНЫМ ДЕПОЗИТАРИЕМ У00120707 Дата депонирования или передачи депозита: 7-го декабря 2000
II. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ
Жизнеспособность микроорганизма, идентифицированного выше в п.11, была протестирована2. На эту дату, указанный микроорганизм был: ΓΊ3 жизнеспособным П3 нежизнеспособным
1 Указать дату предварительного депонирования или, если был внесен новый депозит или была сделана его передача, то следует указать соответствующую дату (дату нового депозита или дату его передачи).
2 В случаях, когда применяется Правило 10.2 (а), пункты (ϋ) и (ίϋ) относятся к самому последнему тесту на жизнеспособность.
3 Нужное отметить крестиком в прилагаемом квадрате.
Приложение 3 страница 25
IV. УСЛОВИЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ТЕСТА НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ4
МУА-575 - У00120707 Этот вирус титровали на клетках ВНК, ТС±05о = 106'5
V. МЕЖДУНАРОДНЫЙ ДЕПОЗИТАРИЙ
Имя: Бг. Р. Д. Раскег ЕСАСС САМИ „ Рогбоп Ώονη ДРес· ЗаИзЬигу МкзНге ЗР4 оде Подпись(и) лица (лиц), имеющего(их) право представлять Международный депозитарий или уполномоченного(ых) лица (лиц) Дата:
4 Заполнить, если требуется информация, и если результаты данного теста были отрицательными
- 18 007811
СЕРТИФИКАТ АНАЛИЗА
Описание продукта Регистрационный номер
МУА-575
00120707
Описание теста:
Определение ТСШ50 путем титрования цитопатического вируса. Ячейка (ЗОР ЕСАСС/055)
Критерий принятия/Описание/Критерии: Негативный контроль не должен обнаруживать никаких признаков цитопатических эффектов (ЦПЭ). Тестируемый образец серийно разводят в 4 лунках с клеточными линиями-индикаторами для каждого разведения. Цитопатические эффекты указывают на присутствие вируса. Титр вируса вычисляют по нижеуказанному уравнению, где х означает величину, полученную из стандартной таблицы ТСГО50, исходя из распределения лунок, при котором обнаруживается менее, чем 4 положительных лунки на разведение, а у означает величину наивысшего разведения, где все 4 лунки являются положительными:
ТСЮ50 =-ίχ101+χ
У
Дата:
Результат:
19/01/01
Клеточная линия-индикатор: Негативный контроль: Тестируемый образец: Распределение: менее, чем 4 положительные лунки: X:
ВНК 21 клон 13
ЦПЭ отсутствует
ЦПЭ
4,4,0
Υ:
0,50
10’5 тсю50 =—!_х1о1+0·50 50 10-5 = ίο6·5
Общий результат:
Вирус присутствует
Описание теста:
Детекция микоплазмы путем выделения микоплазмы из агара со свиной сывороткой и из бульона с лошадиной сывороткой. ЗОР 0С1МУСОЮ1102
Критерий принятия/описание: Все чашки с позитивным контролем (М. рпеитотае & М. ога1ё) должны обнаруживать микоплазму по образованию типичных колоний на чашках с агаром. Бульоны субкультивировали на агаре со свиной сывороткой для микоплазмы, где присутствие микоплазмы оценивали по образованию типичных колоний. Все чашки с агаром для негативного контроля не должны обнаруживать микробного роста.
Критерием положительного теста служит обнаружение микоплазмы по образованию типичных колоний на агаре. Отрицательный результат указывает на отсутствие таких колоний.
Номер теста: 21702
Дата: 12/02/01
Результат: Позитивный контроль: Положительный
Негативный контроль: Отрицательный
Результат теста: Отрицательный
Общий результат: Тест пройден (принято)
Подпись
ЕСАСС, Начальник отдела по контролю за качеством
Дата
- 19 007811
СЕРТИФИКАТ АНАЛИЗА
Описание продукта Регистрационный номер МУА-575 00120707
Описание теста: Детекция микоплазмы с использованием клеточной линиии-индикатора Уего и системы флуоресцентной детекции НоесЫ 33258. ЗОР ОС/МУСО/07/05
Критерий принятия/Описание: Клетки Уего в негативном контроле явно видны как флуоресцирующие ядра без цитоплазматической флуоресценции. Позитивный контроль (М. ога1е) должен указывать на присутствие микоплазмы в виде флуоресцирующих ядер плюс внеядерная флуоресценция ДНК микоплазмы. Результаты положительного теста указывают на наличие внеядерной флуоресценции ДНК микоплазмы. Отрицательные результаты указывают отсутствие цитоплазматической флуоресценции.
Номер теста Дата: Результат: 21702 12/02/01 Позитивный контроль: Положительный Негативный контроль: Отрицательный Результат теста: Отрицательный Общий результат: Тест пройден
Описание теста: Детекция бактерий и грибков путем выделения на триптонно-соевом бульоне (ТВ8) и в жидком тиогликолевом бульоне (РТОМ). (ЗОР ОС/ВР/01/02)
Критерий принятия/описание: Все чашки с позитивным контролем (ВасШи$ зиЬИИз, С1о81п(Иит зрого§епез и Οαηάϊάα сйЫсапз) должны обнаруживать микробный рост (мутность), а негативный контроль не должен обнаруживать микробного роста (прозрачность). Критерием положительного теста служит мутность в любом из тестируемых бульонов. Прозрачность всех бульонов должна указывать на отрицательный результат теста.
Номер теста: 21702
Дата: 12/02/01
Результат: Позитивный контроль: Положительный Негативный контроль: Отрицательный Результат теста: Отрицательный Общий результат: Тест пройден
Подпись.................ЕСАСС, Начальник отдела по контролю за качеством.................Дата
- 20 007811
Регистрационный номер дела заявителя р^ или агента
Международная заявка №
УКАЗАНИЯ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К ДЕПОНИРОВАННОМУ МИКРООРГАНИЗМУ (Правило РСТ 13&й)
А. Ниже приводятся указания, относящиеся к микроорганизму, рассматриваемому в данном описании страница , строка
В. ЦЦЕН1ИФИКАЦИЯДЕПОЗИТА Другие депозиты идентифицированы на другом листе □ Названия учреждениядепозитария:
ЕСАСС
Европейская коллекция клеточных культур
Адрес учреждения-депозитария (включая почтовый индекс и страну) Сеп1ге ίοτ АррИеб М1сгоЫо1о§у & КекеагсЬ
ЗаИзЪигу
У¥Н18Ыге 8Р4 ОГО υηϊίεά Κίη§άοτη
Дата депонирования: 14 февраля 2001 Регистрационный номер: 01021411
С. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ УКАЗАНИЯ Продолжение информации на другом листе □
(оставить пустое место, если такие указания
отсутствуют)
Для всех укизянных стрйн, в которых возможно осуществление тякои процедуры и в той степени, в которой это юридически разрешено в соответствии с законом, действующим в названной стране, требуется, чтобы в указанной стране доступ к образцу депонированного микроорганизма был разрешен только по решению независимого эксперта в соответствии с существующим патентным законодательством, например, Правилом ЕРС 28(4); Правилами выдачи патентов в Великобритании 1995, Приложение 2, Параграф 3; Сводом законов Австралии 3.25(3); Патентным законом Дании: Разделы 22 и 33(3) и, в общих чертах, эти условия аналогичны, с учетом соответствующих изменений, для любой другой указанной страны.
ϋ. НАЗВАНИЯ СТРАН, ДЛЯ КОТОРЫХ СДЕЛАНЫ УКАЗАНИЯ (если эти указания сделаны не для всех названных стран)
Е. СПЕЦИАЛЬНЫЕ УКАЗАНИЯ (оставить пустое место, если такие указания отсутствуют)
Указания, приведенные ниже, будут затем представлены на рассмотрение в Международное
Ктлр0 (предстаеитъ общие донные, например, Регистрационный номер депозита'^
Только для Международного бюро
Только для получающего ведомства
[—ι Этот лист получен вместе с Международной заявкой ргз Этот лист получен “ Международным Бюро
Должностное лицо Должностное лицо
- 21 007811
ПРИЛОЖЕНИЕ 3 страница 14
БУДАПЕШТСКИЙ ДОГОВОР О МЕЖДУНАРОДНОМ ПРИЗНАНИИ ДЕПОНИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ПАТЕНТНОЙ ПРОЦЕДУРЫ МЕЖДУНАРОДНАЯ ФОРМА
ПРОФ. ϋΚ. ΑΝΤΟΝ МАУК
ΜΕΙΏΗΕΙΜΕΚ ВТК. 1
Ц-82319 5ΤΑΚΝΒΕΚΟ
ΟΕΗΜΑΝΥ
ИМЯ И АДРЕС ДЕПОНЕНТА
I. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМА
Идентификационный номер, предоставленный депонентом Уего-МУА-200 Регистрационный номер, присвоенный Международным депозитарием 01021411
II. НАУЧНОЕ ОПИСАНИЕ И/ИЛИ ПРЕДЛОЖЕННОЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ ОБОЗНАЧЕНИЕ
Для микроорганизма, идентифицированного выше в п.1, представлены: 53 Научное описание Г' Предложенное таксономическое обозначение (Отметить крестиком, там, где это необходимо)
III. КВИТАНЦИЯ И РАСПИСКА 0 ПРИНЯТИИ НА ДЕПОНИРОВАНИЕ
Международный депозитарий принимает данный микроорганизм, идентифицированный выше в п.1, который был получен 14-го февраля 2001 (дата предварительного депонирования)1
IV. УВЕДОМЛЕНИЕ 0 ТРЕБОВАНИИ ЗАМЕНЫ
Микроорганизм, идентифицированный выше в п.1, был получен Международным депозитарием (дата предварительного депонирования) и Требование о замене первоначального депозита на депозит, соответствующий Будапештскому договору, было получено депонентом (дата получения требования о замене)
IV. МЕЖДУНАРОДНЫЙ ДЕПОЗИТАРИЙ
Имя: Цг. Ц. Н. Ьемтз Адрес: ЕСАСС САМИ РогДоп Цсжп БаИзЬигу 5Р4 ОЛЗ Подпись(и) лица(лиц), имеющего(их) право представлять Международный депозитарий или уполномоченного лица Дата:
1 Там где применяется Правило 6.4(ά), такой датой является дата приобретения статуса депозита Международного депозитария.
- 22 007811
ПРИЛОЖЕНИЕ 3 страница 24
БУДАПЕШТСКИЙ ДОГОВОР О МЕЖДУНАРОДНОМ ПРИЗНАНИИ ДЕПОНИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ПАТЕНТНОЙ ПРОЦЕДУРЫ
МЕЖДУНАРОДНАЯ ФОРМА
ПРОФ. ΌΕ. ΑΝΤΟΝ МАУР
ИЕ1ЬНЕ1МЕК 5ТК. 1
Б-82319 3ΤΑΚΝΒΕΡΟ ΟΕΚΜΑΝΥ
ИМЯ И АДРЕС ЛИЦА, КОТОРОМУ ВЫДАНО ПОДТВЕРЖДЕНИЕ О ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ МИКРООРГАНИЗМА
ПОДТВЕРЖДЕНИЕ, ВЫДАННОЕ МЕЖДУНАРОДНЫМ ДЕПОЗИТАРИЕМ, СОГЛАСНО ПРАВИЛУ 10.2
О ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ МИКРООРГАНИЗМА, ИДЕНТИФИЦИРОВАННОГО НА СЛЕДУЮЩЕЙ СТРАНИЦЕ
I. ДЕПОНЕНТ II. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМА
т, ПРОФ. БК. ΑΝΤΟΝ МАУК Имя: Адрес: ИЕ1БНЕ1МЕК 5ТК. 1 Б-82319 3ΤΑΚΝΒΕΚΟ ΟΕΡΜΆΝΥ Регистрационный номер, присвоенный МЕЖДУНАРОДНЫМ ДЕПОЗИТАРИЕМ 01021411 Дата депонирования или передачи депозита: 14-го февраля 2001
II. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ
Жизнеспособность микроорганизма, идентифицированного выше в п.11, была протестирована2. На эту дату, указанный микроорганизм был: 133 жизнеспособным ГТ нежизнеспособным
1 Указать дату предварительного депонирования или, если был внесен новый депозит или была сделана его передача, то следует указать соответствующую дату (дату нового депозита или дату его передачи).
2 В случаях, когда применяется Правило 10.2 (а), пункты (ϋ) и (ϋϊ) относятся к самому последнему тесту на жизнеспособность.
3 Нужное отметить крестиком в прилагаемом квадрате.
Приложение 3 страница 25
IV. УСЛОВИЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ТЕСТА НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ4
Уего-МУА-200 титровали на клетках Уего для подтверждения их жизнеспособности.
V. МЕЖДУНАРОДНЫЙ ДЕПОЗИТАРИЙ
Имя: Бг. Б. Н. Ьем18 ЕСАСС САМИ „ Рогбоп Βονη ДРес· 5а1ϊзЬигу МИвЫге ЗР4 ОЛЗ Подпись(и) лица (лиц), имеющего(их) право представлять Международный депозитарий или уполномоченного(ых) лица (лиц) Дата:
4 Заполнить, если требуется информация, и если результаты данного теста были отрицательными
- 23 007811
Регистрационный номер дела заявителя 45 ц или агента Международная заявка №
УКАЗАНИЯ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К ДЕПОНИРОВАННОМУ МИКРООРГАНИЗМУ (Правило РСТ 13½)
A. Ниже приводятся указания, относящиеся к микроорганизму, рассматриваемому в данном описании страница__________13_____________, строка___________1_____________
B. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДЕПОЗИТА Другие депозиты идентифицированы на другом листе О
Названия учреждения-депозитария: ЕСАСС
Европейская коллекция клеточных культур
Адрес учреждения-депозитария (включая почтовый индекс и страну)
Сеп1ге Гог АррНеб М1сгоЫо1о§у & КезеагсЬ
ЗаНзЪшу
АЧИзЬлге 8Р4 ОЮ ипйеб Κίη^άοΐΏ
Дата депонирования: 14 октября 1999 Регистрационный номер: 99101431
С. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ УКАЗАНИЯ (оставить пустое место, если такие указания отсутствуют) Продолжение информации на другом листе 0
Для всех указанных стран, в которых возможно осуществление такой процедуры и в той степени, в которой это юридически разрешено в соответствии с законом, действующим в названной стране, требуется, чтобы в указанной стране доступ к образцу депонированного микроорганизма был разрешен только по решению независимого эксперта в соответствии с существующим патентным законодательством, например, Правилом ЕРС 28(4); Правилами выдачи патентов в Великобритании 1995, Приложение 2, Параграф 3; Сводом законов Австралии 3.25(3); Патентным законом Дании: Разделы 22 и 33(3) и, в общих чертах, эти условия аналогичны, с учетом соответствующих изменений, для любой другой указанной страны.
а НАЗВАНИЯ СТРАН, ДЛЯ КОТОРЫХ СДЕЛАНЫ УКАЗАНИЯ (если эти указания сделаны не для всех названных стран)
Е. СПЕЦИАЛЬНЫЕ УКАЗАНИЯ (оставить пустое место, если такие указания отсутствуют)
Указания, приведенные ниже, будут затем представлены на рассмотрение в Международное Бюро (представить общие данные, например, Регистрационный номер депозита)
Только для получающего ведомства Только для Международного бюро
—ι Этот лист получен вместе с Международной заявкой Й Этот лист получен Международным Бюро
Должностное лицо Должностное лицо
- 24 007811
ПРИЛОЖЕНИЕ 3 страница 14
БУДАПЕШТСКИЙ ДОГОВОР О МЕЖДУНАРОДНОМ ПРИЗНАНИИ ДЕПОНИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ПАТЕНТНОЙ ПРОЦЕДУРЫ МЕЖДУНАРОДНАЯ ФОРМА проф. ϋκ.ϋκ. н.с.миьт. αντον μαυκ
ΗΕΙΏΗΕΙΜΕΒ 5ТК. 1 ϋ-82319 5ΤΑΚΝΒΕΚΟ
ΟΕΚΜΑΝΥ
ИМЯ И АДРЕС ДЕПОНЕНТА
I. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМА
Идентификационный номер, предоставленный депонентом Уего-МУА Регистрационный номер, присвоенный Международным депозитарием У99101431
II. НАУЧНОЕ ОПИСАНИЕ И/ИЛИ ПРЕДЛОЖЕННОЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ ОБОЗНАЧЕНИЕ
Для микроорганизма, идентифицированного выше в п.1, представлены: Научное описание П Предложенное таксономическое обозначение (Отметить крестиком, там, где это необходимо)
III. КВИТАНЦИЯ И РАСПИСКА 0 ПРИНЯТИИ НА ДЕПОНИРОВАНИЕ
Международный депозитарий принимает данный микроорганизм, идентифицированный выше в п.1, который был получен 14-го октября 1999 (дата предварительного депонирования)1
IV. УВЕДОМЛЕНИЕ 0 ТРЕБОВАНИИ ЗАМЕНЫ
Микроорганизм, идентифицированный выше в п.1, был получен Международным депозитарием (дата предварительного депонирования) и Требование о замене первоначального депозита на депозит, соответствующий Будапештскому договору, было получено депонентом (дата получения требования о замене)
IV. МЕЖДУНАРОДНЫЙ ДЕПОЗИТАРИЙ
Имя: Όγ. Р. Ц. Раскег Адрес: ЕСАСС САМЕ Рогкоп Όονη БаИзЬигу ЗР4 ОЛЗ Подпись(и) лица(лиц), имеющего(их) право представлять Международный депозитарий или уполномоченного лица Дата:
1 Там где применяется Правило 6.4(ά), такой датой является дата приобретения статуса депозита Международного депозитария.
- 25 007811
ПРИЛОЖЕНИЕ 3 страница 24 БУДАПЕШТСКИЙ ДОГОВОР О МЕЖДУНАРОДНОМ ПРИЗНАНИИ ДЕПОНИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ПАТЕНТНОЙ ПРОЦЕДУРЫ МЕЖДУНАРОДНАЯ ФОРМА проф. ϋκ.ϋκ. н.с.миьт. αντον μαυκ ИЕ1БНЕ1МЕК ВТК. 1 ϋ-82319 5ΤΑΚΝΒΕΚΟ ΟΕΚΜΑΝΥ
ИМЯ И АДРЕС ЛИЦА, КОТОРОМУ ВЫДАНО ПОДТВЕРЖДЕНИЕ О ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ МИКРООРГАНИЗМА
ПОДТВЕРЖДЕНИЕ, ВЫДАННОЕ
МЕЖДУНАРОДНЫМ ДЕПОЗИТАРИЕМ, СОГЛАСНО ПРАВИЛУ 10.2
О ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ
МИКРООРГАНИЗМА,
ИДЕНТИФИЦИРОВАННОГО НА СЛЕДУЮЩЕЙ СТРАНИЦЕ
I. ДЕПОНЕНТ II. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМА
Имя: ПРОФ. ϋΚ.ΌΚ. Н.С. МЛЬТ. ΑΝΤΟΝ МАУК Адрес: ИЕ1ЬНЕ1МЕВ ЗТК. 1 ϋ-82319 ЗТАКЫВЕКО ΟΕΚΜΑΝΥ Регистрационный номер, присвоенный МЕЖДУНАРОДНЫМ ДЕПОЗИТАРИЕМ У99101431 Дата депонирования или передачи депозита: 14-го октября 1999
II. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ
Жизнеспособность микроорганизма, идентифицированного выше в п.11, была протестирована2. ' На эту дату, указанный микроорганизм был: СЗ3 жизнеспособным П3 нежизнеспособным
1 Указать дату предварительного депонирования или, если был внесен новый депозит или была сделана его передача, то следует указать соответствующую дату (дату нового депозита или дату его передачи).
2 В случаях, когда применяется Правило 10.2 (а), пункты (ίί) и (ίϋ) относятся к самому последнему тесту на жизнеспособность.
3 Нужное отметить крестиком в прилагаемом квадрате.
Приложение 3 страница 25
IV. УСЛОВИЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ТЕСТА НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ4 *
νείΌ-ΜνΑ-99101431 Этот вирус культивировали на клетках Уего в соответствии с инструкциями депонентов. Этот вирус является жизнеспособным и продуцирует цитопатический эффект через 48 часов. Был получен титр 6x10б бляшкообразующих единиц/мл
V. МЕЖДУНАРОДНЫЙ ДЕПОЗИТАРИЙ
Имя: Ότ. Р. Л. Раскег ЕСАСС САМК , Рогбоп ϋονζη Ал₽ес: ЗаИзЬигу ИШзЫге ЗР4 ОЛО Подпись(и) лица (лиц), имеющего(их) право представлять Международный депозитарий или уполномоченного(ых) лица (лиц) Да'та:
4 Заполнить, если требуется информация, и если результаты данного теста были отрицательными
- 26 007811
Регистрационный номер дела заявителя пхт тт НГЧ 4Э гС1-11 или агента Международная заявка №
УКАЗАНИЯ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К ДЕПОНИРОВАННОМУ МИКРООРГАНИЗМУ (Правило РСТ 13 Ыз)
A. Ниже приводятся указания, относящиеся к микроорганизму, рассматриваемому в данном описании
1 1 Л νιραπημα 9 νιρνινα ιу
B. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДЕПОЗИТА Другие депозиты идентифицированы на другом листе 0
Названия учреждения-депозитария: ЕСАСС
Европейская коллекция клеточных культур
Адрес учреждения-депозитария (включая почтовый индекс и страну)
Сеп!ге £ог АррНеб М1сгоЫо1о§у & КезеагсЬ
ЗаНзЬигу
МЛИзЫге 8Р4 ОЮ υηίΐεά Кшдбогп
Дата депонирования: 30 августа 2000 Регистрационный номер: 00083008
С. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ УКАЗАНИЯ Продолжение информации на другом листе □
(оставить пустое место, если такие указания
отсутствуют)
Для всех указанных стран, в которых возможно осуществление такой процедуры и в той степени, в которой это юридически разрешено в соответствии с законом, действующим в названной стране, требуется, чтобы в указанной стране доступ к образцу депонированного микроорганизма был разрешен только по решению независимого эксперта в соответствии с существующим патентным законодательством, например, Правилом ЕРС 28(4); Правилами выдачи патентов в Великобритании 1995, Приложение 2, Параграф 3; Сводом законов Австралии 3.25(3); Патентным законом Дании: Разделы 22 и 33(3) и, в общих чертах, эти условия аналогичны, с учетом соответствующих изменений, для любой другой указанной страны.
И. НАЗВАНИЯ СТРАН, ДЛЯ КОТОРЫХ СДЕЛАНЫ УКАЗАНИЯ (если эти указания сделаны не для всех названных стран)
Е. СПЕЦИАЛЬНЫЕ УКАЗАНИЯ (оставить пустое место, если такие указания отсутствуют)
Указания, приведенные ниже, будут затем представлены на рассмотрение в Международное Бюро (представить общие данные, например, Регистрационный номер депозита)
Только для получающего ведомства Только для Международного бюро
г-1 Этот лист получен вместе с *— Международной заявкой Этот лист получен Международным Бюро
Должностное лицо Должностное лицо
- 27 007811
ПРИЛОЖЕНИЕ 3 страница 14
БУДАПЕШТСКИЙ ДОГОВОР О МЕЖДУНАРОДНОМ ПРИЗНАНИИ ДЕПОНИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ПАТЕНТНОЙ ПРОЦЕДУРЫ МЕЖДУНАРОДНАЯ ФОРМА
ΒΑνΑΚΙΑΝ ЫОНБ1С КЕЗЕАКСН
ΙΝ3ΤΙΤυΤΕ СМВН
РКАЦЫНОРЕКЗТКАЗЗЕ 18В
Б-82152 ΜΑΒΤΙΝ3ΚΙΕΌ
ΟΕΚΜΑΝΥ
ИМЯ И АДРЕС ДЕПОНЕНТА
I. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМА
Идентификационный номер, предоставленный депонентом МУА-ΒΝ Регистрационный номер, присвоенный Международным депозитарием У00083008
II. НАУЧНОЕ ОПИСАНИЕ И/ИЛИ ПРЕДЛОЖЕННОЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ ОБОЗНАЧЕНИЕ
Для микроорганизма, идентифицированного выше в п.1, представлены: 13 Научное описание П Предложенное таксономическое обозначение (Отметить крестиком, там, где это необходимо)
III. КВИТАНЦИЯ И РАСПИСКА О ПРИНЯТИИ НА ДЕПОНИРОВАНИЕ
Международный депозитарий принимает данный микроорганизм, идентифицированный выше в п.1, который был получен 30-го августа 2000 (дата предварительного депонирования)1
IV. УВЕДОМЛЕНИЕ 0 ТРЕБОВАНИИ ЗАМЕНЫ
Микроорганизм, идентифицированный выше в п.1, был получен Международным депозитарием (дата предварительного депонирования) и Требование о замене первоначального депозита на депозит, соответствующий Будапештскому договору, было получено депонентом (дата получения требования о замене)
IV. МЕЖДУНАРОДНЫЙ ДЕПОЗИТАРИЙ
Имя: Бг. Р. И. Раскег Адрес: ЕСАСС САМЕ Рогбоп Бомп ЗаИзЬигу ЗР4 ОДО Подпись(и) лица(лиц), имеющего(их) право представлять Международный депозитарий или уполномоченного лица Дата:
1 Там где применяется Правило 6.4(ά), такой датой является дата приобретения статуса депозита Международного депозитария.
- 28 007811
ПРИЛОЖЕНИЕ 3 страница 24
БУДАПЕШТСКИЙ ДОГОВОР О МЕЖДУНАРОДНОМ ПРИЗНАНИИ ДЕПОНИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ПАТЕНТНОЙ ПРОЦЕДУРЫ МЕЖДУНАРОДНАЯ ФОРМА
ΒΑνΑΚΙΑΝ ΝΟΗΟΙΟ КЕ5ЕАКСН ΙΝΒΤΙΤυΤΕ СМВН РКАЦЫНОРЕКЗТКАЗЗЕ 18В Ц-82152 ΜΑΚΤΙΝΒΚΙΕϋ ΟΕΗΜΑΝΥ
ИМЯ И АДРЕС ЛИЦА, КОТОРОМУ ВЫДАНО ПОДТВЕРЖДЕНИЕ О ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ МИКРООРГАНИЗМА
ПОДТВЕРЖДЕНИЕ, ВЫДАННОЕ
МЕЖДУНАРОДНЫМ ДЕПОЗИТАРИЕМ, СОГЛАСНО ПРАВИЛУ 10.2
О ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ
МИКРООРГАНИЗМА,
ИДЕНТИФИЦИРОВАННОГО НА СЛЕДУЮЩЕЙ СТРАНИЦЕ
I. ДЕПОНЕНТ II. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМА
Имя: ΒΑνΑΚΙΑΝ ЫОКШС ВЕЗЕАКСН ΙΝΒΤΙΤυΤΕ СМВН Адрес: РКАЦЫНОРЕКЗТКАЗЗЕ 18В ϋ-82152 ΜΑΚΤΙΝ3ΒΙΕϋ ΟΕΒΜΑΝΥ Регистрационный номер, присвоенный МЕЖДУНАРОДНЫМ ДЕПОЗИТАРИЕМ У00083008 Дата депонирования или передачи депозита: 30-го августа 2000
II. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ
Жизнеспособность микроорганизма, идентифицированного выше в п.11, была протестирована2. На эту дату, указанный микроорганизм был: 133 жизнеспособным 1 I3 нежизнеспособным
1 Указать дату предварительного депонирования или, если был внесен новый депозит или была сделана его передача, то следует указать соответствующую дату (дату нового депозита или дату его передачи).
2 В случаях, когда применяется Правило 10.2(а), пункты (ίί) и (ίίί) относятся к самому последнему тесту на жизнеспособность.
3 Нужное отметить крестиком в прилагаемом квадрате.
Приложение 3 страница 25
IV. УСЛОВИЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ТЕСТА НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ4
ν00083008-ΜνΑ-ΒΝ Жизнеспособность ΜνΑ-ΒΝ тестируют путем культивирования этого вируса на клетках ВНК и вычисления ΤΟΙΌ5ο
V. МЕЖДУНАРОДНЫЙ ДЕПОЗИТАРИЙ
Имя: Цг. Р. Л. Раскег ЕСАСС САМИ _ Рогбоп Όονη = 5а11зЬигу ИШзЫге ЗР4 ОДО Подпись(и) лица (лиц), имеющего(их) право представлять Международный депозитарий или уполномоченного(ых) лица (лиц) Дата:
4 Заполнить, если требуется информация, и если результаты данного теста были отрицательными
- 29 007811
СЕРТИФИКАТ АНАЛИЗА
Описание продукта Регистрационный номер МУА-ΒΝ 00083008
Описание теста: Детекция микоплазмы путем выделения микоплазмы из агара со свиной сывороткой и из бульона с лошадиной сывороткой 8ОР рС/МУСО/01/02
хСрИТбрпИ ПрИНЯТИл/ОпИСЯНиб: Вес Ч2.ШКИ С ПОЗИТИВНЫМ КОНхрОЛСм \ινί.ри^йиЮШив & М. ога1е) должны обнаруживать микоплазму по образованию типичных колоний на чашках с агаром. Бульоны субкультивируют на агаре со свиной сывороткой для микоплазмы, где присутствие микоплазмы оценивают по образованию типичных колоний. Все чашки с агаром для негативного контроля не должны обнаруживать микробного роста. Критерием положительного теста служит обнаружение микоплазмы по образованию типичных колоний на агаре. Отрицательный результат указывает на отсутствие таких колоний.
Номер теста 21487
Дата: 27/11/00
Результат: Позитивный контроль: Положительный Негативный контроль: Отрицательный Результат теста: Отрицательный Общий результат: Тест пройден
Описание теста: Детекция микоплазмы с использованием клеточной линии-индикатора Уего и системы флуоресцентной детекции Ноеспз! 332э8. 8ОР ОС/МУСО/07/05
Критерий принятия/описание: Клетки Уего в негативном контроле явно видны как флуоресцирующие ядра без цитоплазматической флуоресценции. Позитивный контроль (М. ога1е) должен указывать на присутствие микоплазмы в виде флуоресцирующих ядер плюс внеядерная флуоресценция ДЕЛК микоплазмы. Результаты положительного теста указывают на наличие внеядерной флуоресценции ДНК микоплазмы. Отрицательные результаты указывают отсутствие цитоплазматической флуоресценции.
Номер теста: 21487
Дата: 27/11/00
Результат: Позитивный контроль: Положительный
Негативный контроль: Отрицательный
Результат теста: Отрицательный
Общий результат: Тест пройден
Подпись.................ЕСАСС, Начальник отдела по контролю за качеством.................Дата
- 30 007811
СЕРТИФИКАТ АНАЛИЗА
Описание продукта Регистрационный номер
ΜΥΑ-ΒΝ
00083008
Описание теста:
Детекция бактерий и грибков путем выделения на триптонно-соевом бульоне (ТВ8) и в жидком тиогликолевом бульоне (РТОМ). 80Р ОС/ВР/01/02
Критерий принятия/описание: Все чашки с позитивным контролем (ВасШих зиЬШй, С1ох1гйНит зрого^епез и СапсНАа а1Ысапз) должны обнаруживать микробный рост (мутность), а негативный контроль не должен обнаруживать микробного роста (прозрачность). Критерием на положительный тест служит мутность в любом из тестируемых бульонов. Прозрачность всех бульонов должна указывать на отрицательный результат теста.
Номер теста: 21487
Дата: 27/11/00
Результат: Позитивный контроль: Положительный
Негативный контроль: Отрицательный
Результат теста: Отрицательный
Общий результат: Тест пройден
Описание теста:
Определение ТСЮ50 путем титрования цитопатического вируса. Ячейка (80Р ЕСАСС/055)
Критерий принятия/Описание/Критерии: Негативный контроль не должен обнаруживать никаких признаков цитопатических эффектов. Тестируемый образец серийно разводят в 4 лунках с клеточными линиями-индикаторами для каждого разведения. Цитопатические эффекты указывают на присутствие вируса. Титр вируса вычисляют по нижеуказанному уравнению, где х означает величину, полученную из стандартной таблицы ТСШ50, исходя из распределения лунок, при котором обнаруживается менее, чем 4 положительных лунки на разведение, а у означает величину наивысшего разведения, где все 4 лунки являются положительными:
ТСЮ50 = -х10,+х
У οι /п/по V к! Ч·!
Результат:
Клеточная линия-индикатор: Негативный контроль: Тестируемый образец: Распределение: менее, чем 4 положительные лунки: X:
ВНК 21 (клон 13)
ЦПЭ отсутствует
ЦПЭ
4,4,4, 3,0
Υ:
1,25
10’3
ТСЮ50 =-1-х101+1’25 50 10’7 = 105’25
Общий результат:
Вирус присутствует
Подпись *** Конец Сертификата ***
ЕСАСС, Начальник отдела по контролю за качеством
Дата
- 31 007811
Список последовательностей <110> Вауап'ап иогсНс а/5 <120> Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (МУА) <130* ВЫ45РСТ <150> ЭК РА 2002 00752 <151> 2002-05-16 <160* 37 <17О> рахептш уегзч’оп 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> ДНК <213> праймер <400* 1 саасксксТТ сккдаккасс
<210> 2
<211> 19
<212> ДНК
<213* праймер
<400> 2
сдаксааадг саакскакд <210> 3 <211> 33 <212> ДНК <213* праймер
- 32 007811
<400> 3
гссссдсдда даддсдкааа адккааакка дак 33
<210> 4
<211> 33
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 4
гдагскадаа ксдсксдкаа аааскдсдда ддг 33
<210> 5
<211> 29
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 5
ссдсксдадк ксасдкксад сскксакдс 29
<210> 6
<211> 32
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 6
сдддддссск аккккдкака акакскддка ад 32
<210> 7
<211> 35
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 7
сддскдсадд дкасекксас дкксадсскк сакдс 35
<210> 8
<211> 34
<212> ДНК
<213> праймер
- 33 007811
<400> 8 34
сддаадсбГб абаВддббба ддабаббсбд ΐΐΐΐ
<210> 9
<211> 20
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 9 20
сдбгсдсабд ддббассбсс
<210> 10
<211> 18
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 10 18
дасдсабдаа ддсбдаас
<210> 11
<211> 27
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 11 27
сдсдадсбса абаааааааа дббббас
<210> 12
<211> 29
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 12 29
аддссдсдда бдсабдббаг дсаааакаб
<210> 13
<211> 36
<212> ДНК
- 34 007811 <213> праймер <400> 13 ссдсксдадс дсддакссса акакакддса кадаас <210> 14 <211> 24 <212> ДНК <213> праймер <400> 14 садддссстх ГсагсдсШ сакд 24 <210> 15 <211> 28 <212> ДНК <213> праймер <400> 15 кккскдсадк дакакккакс саакаска <210> 16 <211> 21 <212> ДНК <213> праймер <400> 16 скддакааак асдаддасдк д 21 <210> 17 <211> 20 <212> ДНК <213> праймер <400> 17 дасааккакс сдасдсассд <210> 18 <211> 29
- 35 007811 <212> ДНК <213> праймер <400> 18 сдсдадсБса БББСББадсБ ададБдаБа 29 <210> 19 <211> 27 <212> ДНК <213> праймер <400> 19 аддссдсдда дгдааадсБа дададдд 27
<210> 20
^71.1·»
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 20
ссдсБсдадс дсддаБссБа аасБдБаБсд аБхаББ 36 <210> 21 <211> 26 <212> ДНК <213> праймер <400> 21 садддссссБ аааБдсдсББ сБсааХ 26 <210> 22 <211> 31 <212> ДНК <213> праймер <400> 22
БББсБдсадс сББссБдддБ ББдБаББаас д 31 <210> 23
- 36 007811
<211> 24
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 23 сдкйадасаа сасассдасд агдд 24
<210> 24
<211> 21
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 24 сдд а1 даааа а€кМ1ддаа д 21
<210>
<211> 29
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 25 гссссдсддд дасгсагада «агсдасд 29
<210> 26
<211> 35
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 26 ссадгскада сгадгсгасс аанссасада аагас 35
<210> 27
<211> 39
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 27 сссаадсгсд ддсдддассс сдпгсгадг ахддддагс 39
- 37 007811
<210> 28
<211> 26
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 28 кадддсссдг гагхдссагд агадад 26
<210> 29
<211> 26
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 29 кХксгдсадк дгагаагасс асдадс 26
<210> 30
<211> 22
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 30 с£д1а*аддг аТдТсЛсГд сс 22
<210> 31
<211> 18
<212> ДНК
<213> праймер
<400> 31 г» л+'лллл л*»
уч. ту иску«14. у чуусйхусг л О и.9
<210> 32
<211> 1192
<212> ДНК
<213> вирус коровьей оспы
<220>
- 38 007811 <221> Фрагмент ОРС С 641.
<222> (1).. (526) <223>
<220>
<221> 16Я 64-65 <222> (527)..(608) <223>
<220>
<221> Фрагмент ОРС С 651_ <222> (609)..(1190) <223>
<400> 32 сассккскак адакскдада акддакдакк скссадксда аасакаккск ассакддакс60 сдкккааккк дккдакдаад акддакксак ссккааакдк кккскскдка акадккксса120 ссдааадаск акдсааадаа кккддаакдс дкксстгдкд сккаакдккк ссакадасдд180 сккскадаад ккдакасаас акаддаскад ссдсддкаас ΐΐΐΐβΐΐΐΐΐ адааадкакс240 саксдсккск аксккдккка дакккакккк какааадккк адксксксск кссаасакаа300 каааадкдда адксакккда скадакааас каксадкаад ккккакадад акадасдаас360 ааккадсдка ккдадаадса кккадкдкаа сдкакксдак асаккккдса ккадакккас420 кааксдаккк кдсакаскск акаасасссд сасаадкскд кададааксд скадакдсад480 каддксккдд сддадс^са аскскскксг кдаккасскк асксакдакк ааасскааак540 аагкдкасгк кдкаакакаа кдагакакак ккксасккка ксксакккда даакааааак600 дкккккдккк аассаскдса кдакдкасад аккксддаак сдсааассас садкддкккк660 аккккаксск кдкссаакдк дааткдаакд ддадсддакд сдддккксдк асдБадакад720 касакксссд кккккадасс дадаскссак ссдкааааак дсакасксдк кадкккддаа780 каасксддак скдскакакд дакакксака даккдасккк даксдакдаа ддсксссскд840 кскдсадсса кккккакдак сдксккккдк ддаакккссс ааакадкккк акааасксдс900 ккаакакскк скддааддкк кдкаккскда акддакссас сакскдссак ааксскаккс960 ккдаксксак саккссакаа кккксксксд дккааааскс кааддадакд сддаккааск1020 асккдааакк скссадасаа каскскссда дкдкааакак каскддкака сддккссасс1080 дасксаккак кксссаааак ккдадсадкк дакдсадксд дсакаддкдс сассаакааа1140
- 39 007811 сгамхсхаа дассдсагдг тстдаггтта тстттгадад дттсссаатт сс 1192 <210> 33 <2И> 1200 <212> ДНК <213> вирус коровьей оспы <220>
<221> Фрагмент ОРС 135 К <2ί2> (1).. (96) <223>
<22О>
<221> ОРС С 1361.
<222> (101)..(298) <223>
<220>
<221> Ι6Κ 136-137 <222> (299)..(883) <223>
<220>
<221> Фрагмент ОРС С 1371_ <222> (884)..(1198) <223>
<400> 33 ададдсдтаа аадИааагх адатгтсдаа сдааддссЬс сТТсд-ССкТа гааасрагьа60 дасааадстд агсгсааасс дтсихгсГд дгдгаа1а« ссадтгтддг адкадатаса120
ТатсааГаТс атсаааТСсд адагссдааС ТаСааааТдд дсдТддаггд тгаастатад180 аагсддасдг стдататтсд аааатстдгд дадгспадд т1дд1дда ддгдсаасЕд240 стасттддда тасгдаадкс ^дагаттсад ааадсгдддд дагдМссдд «сдасаСсс300 ассдагддтд тсасагсаск ааГсддИсд дтаасдтсХд гддасдатдд аддсассасГ360 тстасаддтт стддгссгск аСссГсадтс а1саасддад сгасстсаат дсдаддаааГ420
- 40 007811 ддабаадддд ддаабддгдд сгсаДдддда Дсддаадаад адддаадада ДсДасдадаа480 адаДассдат сасдггсдад ддсдсдпдд ДадаасДДаа οΐΐΐΐΐοΐΐΐ сДссдсадсд540 адДДдаДаДД ссаассДсДД сасдДДсдса ДдддДДассб ссдсадДДДД Дасдадсдаг600 ддсасдддса дссддсаддс ддсддададс аддааддсдс ддадсдддад сддддддадс660 ддсДдгсасс ддадсааддс сдддгддадд ааасдсдаса даадсададс садддсдадд720 дддддддсда ададааасда ддададсадс аДДдсДааах ддддсаадад дадсдаааас780 адаагадссд ааассадада ададададдс аддаасасдс ааассааадд Дссаддахдс840 дссДааадас ддааасддда ададбдсдаа аДсаДДсааа аадсдассас ДДаДадаДад900 аДадаДадДа садаааддсд дададдаддс Тассдадсдс дддаддадда ааассддсад960 гасдагсаДа даДдДсдДда ДаДассДдДд аДссдДДДас дддааассад ааадасаддд1020 дДдадссДа! ааасаДдааХ ДДаДДДсДаа ддсхсададс дададДДааД ДдассдДдДа1080 аДаДДДдсДД асаДдсаДас дддадасдад саддаадаад аДДДДДаДса дддсдсддда1140 дддсадааДс ддадададаа ддаддассад сдДдаДДсДД ассадададд аДасааааДа1200 <210>34 <211> 1200 <212> ДНК <213> вирус коровьей оспы <220>
<221> Фрагмент ОРС 07К <222> (1).. (338) <223>
<220>
<221> Ι5Κ 07-08 <222> (339)..(852) <223>
<220>
<221> Фрагмент ОРС С 08Д <222> (853)..(1200) <223>
<400> 34
- 41 007811 аакааааааа адккккаска акккаааакк акккасаккк кккксаскдк ккадксдсдд60 акакддаакк: сдакссгдсс ааааксаака саксакскак адаксакдка асаагаккас120 аакасакада кдаассааак дакакаадас каасадкакд саккаксаса аааакааакс180 сасакккддс кааксааккк сдддсккдда ааааасдкак сдссддаадд даскакакда240 скаасккакс кададакаса ддаакасаас ааксааааск каскдаааск дксааааааа300 кадааасака какддкскак акакасаска саакккадкк аккааккдда каассдакдк360 даккаксаак саагаккаад ааддккддка аагсддкаса кадскаакаа касскакаса420 сссаакаака саасаассак ккскдадккд дакаксагса ааакаскдда кааакасдад480 дасдкдкака дадкаадкаа адааааадаа кдкдаааккк дскакдаадк кдкккаскса540 ааасдакада каскккддкк гаккддаккс дкдкааксак акаккккдса каасатдсак600 саакакакдд сакадаасас даададааас сддкдсдксд дакааккдкс скакакдксд660 касссдкккк адааасакаа саакдадсаа дккааскаак ааагааааад кккаакккдк720 кдасдасдка кдксдккакк кккксксдка каааадакка акккдаккск аакакааксх780 ккадкаккдд акааакакса акксааакка аккссаккад аккакаксак ааакааааак840 адкадсасдс аскаскксад ссааакаккс ккккккдааа сдссакскак сдкадкдадд900 асасаадкда асскакаакд адсаааккка ккадкаксдд ккасакдаад даскккасдг960 ададкддкда ккссаскакс кдкддкасда асддккксак сккскккдак дссаксассс1020 адакдккска гааасккддк аксскккдсс аассаакаса какадскааа сксаддсака1080 кдккссасас аксскдааса акдаааккск ссадаадакд ккасаакдкс кадаккСдда1140 сакккддккк саассдсдкк аасакакдад кдаасасасс сакасакдаа адсдакдада1200 <210* 35 <211> 1200 <212> ДНК <213> вирус коровьей оспы <220* <221* Фрагмент ОРС С 44Ь <222> (1) ··(375) <223* <220>
<221> 1СЯ 44-45 <222> (376)..(647) <223*
- 42 007811 <220>
<221> Фрагмент ОРС С 45Б <222> С648)..С12ОО) <223>
<400> 35 аккксккадс кададкдака аккксдттаа аасакксааа гдккдккааа кдаксддакс60 каааакссак аккккскддк адгдкккста ссадсскаса ккккдскссс дсаддкассд120 дкдсааакдд ссасакккад ккаасакааа аасккакаса ксскдккска ксаасдаккс180 кадаакакса ксддскакак сдсеааааГС кксаксааад ксдасаксас аасскааскс240 адксаакака ккаадаадкк ссакдакдкс акскксдкск акккстакак ссдкакссак300 кдкадаккдк кдассдакка ТсдадТккаа аксаккаста акасксаакс скксадаака360 саакскдкдк кксагхдкаа акккакаддс ддкдкаккка адккддкада кккксаакка420 кдкаксаака кадсаасадк адпспдсс ссксскда! кскадсаксс 1спса«а1480 ккксккскас дкасакааас акдкссаака сдккадасаа сасассдасд акддсддссд540 ссасадасас даакакдаск ааассдатда ссакккаааа ассссксксг адсккксаск600 каааскдкак сдаккаккск кккадаасак дкакаакака аааасаккак кскаккксда660 акккаддскк ссаааааккк кксакссдка аассдакаак аакакакака дасккдккаа720 кадксддаак ааакадакка акдсккааас каксаксакс кссасдакка дадакасаак780 акккасаккк кккккдскдк кксдаааскк каксаакаса сдккаакаса аасссаддаа840 ддадакаккд аааскдаддс кдккдаааак дааасддкда акасаакаак ксадакаакд900 кааааксакд аккссдкакк скдакдакак кадааскдск аакддакдкс дакддкакдк960 акскаддадк акскакккка асааадсакс дакккдскаа какасаакка ксаккккдак1020 таактдктаг тгкакксака кксккаааад дкгссакакк каксааккск кскасаткаа1080 ааакккссак ккккааккка кдкадссссд саакасксск саккасдккк саккккккдк1140 скакаакакс саккккдккс аксксддкас акадаккакс сааккдадаа дсдсакккад1200 <210> 36 <211> 1200 <212> ДНК <213> вирус коровьей оспы <220>
<221> Фрагмент ОРС 148Р
- 43 007811 <222> (1)..(596) <223>
<220>
<221> Ι6Κ 148-149 <222> (597)..(855) <223>
<220>
<221> Фрагмент ОРС С 1491_ <222> (856).. (1200) <223>
<400> 36 сксакадакк аксдасдакк акаскскдка ккадккскдк сддаддакдк дккакскска60 кадакаакда сдксаакддс ааааакаккс каассккксс саккдаксак дскдкаакса120 какссссаск дадкааакдк дксдкадкка дсаадддксс касаассака ккддккдкка180 аадсддакак асскадсааа сдаккддкаа саксдкккас ааасдасака скдкакдкаа240 асаакскакс аскдаккаак какксдссдк кдкскдкакк саккаккада сдадккассд300 аскакккдда кадасасата кдсдаксада какккдсдаа каакаадкдд каккссакка360 каассаксда саакаадсад ккксскаккс саксаааскд какаддкакд ксскскдсса420 адкасакааа ккскадсакс дадсаадака скккаакаса кдкккдкаас сксдадсакс480 сакксдаскк адкакасааа аааакдсадк сдкасааккс кдкасскакс ааддаасааа540 каккдкасдд кадааккдак аакакааака кдадсаккад какккскдкд даккаакада600 кккскадкак ддддаксакк ааксакскск аакскскааа кассксакаа аасдаааааа660 аадскаккак сааакаскдк асддаакдда кксакксгск ксксккккка кдаааскскд720 ккдкакакск аскдакаааа скддаадсаа аааакскдак ааааадаака адаакаадак780 сааддаккак какаааакаа саакадкксс кддкксскск тссасдкска скадсксдкд840 дкаккакаса сакдсскадк аакадкскск ккдсдккдас ддааадсада скадааакаа900 саддскаааа кдкксадаса ссакаакадк ксссаассса дакаакааса дадкассакс960 аасасакксс кккаааскса аксссааасс саааассдкк аааакдкакс сддссааккд1020 акадкадака акдаддкдка садсдсакда кдакккасас адкаассааа акдаааакас1080 кккадкаакк акаадааака кадакддкаа сдксаксакс аасаакссаа каакакдссд1140 дададкааас аккдасддак аааасааааа кдскссдсак ааскскакса кддсаакаас1200
- 44 007811 <210> 37 <211> 1200 <212> ДНК <213> вирус коровьей оспы <220>
<221> Фрагмент ОРС 018ί <222> (1)..(399) <223>
<220>
<221> Ι6Κ 0186-0196 <222> ¢400)..(607) <223>
<220>
<221> Фрагмент ОРС С 0191.
<222> (608)..(1081) <223>
<220>
<221> некодирующая область <222> (1082)..(1200) <223>
<400> 37 ддабдадбад ббббсббсбб баасбббаба сбббббасба абсабаббба дасбдабдба 60 бдддбаабад тдттбааада дббсдббсбс абсабсадаа бааабсааба бсбсгдбббб бббдббабас адабдбабба садссбсага баббасдбаа бадаасдбдб сабсбассбб абкаасбббс ассдсабадб бдггсдсааа басддгсааб ссбббдассс сдбсдабббс сдассаабсб дддсдбабаа бдаабсбааа сбббаабббс ббдбаабсаб бсдааабааб ГбГбадбббд сабссдТадб бабссссббб абдбаасбдб ааагббсбса асдсдабабс бссаббааба абдабдбсда аббсдбдсбд бабасссаба сбдаабддаб даасдаабас сдасддсдбб аабадбаахб 1ас«1±1ха бсбббасаба ббдддбасба дббббасбаб
Л ин си ГЧ1 н К оо ιν в) о А оо К*
О О О О О О О
- 45 007811 сатаадтыа
Ьааа+тссас аадсйастаБ ддаатаадсс аассагспа дгагаасаса
540 сатдхсхгаа адггьатгаа «запаса!
дпдпсга!
агагсдсгас дааШгааас
600 ададааатса дгсгаддааа аааааа!а!с гаодзсагс аБсасдгсгс
1д1а«с1ас
660 дагададгдс гасспаада тдадасагаг ссдгдгсагс ааааагатас тссапаааа
720
1да«аБ1сс ддсадсдаас «даБаСТдд атагагсаса асспхдпа агагссасда
780 саатадасад садгсссатд дтгссагааа садтдадт ассгаст даададагаг
840
Шдгадада гспаиаааа с!д!сдаа!д асатсдсагг
ГагаГсББГа дсгааагсдс
900 ахагдтсасс аГсдХааБа!
сгаассдсд!
ссагссгааа сдШссатс дсгпааада
960 сдпгссдаг адагддхстс атгасатсад гсахасгдад ссаасаааБа таагсдГдта
1020 таасагст даиадааьса дасБсгааад аааасдааБс ддстпапа гасдсагтса
1080 гдагааасст аагдаааааг дггггьсдБТ дггсаадггд датдаагадт агдгсПаа!
1140 аа!!д«аП аспсайаа «аагапга дЬаасдадйа сас!с!а!аа ааасдадаа!
1200

Claims (57)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Рекомбинантный модифицированный вирус коровьей оспы Анкара (МУА), содержащий гетерологичную ДНК-последовательность, встроенную в межгенную область (1СК) вирусного генома.
  2. 2. МУА по п.1, где указанная гетерологичная ДНК-последовательность встроена в 1СК между двумя смежными открытыми рамками считывания (ОРС), выбранными из группы, содержащей 007К-008Ь, 018Ь-019Ь, 0441,-(.)451,, 064Ь-065Ь, 136Ь-137Ь, 148К-149Н
  3. 3. МУА по п.1 или 2, где гетерологичная ДНК-последовательность содержит по меньшей мере одну кодирующую последовательность, предпочтительно находящуюся под транскрипционным контролем поксвирусного транскрипционного регуляторного элемента.
  4. 4. МУА по пп.1-3, где гетерологичная ДНК-последовательность кодирует один или несколько белков, полипептидов, пептидов, чужеродных антигенов или антигенных эпитопов.
  5. 5. МУА по пп.1-4, где гетерологичная ДНК-последовательность получена из вируса денге, вируса японского энцефалита, вируса гепатита В, вируса гепатита С и/или вирусов иммунодефицита, предпочтительно вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) .
  6. 6. МУА по п.5, где гетерологичная ДНК-последовательность, полученная из вируса денге, выбрана из группы, содержащей N81 и РгМ.
  7. 7. МУА по п.6, где указанный ген N81 встроен в 1СК между ОРС 064Ь-065Ь.
  8. 8. МУА по п.6 или 7, где ген РгМ получен из одного или нескольких из 4 серотипов вируса денге.
  9. 9. МУА по пп.6-8, где указанный ген РгМ встроен в 1СК между двумя ОРС, выбранными из группы, содержащей 007К-008Ц 044Ь-045Ь, 136Ь-137Ь, 148К-149Н
  10. 10. МУА по п.5, где гетерологичная ДНК-последовательность, полученная из вируса иммунодефицита, кодирует епу ВИЧ.
  11. 11. МУА по п.10, где ген епу ВИЧ встроен в 1СК между ОРС 007К-008Н
  12. 12. МУА по пп.1-11, где указанный МУА депонирован в ЕСАСС под номером депозита У00083008.
  13. 13. Применение МУА по пп.1-12 в качестве лекарственного средства и/или вакцины.
  14. 14. Применение МУА по пп.1-12 в целях изготовления лекарственного средства и/или вакцины для лечения и/или профилактики вирусной инфекции и/или пролиферирующего заболевания.
  15. 15. Применение по п.14 для лечения или профилактики вирусной инфекции, вызванной вирусом денге, или инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита, предпочтительно ВИЧ-инфекции.
  16. 16. Вакцина, содержащая МУА по пп.1-12.
  17. 17. Фармацевтическая композиция, содержащая МУА по пп.1-12 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, адъювант и/или добавку.
  18. 18. Способ воздействия на иммунную систему животного, а предпочтительно индуцирования иммунного ответа в живом организме животного, включая человека, где указанный способ предусматривает введение МУА по пп.1-12, вакцины по п.16 и/или композиции по п.17 животному, включая человека, если это необходимо.
  19. 19. Способ продуцирования белка, полипептида, пептида, антигена или эпитопа ш уйго, включающий в себя стадии инфицирования клетки-хозяина рекомбинантным МУА по пп.1-12; культивирования инфицированной клетки-хозяина в подходящих условиях;
    выделения полипептида, белка, пептида, антигена, эпитопа и/или вируса, продуцируемых указанной клеткой-хозяином, и/или обогащения ими указанной клетки.
  20. 20. Способ введения ДНК-последовательности в клетку ш уйго, где указанная ДНКпоследовательность является гомологичной и/или гетерологичной геному указанной клетки, где клетка
    - 46 007811 инфицирована МУА по пп.1-12.
  21. 21. Способ введения ДНК-последовательности в клетку ех νίνο, где указанная ДНКпоследовательность является гомологичной и/или гетерологичной геному указанной клетки, где клетку инфицируют МУА по пп.1-12, и где инфицированную клетку впоследствии вводят в живой организм животного, включая человека.
  22. 22. Способ введения ДНК-последовательности в живой организм животного, включая человека, где указанная ДНК-последовательность является гомологичной и/или гетерологичной геному указанного организма животного, путем введения МУА по пп.1-12, вакцины по п.16 и/или композиции по п.17 указанному животному, включая человека.
  23. 23. Клетка, содержащая МУА по пп.1-12.
  24. 24. Плазмидный вектор, содержащий
    ДНК-последовательность, которая направляет, посредством гомологичной рекомбинации, инсерцию ДНК-последовательности, гетерологичной геному вируса МУА (гетерологичная последовательность) в область ЮК, расположенную между двумя смежными ОРС генома МУА;
    указанную гетерологичную последовательность и необязательно, кассету репортерных и/или селективных генов.
  25. 25. Плазмидный вектор по п.24, где указанная ДНК-последовательность содержит полный или неполный фрагмент последовательности ЮК.
  26. 26. Плазмидный вектор по п.24 или 25, где указанная ДНК-последовательность содержит последовательности двух смежных ОРС, фланкирующих ЮК.
  27. 27. Плазмидный вектор по пп.24-26, где последовательность ЮК получена из ЮК, находящейся между ОРС, выбранными из группы, содержащей 007К-008Б, 018Ь-019Ь, 044Ь-045Ь, 064Ь-065Ь, 136Ь137Ь, 148К-149Н
  28. 28. Плазмидный вектор по пп.24-27, где последовательность, полученная из ЮК, содержит последовательность, выбранную из группы, содержащей нуклеотидные последовательности
    527-608 последовательности 8ец Ш Νο. 32;
    299-883 последовательности 8ец Ш Νο. 33;
    339-852 последовательности 8ед Ш Νο. 34;
    376-647 последовательности 8ес| Ш Νο. 35; 597-855 последовательности 8ес| Ш Νο. 36; 400-607 последовательности 8ес| Ιϋ Νο. 37.
  29. 29. Плазмидный вектор по пп.24-28, где последовательности двух смежных ОРС, фланкирующих ЮК, выбраны из группы, содержащей 007К-008Б, 018Ь-019Ь, 044Ь-045Ь, 064Ь-065Ь, 136Ь-137Ь, 148К149Ь.
  30. 30. Плазмидный вектор по пп.24-29, где последовательности двух смежных ОРС, фланкирующих ЮК, содержат последовательность, выбранную из группы, включающей в себя нуклеотидные последовательности
    1-526 и 609-1190 последовательности 8ес| Ιϋ Νο. 32;
    101-298 и 884-1198 последовательности 8ес| Ιϋ Νο. 33;
    1-338 и 853-1200 последовательности 8ес| Ιϋ Νο. 34;
    1-375 и 648-1200 последовательности 8ес| Ιϋ Νο. 35;
    1-596 и 856-1200 последовательности 8ес| Ιϋ Νο. 36;
    1-399 и 608-1081 последовательности 8ес| Ιϋ Νο. 37.
  31. 31. Плазмидный вектор по пп.24-30, где ДНК-последовательность направляет инсерцию гетерологичной последовательности в ЮК генома МУА, депонированного в ЕСАСС под номером депозита У00083008.
  32. 32. Способ продуцирования МУА по пп. 1-12, включающий в себя стадии трансфекции клетки плазмидным вектором по пп.24-31;
    инфицирования указанной трансфицированной клетки МУА;
    идентификации, выделения и, необязательно, очистки МУА по пп.1-12.
  33. 33. Способ по п.32, где указанную клетку инфицируют МУА, депонированным в ЕСАСС под номером депозита У00083008.
  34. 34. ДНК, содержащая
    ДНК-последовательность, которая направляет, посредством гомологичной рекомбинации, инсерцию ДНК-последовательности, гетерологичной геному вируса МУА (гетерологичная последовательность) в область ЮК, расположенную между двумя смежными ОРС генома МУА, и указанную гетерологичную последовательность.
  35. 35. ДНК-последовательность по п.34, где ДНК-последовательность, которая направляет инсерцию гетерологичной последовательности в ЮК генома МУА, содержит полный или неполный фрагмент последовательности ЮК.
  36. 36. ДНК-последовательность по п.34 или 35, где ДНК-последовательность, которая направляет инсерцию гетерологичной последовательности в ЮК генома МУА, содержит последовательности двух смежных ОРС, фланкирующих ЮК.
    - 47 007811
  37. 37. ДНК-последовательность по пп.34-36, где последовательность ЮК получена из ЮК, расположенной между ОРС, выбранными из группы, содержащей 007К-008Б, 018Ь-019Ь, 044Ь-045Ь, 064Ь-065Ь, 136Ь-137Ь, 148К-149Б.
  38. 38. ДНК-последовательность по пп.34-37, где последовательность, полученная из ЮК, содержит последовательность, выбранную из группы, содержащей нуклеотидные последовательности
    527-608 последовательности 8ес| Ш Νο. 32;
    299-883 последовательности 8ес| Ш Νο. 33;
    339-852 последовательности 8ес| Ш Νο. 34;
    376-647 последовательности 8ес| Ш Νο. 35;
    597-855 последовательности 8ес| Ш Νο. 36; 400-607 последовательности 8ес| Ш Νο. 37.
  39. 39. ДНК-последовательность по пп.34-38, где указанные ЮК-фланкирующие последовательности двух смежных ОРС выбраны из группы, содержащей 007К-008Б, 018Ь-019Ь, 044Ь-045Ь, 064Ь-065Ь, 136Ь-137Ь, 148К-149Б.
  40. 40. ДНК-последовательность по пп.34-39, где указанные ЮК-фланкирующие последовательности двух смежных ОРС содержат последовательность, выбранную из группы, содержащей нуклеотидные последовательности
    1-526 и 609-1190 последовательности 8ес| Ш Νο. 32;
    101-298 и 884-1198 последовательности 8ес| Ш Νο. 33:
    1-338 и 853-1200 последовательности 8ес| Ш Νο. 34;
    1-375 и 648-1200 последовательности 8ес| Ш Νο. 35;
    1-596 и 856-1200 последовательности 8ес| Ш Νο. 36;
    1-399 и 608-1081 последовательности 8ес| Ш Νο. 37.
  41. 41. ДНК-последовательность по пп.34-40, где ДНК-последовательность направляет инсерцию гетерологичной последовательности в ЮК генома МУЛ, депонированного в ЕСАСС под номером депозита У00083008.
  42. 42. Применение плазмидного вектора, содержащего
    ДНК-последовательность, которая направляет, посредством гомологичной рекомбинации, инсерцию ДНК-последовательности, гетерологичной геному вируса МУА (гетерологичная последовательность) в область ЮК, расположенную между двумя смежными ОРС генома МУА, и сайт клонирования, встроенный в указанную последовательность ЮК для инсерции указанной гетерологичной последовательности; и необязательно, кассету репортерных и/или селективных генов, в целях генерирования и/или продуцирования рекомбинантного МУА по пп.1-12.
  43. 43. Применение по п.42, где указанная ДНК-последовательность содержит полный или неполный фрагмент последовательности ЮК.
  44. 44. Применение по п.42 или 43, где указанная ДНК-последовательность содержит последовательности двух смежных ОРС, фланкирующих ЮК.
  45. 45. Применение по пп.42-44, где указанная последовательность ЮК получена из ЮК, расположенной между ОРС, выбранными из группы, содержащей 007К-008Б, 018Ь-019Ь, 044Ь-045Ь, 064Ь-065Ь, 136Ь-137Ь, 148К-149Б.
  46. 46. Применение по пп.42-45, где последовательность, полученная из ЮК, содержит последовательность, выбранную из группы, содержащей нуклеотидные последовательности
    527-608 последовательности 8ес| Ш Νο. 32;
    299-883 последовательности 8ес| Ш Νο. 33;
    339-852 последовательности 8ес| Ш Νο. 34;
    376-647 последовательности 8ес| Ш Νο. 35;
    597-855 последовательности 8ес| Ш Νο. 36; 400-607 последовательности 8ес| Ш Νο. 37.
  47. 47. Применение по пп.42-46, где ЮК-фланкирующие последовательности двух смежных ОРС выбраны из группы, содержащей 007К-008Б, 018Ь-019Ь, 044Ь-045Ь, 064Ь-065Ь, 136Ь-137Ь, 148К-149Б.
  48. 48. Применение по пп.42-47, где ЮК-фланкирующие последовательности двух смежных ОРС содержат последовательность, выбранную из группы, содержащей нуклеотидные последовательности
    1-526 и 609-1190 последовательности 8ес| Ш Νο. 32;
    101-298 и 884-1198 последовательности 8ес| Ш Νο. 33;
    1-338 и 853-1200 последовательности 8ес| Ш Νο. 34;
    1-375 и 648-1200 последовательности 8ес| Ш Νο. 35;
    1-596 и 856-1200 последовательности 8ес| Ш Νο. 36;
    1-399 и 608-1081 последовательности 8ес| Ш Νο. 37.
  49. 49. Применение по пп.42-48, где ДНК-последовательность направляет инсерцию гетерологичной последовательности в ЮК генома МУА, депонированного в ЕСАСС под номером депозита У00083008.
  50. 50. Применение ДНК, которая направляет, посредством гомологичной рекомбинации, инсерцию ДНК-последовательности, гетерологичной геному вируса МУА (гетерологичная последовательность), в ЮК, расположенную между двумя смежными ОРС генома МУА, в целях генерирования и/или проду
    - 48 007811 цирования плазмидного вектора по пп.24-31 и/или генерирования, и/или продуцирования рекомбинантного МУА по пп.1-12.
  51. 51. Применение по п.50, где ДНК-последовательность, которая направляет инсерцию указанной гетерологичной последовательности в ЮК генома МУА, содержит полный или неполный фрагмент последовательности ЮК.
  52. 52. Применение по п.50 или 51, где ДНК-последовательность, которая направляет инсерцию указанной гетерологичной последовательности в 1СК генома МУА, содержит последовательности двух смежных ОРС, фланкирующих 1СК.
  53. 53. Применение по пп.50-52, где последовательность 1СК происходит от 1СК, расположенной между ОРС, выбранными из группы, содержащей 007К-008Ь, 018Ь-019Ь, 044Ь-045Ь, 064Ь-065Ь, 136Ь-137Ь, 148К-149П
  54. 54. Применение по пп.50-53, где последовательность, полученная из 1СК, содержит последовательность, выбранную из группы, содержащей нуклеотидные последовательности
    527-608 последовательности 8ец ΙΌ №. 32;
    299-883 последовательности 8ец ΙΌ №. 33;
    339-852 последовательности 8ец ΙΌ №. 34;
    376-647 последовательности 8ец ΙΌ №. 35;
    597-855 последовательности 8ец ΙΌ №. 36; 400-607 последовательности 8ец ΙΌ №. 37.
  55. 55. Применение по пп.50-54, где ЮК-фланкирующие последовательности двух смежных ОРС выбраны из группы, содержащей 007К-008Ь, 018Ь-019Ь, 044Ь-045Ь, 064Ь-065Ь, 136Ь-137Ь, 148К-149П
  56. 56. Применение по пп.50-55, где ЮК-фланкирующие последовательности двух смежных ОРС содержат последовательность, выбранную из группы, содержащей нуклеотидные последовательности
    1-526 и 609-1190 последовательности 8ец ΙΌ №. 32;
    101-298 и 884-1198 последовательности 8ец ΙΌ №. 33;
    1-338 и 853-1200 последовательности 8ец ΙΌ №. 34;
    1-375 и 648-1200 последовательности 8ец ΙΌ №. 35;
    1-596 и 856-1200 последовательности 8ец ΙΌ №. 36;
    1-399 и 608-1081 последовательности 8ец ΙΌ №. 37.
  57. 57. Применение по пп.50-56, где ДНК-последовательность направляет инсерцию указанной гетерологичной последовательности в ЮК генома МУА, депонированного в ЕСАСС под номером депозита У00083008.
EA200401507A 2002-05-16 2003-05-14 Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva) EA007811B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200200752 2002-05-16
DKPA200200753 2002-05-16
PCT/EP2003/005045 WO2003097845A1 (en) 2002-05-16 2003-05-14 Intergenic regions as insertion sites in the genome of modified vaccinia virus ankara (mva)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200401507A1 EA200401507A1 (ru) 2005-06-30
EA007811B1 true EA007811B1 (ru) 2007-02-27

Family

ID=29551228

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200401506A EA012160B1 (ru) 2002-05-16 2003-05-14 Рекомбинантный поксвирус, экспрессирующий гомологичные гены, встроенные в поксвирусный геном, и его применение
EA200401507A EA007811B1 (ru) 2002-05-16 2003-05-14 Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva)
EA200900180A EA020230B1 (ru) 2002-05-16 2003-05-14 Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины анкара (mva), экспрессирующий гомологичные последовательности, встроенные в поксвирусный геном, и его применение

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200401506A EA012160B1 (ru) 2002-05-16 2003-05-14 Рекомбинантный поксвирус, экспрессирующий гомологичные гены, встроенные в поксвирусный геном, и его применение

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200900180A EA020230B1 (ru) 2002-05-16 2003-05-14 Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины анкара (mva), экспрессирующий гомологичные последовательности, встроенные в поксвирусный геном, и его применение

Country Status (23)

Country Link
US (14) US7338662B2 (ru)
EP (3) EP1506301B1 (ru)
JP (4) JP4895505B2 (ru)
KR (4) KR101138067B1 (ru)
CN (6) CN100494388C (ru)
AT (1) ATE315660T1 (ru)
AU (4) AU2003242540A1 (ru)
BR (2) BRPI0311178B8 (ru)
CA (3) CA2481521C (ru)
DE (1) DE60303218T2 (ru)
DK (2) DK1506301T3 (ru)
EA (3) EA012160B1 (ru)
ES (1) ES2256776T3 (ru)
HK (2) HK1076642A1 (ru)
IL (4) IL164177A0 (ru)
MX (2) MXPA04010713A (ru)
NO (3) NO334273B1 (ru)
NZ (2) NZ536502A (ru)
PL (2) PL218318B1 (ru)
PT (1) PT1407033E (ru)
SI (1) SI1407033T1 (ru)
UA (1) UA82479C2 (ru)
WO (2) WO2003097845A1 (ru)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4101327C1 (ru) * 1991-01-18 1991-10-24 Mercedes-Benz Aktiengesellschaft, 7000 Stuttgart, De
DK1335987T4 (en) * 2000-11-23 2016-09-19 Bavarian Nordic As Modified variant of vaccinia virus Ankara
EP2204179A3 (en) * 2002-04-19 2010-12-22 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Virus Ankara for the vaccination of neonates
CN100494388C (zh) 2002-05-16 2009-06-03 巴法里安诺迪克有限公司 改进的安卡拉痘苗病毒(mva)基因组中作为插入位点的基因间隔区
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
MXPA04012966A (es) * 2002-09-05 2005-05-16 Bavarian Nordic As Metodo para el cultivo de celulas primarias y para la amplificacion de virus bajo condiciones libres de suero.
CA2515890C (en) * 2003-02-20 2013-09-17 Therion Biologics Corporation Novel insertion sites in pox vectors
GB2402391A (en) * 2003-06-04 2004-12-08 Oxxon Pharmaccines Ltd Fowlpox recombinant genome
US7951576B2 (en) * 2004-11-05 2011-05-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for preparing cells and viruses
PT1855720T (pt) 2005-02-23 2016-12-14 Bavarian Nordic As Uso de um poxvírus modificado para a rápida indução de imunidade contra um poxvírus ou outros agentes infeciosos
BRPI0711898A2 (pt) * 2006-05-19 2011-12-27 Glycofi Inc composiÇço de proteÍna da eritropoietina substancialmente homogÊnea, composiÇço farmacÊutica, e, mÉtodos de aumentar hematàcrito em um mamÍfero, e de produzir uma composiÇço de eritropoietina
CN101563463B (zh) * 2006-08-25 2013-03-27 美国国有健康与人类服务部(马里兰州) 修饰的安卡拉（mva）痘苗病毒基因的基因组中保守基因之间的基因间位点
EP2426142A3 (en) 2006-10-16 2012-06-13 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in a diagnostic and therapeutic method
EP2086526B1 (en) * 2006-11-09 2014-07-23 The United States Of America As Represented By The Secretary of the Navy Induction of an immune response against Dengue virus using prime-boost approach
US8440202B2 (en) * 2006-11-09 2013-05-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Induction of an immune response against dengue virus using the prime-boost approach
BRPI0806350A2 (pt) * 2007-01-30 2011-09-06 Transgene Sa uso de uma molécula de ácido nucléico, uso de um vetor, uso de um particula viral infecciosa, vetores, particula viral infecciosa e composição
US8268327B2 (en) 2007-04-27 2012-09-18 Bavarian Nordic A/S Immediate protection against pathogens via MVA
AU2008250520B2 (en) * 2007-05-15 2013-10-31 Transgene S.A. Vectors for multiple gene expression
TW200907058A (en) * 2007-05-30 2009-02-16 Wyeth Corp Raccoon poxvirus expressing rabies glycoproteins
AU2008260593A1 (en) * 2007-05-30 2008-12-11 Wyeth Raccoon poxvirus expressing genes of feline antigens
WO2009052328A1 (en) * 2007-10-18 2009-04-23 Bn Immunotherapeutics Inc. Use of mva to treat prostate cancer
US20110052627A1 (en) * 2008-06-20 2011-03-03 Paul Chaplin Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine
KR100894430B1 (ko) * 2008-11-11 2009-04-22 시스템디엔디(주) 초음파, 음향 및 온도변화를 이용한 밸브의 유체누설 측정장치 및 이를 이용한 유체누설 측정방법
UA105193C2 (ru) * 2008-11-21 2014-04-25 Бавариан Нордик А/С Вектор, содержащий две гомологические нуклеотидные последовательности
EP2486138A1 (en) 2009-10-08 2012-08-15 Bavarian Nordic A/S Generation of a broad t-cell response in humans against hiv
DK2488649T3 (da) 2009-10-16 2019-06-17 Us Health Rekombinant modificeret vaccinia ankara (mva)-vaccinia-virus indeholdende restrukturerede insertionssteder
US20110159031A1 (en) * 2009-12-22 2011-06-30 Baxter International Inc. Vaccine to Influenza A Virus
SG184155A1 (en) * 2010-03-26 2012-10-30 Emergent Product Dev Gaithersburg Inc Ectodomains of influenza matrix 2 protein, expression system, and uses thereof
AU2011281982B2 (en) 2010-07-20 2015-12-17 Bavarian Nordic A/S Method for harvesting expression products
CN103200962A (zh) * 2010-09-23 2013-07-10 巴克斯特国际公司 重组病毒载体及用于诱导对黄热病毒的免疫反应的方法
EP2627774B1 (en) * 2010-10-15 2018-11-21 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) influenza vaccine
JP6415977B2 (ja) 2011-04-15 2018-10-31 ジェネラックス・コーポレイションＧｅｎｅｌｕｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 弱毒化ワクシニアウイルスのクローン株およびその使用方法
EP2788021B1 (en) 2011-12-09 2017-01-18 Bavarian Nordic A/S Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c
EP2620446A1 (en) 2012-01-27 2013-07-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Immunogens for HIV vaccination
WO2013181696A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 The Australian National University Vaccination with interleukin-4 antagonists
WO2014019718A1 (en) 2012-08-01 2014-02-06 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
WO2014043535A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions for the treatment of cancer
WO2014055960A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 Genelux Corporation Energy absorbing-based diagnostic and therapeutic methods employing nucleic acid molecules encoding chromophore-producing enzymes
CA2888367A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Bavarian Nordic, Inc. Methods and compositions for the treatment of cancer
DE102013004595A1 (de) 2013-03-15 2014-09-18 Emergent Product Development Germany Gmbh RSV-Impfstoffe
WO2014139587A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Okairòs Ag Improved poxviral vaccines
CA2906735C (en) * 2013-03-15 2020-03-24 Sementis Limited Immune modulation
US10238700B2 (en) 2014-01-02 2019-03-26 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity
KR101645642B1 (ko) 2014-10-16 2016-08-11 대한민국 Kvac１０３ 유래의 재조합 백시니아 바이러스
KR101623498B1 (ko) 2014-10-16 2016-05-24 대한민국 약독화 백시니아 바이러스주 kvac１０３
JP2018510143A (ja) 2015-02-25 2018-04-12 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 不活化非複製改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）の固形腫瘍のための単独療法又は免疫チェックポイント遮断剤併用における使用
CN107847534B (zh) 2015-04-17 2022-10-04 纪念斯隆凯特琳癌症中心 Mva或mvaδe3l作为抗实体瘤的免疫治疗剂的应用
KR20160140075A (ko) * 2015-05-29 2016-12-07 코오롱생명과학 주식회사 폭스바이러스 유래 프로모터 및 이를 포함하는 벡터
AU2016278806A1 (en) * 2015-06-15 2017-12-14 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA) foot and mouth disease virus (FMDV) vaccine
FR3042121A1 (fr) 2015-10-08 2017-04-14 Jean-Marc Limacher Composition anti-tumorale
CN106591361A (zh) * 2015-10-20 2017-04-26 钱文斌 一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用
CA3011014A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Harriet Robinson Compositions and methods for generating an immune response to a tumor associated antigen
DK3407910T3 (da) * 2016-01-29 2022-07-18 Bavarian Nordic As Rekombinant modificeret vaccinia virus ankara (mva)-vaccine mod hesteencephalitisvirus
US20190030157A1 (en) * 2016-02-03 2019-01-31 Geovax Inc. Compositions and Methods for Generating an Immune Response to a Flavivirus
KR20180133395A (ko) 2016-02-25 2018-12-14 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 암 면역요법을 위한, 인간 flt3l 또는 gm-csf의 발현이 있거나 없으며 티미딘 키나제가 결실된 복제 가능 약독화 백시니아 바이러스
BR112018016948A2 (pt) 2016-02-25 2019-01-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center mva recombinante ou mva¿e3l que expressa flt3l humano e uso do mesmo como agente imunoterapêutico contra tumores sólidos
CN109922829A (zh) 2016-05-02 2019-06-21 扬森疫苗与预防公司 治疗性hpv疫苗组合
NZ750578A (en) * 2016-08-19 2023-05-26 Sementis Ltd Viral vaccines
US20200024610A1 (en) * 2016-09-30 2020-01-23 Monsanto Technology Llc Method for selecting target sites for site-specific genome modification in plants
CN111107872A (zh) 2017-05-12 2020-05-05 纪念斯隆-凯特林癌症中心 有用于癌症免疫疗法的牛痘病毒突变体
CA3066573A1 (en) * 2017-06-15 2018-12-20 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Poxvirus vectors encoding hiv antigens, and methods of use thereof
US11311612B2 (en) 2017-09-19 2022-04-26 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria
CN112512569A (zh) * 2018-05-11 2021-03-16 希望之城 表达多个巨细胞病毒(cmv)抗原的mva载体及其用途
CN112512568A (zh) 2018-05-11 2021-03-16 希望之城 遗传修饰的重组痘苗安卡拉(rmva)疫苗改善的稳定性及其制备方法
CN111979204B (zh) * 2019-05-24 2023-10-13 杭州功楚生物科技有限公司 携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及用途
US11666651B2 (en) 2019-11-14 2023-06-06 Aelix Therapeutics, S.L. Prime/boost immunization regimen against HIV-1 utilizing a multiepitope T cell immunogen comprising Gag, Pol, Vif, and Nef epitopes
TW202203966A (zh) * 2020-03-31 2022-02-01 澳大利亞商賽門蒂斯公司 用於防範ｃｏｖｉｄ－１９之以減毒的痘病毒載體為底質之疫苗
TW202413634A (zh) 2022-07-08 2024-04-01 美商維羅米梭公司 溶瘤痘瘡病毒及重組病毒及其使用方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0753581A1 (en) * 1995-07-10 1997-01-15 Immuno Ag Improved recombinant eukaryotic cytoplasmic viruses, method for their production and their use as vaccines
WO1997002355A1 (en) * 1995-07-04 1997-01-23 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Recombinant mva virus, and the use thereof
EP1146125A1 (en) * 2000-04-14 2001-10-17 Transgene S.A. Poxvirus with targeted infection specificity

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5338683A (en) * 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
JPH0795956B2 (ja) * 1986-09-22 1995-10-18 京都大学長 ポックスウイルス由来発現制御領域
US5093258A (en) * 1988-08-26 1992-03-03 Therion Biologics Corporation Recombinant fowlpox virus and recombination vector
US5225336A (en) * 1989-03-08 1993-07-06 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus host range selection system
US5651972A (en) 1989-04-21 1997-07-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Use of recombinant swine poxvirus as a live vaccine vector
US5514375A (en) 1990-08-15 1996-05-07 Virogenetics Corporation Flavivirus recombinant poxvirus vaccine
MY109299A (en) * 1990-08-15 1996-12-31 Virogenetics Corp Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins
US6893845B1 (en) * 1990-09-28 2005-05-17 Applied Molecular Evolution, Inc. Surface expression libraries of heteromeric receptors
ATE247163T1 (de) * 1991-03-07 2003-08-15 Virogenetics Corp Gentechnologisch hergestellter stamm für impfstoffe
BE1004877A3 (fr) * 1991-05-27 1993-02-16 Solvay Virus de l'avipox recombinant, culture de cellules infectees par ce virus et vaccins pour la volaille derives de ce virus.
FR2679249B1 (fr) * 1991-07-15 1993-11-26 Centre Nal Recherc Scientifique Souches de levure avec integration stable de genes heterologues.
CA2110505A1 (en) 1991-07-26 1993-02-18 Enzo Paoletti Infectious bursal disease virus recombinant poxvirus vaccine
EP0561034B1 (en) * 1991-08-26 1999-06-09 IMMUNO Aktiengesellschaft Direct molecular cloning of a modified chordopox virus genome
DK0538496T3 (da) * 1991-08-26 2004-02-23 Baxter Healthcare Sa Rekombinant fjerkrækoppevirus med intakt FPV tk-gen
US5676950A (en) 1994-10-28 1997-10-14 University Of Florida Enterically administered recombinant poxvirus vaccines
DE19629828A1 (de) * 1996-07-24 1998-01-29 Bayer Ag Carbanilide
EP0951555A2 (en) 1996-09-24 1999-10-27 Bavarian Nordic Research Institute A/S Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
AUPP380598A0 (en) * 1998-05-29 1998-06-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Genetically manipulated entomopoxvirus
US6252871B1 (en) 1998-07-01 2001-06-26 Powerwave Technologies, Inc. Switchable combiner/splitter
US20040265324A1 (en) * 1999-03-23 2004-12-30 Cardosa Mary Jane Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
CA2372709C (en) * 1999-05-28 2011-10-25 Stefan Wintersperger Vector for integration of heterologous sequences into poxviral genomes
JP4759201B2 (ja) * 2000-03-14 2011-08-31 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 変異ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）の改変株
IL154169A0 (en) * 2000-08-29 2003-07-31 Wyeth Corp Packaging of positive-strand rna virus replicon particles
DK1335987T4 (en) * 2000-11-23 2016-09-19 Bavarian Nordic As Modified variant of vaccinia virus Ankara
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
CN100494388C (zh) 2002-05-16 2009-06-03 巴法里安诺迪克有限公司 改进的安卡拉痘苗病毒(mva)基因组中作为插入位点的基因间隔区
UA85379C2 (ru) * 2002-11-25 2009-01-26 Бавариан Нордик А/С Рекомбинантный поксвирус, содержащий как минимум два ati промотора коровьей оспы

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997002355A1 (en) * 1995-07-04 1997-01-23 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Recombinant mva virus, and the use thereof
EP0753581A1 (en) * 1995-07-10 1997-01-15 Immuno Ag Improved recombinant eukaryotic cytoplasmic viruses, method for their production and their use as vaccines
EP1146125A1 (en) * 2000-04-14 2001-10-17 Transgene S.A. Poxvirus with targeted infection specificity

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTOINE G. ET AL.: "The Complete Genomic Sequence of the Modified Vaccinia Ankara Strain: Comparison with Other Orthopoxviruses", VIROLOGY, ACADEMIC PRESS, ORLANDO, US, vol. 244, no. 2, 10 May 1998 (1998-05-10), pages 365-396, XP004445824, ISSN: 0042-6822, page 398, left-hand column, last paragraph - right-hand column, paragraph 1 *

Also Published As

Publication number Publication date
PL218318B1 (pl) 2014-11-28
PT1407033E (pt) 2006-05-31
US20110244574A1 (en) 2011-10-06
CA2481799A1 (en) 2003-11-27
US9109233B2 (en) 2015-08-18
MXPA04011194A (es) 2005-02-14
DK1506301T3 (da) 2014-07-21
CN1653183B (zh) 2012-07-25
JP5777199B2 (ja) 2015-09-09
KR20040108798A (ko) 2004-12-24
CA2481799C (en) 2014-01-28
AU2009200380A1 (en) 2009-02-19
NO20111324A1 (no) 2011-09-29
US20110053260A1 (en) 2011-03-03
AU2008255213A1 (en) 2009-01-08
CA2481521C (en) 2012-04-17
NO336489B1 (no) 2015-09-07
IL164172A0 (en) 2005-12-18
AU2003236646A1 (en) 2003-12-02
PL216760B1 (pl) 2014-05-30
EP2253709B1 (en) 2018-04-11
HK1076836A1 (en) 2006-01-27
PL372093A1 (en) 2005-07-11
BR0310051A (pt) 2005-02-15
EP1506301B1 (en) 2014-04-30
EA200401506A1 (ru) 2005-04-28
NZ536502A (en) 2005-10-28
US8288125B2 (en) 2012-10-16
EA200401507A1 (ru) 2005-06-30
ES2256776T3 (es) 2006-07-16
US20120039936A1 (en) 2012-02-16
PL372088A1 (en) 2005-07-11
US20050244428A1 (en) 2005-11-03
SI1407033T1 (sl) 2006-06-30
KR20100110901A (ko) 2010-10-13
EA012160B1 (ru) 2009-08-28
MXPA04010713A (es) 2005-03-07
NO334273B1 (no) 2014-01-27
KR101041691B1 (ko) 2011-06-14
EP2253709A1 (en) 2010-11-24
DE60303218T2 (de) 2006-09-14
CN102703393A (zh) 2012-10-03
US20120178157A1 (en) 2012-07-12
BR0311178A (pt) 2005-03-29
US20110053259A1 (en) 2011-03-03
KR20040108809A (ko) 2004-12-24
CN102199628A (zh) 2011-09-28
AU2003236646B2 (en) 2009-01-15
IL193087A0 (en) 2009-02-11
US8435543B2 (en) 2013-05-07
UA82479C2 (ru) 2008-04-25
US8414900B2 (en) 2013-04-09
DK1407033T3 (da) 2006-05-22
AU2009200380B2 (en) 2009-10-01
AU2008255213B2 (en) 2011-10-06
CN1653184A (zh) 2005-08-10
US20100303856A1 (en) 2010-12-02
IL193087A (en) 2012-10-31
JP4693092B2 (ja) 2011-06-01
EA200900180A1 (ru) 2009-08-28
US7964374B2 (en) 2011-06-21
US20090311746A1 (en) 2009-12-17
US20100173388A1 (en) 2010-07-08
KR20120002627A (ko) 2012-01-06
IL193088A (en) 2015-02-26
JP2011004755A (ja) 2011-01-13
US20120135501A1 (en) 2012-05-31
US7338662B2 (en) 2008-03-04
EA020230B1 (ru) 2014-09-30
EP1407033A1 (en) 2004-04-14
AU2009200380C1 (en) 2010-03-11
US20130243813A1 (en) 2013-09-19
CA2481521A1 (en) 2003-11-27
BRPI0311178B8 (pt) 2021-05-25
US8034354B2 (en) 2011-10-11
NO20044940L (no) 2004-11-12
EP1506301A1 (en) 2005-02-16
DE60303218D1 (de) 2006-04-06
KR101005630B1 (ko) 2011-01-05
NZ536501A (en) 2006-08-31
US8741308B2 (en) 2014-06-03
CN101831411A (zh) 2010-09-15
US20120082696A1 (en) 2012-04-05
JP2005525822A (ja) 2005-09-02
WO2003097846A1 (en) 2003-11-27
CN1653183A (zh) 2005-08-10
KR101138067B1 (ko) 2012-04-24
US8309326B2 (en) 2012-11-13
CA2812019A1 (en) 2003-11-27
US20110250693A1 (en) 2011-10-13
US20060165727A1 (en) 2006-07-27
CN102719408A (zh) 2012-10-10
JP4895505B2 (ja) 2012-03-14
IL164177A0 (en) 2005-12-18
HK1076642A1 (en) 2006-01-20
CN100494388C (zh) 2009-06-03
JP2005525823A (ja) 2005-09-02
EP1407033B1 (en) 2006-01-11
US7550147B2 (en) 2009-06-23
AU2003242540A1 (en) 2003-12-02
NO20045480L (no) 2004-12-16
BRPI0311178B1 (pt) 2020-11-17
IL193088A0 (en) 2009-02-11
JP2010259446A (ja) 2010-11-18
ATE315660T1 (de) 2006-02-15
WO2003097845A1 (en) 2003-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA007811B1 (ru) Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva)
JP4421188B2 (ja) 変性ワクシニアアンカラウイルス変異体
HU229261B1 (en) Recombinant mva-virus comprising a gene encoding a hiv net antigen ar an antigen determinant and use thereof
HU230488B1 (hu) Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
JP5933565B2 (ja) 組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラインフルエンザワクチン
EA012723B1 (ru) Рекомбинантный поксвирус, содержащий по меньшей мере два промотора ati вируса коровьей оспы, и его применение
US20060029619A1 (en) Expression of genes in modified vaccinia virus ankara by using the cowpox ati promoter
CN1723285B (zh) 重组的mva及其产生方法
JPH06511392A (ja) 組換えネコヘルペスウイルスのベクターワクチン
JPH05244940A (ja) 組み換えアビポックスウィルス及びそれから成るワクチン

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM