PL218318B1 - Rekombinowany wirus krowianki Ankara (MVA), zawierająca go komórka, szczepionka lub kompozycja farmaceutyczna, sposób lub zestaw do jego otrzymywania, sekwencja DNA zawierająca genom tego wirusa oraz sposób wykrywania tego wirusa lub komórek nim zainfekowanych - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy rekombinowanego pokswirusa zdolnego do ekspresji dwóch lub więcej obcych genów homologicznych. Wspomniane geny są heterologiczne względem genomu wirusa, lecz homologiczne wobec siebie nawzajem. Geny te pochodzą w szczególności z ściśle pokrewnych wariantów lub podtypów mikroorganizmu. Wynalazek dotyczy również sposobu otrzymywania takiego rekombinowanego pokswirusa i zastosowania go jako leku lub szczepionki. Ponadto, wynalazek związany jest ze sposobem oddziaływania, korzystnie indukowania odpowiedzi immunologicznej w żywych zwierzętach i u ludzi.

Tło wynalazku

Każdy żywy organizm jest stale atakowany przez czynniki zakaźne lub patogenne, takie jak bakterie, wirusy, grzyby lub pasożyty. Tak zwany układ immunologiczny zapobiega stałym infekcjom organizmu, chorobom lub zatruciom spowodowanym takimi czynnikami.

Układ immunologiczny ssaków można podzielić na dwie reakcje: swoistą i nieswoistą (wrodzoną), jednak obie te reakcje są ze sobą ściśle powiązane. Nieswoista odpowiedź immunologiczna jest natychmiastową obroną przed działaniem szerokiego spektrum obcych substancji i czynników infekcyjnych. Swoista odpowiedź immunologiczna jest indukowana po fazie lag, w sytuacji, gdy organizm pobudzony jest substancją, z którą styka się po raz pierwszy. Swoista odpowiedź immunologiczna opiera się głównie na produkcji swoistych antygenowo przeciwciał oraz powstawaniu makrofagów i limfocytów, np., cytotoksycznych komórek T (CTL). Swoista odpowiedź immunologiczna odpowiada za fakt, że osobnik, który przejdzie specyficzną infekcję uzyskuje ochronę przed tą specyficzną infekcją, lecz pozostaje wciąż podatny na inne choroby zakaźne. Ogólnie, druga infekcja tym samym lub bardzo podobnym czynnikiem infekcyjnym wywołuje znacznie łagodniejsze objawy lub nie towarzyszą jej żadne objawy.

Taka, tak zwana, odporność pozostaje na długi czas, w pewnych przypadkach nawet na całe życie. Powyższy efekt związany jest z pamięcią immunologiczną, która może zostać wykorzystana do celu szczepień.

Termin szczepienie dotyczy sposobu wzbudzania odporności u osobnika dzięki podaniu nieszkodliwej, częściowo lub całkowicie nieaktywnej postaci czynnika infekcyjnego, w celu oddziaływania, korzystnie indukowania odpowiedzi immunologicznej u tego osobnika. Prowadzi to do uzyskania pozostającej na długi czas, jeżeli nie - przez całe życie, odporności przeciwko specyficznemu czynnikowi zakaźnemu.

Ludzka ospa wywoływana jest wirusem krowianki. Wirus krowianki należy do rodziny Poxviridae, dużej rodziny wirusów DNA, replikujących w cytoplazmie komórek kręgowców i bezkręgowców.

Rodzinę Poxviridae można podzielić na dwie podrodziny Chordopoxvirinae oraz Etnomopoxvirinae, bazujące na grupie gospodarzy wywodzących się z kręgowców i owadów. Chordopoxvirinae obejmuje, oprócz innych, rodzaj Orthopoxviruses oraz Avipoxviruses (Fields Virology, wyd. Fields B.N., Lippincott-Raven Publishers, wyd. 3 1996, ISBN: 0-7817-0253-4, rozdz. 83).

Rodzaj Orthopoxviruses obejmuje wirus variola (ospy), czynnik wywołujący ospę ludzką, a także inne wirusy o znaczeniu ekonomicznym, np., wirusy ospy wielbłądów, krów, owiec, kóz, osłów i wirus krowianki. Wszystkie wirusy należące do tego rodzaju są genetycznie spokrewnione i posiadają podobną morfologię lub zakres gospodarzy. Endonukleazowe mapy restrykcyjne wykazały wysoki poziom identyczności sekwencji, do 90% odnotowany między różnymi członkami Orthopoxviruses (Mackett & Archard, [1979], J Gen Virol, 45: 683-701).

Wirus krowianki (VV) jest czynnikiem stosowanym przez przynajmniej 100 lat do szczepienia przeciwko ospie. Nie wiadomo, czy W jest nowym gatunkiem, pochodzącym od wirusa krów lub wirusa variola w wyniku długotrwałych seryjnych pasaży, żyjącym przedstawicielem obecnie wymarłego wirusa, czy może produktem rekombinacji genetycznej. Ponadto, podczas długiego okresu obecności VV powstało wiele szczepów tego wirusa. Wspomniane różne szczepy wykazują różną immunogenność i w różnym stopniu wywołują potencjalne komplikacje, najpoważniejsze z nich to po-krowiankowe zapalenie mózgu. Jednakże, wiele z tych szczepów było stosowanych do szczepienia przeciwko ospie. Na przykład, szczep NYCBOH, Western Reserve lub Wyeth były stosowane głównie w USA, natomiast szczep Ankara, Bern, Copenhagen, Lister i MVA stosowano do szczepienia w Europie. W wyniku światowego programu szczepienia różnymi szczepami VV, w 1980r. WHO ostatecznie ogłosiła skuteczne wyeliminowanie wirusa variola.

PL 218 318 B1

Obecnie, VV stosowany jest głównie jako szczep laboratoryjny. Przyjęto go za prototyp Orthopoxviruses, co również sprawiło, że stał się on jednym z najbardziej szczegółowo scharakteryzowanych wirusów (Fields Virology, wyd. Fields B.N., Lippincott-Raven Publishers, wyd. 3 1996, ISBN; 0-7817-0253-4, rozdz. 83 i 84).

VV i ostatnio również inne pokswirusy stosowano do insercji i ekspresji obcych genów. Podstawowa technika wstawiania obcych genów do żywego, infekcyjnego pokswirusa obejmuje rekombinację między sekwencjami DNA wirusa, flankującymi obcy element genetyczny w donorowym plazmidzie a sekwencjami homologicznymi, obecnymi w pomocniczym pokswirusie. Rekombinacja genetyczna jest ogólnie wymianą sekwencji homologicznych DNA między dwiema nićmi DNA. W przypadku pewnych wirusów, RNA może zastąpić DNA. Fragmenty homologiczne kwasu nukleinowego są fragmentami kwasu nukleinowego (DNA lub RNA), posiadającymi taki sam skład sekwencji zasad nukleotydowych. Rekombinacja genetyczna może przebiegać naturalnie w zainfekowanej komórce gospodarza podczas replikacji lub otrzymywania nowego genomu wirusowego. Zatem, rekombinacja genetyczna między genami wirusowymi może zajść podczas cyklu replikacyjnego wirusa, przebiegającego w komórce gospodarza, która jest jednocześnie zainfekowana dwoma lub więcej różnymi wirusami lub innymi produktami genetycznymi. Fragment DNA z pierwszego genomu ulega wymianie podczas otrzymywania fragmentu genomu drugiego infekcyjnego wirusa obecnego w komórce, w którym DNA jest homologiczny z DNA pierwszego genomu wirusowego.

Do osiągnięcia udanej ekspresji wstawionej sekwencji DNA w zmodyfikowanym wirusie infekcyjnym wymagane są dwa warunki. Pierwszym jest zapewnienie, aby insercja nastąpiła w nieistotnym obszarze wirusa, tak, by zmodyfikowany wirus pozostał żywy. Drugim warunkiem dla ekspresji wstawionego DNA jest obecność promotora w prawidłowej zależności z wstawionym DNA. Promotor powinien być położony powyżej sekwencji DNA, która ma ulec ekspresji.

Wykazano i omówiono użyteczność rekombinowanych VV, ekspresjonujących, np., antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby B (HBsAg), hemaglutyninę wirusa grypy (InfHA) lub antygen zarodnikowy z Plasmodium knowlesi, jako żywych szczepionek do celów zapobiegania chorobom zakaźnym (Smith i wsp. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383-407).

Kolejną zaletą VV jest zdolność przyjmowania wielu obcych substancji, genów lub antygenów do pojedynczego genomu VV (Smith & Moss [1983], Gene, 25(1): 21-28). Ponadto, stwierdzono, że możliwe jest wzbudzenie odporności na liczne heterologiczne choroby zakaźne, przy zastosowaniu pojedynczego szczepienia szczepionką poliwalentną (Perkus i wsp., [1985], Science, vol. 229, 981-984).

Przykład ekspresji różnych antygenów przez pojedynczy VV został opisany przez Bray i wsp. Wykazano, że rekombinowany W, zdolny do ekspresji trzech różnych białek strukturalnych serotypu 4 wirusa Dengue; mianowicie białka kapsydu (C), przedbłonowego (PrM), otoczki (E) oraz dwóch niestrukturalnych białek serotypu 4 wirusa Dengue: mianowicie NS1 i NS2a, wykazywał zdolność zapewnienia ochrony przed infekcją serotypem 4 wirusa Dengue u myszy (Bray i wsp. [1989], Virology 2853-2856).

Pod względem infekcji wywoływanych u ludzi, wirus Dengue wraz z jego czterema serotypami, od serotypu 1 wirusa Dengue (Den-1) do serotypu 4 wirusa Dengue (Den-4), jest jednym z najważniejszych członków rodzaju Flavivirus. Infekcje wirusem Dengue wywołują choroby, obejmujące od objawów grypopodobnych do poważnych lub śmiertelnych chorób, gorączki krwotocznej Dengue (DHF) z zespołem szoku (DSS). Dengue pozostaje ciągle głównym problemem zdrowotnym w gęsto zaludnionych obszarach tropikalnych lub podzwrotnikowych, w których występują liczne wektory moskitowe.

Zaniepokojenie spowodowane możliwością rozprzestrzenienia w wielu częściach świata infekcji Dengue i innych chorób indukowanych za pośrednictwem moskitów przez FIaviviruses, spowodowało nasilenie prób otrzymania szczepionki Dengue, która mogłaby zapobiegać zarówno gorączce Dengue (DF), jak i krwotocznej gorączce Dengue (DHF) oraz szczepionek użytecznych w ochronie zaszczepionych osobników przed infekcjami wywołanymi przez pewne lub wszystkie przenoszone przez moskity wirusy FIaviviruses.

Większość przypadków DF miała miejsce po pierwszej infekcji wywołanej przez którykolwiek z czterech serotypów wirusa, natomiast znaczny procent przypadków pojawienia się DHF odnotowano u jednostek zainfekowanych po raz drugi, jednak przez serotyp odmienny od pierwszego infekcyjnego serotypu wirusa Dengue. Powyższe obserwacje pozwoliły na wysunięcie hipotezy, że kolejna infekcja osobnika posiadającego przeciwciała przeciwko jednemu serotypowi wirusa Dengue, wywołana przez inny serotyp tego wirusa w odpowiedniej odległości czasowej, w pewnej liczbie przypadków może spowodować DHF.

PL 218 318 B1

Zgodnie z powyższym, szczepienia przeciwko jednemu serotypowi nie powodują pełnej ochrony przed infekcją wirusem Dengue, lecz jedynie przed infekcją tym konkretnym szczepem wirusa Dengue. Jeszcze ważniejsze jest to, że osoba zaszczepiona przeciwko jednemu serotypowi, narażona jest na poważne niebezpieczeństwo pojawienia się groźnych komplikacji, takich jak gorączka krwotoczna Dengue, gdy zostanie zainfekowana szczepem wirusa Dengue o odmiennym serotypie.

Zatem, istnieje potrzeba multiwalentnej szczepionki, zawierającej antygeny z wszystkich czterech serotypów wirusa Dengue.

Dotychczas, sugerowano otrzymywanie multiwalentnych szczepionek poprzez wymieszanie zestawu rekombinowanych VV, każdy VV kodujący sekwencje różnych wirusów (Moss, [1990] Immunology, 2, 317-327). Jednakże, takie szczepionki multiwalentne niosły ze sobą kilka niedogodności. Po pierwsze, kłopotliwe jest otrzymanie kilku niezależnych, rekombinowanych VV. Oprócz oddzielnych procesów produkcji, bardzo czasochłonna jest kontrola i zapewnienie jakości. Po drugie, infekcja mieszaniną rekombinowanych wirusów, ekspresjonujących różne sekwencje zawsze niesie ryzyko, że infekcja nie będzie szczególnie dobrze zrównoważona. Główne niebezpieczeństwo związane jest z tym, że możliwe jest, że jedynie poszczególne rekombinaty, a nie wszystkie zróżnicowane rekombinowane wirusy zawarte w multiwalentnej szczepionce, zainfekują docelową komórkę. Jedną z przyczyn może być nierówne rozłożenie rekombinowanych wirusów. Inną przyczyną mogą być zakłócenia między różnymi rekombinowanymi wirusami podczas infekcji pojedynczej komórki. Takie zakłócenia znane są jako zjawisko nadkażenia (superinfekcji).

W tym przypadku, jedynie pewne antygeny, a nie wszystkie zawarte w multiwalentnej szczepionce, będą ostatecznie ekspresjonowane z zainfekowanych komórek, a zatem, prezentowane układowi immunologicznemu pacjenta. W konsekwencji, ochrona immunologiczna będzie uzyskana jedynie przed pewnymi antygenami, lecz efekt jest daleki od zapewnienia całkowitej ochrony immunologicznej przed różnymi antygenami prezentowanymi lub możliwymi do zaprezentowania przez szczepionkę multiwalentną.

W przypadku szczepionki przeciwko infekcji wirusem Dengue, rozwiązanie, w którym wykorzystano multiwalentną szczepionkę posiada pewne niedogodności, pojawiające się, gdy różne sekwencje ekspresjonowane są w różnych ilościach lub w nieprzewidziany sposób, jak wykazano na przykładzie białka otoczki wirusa Dengue 2 (Deuble i wsp., [1988], J. Virol. 65; 2853). Ponadto, takie szczepienie jest bardzo niebezpieczne dla pacjenta. Niepełne szczepienie, przy użyciu zestawu rekombinowanych wirusów krowianki zapewnia jedynie odpowiedź immunologiczną chroniącą przed pewnymi, lecz nie przed wszystkimi serotypami wirusa Dengue. Niestety, w przypadku infekcji wirusem Dengue, niepełne szczepienie jest wysoko niewskazane, ze względu na wzrost ryzyka prowadzących do śmierci powikłań, takich jak gorączka krwotoczna Dengue.

Cel wynalazku

W świetle powyższych zagadnień, celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie stabilnej, skutecznej i niezawodnej szczepionki przeciwko chorobom zakaźnym, które mogą być wywołane przez więcej niż jeden szczep, klad, wariant, podtyp lub serotyp mikroorganizmu wywołującego wspomnianą chorobę infekcyjną.

Kolejnym celem wynalazku jest zapewnienie stabilnej, skutecznej i pewnej szczepionki przeciwko infekcjom wirusem Dengue, która pozwoli na niezawodne szczepienie przeciwko wszystkim serotypom wirusa Dengue.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest rekombinowany wirus krowianki Ankara (MVA), charakteryzujący się tym, że zawiera przynajmniej dwie sekwencje homologiczne lub geny o identyczności co najmniej 50%, przy czym każda ze wspomnianych sekwencji homologicznych lub genów jest trwale wstawiona w różnym miejscu insercji genomu wirusowego.

Przedmiotem wynalazku jest również rekombinowany wirus MVA, charakteryzujący się tym, że zawiera przynajmniej dwie sekwencje homologiczne lub geny, przy czym wykazują one identyczność na poziomie przynajmniej 60%,

Korzystnie, sekwencje homologiczne lub geny wykazują identyczność na poziomie 65- 75%. Korzystnie, sekwencje zawierają homologiczne geny, w szczególności pochodzące z flaviwirusa. Korzystnie, flaviwirus jest wirusem Dengue. Korzystnie, geny są przynajmniej dwoma homologicznymi genami pochodzącymi z przynajmniej dwóch różnych serotypów wirusa. Korzystnie, geny są przynajmniej dwoma genami PrM, zwłaszcza genami 4 PrM. Korzystnie, geny homologiczne znajdują się pod kontrolą transkrypcyjną wczesnego/późnego promotora krowianki p7.5. Korzystnie, MVA jest

PL 218 318 B1

MVA-BN zdeponowanym w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Komórkowych (ECACC) pod numerem V00083008. Korzystnie, wirus MVA przejawia ograniczoną replikację lub jest replikacyjnie inkompetentny w komórkach ssaczych, w tym w komórkach ludzkich. Korzystnie, sekwencje wstawione są w naturalnie występujących miejscach delecji i/albo w obszarze międzygenowym genomu wirusa.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest rekombinowany wirus MVA według wynalazku do stosowania jako lek lub szczepionka.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka, która zawiera rekombinowanego wirusa MVA według wynalazku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, która zawiera rekombinowanego wirusa MVA według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik, adiuwant i/lub substancję dodatkową.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest rekombinowany wirus MVA według wynalazku, szczepionka według wynalazku albo kompozycja według wynalazku, do stosowania w oddziaływaniu na odpowiedź immunologiczną w żywych zwierzętach oraz ludziach.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie rekombinowanego wirusa MVA według wynalazku do wytwarzania leku, korzystnie do otrzymywania preparatu do oddziaływania na odpowiedź immunologiczną w żywych zwierzętach oraz ludziach.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka in vitro lub ex vivo zawierająca rekombinowanego wirusa MVA według wynalazku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób in vitro lub ex vivo otrzymywania rekombinowanego wirusa MVA określonego powyżej, charakteryzujący się tym, że obejmuje etapy

- infekcji komórki wirusem MVA;

- transfekcji zainfekowanej komórki pierwszym wektorem zawierającym sekwencję przeznaczoną do prowadzenia do gen genomu wirusa MVA oraz genomową sekwencję wirusa MVA, zdolną do ukierunkowania integracji sekwencji przeznaczonej do insercji w miejscu insercji genomu wirusa MVA;

- identyfikacji, izolacji i ewentualnie oczyszczania otrzymanego rekombinowanego wirusa ospy;

- powtórzenia powyższych etapów przy użyciu rekombinowanego wirusa MVA uzyskanego w poprzednich etapach do infekcji komórki i dodatkowego wektora zawierającego dodatkową sekwencję przeznaczoną do wprowadzenia do genomu wirusa MVA, przy czym wspomniana sekwencja jest homologiczna z sekwencją z pierwszego wektora.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw do uzyskiwania rekombinowanego wirusa MVA określonego powyżej, który to zestaw zawiera;

- dwa lub więcej wektory, każdy z nich zawierający sekwencję, przy czym sekwencje zawarte w różnych wektorach są sekwencjami o identyczności przynajmniej 50%, a każda sekwencja jest flankowana przez sekwencję DNA wirusa MVA, zdolną do ukierunkowania integracji genu w genomie wirusa MVA, oraz

- środki do identyfikacji oraz/albo selekcji rekombinowanych wirusów ospy, posiadających wbudowane w ich genomie wspomniane sekwencje homologiczne.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA zawierająca genom rekombinowanego wirusa MVA określonego powyżej, przy czym wspomniana sekwencja DNA zawiera (i) przynajmniej dwie sekwencje homologiczne o identyczności przynajmniej 50%, które są wprowadzone w różnych miejscach insercji i (ii) przynajmniej część sekwencji genomu wirusa MVA, przy czym wspomniana część sekwencji z genomu wirusa MVA flankuje wspomniane sekwencje homologiczne.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób in vitro lub ex vivo wykrywania komórek zainfekowanych rekombinowanym wirusem MVA określonym powyżej, charakteryzujący się tym, że obejmuje podawanie do wspomnianych komórek sekwencji DNA według wynalazku i wykrywanie wspomnianych komórek zainfekowanych rekombinowanym wirusem MVA.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób in vitro lub ex vivo identyfikacji rekombinowanego wirusa MVA według wynalazku, charakteryzujący się tym, że obejmuje podawanie do wspomnianego wirusa sekwencji DNA według wynalazku i identyfikowanie rekombinowanego wirusa MVA.

Szczegółowy opis wynalazku

Niniejszy wynalazek opiera się na rozwiązaniu obejmującym homologiczne geny pokswirusowe, pochodzące z różnych szczepów, kladów, wariantów, podtypów lub serotypów mikroorganizmu wywołującego chorobę infekcyjną. Jak już wspomniano wyżej, istnieją, na przykład, 4 grupy, podtypy lub serotypy wirusa Dengue, wszystkie zawierające te same typy genów, takich jak, np., gen kodujący białko kapsydu (C), gen kodujący białko przedbłonowe (PrM) lub gen białka otoczki (E). Jednakże,

PL 218 318 B1 sekwencja kwasu nukleinowego tego samego typu genu nie jest całkowicie identyczna i idealnie homologiczna, odpowiednio we wszystkich 4 serotypach: Na przykład, porównanie sekwencji (przy użyciu Lasergene 4.05 Magalign, Macintosh) między genami PrM 30 serotypu 1, 2, 3 i 4 (PrM1-4) wirusa Dengue ujawniło identyczność sekwencji na poziomie 66.5-72.9%, tj., homologię w przybliżeniu 6575%. Podsumowując, odpowiednio, różnice i wariacje w genach różnych podtypów mikroorganizmów wywołujących choroby infekcyjne powodują fakt, że szczepienie przeciwko jednemu podtypowi nie zapewnia automatycznie ochrony przed infekcjami innymi wariantami tego mikroorganizmu. Stąd, pomysł otrzymania rekombinowanego wirusa, zawierającego ściśle pokrewne lub homologiczne geny pochodzące z różnych szczepów, kladów, wariantów, podtypów łub serotypów mikroorganizmu wywołującego chorobę infekcyjną. Jednakże, jak już wcześniej wspomniano, rekombinacja homologiczna między sekwencjami homologicznymi występuje podczas cyklu życiowego wirusa i przebiega nawet między sekcjami DNA nie w pełni homologicznymi. Zatem, oczekiwano, że insercja genów homologicznych w pojedynczym genomie wirusa spowoduje zajście rekombinacji homologicznej, a przez to, delecji wstawionych genów homologicznych.

Jednakże, po uzyskaniu rekombinowanego pokswirusa zawierającego w swoim genomie przynajmniej dwa obce geny o homologii przynajmniej 60%, stwierdzono nieoczekiwanie, że wspomniane geny homologiczne pozostają stabilnie wstawione do genomu wirusa.

Nawet, gdy geny homologiczne o homologii przynajmniej 50% wstawiane były w różnych miejscach insercji genomu wirusa, geny te również pozostawały stabilnie wstawione w genomie wirusowym. W tym przypadku, przypuszczano, że w wyniku rekombinacji między wspomnianymi genami homologicznymi nastąpi dodatkowo utrata genów wirusa, istotnych odpowiednio, dla jego amplifikacji i cyklu życiowego, tj., oczekiwano, że cykl życiowy wirusa będzie silnie zakłócony. Ponadto, częstość rekombinacji jest proporcjonalna do odległości między dwoma związanymi genami, oczekiwano, zatem, że częstość przypadków rekombinacji między dwoma lub więcej homologicznymi genami położonymi w różnych miejscach insercji będzie wysoka, przez co spowoduje delecje wspomnianych genów i/lub poważne zakłócenia. Zgodnie z powyższym, okazało się całkowicie zaskakującym, że nie zaszła żadna rekombinacja, jednak geny homologiczne pozostawały stabilnie wstawione w różnych miejscach insercji genomu wirusowego.

W stanie techniki znane są rekombinowane pokswirusy zawierające obcy DNA z wirusa należącego do Flavivirus, takie jak wirus Japońskiego Zapalenia Mózgu (JEV), wirus Żółtej Febry (YFV) i wirus Dengue (US Patent No. 5,514,375). Jednakże, każdy z genów pochodzących ze wspomnianych Flavivirus wstawiany był jedynie pojedynczo i w tym samym miejscu insercji. Ponadto, porównanie sekwencji za pomocą odpowiedniego programu komputerowego (Lasergene 4.05 Magalign, Macintosh) ujawniło homologię między wstawionymi do genomu pokswirusa genami a genami pochodzącymi z JEV na poziomie 20.2%-29.6%, z YFV: 29.2%-45.3% i z wirusa Dengue: 22.8%-29.5%.

Podobnego ujawnienia dokonano w WO 98/13500, gdzie opisano insercje antygenów wirusa Dengue w tym samym miejscu insercji zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA), szczególnie w miejscu delecji II.

W US Patent No. 5,338,683 opisano insercję genów gp 13 i 14 glikoproteiny wirusa opryszczki w dwóch różnych miejscach insercji jednego rekombinowanego pokswirusa; jednakże oba geny posiadały homologię jedynie na poziomie 25.2%.

Porównanie sekwencji między genem hemaglutyniny a nukleoproteiny wirusa grypy, wstawionym w tym samym miejscu insercji (miejsce delecji III) zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA) ujawniło homologię na poziomie 49.1% (US Patent No. 5,676,950; Sutter i wsp., [1994], Vaccine 12: 1032).

W US Patent No. 5,891,442 ujawniono rekombinowany pokswirus zawierający sekwencję kodującą poliproteinę VP2, VP3 i VP4 zakaźnej choroby kaletkowej. Wspomniane geny poddane fuzji, a następnie, wstawione w pojedynczym miejscu insercji wykazywały homologię 41.9%-50.3%.

Ponadto, w US Patent No. 6,217,882 opisano rekombinowany wektor wirusa ospy świń zawierający antygeny wodowstrętu rzekomego: gp50 i gp63 o homologii 52.7% wstawione w tym samym miejscu insercji.

Podsumowując, można stwierdzić, że zgodnie ze stanem techniki, geny homologiczne lub sekwencje o homologii przynajmniej 50% są wstawiane wszystkie w to samo miejsce lub pojedyncze miejsce insercji w genomie wirusa.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, geny homologiczne lub sekwencje o homologii przynajmniej 50%, tj., homologii rzędu 50% - 100%, tj., o przynajmniej 50% identycznych zasad nukleotydowych. Geny lub sekwencje o homologii poniżej 50% mogą być uważane za heterologiczne. W świetle niniejPL 218 318 B1 szego wynalazku, termin „homologiczny” lub „homologia” stosowany jest, gdy geny lub sekwencje porównywane są ze sobą, natomiast termin gen „obcy”, sekwencja „egzogenna” lub „heterologiczna” stosowany jest, gdy geny lub sekwencje porównywane są z genomem pokswirusa; tj., wspomniane pojęcia odnoszą się do sekwencji DNA, nie związanej normalnie w naturze z pokswirusem według niniejszego wynalazku. Zgodnie z powyższym, wynalazek dotyczy rekombinowanego pokswirusa zawierającego przynajmniej dwa geny heterologiczne w porównaniu z genomem wirusa, lecz homologiczne wobec siebie nawzajem. Termin „geny” odnosi się do sekwencji kodujących, np., białka, polipeptydy, peptydy, antygeny itp. Białka, polipeptydy lub peptydy ulegające translacji z homologicznych genów pełnią taką samą funkcję i wykazują takie same właściwości funkcjonalne. Geny homologiczne pochodzą zazwyczaj z różnych, lecz spokrewnionych źródeł lub organizmów. Zgodnie z jedną z realizacji wynalazku, homologia sekwencji kodujących wynosi korzystnie 70% do 80%, korzystniej 80% do 90% lub 90% do 100%. Najkorzystniej, homologia jest na poziomie 65% do 75%.

Ze względu na to, że rekombinowany pokswirus według wynalazku zawiera istotną informację genetyczną w jednej pojedynczej jednostce infekcyjnej lub jedynie w jednej cząsteczce wirusa, nie ma niebezpieczeństwa pojawienia się nieregularnej infekcji i niezrównoważonej ekspresji różnych sekwencji homologicznych. Zatem, rekombinowany pokswirus według wynalazku, zawierający i zdolny do ekspresji kilku blisko czy nawet ściśle pokrewnych genów lub niemal identycznych sekwencji w jednej komórce infekcyjnej, jest szczególnie cenny w otrzymywaniu multiwalentnych szczepionek.

Zaleta ta jest szczególnie interesująca pod względem wprowadzania szczepionek przeciwko chorobom, które mogą być wywoływane przez kilka ściśle spokrewnionych szczepów lub serotypów wirusa, jak, np., wirusa Dengue. W Przykładach opisano rekombinowane pokswirusy zawierające geny homologiczne różnych serotypów wirusa Dengue.

Geny homologiczne lub sekwencje według niniejszego wynalazku mogą pochodzić z jakiegokolwiek mikroorganizmu, tak jak jakiegokolwiek wirusa, oprócz wektora wirusowego, jakichkolwiek bakterii, jakichkolwiek grzybów lub pasożytów. Korzystnie, geny homologiczne lub sekwencje pochodzą z zakaźnego lub patogennego mikroorganizmu, i korzystniej, z różnych szczepów lub kladów, wariantów, podtypów lub serotypów wspomnianego mikroorganizmu.

Termin „szczep” lub „klad” jest terminem technicznym, dobrze znanym specjalistom w dziedzinie, odnoszącym się do taksonomii mikroorganizmów. W systemie taksonomicznym sklasyfikowano wszystkie scharakteryzowane do tej pory mikroorganizmy w porządku hierarchicznym rodziny, rodzaju, gatunków, szczepów (Fields Virology, wyd. Fields B.N., Lippincott-Raven Publishers, 4 wyd. 2001). Kryterium przynależności do rodziny jest pokrewieństwo filogenetyczne, natomiast rodzaj obejmuje wszystkich członków o wspólnych właściwościach. Szczep zdefiniowany jest jako klasa politetyczna, która stanowi replikującą grupę o tym samym rodowodzie, zajmującą szczególną niszę ekologiczną. Termin „szczep” lub „klad” dotyczy mikroorganizmu, tj., wirusa, który wykazuje wspólną charakterystykę, jak podstawowe cechy morfologiczne lub struktura i organizacja genomu, lecz różni się właściwościami biologicznymi, jak zakres gospodarzy, tropizm tkankowy, występowanie geograficzne, atenuacja lub patogeniczność. Termin „warianty” lub „serotypy” pozwala na dalsze rozróżnienie między członkami tego samego szczepu, zwanymi również podtypami, wykazującymi poszczególne spektrum infekcji lub specyficzne właściwości antygenne, wywołane mniejszymi wariacjami genomowymi.

Zgodnie z kolejną realizacją wynalazku, geny lub sekwencje homologiczne wybierane są spośród wirusów, korzystnie wirusów, które należą do rodzaju Flavivirus, tak jak, korzystnie, lecz nie ograniczając, wirus Dengue, wirus West Nile lub wirus Japońskiego Zapalenia Mózgu; tych które należą do rodzaju Retroviruses, tak jak, korzystnie, lecz nie ograniczając, wirus nabytego ludzkiego niedoboru odporności (HIV); tych które należą do rodzaju Enteroviruses, tak jak, korzystnie, lecz nie ograniczając, wirusy chorób rąk, stóp i ust, EV71; które należą do rodzaju Rotaviruses, lub też należących do rodzaju Orthomyxoviruses, tak jak, korzystnie, lecz nie ograniczając, wirus grypy. Najkorzystniejsze są geny homologiczne pochodzące z FIavivirus.

Zgodnie z kolejną realizacją, geny homologiczne wybrane są spośród genów wirusa Dengue, korzystnie C, NS1 i/lub NS2, lub korzystnie E, korzystniej PrM. Najkorzystniej, geny homologiczne pochodzą z różnych serotypów wirusa, przy czym wspomniane geny mogą pochodzić z jednego, dwóch, trzech lub wszystkich czterech serotypów wirusa Dengue.

Zgonie z inną realizacją, geny homologiczne wybrane są spośród różnych szczepów lub kładów

HIV. Korzystnie, geny homologiczne wybrane są spośród sekwencji kodującej gag/pol, korzystniej z sekwencji kodującej env lub najkorzystniej, z kombinacji strukturalnych i/lub regulatorowych sekwencji kodujących HIV.

PL 218 318 B1

Wektor wirusowy odpowiedni do zastosowania w niniejszym wynalazku wybrany jest z grupy pokswirusów, które mogą być łatwo hodowane w wybranych komórkach gospodarza, jak, np., ptasie komórki gospodarza, lecz które wykazują silnie ograniczoną replikację lub w istocie nie replikują w organizmie człowieka lub komórkach ludzkich.

Zgodnie z kilkoma korzystnymi realizacjami, pokswirus według wynalazku wybrany jest z grupy obejmującej wirusy ospy kanarków (Plotkin i wsp. [1995] Dev Biol Stand.vol 84: str. 165-170. Taylor i wsp. [1995] Vaccine, vol. 13. No. 6: str. 539-549), wirusy ospy drobiu (Alfonso i wsp. [2000] J Virol, str. 3815-3831. Fields Virology, wyd. Fields B.N., Lippincott-Raven Publishers, wyd.4, 2001, rozdz. 85: str. 2916), wirusy ospy pingwinów (Stannard i wsp. [1998] J Gen Virol, 79, str. 1637-1649) lub ich pochodne. Ze względu na to, że wirusy te należą do rodzaju Avipoxvinis mogą być łatwo hodowane i amplifikowane w komórkach ptaków. Jednakże, w komórkach ssaków lub ludzkich wykazują ograniczoną replikację, co oznacza, że istotnie nie, lub prawie, nie produkują zakaźnych wirusów potomnych.

Zgodnie z kolejną realizacją niniejszego wynalazku, wirus krowianki, korzystnie atenuowany wirus krowianki, stosowany jest do otrzymywania rekombinowanych pokswirusów zawierających dwa lub więcej homologicznych genów.

Mimo że wiadomo, że wirusy krowianki (VV) mogą przeprowadzać rekombinację homologiczną krótkich sekwencji homologicznych i w ten sposób wywoływać delecję sekwencji homologicznych (Howley i wsp. [1996], Gene 172: 233-237), twórcy uzyskali rekombinowany wirus krowianki zawierający sekwencje homologiczne lub geny stabilnie wstawione do genomu wirusa. Wynik ten był szczególnie nieoczekiwany, ponieważ według Howely i wsp. już krótkie sekwencje do 300 par zasad (pz) były wystarczające do indukowania zmiany i delecji sekwencji homologicznych w wirusie krowianki. Specjalista w dziedzinie mógł, zatem przypuszczać, że dłuższe sekwencje będą z wysokim prawdopodobieństwem indukować rekombinację. Jednakże, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, nawet sekwencje zawierające w pełni homologiczne geny mogą być stabilnie wstawiane do genomu wirusa krowianki.

Jednym, lecz nie ograniczającym, przykładem wirusa krowianki jest silnie atenuowany i o ograniczonym zakresie gospodarzy szczep Vaccinia, jakim jest zmodyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA) (Sutter, G. i wsp. [1994], Vaccine 12; 1032-40). MVA otrzymano w wyniku około 570 pasaży szczepu Ankara wirusa krowianki (CVA) w fibroblastach embrionów kurcząt (praca przeglądowa Mayr, A. i wsp., Infection 3, 6-14 [1975]). W następstwie wspomnianych pasaży CVA utracił około 31 kilozasad informacji genomowej. Otrzymany szczep wirusa, MVA, został opisany jako posiadający silnie ograniczony zakres komórek gospodarza (Meyer, H. i wsp., J. Gen. Virol. 72, 1031- 1038 [1991]). Typowym szczepem MVA jest MVA 575, zdeponowany w Europejskiej Kolekcji Kultur Komórkowych, pod numerem depozytu ECACC V00120707.

W innej realizacji, szczep MVA-Vero lub jego pochodna mogą być zastosowane według wynalazku. Szczep MVA-Vero został zdeponowany w Europejskiej Kolekcji Kultur Komórkowych, pod numerem depozytu ECACC V99101431 i ECACC 01021411. Bezpieczeństwo MVA-Vero odzwierciedlają jego biologiczne, chemiczne i fizyczne właściwości, opisane w Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym PCT/EPO1/02703. W porównaniu z normalnym MVA, MVA-Vero posiada jedną dodatkową delecję w genomie.

Termin „pochodne” wirusa według wynalazku dotyczy wirusów potomnych, wykazujących te same cechy charakterystyczne, jak wirus rodzicielski, lecz przejawiające różnice w jednej lub więcej części genomu.

Kolejna realizacja wynalazku dotyczy zastosowania MVA-BN. MVA-BN został zdeponowany w Europejskiej Kolekcji Kultur Komórkowych, pod numerem depozytu ECACC V00083008. Zastosowanie MVA-BN lub jego pochodnej pozwala na otrzymanie szczególnie bezpiecznej szczepionki wirusowej, ponieważ wykazano, że wirus MVA-BN jest bardzo silnie atenuowanym wirusem, pochodzącym od zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara. Zatem, w najkorzystniejszej realizacji, MVA-BN lub jego pochodne zawierające dwa lub więcej homologicznych genów według wynalazku jest użyty jako wektor wirusowy. Termin „pochodna MVA-BN” odnosi się do wirusa o takich samych właściwościach funkcjonalnych, jak MVA-BN. Cechy charakterystyczne MVA-BN, opis analizy biologicznej pozwalającej na ocenę, czy MVA jest MVA-BN i jego pochodną oraz sposoby umożliwiające otrzymanie MVA-BN lub jego pochodnych zawarto w WO 02/42480 (włączony tytułem referencji). Prostym sposobem stwierdzenia funkcjonalnych cech MVA-BN lub jego pochodnych jest jego atenuacja i brak replikacji w ludzkich komórkach HaCat.

W rekombinowanym pokswirusie według wynalazku ekspresja sekwencji egzogennej przebiega korzystnie pod kontrolą transkrypcyjnego elementu kontrolnego pokswirusa, korzystniej transkrypcyjnego

PL 218 318 B1 elementu kontrolnego MVA, wirusa ospy kanarków, wirusa ospy drobiu lub ospy pingwinów lub najkorzystniej, promotora wirusa krowianki. Transkrypcyjne elementy kontrolne pokswirusów według wynalazku obejmują ponadto każdy transkrypcyjny element kontrolny funkcjonalny w układzie pokswirusowym.

Insercja egzogennych sekwencji według wynalazku jest korzystnie ukierunkowana do nieistotnych regionów genomu wirusa. Nieistotnymi regionami są np., Ioci lub otwarte ramki odczytu (ORF) genów pokswirusowych, które nie są istotne dla cyklu życiowego pokswirusa. Obszary między genowe, obejmujące przestrzeń między dwiema ORF również uważane są za regiony nieistotne według wynalazku. W innej realizacji wynalazku, sekwencje egzogenne wstawiane są w naturalnie występujących miejscach delecji genomu MVA (ujawnionych w PCT/EP96/02926 włączonym tytułem referencji).

Orientacja wstawionego DNA nie ma wpływu na funkcjonalność lub stabilność rekombinowanego wirusa według wynalazku.

Ze względu na to, że rekombinowane pokswirusy według wynalazku wykazują ścisłe ograniczenia wzrostu, a zatem, są silnie atenuowane, są one idealne do leczenia szerokiej grupy ssaków, włączając ludzi, nawet ludzi z niedoborem odporności. Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej, a także szczepionki służącej do indukcji odpowiedzi immunologicznej w żywym organizmie zwierzęcym, włączając ludzi.

Kompozycja farmaceutyczna może ogólnie obejmować jeden lub więcej z farmaceutycznie dopuszczalnych i/lub akceptowanych nośników, dodatków, antybiotyków, utrwalaczy, adiuwantów, rozcieńczalników i/lub stabilizatorów. Tego typu substancje pomocnicze mogą być wodą, roztworem soli fizjologicznej, glicerolem, etanolem, środkami nawilżającymi lub emulsyfikującymi, substancjami buforującymi pH itp. Odpowiednie nośniki są zazwyczaj rozległymi, wolno metabolizowanymi cząsteczkami, takimi jak białka, polisacharydy, kwasy polimlekowe, kwasy poliglikolowe, polimerowe aminokwasy, kopolimery aminokwasowe, agregaty lipidowe itp.

W celu otrzymania kompozycji szczepionek, rekombinowany MVA uzyskiwany jest w fizjologicznie dopuszczalnej postaci. Może być to dokonane w oparciu o doświadczenie w otrzymywaniu szczepionek przeciwko pokswirusom, stosowanych w szczepieniu przeciwko ospie (zgodnie z opisem wg Stickl, H. i wsp. [1974] Dtsch.med.Wschr. 99, 2386-2392). Na przykład, oczyszczony wirus przechowywany jest w -80°C, na poziomie miana 5x10E8 TCID50/ml, otrzymany w około 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4. W celu uzyskania preparatu szczepionki w zastrzyku, np., 10E2-10E8 cząsteczek rekombinowanego wirusa według wynalazku liofilizowanych jest w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), w obecności 2% peptonu i 1% ludzkiej albuminy, w ampułce, korzystnie w szklanej ampułce. Alternatywnie, zastrzyki szczepionki mogą być produkowane poprzez stopniowe suszenie sublimacyjne wirusa w formulacji. Formulacja ta może zawierać substancje dodatkowe, takie jak mannitol, dekstran, cukier, glicynę, laktozę lub poliwinylopirolidon lub inne dodatki, takie jak przeciwutleniacze lub gaz obojętny, stabilizatory lub odpowiednie do podawania in vivo białka rekombinowane (np., albumina surowicy ludzkiej). Następnie, szklana ampułka jest szczelnie zamykana i może być przechowywana w przedziale temperatur od 4°C do temperatury pokojowej przez kilka miesięcy. Jednakże, dopóki nie ma potrzeby jej użycia, przechowywana jest korzystnie w temperaturach poniżej -20°C.

W celu szczepienia lub leczenia, liofilizat może zostać rozpuszczony w 0,1 do 0.5 ml wodnego roztworu, korzystnie roztworu soli fizjologicznej lub buforu Tris i podawany doukładowo lub domiejscowo, tj., pozajelitowo, podskórnie, dożylnie, domięśniowo, przez skaryfikację lub w jakikolwiek inny sposób podawania znany specjalistom w dziedzinie. Droga podawania, dawka i ilość podań może zostać w znany specjalistom w dziedzinie sposób zoptymalizowana. Jednakże, często, pacjent zaszczepiany jest drugim zastrzykiem około miesiąc do sześciu tygodni po pierwszym szczepieniu.

Rekombinowany wirus według wynalazku stosowany jest do wprowadzenia do komórki docelowej egzogennej sekwencji kodującej. Wprowadzenie egzogennej sekwencji kodującej do komórki docelowej może być wykorzystane do produkcji in vitro odpowiednio, białek, polipeptydów, peptydów, antygenów i epitopów. Ponadto, sposób wprowadzenia homologicznej lub heterologicznej sekwencji do komórek może być stosowany zarówno w terapii in vitro, jak i in vivo. W terapii in vitro, izolowane komórki, wcześniej zainfekowane (ex vivo) rekombinowanym pokswirusem według wynalazku, podawane są do żywego organizmu zwierzęcego w celu indukowania odpowiedzi immunologicznej. W terapii in vivo, w celu indukowania odpowiedzi immunologicznej, rekombinowany pokswirus według wynalazku podawany jest bezpośrednio do żywego organizmu zwierzęcego. W tym przypadku, komórki otaczające miejsce zaszczepienia są bezpośrednio infekowane in vivo przez wirus lub rekombinowany wirus według wynalazku. Po infekcji, komórki syntetyzują białka, polipeptydy, peptydy lub antygeny, kodowane przez egzogenne sekwencje kodujące, a następnie prezentują je lub ich część na powierzchni komórkowej.

PL 218 318 B1

Wyspecjalizowane komórki układu immunologicznego rozpoznają prezentowane obce białka, polipeptydy, peptydy, antygeny i epitopy i inicjują swoistą odpowiedź immunologiczną.

Sposoby otrzymywania rekombinowanych pokswirusów lub wprowadzania egzogennych sekwencji kodujących do genomu pokswirusowego są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Ponadto, metody zostały opisane w przykładach, mogą również zostać wywnioskowane lub skompletowane na podstawie następujących pozycji, podanych tytułem referencji;

- Molecular Cloning, A laboratory Manual. Wydanie drugie. Według J. Sambrook, E.F, Fritsch i T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989: opisano techniki i wiedzę dotyczącą standardowych technik biologii molekularnej, takich jak klonowanie DNA, izolacja RNA, technika western blotting, techniki amplifikacji RT-PCR i PCR,

- Virology Methods Manual. Według Brian WJ Mahy i Hillar O Kangro. Academic Press. 1996: opisano techniki operowania i manipulowania wirusami;

- Molecular Virology: A Practical Approach. Według AJ DAvison i RM Elliott. The Practical Approach Series. IRL Press at Oxford University Press. Oxford 1993. Rozdział 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors (Ekspresja genów w wektorach wirusa krowianki);

- Current Protocols in Molecular Biology. Wyd.: John Wiley i Son Inc. 1998. Rozdział 16, część IV: Expression of proteins in mammalian cells using Vaccinia viral vector: opisano techniki i wiedzę operowania, manipulowania i inżynierii genetycznej MVA.

W celu otrzymania rekombinowanych pokswirusów według wynalazku mogą być zastosowane różne sposoby:

Sekwencja DNA mająca być wstawiona do wirusa może zostać umieszczona w plazmidzie E.coli, do którego wstawiono DNA homologiczny z fragmentem DNA pokswirusa. W oddzielnym etapie, sekwencja DNA mająca być wstawiona, jest ligowana z promotorem. Takie połączenie promotorgen umieszczane jest w plazmidzie, w taki sposób, że jest ono flankowane z obu stron przez DNA homologiczny z sekwencją DNA flankującą region DNA pokswirusa, zawierający nieistotne locus. Otrzymany plazmid jest amplifikowany przez namnażanie bakterii E.coIi, po czym izolowany. Wyizolowany plazmid zawierający sekwencję genu DNA, który ma być włączony, jest transfekowany do kultury komórkowej, np., fibroblastów embrionu kurcząt (CEF), wraz z pokswirusem. Rekombinacja odpowiednio, między homologicznym DNA pokswirusa w plazmidzie i genomie wirusa pozwala na uzyskanie zmodyfikowanego pokswirusa, zawierającego sekwencje obcego DNA.

Zgodnie z korzystną realizacją, komórki odpowiedniej kultury komórkowej, tak, jak komórki CEF, są infekowane pokswirusem. Zainfekowane komórki są, następnie, transfekowane pierwszym wektorem plazmidowym, zawierającym obcy gen, korzystnie pod kontrolą transkrypcyjną elementu kontroli ekspresji pokswirusa. Jak wyjaśniono wyżej, wektor plazmidowy zawiera również sekwencje zdolne do ukierunkowywania insercji sekwencji egzogennej do wybranej części genomu pokswirusa. Dowolnie, wektor plazmidowy zawiera również kasetę obejmującą gen markerowy i/lub selekcyjny związany operacyjnie z promotorem pokswirusa. Odpowiednimi genami markerowymi lub selekcyjnymi są, np., geny kodujące zielone białko fluorescencyjne, β-galaktozydazę, neomycynę, fosforybozylotransferazę lub inne markery. Użycie kaset selekcyjnych lub markerowych ułatwia identyfikację i izolację otrzymanego rekombinowanego pokswirusa. Jednakże, rekombinowany pokswirus może również być identyfikowany za pomocą techniki PCR. Następnie, kolejne komórki infekowane są rekombinowanym pokswirusem uzyskanym jak opisano wyżej i transfekowane drugim wektorem zawierającym gen, homologiczny z genem zawartym w pierwszym wektorze. W tym przypadku, gen ten będzie włączony w różnych miejscach insercji genomu pokswirusowego. Drugi wektor również posiada różne sekwencje ukierunkowujące integrację genu homologicznego z genomem pokswirusa. Po zajściu rekombinacji homologicznej, możliwe jest wyizolowanie rekombinowanego wirusa zawierającego dwa homologiczne geny. W celu wprowadzenia więcej niż dwóch homologicznych genów do rekombinowanego wirusa, powtarzane są etapy infekcji i transfekcji przy użyciu do infekcji rekombinowanego wirusa wyizolowanego w poprzednich etapach i zastosowanie do transfekcji kolejnego wektora zawierającego inny gen homologiczny.

Alternatywnie, etapy infekcji i transfekcji, jak wyżej opisano są zamienne, tj., odpowiednia komórka może najpierw być transfekowana wektorem plazmidowym zawierającym obcy gen, a potem infekowana pokswirusem.

W kolejnej realizacji możliwe jest również wprowadzenie każdego homologicznego genu do różnego wirusa, jednoczesna infekcja komórki wszystkimi uzyskanymi rekombinowanymi wirusami i analiza skriningowa rekombinowanego produktu, obejmującego wszystkie geny homologiczne.

PL 218 318 B1

Wynalazek związany jest ponadto z zestawem zawierającym dwa lub więcej wektory plazmidowe zdolne do ukierunkowywania insercji ekspresjonowanych, homologicznych genów do genomu pokswirusa. Oprócz odpowiedniego miejsca klonowania tego typu wektory plazmidowe zawierają sekwencje zdolne do ukierunkowywania insercji egzogennej sekwencji do wybranych części genomu pokswirusowego. Dowolnie, takie wektory zawierają kasety genu selekcyjnego lub markerowego. Zestaw obejmuje ponadto środki i instrukcje do przeprowadzenia selekcji wirusów, które uległy rekombinacji pod względem jednego lub kilku genów homologicznych i dowolnie, gen selekcyjny lub markerowy, wstawiony za pomocą wspomnianych wektorów.

Zgodnie z kolejną realizacją, wynalazek obejmuje sekwencje DNA lub ich fragmenty pochodzące lub homologiczne z rekombinowanym pokswirusem według wynalazku. Takie sekwencje obejmują przynajmniej część egzogennej sekwencji zawierającej przynajmniej fragment jednego z homologicznych genów według wynalazku i przynajmniej fragment genomowej sekwencji pokswirusa według wynalazku, przy czym wspomniane sekwencje genomowe pokswirusa korzystnie flankują sekwencję egzogenną.

Tego typu sekwencje DNA mogą być zastosowane do identyfikowania lub izolowania wirusa lub jego pochodnych, np., poprzez wykorzystanie ich do otrzymywania starterów PCR, sond hybrydyzacyjnych lub w innych technikach szeregujących.

Krótki opis figur

Figura 1: Schematyczny obraz miejsc insercji dla czterech genów PrM (=przedbłonowe) (serotyp 1-4) w genomie MVA według Przykładu I.

Figura 2-9 i 12-17: Opis plazmidowego wektora insercji, wskazano nazwę wektora, jego wielkość i położenie istotnych sekwencji, takich jak;

AmpR = gen oporności na ampicylinę, bfp = gen niebieskiego białka fluorescencyjnego, dA = delecja A, dE = delecja E, d2 = delecja 2, Ecogpt = gen guanozynofosforybozylotransferazy z E.coli, EGFP = gen wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego, F1 = sekwencja flankująca 1, F2 = sekwencja flankująca 2, I4L = obszar międzygenowy I4L, IGR = obszar międzygenowy, NPT II = gen oporności na neomycynę, P = promotor pokswirusa, pr7.5 = promotor 7.5 krowianki, PrM = gen białka przedbłonowego wirusa Dengue, numer wskazuje, z którego z czterech serotypów pochodzi, rpt = powtórzenie sekwencji flankującej.

Figura 10: Ocena przebiegu klonowania czterech różnych wektorów insercji (pBN49, pBN50, pBN50, pBN40, pBN39) za pomocą PCR. Każdy z plazmidów testowano stosując 4 różne kombinacje starterów (primerów) PCR. Każda kombinacja jest specyficzna dla jednej odrębnej sekwencji PrM włączonej w jednym, odrębnym miejscu insercji.

Figura 11: Weryfikacja techniką PCR rekombinowanych pokswirusów zawierających cztery homologiczne geny PrM wirusa Dengue (Przykład 1). W górnej części żelu widoczne są zróżnicowane wyniki PCR dla rekombinowanego wirusa, natomiast w dolnej części przedstawiono wyniki tych samych reakcji PCR dla plazmidów kontrolnych. Plazmidy zawierające sekwencje homologiczne nazwano pBN39, pBN49 lub pBN50. PrM oznacza wstawione geny białka przedbłonowego z wirusa Dengue, przy czym numery wskazują na jeden z czterech serotypów, z którego pochodzą. dA = delecja A, dE = delecja E, d2 = delecja 2, I4L = obszar międzygenowy I4L określa miejsce insercji egzogennego DNA.

Figura 18: Schematyczny obraz miejsc insercji trzech genów PrM (serotyp 2-4) w genomie MVA według Przykładu 2.

Figura 19; Weryfikacja techniką PCR rekombinowanych pokswirusów zawierających trzy homologiczne geny PrM wirusa Dengue wstawione w obszarach międzygenowych (Przykład 2). W górnej części widoczne są wyniki reakcji PCR specyficznych dla PrM2, na środku przedstawiono wyniki reakcji PCR specyficznej dla PrM3, a na dole wyniki reakcji PCR specyficznych dla PrM4. Obraz na ścieżce 8 odpowiada tym samym reakcjom PCR, przeprowadzonym na plazmidach kontrolnych. Ścieżka 2 odpowiada pustemu wektorowi kontrolnemu MVA. PrM oznacza wstawione geny białka przedbłonowego z wirusa Dengue, przy czym numery wskazują na jeden z czterech serotypów, z którego pochodzą. M = wagowy marker cząsteczkowy.

Poniższe przykłady obrazują niniejszy wynalazek. Dla specjalistów w dziedzinie pozostaje jasne, że opisane poniżej przykłady w żaden sposób nie mogą być rozumiane jako ograniczające zastosowanie technologii według niniejszego wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Wektory insercji

Wektor insercji dla delecji A

PL 218 318 B1

W celu uzyskania insercji egzogennych sekwencji do genomu MVA w tak zwanym miejscu, odpowiednio delecji A lub delecji 1, odpowiadającym pozycji 7608-7609 genomu, przygotowano wektor plazmidowy zawierający około 600 pz sekwencji flankujących sąsiadujących z miejscem delecji A. Do wyizolowania sekwencji flankujących z genomowego DNA MVA-BN, zaprojektowano, stosując program komputerowy (DNAsis, Hitashi software engeneering, San Bruno, USA), odpowiednie startery PCR. Startery te obejmują miejsca enzymów restrykcyjnych, wykorzystane do klonowania sekwencji flankujących w wektorze plazmidowym. Pomiędzy takimi sekwencjami flankującymi wprowadzano kasetę genu selekcji, np., genu NPT II (oporności na neomycynę) pod kontrolą transkrypcyjną promotora wirusa ospy (pokswirusa). Ponadto, istnieje miejsce klonowania dla insercji dodatkowych genów lub sekwencji egzogennych, wstawianych w miejscu delecji A. Jeden tego typu wektor według wynalazku ujawniono na Fig. 2 (pBNX10).

Wektor insercji dla delecji E

W celu uzyskania insercji egzogennych sekwencji do genomu MVA w tak zwanym miejscu, odpowiednio delecji E lub delecji 4, odpowiadającym pozycji 170480-170481 genomu, przygotowano wektor plazmidowy zawierający około 600 pz sekwencji flankujących, sąsiadujących z miejscem delecji E. Wektor zaprojektowano i otrzymano zgodnie z powyższym opisem. Pomiędzy sekwencjami flankującymi umieszczano gen EGFP (zielone białko fluorescencyjne, Clonetech) pod kontrolą transkrypcyjną promotora wirusa ospy (pokswirusa). Ponadto, istnieje miejsce klonowania dla insercji dodatkowych genów lub sekwencji, wstawianych w miejscu delecji A. Jeden tego typu wektor według wynalazku ujawniono na Fig. 3 (pBNX32).

Wektor insercji dla delecji 2

W celu uzyskania insercji egzogennych sekwencji do genomu MVA w tak zwanym miejscu delecji 2, odpowiadającym pozycji 20718-20719 genomu, przygotowano wektor plazmidowy zawierający około 600 pz sekwencji flankujących, sąsiadujących z miejscem delecji 2. Wektor zaprojektowano i otrzymano zgodnie z powyższym opisem. Pomiędzy sekwencjami flankującymi umieszczono gen hbfp (humanizowane niebieskie białko fluorescencyjne, Pavalkis GN i wsp.) pod kontrolą transkrypcyjną promotora wirusa ospy (pokswirusa). Ponadto, istnieje miejsce klonowania dla insercji dodatkowych genów lub sekwencji, wstawianych w miejscu delecji 2. Jeden tego typu wektor według wynalazku ujawniono na Fig. 4 (pBNX36).

Wektor insercji dla międzygenowego obszaru, I4L

W celu uzyskania insercji egzogennych sekwencji w obszarze międzygenowym, między ORF I3L a I4L, odpowiadającym pozycji 56760 genomu, przygotowano wektor zawierający około 600 pz sekwencji flankujących, sąsiadujących z obszarem międzygenowym w locus I4L. Wektor zaprojektowano i otrzymano zgodnie z powyższym opisem. Pomiędzy sekwencjami flankującymi wprowadzano gen Ecogpt (lub gpt oznacza gen fosforybozylotransferazy wyizolowany z E.coli) pod kontrolą transkrypcyjną promotora pokswirusa. Ponadto, istnieje miejsce klonowania dla insercji dodatkowych genów lub sekwencji, wstawianych w obszarze międzygenowym, w położeniu po I4L ORF. Jeden tego typu wektor według wynalazku ujawniono na Fig. 5 (pBNX39).

Otrzymywanie rekombinowanego pokswirusa zawierającego w swoim genomie kilka zintegrowanych genów homologicznych

Wektory insercji

Do wstawienia czterech genów PrM czterech serotypów wirusa Dengue w genomie MVA zastosowano cztery niezależne wektory rekombinacyjne.

Wektory te zawierają - jak opisano szczegółowo wyżej - sekwencje homologiczne z genomem MVA służące do ukierunkowywania insercji drogą rekombinacji homologicznej. Ponadto, każdy wektor zawiera kasetę genu selekcji lub reporterowego.

Sekwencje PrM czterech serotypów wirusa Dengue otrzymywano syntetycznie poprzez przyłączenie oligonukleotydów i powielenie techniką PCR. Otrzymano kasetę ekspresyjną klonując sekwencje PrM elementów promotorowych pokswirusa. Taka kaseta ekspresyjna była, następnie, klonowana w miejscu klonowania odpowiedniego wektora insercji.

W wyniku uzyskano wektor insercji dla delecji A, zawierający gen PrM serotypu 2 wirusa Dengue (Figura 6 - pBN39). Wektor insercji dla delecji 2 zawierał gen PrM serotypu 1 wirusa Dengue (Figura 7 - pBN49). Wektor insercji dla regionu międzygenowego I4L zawierał gen PrM serotypu 3 wirusa Dengue (Figura 8 - pBN50).

Wektor insercji dla delecji E zawierał gen PrM serotypu 4 wirusa Dengue (Figura 9 - pBN40).

Weryfikacja techniką PCR otrzymanych wektorów insercji

PL 218 318 B1

W celu potwierdzenia wyników klonowania przeprowadzono analizę produktów PCR. W technice PCR wykorzystano wybrane pary starterów będące kombinacją startera specyficznie wiążącego się ze specyficzną sekwencją flankującą, odpowiednią dla danego miejsca insercji i startera wybiórczo wiążącego się z jednym z wysoko homologicznych genów PrM wirusa Dengue.

Wektor insercji dla delecji A zawierający gen PrM z serotypu 2 wirusa Dengue analizowany był przy użyciu starterów oBN93 (CGCGGATCCATGCTGAACATCTTGAACAGGAGACGCAGA. SEQ ID NO: 1) i OBN477 (CATGATAAGAGATTGTATCAG. SEQ ID NO,; 2).

Wektor insercji dla delecji 2 zawierający gen PrM z serotypu 1 wirusa Dengue analizowany był przy użyciu starterów oBN194 (ATGTTGAACATAATGAACAGGAGGAAAAGATCTGTGACCATGCTCCTCATGCTGCTGCCC ACAGCCCTGGCGTTCCATCT. SEQ ID NO.; 3) oraz oBN476 (GATTTTGCTATTCAGTGGATGGATG. SEQ ID NO.; 4),

Wektor insercji dla obszaru międzygenowego I4L zawierający gen PrM z serotypu 3 wirusa Dengue analizowany był przy użyciu starterów oBN255 (CCTTAATCGAATTCTCATGTCATGGATGGGGTAACCAGCATTAATAGT. SEQ ID NO.; 5) oraz oBN479 (GCTCCCATTCAATTCACATTGG. SEQ ID NO.; 6).

Wektor insercji dla delecji E zawierający gen PrM z serotypu 4 wirusa Dengue analizowany był przy użyciu starterów oBN210 (ATCCCATTCCTGAATGTGGTGTTAAAGCTACTGAGCGCTTCTCTCGTCTCCGTTCTCCGC TCTGGGTGCATGTCCCATAC. SEQ ID NO.; 7) oraz oBN478 (GTACATGGATGATATAGATATG SEQ ID NO.; 8).

Eksperymenty PCR przeprowadzono w aparacie Thermal cycler GeneAmp 9700 (Perkin Elmer) stosując zestaw polimerazy DNA Taq, zawierający 10x bufor PCR, bufor MgCb oraz polimerazę DNA Taq (Roche, nr kat. 201205) lub jej ekwiwalent.

Ogólnie, reakcje PCR prowadzono w całkowitej objętości reakcji 50 μ|, zawierającej 45 μΐ mieszaniny mastermix, próbkę DNA i w razie potrzeby, ddH2O. Mieszanina mastermix powinna być otrzymana z 30.75 μ| ddH2O, 5 μ| 10xbufor, 1 μ| mieszaniny dNTP (10 mM każdy), 2.5 μ| każdego ze starterów (5 pmol/μΙ), 3 μΙ MgCly(25 mM) oraz 0.25 μΙ polimerazy Taq (5 U/μΙ).

Amp|ifikacja przebiegała według następującego programu:

1) denaturacja;	4 min 94°C
2) 30 cykli
Denaturacja:	30 s	94°C
Asocjacja:	30 s	55°C
Elongacja:	1-3 min	72°C
3) Elongacja	7 min	72°C

4) Zatrzymanie i pozostawienie w 4°C

W zależności od wielkości wstawianego genu, czas elongacji powinien wynosić przyn aj mniej 1 min/kz.

Na podstawie wyników PCR przedstawionych na Fig. 10 wykazano specyficzność poszczególnych kombinacji starterów względem pojedynczego miejsca insercji.

Łączne zastosowanie startera oBN194/oBN476 jest specyficzne dla delecji 2 i wstawienia PrM1. Oczekiwany fragment PCR plazmidu pBN49 posiada długość 678 pz (przedstawiono na ścieżce 3, górna część żelu).

Łączne zastosowanie startera oBN255/oBN479 jest specyficzne dla międzygenowego obszaru I4L i wstawienia PrM3. Oczekiwany fragment PCR plazmidu pBN50 posiada długość 825 pz (przedstawiono na ścieżce 9, górna część żelu).

Łączne zastosowanie startera oBN210/oBN478 jest specyficzne dla delecji E i wstawienia PrM4. Oczekiwany fragment PCR plazmidu pBN40 posiada długość 607 pz (przedstawiono na ścieżce 5, dolna część żelu).

Łączne zastosowanie startera oBN93/oBN477 jest specyficzne dla delecji A i wstawienia PrM2. Oczekiwany fragment PCR plazmidu pBN39 posiada długość 636 pz (przedstawiono na ścieżce 11, dolna część żelu).

Otrzymanie rekombinowanego MVA drogą rekombinacji homologicznej

W celu uzyskania ekspresji obcych genów w rekombinowanym MVA, geny te wstawiane były do genomu wirusowego dzięki procesowi zwanemu rekombinacją homologiczną. W związku z powyż14

PL 218 318 B1 szym, pożądane, obce geny klonowano zgodnie z powyższym opisem do wektora insercji. Wektor ten musiał być użyty do transfekcji po infekcji komórek wirusem MVA-BN. Rekombinacja będzie przebiegać w cytoplazmie zainfekowanych i transfekowanych komórek. Dzięki wykorzystaniu kasety genu selekcji/reporterowego, również zawartej w wektorze insercji, możliwe jest zidentyfikowanie i wyizolowanie komórek zawierających rekombinowane wirusy. Rekombinacja homologiczna w celu uzyskania rekombinacji homologicznej, komórki BHK (nerki młodego chomika) lub komórki CEF (pierwotne fibroblasty embrionu kurcząt) zaszczepiano na 6 studzienkowych płytkach stosując DMEM (podłoże Dulbecco's Modified Eagles Medium, Gibco BRL) + 10% płodową surowicę cielęcą (FCS) lub VP-SFM (Gibco BRL) + 4 mmol/1 L-glutaminy w przypadku procesu bez dodatku surowicy.

Konieczne by komórki znajdowały się w fazie wzrostu, a zatem, w dniu transfekcji powinny osiągnąć konfluencję 60-80%. Komórki zliczano przed zaszczepieniem, ponieważ do określenia poziomu multiplikacji infekcji (moi) musi być znana ich ilość.

Do infekcji zastosowano roztwór wyjściowy MVA, rozcieńczony w DMEM/FCS lub VP-SFM/Lglutaminie, tak by 500 μΐ rozcieńczenia zawierało odpowiednią ilość wirusa, pozwalającego na uzyskanie moi na poziomie 0.01. Komórki zbierano, po czym ponownie rozdzielano po zaszczepieniu. Usuwano podłoże a komórki infekowano 500 μΐ rozcieńczonego wirusa, mieszając przez godzinę w temperaturze pokojowej. Usuwano inokulum i przemywano komórki DMEM/VP-SFM. Zainfekowane komórki pozostawiano w 1.6 ml odpowiednio, DMEM/FCS i VP-SFM/L-glutaminy i prowadzono reakcję transfekcji (Qiagen Effectene Kit).

Do transfekcji zastosowano zestaw transfekcyjny „Effectene” (Qiagen). Mieszaninę transfekcyjną otrzymywano dodając 1-5 μg zlinearyzowanego wektora insercji (całkowita ilość dla wielokrotnej transfekcji) do buforu EC, osiągając objętość końcową 150 pi. Następnie dodano 8.0 μl enhancera (wzmacniacza) na pg DNA, wstrząśnięto i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. W kolejnym etapie, po wstrząśnięciu roztworu, dodano 25 μΐ Effectene na pg DNA, gruntownie mieszano wytrząsając i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 min. Dodano 600 μΐ odpowiednio, DMEM/FCS i VP-SFM/L-glutaminy, wymieszano, a następnie całkowitą mieszaninę transfekcyjną dodawano do komórek, już pokrytych podłożem. W celu wymieszania reakcji transfekcji delikatnie poruszano płytkami. Całonocna inkubacja przebiegała w 37°C, w atmosferze 5% CO2. Następnego dnia podłoże usuwano i zastępowano świeżym roztworem DMEM/FCS lub VP-SFM/L-glutaminy. Inkubację kontynuowano do 3 dnia.

Komórki gromadzono zeskrobując do podłoża, zawiesinę komórkową przenoszono do odpowiednich probówek i zamrażano w -20°C w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub w -80°C, dla długotrwałego przechowywania.

Wstawienie PrM4 do MVA

W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA-BN według wyżej opisanego protokołu, i dodatkowo transfekowano wektorem insercji pBN40, zawierającym gen PrM z serotypu 4 wirusa Dengue oraz gen EGFP, jako gen reporterowy. Ze względu na to, że transfekowany wektor zawiera gen reporterowy, EGFP, zsyntetyzowane białko jest możliwe do wykrycia w komórkach najpóźniej trzeciego dnia po infekcji rekombinowanym wirusem. Tak uzyskane rekombinowane wirusy oczyszczano stosując oczyszczanie na płytkach, metodą „łysinek”.

W celu oczyszczenia na płytkach zainfekowanych komórek (fluorescencyjnych lub zabarwionych) są one izolowane i przenoszone końcówką pipety do podłoża, zawieszane i zasysane w 200 μΐ PBS lub podłoża. Następnie nowa płytka hodowlana zawierająca około 10E6 komórek jest infekowana 100 μΙ zawieszonych komórek. Po 48 godz. komórki są przenoszone do 300 μΐ PBS. Z zawiesiny ekstrahowany jest DNA i analizowany techniką PCR. Wybierany jest klon wykazujący oczekiwany prążek i nowe, 6 studzienkowe płytki są infekowane różnymi ilościami tego wirusa. Pokrycie studzienek 1% agarozą zapobiega dalszemu rozprzestrzenianiu się wirusa. Po 48 godz. izolowane są zainfekowane i zawierające rekombinowany wirus komórki.

Procedura ta powtarzana jest aż do momentu zaniknięcia dzikiego typu MVA-BN, czyli gdy jest on niemożliwy do wykrycia techniką PCR.

Po czterech cyklach oczyszczania na płytkach rekombinowanych wirusów, identyfikowano MVA-PrM4 przy użyciu techniki PCR i zastosowaniu pary starterów powod ujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji (jak opisano wyżej, oBN210 oraz oBN478) oraz jako kontrolę, parę starterów specyficznie rozpoznającą jako miejsce insercji delecję E (oBN453; GTTGAAGGATTCACTTCCGTGGA, SEQ ED NO.: 9 i oBN454 GCATTCACAGATTCTATTGTGAGTC, SEQ ID NO : 10).

PL 218 318 B1

Wstawienie PrM2 do MVA-PrM4

Komórki infekowano MVA-PrM4 według wyżej opisanego protokołu, i dodatkowo transfekowano wektorem insercji pBN39, zawierającym gen PrM z serotypu 2 wirusa Dengue oraz gen NPT II, gen oporności na neomycynę , jako gen selekcyjny. W celu oczyszczenia rekombinowanego MVA, ekspresjonującego gen oporności na antybiotyk, polecane jest przed oczyszczeniem na płytkach metodą „łysinek”, przeprowadzenie trzech cykli amplifikacji wirusa w warunkach selekcji. Selekcję pod kątem aktywności neomycynofosfotransferazy umożliwia dodanie do podłoża G418. G418 jest pochodną neomycyny i inhibituje biosyntezę białek poprzez zakłócenie aktywności rybosomów. Aktywność genu NPT eliminuje działanie G418 poprzez reakcję fosforylacji.

Po 16 cyklach oczyszczania na płytkach w warunkach selekcji neomycyną, rekombinowane wirusy, MVA-PrM4/PrM2, identyfikowano przy użyciu techniki PCR, przy zastosowaniu pary starterów powodujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji (jak opisano wyżej, oBN93 oraz oBN477) oraz jako kontrolę, parę starterów specyficznie rozpoznającą jako miejsce insercji delecję A (jak opisano wyżej, OBN477) oraz oBN452: GTTTCATCAGAAATGACTCCATGAAA, SEQ ID.NO.: 11). Ponadto, weryfikowano również insercję PrM4 w miejscu delecji E, stosując pary starterów: oBN210-oBN478 oraz oBN453 - oBN454.

Wstawienie PrM1 do MVA

W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA-BN według wyżej opisanego protokołu, i dodatkowo transfekowano wektorem insercji pBN49, zawierającym gen PrM z serotypu 1 wirusa Dengue oraz gen humanizowanego białka niebieskiej fluorescencji hbfp, jako gen reporterowy. Zsyntetyzowane białko hbfp jest możliwe do wykrycia w komórkach najpóźniej trzeciego dnia po infekcji rekombinowanym wirusem. Tak uzyskane rekombinowane wirusy oczyszczano stosując oczyszczanie na płytkach, metodą „łysinek”.

Po 10 cyklach oczyszczania na płytkach, rekombinowane wirusy, MVA-PrM1, identyfikowano przy użyciu techniki PCR, przy zastosowaniu pary starterów powodujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji (jak opisano wyżej, oBN194 oraz oBN476) oraz jako kontrolę, parę starterów specyficznie rozpoznającą jako miejsce insercji delecję 2 (oBN54: CGGGGTACCCGACGAACAAGGAACTGTAGCAGAGGCATC, SEQ ID NO.: 12 oraz OBN56: AACTGCAGTTGTTCGTATGTCATAAATTCTTTAATTAT, SEQ ID NO.: 13).

Wstawienie PrM3 do MVA

W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA-BN według opisanego wyżej protokołu, i dodatkowo transfekowano wektorem insercji pBN50, zawierającym gen PrM z serotypu 3 wirusa Dengue oraz gen Ecogptp (Ecogptp lub w skrócie gpt oznacza gen fosforybozylotransferazy), jako gen reporterowy. Tak uzyskane rekombinowane wirusy oczyszczano stosując 3 cykle oczyszczania na płytkach, metodą „łysinek” w warunkach selekcji metabolizmu fosforybozylotransferazy przez dodanie kwasu mykofenolowego, ksantyny i hipoksantyny. Kwas mykofenolowy (MPA) inhibituje dehydrogenazę monofosforanu inozyny i powoduje blokadę syntezy puryn i inhibicję replikacji wirusa w większości linii komórkowych. Ta blokada może być ominięta poprzez ekspresję Ecogpt z konstytutywnego promotora i dostarczenie substratów ksantyny i hipoksantyny.

Uzyskane rekombinowane wirusy, MVA-PrM3, identyfikowano przy użyciu techniki PCR, przy zastosowaniu pary starterów powodujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji (jak opisano wyżej, oBN255 oraz oBN479) oraz jako kontrolę, parę starterów specyficznie rozpoznającą jako miejsce insercji I4L (oBN499: CAACTCTCTTCTTGATTACC, SEQ ID NO.: 14 oraz oBN500: CGATCAAAGTCAATCTATG; SEQID NO.: 15).

Jednoczesna infekcja MVA-PrM1 oraz MVA-PrM3

Komórki infekowano równą ilością MVA-PrM1 oraz MVA-PrM3 zgodnie z powyższym protokołem. Po 3 cyklach oczyszczania niebiesko fluoryzujących klonów na płytkach w warunkach selekcji metabolizmu fosforybozylotransferazy, rekombinowane wirusy analizowano techniką PCR stosując pary starterów (jak opisano wyżej. oBN255 i OBN479. OBN499 i oBN500. oBN194 i oBN476. oBN54 i oBN56). Uzyskane rekombinowane wirusy nazwano MVA-Pr1/PrM3,

Jednoczesna infekcja MVA-PrM1/PrM3 oraz MVA-PrM2/PrM4

Komórki infekowano zgodnie z powyższym protokołem równą ilością MVA-PrM1/PrM3 oraz

MVA-PrM2/PrM4. Wykonano oczyszczenie na płytkach w warunkach selekcji metabolizmu fosforybozylotransferazy i neomycyny. Rekombinowane wirusy indukujące zieloną i niebieską fluorescencję izolowano i analizowano techniką PCR stosując pary starterów (jak opisano wyżej: oBN255 i oBN479.

PL 218 318 B1 oBN499 i oBN500. oBN194 i oBN476, oBN54 i oBN56. oBN93 i oBN477. oBN477 i oBN452. oBN210 i oBN478. oBN453 i oBN454).

Wyniki analizy PCR rekombinowanego wirusa (klon 20) zawierającego wszystkie cztery geny PrM przedstawiono na Figurze 11. W górnej części żelu uwidoczniono różne wyniki PCR dla rekombinowanego wirusa, w niższej części żelu zamieszczono wyniki tych samych reakcji PCR dla kontrolnych plazmidów (jak wskazano). Ścieżka 1, 10 i 11 zawiera 1 kz i 100pz marker molekularny.

Łączne zastosowanie startera oBN210/oBN478 jest specyficzne dla delecji E i insercji PrM4. Oczekiwany fragment PCR rekombinowanego wirusa i plazmidu pBN40 posiada długość 607 pz (przedstawiono na ścieżce 2).

Łączne zastosowanie startera oBN453/oBN454 jest specyficzne dla delecji E.

Oczekiwany fragment PCR rekombinowanego wirusa posiada długość 2.7 kz, oczekiwany prążek dla dzikiego typu wirusa wynosi 2.3 kz (przedstawiono na ścieżce 3). Możliwe jest również zidentyfikowanie w górnej części żelu prążka specyficznego dla dzikiego typu wirusa. Oznacza to, że preparat rekombinowanego wirusa nie jest jeszcze całkowicie oczyszczony z dzikiego typu wirusa. Konieczne jest w tym wypadku dalsze oczyszczanie na płytkach metodą „łysinek”.

Łączne zastosowanie startera oBN93/oBN477 jest specyficzne dla delecji A i insercji PrM2. Oczekiwany fragment PCR rekombinowanego wirusa i plazmidu pBN39 posiada długość 636 pz (przedstawiono na ścieżce 4).

Łączne zastosowanie startera oBN477/oBN452 jest specyficzne dla delecji A. Oczekiwany fragment PCR rekombinowanego wirusa posiada długość 4.1 kz, oczekiwany prążek dla dzikiego typu wirusa wynosi 2.7 kz (przedstawiono na ścieżce 5). Możliwe jest również zidentyfikowanie w górnej części żelu prążka specyficznego dla dzikiego typu wirusa.

Łączne zastosowanie startera oBN255/oBN479 jest specyficzne dla międzygenowego obszaru I4L i insercji PrM3. Oczekiwany fragment PCR rekombinowanego wirusa i plazmidu pBN50 posiada długość 825 pz (przedstawiono na ścieżce 6).

Łączne zastosowanie startera oBN499/oBN500 jest specyficzne dla międzygenowego obszaru I4L. Oczekiwany fragment PCR rekombinowanego wirusa posiada długość 1.0 kz, oczekiwany prążek dla dzikiego typu wirusa wynosi 0.3 kz (przedstawiono na ścieżce 7).

Łączne zastosowanie startera oBN194/oBN476 jest specyficzne dla delecji 2 i insercji PrM1. Oczekiwany fragment PCR rekombinowanego wirusa i plazmidu pBN49 posiada długość 678 pz (przedstawiono na ścieżce 8).

Łączne zastosowanie startera oBN54/oBN56 jest specyficzne dla delecji 2. Oczekiwany fragment PCR rekombinowanego wirusa posiada długość 1.6 kz, oczekiwany prążek dla dzikiego typu wirusa wynosi 0.9 kz (przedstawiono na ścieżce 9). Możliwe jest również zidentyfikowanie w górnej części żelu prążka specyficznego dla dzikiego typu wirusa.

Alternatywnie, możliwe jest otrzymanie 4 różnych wirusów, jednoczesna infekcja komórek wszystkimi czterema wirusami i selekcja rekombinowanych wirusów.

Realizacja może być polepszona również przez zastosowanie rekombinowanych wektorów zawierających dodatkowe markery selekcyjne lub odpornościowe.

P r z y k ł a d 2

Wektory insercji

Wektor rekombinacji dla międzygenowego obszaru 136-137 (IGR 136-137)

W celu uzyskania insercji egzogennych sekwencji do genomu MVA w tak zwanym obszarze międzygenowym (IGR) 136-137 odpowiadającym pozycji 129.940 genomu, przygotowano wektor plazmidowy zawierający około 600 pz sekwencji flankujących sąsiadujących z miejscem insercji. Do wyizolowania sekwencji flankujących z genomowego DNA z MVA-BN zaprojektowano odpowiednie startery PCR. Startery te obejmują miejsca enzymów restrykcyjnych, wykorzystane do klonowania sekwencji flankujących w wektorze plazmidowym. Pomiędzy takimi sekwencjami flankującymi wprowadzano kasetę genu selekcji, np., genu NPT II (oporności na neomycynę) pod kontrolą transkrypcyjną promotora wirusa ospy (pokswirusa) (P). Ponadto, istnieje miejsce klonowania dla insercji dodatkowych genów lub sekwencji egzogennych, wstawianych do IGR 136-137 (PacI). Jeden tego typu wektor według wynalazku ujawniono na Fig. 12 (pBNX67).

Wektor rekombinacji dla międzygenowego obszaru 07-08 (IGR 07-08)

W celu uzyskania insercji egzogennych sekwencji do genomu MVA w obszarze międzygenowym (IGR) 07-08 odpowiadającym pozycji 12.800 genomu, przygotowano wektor plazmidowy zawierający około 600 pz sekwencji flankujących sąsiadujących z miejscem insercji. Do wyizolowania

PL 218 318 B1 sekwencji flankujących z genomowego DNA z MVA-BN zaprojektowano odpowiednie startery PCR. Startery te obejmują miejsca enzymów restrykcyjnych, wykorzystane do klonowania sekwencji flankujących w wektorze plazmidowym. Pomiędzy takimi sekwencjami flankującymi wprowadzano kasetę genu selekcji, np., genu Ecogpt (guaninofosforybozylotransferaza) pod kontrolą transkrypcyjną promotora wirusa ospy (P). Ponadto, istnieje miejsce klonowania dla insercji dodatkowych genów lub sekwencji egzogennych, wstawianych do IGR 07-08 (Pacl). Jeden tego typu wektor według wynalazku ujawniono na Fig. 13 (pBNX88).

Wektor rekombinacji dla między genowego obszaru 44-45 (IGR 44-45)

W celu uzyskania insercji egzogennych sekwencji do genomu MVA w obszarze międzygenowym (IGR) 44-45 odpowiadającym pozycji 37.330 genomu, przygotowano wektor plazmidowy zawierający około 600 pz sekwencji flankujących sąsiadujących z miejscem insercji. Do wyizolowania sekwencji flankujących z genomowego DNA z MVA-BN zaprojektowano odpowiednie startery PCR. Startery te obejmują miejsca enzymów restrykcyjnych, wykorzystane do klonowania sekwencji flankujących w wektorze plazmidowym. Pomiędzy takimi sekwencjami flankującymi wprowadzano kasetę genu selekcji, np., genu NPT II (oporności na neomycynę) pod kontrolą transkrypcyjną promotora wirusa ospy (P). Ponadto, istnieje miejsce klonowania dla insercji dodatkowych genów lub sekwencji egzogennych, wstawianych do IGR 44-45 (Pad). Jeden tego typu wektor według wynalazku ujawniono na Fig. 14 (pBNX87).

Otrzymywanie rekombinowanych pokswirusów zawierających kilka homologicznych genów zintegrowanych w ich genomie

Wektory insercji

W celu uzyskania insercji trzech genów PrM serotypu 2, 3 i 4 wirusa Dengue w genomie MVA, zastosowano trzy niezależne wektory rekombinacyjne.

Wektory te zawierają - jak opisano szczegółowo wyżej - sekwencje homologiczne z genomem MVA, do ukierunkowywania insercji drogą rekombinacji homologicznej. Ponadto, każdy wektor zawiera kasetę genu selekcji i reporterowego. Sekwencje PrM trzech serotypów wirusa Dengue otrzymano syntetycznie, zgodnie z opisem w Przykładzie 1.

W wyniku uzyskano wektor insercyjny dla IGR136-137, zawierający PrM serotypu 4 wirusa Dengue (Fig. 15 - pBN27). Wektor insercyjny dla IGR 07-08 zawierał PrM serotypu 2 wirusa Dengue (Fig. 16 - pBN34) a wektor insercyjny dla IGR 44-45 zawierał PrM serotypu 3 wirusa Dengue (Fig. 17 pBN47).

Otrzymywanie rekombinowanego MVA drogą rekombinacji homologicznej

Otrzymywanie rekombinowanego MVA drogą rekombinacji homologicznej przebiegało zgodnie z opisem w Przykładzie 1. Miejsca insercji dla PrM4, PrM3 i PrM2 w genomie MVA wskazano na Fig. 18.

Insercja PrM 4 do MVA

W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA-BN zgodnie z opisanym wyżej protokołem i transfekowano dodatkowo wektorem insercji pBN27 zawierającym gen PrM serotypu 4 wirusa Dengue i gen EGFP jako gen reporterowy. Ze względu na to, że transfekowany wektor zawiera gen reporterowy, EGFP, zsyntetyzowane białko jest wykrywalne najpóźniej trzeciego dnia w zainfekowanych rekombinowanym wirusem komórkach. Otrzymane w ten sposób rekombinowane wirusy muszą być oczyszczone jak opisano w Przykładzie 1, metodą „łysinek” oczyszczania na płytkach. Po czterech cyklach oczyszczania na płytkach rekombinowanych wirusów, identyfikowano obecność MVA- PrM4, stosując technikę PCR i parę starterów wybiórczo powielających miejsce insercji IGR136-137 (oBN1008: gataccgatcacgttcta. SEQ ID NO.: 16; oraz oBN1009 ggatatgattatgtagag. SEQID NO.: 17).

Insercja PrM 2 do MVA

Komórki infekowano MVA-PrM4 zgodnie z opisanym wyżej protokołem i transfekowano dodatkowo wektorem insercji pBN34 zawierającym gen PrM serotypu 2 wirusa Dengue i gen BFP jako gen reporterowy. Ze względu na to, że transfekowany wektor zawiera gen reporterowy, BFP, zsyntetyzowane białko jest wykrywalne najpóźniej trzeciego dnia w zainfekowanych rekombinowanym wirusem komórkach. Otrzymane w ten sposób rekombinowane wirusy muszą być oczyszczon e jak opisano w Przykładzie 1, metodą „łysinek” oczyszczania na płytkach. Po sześciu cyklach oczyszczania na płytkach rekombinowanego wirusa MVA-PrM4+PrM2, był on pasażowany i amplifikowany, po czym otrzymywano wyjściowy roztwór wirusa. Rekombinowany wirus identyfikowano stosując technikę PCR i parę starterów wybiórczo powielających miejsce insercji IGR07- 08 (oBN 903; ctggataaatacgaggacgtg. SEQ ID NO.: 18; oraz oBN 904: gacaattatccgacgcaccg; SEQID NO.: 19).

PL 218 318 B1

Insercja PrM 3 do MVA

Komórki infekowano MVA-PrM2+4 zgodnie z opisanym wyżej protokołem i transfekowano dodatkowo wektorem insercji pBN47 zawierającym gen PrM serotypu 3 wirusa Dengue i gen EGFP jako gen reporterowy. Ze względu na to, że transferowany wektor zawiera gen reporterowy, EGFP, zsyntetyzowane białko jest wykrywalne najpóźniej trzeciego dnia w zainfekowanych rekombinowanym wirusem komórkach. Otrzymane w ten sposób rekombinowane wirusy muszą być oczyszczone jak opisano w Przykładzie 1, metodą „łysinek” oczyszczania na płytkach, Po trzech cyklach oczyszczania na płytkach rekombinowanych wirusów, identyfikowano obecność MVA-PrM4+3+2, stosując technikę PCR i parę starterów wybiórczo powielających miejsce insercji IGR44- 45 (oBN904: cgttagacaacacaccgacgatgg. SEQ ID NO.: 20; oraz oBN905 cggatgaaaaatttttggaag. SEQ ED NO.: 21).

Wyniki analizy PCR rekombinowanego wirusa zawierającego trzy geny PrM wirusa Dengue przedstawiono na Fig. 19. Eksperymenty PCR zostały przedstawione i opisane w Przykładzie 1. Zastosowanie razem startera oBN1008 i oBN1009 jest specyficzne dla IGR 136-137, który zawiera insercję PrM4 (Fig. 19, umieszczone na dole strony zdjęcie żelu). Oczekiwany fragment PCR rekombinowanego wirusa posiada długość 1kz (przedstawiono na ścieżce 4, 5 i 6) w przypadku kontroli pozytywnej plazmidowej (ścieżka 8). Dla pustego wektora kontrolnego, pozbawionego PrM 4, oczekiwany fragment jest długości 190 pz (ścieżka 2). Na ścieżce M zobrazowano molekularny marker wagowy, natomiast ścieżki 1, 3 i 7 pozostały puste. Łączne zastosowanie starterów oBN902 i oBN903 jest specyficzne dla IGR07-08, zawierającego insercję PrM2 (Fig. 19, górny obraz żelu). Oczekiwany fragment PCR rekombinowanego wirusa posiada długość 960 pz (przedstawiono na ścieżce 4-6), przy pozytywnej kontroli plazmidowej (ścieżka 8). Dla pustego wektora kontrolnego, pozbawionego PrM 2, oczekiwany fragment jest długości 190 pz (ścieżka 2). Kombinacja startera oBN904 i oBN905 jest specyficzna dla IGR44-45, zawierającego insercję PrM3 (Fig. 19, zdjęcie środkowe). Oczekiwany fragment PCR rekombinowanego wirusa posiada długość 932pz (przedstawiono na ścieżce 4-6) w przypadku kontroli pozytywnej plazmidu (ścieżka 8). Dla pustego wektora kontrolnego, pozbawionego PrM 2, oczekiwany fragment jest długości 185 pz (ścieżka 2).

Claims (25)

1. Rekombinowany wirus krowianki Ankara (MVA), znamienny tym, że zawiera przynajmniej dwie sekwencje homologiczne lub geny o identyczności co najmniej 50%, przy czym każda ze wspomnianych sekwencji homologicznych lub genów jest trwale wstawiona w różnym miejscu insercji genomu wirusowego.

2. Rekombinowany wirus MVA, znamienny tym, że zawiera przynajmniej dwie sekwencje homologiczne lub geny, przy czym wykazują one identyczność na poziomie przynajmniej 60%.

3. Rekombinowany wirus MVA według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że sekwencje homologiczne lub geny wykazują identyczność na poziomie 65-75%.

4. Rekombinowany wirus MVA według jednego z zastrz. od 1 do 3, znamienny tym, że sekwencje zawierają homologiczne geny.

5. Rekombinowany wirus MVA według jednego z zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że geny homologiczne pochodzą z flaviwirusa.

6. Rekombinowany wirus MVA według zastrz. 5, znamienny tym, że flaviwirus jest wirusem Dengue.

7. Rekombinowany wirus MVA według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że geny są przynajmniej dwoma homologicznymi genami pochodzącymi z przynajmniej dwóch różnych serotypów wirusa.

8. Rekombinowany wirus MVA według jednego z zastrz. od 5 do 7, znamienny tym, że geny są przynajmniej dwoma genami PrM.

9. Rekombinowany wirus MVA według jednego z zastrz. od 5 do 8, znamienny tym, że geny są genami 4 PrM.

10. Rekombinowany wirus MVA według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że geny homologiczne znajdują się pod kontrolą transkrypcyjną wczesnego/późnego promotora krowianki p7.5.

11. Rekombinowany wirus MVA według jednego z zastrz. od 1 do 10, znamienny tym, że MVA jest MVA-BN zdeponowanym w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Komórkowych (ECACC) pod numerem V00083008.

PL 218 318 B1

12. Rekombinowany wirus MVA według jednego z zastrz. od 1 do 11, znamienny tym, że wirus MVA przejawia ograniczoną replikację lub jest replikacyjnie inkompetentny w komórkach ssaczych, w tym w komórkach ludzkich.

13. Rekombinowany wirus MVA według jednego z zastrz. od 1 do 12, znamienny tym, że sekwencje wstawione są w naturalnie występujących miejscach delecji i/albo w obszarze międzygenowym genomu wirusa.

14. Rekombinowany wirus MVA według jednego z zastrz. od 1 do 13, znamienny tym, że służy jako lek lub szczepionka.

15. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera rekombinowanego wirusa MVA według jednego z zastrz. od 1 do 13.

16. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera rekombinowanego wirusa MVA określonego w jednym z zastrz. od 1 do 13 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik, adiuwant i/lub substancję dodatkową.

17. Rekombinowany wirus MVA według jednego z zastrz. od 1 do 13, szczepionka według zastrz. 15 albo kompozycja według zastrz. 16, do stosowania w oddziaływaniu na odpowiedź immunologiczną w żywych zwierzętach oraz ludziach.

18. Zastosowanie rekombinowanego wirusa MVA według jednego z zastrz. od 1 do 13 do wytwarzania leku.

19. Zastosowanie według zastrz. 18 do otrzymywania preparatu do oddziaływania na odpowiedź immunologiczną w żywych zwierzętach oraz ludziach

20. Komórka in vitro lub ex vivo zawierająca rekombinowanego wirusa MVA według jednego z zastrz. od 1 do 13.

21. Sposób in vitro lub ex vivo otrzymywania rekombinowanego wirusa MVA określonego w jednym z zastrz. od 1 do 13, znamienny tym, że obejmuje etapy

- infekcji komórki wirusem MVA;

- transfekcji zainfekowanej komórki pierwszym wektorem zawierającym sekwencję przeznaczoną do prowadzenia do gen genomu wirusa MVA oraz genomową sekwencję wirusa MVA, zdolną do ukierunkowania integracji sekwencji przeznaczonej do insercji w miejscu insercji genomu wirusa MVA;

- identyfikacji, izolacji i ewentualnie oczyszczania otrzymanego rekombinowanego wirusa ospy;

- powtórzenia powyższych etapów przy użyciu rekombinowanego wirusa MVA uzyskanego w poprzednich etapach do infekcji komórki i dodatkowego wektora zawierającego dodatkową sekwencję przeznaczoną do wprowadzenia do genomu wirusa MVA, przy czym wspomniana sekwencja jest homologiczna z sekwencją z pierwszego wektora.

22. Zestaw do uzyskiwania rekombinowanego wirusa MVA określonego w jednym z zastrz. od 1 do 13, znamienny tym, że zawiera

- dwa lub więcej wektory, każdy z nich zawierający sekwencję, przy czym sekwencje zawarte w różnych wektorach są sekwencjami o identyczności przynajmniej 50%, a każda sekwencja jest flankowana przez sekwencję DNA wirusa MVA, zdolną do ukierunkowania integracji genu w genomie wirusa MVA, oraz

- środki do identyfikacji oraz/albo selekcji rekombinowanych wirusów ospy, posiadających wbudowane w ich genomie wspomniane sekwencje homologiczne.

23. Sekwencja DNA zawierająca genom rekombinowanego wirusa MVA określonego w jednym z zastrz. od 1 do 13, znamienna tym, że wspomniana sekwencja DNA zawiera (i) przynajmniej dwie sekwencje homologiczne o identyczności przynajmniej 50%, które są wprowadzone w różnych miejscach insercji i (ii) przynajmniej część sekwencji genomu wirusa MVA, przy czym wspomniana część sekwencji z genomu wirusa MVA flankuje wspomniane sekwencje homologiczne.

24. Sposób in vitro lub ex vivo wykrywania komórek zainfekowanych rekombinowanym wirusem MVA określonym w jednym z zastrz. od 1 do 13, znamienny tym, że obejmuje podawanie do wspomnianych komórek sekwencji DNA według zastrz. 23 i wykrywanie wspomnianych komórek zainfekowanych rekombinowanym wirusem MVA.

25. Sposób in vitro lub ex vivo identyfikacji rekombinowanego wirusa MVA według jednego z zastrz. od 1 do 13, znamienny tym, że obejmuje podawanie do wspomnianego wirusa sekwencji DNA według zastrz. 23 i identyfikowanie rekombinowanego wirusa MVA.