BRPI0311178B1 - regiões intergênicas como sítios de inserção no genoma do vírus vacínia ancara modificado (mva) - Google Patents

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Abstract

REGIÕES INTERGÊNICAS COMO SÍTIOS DE INSERÇÃO NO GENOMA DO VÍRUS VACÍNIA ANCARA MODIFICADO (MVA). A presente invenção refere-se a novos sítios de inserção úteis para a integração de seqüências exógenas no genoma do vírus Vacínia Ancara Modificado (MVA). A presente invenção fornece ainda vetores plasmideais para inserir o DNA exógeno no genoma do MVA. Além disso, a presente invenção fornece MVA recombinante que compreende uma seqüência exógena de DNA inserida no novo dito sítio de inserção como medicina ou vacina.

Description

A presente invenção refere-se a novos sítios de inserção úteis para a integração de seqüências de DNA exógenas no genoma do MVA.
Antecedentes da Invenção
O Vírus Vacínia Ancara Modificado (MVA) é um membro da fa- mília dos Ortopoxvírus e foi gerado através de aproximadamente 570 passa- gens em série em fibroblastos de embrião de galinha da cepa Ancara do Vírus Vacínia (CVA) (para revisão, ver Mayr, A. e outros [1975], Infection 3, 6-14). Como uma conseqüência destas passagens o vírus MVA resultante contém 31 quilobases menos de informação genômica comparado com o CVA e é altamente restrito em relação às células hospedeiras (Meyer, H. e outros, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 [1991]). O MVA é caracterizado por sua atenua- ção extrema, a saber, através de uma virulência ou uma capacidade de in- fecção menor, mas ainda por uma imunogenicidade excelente. Quando tes- tado em uma variedade de modelos animais, o MVA provou ser avirulento mesmo em indivíduos imunossuprimidos. De forma mais importante, as ex- celentes propriedades da cepa do MVA foram demonstradas em testes clínicos extensos (Mayr e outros, Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987]). Durante estes estudos em mais de 120.000 seres humanos, incluindo paci- entes de alto risco, não foram observados quaisquer efeitos colaterais (Stickl e outros, Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]).
Foi adicionalmente descoberto que o MVA é bloqueado no está- gio tardio do ciclo de replicação do vírus em células de mamíferos (Sutter, G. e Moss., B. [1992] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 10847-10851). Conse- qüentemente, o MVA replica completamente o seu DNA, sintetiza os produ- tos gênicos iniciais, intermediários e tardios, mas não é capaz de montar virions maduros infecciosos, que poderiam ser liberados de uma célula in- fectada. Por esta razão, a saber, por ter a replicação restrita, foi proposto que o MVA servisse como um vetor de expressão gênica.
Mais recentemente, o MVA foi utilizado para gerar vacinas recom- binantes, expressando sequências antigênicas inseridas no sítio do gene da timidina quinase (tk) (Patente U.S. N2 5.185.146) ou no sítio de uma deleção ocorrida de forma natural dentro do genoma do MVA (PCT/EP96/02926).
Embora o lócus de inserção do tk seja amplamente utilizado para gerar poxvirus recombinantes, particularmente para gerar vírus Vacínia recombinantes (Mackett e outros [1982] P.N.A.S. USA 79, 7415-7419) esta tecnologia não era aplicável para o MVA. Foi mostrado por Scheiflinger e outros, que o MVA é muito mais sensível às modificações do genoma quan- do comparado a outros poxvirus, que podem ser utilizados para gerar poxvi- rus recombinantes. Scheiflinger e outros mostraram em particular, que um dos sítios mais comumente utilizados para a integração do DNA heterólogo nos genomas poxvirais, a saber, o lócus do gene da timidina quinase (tk), não pode ser utilizado para gerar MVA recombinante. Qualquer MVA recom- binante tk(-) resultante provou ser altamente instável e após a purificação deletava imediatamente o DNA inserido junto com partes do DNA genômico do MVA (Scheiflinger e outros [1996], Arch Virol 141: pp 663-669).
A instabilidade e, assim, uma maior probabilidade de recombina- ção genômica é um problema conhecido dentro da virologia do pox. Na rea- lidade, o MVA foi estabelecido durante passagens a longo prazo explorando o fato de que o genoma viral do CVA é instável quando propagado in vitro nas células cultivadas em tecidos. Vários milhares de nucleotídeos (31 kb) foram deletados do genoma do MVA, que, portanto, é caracterizado pelas 6 deleções principais e várias pequenas em comparação ao genoma original do CVA.
A organização genômica do genoma do MVA foi descrita recen- temente (Antoine e outros [1998], Virology 244, 365-396). O genoma de 178 kb do MVA é densamente empacotado e compreende 193 quadros abertos de leitura individuais (ORFs), que codificam proteínas de pelo menos 63 amino- ácidos de comprimento. Em comparação com o vírus Varíola altamente in- feccioso e também o protótipo do vírus Vacínia, a saber, a cepa Copenha- gen, a maior parte dos ORFs do MVA está fragmentada ou truncada (Antoi- ne e outros [1998], Virology 244, 365-396). Entretanto, com muito poucas exceções, todos os ORFs, incluindo os ORFs fragmentados e truncados, são transcritos e traduzidos em proteínas. A seguir, é utilizada a nomenclatura de Antoine e outros e - quando apropriado - é também indicada a nomen- clatura baseada na digestão com a enzima de restrição Hind III. Até agora, somente a inserção do DNA exógeno nos sítios de deleção que ocorrem naturalmente do genoma do MVA levam a MVAs re- combinantes estáveis (PCT/EP96/02926). Infelizmente, há apenas um nú- mero restrito de sítios de deleção que ocorrem naturalmente no genoma do MVA. Adicionalmente foi mostrado que outros sítios de inserção, tal como, por exemplo, o lócus do gene tk, são dificilmente úteis para a produção do MVA recombinante (Scheiflinger e outros [1996], Arch Virol 141: pp 663-669).
Objetivo da Invenção
É um objetivo da presente invenção identificar sítios de inserção adicionais do genoma do MVA e fornecer vetores de inserção, que direcio- nam a inserção de seqüências exógenas de DNA nos ditos sítios de inser- ção recém-identificados do genoma do MVA.
É um objetivo adicional da presente invenção fornecer um MVA recombinante, que compreende seqüências exógenas de DNA integradas de forma estável em novos sítios de inserção do genoma do MVA.
Descrição Detalhada da Invenção
Os inventores da presente invenção identificaram novos sítios para a inserção de seqüências exógenas de DNA no genoma do Vírus Vací- nia Ancara Modificado (MVA). Os novos sítios de inserção ficam localizados nas regiões transgênicas (IGRs) do genoma virai, em que as ditas IGRs es- tão, por sua vez, localizadas entre ou flanqueadas por dois quadros abertos de leitura (ORFs) adjacentes do genoma do MVA.
Conseqüentemente, a presente invenção se refere a um MVA recombinante que compreende uma seqüência heteróloga de DNA inserida em uma IGR do genoma viral. De acordo com a presente invenção, uma ou mais seqüências exógenas de DNA podem ser inseridas em uma ou mais IGRs.
Foi descoberto de forma surpreendente que as seqüências de DNA exógenas permanecem na verdade inseridas de forma estáveis nas IGRs do genoma do MVA: como já indicado anteriormente, o genoma do MVA deve ser considerado como sendo bastante instável. Parece que os genes ou as seqüências de DNA não-essenciais para a propagação do vírus são deletados ou fragmentados. Embora tenha sido descoberto - também de forma surpreendente - que os MVAs recombinantes estáveis são obtidos quando as seqüências de DNA heterólogas são inseridas nos sítios de dele- ção que ocorrem naturalmente do genoma do MVA (PCT/EP96/02926) foi - por outro lado - descoberto que os genes da faixa de hospedeiros como, por exemplo, o lócus tk amplamente utilizado para gerar outros poxvirus não são sítios de inserção adequados no MVA. O fato de que Vero-MVA tenha uma deleção genômica extra (PCT/EP01/02703) sugere ainda que o genoma é dinâmico no sentido de que deleta facilmente genes que não são necessári- os para a propagação. Portanto, deveria ser concluído que seria esperado que as seqüências heterólogas de DNA não-essenciais para a propagação virai nos espaços entre os ORFs também fossem deletadas pelo vírus.
Embora a seqüência de nucleotídeos de um ORF codifique uma seqüência de aminoácidos que forma um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína, as IGRs entre dois ORFs não possuem capacidade codificadora, mas podem compreender elementos reguladores, sítios de ligação, seqüên- cias promotoras e/ou intensificadoras essenciais para ou envolvidas no con- trole da transcrição da expressão dos genes virais. Assim, a IGR pode estar envolvida no controle regulador do ciclo de vida virai. Entretanto, os invento- res da presente invenção também mostraram que os novos sítios de inser- ção possuem a vantagem inesperada de que as seqüências exógenas de DNA podem ser inseridas de forma estável no genoma do MVA sem influen- ciar ou alterar as características típicas e a expressão gênica do MVA. Os novos sítios de inserção são especialmente úteis, uma vez que nenhum ORF ou seqüência codificadora do MVA é alterada.
Além disso, foi descoberto de forma surpreendente que o nível de expressão de um gene estranho inserido em uma IGR é maior que o nível de expressão de um gene estranho inserido dentro de um sítio de deleção do genoma do MVA (ver também o Exemplo 1). A seqüência de nucleotideo de um ORF começa regularmente com um códon de início e termina com um códon de término. Dependendo da orientação dos dois ORFs adjacentes, a IGR, a região entre estes ORFs, é flanqueada por dois códons de término dos dois ORFs adjacentes ou pelo códon de término do primeiro ORF e o códon de início do segundo ORF ou pelo códon de início do primeiro ORF e o códon de término do segundo ORF.
Conseqüentemente, o sítio de inserção para a seqüência exóge- na de DNA na IGR pode estar a jusante ou a 3’ do códon de término de um primeiro ORF. No caso do ORF adjacente, também denominado segundo ORF, ter a mesma orientação que o primeiro ORF, este sítio de inserção a jusante do códon de término do primeiro ORF fica a montante ou a 5’ do có- don de início do segundo ORF.
No caso do segundo ORF ter uma orientação oposta em relação ao primeiro ORF, que significa a orientação dos dois ORFs adjacentes aponta uma para a outra, então o sítio de inserção fica a jusante dos códons de término de ambos os ORFs.
Como uma terceira alternativa, no caso de dois ORFs adjacen- tes lidos na direção oposta, mas a orientação dos dois ORFs adjacentes apontam para lados opostos, que é o mesmo que um posicionamento que é caracterizado pelo fato de que os códons de início dos dois ORFs estão adja- centes um ao outro, então o DNA exógeno é inserido a montante em relação a ambos os códons de início.
Os ORFs no genoma do MVA ocorrem em duas direções codifi- cadoras diferentes. Conseqüentemente, a atividade da Polimerase ocorre da esquerda para a direita, isto é, na direção para frente e, correspondente- mente, da direita para a esquerda (direção inversa). É uma prática comum na virologia dos poxs e se tomou uma classificação padronizada para os vírus Vaccinias identificar os ORFs por sua orientação e sua posição nos diferentes fragmentos da digestão de restrição com HindWl do genoma. Para a nomenclatura, os fragmentos diferentes de Hind\\\ são nomeados por letras maiúsculas decrescentes que correspondem ao seu tamanho decrescente. Os ORFs são numerados da esquerda para a direita em cada fragmento de Hind\\\ e a orientação do ORF é indicada por um L maiúsculo (que significa a transcrição da direita para a esquerda) ou R (que significa a transcrição da esquerda para a direita). Adicionalmente, há uma publicação mais recente da estrutura do genoma do MVA, que utiliza uma nomenclatura diferente, simplesmente numerando o ORF partindo da extremidade esquerda até a direita do genoma e indicando sua orientação com um L ou um R maiúsculo (Antoine e outros [1998], Virology 244, 365-396). Como um exemplo, o ORF I4L, de acordo com a nomenclatura antiga, corresponde ao ORF 064L de acordo com Antoine e outros. Se não for indicado de outra forma, a presente invenção utiliza a nomenclatura de acordo com Antoine e outros. De acordo com a presente invenção, as seqüências heterólogas de DNA podem ser inseridas em uma ou mais IGRs entre dois ORFs adja- centes selecionados do grupo que compreende: 001L-002L, 002L-003L, 005R-006R, 006L-007R, 007R-008L, 008L-009L, 017L-018L, 018L-019L, 019L-020L, 020L-021L, 023L-024L, 024L-025L, 025L-026L, 028R-029L, 030L-031L, 031L-032L, 032L-033L, 035L-036L, 036L-037L, 037L-038L, 039L-040L, 043L-044L, 044L-045L, 046L-047L, 049L-050L, 050L-051L, 051L-052R, 052R-053R, 053R-054R, 054R-055R, 055R-056L, 061L-062L, 064L-065L, 065L-066L, 066L-067L, 077L-078R, 078R-079R, 080R-081R, 081R-082R, 081R-082L, 082L-083R, 085R-086R, 086R-087R, 088R-089L, 089L-090R, 092R-093L, 094L-095R, 096R-097R, 097R-098R, 101R-102R, 103R-104R, 105L-106R, 107R-108L, 108L-109L, 109L-110L, 110L-111L, 113L-114L, 114L-115L, 115L-116R, 117L-118L, 118L-119R, 122R-123L, 123L-124L, 124L-125L, 125L-126L, 133R-134R, 134R-135R, 136L-137L, 137L-138L, 141L-142R, 143L-144R, 144R-145R, 145R-146R, 146R-147R, 147R-148R, 148R-149L, 152R-153L, 153L-154R, 154R-155R, 156R-157L, 157L-158R, 159R-160L, 160L-161R, 162R-163R, 163R-164R, 164R-165R, 165R-166R, 166R-167R, 167R-168R, 170R-171R, 173R-174R, 175R-176R, 176R-177R, 178R-179R, 179R-180R, 180R-181R, 183R-184R, 184R-185L, 185L-186R, 186R-187R, 187R-188R, 188R-189R, 189R-190R, 192R-193R.
De acordo com a nomenclatura antiga, o ORF 006L corresponde ao C10L, 019L corresponde ao C6L, 020L ao N1L, 021L ao N2L, 023L ao K2L, 028R ao K7R, 029L ao F1L, 037L ao F8L, 045L ao F15L, 050L ao E3L, 052R ao E5R, 054R ao E7R, 055R ao E8R, 056L ao E9L, 062L ao 11L, 064L ao I4L, 065L ao I5L, 081R ao L2R, 082L ao L3L, 086R ao J2R, 088R ao J4R, 089L ao J5L, 092R ao H2R, 095R ao H5R, 107R ao D10R, 108L ao D11L, 122R ao A11R, 123L ao A12L, 125L ao A14L, 126L ao A15L, 135R ao A24R, 136L ao A25L, 137L ao A26L, 141L ao A30L, 148R ao A37R, 149L ao A38L, 152R ao A40R, 153L ao A41L, 154R ao A42R, 157L ao A44L, 159R ao A46R, 160L ao A47L, 165R ao A56R, 166R ao A57R, 167R ao B1R, 170R ao B3R, 176R ao B8R, 180R ao B12R, 184R ao B16R, 185L ao B17L, e 187R aoB19R.
Preferencialmente, a seqüência heteróloga é inserida em uma IGR flanqueada pelos dois ORFs adjacentes selecionados do grupo que compreende 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
As seqüências heterólogas ou exógenas de DNA são seqüên- cias que, na natureza, não são normalmente encontradas associadas com os poxvirus que são utilizados de acordo com a presente invenção. De acor- do com uma modalidade adicional da presente invenção, a seqüência exó- gena de DNA compreende pelo menos uma seqüência codificadora. A se- qüência codificadora está ligada de forma operacional a um elemento de controle da transcrição, preferencial mente a um elemento de controle da transcrição de poxvirus. Adicionalmente, podem ser também utilizadas com- binações entre o elemento de controle da transcrição e, por exemplo, os sí- tios de entrada de ribossomos.
De acordo com uma modalidade adicional, a seqüência exógena de DNA também pode compreender duas ou mais seqüências codificadoras ligadas a um ou vários elementos de controle da transcrição. Preferencial- mente, a seqüência codificadora codifica uma ou mais proteínas, polipeptí- deos, peptídeos, antígenos estranhos ou epitopos antigênicos, especial- mente os de genes de interesse terapêutico.
Os genes de interesse terapêutico de acordo com a presente invenção podem ser genes derivados de ou homólogos a genes de microor- ganismos patogênicos ou infecciosos que são causadores de doença. Con- seqüentemente, no contexto da presente invenção, tais genes de interesse terapêutico são apresentados ao sistema imunológico de um organismo com a finalidade de efetuar, preferencialmente induzir uma resposta imunológica específica e, desta maneira, vacinar ou proteger de forma profilática o orga- nismo contra uma infecção pelo microorganismo. Em modalidades adicionais preferidas da presente invenção, os genes de interesse terapêutico são se- lecionados dos genes de vírus infecciosos, por exemplo, - mas não-limitados - ao vírus da Dengue, ao vírus da encefalite Japonesa, ao vírus da Hepatite B ou C ou a vírus de imunodeficiência tal como o HIV.
Os genes derivados do vírus da Dengue são preferencialmente os genes NS1 e PrM, em que os ditos genes podem ser derivados de um, dois, três ou de todos os 4 sorotipos do vírus da Dengue. O gene NS1 é preferencialmente derivado do sorotipo 2 do vírus da Dengue e é preferenci- almente inserido na IGR entre os ORFs 064L-065L (I4L-I5L). Os genes PrM, derivados preferencialmente de todos os 4 sorotipos do vírus da Dengue, são preferencialmente inseridos nas IGRs entre os ORFs selecionados de 007L-008L, 044L-045L, 136L-137L, 148R-149L. Mais preferencialmente, o gene PrM derivado do sorotipo 1 do vírus da Dengue (prM 1) é inserido na IGR do 148R-149L, o PrM 2 na IGR 007R-008L, o PrM 3 na IGR dos ORFs 044L-045L e o PrM 4 na IGR 136L-137L.
De acordo com uma modalidade preferida adicional da presente invenção, a seqüência heteróloga de DNA é derivada do HIV e codifica o env do HIV, em que o gene env do HIV é preferencialmente inserido na IGR en- tre os ORFs 007R-008L.
Além disso, os genes de interesse terapêutico de acordo com a presente invenção compreendem ainda genes relacionados a doenças, que possuem um efeito terapêutico sobre um distúrbio proliferativo, câncer ou doenças metabólicas. Por exemplo, um gene de interesse terapêutico em relação ao câncer poderia ser um antígeno de câncer que possui a capaci- dade de induzir uma resposta imunológica anticâncer específica. De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção, a seqüência codificadora compreende pelo menos um gene marcador ou de seleção.
Os genes de seleção fazem a transdução de uma resistência particular em uma célula, através da qual é possível um certo método de seleção. O versado na arte está familiarizado com uma variedade de genes de seleção, que podem ser utilizados em um sistema poxviral. Dentre estes estão, por exemplo, o gene de resistência à Neomicina (NPT) ou o gene da Fosforribosil transferase (gpt).
Os genes marcadores induzem uma reação colorida nas células transduzidas, que pode ser utilizada para identificar células tranduzidas. O versado na arte está familiarizado com uma variedade de genes marcado- res, que podem ser utilizados em um sistema poxviral. Dentre eles está o gene que codifica, por exemplo, a β-Galactosidase (β-gal), a β-Glucosidase (β-glu), a proteína de Fluorescência Verde (EGFP) ou a Proteína de Fluores- cência Azul.
Ainda de acordo com uma modalidade adicional da presente in- venção a seqüência exógena de DNA compreende uma seqüência espaça- dora, que separa o elemento de transcrição e/ou a seqüência codificadora do poxvirus nas seqüências exógenas de DNA partindo do códon de término e/ou do códon de início dos ORFs adjacentes. Esta seqüência espaçadora entre os códons de término/início do ORF adjacente e a seqüência codifica- dora inserida no DNA exógeno possui a vantagem de estabilizar o DNA exó- geno inserido e, assim, qualquer vírus recombinante resultante. O tamanho da seqüência espaçadora varia de acordo com a ausência da própria codifi- cação ou função regulatória.
De acordo com uma modalidade adicional, a seqüência espaça- dora que separa o elemento de controle da transcrição e/ou a seqüência co- dificadora de poxírus na seqüência exógena de DNA partindo do códon de término do ORF adjacente possui pelo menos um nucleotídeo de compri- mento.
De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, a seqüência espaçadora que separa o elemento de controle da transcrição e/ou a região codificadora do poxvirus na seqüência exógena de DNA par- tindo do códon de início do ORF adjacente possui pelo menos 30 nucleotí- deos. Particularmente, nos casos em que um elemento promotor típico do vírus Vacínia é identificado a montante de um códon de início, a inserção do DNA exógeno não pode separar o elemento promotor do códon de início do ORF adjacente. Um elemento promotor típico de Vacínia pode ser identifica- do através da varredura, por exemplo, da seqüência "TAAAT" para os pro- motores tardios (Davison &Moss, J. Mol. Biol. 1989; 210; 771-784) e urn domínio rico em A/T para os promotores iniciais. Uma seqüência espaçadora de aproximadamente 30 nucleotídeos é a distância preferida para assegurar que um promotor de poxvirus localizado a montante do códon de início do ORF não é influenciado. Adicionalmente, de acordo com uma modalidade adicionalmente preferida, a distância entre o DNA exógeno inserido e o có- don de início do ORF adjacente é de aproximadamente 50 nucleotídeos e mais preferencialmente aproximadamente 100 nucleotídeos. De acordo com uma modalidade preferida adicional da presente invenção, a seqüência espaçadora compreende um elemento de controle da transcrição de poxvirus adicional que é capaz de controlar a transcrição do ORF adjacente.
Uma cepa de MVA típica que pode ser utilizada de acordo com a presente invenção para gerar um MVA recombinante é a MVA-575 que foi depositada na European Collection of Animal Cell Cultures sob o número de depósito ECACC V00120707.
Uma outra cepa de MVA preferida é a MVA-Vero ou um derivado da mesma. As cepas de MVA-Vero foram depositadas na European Collecti- on of Animal Cell Cultures sob os números de depósito ECACC V99101431 e 01021411. A segurança da MVA-Vero é refletida pelas características bio- lógicas, químicas e físicas que são descritas no Pedido de Patente Interna- cional PCT/EP01/02703. Em comparação com outras cepas de MVA, a Vero-MVA inclui uma deleção genômica adicional.
Ainda uma outra cepa de MVA mais preferida é a MVA-BN. A MVA-BN foi depositada na European Collection of Animal Cell Cultures sob o número de depósito ECACC V00083008. O vírus MVA-BN é urn virus extre- mamente atenuado também derivado do vírus Vacínia Ancara Modificado (ver também PCT/EP01/13628).
O termo "derivados" de um vírus de acordo com a presente in- venção se refere aos vírus da progénie que exibem os mesmos aspectos característicos que o vírus parental, mas exibindo diferenças em uma ou mais partes de seu genoma. O termo "derivado do MVA" descreve um vírus, que possui as mesmas características funcionais comparadas às do MVA. Por exemplo, um derivado da MVA-BN possui os aspectos característicos da MVA-BN. Uma destas características da MVA-BN ou derivados da mesma é sua atenuação e falta de replicação nas células HaCat humanas.
O MVA recombinante de acordo com a presente invenção é útil como um medicamento ou uma vacina. É, de acordo com uma modalidade adicional, utilizado para a introdução da seqüência codificadora exógena em uma célula alvo, a dita seqüência sendo homóloga ou heteróloga ao genoma da célula alvo.
A introdução de uma seqüência codificadora exógena em uma célula alvo pode ser feita in vitropara produzir proteínas, polipeptídeos, peptídeos, antígenos ou epitopos antigênicos. Este método compreende a infecção de uma célula hospedeira com o MVA recombinante de acordo com a invenção, o cultivo da célula hospedeira infectada sob condições adequa- das e o isolamento e/ou o enriquecimento do polipeptídeo, do peptídeo, da proteína, do antígeno, do epitopo e/ou do vírus produzido pela dita célula hospedeira.
Além disso, o método para a introdução de uma ou mais se- qüências homólogas ou uma ou mais seqüências heterólogas nas células podem ser aplicadas para a terapia in vitroe in vivo. Para a terapia in vitro, as células isoladas que foram previamente (ex vivo)infectadas com o MVA recombinante de acordo com a invenção são administradas ao corpo do animal vivo para efetuar, preferencialmente induzir uma resposta imunológi- ca. Para a terapia in vivo, o poxvirus recombinante de acordo com esta in- venção é administrado diretamente ao corpo do animal vivo para efetuar, preferencialmente induzir uma resposta imunológica. Neste caso, as células que circundam o sítio de inoculação, mas também as células para as quais o vírus é transportado, por exemplo, através da corrente sanguínea, são dire- tamente infectadas in vivo pelo MVA recombinante de acordo com a inven- ção. Após a infecção, estas células sintetizam as proteínas, os peptídeos ou os epitopos antigênicos dos genes terapêuticos, que são codificados pelas seqüências codificadoras exógenas e, subseqüentemente, os apresentam ou partes dos mesmos na superfície celular. Células especializadas do sis- tema imunológico reconhecem a apresentação de tais proteínas, peptídeos ou epitopos heterólogos e ativam uma resposta imunológica específica. Uma vez que o MVA é altamente restrito em relação ao cresci- mento e, assim, altamente atenuado, é útil para o tratamento de uma faixa ampla de mamíferos incluindo seres humanos, incluindo animais ou seres humanos imunocomprometidos. A presente invenção fornece ainda compo- sições farmacêuticas e vacinas para a indução de uma resposta imunológica em um corpo de animal vivo, incluindo um ser humano.
A composição farmacêutica pode incluir de forma geral um ou mais veículos, aditivos, antibióticos, conservantes, adjuvantes, diluentes e/ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis e/ou aprovados. Tais sub- stâncias auxiliares podem ser água, solução salina, glicerol, etanol, agentes umectantes e emulsificantes, substâncias tamponantes do pH ou similares. Os veículos adequados são tipicamente moléculas lentamente metaboliza- das grandes tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agre- gados de lipídeos ou similares.
Para a preparação de vacinas, o poxvirus recombinante de acordo com a invenção é convertido em uma forma fisiologicamente aceitá- vel. Isto pode ser feito com base na experiência na preparação de vacinas de poxvirus utilizadas para a vacinação contra a varíola (que é descrita por Stickl, H. e outros [1974] Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392). Por exemplo, o vírus purificado é armazenado a -80°C com um título de 5x108 TCID50/mL formulado em aproximadamente 10 mM de Tris, 140 mM de NaCI pH 7,4.
Para a preparação das doses de vacina, por exemplo, 102-108partículas do vírus são liofilizadas em 100 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) na presença de 2% de peptona e 1% de albumina de soro humano em uma ampola, preferencialmente uma ampola de vidro. Alternativamente, as doses de vacina podem ser produzidas através da secagem por conge- lamento em etapas do vírus em uma formulação. Esta formulação pode conter aditivos adicionais tais como manitol, dextrano, açúcar, glicina, lactose ou polivinilpirrolidona ou outros auxiliadores tais como antioxidantes ou gás inerte, estabilizantes ou proteínas recombinantes (por exemplo, albumina do soro humano) adequados para a administração in vivo. A ampola de vidro é então selada e pode ser armazenada entre 4°C e a temperatura ambiente durante vários meses. Entretanto, contanto que não haja necessidade, a ampola é armazenada preferencialmente a temperaturas abaixo de -20°C. Para a vacinação ou terapia, o produto liofilizado pode ser dis- solvido em 0,1 até 0,5 mL de uma solução aquosa, preferencialmente solu- ção salina fisiológica ou tampão Tris e administrado de forma sistêmica ou local, isto é, de forma parenteral, subcutânea, intramuscular, através da es- carificação ou qualquer outra via de administração conhecida pelo versado. O modo de administração, a dose e o número de administrações podem ser otimizados pelos versados na arte de uma maneira conhecida. Entretanto, de forma mais comum, um paciente é vacinado com uma segunda dose aproximadamente um mês até seis semanas após a primeira dose de vaci- nação.
A presente invenção se refere ainda a vetores plasmideais que podem ser utilizados para gerar MVA recombinante de acordo com a pre- sente invenção e ainda se refere a certas seqüências de DNA: De forma regular, a IGR localizada entre ou flanqueada pelos dois ORFs adjacentes compreende seqüências de nucleotídeos em que a seqüência exógena de DNA de interesse pode ser inserida. Conseqüente- mente, o vetor plasmideal de acordo com a presente invenção compreende uma seqüência de DNA derivada de ou homóloga ao genoma do MVA, em que a dita seqüência de DNA compreende um fragmento completo ou parcial de uma seqüência de IGR localizada entre ou flanqueada por dois ORFs adjacentes do genoma virai. Preferencialmente, o vetor plasmideal compre- ende inserido na dita seqüência derivada pela IGR pelo menos um sítio de clonagem para a inserção de uma seqüência de DNA exógena de interesse e, preferencialmente, para a inserção de um elemento de controle da trans- crição do poxvirus ligado de forma operacional à dita seqüência heteróloga de DNA. Opcionalmente, o vetor plasmideal compreende um cassete gênico repórter e/ou de seleção. O vetor plasmideal, preferencialmente, compreende ainda seqüências dos dois ORFs adjacentes que flanqueiam o dito fragmento completo ou parcial da seqüência da IGR.
Foram identificados alguns IGRs que não incluem seqüências de nucleotídeos. Nestes casos, o vetor plasmideal compreende seqüências de DNA das seqüências flanqueadoras da IGR, isto é, seqüências de DNA dos dois ORFs adjacentes. Preferencialmente, o sítio de clonagem para a inser- ção da seqüência heteróloga de DNA é inserido na IGR. O DNA das se- qüências que flanqueiam a IGR é utilizado para direcionar a inserção de se- qüências exógenas de DNA na IGR correspondente no genoma do MVA. Tal vetor plasmideal pode incluir adicionalmente um fragmento completo ou par- cial de uma seqüência da IGR que compreende o sítio de clonagem para a inserção da seqüência de DNA heteróloga e, opcionalmente, do cassete gê- nico repórter e/ou de seleção.
As seqüências de DNA da IGR assim como as seqüências que flanqueiam a IGR dos dois ORFs adjacentes são preferencialmente selecio- nadas das IGRs e dos ORFs, respectivamente, selecionados do grupo que compreende 001L-002L, 002L-003L, 005R-006R, 006L-007R, 007R-008L, 008L-009L, 017L-018L, 018L-019L, 019L-020L, 020L-021L, 023L-024L, 024L-025L, 025L-026L, 028R-029L, 030L-031L, 031L-032L, 032L-033L, 035L-036L, 036L-037L, 037L-038L, 039L-040L, 043L-044L, 044L-045L, 046L-047L, 049L-050L, 050L-051L, 051L-052R, 052R-053R, 053R-054R, 054R-055R, 055R-056L, 061L-062L, 064L-065L, 065L-066L, 066L-067L, 077L-078R, 078R-079R, 080R-081R, 081R-082R, 081R-082L, 082L-083R, 085R-086R, 086R-087R, 088R-089L, 089L-090R, 092R-093L, 094L-095R, 096R-097R, 097R-098R, 101R-102R, 103R-104R, 105L-106R, 107R-108L, 108L-109L, 109L-110L, 110L-111L, 113L-114L, 114L-115L, 115L-116R, 117L-118L, 118L-119R, 122R-123L, 123L-124L, 124L-125L, 125L-126L, 133R-134R, 134R-135R, 136L-137L, 137L-138L, 141L-142R, 143L-144R, 144R-145R, 145R-146R, 146R-147R, 147R-148R, 148R-149L, 152R-153L, 153L-154R, 154R-155R, 156R-157L, 157L-158R, 159R-160L, 160L-161R, 162R-163R, 163R-164R, 164R-165R, 165R-166R, 166R-167R, 167R-168R, 170R-171R, 173R-174R, 175R-176R, 176R-177R, 178R-179R, 179R-180R, 180R-181R, 183R-184R, 184R-185L, 185L-186R, 186R-187R, 187R-188R, 188R-189R, 189R-190R, 192R-193R.
As seqüências são, mais preferencialmente, selecionadas das IGRs e dos ORFs, respectivamente, selecionados do grupo que compreende 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148L-149L. As seqüências derivadas das IGRs são, preferencialmente, selecionadas do grupo que compreende a seqüência de nucleotídeos - n9 527-608 da SEQ ID Ns: 32; - n9 299-883 da SEQ ID N9: 33; - n9 339-852 da SEQ ID N9: 34; - n9 376-647 da SEQ ID N9: 35; - n9 597-855 da SEQ ID N9: 36; - n9 400-607 da SEQ ID N9: 37.
As seqüências que flanqueiam a IGR dos dois ORFs adjacentes são, preferencialmente, selecionadas do grupo que consiste nas seqüências de nucleotídeos: - n9 1 -525 e 609-1190 da SEQ ID N2: 32; - n9 101-298 e 884-1198 da SEQ ID N9: 33; - n9 1-338 e 853-1200 da SEQ ID N9: 34; - n9 1-375 e 648-1200 da SEQ ID N9: 35; - na 1-596 e 856-1200 da SEQ ID NQ: 36; - na 1-399 e 608-1081 da SEQ ID Na: 37.
As seqüências de DNA são preferencialmente derivadas do ou homólogas ao genoma do MVA depositado na ECACC sob o número de de- pósito V00083008.
Para gerar um vetor plasmideal de acordo com a presente in- venção, as seqüências são isoladas e clonadas em um vetor de clonagem padrão, tal como o pBluescript (Stratagene), em que flanqueiam o DNA exó- geno que será inserido no genoma do MVA. Opcionalmente, tal vetor plas- mideal compreende um cassete gênico de seleção ou repórter, que pode ser deletado do vírus recombinante final, devido a uma seqüência repetitiva in- cluída no dito cassete.
Os métodos para introduzir seqüências exógenas de DNA atra- vés de um vetor plasmideal em um genoma de MVA e os métodos para a obtenção do MVA recombinante são bem conhecidos pelo versado na arte e, adicionalmente, podem ser deduzidos das referências a seguir: - Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Segunda Edição. Por J. Sambro- ok, E. F. Fritsch e T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989: descreve técnicas e conhecimento para técnicas padrão de biologia mole- cular tais como a clonagem do DNA, o isolamento do RNA, a análise de western blot, as técnicas de amplificação por RT-PCR e PCR; - Virology Methods Manual. Editado por Brian WJ Mahy e Hillar O Kangro. Academic Press, 1996: descreve técnicas para o processamento e para a manipulação de vírus; - Molecular Virology.A Praticai Approach. Editado por AJ Davison e RM Elli- ott. The Praticai Approach Series. IRL Press at Oxford University Press. Oxford 1993. Capítulo 9: Expression of genes by Vacínia virus vectors; - Current Protocols in Molecular Biology. Editor: John Wiley and Son Inc. 1998. Capítulo 16, seção IV: Expression of proteins in mammalian cells using Vacínia viral vector: descreve técnicas e conhecimento para o processa- mento, para a manipulação e para a engenharia genética do MVA. O MVA de acordo com a presente invenção, preferencialmente o MVA depositado na ECACC sob o número de depósito V00083008, pode ser produzido através da transfecção de uma célula com um vetor plasmideal de acordo com a presente invenção, da infecção da célula transfectada com um MVA e, subseqüentemente, da identificação, do isolamento e, opcionalmen- te, da purificação do MVA de acordo com a invenção. As seqüências de DNA de acordo com a invenção podem ser utilizadas para identificar ou isolar o MVA ou seus derivados de acordo com a invenção e células ou indivíduos infectados com um MVA de acordo com a presente invenção. As seqüências de DNA são, por exemplo, utilizadas para gerar iniciadores da PCR, sondas de hibridização ou são utilizadas em tec- nologias de arranjos.
Breve descrição das Figuras
Figura 1: Mapa de restrição das construções de vetores pBNX39 (Figura 1a), pBNX70 (Figura 1b) e pBN84 (Figura 1c), que compreende aproximadamente 600 pb das seqüências do MVA que flanqueiam o sítio de inserção após o ORF I4L. Os plasmídeos compreendem adicionalmente o DNA exógeno (Ecogpt e hBFP, respectivamente) sob o controle transcricio- nal de um promotor de poxvirus P) entre as seqüências flanqueadoras: Flan- co 1 (F1 I4L-I5L) e Flanco 2 (F2 I4L-I5L). F1rpt significa uma seqüência re- petitiva do Flanco 1 para permitir a deleção do cassete repórter de um vírus recombinante resultante. O pBN84 (Figura 1c) adicionalmente codifica a proteína NS1 do vírus da Dengue (NS1 DEN). Abreviações adicionais: AmpR = gene de resistência à Ampicilina; pbs = pares de base. Figura 2: Mapa de restrição das construções de vetores pBNX51 (Figura 2a), pBNX67 (Figura 2b) e pBN27 (Figura 2c), que compreende aproximadamente 600 pb de seqüências do MVA que flanqueiam o sítio de inserção após o ORF 137L (Flanco 1: F1136-137 corresponde à posição 129340 - 129930 do genoma do MVA; Flanco 2: F2136-137 corresponde à posição 129931 - 130540 do genoma do MVA). Adicionalmente, o vetor pBNX67 (Figura 2b) compreende o DNA exógeno (gene NPT II = resistência à neomicina) sob o controle transcricional de um promotor de poxvirus P) entre as seqüências flanqueadoras. F2rpt significa uma seqüência repetitiva do Flanco 2 para permitir a deleção do cassete repórter de um vírus recom- binante resultante. O pBN27 (Figura 2c) codifica adicionalmente o PrM4 do vírus da Dengue sob o controle de um promotor de poxvirus. Abreviações adicionais: AmpR = gene de resistência à Ampicilina; pbs = pares de bases; IRES = sítio interno de entrada de ribossomos; EGFP = gene para a proteína fluorescente verde aumentada. Figura 3: O mapa de restrição das construções de vetores pBNX79 (Figura 3a), pBNX86 (Figura 3b), pBNX88 (Figura 3c), pBN34 (Figu- ra 3d) e pBN56 (Figura 3e), que compreende aproximadamente 600 pbs das seqüências do MVA que flanqueiam o sítio de inserção entre os ORFs 007R e 008L (Flanco 1: F1 IGR 07-08 começa na posição 12200 do genoma do MVA; Flanco 2: F2 IGR 07-08 termina na posição 13400 do genoma do MVA). F2rpt significa uma seqüência repetitiva do Flanco 2 para permitir a deleção do cassete repórter de um vírus recombinante resultante. Adicio- nalmente os vetores pBNX88 (Figura 3c) e pBNX86 (Figura 3b) compreen- dem o DNA exógeno (BFP + gpt e NPT II + EGFP, respectivamente) sob o controle transcricional de um promotor de poxvirus P) entre as seqüências flanqueadoras. F2rpt significa uma seqüência repetitiva do Flanco 2 para permitir a deleção do cassete repórter de um vírus recombinante resultante. O pBN56 (Figura 3e) codifica adicionalmente a proteína env do HIV-1 e o pBN34 (Figura 3d) contém a seqüência codificadora de PrM2 do vírus da Dengue sob o controle de um promotor de poxvirus. Abreviações adicionais: AmpR = gene de resistência à Ampicilina; pbs = pares de bases. Figura 4: Mapa de restrição das construções de vetores pBNX80 (Figura 4a), pBNX87 (Figura 4b) e pBN47 (Figura 4c) que compreendem aproximadamente 600/640 pbs das seqüências do MVA que flanqueiam o sítio de inserção entre os ORFs 044L e 045L (Flanco 1: F1 IGR44-45 come- ça na posição 36730 do genoma do MVA; Flanco 2: F2 IGR44-45 termina na posição 37970 do genoma do MVA). Adicionalmente o vetor pBNX87 (Figura 4b) compreende o DNA exógeno (gene NPT II + EGFP) sob o controle transcricional de um promotor de poxvirus P) entre as seqüências flaqueado- ras. F2rpt significa uma seqüência repetitiva do Flanco 2 para permitir a de- leção do cassete repórter de um vírus recombinante resultante. O pBN47 (Figura 4c) codifica adicionalmente PrM3 do vírus da Dengue sob o controle de um promotor de poxvirus. Abreviações adicionais: AmpR = gene de resistência à Ampicili- na; pbs = pares de bases. Figura 5: Mapa de restrição das construções de vetores pBNX90 (Figura 5a), pBNX92 (Figura 5b) e pBN54 (Figura 5c), que compreende aproximadamente 596/604 pbs das seqüências do MVA que flanqueiam o sitio de inserção entre os ORFs 148R e 149L (Flanco 1: F1 IGR148-149 co- meça na posição 136900 do genoma do MVA; Flanco 2: F2 IGR148-149 termina na posição 138100 do genoma do MVA). Adicionalmente o vetor pBNX92 (Figura 5b) compreende o DNA exógeno (gpt + BFP) sob o controle da transcrição de um promotor de poxvirus P) entre as seqüências flanquea- doras. O pBN54 (Figura 5c) codifica adicionalmente PrM1 do vírus da Den- gue. F2rpt significa uma seqüência repetitiva do Flanco 2 para permitir a de- leção do cassete repórter de um vírus recombinante resultante. Abreviações adicionais: AmpR = gene de resistência à Ampicilina; pbs = pares de bases. Figura 6: Apresentação esquemática dos sítios de inserção in- tergênicos do MVA (Genbank Ac. U94848). Figura 7: Análise de PCR da IGR I4L-I5L no MVA recombinante com o NS1 do vírus da Dengue inserido na IGR I4L-I5L. A faixa "BN" mostra o produto da PCR utilizando o vetor vazio MVA-BN. Utilizando o MVA re- combinante com NS1, pode ser detectado um fragmento de tamanho maior (1, 2, 3, 4: concentrações diferentes de DNA). M = marcador de peso mole- cular, H2O = água para controle negativo. Figura 8: Figura 8a: Análise de PCR da IGR 136-137 no MVA recombinante com o PrM4 do vírus da Dengue inserido na IGR 136-137. A faixa "BN" mostra o produto da PCR utilizando o vetor vazio MVA-BN. Utili- zando o MVA recombinante com PrM4, pode ser detectado um fragmento de tamanho maior (mBN23, 1/10, 1/100: concentrações diferentes do DNA). M = marcador de peso molecular, H2O = água para controle negativo, pBN27 = plasmídeo para controle positivo. Figura 8b: curva de crescimento em várias etapas para o vetor vazio MVA-BN e o MVA recombinante com PrM4 inserido na IGR 136-137 (MVA-mBN23). Figura 9: Figura 9a: Análise de PCR da IGR 07-08 no MVA re- combinante com o PrM2 do vírus da Dengue inserido na IGR 07-08. A faixa 3 mostra o produto da PCR utilizando o vetor vazio MVA-BN. Utilizando o MVA recombinante com PrM2, pode ser detectado um fragmento de tama- nho maior (faixa 2). M = marcador de peso molecular, faixa 1 = água para controle negativo. Figura 9b: curva de crescimento em várias etapas para o vetor vazio MVA-BN e o MVA recombinante com PrM2 inserido na IGR 07-08 (MVA-mBN25). Figura 10: Análise de PCR da IGR 07-08 no MVA recombinante com o env do HIV inserido na IGR 07-08. A faixa BN mostra o produto da PCR utilizando o vetor vazio MVA-BN. Utilizando o MVA recombinante com PrM2, pode ser detectado um fragmento de tamanho maior (faixas 1, 2, 3). M = marcador de peso molecular, - = água para controle negativo, + = con- trole positivo do plasmídeo. Figura 11: Figura 11a: Análise de PCR da IGR 44-45 no MVA recombinante com o PrM3 do vírus da Dengue inserido na IGR 44-45. A fai- xa BN mostra o produto da PCR utilizando o vetor vazio MVA-BN. Utilizando o MVA recombinante com PrM3, pode ser detectado um fragmento de tama- nho maior (faixas 1-4 concentrações diferentes de DNA). M = marcador de peso molecular, - = água para controle negativo. Figura 11b: curva de crescimento em várias etapas para o vetor vazio MVA-BN e o MVA recombinante com PrM3 inserido na IGR 44-45 (MVA-mBN28). Figura 12: Figura 12a: Análise de PCR da IGR 148-149 no MVA recombinante com o PrM1 do vírus da Dengue inserido na IGR 148-149. A faixa BN mostra o produto da PCR utilizando o vetor vazio MVA-BN. Utili- zando o MVA recombinante com PrM1, pode ser detectado um fragmento de tamanho maior (faixa 1). M = marcador de peso molecular, - = água como controle negativo, + = controle positivo do plasmídeo. Figura 12b: curva de crescimento em várias etapas para o vetor vazio MVA-BN e o MVA recombinante com PrM1 inserido na IGR 44-45 (MVA-mBN33). Os exemplos a seguir ilustrarão adicionalmente a presente in- venção. Será bem entendido por qualquer versado na arte que os exemplos fornecidos não devem de forma alguma ser interpretados de uma maneira que limite a presente invenção a estes exemplos. O âmbito da invenção é somente limitado pelo âmbito completo das reivindicações em anexo.
Exemplo 1 Vetores de inserção pBNX39, pBNX70 e pBN84
Para a inserção de seqüências exógenas na região intergênica adjacente ao ORF 065L (o sítio de inserção está na posição do genoma 56760) do MVA, foi construído um vetor que compreende aproximadamente 1200 pb das seqüências flanqueadoras adjacentes ao sítio de inserção. Estas se- qüências flanqueadoras são sepearadas em dois flancos que compreendem em um flanco aproximadamente 610 pb do ORF 065L (nomenclatura alter- nativa: ORF I4L) e na outra parte aproximadamente 580 pb da região inter- gênica atrás do ORF 065L assim como partes do próximo ORF. Entre estas seqüências flanqueadoras um gene Ecogpt (gpt significa o gene da fosforri- bosiltransferase isolado de E. coli) e um BFP (proteína fluorescente azul), respectivamente, ficam localizados sob o controle transcricional de um promotor de poxvirus. Adicionalmente, há pelo menos um sítio de clonagem para a inser- ção de genes ou seqüências adicionais que serão inseridos na região inter- gênica atrás do ORF I4L. Os exemplos das construções de vetores de acor- do com a presente invenção são divulgados nas Figuras 1 a) e b) (pBNX39, pBNX70). No vetor pBN84 (Figura 1c) a região codificadora para o NS1 do vírus da Dengue é inserida no sítio de clonagem do pBNX70 (Figura 1b).
Produção do MVA recombinante através da recombinação homóloga
Os genes estranhos podem ser inseridos no genoma do MVA através da recombinação homóloga. Para tal finalidade, o gene estranho de interesse é clonado em um vetor plasmideal, como descrito anteriormente. Este vetor é transfectado em células infectadas com o MVA. A recombinação ocorre no citoplasma das células infectadas e transfectadas. Com o auxílio do cassete de seleção e/ou repórter, que também está contido no vetor de inserção, as células que compreendem os vírus recombinantes são identifi- cadas e isoladas.
Para a recombinação homóloga, células de BHK (de rins de hamsters bebês) ou CEF (fibroblastos embrionários primários de galinha) são semeadas em placas de 6 poços utilizando DMEM (Meio de Eagles Mo- dificado por Dulbecco, Gibco BRL) + 10% de soro fetal de bezerro (FCS) ou VP-SFM (Gibco BRL) + 4 mmoles/L de L-Glutamina para um processo de produção isento de soro.
As células precisam estar ainda na fase de crescimento e, por- tanto, devem atingir 60-80% de confluência no dia da transfecção. As células foram contadas antes do inóculo, uma vez que o número de célula tem que ser conhecido para a determinação da multiplicidade de infecção (moi) para a infecção.
Para a infecção, o estoque de MVA é diluído em DMEM/FCS ou VP-SFM/L-Glutamina de forma que 500 pL da diluição contenham uma quantidade apropriada de vírus que fornecerá uma moi de 0,1 - 1,0. É assu- mido que as células tenham se dividido uma vez após o inóculo. O meio é removido das células e as células são infectadas com 500 pL de vírus diluído durante 1 hora com agitação à temperatura ambiente. O inóculo é removido e as células são lavadas com DMEM/VP-SFM. As células infectadas são deixa- das em 1,6 mL de DMEM/FCS e VP-SFM/L-Glutamina, respectivamente, enquanto a reação de transfecção é ajustada (Qiagen Effectene Kit).
Para a transfecção, é utilizado o kit de transfecção "Effectene" (Qiagen). Uma mistura de transfecção é preparada de 1-2 pg de vetor de inserção linearizado (quantidade total para a transfecção múltipla) com o tampão EC para fornecer um volume final de 100 pL. Adicionar 3,2 pL do Enhancer, submeter ao vórtex e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Então, 10 pL de Effectene são adicionados após submeter o tubo de estoque ao vórtex e a solução é misturada vigorosamente com o vórtex e incubada à temperatura ambiente durante 10 min. 600 jiL de DMEM/FCS e VP-SFM/L-Glutamina, respectivamente, são adicionados, misturados e subse- qüentemente, a mistura de transfecção toda é adicionada nas células, que já estão cobertas com meio. De forma delicada a placa é agitada para misturar a reação de transfecção. A incubação ocorre a 37°C com 5% de CO2 durante a noite. No dia seguinte o meio é removido e substituído por DMEM/FCS ou VP-SFM/L-Glutamina. A incubação é mantida até o 3sdia. Para a coleta, as células são raspadas no meio, então a suspensão de células é transferida para um tubo adequado e congelada a -20°C durante um armazenamento de curto período ou a -80°C durante um armazenamento de período longo.
Inserção de Ecoqpt no sítio de inserção I4L do MVA
Em uma primeira rodada, as células foram infectadas com MVA de acordo com o protocolo descrito anteriormente e foram adicionalmente transfectadas com o vetor de inserção pBNX39 (Figura 1a) contendo o gene Ecogpt (Ecogpt, ou abreviado para gpt, significa o gene da fosforribosil- transferase) como o gene repórter. Os vírus recombinantes resultantes foram purificados através de 3 rodadas de purificação de placas sob a seleção do metabolismo da fosforribosiltransferase através da adição do ácido mi- cofenólico, da xantina e da hipoxantina. O ácido micofenólico (MPA) inibe a desidrogenase do monofosfato de iosina e resulta no bloqueio da síntese de purina e na inibição da replicação virai na maior parte das linhagens de células. Este bloqueio pode ser vencido através da expressão do Ecogpt partindo de um promotor constitutivo e fornecendo os substratos xantina e hipoxantina. Os vírus recombinantes resultantes foram identificados através de ensaios padrão da PCR utilizando um par de iniciadores que amplifica seletivamente o sítio de inserção esperado. Para amplificar o sítio de inserção I4L foi utilizado o par de iniciadores, BN499 (CAA CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEQ ID N2: 1) e BN500 (CGA TCA AAG TCA ATC TAT G, SEQ ID N2: 2). No caso do DNA do vetor vazio o vírus MVA é amplificado e o fragmento da PCR esperado possui 328 nucleotídeos (nt) de comprimento, no caso de um MVA recombinante ser amplificado, que possui o DNA exógeno incorporado no sítio de inserção I4L, o fragmento é de forma correspondente maior.
Inserção de NS1 no sítio de inserção IGR064L-065L (I4L-I5L) do MVA
Em uma primeira rodada, as células foram infectadas com o MVA de acordo com o protocolo descrito anteriormente e foram adicionalmente transfectadas com o vetor de inserção pBN84 (Figura 1 c) contendo o gene Ecogpt para a seleção e o BFP (proteína fluorescente azul) como o gene repórter. Os vírus recombinantes foram purificados através de 7 rodadas de purificação de placas sob a seleção do metabolismo da fosforribosil- transferase através da adição do ácido micofenólico, da xantina e da hipo- xantina. O ácido micofenólico (MPA) inibe a desidrogenase do monofosfato de inosina e resulta no bloqueio da síntese de purina e na inibição da repli- cação virai na maior parte das linhagens de células. Este bloqueio pode ser vencido através da expressão do Ecogpt partindo de um promotor constitutivo e do fornecimento dos substratos xantina e hipoxantina.
Os vírus recombinantes resultantes foram identificados através de ensaios padrão da PCR utilizando um par de iniciadores que amplifica seletivamente o sítio de inserção esperado. Para amplificar o sítio de inserção I4L foi utilizado o par de iniciadores, BN499 (CAA CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEQ ID N°: 1) e BN500 (CGA TCA AAG TCA ATO TAT G, SEQ ID Ns: 2). No caso do DNA do vetor vazio o vírus MVA é amplificado e o fragmento da PCR esperado possui 328 nucleotídeos (nt) de comprimento, no caso de um MVA recombinante para NS1 ser amplificado, que incorporou a região codificadora do NS1 do vírus da Dengue, espera-se que o fragmento tenha 1683 pb. Os resultados da PCR na Figura 7 mostram claramente a inserção estável do NS1 no sítio de inserção I4L após 17 rodadas de amplificação do vírus.
Teste do recMVA incluindo NS1 (MVA-BN22) in vitro
Um frasco T25 com monocamadas aproximadamente 80% confluentes de células BHK foi inoculado com 100 pL do estoque de vírus diluído até 1 x 107 em MEMα com 1% de FCS e agitado à temperatura ambiente durante 30 minutos. 5 ml_ do MEMα com 3% de FCS foram adicionados em cada frasco e incubados a 30°C em uma incubadora com CO2. O frasco foi coletado após 48 horas. O sobrenadante foi removido do frasco e foi centrifugado a 260 g durante 10 minutos a 4°C. Os sobrenadantes foram armazenados em alíquotas a -80°C. O pélete foi lavado com 5 ml_ de PBS 1x duas vezes e então ressuspensa em 1 mL de tampão de rompimento hipotônico com 1% de TX100. Os lisados de células foram coletados e centrifugados durante 5 minutos a 16.000 g e os sobrenadantes foram armazenados em um tubo de microcentrífuga a -80°C. Os frascos inoculados com MVA incluindo GFP, MVA incluindo o gene NS1 em um sítio de deleção (MVA-BN07) e os frascos com infecção falsa foram também tratados da mesma maneira descrita acima. O lisado de células/vírus e o sobrenadante foram tratados em tampão de amostra não redutor/redutor sob condições sem aquecimen- to/aquecimento. As proteínas foram separadas em SDS PAGE a 10% e transferidas para membranas de nitrocelulose. As manchas foram submetidas à sonda durante a noite com soros agrupados de pacientes convalescentes (PPCS) a uma diluição de 1:500. Após lavar 3 vezes com PBS 1X, as manchas foram incubadas com IgG-HRP anti-humana (DAKO) durante 2 horas à temperatura ambiente. Após as manchas terem sido lavadas como descrito anteriormente, a cor foi desenvolvida utilizando 4-cloro-1-naftol. Os resultados do western blot mostraram que o NS1 no MVA- BN22 é expresso em grandes quantidades. O NS1 foi expresso na confirmação direita, na forma de um dímero sob uma condição sem aquecimento e como um monômero sob uma condição de aquecimento.
A expressão do NS1 foi comparada tanto no MVA-BN22 quanto no MVA-BN07. As células BHK foram inoculadas com a mesma pfu e coletadas após 48 horas. Os resultados mostraram que a expressão do NS1 era muito maior no BN22 que no BN07. Os resultados do western blot também mostraram que há mais NS1 secretado no sobrenadante com a construção BN22 comparado com a BN07. Os resultados mostraram ainda que o NS1 expresso nas células infectadas com BN22 é antigênico e é reconhecido pelos soros agrupados de pacientes convalescentes. Em conclusão, o NS1 é expresso em grandes quantidades e na confirmação direita nas células BHK infectadas com BN22. Tanto o dímero quanto o monômero são antigênicos e são reconhecidos pelos soros agrupados dos pacientes convalescentes.
Exemplo 2 Vetor de inserção pBNX67 e pBN27
As seqüências do MVA adjacentes ao novo sítio de inserção (na posição do genoma 129940) entre os ORFs 136L e 137L foram isoladas através da amplificação padronizada da PCR da seqüência de interesse utilizando os iniciadores a seguir: OBN543 (TCCCCGCGGAGAGGCGTAAAAGTTAAATTAGAT; SEQ ID Ns: 3) e OBN544 (TGATCTAGAATCGCTCGTAAAAACTGCGGAGGT; SEQ ID Ns: 4) para o isolamento do Flanco 1; OBN578 (CCGCTCGAGTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEQ ID N2: 5) e OBN579 (CGGGGGCCCTATTTTGTATAATATCTGGTAAG; SEQ ID N2: 6) para o isolamento do Flanco 2; O fragmento da PCR compreende que o Flanco 1 foi tratado com as enzimas de restrição Sacll e Xbal e ligado a um vetor básico digerido com Sacll/Xbal e desfosforilado, tal como o pBluescript (Stratagene). O plasmídeo resultante foi digerido com Xhol/Apal, desfosforilado e ligado ao fragmento da PCR digerido com Xhol/Apal que compreende o Flanco 2. Opcionalmente, uma seqüência repetitiva do Flanco 2 que foi isolada através da PCR utilizando os iniciadores OBN545 (CGGCTGCAGGGTACCTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEQ ID N2: 7) e oBN546 (CGGAAGCTTTATATGGTTTAGGATATTCTGTTTT; SEQ ID N2: 8) e que foi digerida com Hindlll/Pstl, foi inserida no sítio Hindlll/Pstl do vetor resultante. A Figura 2a) mostra o vetor (pBNX51).
Um cassete repórter que compreende um promotor sintético, o gene NPT II (resistência à neomicina), uma região de poli-A, IRES, o gene EGFP (Ps-NPTII-poliA-IRES-EGFP) foi digerido com Ecl136ll/Xhol e inserido no sítio Hindlll/Xhol do vetor de inserção, em que o sítio Hindlll foi transformado em ponta cega com a DNA Polimerase do T4 (Roche). Um mapa de restrição de um exemplo de construção de vetor de acordo com este exem-plo é descrito na Figura 2b) (pBNX67). Para a construção do pBN27 (Figura 2c) o PrM do vírus da Dengue do sorotipo 4 foi inserido no único sítio de Pad do pBNX67.
Produção do MVA recombinante através da recombinação homóloga
O vetor pBNX67 (Figura 2b) pode ser utilizado para gerar um MVA recombinante utilizando o protocolo mencionado anteriormente - por exemplo, a utilização do pBN27 (Figura 2c) para a recombinação homóloga resulta em um MVA recombinante que carrega o PrM4 do vírus da Dengue na região intergênica entre dois ORFs adjacentes.
Inserção do PrM4 no sítio de inserção IGR136-137 do MVA
Em uma primeira rodada, as células foram infectadas com o MVA de acordo com o protocolo descrito anteriormente e foram adicionalmente transfectadas com o vetor pBN27 (Figura 2c) contendo o gene NPT para seleção e EGFP (proteína fluorescente verde aumentada) como o gene repórter. Os vírus recombinantes foram purificados através de 4 rodadas de purificação de placas sob a seleção com G418. Os vírus recombinantes resultantes foram identificados através de ensaios padronizados da PCR utilizando um par de iniciadores amplificando seletivamente o sítio de inserção esperado. Para amplificar o sítio de inserção IGR136-137, foi utilizado o par de iniciadores BN900 (cgttcgca- tgggttacctcc, SEQ ID Ns: 9) e BN901 (gacgcatgaaggctgaac, SEQ ID N-. 10). No caso de o DNA do vírus MVA do vetor vazio ser amplificado, o fragmento da PCR esperado possui 88 nucleotídeos (nt) de comprimento, no caso em que um MVA recombinante para o PrM4 ser amplificado, que incorporou a região codificadora do PrM4 do vírus da Dengue no sítio de inserção IGR136-137, espera-se que o fragmento tenha 880 pb. Os resultados da PCR na Figura 8a) mostram claramente a inserção estável do PrM4 no sítio de inserção IGR136-137 após 22 rodadas de amplificação virai. O MVA re- combinante ainda exibe as mesmas características de crescimento que o MVA-BN. Este se replica em fibroblastos embrionários de galinha (células CEF) e cresce atenuado em células de mamíferos (Figura 8b).
Exemplo 3 Vetores de inserção pBNX79, pBNX86, pBNX88, pBN34 e pBN56
As seqüências do MVA adjacentes ao novo sítio de inserção (na posição do genoma 12800) entre os ORFs 007R e 008L foram isoladas através da amplificação padronizada da PCR da seqüência de interesse utilizando os iniciadores a seguir: IGR 07/08 F1up (CGCGAGCTCAATAAAAAAAAGTTTTAC; SEQ ID Ns: 11) e IGR 07/08 F1up (AGGCCGCGGATGCATGTTATGCAAAATAT; SEQ ID N2: 12) para o isolamento do Flanco 1; IGR 07/08 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC; e IGR 07/08 F2up (CAGGGCCCTCTCATCGCTTTCATG; SEQ ID N2: 13) SEQ ID N2:14) para o isolamento do Flanco 2. O fragmento da PCR que compreende o Flanco 1 foi tratado com as enzimas de restrição Sacll e Saci e ligado a um vetor básico digerido com Sacll/Sacl e desfosforilado, tal como o pBluescript (Stratagene). O plasmídeo resultante foi digerido com Xhol/Apal, desfosforilado e ligado ao fragmento da PCR digerido com Xhol/Apal que compreende o Flanco 2. Opcionalmente, uma seqüência repetitiva do Flanco 2 que tinha sido isolada através da PCR utilizando os iniciadores 07/08 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC; SEQ ID N2: 13) e IGR 07/08 F2mid (TTTCTGCAGTGATATTATCCAATACTA; SEQ ID N2: 15) e que é digerida com BamHI/Pstl, foi inserida no sítio BamHI/Pstl do vetor resultante.
Qualquer cassete que compreenda o gene repórter ou terapêutico, que possua, por exemplo, um promotor de poxvirus, um gene marcador, uma região poli-A e opcionalmente um elemento IRES, um gene adicional, por exemplo, expressando uma substância ou um produto gênico terapeuti- camente ativo, pode ter ponta cega com a DNA Polimerase do T4 (Roche) após a digestão de restrição e ser inserido em um sítio de clonagem adequado do vetor plasmideal. Um mapa de restrição de um exemplo de construção de vetor de acordo com este exemplo é descrita na Figura 3a) (pBNX79). A inserção do cassete de seleção NPT/EGFP resultou no vetor pBNX86 (Figura 3b) e a inserção do cassete de seleção gpt/BFP no vetor pBNX88 (Figura 3 c), respectivamente. Considerando uma unidade de expressão para um gene terapêutico, que compreende um gene terapêutico e um promotor ligados de forma operacional, esta unidade de expressão é inserida no sítio Pad. Para a construção do pBN34 (Figura 3d) o PrM2 do vírus da Dengue foi clonado no pBNX88 (Figura 3c) e para a síntese do pBN56 (Figura 3e) a região codificadora do env de HIV foi clonada através do Pad no pBNX86 (Figura 3b).
Produção do MVA recombinante através da recombinação homóloga
Os vetores pBNX86 (Figura 3b) e pBNX88 (Figura 3c), respectivamente, podem ser utilizados para gerar um MVA recombinante utilizando o protocolo mencionado anteriormente. A utilização do pBN34 (Figura 3d) para a recombinação homóloga resulta em um MVA recombinante que carrega o PrM2 do vírus da Dengue na região intergênica entre os ORFs adjacentes. A recombinação do pBN56 (Figura 3e) com o genoma do MVA-BN resulta em um MVA recombinante, que contém o gene env do HIV na IGR correspondente.
Inserção do PrM2 no sítio de inserção IGR07-08 do MVA
Em uma primeira rodada, as células foram infectadas com o MVA de acordo com o protocolo descrito anteriormente e foram adicionalmente transfectadas com o vetor de inserção pBN34 (Figura 3d) contendo o gene gpt para seleção e BFP como gene repórter. Os vírus recombinantes resultantes foram purificados através de 3 rodadas de purificação de placas sob seleção pelo ácido micofenólico como descrito no Exemplo 1.
Os vírus recombinantes resultantes foram identificados através de ensaios padronizados da PCR utilizando um par de iniciadores que amplificam seletivamente o sítio de inserção esperado. Para a amplificação do sítio de inserção IGR07-08, foi utilizado o par de iniciadores BN902 (ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID Ne: 16) e BN903 (gacaattatccgacgcaccg SEQ ID Ns: 17). No caso do DNA do virus MVA de vetor vazio ser amplificado o fragmento da PCR esperado possui 190 nucleotídeos (nt) de comprimento, no caso de um MVA recombinante para PrM2 ser amplificado, que incorporou a região codificadora do PrM2 do vírus da Dengue no sítio de inserção IGR07-08, espera-se que o fragmento tenha 950 pb. Os resultados da PCR na Figura 9a) mostram claramente a inserção estável do PrM2 no sítio de inserção IGR07-08 após 20 rodadas da amplificação do vírus. O MVA recombinante exibe ainda as mesmas características de crescimento que o MVA-BN. Se replica em fibroblastos embrionários de galinha (células CEF) e crescem atenuados em células de mamíferos (Figura 9b).
Inserção do env do HIV no sítio de inserção IGR07-09 do MVA
Em uma primeira rodada, as células foram infectadas com o MVA de acordo com o protocolo descrito anteriormente e foram adicionalmente infectadas com o vetor de inserção pBN56 (Figura 3e) contendo o gene NPT para seleção e EGFP como gene repórter. Os vírus recombinantes resultantes foram purificados através de 6 rodadas de purificação de placas sob a seleção com G418.
Os vírus recombinantes resultantes foram identificados através de ensaios padronizados da PCR utilizando um par de iniciadores que amplificam seletivamente o sítio de inserção esperado. Para amplificar o sítio de inserção IRG07-08, foi utilizado o par de iniciadores BN902 (ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID Ne: 16) e BN903 (gacaattatccgacgcaccg, SEQ ID Ns: 17). No caso do DNA do vírus MVA de vetor vazio ser amplificado o fragmento da PCR esperado possui 190 nucleotídeos (nt) de comprimento, no caso de um MVA recombinante para env ser amplificado, que incorporou a região codificadora do env do HIV no sítio de inserção IGR07-08, espera-se que o fragmento tenha 2,6 kb. Os resultados da PCR na Figura 10 mostram claramente a inserção estável do env no sítio de inserção IGR07-08 após 20 rodadas da amplificação do vírus.
Exemplo 4 Vetores de inserção pBNX80, pBNX87 e pBN47
As seqüências do MVA adjacentes ao novo sítio de inserção (na posição do genoma 37330) entre os ORFs 044L e 045L foram isoladas através da amplificação padronizada da PCR da seqüência de interesse utilizando os iniciadores a seguir. IGR44/45F1up (CGCGAGCTCATTTCTTAGCTAGAGTGATA; SEQ ID N2: 18) e IGR44/45F1end (AGGCCGCGGAGTGAAAGCTAGAGAGGG; SEQ ID N2: 19) para o isolamento do Flanco 1; IGR44/45F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT; SEQ ID N2: 20) e IGR44/45F2end (CAGGGCCCCTAAATGCGCTTCTCAAT; SEQ ID N2: 21) para o isolamento do Flanco 2. O fragmento da PCR que compreende o Flanco 1 foi tratado com as enzimas de restrição Sacll e Saci e ligado a um vetor básico digerido com Sacll/Sacl e desfosforilado, tal como o pBluescript (Stratagene). O plasmídeo resultante foi digerido com Xhol/Apal, desfosforilado e ligado ao fragmento da PCR digerido com Xhol/Apal que compreende o Flanco 2.
Opcionalmente, uma seqüência repetitiva do Flanco 2, que foi isolada através da PCR utilizando os iniciadores IGR44/45F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT; SEQ ID N2: 20) e IGR44/45F2mid (TTTCTGCAGCCTTCCTGGGTTTGTATTAACG; SEQ ID N2: 22) e que foi digerida com BamHI/Pstl, foi inserida no sítio BamHI/Pstl do vetor resultante.
Qualquer cassete que compreenda um gene repórter ou terapêutico, que possua, por exemplo, um promotor de poxvirus, um gene marcador, uma região poli-A e opcionalmente um elemento IRES, um gene adicional, por exemplo, que expressa uma substância ou um produto gênico terapeuticamente ativo, pode ter suas pontas cegas com a DNA Polimerase do T7 (Roche) após uma digestão de restrição e ser inserido em um sítio de clonagem adequado do vetor plasmideal. Considerando um cassete de gene repórter, o sítio das enzimas de restrição Pstl, EcoRI, EcoRV, Hindlll, Aval ou Xhol entre o Flanco 2 e a repetição do Flanco 2 é preferido como o sítio de clonagem. Para a construção do pBNX87 (Figura 4b) o cassete de seleção NPT/EGFP foi inserido no pBNX80 (Figura 4a).
Considerando uma unidade de expressão para um gene terapêutico, que compreende um gene terapêutico e um promotor ligado de forma operacional, esta unidade de expressão é inserida no sítio Pacl.
Um mapa de restrição de exemplos de construções de vetores de acordo com este exemplo é descrito na Figura 4a) e b) (pBNX80, pBNX87). O vetor pode ser utilizado para gerar um MVA recombinante - seguindo o protocolo mencionado anteriormente - que carrega uma seqüência exógena na região intergênica entre dois ORFs adjacentes. Para a construção do pBN47 (Figura 4c) o PrM do sorotipo 3 do vírus da Dengue foi clonado no pBNX87 (Fi. ura 4b).
Inserção do PrM3 no síuo de inserção IGR44-45 do MVA
Em uma primeira rodada, as células foram infectadas com o MVA de acordo com o protocolo descrito anteriormente e foram adicionalmente transfectadas corn o vetor de inserção pBN47 (Figura 4c) contendo o gene NPT para a seleção e EGFP como o gene repórter. Os vírus recombinantes resultantes foram purificados através de 3 rodadas de purificação de placas sob a seleção com G418.
Os vírus recombinantes resultantes foram identificados através de ensaios padronizados da PCR utilizando um par de iniciadores que amplifica seletivamente o sítio de inserção esperado. Para a amplificação do sítio de inserção IGR44-45, foi utilizado o par de iniciadores BN904 (cgttagacaacacaccgacgatgg, SEQ ID N2: 23) e BN905 (cggatgaaaaatttttaag, SEQ ID N2: 24). No caso em que o DNA do vírus MVA de vetor vazio for amplificado, o fragmento da PCR esperado possui 185 nucleotídeos (nt) de comprimento, no caso de um MVA recombinante para o PrM3 ser amplificado, no qual foi incorporada a região codificadora do PrM3 do vírus da Dengue no sítio de inserção IGR44-45, espera-se que o fragmento possua 850 pb. Os resultados da PCR na Figura 11a) mostram claramente a inserção estável do PrM3 no sítio de inserção após 19 rodadas de amplificação do vírus. O MVA recombinante exibe ainda as mesmas características de crescimento que as do MVA-BN. Se replica em fibroblastos embrionários de galinha (células CEF) e cresce atenuado em células de mamíferos (Figura 11b).
Exemplo 5 Vetores de inserção pBNX90, pBNX92 e pBN54
As seqüências do MVA adjacentes ao novo sítio de inserção (na posição do genoma 137496) entre os ORFs 148R e 149L foram isoladas através da amplificação padronizada da PCR da sequência de interesse utilizando os iniciadores a seguir: IGR148/149F1 up (TCCCCGCGGGGACTCATAGATTATCGACG; SEQ ID N2: 25) e IGR148/149F1 end (CTAGTCTAGACTAGTCTATTAATCCACAGAAATAC; SEQ ID N2: 26) para o isolamento do Flanco 1; IGR148/149F2up (CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC; SEQ ID Ne: 27) e IGR148/149F2end (TAGGGCCCGTTATTGCCATGATAGAG, SEQ ID N2: 28) para o isolamento do Flanco 2. O fragmento da PCR que compreende o Flanco 1 foi tratado com as enzimas de restrição Sacll e Xbal e ligado a um vetor básico digerido com Sacll/Xbal e desfosforilado, tal como o pBluescript (Stratagene). O plasmídeo resultante foi digerido com Hindlll/Apal, desfosforilado e ligado ao fragmento da PCR digerido com Hindlll/Apal que compreende o Flanco 2. Opcionalmente, uma seqüência repetitiva do Flanco 2, que foi isolada através da PCR utilizando os iniciadores IGR148/149F2up (CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC; SEQ ID N2: 27) e IGR148/149F2mid (TTTCTGCAGTGTATAATACCACGAGC; SEQ ID N2: 29) e que foi digerida com BamHI/Pstl, foi inserida no sítio BamHI/Pstl do vetor resultante. Qualquer cassete que compreenda um gene repórter ou terapêutico, que possua, por exemplo, um promotor de poxvirus, um gene marcador, uma região poli-A e opcionalmente um elemento IRES, um gene adi- cional, por exemplo, que expressa uma substância ou produto gênico tera- peuticamente ativo, pode ter a ponta cega com a DNA Polimerase do T4 (Roche) após uma digestão de restrição e ser inserido em um sítio de clonagem adequado do vetor plasmideal. Para a construção do pBNX92 (Figura 5b), o cassete de expressão gpt/BFP foi inserido neste sítio de clonagem. Considerando um cassete de gené repórter, os sítios de enzimas de restrição Pstl, EcoRI, EcoRV e Hindlll entre o Flanco 2 e a repetição do Flanco 2 são preferidos como o sítio de clonagem. Considerando uma unidade de expressão para um gene terapêutico, que compreende um gene terapêutico e um promotor ligado de forma operacional, esta unidade de expressão é inserida no sítio Pacl. Para a construção do pBN54 (Figura 5c) o PrM1 do vírus da Dengue foi inserido neste sítio Pacl. Um mapa de restrição de um exemplo de construção de vetor de acordo com este Exemplo é descrito nas Figuras 5a) e b) (pBNX90, pBNX92). O vetor pode ser utilizado para gerar um MVA recombinante - seguindo o protocolo mencionado anteriormente - que carrega uma seqüência exógena na região intergênica entre dois ORFs adjacentes. Para a produção de um MVA recombinante que expressa o PrM1 do vírus da Dengue, o pBN54 (Figura 5c) foi utilizado para uma recombinação homóloga.
Inserção do PrM1 no sítio de inserção IGR148-149 do MVA
Em uma primeira rodada, as células foram infectadas com o MVA de acordo com o protocolo descrito anteriormente e foram adicionalmente transfectadas com o vetor de inserção pBN54 (Figura 5c) contendo o gene gpt para a seleção e BFP como o gene repórter. Os vírus recombinantes resultantes foram purificados através de 3 rodadas de purificação de placas sob a seleção com o ácido micofenólico. Os vírus recombinantes resultantes foram identificados através de ensaios padronizados da PCR utilizando um par de iniciadores que amplifica seletivamente o sítio de inserção esperado. Para amplificar o sítio de inserção IGR148-149, foi utilizado o par de iniciadores BN960 (ctgtataggtatgtcctctgcc, SEQ ID Ns: 30) e BN961 (gctagtagacgtggaaga, SEQ ID Ne: 31). No caso do DNA do virus MVA de vetor vazio ser amplificado, o fragmento da PCR esperado possui 450 nucleotídeos (nt) de comprimento, no caso de um MVA recombinante para PrM1 ser amplificado, que incorporou a região codificadora do PrM1 do vírus da Dengue no sítio de inserção 5 IGR148-149, espera-se que o fragmento possua 1200 pb. Os resultados da PCR na Figura 12 a) mostram claramente a inserção estável do PrM1 no sítio de inserção IGR148-149 após 23 rodadas de amplificação virai. O MVA recombinante ainda exibe as mesmas características de crescimento que as do MVA-BN. Se replica em fibroblastos embrionários de galinha (células 10 CEF) e cresce atenuado em células de mamíferos (Figura 12b).

Claims (27)

1. Virus Vacínia Ancara Modificado (MVA) recombinante caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de DNA heteróloga, exógena inserida em uma região intergênica (IGR) do genoma virai, em que a sequência heteróloga de DNA exógeno é inserida em uma IGR entre dois quadros abertos de leitura adjacentes (ORFs) selecionados do grupo que compreende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L; em que sequência de IGR compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que compreende as sequências de nucleotídeos - no. 527-608 da SEQ ID NO: 32, - no. 299-883 da SEQ ID NO: 33, - no. 339-852 da SEQ ID NO: 34, - no. 376-647 de SEQID NO: 35, - no. 597-855 de SEQID NO: 36; - no. 400-607 da SEQ ID NO: 37
2. MVA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência heteróloga de DNA exógeno compreende pelo menos uma sequência codificadora, preferencialmente, sob o controle transcricional de um elemento de controle da transcrição de poxvirus.
3. MVA, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que a sequência heteróloga de DNA exógeno codifica uma ou mais proteinas, polipeptideos, peptideos, antigenos estranhos ou epitopos antigênicos.
4. MVA, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a sequência heteróloga de DNA exógeno é derivada do virus da Dengue, do virus da encefalite Japonesa, do virus da Hepatite B, do virus da Hepatite C e/ou de virus de imunodeficiência, preferencialmente, o virus da imunodeficiência humana (HIV).
5. MVA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a sequência heteróloga de DNA exógeno derivada do virus da Dengue é selecionada do grupo que consiste em NS1 e PrM.
6. MVA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o gene NS1 é inserido na IGR entre os ORFs 0 64L-065L.
7. MVA, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o gene PrM é derivado de um ou mais dos 4 sorotipos do virus da dengue.
8. MVA, de acordo com as reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que o gene PrM é inserido na IGR entre os ORFs selecionados do grupo que compreende: 007R- 008L, 044L-045L, 136L-137L, 148R-149L.
9. MVA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a sequência heteróloga de DNA exógeno derivada do virus da imunodeficiência codifica o env do HIV.
10. MVA de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o gene env do HIV é inserido na IGR entre os ORFs 007R-008L.
11. MVA, de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que sendo o MVA depositado na ECACC sob o número de depósito V00083008.
12. Uso do MVA conforme definido nas reivindicações 1 a 11 caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento e/ou uma vacina para o tratamento e/ou a profilaxia de uma infecção viral e/ou uma doença proliferativa.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a infecção viral é dengue ou infecção pelo virus da imunodeficiência, preferencialmente, a infecção pelo HIV.
14. Vacina caracterizada pelo fato de que compreende o MVA como definido nas reivindicações 1 até 11.
15. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o MVA como definido nas reivindicações 1 a e 11 um veiculo diluente adjuvante e/ou aditivo farmaceuticamente aceitável.
16. Método para a produção de uma proteína, polipeptideo, peptideo, antigeno ou epitopo in vitro caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - infectar uma célula hospedeira com o MVA recombinante conforme definido nas reivindicações 1 a 11, - cultivar a célula hospedeira infectada sob condições adequadas, - isolar e/ou enriquecer o polipeptideo, a proteína, o peptídeo, o antígeno, o epítopo e/ou o vírus produzido pela dita célula hospedeira.
17. Método para a introdução de uma sequência de DNA em uma célula in vitro,caracterizado pelo fato de que a dita sequência de DNA sendo homóloga e/ou heteróloga em relação ao genoma da dita célula, em que a célula é infectada com o MVA conforme definido pelas reivindicações 1 a 11.
18. Vetor plasmideal caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de DNA derivada a partir de ou homóloga ao genoma de um MVA conforme definido pelas reivindicações 1 a 11, em que a sequência de DNA compreende uma IGR completa ou um fragmento de um IGR, e em que o IGR é selecionado a partir do grupo que consiste em IGRs: 007R- 008L, 018L-019L, 044L045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L, em que a sequência de IGR compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que compreende as sequências de nucleotídeos - no. 527-608 da SEQ ID NO: 32, - no. 299-883 da SEQ ID NO: 33, - no. 339-852 da SEQ ID NO: 34, - no. 376-647 de SEQID NO: 35, - no. 597-855 de SEQID NO: 36; - no. 400-607 da SEQ ID NO: 37
19. Vetor plasmideal, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que um cassete repórter é inserido dentro da IGR.
20. Vetor plasmideal, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que um cassete de gene de seleção é inserido dentro da IGR.
21. Vetor plasmideal, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende sequências de duas ORF adjacentes.
22. Vetor plasmideal, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que uma sequência de DNA exógena é inserida no sítio de clonagem da sequência de IGR,
23. Vetor plasmideal, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA exógeno compreende uma sequência de vírus da dengue.
24. Vetor plasmideal, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a sequência do vírus dengue é selecionada de entre o grupo consistindo das sequências de NSI e prM.
25. Vetor plasmideal, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a sequência do virus dengue é uma sequência prM.
26. Processo para a produção do MVA conforme definido pelas reivindicações 1 a 11 caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de transfectar uma célula com um vetor plasmideal conforme definido pelas reivindicações 18 a 25; - infectar a célula transfectada com um MVA; - identificar, isolar e, opcionalmente, purificar o MVA conforme definido pelas reivindicações 1 a 12.
27. Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a célula é infectada com o MVA depositado na ECACC sob o número de depósito V00083008.
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