PT1420822E - Vírus vacínia modificado ancara para a vacinação de neonatais - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO

"VÍRUS VACÍNIA MODIFICADO ANCARA PARA A VACINAÇÃO DE NEONATAIS" A invenção diz respeito à utilização de um virus para a preparação de um medicamento destinado à vacinação ou tratamento de um animal neonatal, incluindo um humano, em que o virus é capaz de infectar as células do animal neonatal, incluindo um humano, mas é incapaz de se replicar em progenitura virai infecciosa no animal neonatal, incluindo um humano. 0 virus é um Vírus Vacínia Modificado Ancara. A invenção diz respeito à utilização de MVA como definido acima para aumentar o nível de factores activadores de células dendríticas, ou suas células precursoras, e/ou para aumentar o número de células dendríticas, ou suas células precursoras, e/ou para aumentar a produção e/ou o teor celular de um interferâo (IFN) ou IL-12.

Contexto da invenção 0 ambiente natural de animais e seres humanos contém uma grande variedade de agentes infecciosos, como vírus, bactérias ou fungos. Muitos destes agentes infecciosos podem causar doenças nos hospedeiros infectados. Em circunstâncias normais, o hospedeiro infectado recupera da doença induzida pelo agente infeccioso após um certo período de tempo. Esta recuperação deve-se ao sistema imunológico de um animal ou de um ser humano. 0 sistema imunológico é a parte do corpo humano ou animal que é responsável pela eliminação do agente 2 infeccioso. A resposta imunológica divide-se numa reacção especifica e numa inespecifica (inata), apesar de ambas cooperarem intimamente. A resposta imunológica inespecifica é a defesa imediata contra uma grande variedade de substâncias estranhas e agentes infecciosos. Na resposta imunológica inata contra vírus, o Interferão (IFN)-a e IFN-β são absolutamente essenciais para controlar a replicação virai inicial e para activar células assassinas naturais (NK) para matar imediatamente células infectadas. Patogenes bacterianos ou parasitários intracelulares induzem IL-12, que regula positivamente IFN-γ em células NK e/ou nalguns subconjuntos de células T. Células NK activadas por IFN-γ podem agora matar patogenes intracelulares. Além disso, o IFN-γ também activa macrófagos e permite-lhes matar patogenes interiorizados.

De longe, a fonte mais rica de IFN-α/β numa base por célula são células dendríticas (DCs), uma população celular especializada estrategicamente distribuída em todo o corpo. As DCs plasmocitóides ou DCs CDllc+ CD8+ estão entre os melhores produtores de IFN-α/β. As DCs CD8+ que estão infectadas com patogenes não virais intracelulares são as células cruciais que conseguem segregar IL-12 essencial para os passos iniciais da defesa imunológica.

Uma resposta imunológica específica pode ser induzida contra uma substância estranha particular (antigene) após uma fase de retardamento quando o organismo é provocado com esta substância pela primeira vez. A iniciação da resposta imunológica específica também é coordenada por DCs. Há um tráfego constante destas células da periferia para os órgãos linfóides secundários, ou nodos linfáticos ou baço, onde recirculam células T e B virgens. 0 antigene que é transportado por DCs para estes órgãos permite a activação 3 de células T e B virgens, que se tornam células T e B efectoras. Por este motivo, as DCs não só transportam o antigene, mas a plasticidade do reconhecimento de patogenes permite a activação de diferentes genes em DCs e, assim, uma iniciação de células T ajustada por patogenes. A resposta imunológica especifica é altamente eficiente e é responsável pelo facto de um indivíduo que recupera de uma infecção específica estar protegido contra esta infecção específica. Assim, uma segunda infecção com o mesmo agente infeccioso ou um muito semelhante causa sintomas muito mais suaves ou nenhuns sintomas, uma vez que já existe uma "imunidade específica pré-existente" para este agente. Essa imunidade e a memória imunológica, respectivamente, persistem durante um longo período de tempo, nalguns casos mesmo durante toda a vida. Em conformidade, a indução de uma memória imunológica pode ser utilizada para vacinação, isto é, para proteger um indivíduo contra infecção com um patogene específico.

Para a vacinação, o sistema imunológico é provocado com uma vacina que, em si mesma, é menos nociva do que o agente patogénico contra o qual se pretende induzir uma resposta imunológica. A vacina compreende ou expressa epítopos que se encontram no agente ou que são expressos pelo agente contra o qual se realiza a vacinação. Em consequência, o organismo é imunizado contra o agente que contém o epítopo que faz parte da vacina.

Vacinas típicas consistem em vírus atenuados ou inactivados (por exemplo, as vacinas de poliovírus ou vírus da varíola), proteínas recombinantes (por exemplo, proteína S do vírus da Hepatite B recombinante), toxinas bacterianas inactivadas pelo calor (toxina tetânica de Clostridium) ou polissacáridos da parede da cápsula bacteriana (Streptococcus pneumoniae) . 4

Uma vez que doenças infecciosas podem conduzir a estados muito críticos em recém-nascidos e lactentes, há um interesse em vacinar crianças ou animais recém-nascidos tão cedo quanto possível. Exemplos de estados contra os quais é desejável uma vacinação são infecções por poxvírus, incluindo varíola. No entanto, as tentativas para vacinar com êxito recém-nascidos são dificultadas pelo facto do sistema imunológico de mamíferos recém-nascidos ainda não estar maduro. Pensa-se que o sistema imunológico de lactentes neonatais e animais mamíferos amadurece gradualmente durante um certo período de tempo. Para humanos, a maturação ocorre durante o primeiro ano de vida. É este o motivo para o facto do grupo de idades dos neonatais estar sujeito a várias infecções durante este primeiro ano (Gans et al., J. Am. Med. Assoe. (1998) 280, 527-532). Mais particularmente, os lactentes neonatais têm função enfraquecida de células B, deficiências na apresentação de antigenes primários por células dendríticas e proliferação limitada de células T (Gans et al., J. Am. Med. Assoe. (1998) 280, 527-532) . Pouco depois do nascimento, os níveis de células T no baço são 1 000 vezes inferiores aos dos adultos. Para obter pelo menos uma imunização fraca, foi sugerido utilizar vírus em replicação ou formulações compreendendo um adjuvante para imunização. Contudo, com vírus em replicação há sempre o risco do sistema imunológico imaturo poder ser subjugado por infecção virai ou vacinas virais vivas, uma vez que as células T são necessárias para a eliminação virai (Hassett et al., J. Virol. (1997) Tl, 7881-7888). Uma vez que há uma produção reduzida de citoquinas por células T auxiliadoras Th-1 em neonatais, a resposta dos lactentes é predominantemente de Th-2. Em consequência, células T citotóxicas não são recrutadas e não há eliminação virai. 5 A situação em animais mamíferos é muito semelhante à situação em humanos, isto é, o sistema imunológico ainda não está maduro após o nascimento. Em ratinhos recém-nascidos, o número de células T CD4+ esplénicas é 80 000 e o de células T CD8+ é 1000 vezes inferior ao existente em baços de adultos. Além disso, o sistema produtor de Interferão (IFN) é imaturo nestes ratinhos. Em consequência, ratinhos neonatais são incapazes de controlar eficientemente a expansão de patogenes intracelulares por IFN no sítio da infecção. Adicionalmente, o número baixo e, possivelmente, fase de activação inadequada de células imunológicas estão demasiado limitados para enfrentar com êxito os patogenes em expansão rápida ou vírus em replicação utilizados para a vacinação.

Kovarik et al. (Virology (2001) 285, 12-20) revelam a indução de respostas de anticorpos, de células Thl e T citotóxicas do tipo adulto num modelo de imunização murina no início da vida utilizando a estirpe NYVAC(KIL) à base de vacínia derivada da estirpe Copenhaga. Todavia, essa estirpe replica-se em células humanas.

Devido ao risco associado às vacinas virais vivas não é recomendado vacinar animais neonatais, incluindo humanos, com vírus em replicação. Por exemplo, recomenda-se não vacinar recém-nascidos contra a varíola com as estirpes do vírus vacínia que foram utilizadas até à erradicação da varíola, como as estirpes Elstee, Copenhaga e NYCBH. De acordo com recomendações recentes nos E.U.A., bebés com menos de 12 meses de idade não devem ser vacinados com as vacinas contra a varíola comercializadas até à data. A vacinação de neonatais com formulações compreendendo um adjuvante tem a desvantagem de numerosas substâncias nocivas serem introduzidas no corpo. Assim, só se procede à 6 vacinação de neonatais humanos em casos de emergência, por exemplo, no caso de infecção com o virus da Hepatite B.

Em resumo, é de salientar que o sistema imunológico não está maduro na altura do nascimento. Uma vez que a vacinação com virus competentes para replicação ou formulações compreendendo um adjuvante tem desvantagens significativas, os lactentes não são vacinados antes dos 2 meses de idade na Alemanha ("Empfehlung der Stándigen Impfkommission STICO", 2001) ou das 6 semanas nos E.U.A. ("Recommended Childhood Immunization Schedule, United States", ACIP) . O atraso do desenvolvimento do sistema imunológico é compensado, em parte, pela transferência de anticorpos maternos da mãe para o lactente durante a gravidez ou por aleitamento. No entanto, nem todos os lactentes são amamentados por vários motivos. Em consequência, há um período de tempo muito crítico de cerca de 6-8 semanas em humanos durante o qual o lactente, com um sistema imunológico imaturo e, assim, não completamente funcional, não recebe anticorpos maternos e durante o qual uma vacinação não é habitualmente bem sucedida ou é demasiado perigosa. A situação é muito semelhante em animais mamíferos, em particular para animais economicamente importantes, como vacas, ou animais de estimação, como gatos e cães. Para reduzir os custos, a quantidade de leite que o vitelo recebe da mãe é muitas vezes drasticamente reduzida. Em vez disso, o vitelo recebe uma mistura de leite em pó e ração concentrada de iniciação e específica, por vezes logo na primeira semana após o nascimento. Em consequência, o vitelo não recebe a quantidade e variedade necessárias de anticorpos maternos, de modo que o sistema imunológico imaturo fica muito susceptível a infecções. Além disso, é 7 frequente os criadores de vitelos e os que os engordam para a produção de carne não serem os mesmos. Às 4 até 6 semanas de idade, vitelos de diferentes criadores de gado são reunidos e transportados para outras quintas para a produção de carne. Nesta altura, os níveis de anticorpos maternos são baixos e o sistema imunológico não está completamente desenvolvido, mas os animais são expostos a novos agentes infecciosos em condições de "stress". Isto aumenta o risco de infecções que poderia ser prevenido por vacinação. Pode encontrar-se uma situação semelhante em instalações de criação de gatos ou cães, em que a pressão infecciosa é elevada.

Objectivo da invenção 0 objectivo da presente invenção consiste em proporcionar meios que permitam a maturação acelerada do sistema imunológico de animais e humanos recém-nascidos.

Descrição pormenorizada da invenção

De acordo com a presente invenção, foi inesperadamente descoberto que é possível vacinar e/ou tratar de forma segura e eficiente animais neonatais, incluindo humanos, com vírus capazes de infectar células do animal neonatal, incluindo um humano, mas incapazes de se replicarem nessas células em progenitura virai infecciosa. Em particular, foi mostrado que o MVA, em particular MVA-BN e seus derivados (ver abaixo), pode ser administrado a recém-nascidos sem exibir quaisquer efeitos nocivos. A vacinação do animal com o vírus conduz a uma resposta imunológica específica contra o vírus utilizado para a vacinação e/ou a uma vacinação geral contra antigenes estranhos e antigenes tumorais, como 8 explicado abaixo mais pormenorizadamente a título exemplificativo. Além disso, o MVA utilizado de acordo com a presente invenção conduz a uma indução e/ou reforço da maturação do sistema imunológico, que está associado a um aumento do número de células dendríticas e factores como Interferões. A vacinação com o MVA utilizado de acordo com a presente invenção é possível mesmo que a formulação que é administrada ao animal não compreenda um adjuvante.

Em resumo, os vírus que são utilizados de acordo com a presente invenção (i) induzem uma resposta imunológica eficaz em neonatais, (ii) podem ser administrados sem necessidade de um adjuvante e (iii) não carregam o risco de subjugar o organismo.

De acordo com a presente invenção, o efeito protector é exercido durante pelo menos 5 dias, preferivelmente durante pelo menos 7, 14 ou 28 dias após a primeira vacinação.

Os vírus que são "capazes de infectar células" são vírus dotados, na superfície virai, de estruturas capazes de interagir com as células-hospedeiro numa extensão tal que o vírus, o pelo menos o genoma virai, fica incorporado na célula-hospedeiro. Apesar do MVA utilizado de acordo com a presente invenção ser capaz de infectar a célula-hospedeiro, é incapaz de se replicar em progenitura virai infecciosa nas células infectadas. No contexto da presente invenção, o termo "vírus incapaz de se replicar em progenitura virai infecciosa nessas células" refere-se a vírus cujo genoma é pelo menos parcialmente transcrito e traduzido em proteínas virais ou é mesmo replicado; no entanto, não é empacotado em partículas virais infecciosas. Assim, o MVA utilizado de acordo com a presente invenção é um vírus que conduz a infecções abortivas no hospedeiro. Podem ocorrer infecções abortivas por duas razões: de acordo com a primeira alternativa, uma célula pode estar 9 susceptível a infecção mas pode não ser permissiva para a multiplicação do vírus, por exemplo, devido ao facto de nem todos os genes virais necessários para a multiplicação do vírus nessa célula serem expressos e/ou estarem presentes no genoma virai. 0 vírus utilizado de acordo com a presente invenção em células humanas é o Vírus Vacínia Modificado Ancara (MVA), que é explicado mais pormenorizadamente abaixo. Uma infecção abortiva também pode resultar de infecção de células com vírus defeituosos sem um complemento completo de genes virais. Um exemplo de um desses vírus para células humanas é DISC-HSV1 (vírus Herpes simplex de um único ciclo incapacitado), isto é, um vírus Herpes simplex que está restringido a um único ciclo de infecção (Dilloo et al., Blood 1997, 8_9: 119-127). Este vírus não tem o gene para a glicoproteína H (gH) essencial, mas pode crescer para títulos elevados numa linha de células de complementação que expressa a gH. Em linhas de células não de complementação que são permissivas para o crescimento do vírus herpes, está restringido a um único ciclo de replicação, o que conduz à libertação de vírus não infeccioso. 0 termo "incapaz de se replicar" refere-se preferivelmente a vírus que não se replicam nas células do animal vacinado. No entanto, também pertencem ao âmbito da presente candidatura aqueles vírus MVA que exibem uma actividade de replicação residual muito pequena que é controlada pelo sistema imunológico imaturo do neonatal. 0 MVA de acordo com a presente invenção pode ser qualquer MVA que seja capaz de infectar células do animal mas incapaz de se replicar em progenitura virai infecciosa nessas células. Deve entender-se que um vírus que é capaz de infectar células de uma primeira espécie animal mas incapaz de se replicar em progenitura virai infecciosa nessas células pode comportar-se de forma diferente numa 10 segunda espécie animal. Por exemplo, para humanos, o MVA-BN e seus derivados (ver abaixo) são vírus capazes de infectar células do humano mas incapazes de se replicarem em progenitura virai infecciosa em células humanas. Os mesmos vírus podem replicar-se em galinhas, isto é, em galinhas, o MVA-BN pode não ser um vírus que seja incapaz de se replicar em progenitura virai infecciosa em células da galinha. O experimentado na área sabe quais são os vírus que devem ser escolhidos para uma espécie animal específica. Um teste que permite determinar se um vírus é capaz ou incapaz de se replicar num animal neonatal ou pré-natal é revelado no documento WO 02/42480 e utiliza a estirpe de ratinhos AGR129. Os resultados obtidos neste modelo de ratinhos são indicativos para humanos. Assim, o termo "incapaz de se replicar em progenitura virai infecciosa", tal como é utilizado na presente candidatura, corresponde ao termo "falha em replicar-se in vivo" utilizado para ratinhos no documento WO 02/42480. Apresentam-se abaixo mais pormenores deste teste. Os vírus de acordo com a presente invenção são preferivelmente capazes de se replicarem em pelo menos um tipo de células de pelo menos uma espécie animal. Assim, é possível amplificar o vírus antes da administração ao animal que se pretende vacinar e/ou tratar. A título exemplificativo refere-se o MVA-BN que pode ser amplificado em células CEF mas que é um vírus incapaz de se replicar em progenitura virai infecciosa no humano neonatal. Neste contexto, deve notar-se que vírus química ou fisicamente inactivados não têm todas as propriedades desta especificação preferida, uma vez que vírus inactivados são capazes de infectar células do animal neonatal, incluindo um humano, e incapazes de se replicarem em progenitura virai infecciosa no animal neonatal, incluindo um humano, mas estes vírus 11 são incapazes de se replicarem em pelo menos um tipo de células de pelo menos uma espécie animal.

Para células de mamífero, em particular para células humanas, o DNA vírus é vírus Vacínia Modificado Ancara (MVA). 0 vírus Vacínia Modificado Ancara (MVA) está relacionado com o vírus Vacínia, um membro do género Orthopoxvirus da família Poxviridae. 0 MVA foi gerado por 516 passagens em série em fibroblastos de embrião de galinha da estirpe Ancara do vírus vacínia (CVA) (para um artigo de revisão ver Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14 [1975]). Em consequências destas passagens de longa duração, no vírus MVA resultante foram deletadas cerca de 31 quilobases da sua sequência genómica e, em consequência, foi descrito como altamente restringido, quanto a células-hospedeiro, a células aviárias (Meyer, H., et al., J. Gen. Virol. T2, 1031-1038 [1991]). Foi mostrado, numa variedade de modelos animais, que o MVA resultante era significativamente avirulento (Mayr, A., & Danner, K. [1978] Dev. Biol. Stand. 4_1: 225-34). Adicionalmente, esta estirpe do MVA foi testada em ensaios clínicos como vacina para imunização contra a doença da varíola humana (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). Estes estudos envolveram mais de 120 000 humanos, incluindo pacientes de alto risco, e demonstrou que, em comparação com vacinas à base de Vacínia, o MVA tinha virulência ou infecciosidade decrescida mantendo boa imunogenicidade.

Estirpes preferidas de acordo com a presente invenção são MVA 575, depositada na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) com o número de depósito V00120707, e MVA-BN, depositada na mesma instituição com o número de depósito V000083008, e respectivos derivados. Se for 12 pretendido vacinar/tratar humanos, são particularmente preferidos MVA-BN e seus derivados.

As propriedades de estirpes do MVA particularmente preferidas, preferivelmente das estirpes mais preferidas para humanos, como MVA-BN e seus derivados, podem ser resumidas do modo seguinte: (i) capacidade de replicação reprodutiva em fibroblastos de embrião de galinha (CEF) e na linha de células BHK, mas sem capacidade de replicação reprodutiva na linha celular humana HaCat, (ii) falha em replicarem-se in vivo, (iii) indução de imunogenicidade mais elevada em comparação com a estirpe conhecida MVA 575 (ECACC V00120707) num modelo de provocação letal e/ou (iv) indução de pelo menos substancialmente o mesmo nivel de imunidade em regimes primários com vírus vacínia / reforço com vírus vacínia em comparação com regimes primários com DNA / reforço com vírus vacínia.

As estirpes do MVA preferidas para utilização de acordo com a presente invenção têm a propriedade (ii) de falha em replicarem-se no organismo a ser vacinado ou tratado e/ou no sistema de teste correspondente como explicado abaixo, e preferivelmente uma propriedade adicional das acima, mais preferivelmente duas propriedades adicionais das acima. São muito preferidas estirpes do MVA com todas as propriedades acima. Um exemplo de uma estirpe do MVA com todas as propriedades acima em humanos é MVA-BN. Derivados preferidos do MVA-BN são derivados que têm, adicionalmente à característica (ii), pelo menos uma das propriedades acima, mais preferivelmente pelo menos duas das 13 propriedades acima. São muito preferidos derivados do MVA-BN com todas as propriedades acima.

Quanto a informações pormenorizadas respeitantes aos ensaios utilizados para determinar se uma estirpe do MVA tem uma ou mais das caracteristicas acima (i) até (iv) refere-se o documento WO 02/42480. Esta publicação também revela como obter virus com as propriedades desejadas. Em particular, o documento WO 02/42480 fornece uma definição pormenorizada das caracteristicas do MVA-BN e de um derivado do MVA-BN e revela em pormenor os ensaios biológicos que são utilizados para determinar se uma estirpe do MVA é MVA-BN ou respectivo derivado. Por outras palavras, são reveladas no documento WO 02/42480 as caracteristicas do MVA-BN, a descrição de ensaios biológicos que permitem avaliar se uma estirpe do MVA é MVA-BN ou respectivo derivado e métodos que permitem obter MVA-BN ou respectivo derivado. Seguidamente resume-se o modo como o experimentado na área chega a estirpes do MVA com uma ou mais das caracteristicas acima e o modo como pode testar se uma dada estirpe do MVA tem uma ou mais das referidas caracteristicas e, assim, é um virus muito preferido de acordo com a presente invenção. Deve entender-se que o resumo seguinte não limita a relevância do documento WO 02/42480 para a presente candidatura quanto às informações seguintes. Ao invés, WO 02/42480 é aqui incorporado na sua totalidade por referência. O termo "incapaz de replicação reprodutiva" na linha de células HaCAT (Boukamp et ai., 1988, J. Cell. Biol. 106 (3): 761-71) é utilizado na presente candidatura como definido no documento WO 02/42480. Assim, um virus que é "incapaz de replicação reprodutiva" na linha de células HaCat é um virus que exibe uma razão de amplificação inferior a 1 na linha celular humana HaCat. 14

Preferivelmente, a taxa de amplificação do vírus utilizado como vector de acordo com a invenção é 0,8 ou inferior na linha celular humana HaCat. A "razão de amplificação" de um vírus é a razão entre o vírus produzido a partir de uma célula infectada (Saída) e a quantidade originalmente utilizada para inicialmente infectar as células (Entrada) ("razão de amplificação"). Uma razão de "1" entre a Saída e a Entrada define um estado de amplificação em que a quantidade de vírus produzido a partir das células infectadas é igual à quantidade inicialmente utilizada para infectar as células. O termo "derivados" dos vírus depositados em ECACC V00083008 refere-se preferivelmente a vírus que exibem essencialmente as mesmas características de replicação da estirpe depositada mas que exibem diferenças numa ou mais partes do seu genoma. Vírus com as mesmas "características de replicação" do vírus depositado são vírus que se replicam com razões de amplificação semelhantes às da estirpe depositada em células CEF e nas linhas de células BHK, HaLa, HaCat e 143B e que exibem uma replicação semelhante in vivo, determinada no modelo de ratinho transgénico AGR129 (ver abaixo). O termo "falha em replicar-se in vivo" é utilizado na presente candidatura como definido no documento WO 02/42480. Assim, esse termo refere-se a vírus que não se replicam em humanos e no modelo de ratinhos como explicado em WO 02/42480. Os ratinhos utilizados em WO 02/42480 são incapazes de produzir células B e T maduras (ratinhos AGR 129) . Em particular, o MVA-BN e seus derivados não matam ratinhos AGR129 num período de tempo de pelo menos 45 dias, mais preferivelmente em pelo menos 60 dias, muito preferivelmente em 90 dias após a infecção dos ratinhos com 107 pfu de vírus administradas intraperitonealmente. Preferivelmente, os vírus que exibem "falha em replicar-se 15 in vivo" são suplementarmente caracterizados por não ser possível recuperar nenhum vírus de órgãos ou tecidos dos ratinhos AGR129 45 dias, preferivelmente 60 dias e muito preferivelmente 90 dias após a infecção dos ratinhos com 107 pfu de vírus administradas intraperitonealmente.

Em vez dos ratinhos AGR129 pode utilizar-se qualquer outra estirpe de ratinho que seja incapaz de produzir células B e T maduras e que, como tal, esteja gravemente imunocomprometida e altamente susceptível a um vírus em replicação.

Os pormenores da experiência de provocação letal utilizada para determinar se uma estirpe do MVA tem "uma imunogenicidade mais elevada em comparação com a estirpe conhecida MVA 575" são explicados no documento WO 02/42480. Nesse modelo de provocação letal, ratinhos não vacinados morrem após a infecção com estirpes de vacínia competentes para replicação, como a estirpe Western Reserve L929 TK+ ou IHD-J. A infecção com vírus vacínia competentes para replicação é referida como "provocação" no contexto da descrição do modelo de provocação letal. Quatro dias após a provocação, os ratinhos são habitualmente mortos e determina-se o titulo virai nos ovários por ensaios comuns em placas utilizando células VERO. Determina-se o título virai para ratinhos não vacinados e para ratinhos vacinados com MVA-BN e seus derivados. Mais especificamente, o MVA-BN e seus derivados são caracterizados por, neste teste, após a vacinação com 102 TCID50/ml de virus, os títulos do vírus nos ovários serem reduzidos em pelo menos 70%, preferivelmente em pelo menos 80%, mais preferivelmente em pelo menos 90% em comparação com ratinhos não vacinados.

Numa especificação preferida, a utilização de MVA, em particular MVA-BN e seus derivados, é útil para administração primária/de reforço. Os vírus, em particular 16 estirpes do MVA que são muito preferivelmente utilizadas na presente invenção, como MVA-BN e seus derivados, bem como virus recombinantes correspondentes com sequências heterólogas, podem ser utilizados de modo eficiente primeiramente para iniciar e depois para reforçar respostas imunológicas em animais nativos, bem como em animais com uma imunidade pré-existente a poxvirus. Assim, o virus mais preferido de acordo com a presente invenção induz, pelo menos substancialmente, o mesmo nível de imunidade em regimes primários com vírus vacínia / de reforço com vírus vacínia em comparação com regimes primários com DNA / de reforço com vírus vacínia.

Um vírus vacínia, em particular uma estirpe do MVA, é considerado como indutor de pelo menos substancialmente o mesmo nível de imunidade em regimes primários com vírus vacínia / de reforço com vírus vacínia em comparação com regimes primários com DNA / de reforço com vírus vacínia se a resposta de CTL, medida num dos "ensaio 1" e "ensaio 2" revelados em WO 02/42480, preferivelmente em ambos os ensaios, for pelo menos substancialmente igual em regimes primários com vírus vacínia / de reforço com vírus vacínia em comparação com regimes primários com DNA / de reforço com vírus vacínia. Mais preferivelmente, a resposta de CTL após administração primária com vírus vacínia / de reforço com vírus vacínia é mais elevada em pelo menos um dos ensaios em comparação com regimes primários com DNA / de reforço com vírus vacínia. Muito preferivelmente, a resposta de CTL é mais elevada em ambos os ensaios.

O vírus utilizado de acordo com a presente invenção pode ser um MVA não recombinante, isto é, um vírus que não contém sequências de nucleótidos heterólogas. Um exemplo de um vírus vacínia não recombinante é MVA-BN e seus derivados. Alternativamente, o vírus pode ser um MVA 17 recombinante que contém sequências de nucleótidos adicionais que são heterólogas para o vírus. 0 termo "heterólogo", tal como utilizado na presente candidatura, refere-se a qualquer combinação de sequências de ácidos nucleicos que normalmente não se encontram intimamente associadas ao vírus na natureza; esse vírus também é denominado "vírus recombinante". A sequência de ácido nucleico heteróloga é preferivelmente seleccionada de uma sequência que codifica para pelo menos um antigene, epítopo antigénico, proteínas benéficas e/ou composto terapêutico. 0 termo "proteínas benéficas", tal como utilizado na presente candidatura, refere-se a quaisquer proteínas que ajudem a proteger um animal contra um antigene seleccionado de entre um antigene tumoral e antigene estranho, em que o antigene tumoral e o antigene estranho são diferentes dos antigenes associados ao vírus. Alternativamente e mais particularmente, as "proteínas benéficas" são activas no aumento do nível de factores activadores de células dendríticas e/ou activas no aumento do número de células dendríticas e/ou activas no aumento da produção e/ou teor celular de um interferão (IFN) ou IL-12. Assim, exemplos dessas proteínas benéficas são interferões, como IFN-alfa ou IFN-beta, IL-12, Flt-3-L e/ou GM-CSF.

Os epítopos antigénicos podem ser quaisquer epítopos para os quais faça sentido induzir uma resposta imunológica. Exemplos de epítopos antigénicos são epítopos de Plasmodium falciparum, Mycobacteria, vírus Influenza, de vírus seleccionados da família de Flavivírus, Paramixovírus, vírus da Hepatite, vírus da Imunodeficiência Humana ou de vírus causadores de febre hemorrágica, como Hantavírus ou Filovírus, isto é, vírus Ébola ou Marburg. Assim, por exemplo, se um MVA recombinante que expressa 18 epítopos heterólogos for utilizado para vacinar neonatais de acordo com a presente invenção, o resultado deste tratamento é não só uma vacinação geral devido à maturação acelerada do sistema imunológico mas também uma vacinação especifica contra o epitopo heterólogo expresso a partir do MVA heterólogo.

Um "composto terapêutico" codificado pelo ácido nucleico heterólogo no vírus recombinante pode ser, por exemplo, um ácido nucleico terapêutico, como um ácido nucleico anti-sentido, ou um péptido ou proteína com actividade biológica desejada. A inserção da seguência de ácido nucleico heteróloga é preferivelmente feita numa região não essencial do genoma do vírus. Alternativamente, a sequência de ácido nucleico heteróloga é inserida num sítio de deleção de ocorrência natural do genoma virai (para MVA revelado em PCT/EP96/ 02926). Métodos de como inserir sequências heterólogas no genoma virai, como um genoma de poxvírus, são conhecidos do experimentado na área. A presente invenção também descreve uma composição farmacêutica e uma vacina compreendendo MVA, por exemplo, para induzir uma resposta imunológica num corpo animal vivo, incluindo um humano. A composição farmacêutica pode geralmente incluir um ou mais transportadores, aditivos, antibióticos, conservantes, adjuvantes, diluentes e/ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis e/ou aprovados. Essas substâncias auxiliares podem ser água, solução salina, glicerol, etanol, agentes humedecedores ou emulsionantes, substâncias de tamponamento do pH ou afins. Transportadores adequados são, tipicamente, moléculas grandes metabolizadas lentamente, como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos 19 poliméricos, copolímeros com aminoácidos, agregados lipídicos ou afins.

Para a preparação de vacinas, o vírus, ou seus recombinantes, é convertido numa forma fisiologicamente aceitável. Esses métodos são conhecidos do experimentado na área. Para o MVA, a vacina pode ser preparada com base na experiência na preparação de vacinas de poxvírus utilizadas para vacinação contra a varíola (como descrito por stickl, H., et al. [1974] Dtsch. Med. Wschr. 99_, 2386-2392). Por exemplo, o vírus purificado é armazenado a -80°C com um título de 5 x 108 TCID50/ml formulado em Tris cerca de 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4. Para a preparação de doses de vacinas, por exemplo, 101 - 108 partículas do vírus, como MVA, são liofilizadas em 100 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) na presença de 2% de peptona e 1% de albumina humana numa ampola, preferivelmente uma ampola de vidro. Alternativamente, as doses de vacinas podem ser produzidas por liofilização em passos do vírus numa formulação. Esta formulação pode conter aditivos adicionais, como manitol, dextrano, açúcar, glicina, lactose ou polivinilpirrolidona, ou outros aditivos, como antioxidantes ou gás inerte, estabilizadores ou proteínas recombinantes (por exemplo, albumina do soro humano) adequados para administração in vivo. A ampola de vidro é seguidamente selada e pode ser armazenada entre 4°C e a temperatura ambiente durante vários meses. No entanto, desde que não haja necessidade, a ampola é armazenada preferivelmente a temperaturas inferiores a -20°C.

Para vacinação ou terapia, o liofilizado pode ser dissolvido em 0,1 até 0,5 ml de uma solução aquosa, preferivelmente soro fisiológico ou tampão Tris, e administrado sistémica ou localmente, isto é, parentericamente, intramuscularmente ou por qualquer outra 20 via de administração conhecida do técnico experimentado. O modo de administração, a dose e o número de administrações podem ser optimizados pelos experimentados na área de uma forma conhecida. O MVA utilizado de acordo com a presente invenção pode ser administrado por aplicação oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica e/ou subcutânea. Em animais pequenos, a inoculação para a imunização é preferivelmente feita parentericamente ou nasalmente, ao passo que, em animais maiores ou humanos, é preferida uma inoculação subcutânea, intramuscular ou oral. O MVA é preferivelmente administrado numa dose de 101 TCID50 (dose infecciosa de cultura de tecido) até 109 TCID50.

Como notado acima, o MVA, como MVA-BN e seus derivados, pode ser administrado numa quantidade terapeuticamente eficaz numa primeira inoculação ("inoculação primária") e numa segunda inoculação ("inoculação de reforço").

No contexto da presente invenção, o termo "animal" também abrange seres humanos. Mais geralmente, o animal é um animal vertebrado, preferivelmente um animal mamífero, incluindo um humano. Exemplos específicos de animais são animais de estimação, como cães, gatos, animais economicamente importantes, como vitelos, gado vacum, ovelhas, cabras, cavalos, porcos, e outros animais, como ratinhos, ratos. Para estas espécies animais e para humanos, os vírus MVA são os vírus preferidos. A invenção também pode ser utilizada para pássaros economicamente importantes, como perus, patos, gansos e galinhas, se forem utilizados vírus capazes de infectar as células do pássaro mas incapazes de se replicarem em progenitura virai infecciosa nessas células. 21 0 termo "animais domésticos", tal como utilizado na presente descrição, refere-se preferivelmente a animais domésticos mamíferos, mais preferivelmente a cães, gatos, vitelos, gado vacum, ovelhas, cabras, porcos, cavalos, veados. A título exemplificativo, o MVA, em particular MVA-BN e seus derivados, pode ser utilizado na forma de vacinas específicas, isto é, para induzir uma resposta imunológica que protege o recém-nascido vacinado contra doenças causadas por um vírus virulento pertencente ao mesmo grupo, família ou género virai do vírus que foi utilizado para a vacinação. A título exemplificativo, o MVA como definido acima, em particular MVA-BN e seus derivados, pode ser utilizado para vacinar humanos recém-nascidos contra infecções causadas por poxvírus, em particular contra a varíola. 0 MVA, em particular MVA-BN e seus derivados, também pode ser utilizado para vacinar animais vertebrados contra infecções causadas por poxvírus de importância veterinária. 0 vírus utilizado para a vacinação pode ser um vírus não recombinante, como MVA-BN ou seus derivados, ou um vírus recombinante com genes no genoma virai que não se encontram naturalmente nesse genoma. 0 vírus recombinante tem genes adicionais que ajudam a estimular a resposta imunológica. Exemplos deste tipo de genes são genes de citoquinas e genes de interferões.

Suplementarmente, a título exemplificativo, os neonatais podem ser vacinados com um vírus recombinante que tem uma sequência de ácido nucleico heteróloga como definida acima para induzir uma resposta imunológica contra a sequência de aminoácidos expressa pela sequência de ácido nucleico heteróloga. A título exemplificativo, a sequência de ácido nucleico pode codificar para um antigene ou epítopo antigénico como definido acima. Exemplos de vírus 22 recombinantes são MVAs recombinantes, em particular MVA-BN recombinante ou respectivo derivado, compreendendo um ácido nucleico heterólogo que codifica para antigenes de (i) virus diferentes do MVA, como HIV-1, HIV-2, virus Dengue, Virus do Nilo Ocidental, virus da Encefalite japonesa, virus do sarampo, (ii) antigenes tumorais, (iii) bactérias, (iv) fungos. Se o antigene expresso a partir do virus recombinante for, por exemplo, um antigene do HIV, é possível utilizar o vírus recombinante para induzir uma resposta imunológica no neonatal vacinado contra o HIV e para prevenir a SIDA. Num sentido mais lato, o vírus recombinante que expressa o antigene ou epítopo antigénico é utilizado para induzir uma resposta imunológica contra o agente de onde deriva a sequência heteróloga e/ou contra o agente que compreende o antigene ou epítopo antigénico.

De acordo com a invenção, em terceiro lugar, foi inesperadamente descoberto que vírus capazes de infectar as células do animal neonatal, incluindo um humano, mas incapazes de se replicarem em progenitura virai infecciosa no animal neonatal, incluindo um humano, podem ser utilizados para a preparação de um medicamento destinado a proteger um animal recém-nascido, incluindo um humano, contra um antigene seleccionado de entre um antigene tumoral e antigene estranho, em que o antigene tumoral e/ou o antigene estranho são diferentes dos antigenes associados ao vírus.

De acordo com a invenção, recém-nascidos vacinados com MVA, como MVA-BN e seus derivados, estão protegidos contra uma provocação com antigenes estranhos, como agentes infecciosos. Assim, de acordo com a presente invenção, o MVA é uma vacina geral para recém-nascidos, isto é, por vacinação de recém-nascidos com MVA, o sistema imunológico dos recém-nascidos torna-se mais competente para lidar com 23 antigenes estranhos, como vírus. Na secção de exemplos, isto é exemplificado para vacinação com MVA e provocação subsequente com vírus Herpes simplex do tipo 1. Assim, se o MVA for utilizado para a vacinação de recém-nascidos, os animais vacinados ficam mais protegidos contra antigenes estranhos do que animais não vacinados no período de tempo crítico até ser estabelecido um sistema imunológico funcional e maduro.

De acordo com a presente invenção, "o antigene tumoral e/ou o antigene estranho são diferentes dos antigenes associados ao vírus". Este termo deve ser interpretado no sentido de que, de acordo com a invenção, essencialmente não se pretende utilizar o MVA para induzir uma resposta imunológica contra o próprio vírus. Ao invés, utiliza-se o vírus para induzir uma resposta imunológica ou, pelo menos, uma estimulação imunológica geral que protege o hospedeiro contra antigenes estranhos e antigenes tumorais, respectivamente, que não estão associados ao vírus. O termo "antigenes associados ao vírus" refere-se a epítopos e antigenes da partícula virai e a antigenes e epítopos na superfície de uma célula infectada com o vírus que resultam da expressão do genoma virai.

No contexto desta especificação, o termo "antigenes estranhos" refere-se a quaisquer antigenes e epítopos que, naturalmente, não são uma parte ou um componente do corpo animal. Antigenes estranhos são, especialmente, antigenes e epítopos de agentes infecciosos e toxinas. Agentes infecciosos típicos são vírus tais como vírus herpes, retrovírus, vírus da raiva, rabdovírus, adenovírus; bactérias tais como Salmonella, Mycoplasma, Meningococcus, Hemophilus; priões ou fungos. A invenção é interessante não só para vacinar animais contra antigenes estranhos mas, numa especificação 24 alternativa, também é adequada para vacinar contra antigenes tumorais. "Antigenes tumorais" são antigenes associados a certas doenças tumorais. Antigenes tumorais são, muito frequentemente, antigenes codificados pelo genoma do hospedeiro que desenvolve o tumor. Assim, num sentido estrito, antigenes tumorais não são antigenes estranhos. No entanto, antigenes tumorais encontram-se em quantidades significativas em tumores, ao passo que a quantidade de antigenes tumorais em tecidos normais é significativamente mais baixa e, muito frequentemente, não se encontram nenhuns antigenes tumorais em tecido normal. Exemplos de antigenes tumorais são conhecidos do experimentado na área e incluem, por exemplo, os antigenes MAGE. 0 MVA é eficaz contra entes antigenes tumorais uma vez que a vacinação de animais conduz a uma activação e/ou maturação acelerada do sistema imunológico, que então pode conduzir à destruição de células tumorais. 0 termo "proteger contra um antigene" refere-se ao desenvolvimento de uma resposta imunológica que é dirigida contra o antigene estranho ou tumoral. Se o antigene estranho for um agente infeccioso, o hospedeiro é protegido contra esse agente, isto é, o hospedeiro desenvolve uma resposta imunológica contra esse antigene. Em consequência, a infecção com o agente infeccioso conduz a uma doença menos grave ou a ausência de doença. 0 termo "proteger" não deve ser entendido no sentido de haver sempre uma protecção de 100% contra o antigene estranho ou tumoral. Ao invés, o termo "protecção", tal como utilizado na presente candidatura, refere-se a qualquer efeito benéfico que ajuda o animal a lidar com o antigene estranho e o antigene tumoral, respectivamente.

De acordo com a presente invenção, esse efeito protector é exercido durante pelo menos 5 dias, 25 preferivelmente durante pelo menos 7, 14 ou 28 dias após a primeira vacinação. Por outras palavras, o animal vacinado e/ou tratado é protegido, por exemplo, contra um antigene estranho se o animal contactar com esse antigene após 5, 7, 14 e 28 dias, respectivamente.

No contexto da presente invenção, o efeito da vacinação de recém-nascidos com o MVA pode ser explicado pela indução ou reforço da maturação do sistema imunológico e/ou pela activação do sistema imunológico. No contexto da presente invenção, o termo "indução ou reforço da maturação do sistema imunológico" refere-se, inter alia, ao aumento acelerado de células dendriticas ou seus precursores em vacinados relativamente a controlos. Os termos "aceleração da maturação" do sistema imunológico e "reforço da maturação" do sistema imunológico são utilizados nesta descrição de forma intermutável. A "activação do sistema imunológico" caracteriza-se pela expressão, na superfície de células, de moléculas e hormonas que facilitam a interacçâo célula/célula ou tráfego e/ou pela secreção dessas moléculas e hormonas pelas células. Receptores específicos recebem estes sinais e respondem. Marcadores da activação são, inter alia, Flt3-L, IL-12, IFN-alfa, MHC-II e CD8, em particular CD8alfa (ver abaixo). 0 desenvolvimento/maturação acelerado do sistema imunológico está correlacionado com um aumento do nivel de factores activadores e/ou mobilizadores de células dendriticas (DCs), ou suas células precursoras, e/ou com um aumento do número de células dendriticas e suas células precursoras e/ou com um aumento da produção e/ou teor celular de um interferão ou IL-12. Um exemplo de células precursoras de DCs que são induzidas pelo MVA são precursores de DCs plasmocitóides, que são muito 26 importantes para a defesa contra infecções virais e que parecem produzir IFN α/β.

Mais especificamente, o reforço da maturação do sistema imunológico é preferivelmente definido por um aumento de pelo menos 2 vezes de marcadores de superfície presentes em DCs, como MHC-II, CD40 e/ou CD80/86. Preferivelmente, esse aumento pode ser medido no sangue. Outros marcadores para caracterizar um reforço da maturação do sistema imunológico são Flt3-L, IL-12, IFN-alfa, MHC-II e CD8a (ver abaixo). Além disso, a maturação acelerada do sistema imunológico está preferivelmente correlacionada com um aumento de pelo menos 1,5 vezes, preferivelmente um aumento de pelo menos 2,0 vezes do número de células positivas para CDllc no sangue e/ou no baço 7 dias após a administração de MVA-BN a animais recém-nascidos em comparação com animais de controlo que não receberam MVA-BN. Além disso, o reforço da maturação do sistema imunológico pode estar preferivelmente correlacionado com um aumento de pelo menos 1,5 vezes, mais preferivelmente um aumento de pelo menos 2,0 vezes da concentração de Flt3-L dois dias após a vacinação de neonatais com vírus de acordo com a presente invenção em comparação com controlos de idades correspondentes.

Neste contexto deve notar-se que há uma associação entre o fenótipo e a função de populações de DCs murinas e humanas, que podem ser caracterizadas pelos seus fenótipos de superfície (Hochrein et al., 2002, Hum. Immunol. 63: 1103). Podem detectar-se DCs no sangue utilizando citometria de fluxo empregando uma gama de marcadores de superfície (MacDonald et al., 2002, Blood 100: 4512) que também permitem identificar populações específicas de DCs, como DCs plasmocitóides (Dzionek et al., 2002, Hum. Immunol. 63_: 1133; Dzionek et al., 2000, J. Immunol. 165: 6037). Utilizando técnicas semelhantes, também podem 27 detectar-se DCs noutros tecidos humanos (Summers et ai., 2001, Am. J. Pathol. 159: 285).

De acordo com a presente invenção, os vírus como definidos acima também poderão ser utilizados para tratar animais neonatais com a finalidade de aumentar o nível de factores activadores e/ou mobilizadores de células dendríticas (DCs), ou suas células precursoras, e/ou aumentar o número de células dendríticas e suas células precursoras e/ou aumentar a produção e/ou teor celular de um interferão ou IL-12. Foi demonstrado que, após vacinação com MVA-BN, as células dendríticas plasmocitóides produzem significativamente mais IL-12 e têm uma produção acrescida de IFN-alfa e regulação positiva de MHC-II e CD8a. O aumento de IL-12 após a administração dos vírus utilizados de acordo com a presente invenção é preferivelmente 2 vezes, mais preferivelmente 100 vezes, 500 vezes, 1000 vezes, 2500 vezes ou 5000 vezes. O aumento da concentração de Flt3-L dois dias após a vacinação de neonatais com MVA, muito preferivelmente com MVA-BN ou seus derivados, é preferivelmente 1,5 vezes, mais preferivelmente 2,0 vezes em comparação com controlos de idades correspondentes. O termo "activação de células dendríticas ou seus precursores" refere-se à maturação de DCs em células apresentadoras de antigenes por fases celulares mal definidas conduzidas por hormonas e estímulos. Os intermediários de DCs são denominados precursores. Estas DCs imaturas atingem a periferia. Diferentes estímulos (antigénicos) activam DCs. Marcadores da activação que são regulados positivamente em células dendríticas activadas são, inter alia, Flt3-L, IL-12, IFN-alfa, MHC-II e CD8a (ver abaixo).

Foi notado que hormonas como GM-CSF conduzem a DCs mais imaturas na periferia. Uma vez que o GM-CSF conduz a mais 28 precursores de DCs na medula óssea, sangue e órgãos periféricos (e as células têm de se mover para aí) , este fenómeno foi denominado "mobilização de células dendríticas ou seus precursores". Esta definição também é utilizada na presente descrição.

Em consequência, a vacinação de animais, incluindo um humano, é especialmente útil se for pretendido aumentar o nível de factores activadores de células dendríticas (DCs), ou suas células precursoras, e/ou aumentar o número de células dendríticas, ou suas células precursoras, e/ou aumentar a produção e/ou teor celular de um interferão ou IL-12 .

Factores activadores de células dendríticas compreendem, inter alia, Flt3-L (Lyman et al., Cell 1993, 75: 1157-1167) e GM-CSF. Interferões típicos de acordo com a presente invenção são IFN-alfa e IFN-beta. Os vírus utilizados de acordo com a presente invenção induzem Flt3-L, e presume-se que alguns dos efeitos benéficos observados se devem a essa indução.

No contexto da presente candidatura, um animal ou humano recém-nascido é definido como um animal ou humano que ainda não tem um sistema imunológico maduro. Ao longo desta especificação, os termos "animal recém-nascido" e "animal neonatal" são utilizados como sinónimos. Um sistema imunológico maduro caracteriza-se pela capacidade para activar completamente o sistema imunológico inato e pelo facto de todas as funções e produtos conhecidos de células T e B estarem operacionais, em particular isotipos de imunoglobulinas tais como IgA e IgE. Assim, um sistema imunológico imaturo caracteriza-se por um número baixo de células T, células B e células dendríticas relativamente a adultos, por uma produção de IFN que é baixa em comparação com adultos e pelo facto dos órgãos linfóides secundários 29 não estarem completamente maduros. Mais especificamente, um "neonatal" ou "recém-nascido" no contexto da presente invenção pode ser definido como um animal lactente com um número de células CD4 + esplénicas que é preferivelmente pelo menos 2 vezes, mais preferivelmente pelo menos 20 vezes, mais preferivelmente pelo menos 200 vezes, mais preferivelmente pelo menos 2000 vezes, muito preferivelmente pelo menos 20 000 vezes mais baixo do que o número médio de células CD4+ esplénicas em adultos.

Em ratinhos, o sistema imunológico está maduro às 4 semanas de idade. Em humanos, a maturidade é atingida provavelmente aos 6 meses até 1 ano. Em gatos e cães, o sistema imunológico está maduro habitualmente aos 6 meses de idade, em vitelos, ovelhas e porcos às 4-12 semanas de idade. A vacinação com MVA é preferivelmente feita durante o período de tempo antes do sistema imunológico estar maduro. No entanto, uma vez que a maturidade se desenvolve quase exponencialmente após o nascimento, é muito preferido proceder à vacinação com MVA tão cedo quanto possível após o nascimento. Uma vez que, em todos os animais domésticos relevantes e em humanos, o sistema imunológico está maduro não antes das 4 semanas após o nascimento, é geralmente preferível que a vacinação com MVA seja feita preferivelmente num período de 4 semanas após o nascimento, mais preferivelmente em 2 semanas após o nascimento, ainda mais preferivelmente numa 1 semana após o nascimento, muito preferivelmente em 3 dias após o nascimento. Estes termos gerais são aplicáveis a todos os animais domésticos importantes, em particular a todos os animais domésticos mamíferos importantes, incluindo humanos. O experimentado na área estará ciente do facto de mesmo animais mais velhos poderem ser considerados recém-nascidos/neonatais no contexto da presente invenção e de, em consequência, a 30 vacinação também poder ser realizada com êxito em animais mais velhos quando o sistema imunológico ainda não estiver maduro às 4 semanas após o nascimento. Assim, em humanos, a vacinação pode ser realizada num período de 6 meses após o nascimento, mais preferivelmente em 3 meses após 0 nascimento, mais preferivelmente em 2 meses após 0 nascimento, mais preferivelmente em 4 semanas após 0 nascimento, mais preferivelmente em 2 semanas após 0 nascimento, ainda mais preferivelmente numa 1 semana após 0 nascimento, muito preferivelmente em 3 dias após 0 nascimento. A título exemplificativo, uma vez que os melhores efeitos do MVA como vacina geral são observados se o vírus for administrado a um sistema imunológico imaturo, podem ser vacinados animais pré-natais, incluindo humanos. A vacinação pré-natal pode ser desejável em animais economicamente importantes, como gado vacum ou porcos. Se a placenta deixar passar o vírus, o pré-natal pode ser vacinado simplesmente por vacinação do animal materno. Assim, a vacinação do animal materno para vacinar o pré-natal é particularmente promissora num animal com uma placenta endoteliocorial, como cães, gatos, ratos e ratinhos, ou com uma placenta hemocorial, como primatas, incluindo humanos. Em animais com uma placenta corioepitelial, como gado vacum e ovelhas, ou com uma placenta sindesmocorial, como porcos e cavalos, a vacinação de pré-natais pode ser realizada por administração no útero. Obviamente, este modo de administração também pode ser empregue para um animal com uma placenta endoteliocorial ou hemocorial.

Uma vez que o MVA conduz a uma maturação acelerada do sistema imunológico e uma vez que o MVA é, consequentemente, útil como vacina geral, os animais 31 vacinados ficam protegidos contra uma variedade de doenças. Mais especificamente, o MVA pode ser utilizado para vacinar gatos para proporcionar bem-estar geral e contra herpes felina ou peritonite infecciosa felina. 0 MVA pode ser utilizado em cães para proporcionar bem-estar geral e contra doenças (virais) associadas ao tracto respiratório. 0 MVA pode ser utilizado em porcos para proporcionar bem-estar geral e contra infecções por Hemophilus ou Mycoplasma, especialmente em porcos na engorda.

Como notado a titulo exemplificativo, o MVA pode ser utilizado em recém-nascidos ou animais pré-natais para proteger esse animal contra um antigene estranho e/ou um antigene tumoral, em que o antigene tumoral é diferente dos antigenes associados ao virus utilizado para a vacinação. No entanto, esta aplicação não se restringe a animais recém-nascidos e pré-natais. Ao invés, isto pode ser feito para animais de todas as idades, pois também é possível observar um efeito benéfico em animais adultos. Assim, o MVA, em particular MVA-BN e seus derivados, é útil para proteger um animal, incluindo um humano, contra um antigene seleccionado de entre um antigene tumoral e antigene estranho, em que o antigene tumoral e/ou o antigene estranho são diferentes dos antigenes associados ao vírus. Como notado acima, o MVA é capaz de infectar células do animal mas é incapaz de se replicar em progenitura virai infecciosa nessas células. Todas as informações, definições, incluindo a definição da duração do efeito protector, e exemplos apresentados para neonatais também se aplicam para adultos.

Em contraste com recém-nascidos, o sistema imunológico de animais adultos já amadureceu. Ainda assim, poderá acontecer que o sistema imunológico esteja enfraquecido devido a certas doenças ou simplesmente devido à idade do 32 animal. Especialmente em pessoas imunocomprometidas e em pessoas mais idosas, a administração do MVA ao animal pode exercer um efeito benéfico, inter alia, aumentando o nivel de factores activadores e/ou mobilizadores de células dendriticas (DCs), ou suas células precursoras, e/ou aumentando o número de células dendriticas, ou suas células precursoras, e/ou aumentando a produção e/ou teor celular de um interferão ou IL-12. Assim, mesmo em animais adultos, a administração de MVA pode conduzir a uma competência acrescida do sistema imunológico para lidar com antigenes estranhos e/ou antigenes tumorais. Por outras palavras, apesar de não fazer parte da invenção reivindicada, o MVA é útil para activar o sistema imunológico em geral. A invenção também diz respeito ao MVA para a preparação de um medicamento a ser administrado a um animal neonatal, incluindo um humano, cujo medicamento aumenta o nivel de factores activadores de células dendriticas e/ou aumenta o número de células dendriticas e/ou aumenta a produção e/ou teor celular de um interferão (IFN) ou IL-12. Todas as definições apresentadas acima para as outras especificações também são aplicáveis à presente especificação. De acordo com esta especificação, essencialmente a invenção não pretende induzir uma protecção contra antigenes estranhos e/ou antigenes tumorais. Ao invés, esta especificação pretende tratar estados e doenças caracterizados por um nivel baixo de factores activadores de células dendriticas e/ou por um número insuficiente ou demasiado baixo de células dendriticas e/ou por uma baixa produção e/ou teor celular de um interferão (IFN) ou IL-12. Assim, de acordo com esta especificação, o tratamento com MVA pode proteger contra alergias ou doenças autoimunes. Mais uma vez, este tratamento é particularmente promissor se o MVA for administrado a animais recém-nascidos. 33 A título exemplificativo, o MVA, em particular MVA-BN e seus derivados, é particularmente útil para induzir respostas imunológicas em animais imunocomprometidos, por exemplo, macacos (CD4 < 400/μ1 de sangue) infectados com SIV, ou em humanos imunocomprometidos. 0 termo "imunocomprometido" descreve o estado do sistema imunológico de um indivíduo que exibe somente respostas imunológicas incompletas ou que tem eficiência reduzida na defesa contra agentes infecciosos. A título exemplificativo, o MVA pode ser utilizado num método para proteger um animal, incluindo um humano, contra um antigene seleccionado de entre um antigene tumoral e antigene estranho por administração de um vírus de acordo com a presente invenção, em particular vírus Vacínia Modificado Ancara (MVA), em que o antigene tumoral e/ou o antigene estranho são diferentes dos antigenes associados ao vírus.

Adicionalmente, a título exemplificativo, o MVA pode ser utilizado num método para o tratamento de um animal, incluindo um humano, para aumentar o nível de factores activadores de células dendríticas e/ou para aumentar o número de células dendríticas e/ou aumentar a produção e/ou teor celular de um interferão (IFN) ou IL-12, que compreende a administração de um vírus Vacínia Modificado Ancara (MVA).

Resumo da Invenção

Utilização de Vírus Modificado Ancara (MVA) para a preparação de um medicamento destinado à vacinação ou tratamento de um animal neonatal, incluindo um humano, em que o MVA é capaz de infectar as células do animal neonatal, incluindo um humano, mas é incapaz de se replicar 34 em progenitura virai infecciosa no animal neonatal, incluindo um humano, em que o tratamento induz ou reforça a maturação do sistema imunológico.

Utilização como acima, em que a estirpe do MVA é MVA-BN, depositada na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) com o número de depósito V00083008, e respectivos derivados.

Utilização como acima, em que o MVA é administrado por aplicação oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica e/ou subcutânea.

Utilização como acima, em que o MVA é administrado numa quantidade terapeuticamente eficaz numa primeira inoculação ("inoculação primária") e numa segunda inoculação ("inoculação de reforço").

Utilização como acima, em que o MVA é administrado ao animal, incluindo um humano, numa quantidade de pelo menos 101 TCID50 (dose infecciosa de cultura de tecido).

Utilização como acima, em que o genoma do MVA compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico heteróloga.

Utilização como acima, em que a sequência de ácido nucleico heteróloga é seleccionada de uma sequência que codifica para pelo menos um antigene, epitopo antigénico e/ou um composto terapêutico.

Utilização como acima, em que a vacinação ou tratamento é utilizado para induzir ou reforçar a maturação e/ou activação do sistema imunológico.

Utilização como acima, em que o tratamento é utilizado (i) para aumentar o nivel de factores activadores e/ou mobilizadores de células dendríticas, ou suas células precursoras, (ii) para aumentar o número de células dendríticas, ou suas células precursoras, ou (iii) para 35 aumentar a produção e/ou teor celular de um interferão (IFN) ou IL-12.

Utilização como acima, em que o factor activador de células dendríticas é Flt3-L e/ou GM-CSF.

Utilização como acima, em que o interferão é IFNa e/ou IFNp.

Descrição Breve das Figuras

Figura IA: Ratinhos recém-nascidos foram injectados uma vez, num periodo de 24 - 48 horas após o nascimento, com 106 p.f.u. de MVA ou DISC HSV-1 ou foram tratados com soro fisiológico (NaCl) como controlos. Aos 7 dias de idade utilizou-se CDllc, um marcador pan-DCs, para determinar estas células em sangue periférico por citometria de fluxo. Apresentam-se a média e desvio padrão de 3 até 5 experiências.

Figura 1B: Experiência como na Fig. IA. No entanto, as células CDllc foram determinadas no baço por citometria de fluxo.

Figura 1C: Experiência como na Fig. IA. No entanto, as células CDllc foram determinadas em fluido peritoneal por citometria de fluxo.

Figura 2: Ratinhos foram vacinados com MVA-BN como indicado na coluna da esquerda. Passadas duas semanas, determinou-se, por citometria de fluxo, a percentagem de células simplesmente positivas CDllc+ e duplamente positivas CDllc+/CD8+ no baço e no sangue. 36

Figura 3: Ratinhos recém-nascidos foram injectados com MVA ou NaCl como controlo no dia um e no dia 5 de idade. No dia 8 determinou-se Flt3-L murina no soro destes ratinhos por ELISA, os valores estão apresentados em pg/ml.

Figura 4: Ratinhos recém-nascidos foram injectados uma vez, num periodo de 24 - 48 horas após o nascimento, com 106 p.f.u. de MVA ou foram tratados com NaCl como controlos. Aos 7 dias de idade, todos os ratinhos foram expostos a 100 x LD50 da estirpe F do HSV-1. Monitorizou-se o número de animais sobreviventes durante 21 dias.

Figura 5: Ratinhos foram tratados como na Fig. 4. Os dados representam 9 experiências de provocação diferentes com 100 LD5o de HSV-1. Nenhum dos animais de controlo sobreviveu à provocação.

Figura 6: Sobrevivência de ratinhos adultos vacinados, no primeiro dia de vida, com MVA-BN após uma provocação letal com vacínia. Três ninhadas de 6 crias com 1 dia de idade (18 ratinhos) foram vacinadas com MVA-BN (2,5 x 107 TCID50) e, às 4 semanas (ratinhos adultos), foram provocadas com uma dose letal de vacinia: a vacinação com MVA-BN induziu claramente uma imunidade protectora em ratinhos neonatais, que durou até à idade adulta.

Exemplos

Exemplo 1 (i) MVA-BN e DISC-HSV induzem DCs dos fenótipos CDllc+ e CD8+ em animais recém-nascidos 37

Primeiro conjunto de experiências. Ratinhos recém-nascidos são naturalmente imunodeficientes porque o sistema de IFNs não está maduro. 0 número e estado de activação de DCs, os melhores produtores de IFNs presentemente conhecidos, não foram analisados. As DCs podem ser induzidas in vitro, bem como in vivo, por uma variedade de estímulos. Nestes estudos testou-se se uma replicação controlada de MVA-BN poderia induzir DCs, e analisámos o seu fenótipo. Grupos de ratinhos foram injectados com 106 unidades formadoras de placas (p.f.u.) de MVA-BN ou solução salina apenas num período de 1 - 2 dias após o nascimento e, nalguns casos, 5 dias após o nascimento. Analisaram-se células do sangue e do baço de ratinhos individuais de ambos os grupos por FACS e compararam-se os dados.

Os dados de 7 até 8 ratinhos individuais indicaram que o tratamento com MVA-BN aumentou células CDllc+ 2-3 vezes acompanhado de expressão acrescida de MHC II e presença aumentada de células T do tipo CD4 ou CD8. É interessante notar que CD19/54, um marcador para células B maduras, diminuiu, indicando que estas células emigraram em órgãos diferentes do baço ou que precursores de células B foram recrutados precocemente para outras linhagens, especialmente DCs do fenótipo plasmocitóide que têm marcadores iniciais para células B (B220).

Os dados das três experiências diferentes indicaram reprodutibilidade e diferenças significativas. Experiências realizadas com DISC-HSV-1, uma vacina virai diferente controlada quanto à replicação, revelaram que induz quantidades semelhantes de células CDllc+ após iniciação neonatal.

Os resultados estão resumidos nas Figs. 1A-C.

Para investigar suplementarmente subpopulações de DCs no sangue e baço e analisar o efeito a longo prazo do 38 tratamento com MVA-BN, analisaram-se células no sangue e baço às 2 semanas de idade. Nesta altura, os animais tratados tinham cerca de duas vezes o número de células CDllc+ no baço relativamente à uma semana de idade, mas um único tratamento com o vírus na altura do nascimento conduziu a um número aumentado em 3 vezes destas células no baço 2 semanas mais tarde (Fig. 2) . Observaram-se efeitos semelhantes no sangue, com a excepção de CDllc+/CD8a+ terem sido cerca de 4 vezes mais elevadas. Um único tratamento com MVA-BN aos 7 dias após o nascimento conduziu a um aumento de CDllc+/CD8a+ de 13 para 40 vezes, com um efeito menos dramático nas células CDllc+. Como esperado, duas vacinações na altura do nascimento e no dia 7 exerceram um efeito significativo em células CDllc+. Os vários efeitos estão apresentados na Figura 2.

Segundo conjunto de experiências. Ratinhos de uma semana de idade que foram vacinados na altura do nascimento com 2,5 x 107 TCID50 de MVA-BN exibiram uma composição diferente de populações de células imunologicamente relevantes no baço e no sangue relativamente a ratinhos de controlo (Tabela 1) . No sangue observou-se um aumento da população de linfócitos positivos para CD8, bem como um aumento do número de células NK. O número de células positivas para CDllc foi cerca de 3 vezes mais elevado do que em controlos, e a percentagem de células B (células duplamente positivas para B220 e CD19) diminuiu significativamente. No baço, o número total de células não diferiu entre animais imunizados e controlos. Em contraste com o sangue, o baço de animais vacinados tinha mais linfócitos T positivos para CD4 do que dos controlos, e o número de células NK não aumentou. De modo semelhante ao sangue, o número relativo de linfócitos positivos para CD8 aumentou e o número de células B diminuiu. A percentagem de 39 células positivas para CDllc foi cerca de 3 vezes mais elevada do que nos controlos. Primeiramente reconhecemos uma diferença na percentagem de células dendriticas no dia 5 após a vacinação com MVA-BN, quando o número de células positivas para CDllc no baço de 4 controlos não tratados foi 3,6%, em comparação com 4,8% em 4 ratinhos vacinados com MVA-BN. A mesma quantidade de MVA-BN inactivado por UV não causou nenhuma alteração significativa nas populações de células após a vacinação de ratinhos neonatais em comparação com controlos (dados não mostrados). A dose da vacinação inicial foi escolhida arbitrariamente. Após titulação da inoculação, seleccionámos uma dose padrão de 2,5 x 106 TCID5o para a vacinação (10 vezes inferior à da experiência inicial). A esta dose foram induzidos números máximos de DCs (Tabela 2).

Tabela 1. Alterações induzidas em células do sangue e do baço em ratinhos recém-nascidos 1 semana após a imunização com 2,5 x 107 TCID50 de MVA-BN

Parâmetro 0 O NaCl Sangue MVA-BN P* NaCl Baço MVA-BN P* Total de células x 10b 17,9+1,9 24,1+2,6 0,105 % CDllc 5, 4±1,3 18,6±1,5 0,001 2,8±0,1 7,9+0,8 0,001 %CDllc/CD8a 0,5+0,1 2,7±0, 3 0,001 1,1+0,1 4,6+0,7 0,002 %CD4/CD3 16, 9+1,1 16,1+1,5 0,999 4,8+0, 3 8,1+1,5 0,004 %CD8a/CD3 6, 0+0, 9 10,3±0,9 0,002 4,7+0,3 8,4+1,1 0,002 %NK1,1/DX5 16,4±1,2 24,4+3,3 0,032 2,5+0,3 2,4+0,2 0,862 %CD19/B220 22,3±0,5 8,4+0,8 0,001 16,2+1,3 8, 6+0,9 0,004 * Teste U de Mann-Whitney 40

Tabela 2. Indução de células positivas para CDllc no baço de ratinhos de tipo selvagem com 1 dia de idade e ratinhos com destruições dirigidas para genes num período de 7 dias após tratamento com MVA

Estirpe do dose de MVA controlos MVA-BN %CDllc razão ratinho i—3 O 1—1 σ %CDllc tipo selvagem3 2,5x10' 2, 8 7,9 2,8 tipo selvagem 2,5xl06 2,1 11, 9 5, 6 tipo selvagem 2,5xl05 2,5 6, 6 2, 6 RAGb 2,5xl07 4,2 5,4 1,3 AG12 9C 2,5xl03 2, 6 2,7 1,0 3 Tipo selvagem = ratinhos C57BL/6 ou 129 Sv/Ev. b RAG Deleção em ratinhos em gene activador da recombinação (isto é, sem células T e B funcionais). 3 AG129 Destruições dirigidas a genes de receptores de IFN do Tipo I (IFN- α e β) e Tipo II (IFN—γ) . (ii) MVA-BN induz preferencialmente células dendríticas plasmocitóides (pDCs)

De acordo com outros autores, células positivas para CDllc que também expressaram CD45RA ou CD45R foram consideradas como pDCs (Asselin-Paturel et al., 2001, Nat. Immunol. 12_: 1144) . Foi perguntado se o MVA-BN induziria um aumento de pDCs. Realizou-se outra experiência na qual também se analisaram positivos para CD45RA ou CD45R ou CDllc. A percentagem de células duplamente positivas para CDllc e CD45R foi significativamente mais elevada em ratinhos tratados com MVA-BN (5,6 ± 0,7%) do que em ambos os grupos de controlo (não tratado 3,0 ± 0,3%, p=0,01; MVA-BN inactivado por UV 3,0 ± 0,2%, p=0,006; teste U de Mann-Whitney). 41 (iii) Ratinhos neonatais tratados com MVA-BN têm níveis elevados de Flt3-L no soro 0 Flt3-L é um factor hematopoiético que conduz a níveis aumentados de DCs em animais adultos. Em humanos e, possivelmente, em ratinhos, a fonte mais rica deste factor são células T activadas. Para determinar se os números elevados de DCs poderiam resultar de Flt3-L induzido, soro de ratinhos tratados com MVA-BN foi comparado com soro de animais pseudo-tratados quanto à presença deste factor. Os animais tratados nos dias 2 e 5 tinham duas vezes os níveis de Flt3-L no soro em comparação com o soro de animais pseudo-tratados. Assim, o Flt3-L é um dos factores que poderá ser responsável por números elevados de DCs (Fig. 3) .

Avaliou-se a progressão temporal da indução de Flt3-L em ratinhos recém-nascidos após administração de MVA-BN. Em recém-nascidos, a vacinação com MVA-BN induziu um aumento da concentração de Flt3-L num período de 24 horas. A indução atingiu um máximo após 48 horas e ainda estava presente no dia 7, altura em que as células do baço foram habitualmente analisadas e se testou a resistência contra o HSV-1 (ver abaixo). Nos ratinhos vacinados, a concentração de Flt3-L no soro aumentou duas vezes às 24 horas e 48 horas após a vacinação em comparação com animais de controlo de idades correspondentes.

Exemplo 2 (i) Ratinhos neonatais tratados com MVA-BN sobrevivem a uma provocação com 100 até 500 LD50 de HSV-1

Grupos de ratinhos foram tratados com a dose padrão de MVA-BN um ou 2 dias após o nascimento e foram provocados 42 aos 7-8 dias de idade com 100 até 500 LD50 de vírus Herpes simplex 1 (HSV-1) (Fig. 4). Os ratinhos tratados com MVA-BN sobreviveram à provocação com HSV 1, ao passo que todos os ratinhos de controlo morreram num período de 5 - 6 dias após a inoculação do vírus provocador.

Para corroborar suplementarmente estas observações realizaram-se 9 experiências de provocação com 40 ratinhos tratados com MVA BN e 45 ratinhos de controlo. Mais de 80% dos ratinhos tratados com o vírus sobreviveram à provocação, ao passo que todos os ratinhos de controlo morreram (Fig. 5).

Num conjunto separado de experiências, os ratinhos foram tratados na altura do nascimento com MVA-BN (2,5 x 106 TCID50/ratinho). No dia 8 realizou-se uma provocação com 103 (1 LD50) ou 105 (100 LD50) PFU de HSV-1. Após a vacinação com MVA-BN, 65% dos ratinhos sobreviveram a uma dose virai que matou 100% dos ratinhos de controlo (100 LD5o) e 90% sobreviveram a uma dose que matou 45,5% dos controlos (1 LD50) . Em experiências adicionais, um grupo de 7 ratinhos vacinados com MVA-BN inactivado por UV foram infectados com HSV-1. Cinco deles morreram num período de 7 dias. Os restantes 2 animais deixaram de crescer e morreram nos dias 22 e 29. Em consequência, os ratinhos tratados com MVA-BN atingiram um estado de resistência acrescida contra o HSV-1 que estava associado ao MVA-BN vivo, mas não ao MVA-BN inactivado.

Em experiências de controlo realizadas com ratinhos sem células T funcionais, foi determinado que a protecção contra o HSV-1 após vacinação com MVA-BN não se deveu a linfócitos T citotóxicos com reacção cruzada induzidos pelo MVA-BN.

Testou-se se células DC seriam responsáveis pela protecção de ratinhos contra o HSV-1 após vacinação com 43 MVA-BN. Para esta finalidade, ratinhos virgens com 8 dias de idade foram provocados com 5 x 104 PFU de HSV-1 4 horas após a transferência de células de ratinhos tratados com MVA. Numa primeira experiência, esplenócitos de ratinhos com 8 dias de idade tratados no dia 1 de vida com MVA-BN foram separados nas fracções rica em DCs (baixa densidade) e pobre em DCs (alta densidade). Os ratinhos que receberam 5 x 106 células da fracção rica em DCs sobreviveram à provocação até 50%, ao passo que todos os ratinhos que receberam uma suspensão 10 vezes menos rica em DCs ou ratinhos não tratados morreram num período de 5 dias. Uma segunda abordagem consistiu em transferir células positivas para CDllc isoladas positivamente de ratinhos com 8 dias de idade tratados, no dia 1 de vida, com MVA-BN para ratinhos virgens de idades correspondentes. Uma suspensão de 2 x 106 esplenócitos contendo mais de 80% de células positivas para CDllc de ratinhos tratados com MVA-BN protegeu ratinhos virgens de infecção pelo HSV-1. Em contraste, 4 ratinhos da mesma ninhada não tratados, bem como 8 animais não tratados adicionais, morreram após a provocação. Suplementarmente, ratinhos que receberam a mesma quantidade de células do baço ou ratinhos que receberam um equivalente do baço (50 x 106 células) da fracção negativa não exibiram resistência acrescida contra o HSV-1. Assim, células positivas para CDllc conseguem proteger ratinhos do HSV-1.

Foram descritos na técnica anterior efeitos protectores de curto prazo, na gama de cerca de 24 horas, após a administração de MVA (Vilsmeier, B., Berl. Miinch. Tierárztl. Wschr. 112 (1999) 329-333). Apesar dos vírus utilizados nessa publicação não serem vírus incapazes de se replicarem em progenitura virai infecciosa no animal neonatal ou pré-natal utilizado, testou-se se o modo de acção revelado em Vilsmeier seria semelhante ao modo de 44 acção descrito na presente candidatura. Mais particularmente, Vilsmeier revela que o MVA, em particular MVA inactivado, induz uma paraimunidade durante cerca de 24 horas. Para testar se o efeito de paraimunidade também seria responsável pelos efeitos protectores revelados na presente candidatura, ratinhos com 24 horas de vida foram vacinados com MVA-BN ou MVA-BN inactivado. Aos 7 dias de idade, os ratinhos foram provocados com uma dose letal de HSV-1 (105 PFU de HSF-lf) . Os ratinhos de controlo não vacinados morreram 6 dias após a provocação. Também os ratinhos vacinados com MVA-BN inactivado não ficaram protegidos contra uma provocação com HSV-1. 0 número de células DC nestes ratinhos não aumentou. Em contraste, os ratinhos vacinados com MVA-BN não inactivado ficaram significativamente protegidos contra uma provocação com HSV-1. Aos 30 dias após a provocação, mais de 80% dos ratinhos ainda estavam vivos. Dois dias após a vacinação verificou-se existir no soro Flt3-L aumentado. Verificou-se existirem no baço números elevados de DCs. O Flt3-L aumentado estava associado a números elevados de DCs. Isto confirma que os efeitos de paraimunidade não são responsáveis pela protecção observada. (ii) MVA-BN induz uma imunidade especifica em neonatais que dura até à idade adulta

Ratinhos C57B1/6 com um dia de idade (tamanho do grupo 18) foram vacinados (i.p.) com MVA-BN (2,5 x 107 TCID50) . Quatro semanas após a vacinação, quando os ratinhos foram considerados adultos, foram provocados com uma dose letal (1 x 104 TCID50) de vacinia Western Reserve (W-WR) . Exceptuando um animal, todos os outros animais vacinados com MVA-BN sobreviveram. Em contraste, todos os animais 45 vacinados com placebo morreram num período de 7 dias e exibiram sintomas clínicos graves, como pelo emaranhado, perda de peso e actividade reduzida. Claramente, isto é uma demonstração clara de que a vacinação com MVA-BN não só é segura em animais neonatais mas é capaz de induzir uma resposta imunológica protectora contra uma infecção letal com vacínia (vírus relacionado com o MVA-BN).

Lisboa, 23 de Agosto de 2007

Claims (12)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de vírus vacínia modificado Ancara (MVA) para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de um animal neonatal, incluindo um humano, em que o MVA é um vírus que infecta abortivamente o animal neonatal, incluindo um humano, e em que o tratamento induz ou reforça a maturação do sistema imunológico.

2. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que a estirpe do MVA é MVA-BN, depositada na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (R.U.), com o número V00083008, ou respectivos derivados, em que os derivados se caracterizam por (i) serem capazes de replicação reprodutiva em fibroblastos de embrião de galinha (CEF) e na linha de células de rim de hamster bebé BHK mas incapazes de replicação reprodutiva numa linha celular humana e (ii) uma falha em se replicarem numa estirpe de ratinho incapaz de produzir células B e T maduras e, como tal, gravemente imunocomprometida e altamente susceptível a um vírus em replicação.

3. Utilização de acordo com a Reivindicação 2, em que a linha celular humana é HaCat ou HeLa.

4. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 3, em que o reforço da maturação do sistema imunológico está correlacionado com um aumento do número de células dendríticas e suas células precursoras. 2

5. Utilização de acordo com a Reivindicação 4, em que as células precursoras das células dendriticas são precursores de células dendriticas plasmocitóides.

6. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 5, em que o reforço da maturação do sistema imunológico está correlacionado com um aumento de pelo menos 1,5 vezes da concentração de Flt3-L dois dias após a administração de MVA.

7. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 6, em que o medicamento é administrado por aplicação oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, intra-uterina e/ou subcutânea.

8. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 7, em que o medicamento é administrado numa quantidade terapeuticamente eficaz numa primeira inoculação ("inoculação primária") e numa segunda inoculação ("inoculação de reforço").

9. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 8, em que o medicamento é administrado ao animal, incluindo um humano, numa quantidade de pelo menos 101 TCID50 (dose infecciosa de cultura de tecido) de MVA.

10. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 9, em que o genoma do vírus compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico heteróloga. 3

11. Utilização de acordo com a Reivindicação 10, em que a sequência de ácido nucleico heteróloga é seleccionada de uma sequência que codifica para pelo menos um antigene, epitopo antigénico e/ou um composto terapêutico.

12. Utilização de acordo com a Reivindicação 10, em que a sequência de ácido nucleico heteróloga codifica uma proteína seleccionada de entre Interferão, IL-12, Flt3-L e GM-CSF. Lisboa, 23 de Agosto de 2007