KR20110017904A - 신생아의 백신접종용 변형 백시니아 바이러스 안카라 - Google Patents

신생아의 백신접종용 변형 백시니아 바이러스 안카라 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물 세포를 감염시킬 수 있지만 수 있지만 사람을 비롯한 신생아나 태아 동물에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수는 없는 사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물을 백신접종 또는 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한 바이러스의 용도에 관한 것이다. 이러한 바이러스는 바람직하게는 변형 백시니아 바이러스 안카라(Modified Vaccinia Virus Ankara)이다. 특히, 본 발명은 백신접종에 사용된 바이러스와 동일한 바이러스 족에 속하는 바이러스에 의한 감염으로부터 신생아를 백신접종하는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 외래 항원 및 종양 항원으로부터 선택된 항원에 대하여 신생아를 백신접종하는 것에 관한 것으로 상기 종양 항원 및/또는 외래 항원은 상기 바이러스와 관련된 항원과는 상이한 것을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 덴드라이트 세포 또는 이들의 전구 세포를 활성화시키는 인자의 양을 증가시키고/거나 덴드라이트 세포 또는 이들의 전구 세포의 개수를 증가시키고/거나 인터페론(IFN) 또는 IL-12의 생산 및/또는 세포 함량을 증가시키기 위한 상기 정의된 바와 같은 바이러스의 용도에 관한 것이다.

Description

신생아의 백신접종용 변형 백시니아 바이러스 안카라{Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates}
본 발명은 사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물 세포를 감염시킬수 있지만 수 있지만 사람을 비롯한 신생아나 태아 동물에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수는 없는 사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물을 백신접종 또는 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한 바이러스의 용도에 관한 것이다. 이러한 바이러스는 바람직하게는 변형 백시니아 바이러스 안카라(Modified Vaccinia Virus Ankara)이다. 특히, 본 발명은 백신접종에 사용된 바이러스와 동일한 바이러스 그룹에 속하는 바이러스에 의한 감염으로부터 신생아를 백신접종하는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 외래 항원 및 종양 항원으로부터 선택된 항원에 대하여 신생아를 백신접종하는 것에 관한 것으로 상기 외래 항원 및 종양 항원은 상기 바이러스와 관련된 항원과는 상이한 것을 특징으로 하는 백신접종에 관한 것이다. 본 발명은 또한 덴드라이트 세포 또는 이들의 전구 세포를 활성화시키는 인자의 양을 증가시키고 및/또는 덴드라이트 세포 또는 이들의 전구 세포의 개수를 증가시키고 및/또는 인터페론(IFN) 또는 IL-12의 생산 및/또는 세포 함량을 증가시키기 위한 상기 정의된 바와 같은 바이러스의 용도에 관한 것이다.
동물 및 사람의 천연 환경은 바이러스, 세균 또는 진균과 같은 다양한 병원체를 함유한다. 이들 병원체의 다수는 감염된 숙주에서 질병을 유발할 수 있다. 정상 조건하에서 감염된 숙주는 특정 기간 후에 그 병원체에 의해 유발된 질병으로부터 회복된다. 이러한 회복과정은 동물이나 인간의 면역계에 기인한 것이다.
면역계는 병원체를 제거하는데 관여하는 인간이나 동물체의 일부이다. 면역반응은 특수 반응과 비특수(선천적) 반응으로 나눠지며, 이들 양쪽은 서로 밀접하게 협력한다. 비특수 면역반응은 다양한 외래 물질 및 병원체에 대한 즉각적인 방어이다. 바이러스에 대한 선천적 면역반응에서, 인터페론(IFN)-α 및 IFN-β는 초기 바이러스 복제를 제어하고 또 감염된 세포를 즉시 치사시키는 천연 킬러(NK) 세포를 활성화시키는데 절대적으로 필요하다. 세포내 세균 또는 기생성 병원균은 NK 세포 및/또는 일부 T 세포 서브세트에서 IFN-γ를 조절하도록 IL-12를 유도한다. IFN-γ 활성화된 NK 세포는 세포내 병원균을 치사시킬 수 있다. 또한 IFN-γ은 또한 대식세포를 활성화시키며 또 이들이 내재화된 병원균을 치사시키도록 작용한다.
지금까지 세포를 기본으로 하여 IFN-α/β의 가장 풍부한 공급원은 체내를 통하여 전략적으로 분포된 특수한 세포 집단인 덴드라이트 세포(DC)이다. 그중에서도 플라즈마사이토이드(Plasmacytoid) DC 또는 CD11c+ CD8+ DC가 가장 훌륭한 IFN-α/β 생산자이다. 세포내 비-바이러스성 병원균으로 감염된 CD8+ DC는 면역 방어의 초기 단계에 필수적인 IL-12를 분비할 수 있는 중요한 세포이다.
생물이 특정 외래 물질(항원)과 처음으로 접촉했을 때 유도기(lag phase)후에 상기 특정 외래물질(항원)로부터 특정 면역반응이 유도될 수 있다. 특정 면역반응의 개시는 DC에 의해 역시 조절된다. 말초에서부터 2차 림프기관, 림프절 또는 천연 T 및 B 세포가 재순환되는 비장까지 상기 세포의 일정한 교환이 존재한다. DC에 의해 이들 기관으로 운반된 항원은 천연 T 및 B 세포를 활성화시켜 이팩터(effector) T 및 B 세포로 되게한다. 이를 위하여, 항원 뿐만 아니라 병원균 인식의 적응성을 갖는 DC는 DC에서 상이한 유전자 활성화를 가능하게 하므로 T 세포의 프라이밍이 조절된 병원균을 허용한다.
특정 면역반응은, 특정 감염으로부터 회복한 개인이 상기와 같은 특정 감염으로부터 보호된다는 사실에서 아주 효과적이고 신뢰할만 하다. 따라서, 동일하거나 아주 유사한 병원체와 두 번째 감염은 훨씬 약한 증후를 유발하거나 또는 거의 증후를 유발하지 않는데, 이는 상기 병원체에 대해 "기존의 특정 면역"이 이미 존재하기 때문이다. 이러한 면역 및 면역학적 기억은 오랫동안 지속되며, 어떤 경우에는 평생 지속되기도 한다. 따라서, 이러한 면역학적 기억의 유도를 백신접종, 즉 특정 병원균에 의한 감염으로부터 개인을 보호하기 위해 이용할 수 있다.
백신접종하기 위하여, 면역계는 면역반응이 유도되어야하는 병원균 보다 덜 유해한 백신과 접촉된다. 이러한 백신은 백신접종이 실시되는 병원균에서 발견되거나 그에 의해 발현되는 항원결정인자를 포함하거나 발현한다. 따라서 생물은 백신의 일부인 항원결정인자를 함유하는 병원균으로부터 면역화된다.
전형적인 백신은 약화되거나 불활성화된 바이러스(예컨대 폴리오 또는 천연두 백신), 재조합 단백질(예컨대 재조합 B형 간염 바이러스 S-단백질), 가열 불활성화된 세균 독소(파상풍균(clostridium tetani) 독소) 또는 세균 캡슐벽의 다당류(폐렴성 구균(Streptococcus pneumoniae)) 이다.
전염병은 신생아나 젖먹이에서 아주 위험한 상태를 초래할 수 있기 때문에, 어린이나 신생아 동물을 가능한한 빨리 백신접종하려는 관심이 존재한다. 백신접종이 요구되는 상태의 예는 천연두를 비롯한 두창 바이러스 감염이다. 그러나, 신생아를 성공적으로 백신접종하려는 시도는 포유류 신생아의 면역계가 아직 성숙되어 있지 않은 사실에 의해 방해된다. 신생아 및 포유동물의 면역계는 특정 기간에 걸쳐 서서히 성숙되어 지는 것으로 보여진다. 인간의 경우, 그러한 성숙은 생애 첫 해 동안 생긴다. 이것이 바로 신생아 연령군이 첫 해 동안에 다양한 감염에 노출되어 있는 사실의 이유이기도 하다(Gans et al., J. Am . Med . Assoc. (1998) 280, 527-532). 보다 특히, 신생 유아는 손상된 B-세포 기능, 덴드라이트 세포에 의해 나타나는 일차 항원의 결핍 및 제한된 T-세포 증식을 갖는다(Gans et al., J. Am. Med . Assoc. (1998) 280, 527-532). 출생 직후에 비장에서 T 세포 양은 성인보다 1000 배 정도 낮다. 적어도 약한 면역화를 얻기 위해서는, 면역화를 위한 보조제를 포함하는 복제성 바이러스 또는 제제의 사용이 제안되었다. 그러나, 복제성 바이러스를 사용하는 경우 바이러스 제거에 T 세포가 필요하기 때문에 바이러스 감염 또는 생 바이러스 백신에 의해 압도될 위험이 언제나 존재한다(Hassett et al ., J. Virol . (1997) 71, 7881-7888). 신생아에서는 Th-1 헬퍼 T 세포에 의한 사이토카인의 생산이 감소되기 때문에, 유아에 의한 반응은 주로 Th-2 이다. 따라서, 세포독성 T 세포는 이용되지 않고 바이러스 제거는 달성되지 않는다.
포유동물에서의 상황도 사람에서 상황과 아주 유사하다, 즉 출생후 면역계는 성숙하지 않다. 갓태어난 마우스에서, 비장 CD4+ T 세포의 개수는 80.000이고 CD8+ T 세포의 개수는 성체 마우스의 비장에서 보다 1000배 낮다. 또한 인터페론(IFN) 생산 계는 이들 마우스에서 미숙하다. 따라서, 신생아 마우스는 감염 부위에서 IFN에 의한 세포내 병원균의 팽창을 효과적으로 제어할 수 없다. 또한, 낮은 면역세포 개수 및 면역세포의 부적합한 활성화 단계는 너무 제한되어서 백신접종에 사용되는 급속하게 팽창하는 병원균 또는 복제성 바이러스에 대처할 수 없다.
생 바이러스 백신과 관련된 위험으로 인하여, 사람을 비롯한 신생아 동물을 복제성 바이러스로 백신접종하는 것은 추천되지 않는다. 예컨대 천연두를 박멸하기 전 까지 사용되었던 엘스테(Elstee), 코펜하겐 및 NYCBH 균주와 같은 백시니아 바이러스 균주를 사용하여 신생아를 천연두로부터 백신접종하는 것은 추천되지 않는다. 미국에서 최근의 추천에 따르면, 12개월 아래의 영아는 지금까지 시판되는 천연두 백신을 맞지 않아야 한다.
보조제를 포함하는 제제를 사용한 신생아의 백신접종은 다수의 유해 물질이 체내로 도입되는 단점이 있다. 따라서 사람 신생아의 백신접종은 B형 간염 감염의 경우와 같이 위급한 경우에서만 실시되고 있다.
요컨대, 면역계는 출생시에는 성숙하지 않음을 유의해야한다. 복제기능을 가진 바이러스 또는 보조제를 포함하는 제제를 사용한 백신접종은 결점이 현저하기 때문에, 영아들은 독일의 경우 2개월이 되기 전에는 백신접종되지 않고(Empfehlung der Staendigen Impfkommission STICO, 2001) 또는 미국에서는 6주 전에는 백신접종되지 않는다(ACIP "Recommended Childhood Immunization Schedule, United States").
면역계 발달의 지연은 임신기간 동안 또는 수유를 통하여 엄마로부터 젖먹이에게 모성 항체가 전달되는 것에 의해 부분적으로 보상된다. 그러나, 여러 이유로 인하여 모든 유아가 수유를 받고 있는 것은 아니다. 따라서, 미성숙하여 충분히 작용하지 않는 면역계를 갖는 유아가 모성 항체를 받지 못하는 기간 및 백신접종이 대개 성공적이지 않거나 너무 위험한 기간인 약 6-8주의 아주 중요한 기간이 사람에게 존재한다.
이러한 상황은 포유동물, 특히 젖소와 같은 경제적으로 중요한 동물 또는 고양이 및 개와 같은 반려동물에서도 아주 유사하다. 비용을 절감하기 위하여 송아지가 어미로부터 받는 우유의 양은 흔히 급격하게 감소된다. 대신 송아지는 우유 분말, 어린동물용 사료 및 특수 농축 사료의 혼합물을 때때로 생후 첫주에 이미 먹게된다. 따라서, 그러한 송아지는 필요한 양 및 다양한 모성 항체를 받지 못하므로 미성숙 면역 계는 아주 감염되기 쉽다. 또한, 송아지를 교배시키는 농부 및 고기 생산을 위해 이들을 키우는 사람들은 동일하지가 않다. 4 내지 6주의 나이에 교배시킨 농부가 다른 송아지들을 모아서 선적해서 소고기 생산을 위한 다른 농장으로 보내진다. 이때, 모성 항체는 낮고 면역계는 충분히 발달되지 않지만, 동물들은 스트레스 조건하에서 새로운 병원체에 노출되게된다. 이는 백신접종에 의해 예방될 수 있었던 감염 위험을 증가시킨다. 이와 유사한 상황은 감염압박이 높은 고양이나 개 사육 시설에서도 찾아 볼 수 있다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 외래 항원 및 인간 및 동물에서 질병과 관련된 항원을 인간 및 동물 신생아에게 백신접종하는 수단을 제공하는 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 목적은 동물 및 인간의 신생아의 면역계의 성숙을 촉진시키는 수단을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 두창 바이러스 감염, 특히 천연두로부터 사람을 비롯한 동물 신생아를 예방접종하는 수단을 제공하는 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명에 따르면, 사람을 비롯한 동물의 신생아 또는 태아의 세포를 감염시킬 수 있지만 상기 세포에서 전염성 후대 바이러스로 복제될 수 없는 바이러스를 사용하여 사람을 비롯한 동물의 신생아 또는 태아를 안전하고 효과적으로 백신접종 및/또는 치료할 수 있다는 것이 예기치 않게 밝혀졌다. MVA, 특히 MVA-BN 및 그의 유도체(이하 참조)와 같은 본 발명에 따라 사용된 바이러스는 어떠한 유해 효과도 없이 신생아에게 투여될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 동물에 바이러스를 백신접종하면 백신접종에 사용된 바이러스에 대하여 특정 면역반응 및/또는 이하에 보다 자세하게 설명된 외래 항원 및 종양 항원에 대한 일반적 백신접종을 유발한다. 또한 본 발명에 따라 사용된 바이러스는 덴드라이트 세포 및 인터페론과 같은 인자의 개수의 증가와 관련된 면역계 성숙의 유도 및/또는 향상을 유발한다. 본 발명에 따라 사용된 바이러스를 사용한 백신접종은 동물에 투여되는 제제가 보조제를 포함하지 않더라도 가능하다.
요컨대, 본 발명에 따라 사용되는 바이러스는 (i) 신생아에서 효과적인 면역반응을 유발하고, (ii) 보조제의 필요없이 투여될 수 있으며 또 (iii) 생물체를 위협할 우려가 없다.
본 발명에 따르면, 상기 보호 효과는 첫 백신접종후 적어도 5일, 바람직하게는 적어도 7일, 14일 또는 28일 동안 발휘된다.
"세포를 감염시킬 수 있는" 바이러스는 바이러스 또는 적어도 바이러스 게놈이 숙주 세포에 혼입될 수 있을 정도로 숙주 세포와 상호작용할 수 있는 바이러스 표면 구조를 갖고 있는 바이러스이다. 본 발명에 따라 사용된 바이러스는 숙주 세포를 감염시킬 수 있지만, 이들은 감염된 세포에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없다. 본 발명과 관련하여, 용어 "상기 세포에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없는 바이러스"라는 용어는 게놈이 적어도 부분적으로 바이러스 단백질로 전사되고 번역되거나 또는 복제되더라도 감염성 바이러스 입자내에 팩케이징되지 않는 바이러스를 지칭한다. 따라서, 본 발명에 따른 바이러스는 숙주에서 비진행성 감염을 초래하는 바이러스이다. 비진행성 감염은 다음 2가지 이유로 인하여 생길 수 있다: 그 하나에 따르면 세포는 감염되기 쉽지만 상기 세포에서 바이러스의 복제에 필요한 모든 바이러스 유전자가 발현되고 및/또는 바이러스 게놈에 존재하는 것은 아니라는 사실로 인하여 바이러스 복제는 허용하지 않는다. 본 발명에 따른 인간 세포중의 상기 유형의 바이러스의 예는 이하에 더욱 자세하게 설명된 MVA(Modified Vaccinia Virus Ankara)이다. 두 번 째 예로서 비진행성 감염은 바이러스 유전자의 완전성이 결여된 결함있는 바이러스에 의한 세포의 감염에 의해 초래될 수 있다. 인간 세포에 대한 이러한 본 발명에 따른 바이러스의 예는 DISC-HSV1(불능으로 된 단일-주기 단순포진 바이러스(Herpes simplex virus)), 즉 단일주기 감염에 한정된 단순포진 바이러스이다(Dilloo et al., Blood 1997, 89: 119-127). 이 바이러스는 필수 당단백질 H(gH)에 필요한 유전자를 결여하고 있지만, gH를 발현하는 완전한 세포주에서 높은 역가로 성장할 수 있다. 단순포진 바이러스 성장을 허용하는 비-완전성 세포주에서는 단일 주기의 복제로 한정되어 비감염성 바이러스의 방출을 초래한다. "복제될 수 없다"는 용어는 바람직하게는 백신접종된 동물의 세포에서 전혀 복제될 수 없는 바이러스를 지칭한다. 그러나, 신생아의 미성숙 면역계에 의해 제어되는 미소한 잔류 복제 활성을 나타내는 바이러스는 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명에 따른 바이러스는 동물의 세포를 감염시킬 수 있지만 상기 세포에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없는, 즉, 불임적으로 감염되는(abortively infected) 바이러스이다. 제1 동물 종의 세포를 감염시킬 수 있지만 상기 세포에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없는 바이러스는 제2 동물종에서는 다르게 행동할 수 있다. 예컨대, 인간의 경우 MVA-BN 및 그의 유도체(이하 참조)는 인간의 세포를 감염시킬 수 있지만 인간 세포에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없는 바이러스이다. 동일한 바이러스는 닭에서 복제될 수 있다, 즉 닭에서 MVA-BN은 닭의 세포에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없는 바이러스가 아닐 수 있다. 바이러스는 특정 동물 종에 맞게 선택되어야하는 것은 당업자에게 공지된 것이다. 어떤 바이러스가 신생아 또는 태아 동물에서 복제될 수 있는지 여부를 결정하는 시험은 WO 02/42480호에 기재되어 있고 AGR129 마우스 균주를 사용하고 있다. 상기 마우스 모델에서 얻은 결과는 인간에게도 나타난다. 따라서, 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없다"는 WO 02/42480호에서 마우스에 대해 사용된 것과 같은 용어 "생체내에서 복제될 수 없다"에 해당된다. 이 시험에 대한 보다 자세한 내용을 이하에 나타낸다. 본 발명에 따른 바이러스는 적어도 1개 동물 종의 적어도 1개 유형의 세포에서 복제될 수 있다. 따라서, 백신접종 및/또는 치료할 동물에 투여하기 전에 바이러스를 증폭시킬 수 있다. CEF 세포에서 증폭될 수 있지만 신생아 또는 태아 인간에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없는 바이러스인 MVA-BN을 예로 들 수 있다. 불활성 바이러스가 사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물의 세포를 감염시킬 수 있고 사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없지만, 이들 바이러스는 적어도 1종 동물 종의 적어도 1개 유형의 세포에서 복제될 수 없기 때문에, 본 명세서에서 화학적으로 또는 물리적으로 불활성 바이러스는 바람직한 구체예의 모든 특성을 갖는 것은 아니다.
바람직하게는 상기 바이러스는 DNA 바이러스이다. 보다 바람직하게는, 포유류 세포의 경우, 특히 인간 세포의 경우, DNA 바이러스는 DISC-허피스 바이러스 및 MVA(Modified Vaccinia virus Ankara)로부터 선택된다.
MVA 바이러스는 폭스비리대(Poxviridae) 과의 오르토폭스바이러스(Orthopoxvirus) 속(genera)의 구성원인 백시니아 바이러스에 관련된다. MVA는 백시니아 바이러스의 안카라(Ankara) 균주의 닭 배아 섬유아세포(CVA)상에서 516개 시리얼 패세이지에 의해 생성되었다(Mayr, A., et al., Infection 3, 6-14 [1975] 참조). 이러한 장기간 경로의 결과로서 생성한 MVA 바이러스는 그의 게놈 서열의 약 31 킬로베이스를 제거하고 있으므로 조류 세포에 한정된 숙주 세포로서 기재되어 있다(Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 [1991]). 상기 생성한 MVA는 다수의 동물 모델에서 독성이 아닌 것으로 밝혀졌다. 또한, 이러한 MVA 균주는 인간 천연두 질병으로부터 면역시키기 위한 백신으로서 임상실험으로 시험되고 있다(Mayer et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). 이들 연구는 고위험 환자를 비롯하여 120,000명의 사람에 걸쳐 실시되었고 또 백시니아를 기본으로 한 백신과 비교하여, MVA는 독성 또는 감염성을 감소시켰지만 양호한 면역원성을 유지하고 있음이 밝혀졌다.
본 발명에 따른 바람직한 균주는 ECACC(European Collection of Animal Cell Cultures)에 기탁번호 V00120707호로 기탁되어 있는 MVA 575 및 동일 기관에 기탁번호 V000083008호로 기탁되어 있는 MVA-BN, 및 이들의 유도체이다. 인간을 백신접종/치료하려는 경우, MVA-BN 및 그의 유도체가 특히 바람직하다.
특히 바람직한 MVA 균주, 바람직하게는 MVA-BN 및 그의 유도체와 같은 인간에게 가장 바람직한 균주의 특성은 다음과 같이 요약할 수 있다:
(i) 닭 배아 섬유아세포(CEF) 및 세포주 BHK에서 번식 복제능을 갖지만, 인간 세포주 HaCat에서는 번식 복제될 수 없음,
(ii) 생체내에서는 복제될 수 없음,
(iii) 치사 유발(lethal challenge) 모델에서, 공지 균주 MVA 575(ECACC V00120707)와 비교하여 훨씬 높은 면역원성 유발, 및/또는
(iv) DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방계획과 비교할 때, 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방계획에서 적어도 실질적으로 동일한 정도의 면역성 유발.
본 발명에 따른 바람직한 MVA 균주는 백신접종되거나 치료될 생물 및/또는 이하에 설명한 바와 같은 상응하는 시험 계에서 복제될 수 없는 특성(ii) 및 바람직하게는 상술한 특성중 1개의 추가적 특성, 보다 바람직하게는 상술한 특성중 2개의 추가 특성을 갖는다. 상기 특성을 모두 갖는 MVA 균주가 가장 바람직하다. 인간에서 상술한 특성을 모두 갖는 MVA 균주의 예는 MVA-BN 이다. MVA-BN의 바람직한 유도체는 (ii) 특징 이외에, 상술한 특성중 적어도 1개, 보다 바람직하게는 상기 특성중 적어도 2개를 갖는 유도체이다. 상술한 특성을 모두 갖는 MVA-BN 유도체가 가장 바람직하다.
MVA 균주가 상술한 특성(i) 내지 (iv)의 1개 또는 그 이상을 갖는지 여부를 결정하기 위해 사용된 분석법에 관한 상세한 정보는 WO 02/42480호를 참조할 수 있다. 상기 문헌은 또한 소망하는 특성을 갖는 바이러스를 얻는 방법도 기재하고 있다. 특히, WO 02/42480호는 MVA-BN 및 MVA-BN 유도체의 상세한 특징 설명을 제공하며 또 MVA 균주가 MVA-BN 또는 그의 유도체인지 여부를 결정하기 위해 사용되는 생물학적 분석법도 자세하게 제시하고 있다. 즉, MVA-BN의 특징, MVA 균주가 MVA-BN인지 그의 유도체인지 평가하는 생물학적 분석법의 설명 및 MVA-BN 및 그의 유도체를 얻기 위한 방법이 WO 02/42480호에 기재되어 있다. 이하에서는 당업자들이 상술한 특성중의 1개 또는 그 이상을 갖는 MVA 균주를 얻는 방법 및 얻어진 MVA 균주가 상술한 특성중의 하나 또는 그 이상을 갖는지 여부를 시험하여 본 발명에 따른 가장 바람직한 바이러스를 시험하는 방법을 간단히 요약한다. 이하의 요약은 본 발명에 있어서 WO 02/42480호의 관련성을 이하의 정보에 제한하려는 것은 아니다. 대신, WO 02/42480호는 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
세포주 HaCAT에서 "번식 복제할 수 없다"는 용어(Boukamp et al., 1988, J Cell Biol 106(3): 761-71)는 WO 02/42480호에 정의된 바와 같이 본 발명에서 사용된다. 따라서, 세포주 HaCat에서 "번식 복제될 수 없는" 바이러스는 인간 세포주 HaCat에서 1 미만의 증폭비를 나타내는 바이러스이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 벡터로 사용되는 바이러스의 증폭비는 인간 세포주 HaCat에서 0.8 이하이다. 바이러스의 "증폭비"는 제1 장소에서 세포를 감염시키기 위해 원래 사용된 양(인ㅍ풋)에 대한 감염된 세포로부터 생산된 바이러스(아웃풋)의 비(증폭비)이다. 아웃푸트 및 인푸트 사이의 "1" 비율은 감염된 세포로부터 생산된 바이러스의 양이 세포를 감염시키기 위해 처음에 사용된 양과 동일한 증폭 상태를 정의한다. ECACC V00083008에 기탁된 바이러스의 "유도체"라는 용어는 기탁된 균주와 거의 동일한 복제 특성을 나타내지만 그의 게놈에서 1 또는 그 이상의 부분에서 차이점을 나타내는 바이러스를 지칭한다. 기탁된 바이러스와 동일한 "복제 특징"을 갖는 바이러스는 기탁된 균주 보다 CEF 세포 및 세포주 BHK, HeLa, HaCat 및 143B에서 유사한 증폭비로 복제될 수 있고 또 AGR129 트랜스제닉 마우스 모델(이하 참조)에서 결정되는 것과 같은 생체내에서 유사한 복제를 나타내는 바이러스이다.
용어 "생체내에서 복제될 수 없다"는 것은 WO 02/42480호에 정의된 바와 같이 본 발명에서 사용된다. 따라서, 상기 용어는 WO 02/42480호에 설명된 바와 같이 인간 및 마우스 모델에서 복제되지 않는 바이러스를 지칭한다. WO 02/42480호에서 사용된 마우스는 성숙 B- 및 T-세포를 생산할 수 없다(AGR 129 마우스). 특히 MVA-BN 및 그의 유도체는 마우스를 복막내 투여된 107 pfu 바이러스에 의해 감염시킨 후 45일간의 기간 동안, 보다 바람직하게는 적어도 60일내에, 가장 바람직하게는 90일 이내에 AGR129 마우스를 치사시키지 않는다. 바람직하게는, "생체내에서 복제될 수 없는" 바이러스는 어떤 바이러스도 복막내로 투여된 107 pfu 바이러스에 의해 마우스를 감염시킨 후 45일, 바람직하게는 60일, 가장 바람직하게는 90일내에 AGR129 마우스의 기관 또는 조직으로부터 회복될 수 없는 것을 특징으로 한다. AGR129 마우스 대신 성숙 B 및 T 세포를 생산할 수 없고 심하게 면역 손상되고 복제성 바이러스에 감염되기 쉬운 다른 마우스 균주도 사용될 수 있다.
MVA 균주가 "공지 균주 MVA 575에 비하여 더 높은 면역원성"을 갖는지 여부를 결정하기 위해 사용되는 치사 유발실험의 상세한 내용은 WO 02/42480호에 설명되어 있다. 이러한 치사 유발모델에서 백신접종되지 않은 마우스는 웨스턴 리저브 균주 L929 TK+ 또는 IHD-J와 같은 복제를 감당할 수 있는 백시니아 균주로 감염된 후 죽는다. 복제를 감당할 수 있는 백시니아 바이러스에 의한 감염을 치사 유발 모델의 설명과 관련하여 "유발"로 지칭한다. 상기 유발처리된지 4일 후 마우스는 통상 죽게되며 난소에서의 바이러스 역가는 VERO 세포를 사용한 표준 플라크 에세이법으로 결정한다. 바이러스 역가는 MVA-BN 및 그의 유도체로 백신접종된 마우스 및 백신접종되지 않은 마우스에 대해 측정한다. 보다 자세하게는 MVA-BN 및 그의 유도체는 102 TCID50/ml 바이러스에 의해 백신접종된 후 상기 시험에서 난소 바이러스 역가가 백신접종되지 않은 마우스에 비하여 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 감소되는 것을 특징으로 한다.
바람직한 구체예로서 MVA, 특히 MVA-BN 및 그의 유도체와 같은 본 발명에 따른 바이러스는 프라임/부스트(prime/boost) 투여용으로 유용하다. 본 발명에서 가장 바람직하게 사용되는 바이러스, 특히 MVA-BN 및 그의 유도체와 같은 MVA 균주 뿐만 아니라 이질적인 서열을 갖는 상응하는 재조합 바이러스는 자연그대로의 동물 뿐만 아니라 두창 바이러스에 대해 기존의 면역성을 갖고 있는 동물에서 효과적으로 면역반응을 처음으로 프라이밍한 다음 면역반응을 부양시키는 데 효과적으로 사용될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 가장 바람직한 바이러스는 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방계획에서 DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방계획과 실질적으로 동일한 면역정도를 유발한다.
백시니아 바이러스, 특히 MVA 균주는 WO 02/42480호에 기재된 바와 같이 "에세이 1" 및 "에세이 2"의 하나, 바람직하게는 양쪽 에세이 모두로 측정된 CTL 반응이, DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방계획과 비교할 때, 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방계획에서 적어도 실질적으로 동일하면, DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방계획과 비교할 때 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방계획에서 적어도 실질적으로 동일한 정도의 면역을 유발하는 것으로 간주된다. 보다 바람직하게는 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 투여후 CTL 반응은, DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방계획과 비교할 때, 상기 에세이법중의 적어도 하나에서 더 높다. 가장 바람직하게는 CTL 반응은 양쪽 에세이에서 더 높다.
본 발명에 따라 사용되는 바이러스는 MVA와 같은 비-재조합 바이러스, 즉 이질적인 뉴클레오티드 서열을 함유하지 않는 바이러스일 수 있다. 비-재조합 백시니아 바이러스의 예는 MVA-BN 및 그의 유도체이다. 다르게는 바이러스는 상기 바이러스에 이질적인 부가적인 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 MVA와 같은 재조합 바이러스일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "이종성(heterologous)" 이라는 용어는 천연적인 바이러스에서는 보통 찾아볼 수 없는 핵산 서열의 조합을 지칭하는 것으로, 이러한 바이러스는 또한 "재조합 바이러스"로도 불린다.
이종성 핵산 서열은 바람직하게는 1개 이상의 항원, 항원성 항원결정기, 유리한 단백질 및/또는 치료적 화합물을 코딩하는 서열로부터 선택된다.
본 명세서에 이용된 용어 "유리한 단백질"은 상기 바이러스와 관련된 항원과는 상이한 종양 항원 및 외래 항원으로부터 선택된 항원으로부터 동물을 보호하는데 유용한 단백질을 지칭한다. 다르게는, 보다 특히 "유리한 단백질"은 덴드라이트 세포를 활성화시키는 인자의 양을 증가시키는데 효과적이고 및/또는 덴드라이트 세포의 개수를 증가시키는데 효과적이며 및/또는 인터페론(IFN) 또는 IL-12의 생산 및/또는 세포 함량을 증가시키는데 효과적이다. 따라서, 이러한 유리한 단백질의 예는 IFN-알파 또는 IFN-베타와 같은 인터페론, IL-12, Flt-3-L 및/또는 GM-CSF이다.
항원성 항원결정기는 면역반응을 유발하도록 감작시키는 모든 항원결정기일 수 있다. 이러한 항원성 항원결정기의 예는 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 미코박테리아(Mycobacteria), 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스(Flaviviruses)과에서 선택된 바이러스, 파라믹소바이러스(Paramyxoviruses), 간염 바이러스, 인간의 면역결핍 바이러스 또는 한타바이러스(Hantaviruses) 또는 필로바이러스(Filoviruses)와 같은 출혈열을 유발하는 바이러스, 즉 에볼라 또는 마르부르그(Marburg) 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 항원결정기이다. 따라서, 예컨대 본 발명에 따라 신생아를 백신접종하기 위해 이질적 항원결정기를 나타내는 재조합 MVA가 사용되면, 상기 처리의 결과는 면역계의 성숙을 촉진시키는 것에 의한 일반적 백신접종일 뿐만 아니라 이질적 MVA로부터 발현된 이질적인 항원결정기에 대한 특수한 백신접종이다.
재조합 바이러스에 있는 이종성 핵산에 의해 코딩된 "치료적 화합물"은 예컨대 안티센스 핵산과 같은 치료적 핵산 또는 소망하는 생물학적 활성을 갖는 펩티드 또는 단백질일 수 있다.
이종성 핵산 서열의 삽입은 바람직하게는 바이러스 게놈의 비-필수 영역으로 행해진다. 다르게는, 상기 이종성 핵산 서열은 바이러스 게놈의 천연적으로 생기는 결실 부위에 삽입된다(PCT/EP96/02926호에 기재된 MVA 경우). 이질적인 서열을 두창 바이러스 게놈과 같은 바이러스 게놈에 삽입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명은 또한 사람을 비롯한 살아있는 동물체내에서 면역반응을 유발하기 위한 MVA와 같은 본 발명에 따른 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물 및 백신을 제공한다.
약제학적 조성물은 일반적으로 1개 이상의 약제학적으로 허용되는 및/또는 승인된 담체, 보조제, 항생물질, 보존제, 보조제, 희석제 및/또는 안정화제를 포함할 수 있다. 이러한 보조 물질은 물, 염수, 글리세롤, 에탄올, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등일 수 있다. 적합한 담체는 전형적으로 단백질, 다당류, 폴리락틱산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집물 등과 같이 대형이고, 서서히 대사되는 물질이다.
백신을 제조하기 위하여, 바이러스 또는 그의 재조합체는 생리적으로 허용되는 형태로 전환되어야한다. 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. MVA 및 기타 두창 바이러스의 경우, 백신은 천연두를 백신접종하기 위해 사용되는 두창 바이러스 백신 제조에서 경험을 토대로 제조될 수 있다(Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392에 기재된 바와 같이). 예컨대, 상기 정제된 바이러스는 약 10 mM 트리스, 140 mM NaCl pH 7.4에 조제되어 5 x 108 TCID50/ml의 역가를 가지며 -80℃에서 저장된다. 백신 주사를 제조하기 위해, 예컨대 MVA와 같은 바이러스의 101-108 입자를 앰플, 바람직하게는 유리 앰플에서 2% 펩톤 및 1% 인간 알부민 존재하의 100 ml의 포스페이트-완충 염수 (PBS)중에서 동결건조시켰다. 다르게는, 백신 주사는 제제중의 바이러스를 단계별로 동결-건조시키는 것에 의해 제조할 수 있다. 상기 제제는 만니톨, 덱스트란, 당, 글리신, 락토오스 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 부가적 첨가제 또는 생체내 투여에 적합한 산화방지제 또는 불활성 가스, 안정화제 또는 재조합 단백질(예컨대 인간 혈청 알부민)과 같은 추가의 첨가제를 함유할 수 있다. 이어 유리 앰플을 밀봉시키고 4℃ 내지 실온에서 수개월간 저장할 수 있다. 그러나, 특별한 필요가없는 한 앰플은 -20℃ 아래의 온도에서 저장하는 것이 바람직하다.
백신접종 또는 치료를 위하여 동결건조물은 0.1 내지 0.5 ml의 수용액, 바람직하게는 생리학적 식염수 또는 트리스 완충액에 용해시켜서 비경구적으로, 근육내로 또는 당업자에게 공지된 다른 투여 경로에 의해 전신적으로 또는 국소적으로 투여된다. 투여형태, 투여량 및 투여회수는 당업자에게 공지된 방식으로 최적화될 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA는 경구적, 경비적, 근육내, 정맥내, 복막내, 경피적, 자궁내 및/또는 피하로 투여될 수 있다. 어린 동물에서 면역화를 위한 접종은 바람직하게는 비경구적으로 또는 경비적으로 실시되는 것이 바람직한 반면에, 성체 동물 또는 인간에서는 피하, 근육내 또는 경구 접종이 바람직하다.
MVA는 101 TCID50 (조직 배양 감염 투여량) 내지 109 TCID50 의 투여량으로 투여되는 것이 바람직하다.
상기에서 지적한 바와 같이, 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA-BN 및 그의 유도체와 같은 MVA는 제1 접종("프라이밍 접종") 및 제2 접종("부스팅 접종")시에 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 내용에서 용어 "동물"은 인간을 포함하는 것이다. 보다 일반적으로, 동물은 척추 동물, 바람직하게는 사람을 비롯한 포유동물이다. 동물의 특정 예는 개, 고양이와 같은 애완동물, 송아지, 소, 양, 염소, 말, 돼지와 같은 경제적으로 중요한 동물 및 마우스, 래트와 같은 기타 동물이다. 이들 동물 종 및 인간에 대해서 MVA 및 DISC-HSV가 특히 바람직한 바이러스이다. 본 발명은 또한 종류 세포를 감염시킬 수 있지만 조류 세포에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없는 바이러스라면 칠면조, 오리, 거위 및 닭과 같은 경제적으로 중요한 조류에도 이용될 수 있다.
*본 발명에서 사용된 바와 같은 용어 "가축 동물"은 바람직하게는 포유류 가축동물, 보다 바람직하게는 개, 고양이, 송아지, 소, 양, 염소, 돼지, 말, 사슴을 지칭한다.
제1 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA-BN 및 그의 유도체는 특정 백신으로 사용될 수 있으며, 즉 백신접종에 사용된 바이러스와 동일 바이러스 그룹(group), 과(family) 또는 속(genus)에 속하는 독성 바이러스에 의해 유발된 질병으로부터 백신접종된 신생아를 보호하는 면역반응을 유발하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대 상기와 같은 MVA, 특히 MVA-BN 및 그의 유도체는 두창 바이러스 감염, 특히 천연두로부터 인간 신생아를 백신접종하기 위해 사용될 수 있다. MVA, 특히 MVA-BN 및 그의 유도체는 또한 수의학적으로 중요한 척추 동물들을 두창 바이러스 감염으로부터 백신접종하기 위해 사용될 수 있다. 제1 구체예에 따르면 백신접종에 사용된 바이러스는 MVA-BN 또는 그의 유도체와 같은 비-재조합 바이러스이거나, 또는 바이러스 게놈에서 천연적으로 발견되지 않는 유전자를 바이러스 게놈중에 가지고 있는 재조합 바이러스일 수 있다. 바람직하게는, 재조합 바이러스는 면역반응을 자극하는데 유용한 부가적인 유전자를 가지고 있다. 이러한 종류의 유전자의 예는 사이토카인 유전자 및 인터페론 유전자이다.
제2 구체예에 따르면, 신생아는 이종성 핵산 서열로부터 발현되는 아미노산 서열에 대하여 면역반응을 유발하기 위해 상기 정의된 바와 같은 이종성 핵산서열을 갖는 재조합 바이러스에 의해 백신접종된다. 예로서, 상기 핵산 서열은 상기 정의한 바와 같은 항원 또는 항원성 항원결정기를 코딩할 수 있다. 상기 구체예에 따른 재조합 바이러스의 예는 (i) HIV-1, HIV-2, 뎅기 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 홍역 바이러스와 같은 MVA 이외의 바이러스, (ii) 종양 항원, (iii) 세균, (iv) 진균으로부터 선택된 항원을 코딩하는 이종성 핵산을 포함하는 재조합 MVA, 특히 재조합 MVA-BN 또는 그의 유도체이다. 재조합 바이러스로부터 발현된 항원이 예컨대 HIV 항원이면, HIV로부터 백신접종된 신생아를 HIV로부터 면역반응을 유발하고 또 AIDS를 예방하기 위해 상기 재조합 바이러스를 이용할 수 있다. 넓은 의미에서, 항원 또는 항원성 항원결정기를 발현하는 재조합 바이러스는 이질적인 서열이 유도되는 물질로부터 면역반응을 유도하거나 및/또는 항원 또는 항원성 항원결정기를 포함하는 물질로부터 면역반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
제3 구체예에 따르면, 사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물 세포를 감염시킬 수 있지만 사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없는 바이러스는 동물, 특히 사람을 비롯한 신생아 동물에서 상기 바이러스와 관련된 항원과는 상이한 종양 항원 및 외래 항원으로부터 선택된 항원으로부터 보호하기 위한 의약제조에 사용될 수 있다는 것이 예기치 않게 밝혀졌다.
제3 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA-BN 및 그의 유도체와 같은 MVA에 의해 백신접종된 신생아는 병원체와 같은 외래 항원에 의한 유발로부터 보호된다. 따라서, 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA는 신생아를 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA로 백신접종하는 것에 의해 신생아의 면역계가 바이러스와 같은 외래 항원에 더욱 잘 대처하도록 하는 신생아에 대한 일반적 백신이다. 실시예 부분에서 이것은 MVA로 백신접종한 다음 단순포진 바이러스 타입 1과의 유발시험으로 예시되어 있다. 따라서, 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA가 신생아의 백신접종용으로 사용되면, 백신접종된 동물은 기능적이고 성숙한 면역계가 확립될 때 까지 중요한 시기에서 백신접종되지 않은 동물에 비하여 외래 항원으로부터 더욱 잘 보호된다.
본 발명에 따르면 "종양 항원 및/또는 외래 항원이 바이러스와 관련된 항원과는 상이하다"는 용어는 본 발명의 구체예에 따르면 바이러스 자체에 대한 면역반응을 유발하는 MVA와 같은 바이러스를 사용하는 것이 아니라는 것으로 해석된다. 대신 상기 바이러스는 바이러스와 관련되지 않은 외래 항원 및 종양 항원으로부터 숙주를 보호하는 면역반응 또는 적어도 일반적인 면역자극을 유발하기 위해 사용된다. 용어 "바이러스와 관련된 항원"은 바이러스 입자의 항원결정인자와 항원 및 바이러스 게놈의 발현 결과로 바이러스에 의해 감염된 세포의 표면상에 있는 항원과 항원결정기를 지칭한다.
상기 구체예와 관련하여, 용어 "외래 항원"은 동물 체내에 천연적인 부분 또는 성분이 아닌 항원 및 항원결정기를 지칭한다. 외래 항원은 병원체 및 독소로부터의 항원 및 항원결정기이다. 전형적인 병원균은 허피스 바이러스, 레트로 바이러스, 공수병 바이러스, 라브도바이러스(rhabdovirus), 아데노바이러스와 같은 바이러스; 살모넬라(Salmonella), 미코플라즘(Mycoplasm), 메닝기코커스(Meningicoccus), 헤모필루스(Hemophilus)와 같은 세균; 프리온 또는 진균이다.
본 발명은 외래 항원으로부터 동물을 백신접종하는 것에 관심을 갖고 있을 뿐만 아니라 다른 구체예로서 종양 항원으로부터 백신접종에도 적합하다. "종양 항원"은 특정 종양 질병과 관련된 항원이다. 종양 항원은 가장 흔히 종양을 유발하는 숙주의 게놈에 의해 코딩된 항원이다. 따라서, 엄격한 의미에서 종양 항원은 외래 항원은 아니다. 그러나, 종양 항원은 종양에서 상당량 발견되는 반면에, 정상 조직에서 종양 항원의 양은 아주 낮고 대개 정상 조직에서는 종양 항원은 거의 발견되지 않는다. 종양 항원의 예는 당업자에게 공지되어 있으며 예컨대 MAGE 항원을 포함한다. MVA는 동물의 백신접종이 면역 계의 성숙을 활성화하거나 및/또는 촉진시킨 다음 종양 세포의 파괴를 유발하기 때문에 이들 종양 항원에 대해 효과적이다.
용어 "항원으로부터 보호"한다는 것은 외래 항원 또는 종양 항원에 향한 면역반응의 발현을 지칭한다. 외래 항원이 병원체이면, 숙주는 상기 항원에 대한 면역반응을 발현하여 상기 병원체에 대해 보호된다. 따라서, 병원체에 의한 감염은 덜 심각한 질병을 유발하거나 질병을 전혀 유발하지 않는다. 용어 "보호한다"는 것은 외래 항원 또는 종양 항원으로부터 언제나 100% 보호된다는 의미로 이해되지는 않는다. 대신, 본 발명에서 사용된 용어 "보호한다"는 것은 동물이 외래 항원 및 종양 항원에 대처하도록 돕는 유리한 효과를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 이러한 보호 효과는 첫 백신접종한 후 적어도 5일, 바람직하게는 적어도 7일, 14일 또는 28일간 발휘된다. 즉, 백신접종 또는 치료된 동물은 그 동물이 상기 항원과 5, 7, 14 및 28일후에 접촉되게 되면 외래 항원으로부터 보호된다.
본 발명과 관련하여, 신생아를 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA로 백신접종하는 효과는 면역계 성숙의 유발 또는 향상 및/또는 면역계의 활성화에 의해 설명될 수 있다. 본 발명과 관련하여, 용어 "면역계 성숙의 유발 또는 향상"은 대조용과 비교하여 백신접종된 동물에서 덴드라이트 세포 또는 이들의 전구체의 증가가 가속된다는 것을 의미한다. 면역계의 "성숙 촉진" 및 면역계의 "성숙 향상"이라는 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
"면역계의 활성화"는 세포/세포 상호작용 또는 거래를 용이하게 하는 분자 및 호르몬의 세포 표면상에서 발현 및/또는 상기 세포에 의한 상기 분자 및 호르몬의 분비를 특징으로 한다. 특정 수용체는 이들 시그널을 받아서 감응한다. 활성화 마커는 Flt3-L, IL-12, IFN-알파, MHC-II 및 CD8이며, 특히 CD8알파(이하 참조) 이다.
면역계의 발현/성숙 가속화는 덴드라이트 세포(DC) 또는 이들 전구 세포를 활성화하거나 및/또는 이동시키는 인자의 양을 증가시키거나 및/또는 덴드라이트 세포 및 이들 전구세포의 개수 증가 및/또는 인터페론 또는 IL-12의 생산 및/또는 세포 함량을 증가시키는 것과 상관관계가 있다. 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA에 의해 유발되는 DC 전구 세포의 예는 바이러스 감염으로부터 방어하는데 아주 중요하며 IFN α/β를 생산하는 것으로 보여지는 플라즈마사이토이드 DC 전구세포이다.
보다 자세하게는, 면역계의 성숙 향상은 바람직하게는 MHC-II, CD40 및/또는 CD80/86과 같은 DC상에서 발견되는 표면 마커에서 적어도 2배 증가하는 것으로 정의된다. 바람직하게는 이러한 증가는 혈액에서도 측정될 수 있다. 또한 면역계의 성숙향상을 특징화하는 마커는 Flt3-L, IL-12, IFN-알파, MHC-II 및 CD8a (이하 참조)이다. 또한, 면역계의 성숙가속은 바람직하게는 MVA-BN 처리되지 않은 대조용 동물에 비교하여 신생아 동물에게 MVA-BN을 투여한 지 7일 후 혈액 및/또는 비장에서 CD11c 포지티브 세포의 개수의 적어도 1.5배 증가, 바람직하게는 적어도 2.0배 증가와 관련이 있다. 또한, 면역계의 성숙 향상은 바람직하게는, 연령이 맞추진 대조용과 비교하여, 본 발명에 따른 바이러스를 이용하여 신생아를 백신접종한 지 2일 후 Flt3-L의 농도의 적어도 1.5배 증가, 보다 바람직하게는 적어도 2.0배 증가와 관련이 있다.
이와 관련하여 표면 표현형에 의해 특징화될 수 있는 쥐 및 인간의 DC 집단의 표현형과 작용 간에는 상관관계가 있다는 것을 알아야한다(Hochrein et al. 2002, Hum . Immunol. 63: 1103). 혈액중의 DC는 확인해야할 플라즈마사이토이드 DC와 같은 DC의 특정 집단을 허용하는 일련의 표면 마커(MacDonald et al. 2002. Blood. 100: 4512)를 사용하여 유세포 분석법(flow cytometry)에 의해 검출될 수 있다(Dzionek et al. 2002. Hum Immunol. 63: 1133; Dzionek et al 2000. J. Immunol. 165: 6037). 유사한 수법을 이용하여 DC는 다른 인간 조직에서도 검출될 수 있다(Summers et al. 2001. Am . J. Pathol. 159: 285).
본 발명에 따르면, 상기에서 정의된 바와 같은 바이러스는 덴드라이트 세포(DC) 또는 이들의 전구 세포를 활성화시키고/거나 이동시키는 인자의 양을 증가시키고 및/또는 덴드라이트 세포 및 이들의 전구 세포의 개수를 증가시키고/거나 인터페론 또는 IL-12의 생산 및/또는 세포 함량을 증가시키기 위해 신생아 또는 태아 동물을 처리하는데 이용될 수 있다. MVA-BN을 사용한 백신접종 이후에 플라즈마사이토이드 덴드라이트 세포는 상당히 많은 IL-12를 제조하며 향상된 IFN-알파 생산 및 증가된 MHC-II 및 CD8a 조절 특징을 갖고 있음이 나타났다. 본 발명에 따라 사용된 바이러스를 투여한 후 IL-12의 증가는 바람직하게는 2배, 보다 바람직하게는 100배, 500배, 1000배, 2500배 또는 5000배이다. 본 발명에 따른 바이러스, 가장 바람직하게는 MVA-BN 또는 그의 유도체를 사용하여 신생아를 백신접종한 지 2일 후 Flt3-L의 농도증가는, 연령을 맞춘 대조용과 비교할 때, 바람직하게는 1.5배, 보다 바람직하게는 2.0배이다.
용어 "덴드라이트 세포 또는 이들의 전구세포의 활성화"는 호르몬 및 자극에 의한 불명확(ill-defined) 세포 단계를 통하여 DC가 성숙하여 항원 제공 세포로 성숙하는 것을 지칭한다. DC의 중간체를 전구체라 칭한다. 이들 미성숙 DC는 말초에 도달한다. 상이한(항원성) 자극은 DC를 활성화시킨다. 활성화된 덴드라이트 세포에서 조절향상된 활성화 마커는 Flt3-L, IL-12, IFN-알파, MHC-II 및 CD8a(이하 참조) 이다.
GM-CSF와 같은 호르몬은 말초에서 더욱 미성숙 DC를 초래함이 알려져 있었다. GM-CSF는 골수, 혈액 및 말초 기관( 및 이들 세포는 그 곳에서 이동해야한다)에서 더 많은 DC 전구세포를 초래하기 때문에, 이러한 현상을 "덴드라이트 세포 또는 이들의 전구세포의 이동화"로 칭한다. 이러한 정의는 본 명세서에서 이용될 수 있다.
따라서, 사람을 비롯한 동물의 백신접종은 덴드라이트 세포(DC) 또는 이들의 전구 세포를 활성화시키는 인자 양의 증가 및/또는 덴드라이트 세포 또는 이들의 전구세포의 개수의 증가 및/또는 인터페론 또는 IL-12의 생산 및/또는 세포 함량을 증가시키기 위한 것일 때 특히 유용하다.
덴드라이트 세포를 활성화시키는 인자는 Flt3-L(Lyman et al., Cell 1993 75: 1157-1167) 및 GM-CSF를 포함한다. 본 발명에 따른 전형적인 인터페론은 IFN-알파 및 IFN-베타이다. 본 발명에 따라 사용된 바이러스는 Flt3-L을 유도하며 관찰된 유리한 효과의 일부는 상기 유도에 기인한 것으로 보인다.
본 발명과 관련하여, 신생아 동물 또는 인간은 성숙 면역계를 아직 갖지 않는 동물 또는 인간으로 정의된다. 본 명세서를 통하여 용어 "신생아 동물" 및 "태아 동물"은 동일한 의미로 사용된다. 성숙 면역계는 천연 면역계를 충분히 활성화시키는 능력 및 모든 공지 T 및 B 세포 기능 및 생성물, 특히 IgA 및 IgE와 같은 면역글로불린 아이소타입(isotype)이 제자리에 있는 사실을 특징으로 한다. 따라서 미성숙 면역계는 성인에 비하여 낮은 T 세포, B 세포 및 덴드라이트 세포의 개수, 성인과 비교하여 낮은 IFN 생산 및 2차 림프 기관이 충분히 성숙하지 않은 사실을 특징으로 한다. 보다 자세하게는, 본 발명과 관련하여 "신생아" 또는 "갓난아이"는 비장 CD4+ 세포의 개수가 성인의 평균 비장 CD4+ 세포 개수 보다 적어도 2배, 보다 바람직하게는 적어도 20배, 더욱 바람직하게는 적어도 200배, 더욱 바람직하게는 적어도 2000배, 가장 바람직하게는 적어도 20,000배 낮은 유아 동물로 정의될 수 있다.
마우스에서 면역계는 생후 4주가 되어야 성숙된다. 인간의 경우, 성숙될 때 까지 약 6개월 내지 1년이 소요된다. 고양이 및 개의 경우, 면역계는 보통 6개월 정도에 성숙되고, 송아지, 양 및 돼지에서는 4 내지 12주 정도에 성숙된다. 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA를 사용한 백신접종은 바람직하게는 면역계가 성숙되기 전에 실시된다. 그러나, 출생후 성숙이 거의 기하급수적으로 발달되기 때문에 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA를 사용하여 출생후 가능한한 빠르게 백신접종하는 것이 가장 바람직하다. 모든 관련 가축 동물 및 인간에서 면역계는 생후 4주 이후에 성숙되므로, 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA를 사용한 백신접종은 바람직하게는 생후 4주 이내, 보다 바람직하게는 생후 2주 이내, 더욱 바람직하게는 생후 1주 이내, 가장 바람직하게는 생후 3일 이내에 실시되는 것이 일반적으로 바람직하다. 이러한 일반적 기간은 모든 중요한 가축 동물, 특히 사람을 비롯한 모든 중요한 포유류 가축 동물에 적용될 수 있다. 당업자들은 더 나이많은 동물도 본 발명의 내용에서 갓난아이/신생아로서 간주될 수 있다는 것과 따라서 면역계가 생후 4주에 성숙되지 않을 때 더 나이많은 동물에 대해서 백신접종을 성공적으로 실시할 수 있다는 사실을 잘 숙지하고 있을 것이다. 따라서, 인간의 경우, 백신접종은 생후 6개월 이내, 보다 바람직하게는 생후 3개월 이내, 더욱 바람직하게는 생후 2개월 이내, 보다 바람직하게는 생후 4주 이내, 더욱 바람직하게는 생후 2주 이내, 더 더욱 바람직하게는 생후 1주 이내, 가장 바람직하게는 생후 3일 이내에 실시될 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA의 일반적 백신으로서의 가장 훌륭한 효과는 바이러스가 미성숙 면역계에 투여될 때 관측되기 때문에, 사람을 비롯한 태아 동물을 백신접종하는 것도 바람직할 수 있다. 태아 백신접종은 소나 돼지와 같은 경제적으로 중요한 동물에서 바람직할 수 있다. 태반이 바이러스를 통과시킨다면, 태아는 단순히 어미 동물을 백신접종하는 것에 의해 백신접종될 수 있다 따라서, 태아를 백신접종하기 위해 어미 동물을 백신접종하는 것은 개, 고양이, 래트 및 마우스와 같이 내피성 융모막성 태반을 갖는 동물 또는 사람을 비롯한 영장류와 같이 혈융모태반을 갖는 동물에서 특히 유망하다. 소 및 양과 같이 융모상피성 태반을 갖는 동물 또는 돼지 및 말과 같이 경합직 융모성 태반을 갖는 동물에서, 태아의 백신접종은 자궁내 투여에 의해 실시되는 것이 바람직할 수 있다. 물론, 이러한 투여 형태는 내피성융모막성 태반 또는 혈융모 태반을 갖는 동물에 대해서도 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA는 면역계의 성숙 가속을 초래하고 또 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA는 일반적 백신으로 유용하기 때문에, 백신접종된 동물은 다양한 질병으로부터 보호된다. 보다 자세하게는 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA는 일반적 건강과 고양이과 허피스 또는 고양이과 전염성 복막염으로부터 보호하기 위해 고양이를 백신접종하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA는 일반적 건강과 호흡기 관련(바이러스성) 질병으로부터 보호하기 위해 개에서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA는 일반적 건강과 헤모필루스(Hemophilus) 또는 미코플라즘(Mycoplasm) 감염으로부터 보호하기 위해 돼지, 특히 비육 돼지에 사용될 수 있다.
지적된 바와 같이 바람직한 구체예는 외래 항원 및/또는 종양 항원으로부터 동물을 보호하기 위해 신생아 또는 태아 동물에 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA를 사용하며, 이때 종양 항원은 백신접종에 사용된 바이러스와 관련된 항원과는 상이하다. 그러나, 상기 구체예는 신생아 및 태아 동물에 한정되는 것은 아니다. 대신, 다른 구체예로서, 본 발명은 성체 동물에서도 유리한 효과가 관찰될 수 있기 때문에 모든 연령의 동물에 대해 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명의 구체예에 따르면, 상기 정의한 바와 같은 바이러스, 특히 MVA-BN 및 그의 유도체는 사람을 비롯한 동물을 종양 항원 및 외래 항원으로부터 선택된 항원으로부터 보호하는데 유용하며, 이때 상기 종양 항원 및/또는 외래 항원은 바이러스와 관련된 항원과는 상이하다. 상기 지적한 바와 같이, 본 발명에 따라 사용된 바이러스는 동물 세포를 감염시킬 수 있지만 상기 세포에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없다. 상기 신생아에 대해 적용된 모든 정보, 보호 효과의 지속에 관한 정의를 포함한 정의, 실시예 뿐만 아니라 바람직한, 보다 바람직한 및 가장 바람직한 구체예는 바이러스가 성체에 투여될 수 있는 본 발명에 따른 구체예에 또한 적용될 수 있다.
신생아와 대조적으로, 성체 동물의 면역 계는 이미 성숙되어 있다. 그럼에도 불구하고, 특정 질병에 의해 또는 단순히 동물의 나이로 인하여 면역계가 약화될 수 있다. 특히 면역이 손상된 사람 및 노인의 경우 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA의 투여는 덴드라이트 세포(DC) 또는 이들의 전구세포를 활성화시키고 및/또는 이동시키는 인자의 양을 증가시키고 및/또는 덴드라이트 세포 또는 이들의 전구 세포의 개수를 증가시키며 및/또는 인터페론 또는 IL-12의 생산 및/또는 세포 함량을 증가시키는 것에 의해 유리한 효과를 가질 수 있다. 따라서, 성체 동물의 경우에서도 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA의 투여는 외래 항원 및/또는 종양 항원을 처리하기 위한 면역계의 역량 향상을 초래할 수 있다. 다시 말해, 본 발명에 따른 바이러스는 일반적으로 면역계의 활성화에 유용하다.
본 발명은 사람을 비롯한 동물에 투여하기 위한 의약으로서, 덴드라이트 세포(DC) 또는 이들의 전구세포를 활성화시키고 및/또는 이동시키는 인자의 양을 증가시키고 및/또는 덴드라이트 세포 또는 이들의 전구 세포의 개수를 증가시키며 및/또는 인터페론 또는 IL-12의 생산 및/또는 세포 함량을 증가시키는 의약을 제조하기 위한 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA에 관한 것이다. 다른 구체예에 대해 상기 주어진 모든 정의는 본 구체예에 대해서도 또한 적용될 수 있다. 본 구체예에 따르면, 본 발명은 외래 항원 및/또는 종양 항원에 대한 보호를 유도하는 것을 주 목적으로 하지 않는다. 대신, 본 구체예는 덴드라이트 세포를 활성화시키는 인자의 양이 적은 것과 및/또는 덴드라이트 세포의 개수가 불충분하거나 아주 적은 것 및/또는 인터페론(IFN) 또는 IL-12의 생산 및/또는 세포 함량이 낮은 것을 특징으로 하는 상태 및 질병을 치료하는 것을 목적으로 한다. 따라서 본 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA를 사용한 치료는 알레르기 또는 자가면역 질병으로부터 보호할 수 있었다. 다시 상기 처리는 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA가 신생아 동물에 투여될 수 있다면 특히 유망하다.
부가적으로, 추가의 구체예에 따르면, MVA와 같은 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA-BN 및 그의 유도체는 면역성이 손상된 동물, 예컨대 SIV 감염된 원숭이(CD4 < 400/㎕의 혈액) 또는 면역성이 손상된 인간에서 면역반응을 유도하는데 특히 유용하다. 용어 "면역성이 손상된"은 불완전한 면역 반응만을 나타내거나 또는 병원체에 대한 방어 효율이 감소된 개인의 면역 계 상태를 설명한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA(Modified Vaccinia virus Ankara)를 투여함으로써 종양 항원 및 외래 항원으로부터 선택된 항원으로부터 사람을 비롯한 동물을 보호하는 방법에 관한 것으로, 상기 종양 항원 및 외래 항원은 상기 바이러스와 관련된 항원과는 상이한 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서 본 발명은 MVA를 투여하는 것을 포함하는, 덴드라이트 세포를 활성화시키는 인자의 양을 증가시키고 및/또는 덴드라이트 세포의 개수를 증가시키며 및/또는 인터페론 또는 IL-12의 생산 및/또는 세포 함량을 증가시키기 위해 사람을 비롯한 동물을 치료하는 방법에 관한 것이다.
발명의 요약
사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물을 백신접종 또는 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한 바이러스의 용도에 있어서,
상기 바이러스는 사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물 세포를 감염시킬 수 있지만 사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없는 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스의 용도.
사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물 세포를 감염시킬 수 있지만 사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없는 바이러스를 투여하는 것을 포함하는, 사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물을 치료 또는 백신접종하는 방법.
사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물을 백신접종하거나 치료하기 위한 바이러스에 있어서,
상기 바이러스는 사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물 세포를 감염시킬 수 있지만 사람을 비롯한 신생아 또는 태아 동물에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없는 것을 특징으로 하는 바이러스.
바이러스가 DNA 바이러스인 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
바이러스가 DISC-허피스 바이러스 및 MVA로부터 선택되는 용도, 방법 또는 바이러스.
MVA 균주는 European Collection of Animal Cell Culture(ECACC)에 기탁번호 V00083008에 기탁된 MVA-BN인 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
MVA가 경구, 경비, 근육내, 정맥내, 복막내, 경피, 자궁내 및/또는 피하 적용에 의해 투여되는 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
MVA가 제1 접종("프라이밍 접종") 및 제2 접종("부스팅 접종")에 의해 치료 유효량으로 투여되는 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
MVA가 사람을 비롯한 동물에 적어도 101 TCID50 (조직 배양 감염 투여량)의 양으로 투여되는 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
백신접종이 두창 바이러스 감염으로부터 보호하기 위한 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
두창 바이러스 감염이 천연두 감염인 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
바이러스 게놈이 1개 이상의 이종성 핵산 서열을 포함하는 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
상기 이종성 핵산 서열이 1개 이상의 항원, 항원성 항원결정기 및/또는 치료적 화합물을 코딩하는 서열로부터 선택되는 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
상기 백신접종은 이질적인 서열이 1개 이상의 항원 또는 항원성 항원결정기를 포함하는 물질이거나 그로부터 유도되는 물질로부터 보호되는 것인 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
백신접종은 종양 항원 및 외래 항원으로부터 선택되는 항원으로부터 사람을 비롯한 동물을 보호하기 위한 것으로, 상기 종양 항원 및/또는 외래 항원은 상기 바이러스와 관련된 항원과는 상이한 것을 특징으로 하는 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
외래 항원이 병원균 및 독소로부터 선택되는 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
병원균이 바이러스, 세균, 프리온 및 진균으로부터 선택되는 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
백신처리 또는 치료를 이용하여 면역계의 성숙 및/또는 활성화를 유도 또는 향상시키는 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
상기 치료가 (i) 덴드라이트 세포 또는 이들의 전구세포를 활성화시키고 및/또는 이동시키는 인자의 양을 증가시키고, (ii) 덴드라이트 세포 또는 이들의 전구 세포의 개수를 증가시키며 또는 (iii) 인터페론(IFN) 또는 IL-12의 생산 및/또는 세포 함량을 증가시키기 위해 이용되는 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
덴드라이트 세포를 활성화시키는 인자는 Flt3-L 및/또는 GM-CSF인 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
인터페론이 IFNα 및/또는 IFNβ인 상술한 바와 같은 용도, 방법 또는 바이러스.
상술한 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물.
상술한 바이러스를 포함하는 백신.
도 1A: 갓태어난 마우스에 생후 24-48시간 이내에 106 p.f.u의 MVA 또는 DISC HSV-1를 1회 주사하거나 또는 대조용으로 생리적 식염수(NaCl)를 처리하였다. 생후 7일경에, 팬 DC 마커인 CD11c를 사용하여 유세포 측정법에 의해 말초 혈액에서 이들 세포를 측정하였다. 3 내지 5회 실험의 평균 및 표준편차를 나타낸다.
도 1B: 도 1A에서와 같은 실험. 그러나, CD11c 세포는 유세포 측정법에 의해 비장에서 측정하였다.
도 1C: 도 1A에서와 같은 실험. 그러나, CD11c 세포는 유세포 측정법에 의해 복막액에서 측정하였다.
도 2: 마우스를 좌측 칼럼에 나타낸 바와 같이 MVA-BN으로 백신접종시켰다. 2주 후, 비장 및 혈액중에 있는 CD11c+ 단일 및 CD11c+/CD8+ 이중 포지티브 세포의 %는 유세포 측정법으로 측정하였다.
도 3: 갓태어난 마우스에 생후 1일 및 5일에 MVA 또는 대조용으로 NaCl을 주사하였다. 8일에, 이들 마우스의 혈청에서 ELISA법에 의해 쥐의 Flt3-L을 측정하고 그 값을 pg/ml으로 나타내었다.
도 4: 갓태어난 마우스에 생후 24 내지 48시간 이내에 106 p.f.u.의 MVA를 1회 주사하거나 또는 대조용으로 NaCl로 처리하였다. 생후 7일에, 모든 마우스를 100 x LD50의 HSV-1 균주 F에 노출시켰다. 생존하는 동물의 수는 21일 동안 모니터링하였다.
도 5: 마우스를 도 4에서와 같이 처리시켰다. 데이터는 100 LD50의 HSV-1을 사용하여 9개의 상이한 유발실험을 나타낸다. 대조용 동물은 유발시험에서 살아남지 못한다.
도 6: 생후 1일에 MVA-BN으로 백신접종된 성체 마우스가 후속하는 치사 백시니아 유발시험에서 생존. 6마리의 1일된 새끼 세 배(little)(18마리 마우스)에 MVA-BN(2.5 x 107 TCID50)를 백신접종하고 4주(성체 마우스)를 치사 백시니아 투여량을 이용하여 유발시험하였다. MVA-BN 백신접종은 신생아 마우스에서 성체로 될 때 까지 지속된 보호성 면역을 분명하게 유도하였다.
이하 실시예는 본 발명을 더욱 자세하게 설명한다. 제시된 실시예는 본 발명에 의해 제공되는 기술을 실시예에 적용하는 것으로 제한하는 의미로 해석되는 것이 아니라는 것은 당업자들이 숙지하고 있을 것이다.
실시예 1
(i) MVA - BN 및 DISC - HSV 는 갓태어난 동물에서 CD11c + 및 CD8 + 표현형의 DC 를 유발한다.
제1 실험 세트: 갓태어난 마우스는 IFN 계가 성숙되지 않기 때문에 본래 면역결핍성이다. 지금까지 IFN의 가장 우수한 생산자인 DC의 개수 및 활성화 상태는 아직 분석되어 있지 않다. DC는 다양한 자극에 의해 시험관내에서 뿐만 아니라 생체내에서 유발될 수 있다. 이들 연구에서 제어된 MVA-BN 복제가 DC를 유발할 수 있는지 여부를 시험하고 이들의 표현형을 분석하였다. 마우스 그룹에 생후 1-2일내에 및 일부 경우에 생후 5일에 106 플라크 형성 단위(p.f.u)의 MVA-BN 또는 염수를 1회씩 주사하였다. 양쪽 그룹의 개별 마우스로부터 얻은 혈액 및 비장 세포를 FACS에 의해 분석하고 데이터를 비교하였다.
7 내지 8개 개별 마우스로부터 얻은 데이터는 MVA-BN 처리가 MHC II의 발현증가 및 CD4 또는 CD8 타입의 T 세포의 존재 증가를 수반하는 CD11c+ 세포를 2 내지 3배 증가시킴을 나타내었다. 흥미로운 것은, 성숙 B 세포의 마커인 CD19/54는 감소되며, 이것은 이들 세포가 비장 이외의 기관으로 이동하거나 B세포의 전구세포가 초기 B 세포 마커(B220)를 갖는 플라즈마사이토이드 표현형의 다른 계통의 DC에 보충되었음을 나타낸다.
3회의 상이한 실험 데이터는 재현성 및 현저한 차이를 나타내었다. 상이한 복제 제어 바이러스성 백신인 DISC-HSV-1을 사용한 실험은 신생아 프라이밍 이후에 유사한 양의 CD11c+ 세포를 유도한다.
결과를 도 1A-1C에 요약한다.
혈액 및 비장에서 DC의 생물형군을 더욱 조사하고 또 MVA-BN 처리의 장기간 효과를 분석하기 위하여, 혈액 및 비장중의 세포를 2주일에 분석하였다. 이 시점에서, 처리된 동물은 1주일에 처리된 것에 비하여 비장에서 CD11c+ 세포의 개수가 약 2배이지만, 탄생시 바이러스로 단일 처리한 것은 2주후에 비장에서 이들 세포 개수의 3배 증가를 초래한다(도 2). CD11c+/CD8a+가 4배 정도 높은 것을 제외하고는 혈액에서도 유사한 효과가 나타났다. 생후 7일에 MVA-BN으로 단일 처리하면 13 내지 40배 정도의 CD11c+/CD8a+ 증가를 초래하는 반면에 CD11c+ 세포에 대해서는 효과가 덜하였다. 예상된 바와 같이, 탄생시 및 생후 7일에 2회 백신접종하면 CD11c+ 세포상에 현저한 효과를 나타내었다. 다양한 효과를 도 2에 나타낸다.
제2 실험 세트: 탄생시 2.5 x 107 TCID50의 MVA-BN으로 백신접종된 1주일된 마우스는 대조용 마우스에 비하여 비장 및 혈액에서 상이한 조성의 면역학적으로 관련있는 세포 집단을 나타내었다(표 1). 혈액에서 CD8 포지티브 림프구 집단에서 증가가 있었고 NK 세포 개수의 증가가 있었다. CD11c 포지티브 세포의 개수는 대조용과 비교하여 3배 정도 높았고 B-세포(B220 및 CD19 이중 포지티브 세포)의 %는 현저히 감소되었다. 비장에서 세포의 전체 개수는 면역화된 동물과 대조용 동물에서 차이가 없었다. 혈액과 대조적으로, 백신접종된 동물의 비장은 대조용과 비교하여 더 많은 CD4 포지티브 T 림프구를 나타내었고 또 NK 세포의 개수는 증가되지 않았다. 혈액과 유사하게, CD8 포지티브 림프구의 상대적 개수가 증가되었고 또 B-세포의 개수는 감소되었다. CD11c 포지티브 세포의 %는 대조용과 비교하여 3배 정도 높았다. 우리는 MVA-BN으로 백신접종한지 5일되는 날 덴드라이트 세포의 %의 차이를 먼저 인식하였는데, MVA-BN 백신접종된 4마리 마우스에서 4.8%인 것과 대조적으로 4개의 미처리 대조군의 비장에서 CD11c 포지티브 세포의 개수는 3.6%이었다. 동일한 양의 UV-불활성화 MVA-BN은 대조용(데이터 제시되지 않음)과 비교하여 세포 집단에서 유의한 변화를 유발하지 않았다. 초기 백신접종 투여량은 임의로 선택하였다. 접종물의 역가를 측정한 후 우리는 백신접종을 위해 2.5 x 106 TCID50 의 표준 투여량을 선택하였다(초기 실험에서 보다 10배 미만). 이 투여량에서 DC의 최대개수가 유도되었다(표 2).
Figure pat00001
Figure pat00002
( ii ) MVA - BN 은 우선적으로 플라즈마사이토이드 덴드라이트 세포( pDC )를 유도한다.
다른 저자에 따르면 CD45RA 또는 CD45R을 또한 발현한 CD11c 포지티브 세포는 pDC로 간주되었다(Asselin-Paturel, et al. 2001, Nat Immunol, 12: 1144). MVA-BN이 pDC의 증가를 유발하였는지 여부가 의문시 되었다. CD11c 포지티브상의 CD45RA 또는 CD45R을 분석하는 추가의 실험이 실시되었다. CD11c 및 CD45R 이중 포지티브 세포의 %는 양쪽 대조 그룹(미처리 3.0 ± 0.3%, p = 0.01; UV-불활성화 MVA-BN 3.0 ±0.2%, p = 0.006. 맨-휘트니 유-시험) 에서 보다 MVA-BN 처리된 마우스(5.6±0.7%)에서 훨씬 더 높았다.
( iii ) MVA - BN 으로 처리된 신생아 마우스는 혈청 Flt3 -L의 양을 증가시켰다.
Flt3-L은 성체 동물에서 DC 양의 증가를 초래하는 조혈인자이다. 사람 및 가능하게는 마우스에서, 이 인자의 가장 풍부한 공급원은 활성화된 T 세포이다. 증가된 개수의 DC가 유도된 Flt3-L의 결과인지 여부를 결정하기 위하여, MVA-BN 처리된 마우스의 혈청을 이 인자의 존재에 대해 모의 처리된 동물과 비교하였다. 모의 처리된 동물의 혈청과 비교할 때 처리된 동물은 2일 및 5일에 혈청에서 Flt3-L의 양이 2배이었다. 따라서 Flt3-L은 증가된 개수의 DC에 관여하는 인자중의 하나이다 (도 3).
신생아 마우스에서 Flt3-L 유도시간을 MVA-BN을 투여한 후에 평가하였다. 신생아에서, MVA-BN 백신접종은 24시간 이내에 Flt3-L 농도 증가를 유도하였다. 이러한 유도는 48시간 후에 최대에 도달하였고 비장 세포를 분석하고 HSV-1에 대한 내성을 시험(이하 참조)하는 7일에도 여전히 존재하였다. 백신접종된 마우스에서 혈청중의 Flt3-L 농도는, 연령을 맞춘 대조용 동물과 비교할 때, 백신접종한지 24시간 및 48시간 후에 2배이었다.
실시예 2
(i) MVA - BN 처리된 신생아 마우스는 100 내지 500 LD 50 의 HSV -1을 사용한 유발시험에서 살아남는다.
마우스 그룹을 생후 1일 또는 2일에 표준 투여량의 MVA-BN으로 처리한 다음 7-8일에 100 내지 500 LD50의 단순포진 바이러스 1(HSV-1)를 사용하여 유발시험하였다(도 4). MVA-BN 처리된 마우스는 HSV1에 의한 유발시험에서 살아남은 반면, 모든 대조용 마우스는 유발 바이러스를 접종한 지 5-6일내에 죽었다.
이러한 관찰을 더욱 지지하기 위하여, 40마리의 MVA-BN 처리된 마우스와 45마리의 대조용 마우스를 사용하여 9개 유발시험을 실시하였다. 바이러스 처리된 마우스의 80% 이상이 유발실험에서 살아남았고 반면, 모든 대조용 마우스는 죽었다(도 5).
별도의 실험세트로서, 마우스를 출생시에 MVA-BN (2.5 x 106 TCID50/마우스)으로 처리하였다. 8일째되는 날 103 (1 LD50) 또는 105 (100 LD50) PFU의 HSV-1으로 유발실험을 실시하였다. MVA-BN 백신접종 후 65%의 마우스는, 100%의 대조용 마우스를 치사시킨 바이러스 투여량(100 LD50)에도 생존하였고, 90%의 마우스는 45.5%의 대조용 마우스를 치사시킨 투여량(1 LD50)에도 생존하였다. 추가의 실험에서, UV-불활성화된 MVA-BN으로 백신접종된 7마리 마우스 그룹을 HSV-1로 감염시켰다. 이들중 5마리는 7일이내에 죽었다. 나머지 2마리 동물은 성장이 중지되었고 또 22일 및 29일에 죽었다. 따라서, MVA-BN으로 처리된 마우스는 생 MVA-BN과는 관련있지만 불활성화된 MVA-BN과는 관련이 없는 HSV-1에 대한 증가된 내성상태에 도달하였다.
기능적 T-세포를 갖지 않는 마우스를 이용한 대조 실험에서, MVA-BN으로 백신접종한 후 HSV-1에 대한 보호작용은 MVA-BN에 의해 유도된 교차반응성 세포독성 T-림프구에 기인한 것이 아님이 확인되었다.
DC 세포가 MVA-BN으로 백신접종한 후 HSV-1으로부터 마우스를 보호하는데 관여하는지 시험하였다. 이를 위하여, MVA-처리된 마우스로부터 세포 전달이 있은지 4시간 후에 투약받지 않은(naive) 생후 8일된 마우스를 5 x 104 PFU HSV-1으로 유발실험하였다. 제1 실험에서는 생후 1일에 MVA-BN으로 처리된 8일된 마우스로부터 얻은 비장세포를 DC 풍부 분획(저밀도) 및 DC 부족(고밀도) 분획으로 나누었다. DC 풍부 분획으로부터의 5 x 106 세포를 받은 마우스는 50%정도 유발실험에서 살아남은 반면에, 10배 적은 DC 풍부 현탁액처리된 모든 마우스 또는 미처리 마우스는 5일 이내에 죽었다. 제2 실험은 생후 1일에 MVA-BN으로 처리된 8일된 마우스로부터 분리한 CD11c 포지티브 세포를 천연의 연령을 맞춘 마우스에 전달하는 것에 의해 실시하였다. MVA-BN 처리된 마우스로부터 얻은 80% 이상의 CD11c 포지티브 세포를 함유하는 2 x 106 비장세포의 현탁액은 천연 마우스를 HSV-1 감염으로부터 보호하였다. 대조적으로, 4마리의 미처리 동배동물(littermates) 뿐만 아니라 8마리의 부가적인 미처리 동물은 유발실험후 죽었다. 또한 동량의 비장 세포를 받은 마우스 또는 네가티브 분획의 1 비장 당량(50 x 106 세포)를 받은 마우스는 HSV-1에 대한 증가된 내성을 나타내지 않았다. 따라서 CD11c 포지티브 세포는 마우스를 HSV-1로부터 보호할 수 있다.
MVA 투여후 약 24시간 범위에서 단시간 보호효과는 종래 기술에 기재되어 있다(Vilsmeier, B., Berl. Muench. Tierarztl. Wschr. 112 (1999), 329-333). 상기 문헌에 사용된 바이러스는 사용된 신생아 또는 태아 동물에서 감염성 후대 바이러스로 복제될 수 없는 바이러스는 아니지만, Vilsmerier에 의해 기재된 바와 같이 작용모드가 본 출원에 기재된 바와 같은 작용모드와 유사한지 시험하였다. 보다 자세하게는, Vilsmeier는 MVA, 특히 불활성화된 MVA는 약 24시간 동안 의사단일성을 유발한다고 개시하고 있다. 의사단일 효과가 본 출원에서 기재된 바와 같은 보호 효과를 설명할 수 있는지 실험하기 위하여, 생후 24시간된 마우스를 MVA-BN으로 백신접종시키거나 또는 불활성화된 MVA-BN으로 백신접종하였다. 7일되는 날 마우스에 HSV-1 (105 PFU HSF-1f)의 치사량으로 유발시험하였다. 백신접종되지 않은 대조용 마우스는 유발시험 6일에 죽었다. 또한 불활성화된 MVA-BN으로 백신접종된 마우스는 HSV-1에 의한 유발실험에 대하여 보호되지 않았다. 이들 마우스에서 DC 세포의 개수는 증가되지 않았다. 이와 대조적으로, 불활성화되지 않은 MVA-BN으로 백신접종된 마우스는 HSV-1에 의한 유발실험으로부터 상당히 보호되었다. 유발실험한 지 30일 후에도 80% 이상의 마우스는 여전히 생존하였다. 백신접종한 후 2일되는 날 혈청에서 증가된 혈청 Flt3-L이 발견되었다. 증가된 개수의 DC가 비장에서도 발견되었다. 향상된 Flt3-L은 증가된 개수의 DC와 관련이 있었다. 이것은 의사단일 효과가 관찰된 보호작용에 관여하지 않음을 확인시켜 준다.
( ii ) MVA - BN 은 성체가 될 때 까지 지속되는 신생아에서의 특수한 면역성을 유발한다.
1일된 C57Bl/6 마우스(그룹 크기 18)에 MVA-BN(2.5 x 107 TCID50)을 백신접종하였다. 백신접종한 지 4주후, 마우스가 성체로 간주될 때, 치사량(1 x 104 TCID50)의 백시니아 웨스턴 리저브(VV-WR)을 사용하여 유발실험하였다. 1마리 동물을 제외하고는 다른 모든 MVA-BN 백신접종된 동물은 생존하였다. 대조적으로, 모든 위약 백신접종된 동물은 7일 이내에 죽었으며 주름진 털, 체중감소 및 활동성 감소와 같은 심각한 임상적 증후를 나타내었다. 분명히 이것은 MVA-BN 백신접종이 신생아 동물에서 안전할 뿐만 아니라 치사량의 백시니아(MVA-BN에 관련된 바이러스) 감염에 대해서도 보호작용의 면역반응을 유도할 수 있음을 분명히 나타낸다.
ECACC V00120707 20001207 ECACC V00083008 20000830

Claims (11)

  1. 변형 백시니아 바이러스 안카라(Modified vaccinia virus Ankara, MVA)로부터 제조된, 사람을 포함하는 신생기 동물의 면역계의 성숙을 유도 또는 향상시키기 위한 약제로서, 상기 MVA가 사람을 포함하는 신생기 동물에 불임적으로(abortively) 감염되는 바이러스이고, 상기 성숙이 덴드라이트 세포 및 이들의 전구 세포의 수치 증가와 상관관계가 있음을 특징으로 하는, 약제.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 MVA가 영국 솔즈베리(Salisbury) 소재, European Collection of Animal Cell Culture (ECACC)에 기탁번호 V00083008로 기탁된 것과 같은, MVA-BN 균주 또는 이의 유도체이고, 여기서 상기 안카라 균주 MVA-BN 또는 이의 유도체가 (i) 닭 배아 섬유아세포(CEF) 및 세포주 BHK에서 재생산적으로 복제가능하나, 인간 세포주들에서는 재생산적으로 복제불가능하며, 성숙 B 및 T 세포를 생산할 수 없고, 심각하게 면역 저하되어 있으며, 복제중인 바이러스에 매우 민감한 마우스 계통(strain)에서 복제 불가능함을 특징으로 하는, 약제.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 인간 세포주들이 HaCat와 HeLa인, 약제.
  4. 제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 덴드라이트 세포의 전구 세포가 플라스마사이토이드(plasmacytoid) 덴드라이스 세포 전구체인, 약제.
  5. 제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역계의 성숙의 향상이, 상기 MVA의 투여 2일 경과 후, Flt3-L의 농도의 1.5배 이상의 증가와 상관관계가 있는, 약제.
  6. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제가 경구, 비내, 근육내, 정맥내, 복강내, 피부내, 자궁내(intra-utero) 및/또는 피하 적용에 의해 투여되는, 약제.
  7. 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제가 첫 번째 접종("프라이밍 접종")시 및 두 번째 접종("부스터 접종")시, 치료적 유효량으로 투여되는, 약제.
  8. 제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제의 MVA가 적어도 101TCID50(조직 배양 감염 투여량)의 양으로, 사람을 포함하는 상기 동물에게 투여되는, 약제.
  9. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, 상기 MVA 바이러스의 게놈이 하나 이상의 이종성 핵산 서열을 포함하는, 약제.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 이종성 핵산 서열이 하나 이상의 항원, 항원성 에피토프, 및/또는 치료 화합물을 코딩하는 서열로부터 선택되는, 약제.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 이종성 핵산 서열이 인터페론, IL-12, Flt3-L 및 GM-CSF 중에서 선택된 단백질을 엔코딩하는, 약제.
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