NO336348B1

NO336348B1 - Anvendelse av modifisert vacciniavirus Ankara (MCA) til fremstilling av et legemiddel for behandling av et neonatalt dyr.

Info

Publication number: NO336348B1
Application number: NO20044941A
Authority: NO
Inventors: Paul Chaplin; Mark Suter; Mathias Ackermann; Marco Franchini; Sabine Vollstedt; Hans Peter Hefti
Original assignee: Bavarian Nordic As
Priority date: 2002-04-19
Filing date: 2004-11-12
Publication date: 2015-08-03
Also published as: WO2003088994A3; JP2005523318A; UA85371C2; HK1078777A1; JP4801880B2; JP2010120955A; EP2204180A2; NZ536592A; EP2204180A3; US8163293B2; CA2478009A1; EP2204179A2; AU2003239805B2; ES2288609T5; DK1420822T3; DE60314823T3; EA200401405A1; US20110135683A1; EP1420822B1; US7897156B2

Description

Oppfinnelsen angår anvendelse av et virus til fremstilling av et legemiddel for vaksinering eller behandling av neonatale eller prenatale dyr, inkludert et menneske, hvori virus er i stand til å infisere cellen til det neonatale eller prenatale dyret, inkludert et menneske, men ikke i stand til å bli replikert til infeksiøse etterkommervirus i det neonatale eller prenatale dyr, inkludert et menneske. Viruset er et modifisert vacciniavirus Ankara (MVA).

Særlig angår oppfinnelsen vaksinasjon av nyfødte mot infeksjoner med virus som tilhører samme virusgruppe som virus brukt til vaksinasjon. Videre angår oppfinnelsen vaksinasjon av nyfødte mot antigener valgt fra fremmede antigener og tumorantigener, hvori tumorantigenene og/eller det fremmede antigen er forskjellig fra antigenene assosiert med virus. Oppfinnelsen angår videre anvendelse av virus som definert ovenfor for å øke nivået av faktorer som aktiverer dendrittiske celler eller deres forløperceller og/eller å øke antall dendrittiske celler eller deres forløperceller og/eller å øke produksjon og/eller cellulært innhold av et interferon (IFN) eller IL-12.

De naturlige omgivelsene for dyr og mennesker inneholder et stort utvalg av infeksiøse midler så som virus, bakterier eller sopp. Mange av disse infeksiøse midler kan forårsake sykdommer i de infiserte verter. Under normale omstendigheter restitueres den infiserte vert fra sykdommen indusert av det infeksiøse middel etter en viss tidsperiode. Denne restitusjonen skyldes immunsystemet til dyret eller mennesket.

Immunsystemet er den del av den menneskelige eller dyrekropp som er ansvarlig for å eliminere det infeksiøse middel. Immunresponsen er oppdelt i en spesifikk og en uspesifikk (iboende) reaksjon skjønt begge samarbeider tett. Dem uspesifikke immunresponsen er det øyeblikkelige forsvar mot et stort utvalg av fremmede stoffer og infeksiøse midler. I den iboende immunresponsen mot virus, er interferon (IFN)-a og IFN-P absolutt essensielle for å kontrollere den initiale virusreplikasj on og aktivere naturlige dreper (NK) celler for øyeblikkelig å drepe infiserte celler. Intracellulære bakterielle eller parasittiske patogener induserer IL-12 som oppregulerer IFN-y i NK-celler og/eller noen undersett av T-celler. IFN-y-aktiverte NK-celler kan nå drepe intracellulære patogener. Videre aktiverer IFN-y også makrofager og gjør dem i stand til å drepe internaliserte patogener.

Den beste kilden til IFN-a/p på pr. cellebasis er dendrittiske celler (DC), en spesialisert cellepopulasjon strategisk fordelt i kroppen. Plasmocytoid DC eller CD1 lc+CD8+DC er blant de beste produsentene av IFN-a/p. CD8<+>DC som er infisert med intracellulære ikke-virale patogener er de viktige cellene som er i stand til å sekrere IL-12 essensielt for de tidlige trinn i immunforsvaret.

En spesifikk immunrespons kan induseres mot et spesielt fremmed stoff (antigen) etter en forsinkelsesfase, når organismen blir utfordret med dette stoffet for første gang. Initiering av den spesifikke immunresponsen er også koordinert av DC. Det er en konstant trafikk av disse celler fra periferien til de sekundære lymfoide organer, lymfeknutene eller milten hvor naive T- og B-celler resirkulerer. Antigen som blir bragt til disse organer av DC gjør mulig aktivering av naive T- og B-celler for å bli effektor T- og B-celler. For disse bærer ikke DC bare antigenet men plastisiteten til patogengjenkjennelse tilsvarer forskjellig genaktivering i DC og således en patogenjustert pre-aktivering av T-celler.

Den spesifikke immunresponsen er meget effektiv og er ansvarlig for det faktum at et individ som restitueres fra en spesifikk infeksjon er beskyttet mot denne spesifikke infeksjonen. Således vil en andre infeksjon med det samme eller meget likt infeksiøst middel forårsake mye mildere symptomer eller ikke noen symptomer i det hele tatt siden det allerede er en "pre-eksisterende spesifikk immunitet" for dette middel. Slik immunitet og den immunologiske hukommelse varer over en lang tid og i noen tilfeller til og med gjennom hele livet. Følgelig kan induksjon av en immunologisk hukommelse brukes til vaksinasjon, dvs. å beskytte et individ mot infeksjon med et spesifikt patogen.

For vaksinasjon blir immunsystemet utfordret med en vaksine som i seg selv er mindre farlig enn det patogene midlet mot hvilke en immunrespons skal induseres. Vaksinen omfatter eller uttrykker epitoper som er funnet i eller uttrykt ved midlet mot hvilke vaksinasjonen foretas. Organismen er således immunisert mot midlet som inneholder epitopen som er del av vaksinen.

Typiske vaksiner er svekkede eller inaktiverte virus (feks. polio- eller koppevirusvaksiner), rekombinante proteiner (f.eks. rekombinant hepatitt B-virus S-protein), varmeinaktiverte bakterielle toksiner (Clostridium tetani toxin) eller polysakkarider fra den bakterielle kapselvegg (Streptococcus pneumoniae).

Siden infeksiøse sykdommer kan føre til meget kritiske tilstander hos nyfødte og spedbarn, er det en interesse å vaksinere barn eller nyfødte dyr så tidlig som mulig. Eksempler på tilstander mot hvilke en vaksine er ønskelig er poksvirusinfeksjoner, inkludert kopper. Imidlertid er forsøk på vellykket vaksinering av nyfødte hindret av det faktum at immunsystemet til nyfødte pattedyr ikke ennå er modent. Immunsystemet til neonatale barn og pattedyr er ment å modnes gradvis over en viss tidsperiode. For mennesker skjer modningen under det første leveåret. Dette er grunnen til det faktum at den neonatale aldersgruppe er utsatt for forskjellige infeksjoner i løpet av det første år (Gans et al., J. Am. Med. Assoc. (1998) 280, 527-532). Mer spesielt har neonatale barn svekket B-cellefunksjon, defekter i primær antigenpresentasjon ved dendrittiske celler og begrenset T-celleproliferasjon (Gans et al., J. Am. Med. Assoc. (1998) 280, 527-532). Kort etter fødsel er T- cellenivåene i milten tusen ganger lavere enn hos voksne. For å oppnå minst en svak immunisering ble det foreslått å bruke enten replikerende virus eller formuleringer som omfatter en adjuvans for injisering. Med replikerende virus er det imidlertid alltid den risikoen at det umodne immunsystemet kan bli overveldet av virusinfeksjon eller levende virale vaksiner siden T-celler er nødvendig for viral utklarering (Hassett et al., J. Virol. (1997) 71, 7881-7888). Siden det er en redusert produksjon av cytokiner ved Th-1 hjelpe T-celler i nyfødte er responsen til barn hovedsakelig Th-2. Følgelig er cytotoksiske T-celler ikke rekruttert og utklarering av virus oppnås ikke.

Situasjonen hos pattedyrdyr er meget lik situasjonen hos mennesker, dvs. immunsystemet etter fødsel er ikke enda modent. Hos nyfødte mus er antall milt CD4+ T-celler 80000 og antallet CD8+ T-celler 1000 ganger lavere enn i milten til voksne. Videre er det interferon (INF) produserende system umodent hos disse musene. Derfor er neonatale mus ute av stand til effektivt å kontrollere ekspansjon av intracellulære patogener ved IFN på infeksjons stedet. I tillegg er det lave antall og eventuelt utilstrekkelige aktiveringstrinn til immuncellene altfor begrenset til å bekjempe hurtig ekspanderende patogener eller replikerende vira brukt for vaksinasjon.

På grunn av risikoen assosiert med levende virusvaksiner er det ikke anbefalt å vaksinere neonatale dyr, inkludert mennesker, med replikerende virus. Det er f.eks. anbefalt ikke å vaksinere nyfødte mot kopper med vacciniavirusstammer som er blitt brukt inntil utslettelsen av kopper, så som stammene Elstee, Copenhagen og NYCBH. I henhold til nylige anbefalinger i USA bør ikke babyer yngre enn 12 måneder få de inntil nå kommersialiserte koppevaksiner.

Vaksinasjon av nyfødte med formuleringer som omfatter en adjuvans har den ulempen at forskjellige skadelige stoffer blir innført i kroppen. Således blir en vaksinasjon av humane nyfødte bare gjort i krisesituasjoner, f.eks. i tilfelle av hepatitt B virusinfeksjon.

Som oppsummering skal det bemerkes at immunsystemet ikke er modent ved fødsel. Siden vaksinasjon med replikasjonskompetente virus eller formuleringer som omfatter en adjuvans har betydelige ulemper, blir ikke barn vaksinert før de er 2 måneder gamle i Tyskland (Empfehlung der Ståndigen Impfkommission STICO, 2001) eller 6 uker i USA (ACIP "Recommended Childhood Immunization Schedule, United States").

Forsinkelsen i utvikling av immunsystemet blir delvis kompensert ved overføring av maternale antistoffer fra moren til spedbarnet under graviditeten eller ved amming. Alle spedbarn blir imidlertid ikke ammet av forskjellige årsaker. Således er det en meget kritisk tidsperiode på ca. 6-8 uker hos mennesker under hvilke spedbarnet har et umodent og således ikke fullt funksjonelt immunsystem, ikke mottar maternale antistoffer og under hvilke en vaksinasjon vanligvis ikke er vellykket eller altfor farlig.

Situasjonen er meget lik hos pattedyr-dyr, særlig for økonomisk viktige dyr så som kuer eller kjæledyr så som katter og hunder. For å redusere kostnadene blir melkemengden som kalven mottar fra moren ofte drastisk redusert. Isteden mottar kalven en blanding av melkepulver, startfor og spesifikt konsentrert for, noen ganger allerede i den første uken etter fødsel. Følgelig mottar ikke kalven den nødvendige mengde og utvalg av maternale antistoffer slik at det umodne immunsystemet er meget utsatt for infeksjon. Videre er farmere som avler kalver og de som forer dem opp for kjøttproduksjon ofte ikke de samme. På 4-6 ukers alder blir kalver fra forskjellige avlsfarmer samlet og transportert til andre farmer for kjøttproduksjon. På dette tidspunkt er maternale antistoffer lave og immunsystemet er ikke fullt utviklet mens dyrene blir eksponert til nye infeksiøse midler under stressende betingelser. Dette øker risikoen for infeksjoner som kunne vært forhindret ved vaksinasjon. En lignende situasjon kan finnes hos katteavlere eller hundeavlere hvor det infeksiøse trykket er høyt.

I norsk søknad nr. 20032309A beskrives et svekket virus utledet fra Vaccinia Ankaravirus.

I artikkelen av Yong-de Zhu et al, (2000) i Virology, vol 276, nr. 1, side 202-213 beskrives en studie av nyfødte aper som er immunisert med rekombinant vaccinia virus som uttrykker hemagglutinin fra meslingvirus og fusjonsproteiner.

Det er en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe midler for å vaksinere henholdsvis nyfødte mennesker og dyr, mot fremmede antigener og antigener som er assosiert med sykdommer i henholdsvis mennesker og dyr. Mer spesielt er hensikten med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe midler som tillater akselerert modning av immunsystemet til de nyfødte dyrene eller menneskene. Det er en ytterligere hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe midler som innbefatter vaksinering av neonatale dyr, inkludert mennesker, mot poksvirusinfeksjoner, særlig mot kopper.

I henhold til foreliggende oppfinnelse ble det uventet funnet at det er mulig og sikkert og effektivt vaksinere og/eller behandle neonatale eller prenatale dyr, inkludert mennesker, med virus som er i stand til å infisere cellene til det neonatale eller prenatale dyr, inkludert et menneske, men ikke i stand til å bli replikert i nevnte celler til infeksiøse etterkommervirus.

Nærmere bestemt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse anvendelse av modifisert vacciniavirus Ankara (MVA), hvori MVA-et er stammen MVA-BN deponert ved European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK) med deponeringsnummeret V00083008 eller derivater derav hvori nevnte Ankara stamme MVA-BN eller dens derivater er kjennetegnet (i) ved å være i stand til reproduserende replikasjon i hønseembryofibroblaster (CEF) og i babyhamster nyrecellelinjen BHK, men ingen evne til reproduserende replikasjon i humane cellelinjer, og (ii) ved en manglende evne til å reprodusere i en musestamme som ikke er i stand til å produsere modne B- og T-celler og som sådan er alvorlig immunkompromittert og meget utsatt for en reproduserende virus, til fremstilling av et legemiddel for behandlingen av et neonatalt dyr inkludert et menneske, hvori MVA er et virus som abortivt infiserer det neonatale dyret, inkludert menneske, og hvori behandlingen induserer eller forsterker modningen av immunsystemet, hvori nevnte modning er korrelert med en økning av antallet av dendrittiske celler eller deres forløperceller.

Særlig er det blitt vist at viruset brukt i henhold til foreliggende oppfinnelse, så som MVA, særlig MVA-BN og dets derivater (se nedenfor), kan administreres til nyfødte uten at det vises noen skadelige virkninger. Vaksineringen av dyr med virus fører til en spesifikk immunreaksjon mot viruset brukt for vaksinering og/eller til en generell vaksinasjon mot fremmede antigener og tumorantigener som forklart nedenfor i mer detalj. Videre fører viruset brukt i henhold til foreliggende oppfinnelse til en induksjon og/eller forsterkning av modningen til immunsystemet som er assosiert med en økning i antall dendrittiske celler og faktorer så som interferoner. Vaksinasjon med virus brukt i henhold til foreliggende oppfinnelse er mulig selv om formuleringen som administreres til dyret ikke omfatter en adjuvans.

I oppsummering vil virus som blir anvendt i henhold til foreliggende oppfinnelse (i) gi en effektiv immunrespons hos nyfødte, (ii) kan administreres uten behov for en adjuvans og (iii) bærer ikke risikoen for å overvelde organismen.

Anvendelsen i henhold til foreliggende oppfinnelse medfører at den beskyttende virkningen blir utøvet for minst 5 dager, fortrinnsvis 7, 14 eller 28 dager etter første vaksinasjon.

Virus som er "i stand til å infisere celler" er virus som har på den virale overflate strukturer som er i stand til å interagere med vertscellene til en slik grad at virus eller i det minste det virale genomet blir inkorporert i vertscellen. Skjønt virus brukt i henhold til foreliggende oppfinnelse er i stand til å infisere vertscellen, er de ikke i stand til å bli replikert til infeksiøse etterkommervirus i de infiserte celler. Overensstemmende med den foreliggende oppfinnelse betyr betegnelsen "virus ikke i stand til å bli replikert til infeksiøs etterkommervirus i nevnte celler" virus hvis genom i det minste delvis transkriberes og translateres til virale proteiner eller til og med replikert, imidlertid ikke pakket til infeksiøse virale partikler. Således er virus brukt i henhold til den foreliggende oppfinnelse virus som fører til mislykkede infeksjoner i verten. Mislykkede infeksjoner kan skje av to årsaker: i henhold til det første alternativ kan en celle være utsatt for infeksjon men den trenger ikke å tillate formering av virus, f.eks. på grunn av det faktum at ikke alle virale gener for formering av virus i nevnte celle blir uttrykt og/eller er tilstede i det virale genomet. Et eksempel på denne type virus i henhold til foreliggende oppfinnelse i humane celler er modifisert vacciniavirus Ankara (MVA) som er forklart i mer detalj nedenfor. I henhold til et andre alternativ kan en mislykket infeksjon også resulteres fra infeksjon av cellen med defekte virus, som mangler et komplett antall av virale gener. Et eksempel på et slikt virus i henhold til foreliggende oppfinnelse for humane celler er DISC-HSV1 (uskadeliggjort enkel-syklus Herpes simplex virus), dvs. et Herpes simplex virus som er begrenset til en enkel infeksjonssyklus (Dilloo et al., Blood 1997, 89: 119-127). Dette virus mangler genet for det essensielle glykoprotein H (gH), men kan dyrkes til høy titer i en komplementerende cellelinje som uttrykker gH. I ikke-komplementerende cellelinjer som tillater herpes-virusvekst, er den begrenset til en enkel replikasjonssyklus som fører til frigjøring av ikke-infeksiøse virus. Betegnelsen "ikke i stand til å bli replikert" refererer seg fortrinnsvis til virus som ikke replikerer i det hele tatt i cellene til det vaksinerte dyr. Virus som viser en liten residual replikasjonsaktivitet som blir kontrollert av det umodne immunsystemet til den nyfødte er imidlertid også innenfor foreliggende søknads område.

Virus i henhold til foreliggende oppfinnelse er et modifisert vacciniavirus Ankara (MVA), hvori MVA-et er stammen MVA-BN deponert ved European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK) med deponeringsnummeret V00083008 eller derivater derav hvori nevnte Ankara stamme MVA-BN eller dens derivater er kjennetegnet ved (i) ved å være i stand til reproduserende replikasjon i hønseembryofibroblaster (CEF) og i babyhamster nyrecellelinjen BHK, men ingen evne til reproduserende replikasjon i humane cellelinjer, og (ii) ved en manglende evne til å reprodusere i en musestamme som ikke er i stand til å produsere modne B-og T-celler og som sådan er alvorlig immunkompromittert og meget utsatt for et reproduserende virus. Det skal forstås at et virus som er i stand til å infisere celler til en første dyreart men ikke i stand til å bli replikert til infeksiøse etterkommervirus i nevnte celler kan oppføre seg forskjellig i en annen dyreart. F.eks. for humane MVA-BN og dets derivater (se nedenfor) er virus som er i stand til å infisere celler hos mennesker men som ikke er i stand til å bli replikert til infeksiøse etterkommervirus i humane celler. De samme virus kan replikere i høns, dvs. i høns behøver ikke MVA-BN å være et virus som ikke er i stand til å bli replikert til infeksiøse etterkommervirus i cellene til høns. Det er kjent for en person med kunnskap på området hvilke virus som skal velges for en spesifikk dyreart. En test som tillater en å bestemme i hvilken grad et virus er i stand eller ikke i stand til å bli replikert i et neonatalt eller prenatalt dyr er beskrevet i WO 02/42480 og anvender AGR129 musestamme. Resultatene oppnådd i denne musemodellen er indikerende for mennesker. Således tilsvarer betegnelsen "ikke i stand til å bli replikert til infeksiøs etterkommervirus" som brukt i foreliggende søknad betegnelsen "mangel på replikasjon in vivo" som brukt for mus i WO 02/42480. Flere detaljer for denne testen er gitt nedenfor. Virus i henhold til foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis i stand til å bli replikert i minst én celletype til minst én dyreart. Således er det mulig å amplifisere virus før administrering til dyret som skal vaksineres og/eller behandles. Ved hjelp av eksempel refereres det til MVA-BN som kan amplifiseres i CEF-celler men som er et virus som ikke er i stand til å bli replikert til infeksiøse etterkommervirus i det neonatale eller prenatale mennesket. I denne forbindelse skal det bemerkes at kjemisk eller fysisk inaktiverte virus ikke har alle egenskapene til denne foretrukne utformingen siden inaktiverte virus er i stand til å infisere cellene til det neonatale eller prenatale dyr, inkludert et menneske, og ikke i stand til å bli replikert til infeksiøs etterkommervirus i det neonatale eller prenatale dyr, inkludert et menneske, men disse virus er ikke i stand til og replikeres i minst én type av celler hos minst én dyreart.

Modifisert vaccinia Ankara (MVA) virus er beslektet med vacciniavirus, et medlem av slekten ortopoksvirus i familien til poksviridae. MVA er blitt dannet ved 516 seriepasseringer på hønseembryofibroblaster til Ankara-stammen av vacciniavirus (CVA) (for oversikt se Mayr, A., et al., Infection 3, 6-14 [1975]). Som en konsekvens av disse langtidspassasjene mistet det resulterende MVA-virus ca. 31 kilobaser av dens genomsekvens og ble derfor beskrevet som meget vertscellebegrenset til fugleceller (Mayr, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038

[1991]). Det er vist i et utvalg av dyremodeller at den resulterende MVA var signifikant avirulent (Mayr, A. & Danner, K. [1978] Dev. Biol. Stand. 41: 225-34). I tillegg er denne MV A-stammen testet i kliniske forsøk som vaksine for å immunisere mot human koppesykdom (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). Disse undersøkelsene involverte over 120000 mennesker inkludert høyrisikopasienter og viste at sammenlignet med vacciniabaserte vaksiner, hadde MVA redusert virulens eller infeksiøsitet mens det opprettholdt god immunogenisitet.

Egenskapene til spesielt foretrukne MVA-stammer, fortrinnsvis de mest foretrukne stammer for mennesker, så som MVA-BN og dets derivater kan oppsummeres som følger: (i) evne til reproduserende replikasjon i hønseembryofibroblaster (CEF) og i cellelinjen BHK, men ingen evne til reproduserende replikasjon i den humane cellelinje HaCat,

(ii) svikt i replikeringen in vivo,

(iii) induksjon av en høyere immunogenisitet sammenlignet med de kjente stammer MVA 575 (ECACC V00120707) i en letal utfordringsmodell og/eller (iv) induksjon av minst hovedsakelig det samme immunitetsnivå i vacciniavirus pre-aktivering/vacciniavirus forsterkningsregimer sammenlignet med DNA-reaktivering/vacciniavirus forsterkerregimer.

For detaljert informasjon med hensyn på assayet brukt til å bestemme i hvilken grad MV A-stammen har én eller flere av de ovennevnte trekk (i) til (iv) refereres det til WO 02/42480. Denne publikasjonen beskriver også hvordan virus som har de ønskede egenskapene kan oppnås. Særlig tilveiebringer WO 02/42480 en detaljert definisjon av trekkene til MVA-BN og til et derivat av MVA-BN og beskriver i detalj de biologiske assayene som blir brukt for å bestemme om en MV A-stamme er MVA-BN eller et derivat derav. Med andre ord er trekkene til MVA-BN, beskrivelse av biologiske assayer som tillater å evaluere om en MVA-stamme er MVA-BN eller et derivat derav og fremgangsmåter som tillater en å oppnå MVA-BN eller et derivat derav, beskrevet i WO 02/42480. I det følgende er det kort oppsummert hvordan en person med kunnskap på området tilveiebringer MVA-stammer som har én eller flere av de ovennevnte trekk og hvordan han kan teste om en gitt MVA-stamme har ett eller flere av nevnte trekk og således er det mest foretrukne virus i henhold til foreliggende oppfinnelse. Den følgende oppsummering skal ikke forstås som begrensning av relevansen til WO 02/42480 for den foreliggende søknad til den følgende informasjonen..

Betegnelsen "ikke i stand til reproduserende replikasjon" i cellelinjen HaCAT (Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106(3): 761-71) blir benyttet i den foreliggende søknad som definert i WO 02/42480. Således er en virus som "ikke er i stand til reproduserende replikasjon" i cellelinjen HaCat en virus som viser et amplifikasjonsforhold på mindre enn én i den humane cellelinjen HaCat. Fortrinnsvis er amplifikasjonsgraden til virus brukt som en vektor i henhold til foreliggende oppfinnelse 0,8 eller mindre i den humane cellelinje HaCat. "Amplifikasjonsgraden" til et virus er forholdet mellom virus produsert fra en infisert celle (utbytte) til mengden opprinnelig brukt til å infisere cellen i første instans (tilførsel) ("amplifikasjonsgrad"). En grad på "1" mellom utbytte og tilførsel definerer en amplifikasjonsstatus hvori mengden av virus produsert fra den infiserte celle er den samme som mengden initialt brukt for å infisere cellene. Betegnelsen "derivater" av virus som deponert under ECACC V00083008 betegner fortrinnsvis virus som viser essensielt de samme replikasjonsegenskaper som den deponerte stamme men som viser forskjeller i én eller flere deler av dets genom. Virus som har de samme "replikasjonsegenskaper" som den deponerte virus er virus som replikerer med liknende amplifikasjonsgrader som den deponerte stammen i CEF-celler og cellelinjene BHK, HeLa, HaCat og 143B og som viser en liknende replikasjon in vivo som bestemt i den AGR129 transgene musemodell (se nedenfor).

Betegnelsen "replikeringssvikt in vivo" er brukt i foreliggende søknad som definert i WO 02/42480. Således angår nevnte betegnelse virus som ikke replikerer i mennesker og i musemodellen som forklart i WO 02/42480. Musene brukt i WO 02/42480 er ute av stand til å produsere modne B- og T-celler (AGR 129 mus). Spesielt MVA-BN og dets derivater dreper ikke AGR129-mus innenfor en tidsperiode på minst 45 dager, mer fortrinnsvis innenfor minst 60 dager, mest fortrinnsvis innenfor 90 dager etter infeksjon av musene med IO<7>pfu-virus administrert intraperetonealt. Fortrinnsvis er virus som viser "replikasjonssvikt in vivo"karakterisert vedat ingen virus kan gjenvinnes fra organer eller vev til AGR129-mus 45 dager, fortrinnsvis 60 dager og mest fortrinnsvis 90 dager etter infeksjon av musene med 10<7>pfu-virus administrert intraperetonealt.

Istedenfor AGR129-mus kan enhver annen musestamme anvendes som er i stand til å produsere modne B- og T-celler og som sådan er alvorlig immunkompromittert og meget utsatt for en replikerende virus.

Detaljene ved det letale utfordringseksperimentet brukt for å bestemme om en MVA-stamme har "en høyere immunogenisitet sammenlignet med den kjente stamme MVA 575" er forklart i WO 02/42480. I en slik letal utfordringsmodell dør uvaksinerte dyr etter infeksjonen med replikasjonskompetente vacciniastammer, så som Western Reserve stamme L929 TK+ eller IHD-J. Infeksjonen med replikasjonskompetente vacciniavirus blir betegnet som "utfordring" i sammenheng med beskrivelsen av den letale utfordringsmodellen. Fire dager etter utfordringen blir musene vanligvis drept og den virale titer i ovariene blir bestemt ved standard plakkassayer ved å bruke VERO-celler. Den virale titer blir bestemt for uvaksinerte mus og for mus vaksinert med MVA-BN og dets derivater. Mer spesifikt er MVA-BN og dens derivaterkarakterisert vedat i denne test er, etter vaksinasjon med IO<2>TCID50/ml virus, ovarievirustiter redusert med minst 70 %, fortrinnsvis minst 80 %, mer fortrinnsvis med minst 90 % sammenlignet med uvaksinerte mus.

I en foretrukket utforming er virus i henhold til foreliggende oppfinnelse nyttig for preaktiverings-/forsterkings-administrering. Virusene iforeliggende oppfinnelse anvendes for effektivt først å pre-aktivere og deretter forsterke immunresponsen i native dyr så vel som i dyr med en pre-eksisterende immunitet for poksvirus. Således induserer viruset henhold til foreliggende oppfinnelse minst hovedsakelig det samme nivå av immunitet i vacciniavirus pre-aktivering/vacciniavirus-forsterkingsregimer sammenlignet med DNA-pre-aktivering/vacciniavirus-forsterkingsregimer.

En vacciniavirus, særlig en MVA-stamme er betraktet som å indusere minst hovedsakelig det samme nivå av immunitet i vacciniavirus pre-aktiverings-/ vacciniavirus-forsterkingsregimer sammenlignet med DNA-preaktivering/vacciniavirus-forsterkingsregimer hvis CTL-responsen som målt i én av "assay 1" og "assay 2" som beskrevet i WO 02/42480, fortrinnsvis i begge assayer, minst hovedsakelig det samme i vacciniavirus-pre-aktivering/vacciniavirus-forsterkingsregimer sammenlignet med DNA-pre-aktiverings-/vacciniavirus-forsterkingsregimer. Mer fortrinnsvis er CTL-responsen etter vacciniavirus-preaktiverings-/vacciniavirus-forsterkingsadministrasjon høyere i minst ett av assay ene, sammenlignet med DNA- pre-aktiverings-/vacciniavirus-forsterkingsregimer. Mest fortrinnsvis er CTL-responsen høyere i begge assayer.

Virus brukt i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan være modifisert vacciniavirus Ankara (MVA), hvori MVA-et er stammen MVA-BN deponert ved European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK) med deponeringsnummeret V00083008 eller derivater derav hvori nevnte Ankara stamme MVA-BN eller dens derivater erkarakterisert(i) ved å være i stand til reproduserende replikasjon i hønseembryofibroblaster (CEF) og i babyhamster nyrecellelinjen BHK, men ingen evne til reproduserende replikasjon i humane cellelinjer, og (ii) ved en manglende evne til å reprodusere i en musestamme som ikke er i stand til å produsere modne B- og T-celler og som sådan er alvorlig immunkompromittert og meget utsatt for et reproduserende virusBetegnelsen "heterolog" som brukt i foreliggende søknad betegner enhver kombinasjon av nukleinsyresekvenser som ikke normalt er funnet intimt assosiert med virus i naturen, slik virus blir også kalt "rekombinant virus".

Den heterologe nukleinsyresekvens er fortrinnsvis valgt fra en sekvens som koder for minst ett antigen, antigenepitop, gunstige proteiner og/eller terapeutisk forbindelse.

Betegnelsen "gunstige proteiner" som brukt i foreliggende søknad betegner ethvert protein som hjelper til å beskytte et dyr mot et antigen valgt fra tumorantigen og fremmende antigen, hvori tumorantigenet og det fremmede antigenet er forskjellig fra antigenene assosiert med virus. Alternativt og mer spesielt er "gunstige proteiner" aktive til å øke nivået av faktorer som aktiverer dendrittiske celler og/eller aktive til å øke antall dendrittiske celler og/eller aktive til å øke produksjon og/eller cellulært innhold av et interferon (IFN) eller IL-12. Således er eksempler på slike gunstige proteiner interferoner så som IFN-alfa eller IFN-beta, IL-12, Flt3-L eller GM-CSF.

De antigene epitopene kan være alle epitoper til hvilke det er fornuftig å indusere en immunrespons. Eksempler på antigene epitoper er epitoper fra Plasmodium falciparum, Mycobacteria, influensavirus, fra virus valgt fra familien Flaviviruser, Paramyxovirus, hepatittvirus, human immunsviktvirus eller fra virus som forårsaker blødningsfeber, så som Hantavirus eller Filovirus, dvs. Ebola eller Marburg-virus. Således, hvis f.eks. en rekombinant MVA som uttrykker heterologe epitoper blir brukt til å vaksinere nyfødte i henhold til foreliggende oppfinnelse er resultatet av denne behandling ikke bare en generell vaksinasjon på grunn av den akselererte modning av immunsystemet men også en spesifikk vaksinasjon mot den heterologe epitopen uttrykt fra det heterologe MVA.

En "terapeutisk forbindelse" kodet av den heterologe nukleinsyren i den rekombinante virus kan være f. eks. en terapeutisk nukleinsyre så som en antisense nukleinsyre eller et peptid eller protein med ønsket biologisk aktivitet.

Innskudd av heterolog nukleinsyresekvens er fortrinnsvis i en ikke-essensiell region av virusgenomet. Alternativt er den heterologe nukleinsyresekvens innskutt på et naturlig forekommende delesjonssete i det virale genomet (for MVA beskrevet i PCT/EP96/02926). Fremgangsmåter for hvordan å innføre heterologe sekvenser i det virale genomet som et poksviralt genom er kjent for en person med kunnskap på området.

Det beskrives heri også en farmasøytisk sammensetning og en vaksine som omfatter en virus i henhold til foreliggende oppfinnelse, så som MVA, feks. for å indusere en immunrespons i en levende dyrekropp, inkludert et menneske.

Den farmasøytiske sammensetningen kan generelt inkludere én eller flere farmasøytisk akseptable og/eller anbefalte bærere, tilsettinger, antibiotika, preserveringsmidler, adjuvanser, fortynningsmidler og/eller stabilisatorer. Slike hjelpestoffer kan være vann, saltoppløsning, glyserol, etanol, fuktingsmidler eller emulgerende midler, pH-buffersubstoffer eller lignende. Egnede bærere er typisk store, langsomt metaboliserte molekyler så som proteiner, polysakkarider, polymelkesyrer, polyglykolsyrer, polymere aminosyrer, aminosyrekopolymerer, lipidaggregater eller lignende.

For fremstilling av vaksinen blir virus eller dets rekombinanter konvertert til en fysiologisk akseptabel form. Slike fremgangsmåter er kjent for en person med kunnskap på området. For MVA og andre poksvirus kan vaksinen fremstilles basert på erfaring med fremstilling av poksvirus vaksiner brukt for vaksinasjon mot kopper (som beskrevet av Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). F.eks. blir det rensede virus lagret ved -80°C med en titer på 5x10<8>TCID50/ml formulert i ca. 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,4. For fremstilling av vaksineinjeksjoner, blir feks. lO^lO8 viruspartikler så som MVA lyofilisert i 100 ml fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) i nærvær av 2 % pepton og 1 % humant albumin i en ampulle, fortrinnsvis en glassampulle. Alternativt kan vaksineinjeksjonen produseres ved trinnvis frysetørking av virus i en formulering. Denne formuleringen kan inneholde ytterligere tilsettinger så som mannitol, dekstran, sukker, lysin, laktose eller polyvinylpyrrolidon eller andre tilsettinger så som antioksidanter eller inerte gasser, stabilisatorer eller rekombinante proteiner (feks. humant serumalbumin) egnet for in vivo administrering. Glassampullen blir deretter forseglet og kan lagres mellom 4°C og romtemperatur i flere måneder. Så lenge det ikke eksisterer noe behov blir imidlertid ampullen fortrinnsvis lagret ved temperaturer lavere enn -20°C.

For vaksinasjon eller terapi kan lyofilisatet oppløses i 0,1-0,5 ml av en vandig oppløsning, fortrinnsvis fysiologisk saltoppløsning eller Tris-buffer, og administreres enten systemisk eller lokalt, dvs. ved parenteral, intramuskulær eller enhver annen administrasjons vei kjent for en person med kunnskap på området. Administrasjonsmåten, dosen og antall administrasjoner kan optimaliseres med de med kunnskap på området på en kjent måte.

Virus i henhold til foreliggende oppfinnelse kan administreres ved oral, nasal, intramuskulær, intravenøs, intraperetoneal, intradermal, intrauterus og/eller subkutan applikasjon. I små dyr blir inokulasjon for immunisering fortrinnsvis utført parenteralt eller nasalt, mens i større dyr eller mennesker er en subkutan, intramuskulær eller oral inokulering foretrukket.

MVA blir administrert fortrinnsvis i en dose på 10<1>TCID50

(vevskulturinfeksjonsdose) til IO9 TCID50.

Som nevnt ovenfor kan virus i henhold til foreliggende oppfinnelse administreres i en terapeutisk effektiv mengde i en første inokulering ("preaktiveringsinokulering") og i en andre inokulering ("forsterkerinokulering").

I forbindelse med foreliggende oppfinnelse dekker betegnelsen "dyr" også mennesker. Mer generelt er dyret et virveldyr, fortrinnsvis et pattedyr inkludert et menneske. Spesifikke eksempler på dyr er kjæledyr så som hunder, katter, økonomisk viktige dyr så som kalver, kveg, sau, geit, hester, griser og andre dyr så som mus, rotter. For disse dyrearter og for mennesker er MVA og DISC-HSV spesielt foretrukne virus. Oppfinnelsen kan også anvendes for økonomisk viktige fugler så som kalkuner, ender, gås og høns hvis viruset som brukes er i stand til å infisere fuglens celler men ikke i stand til å bli replikert til infeksiøse etterkommervirus i nevnte celler.

Betegnelsen "tamdyr" som brukt i foreliggende oppfinnelse betyr fortrinnsvis tamme pattedyr, mer fortrinnsvis hunder, katter, kalver, kveg, sau, geit, griser, hester, hjortedyr.

I henhold til et første alternativ kan virus i henhold til foreliggende oppfinnelse

anvendes som spesifikke vaksiner, dvs. til å utløse en immunrespons som beskytter den vaksinerte nyfødte mot sykdommer forårsaket av en virulent virus som tilhører samme virusgruppe, familie eller slekt enn virus som ble brukt for vaksinering. Som et eksempel kan MVA som definert ovenfor, særlig MVA-BN og dets derivater anvendes til å vaksinere nyfødte mennesker mot poksvirusinfeksjoner, særlig mot kopper. MVA, særlig MVA-BN og dens derivater kan også anvendes til å vaksinere virveldyr mot poksvirusinfeksjoner av veterinærmessig viktighet. I henhold til dette første alternativet kan virus brukt for vaksinasjon være et ikke-rekombinant virus, så som MVA-BN eller dets derivater, eller en rekombinant virus som har gener i det

virale genomet som ikke er naturlig funnet i nevnte genom. Fortrinnsvis har det rekombinante virus ytterligere gener som hjelper til med stimulering av immunresponsen. Eksempler på denne type gener er cytokine gener og interferongener.

I henhold til et annet men beslektet alternativ blir nyfødte vaksinert med en rekombinant virus som har en heterolog nukleinsyresekvens som definert ovenfor for å indusere en immunrespons mot aminosyresekvensen uttrykt fra den heterologe nukleinsyresekvens. Som eksempel kan nukleinsyresekvensen kode for et antigen eller en antigen epitop som definert ovenfor. Eksempler på en rekombinant virus i henhold til denne utformingen er rekombinant MVA, særlig rekombinant MVA-BN eller et derivat derav, som omfatter en heterolog nukleinsyre som koder for antigen fra (i) virus andre enn MVA, så som HIV-1, HIV-2, Denguevirus, West-Nile virus, japansk enzefalittvirus, meslingvirus, (ii) tumorantigener, (iii) bakterier, (iv) sopp. Hvis antigenet uttrykt fra det rekombinante virus er f.eks. et HIV-antigen er det mulig å bruke det rekombinante virus til å indusere en immunrespons i den vaksinerte nyfødte mot HIV og forhindre AIDS. I bredere forstand i det rekombinante virus som uttrykker antigenene eller antigenepitop brukt til å indusere en immunrespons mot midlet fra hvilken den heterologe sekvens er avledet og/eller mot midlet som omfatter antigenet eller antigenepitopen.

I henhold til et tredje alternativ er det uventet blitt funnet at virus som er i stand til å infisere cellene til det nyfødte eller prenatale dyr, inkludert et menneske, men ikke i stand til å bli replikert til infeksiøse etterkommervirus i det neonatale eller prenatale dyr, inkludert et menneske, kan anvendes til fremstilling av et legemiddel til å beskytte et dyr, særlig et nyfødt dyr, inkludert et menneske, mot et antigen valgt fra tumorantigen og fremmede antigen, hvori tumorantigenet og/eller det fremmede antigenet er forskjellig fra antigenene assosiert med virus.

I dette tredje alternativ blir nyfødte vaksinert med virus i henhold til foreliggende oppfinnelse beskyttet mot en utfordring med fremmede antigener så som infeksiøse midler. Således er virus i henhold til foreliggende oppfinnelse en generell vaksine for nyfødte, dvs. vaksinere nyfødte med virus i henhold til foreliggende oppfinnelse blir immunsystemet til de nyfødte mer kompetente til å bekjempe fremmede antigener så som virus. I eksempelavsnittet er dette eksemplifisert for vaksinasjon med MVA og en påfølgende utfordring med Herpes simplex virus type 1. Således vil virus i henhold til foreliggende oppfinnelse, særlig MVA, bli brukt ved vaksinasjon av nyfødte blir de vaksinerte dyrene mer beskyttet mot fremmede antigener enn uvaksinerte dyr i en kritisk tidsperiode inntil et funksjonelt og modent immunsystem er etablert.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er "tumorantigenet og/eller det fremmede antigen" forskjellig fra antigenene assosiert med virus. Denne betegnelsen skal fortolkes slik at i henhold til denne utforming er oppfinnelsen ikke primært ment å benytte et virus så som MVA for å indusere en immunrespons mot viruset i seg selv. Isteden er virus brukt til å indusere en immunrespons eller i det minste en generell immunstimulering som beskytter verten mot henholdsvis fremmede antigener og tumorantigener, som ikke er assosiert med virus. Betegnelsen "antigener assosiert med virus" betegner epitoper og antigener til viruspartikkelen og til antigener og epitoper på overflate av en celle infisert med virus som er resultat av ekspresjon av det virale genom.

I sammenheng med denne utforming betyr betegnelsen "fremmede antigener" ethvert antigen og epitoper som ikke naturlig er en del eller en komponent av dyrelegemet. Fremmede antigener er spesielt antigener og epitoper fra infeksiøse midler og toksiner. Typiske infeksiøse midler er virus så som herpesvirus, retrovirus, rabiesvirus, rabdovirus, adenovirus; bakterier så som Salmonella, Mycoplasma, Meningicoccus, Hemophilus; prioner eller fungi.

Oppfinnelsen er ikke bare av interesse for å vaksinere dyr mot fremmede antigener, men i en alternativ utforming er den også egnet til å vaksinere mot tumorantigener. "Tumorantigener" er antigener assosiert med visse tumorsykdommer. Tumorantigener er oftest antigener kodet for ved genomet til verten som utvikler tumoren. Således i en streng tolkning er tumorantigener ikke fremmede antigener. Tumorantigener er imidlertid funnet i signifikante mengder i tumorer, mens mengden av tumorantigener i normalt vev er signifikant lavere og oftest er ikke tumorantigener funnet i det hele tatt i normalt vev. Eksempler på tumorantigener er kjent for en person med kunnskap på området og inkluderer feks. MAGE-antigener. MVA er effektive mot disse tumorantigener siden vaksinasjon av dyr fører til en aktivering og/eller akselerert modning av immunsystemet som heretter kan føre til destruksjon av tumorceller.

Betegnelsen "beskyttelse mot et antigen" betyr utvikling av en immunrespons som er rettet mot det fremmede antigenet eller tumorantigenet. Hvis det fremmede antigen er et infeksiøst middel blir verten beskyttet mot nevnte middel, dvs. verten utvikler en immunrespons mot nevnte antigen. Følgelig fører infeksjonen med det infeksiøse middel til en mindre alvorlig sykdom eller ingen sykdom i det hele tatt. Betegnelsen "beskyttende" skal ikke forstås slik at det alltid er 100 % beskyttelse mot det fremmede eller tumorantigenet. Isteden betyr betegnelsen "beskyttelse" som brukt i foreliggende søknad enhver gunstig virkning som hjelper dyret til å behandle henholdsvis det fremmede antigenet og tumorantigenet.

En slik beskyttende virkning kan bli utøvd i minst 5 dager, fortrinnsvis i minst 7, 14 eller 28 dager etter første vaksinasjon. Med andre ord blir det vaksinerte og/eller behandlede dyr beskyttet, feks. mot et fremmed antigen etter henholdsvis 5, 7, 14 og 28 dager.

I sammenheng med foreliggende oppfinnelse kan virkningen av vaksinasjonen av nyfødte med virus i henhold til foreliggende oppfinnelse forklares ved induksjon eller forsterkning av modning av immunsystemet og/eller aktivering av immunsystemet. I sammenheng med foreliggende oppfinnelse betyr betegnelsen "induksjon eller forsterkning av modningen av immunsystemet" blant annet akselerert økning av dendrittiske celler eller deres forløpere i de vaksinerte i forhold til kontroller. Betegnelsen "akselerering av modningen" av immunsystemet og "forsterking av modningen" av immunsystemet blir brukt om hverandre i denne beskrivelsen.

"Aktivering av immunsystemet" erkarakterisert vedekspresjon på overflaten av cellene av molekyler og hormoner som gjør lettere celle/celleinteraksjon eller trafikkering og/eller ved sekresjon av nevnte molekyler og hormoner fra cellene. Spesifikke reseptorer tar opp disse signaler og gir en respons. Aktiveringsmarkører er blant annet Flt3-L, IL-12, IFN-alfa, MHC-II og CD8, særlig CD8alfa (se nedenfor).

Den akselererte utvikling/modning av immunsystemet er korrelert med en økning av nivået av faktorer som aktiverer og/eller mobiliserer dendrittiske celler (DC) eller deres forløperceller og/eller en økning i antall dendrittiske celler og deres forløperceller, og/eller en økning i produksjon og/eller cellulært innhold av et interferon eller IL-12. Et eksempel på DC-forløperceller som blir indusert av virus i henhold til foreliggende oppfinnelse, er plasmocytoide DC-forløpere som er meget viktige for forsvarsverket mot virale infeksjoner og som synes å produsere IFN-a/p.

Mer spesifikt er forsterkingen av modningen av immunsystemet fortrinnsvis definert med minst to ganger økning i overflatemarkører funnet på DC, så som MHC-II, CD40 og/eller CD80/86. Fortrinnsvis kan en slik økning måles i blodet. Ytterligere markører for å karakterisere en forsterking av modningen av immunsystemet er Flt3-L, IL-12, IFN-alfa, MHC-II og CD8a (se nedenfor). Videre er den akselererte modning av immunsystemet fortrinnsvis korrelert til minst 1,5 ganger økning, fortrinnsvis minst to ganger økning i antall CDllc positive celler i blodet og/eller milten 7 dager etter administrering av MVA-BN til nyfødte dyr sammenlignet med kontrolldyr som ikke har mottatt MVA-BN. Videre kan forsterking av modningen av immunsystemet fortrinnsvis korreleres med minst 1,5 ganger økning, mer fortrinnsvis minst 2,0 ganger økning i konsentrasjonen av Flt3-L 2 dager etter vaksinering av nyfødte med virus i henhold til foreliggende oppfinnelse, sammenlignet med alderstilpassede kontroller.

I denne forbindelse skal det bemerkes at det er en assosiasjon mellom fenotyp og funksjon av murine og humane DC-populasjoner som kan karakteriseres ved deres overflatefenotyp (Hochrein et al. 2002. Hum. Immunol. 63: 1103). DC i blodet kan detekteres ved å bruke flow cytometri ved å bruke et område av overflatemarkører

(MacDonald et al. 2002. Blood. 100: 4512) som også tillater at spesifikke populasjoner av DC, så som plasmaktoidet DC kan identifiseres (Dzionek et al. 2002. Hum Immunol. 63: 1133; Dzionek et al. 2000. J. Immunol. 165: 6037). Ved bruk av lignende teknikk kan DC også detekteres i annet humant vev (Summers et al. 2001. Am. J. Pathol. 159: 285).

I henhold til foreliggende oppfinnelse kan virus som definert ovenfor også anvendes til å behandle neonatale eller prenatale dyr for å øke nivået av faktorer som aktiverer og/eller mobiliserer dendrittiske celler (DC) eller deres forløperceller, og/eller en økning i antall dendrittiske celler og deres forløperceller, og/eller en økning i produksjon og/eller cellulært innhold av et interferon eller IL-12. Det er blitt vist at etter vaksinasjon med MVA-BN produserer de plasmacytoide dendrittiske celler signifikant mer IL-12 og har en øket IFN-alfa-produksjon og oppregulering av MHC-II og CD8a. Økningen av IL-12 etter administrering av virus anvendt i henhold til den foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis 2 ganger, mer fortrinnsvis 100 ganger, 500 ganger, 1000 ganger, 2500 ganger eller 5000 ganger. Økningen i konsentrasjon av Flt3-L to dager etter vaksinasjon av nyfødte med virus i henhold til foreliggende oppfinnelse, mest fortrinnsvis med MVA-BN eller dets derivater, er fortrinnsvis 1,5 gang, mer fortrinnsvis 2,0 gang sammenlignet med alderstilpassede kontroller.

Betegnelsen "aktivering av dendrittiske celler eller deres forløpere" betyr modning av DC til antigenpresenterende celler gjennom dårlig definerte celletrinn drevet av hormoner og stimuli. Mellomproduktene til DC er betegnet forløpere. Disse umodne DC når periferien. Forskjellige (antigene) stimuli aktiverer DC. Aktiveringsmarkører som er oppregulert i aktiverte dendrittiske celler er blant annet Flt3-L, IL-12, IFN-alfa, MHC-II og CD8a (se nedenfor).

Det ble bemerket at hormoner så som GM-CSF fører til mer umodne DC i periferien. Fordi GM-CSF fører til mer DC-forløper i benmarg, blod og perifere organer (og cellene beveger seg der) har dette fenomenet blitt betegnet "mobilisering av dendrittiske celler eller deres forløpere". Denne definisjonen er også brukt i foreliggende beskrivelse.

Følgelig er vaksinering av dyr inkludert et menneske spesielt nyttig, hvis den er ment å øke nivået av faktorer som aktiverer dendrittiske celler (DC) eller deres forløperceller og/eller å øke antall dendrittiske celler eller deres forløperceller og/eller øke produksjonen og/eller cellulært innhold av et interferon eller IL-12.

Faktorer som aktiverer dendrittiske celler omfatter blant annet Flt3-L (Lyman et al., Cell 1993, 75: 1157-1167) og GM-CSF. Typiske interferoner i henhold til den foreliggende oppfinnelse er IFN-alfa og IFN-beta. Virus brukt i henhold til foreliggende oppfinnelse induserer Flt3-L og det er antatt at noe av de gunstige virkningene observert skyldes nevnte induksjon.

I sammenheng med foreliggende søknad er et nyfødt dyr eller menneske definert som et dyr eller menneske som ikke enda har et modent immunsystem. Gjennom denne beskrivelsen er betegnelsene "nyfødt dyr" og "neonatalt dyr" brukt synonymt. Et modent immunsystem erkarakterisert vedevnen til fullt å aktivere det medfødte immunsystemet og av det faktum at alle kjente T- og B-cellefunksjoner og produkter er på plass, særlig immunoglobulinisotyper så som IgA og IgE. Således er et umodent immunsystemkarakterisert vedet lavt antall T-celler, B-celler og dendrittiske celler i forhold til hos voksne, ved en IFN-produksjon som er lav sammenlignet med hos voksne, og av det faktum at de sekundære lymfoide organer ikke er helt modne. Mer spesifikt kan en "neonatal" eller "nyfødt" i sammenheng med foreliggende oppfinnelse defineres som et spedbarndyr som har et antall milt CD4'-celler som er fortrinnsvis minst 2 ganger, mer fortrinnsvis minst 20 ganger, mer fortrinnsvis minst 200 ganger, mer fortrinnsvis minst 2000 ganger, mest fortrinnsvis minst 20000 ganger lavere enn det gjennomsnittlige antall milt CD4+-celler hos voksne.

I mus er immunsystemet modent ved 4 ukers alder. Hos mennesker tar modningen sannsynligvis 6 måneder til 1 år. I katter og hunder er immunsystemet vanligvis modent i 6 måneders alder, hos kalver, sau og griser ved 4-12 ukers alder. Vaksinasjon med virus i henhold til foreliggende oppfinnelse blir fortrinnsvis gjort under perioden før immunsystemet er modent. Siden modenhet utvikles nesten eksponensielt etter fødsel er det imidlertid mest foretrukket å vaksinere med virus i henhold til foreliggende oppfinnelse, så hurtig etter fødsel som mulig. Siden i alle relevante tamdyr og hos mennesker er immunsystemet modent ikke tidligere enn 4 uker etter fødsel, er det generelt foretrukket at vaksinasjon med virus i henhold til foreliggende oppfinnelse, blir gjort fortrinnsvis innen 4 uker etter fødsel, mer fortrinnsvis innen 2 uker etter fødsel, enda mer fortrinnsvis innen 1 uke etter fødsel, mest fortrinnsvis innen 3 dager etter fødsel. Disse generelle retningslinjer er anvendbare for alle viktige tamdyr, særlig alle viktige tamme pattedyr, inkludert mennesker. En person med kunnskap på området vil være klar over det faktum at selv eldre dyr kan betraktes som nyfødte/neonatale i sammenheng med foreliggende oppfinnelse og at vaksinasjonen således med hell kan utføres med eldre dyr, når immunsystemet ikke enda er modent 4 uker etter fødsel. Således kan hos mennesker vaksinasjonen utføres innenfor 6 måneder etter fødsel, mer fortrinnsvis innenfor 3 måneder etter fødsel, mer fortrinnsvis innenfor 2 måneder etter fødsel, mer fortrinnsvis innenfor 4 uker etter fødsel, mer fortrinnsvis innenfor 2 uker etter fødsel og enda mer fortrinnsvis innenfor 1 uke etter fødsel, mest fortrinnsvis innen 3 dager etter fødsel.

Siden de beste virkninger av virus i henhold til foreliggende oppfinnelse som en generell vaksine observeres hvis viruset blir administrert til et umodent immunsystem kan det være foretrukket å vaksinere selv prenatale dyr inkludert mennesker. Prenatal vaksinering kan være ønskelig hos økonomisk viktige dyr så som kveg eller griser. Hvis placenta lar virus passere gjennom kan det prenatale dyr vaksineres ganske enkelt ved å vaksinere mordyret. Således er vaksinasjon av mordyret for å vaksinere det prenatale dyr spesielt lovende hos et dyr som har en placenta endotheliochorialis så som hunder, katter, rotter og mus eller som har en placenta heamochorialis, så som primater, inkludert mennesker. I dyr som har en placenta chorionepithelialis så som kveg og sau eller som har en placenta syndesmochorialis, så som griser og hester kan vaksinering av prenatale dyr fortrinnsvis gjøres ved in utero administrering. Denne administrasjonsmåten kan selvfølgelig også gjøres for dyr som har en placenta endotheliochorialis eller heamochorialis.

Siden virus i henhold til foreliggende oppfinnelsefører til en akselerert modning av immunsystemet og siden virus i henhold til foreliggende oppfinnelsesåledes er nyttig som en generell vaksine blir de vaksinerte dyr beskyttet mot et utvalg av sykdommer. Mer spesifikt kan virus i henhold til foreliggende oppfinnelseanvendes til å vaksinere katter for generell velvære og mot feline herpes eller feline infeksiøs peritonitt. Virus i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan anvendes til hunder for generell velvære og mot respiratorisk traktassosierte (virale) sykdommer. Virus i henhold til foreliggende oppfinnelsekan brukes til griser for generelt velvære og mot Hemophilus eller Mycoplasm infeksjoner, særlig til griser under oppfeting.

Som antydet tidligere er det en foretrukket utforming å anvende virus i henhold til foreliggende oppfinnelse hos nyfødte eller prenatale dyr for å beskytte nevnte dyr mot et fremmed antigen og/eller et tumorantigen, hvori tumorantigenet er forskjellig fra antigenene assosiert med virus brukt for vaksinasjon. Denne utforming er imidlertid ikke begrenset til nyfødte og prenatale dyr. Isteden kan i en alternativ utforming oppfinnelsen utføres for dyr av alle aldere, siden en gunstig virkning kan observeres også hos voksne dyr. Således, i henhold til denne utforming er virus som definert ovenfor, særlig MVA-BN og dens derivater nyttig til å beskytte et dyr, inkludert et menneske, mot et antigen valgt fra tumorantigen og fremmed antigen, hvori tumorantigenet og/eller det fremmede antigen er forskjellig fra antigenene assosiert med virus. Som pekt på ovenfor er virus anvendt i henhold til foreliggende oppfinnelse i stand til å identifisere celler hos dyret men ikke i stand til å bli replikert til infeksiøse etterkommervirus i nevnte celler. All informasjon, definisjoner, inkludert definisjonen til varigheten av den beskyttende virkning, eksempler så vel som de foretrukkede, mer foretrukkede og mest foretrukkede utforminger gitt ovenfor for neonatale dyr kan også appliseres til foreliggende utforming i henhold til hvilke virus også kan administreres til voksne.

I kontrast til nyfødte har immunsystemet til voksne dyr allerede modnet. Ikke desto mindre kan det være at immunsystemet er svekket på grunn av visse sykdommer eller ganske enkelt på grunn av dyrets alder. Særlig hos immunkompromitterte folk og hos eldre folk kan administrering av virus i henhold til foreliggende oppfinnelsetil dyret ha en gunstig virkning, blant annet ved å øke nivået av faktorer som aktiverer, og/eller mobiliserer dendrittiske celler (DC) eller deres forløperceller, og/eller ved å øke antall av dendrittiske celler eller deres forløperceller, og/eller ved å øke produksjon og/eller cellulært innhold av et interferon eller IL-12. Således kan, selv i voksne dyr administrasjon av virus i henhold til foreliggende oppfinnelseføre til en øket kompetanse til immunsystemet for å behandle fremmede antigener og/eller tumorantigener. Med andre ord er virus brukt i henhold til foreliggende oppfinnelse nyttig til aktivering av immunsystemet generelt.

Oppfinnelsen angår videre virus i henhold til foreliggende oppfinnelsetil fremstilling av et legemiddel som skal administreres til et dyr, inkludert et menneske, hvori nevnte legemiddel øker nivået av faktorer som aktiverer dendrittiske celler og/eller øker antall dendrittiske celler, og/eller øker produksjonen og/eller cellulært innhold av et interferon (IFN) eller IL-12. Alle definisjoner gitt ovenfor for de andre utformingene kan også appliseres i foreliggende utforming. I henhold til denne utforming retter ikke oppfinnelsen seg primært mot å indusere en beskyttelse mot fremmede antigener og/eller tumorantigener. Isteden er denne utforming rettet på å behandle tilstander og sykdommerkarakterisert vedet lavt nivå av faktorer som aktiverer dendrittiske celler, og/eller ved et utilstrekkelig eller altfor lavt antall av dendrittiske celler, og/eller ved en lav produksjon og/eller cellulært innhold av et interferon (IFN) eller IL-12. Således i henhold til denne utforming kunne behandlingen med virus i henhold til foreliggende oppfinnelsebeskytte mot allergier eller autoimmune sykdommer. Igjen er denne behandling spesielt lovende hvis virus i henhold til foreliggende oppfinnelseadministreres til nyfødte dyr.

I tillegg i henhold til en ytterligere utforming er virus i henhold til foreliggende oppfinnelse, så som MVA-BN og dens derivater spesielt nyttig til å indusere immunresponser i immunkompromitterte dyr, feks. aper (CD4 < 400/ul blod) infisert med SIV, eller i immunkompromitterte mennesker. Betegnelsen "immunkompromitterte" beskriver status av immunsystemet til et individ, som viser bare ufullstendige immunresponser eller har en redusert effektivitet ved forsvar mot infeksiøse midler.

Det beskrives heri en fremgangsmåte til behandling av et dyr, inkludert et menneske, for å øke nivået av faktorer som aktiverer dendrittiske celler og/eller som øker antallet av dendrittiske celler og/eller øker produksjonen og/eller cellulært innhold av et interferon (IFN) eller IL-12, som omfatter administrering av et Modifisert Vaccinia virus Ankara (MVA).

I en utføreselsform av foreliggende anvendelse har viruset ingen evne til reproduserende replikasjon i den humane cellelinjen HaCat eller HeLa.

I følge en annen utførelsesform av foreliggende anvendelse er forløpercellene av de dendrittiske cellene plasmacytoide dendrittiske celleforløpere.

I følge en annen utførelsesform av foreliggende anvendelse er forsterkingen av modningen av immunsystemet korrelert med en minst 1,5 ganger økning i konsentrasjonen av Flt3-L to dager etter administreringen av MVA.

I følge ytterligere en annen utførelsesform av foreliggende anvendelse kan legemidlet administreres ved oral, nasal, intramuskulær, intraperitoneal, intradermal, intrautero og/eller subkutan applikasjon.

I følge ytterligere en annen utførelsesform av foreliggende anvendelse kan legemidlet administreres i en terapeutisk effektiv mengde i en første inokulering ("preaktiveringsinokulering") og i en andre inokulering ("forsterkerinokulering").

I følge ytterligere en annen utførelsesform av foreliggende anvendelse kan legemidlet administreres til dyret, inkludert et menneske, i en mengde på minst 10<1>TCID50(vevskulturinfeksiøs dose) av MVA.

I følge ytterligere en annen utførelsesform av foreliggende anvendelse omfatter virusgenomet minst én heterolog nukleinsyresekvens.

I følge ytterligere en annen utførelsesform av foreliggende anvendelse er den heterologe nukleinsyresekvensen valgt fra en sekvens som koder for minst ett antigen, antigenepitop, og/eller terapeutisk forbindelse.

I følge ytterligere en annen utførelsesform av foreliggende anvendelse koder den heterologe nukleinsyresekvensen for et protein valgt fra interferon, IL-12, Flt3-L og

GM-CSF.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. IA: Nyfødte mus ble injisert én gang innen 24-48 timer etter fødsel med IO<6>p.f.u. av MVA eller DISC HSV-1 eller behandlet med fysiologisk saltoppløsning (NaCl) som kontroller. Ved en alder på 7 dager, ble CD1 lc, en pan DC-markør brukt til å bestemme disse cellene i det perifere blod ved flow cytometri. Gjennomsnittelig og standard avvik på 3-5 eksperimenter er vist. Fig. IB: Eksperiment som i fig. IA. CD1 lc-cellene ble imidlertid bestemt i milten ved flow cytometri. Fig. 1C: Eksperiment som i fig. IA. CDllc-celler ble imidlertid bestemt i peretoneal væske ved flow cytometri. Fig. 2: Mus ble vaksinert med MVA-BN som angitt i venstre kolonne. Etter 2 uker ble prosentandel av CDllc<+>enkel og CDllc<+>/CD8<+>dobbelt positive celler i milt og i blodet bestemt ved flow cytometri. Fig. 3: Nyfødte mus ble injisert med MVA eller NaCl som kontroller på dag 1 og dag 5 etter fødsel. På dag 8 ble murint Flt3-L bestemt i serum hos disse mus ved ELISA og verdiene er gitt i pg/ml. Fig. 4: Nyfødte mus ble injisert én gang innen 24-48 timer etter fødsel med IO<6>p.f.u. MVA eller behandlet med NaCl som kontroller. I en alder av 7 dager ble alle musene eksponert til 100 x LD50av HSV-1-stamme F. Antall overlevende dyr ble overvåket i 21 dager. Fig. 5: Mus ble behandlet som i fig. 4. Dataene representerer 9 forskjellige utfordringseksperimenter med 100 LD50av HSV-1. Ingen av kontrolldyrene overlevde utfordringen. Fig. 6: Overlevelse av voksne mus vaksinert på den første dag etter fødsel med MVA-BN etterfulgt av en letal vacciniautfordring. Tre kull på 6 1 dag gamle unger (18 mus) ble vaksinert med MVA-BN (2,5 x IO7 TCID50) og ved 4 uker (voksne mus) utfordret med en letal dose av vaccinia. MVA-NB-vaksinasjonen induserte klart en beskyttende immunitet hos neonatale mus som varte inntil voksen alder.

Eksempler

De følgende eksempler vil ytterligere illustrere den foreliggende oppfinnelse. Det skal forstås av en person med kunnskap på området at de tilveiebragte eksempler på ingen måte skal fortolkes på en måte som begrenser anvendelsen av teknologien tilveiebragt disse eksemplene av foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

(i) MVA-BN og DISC-HSV induserer DC av CDllc<+>og CD8<+>fenotypen i nyfødte dyr

Første sett av eksperimenter: Nyfødte mus er naturlig immunodefekte på grunn av at IFN-systemet ikke er modent. Antall aktiveringstilstand av DC, de beste produsenter av IFN kjent i dag er ikke blitt analysert. DC kan induseres in vitro så vel som in vivo av et utvalg av stimuli. I disse undersøkelsene ble det testet om en kontrollert MVA-BN-replikasjon kunne indusere DC og deres fenotyp ble analysert. Grupper av mus ble injisert med IO<6>plakkdannende enheter (p.f.u.) av MVA-BN eller saltoppløsning bare innenfor 1 -2 dager etter fødsel og i noen tilfeller 5 dager etter fødsel. Blod- og miltceller fra individuelle mus fra begge grupper ble analysert med FACS og dataene sammenlignet.

Data fra 7-8 individuelle mus anga at behandlingen med MVA-BN øket CD1 lc+-celler 2-3 ganger etterfulgt av en øket ekspresjon av MHC II og øket nærvær av T- celler av CD4- eller CD8-type. Av interesse er det at CD 19/54, en markør for modne B-celler, ble redusert, noe som kan bety at disse celler emigrerte til organer utover milten eller at forløperen til B-celler ble rekruttert tidlig til andre nedstamningslinjer, feks. DC av den plasmocutoide fenotyp som bærertidlige B-cellemarkører (B220).

Data fra tre forskjellige eksperimenter anga reproduserbarhet og signifikante forskjeller. Eksperimenter med DISC-HSV-1, en annerledes replikasjonskontrollert viral vaksine, induserer liknende mengder av CD1 lc+-celler etter neonatal preaktivering.

Resultatene er oppsummert i fig. 1A-C.

For ytterligere å undersøke subpopulasjoner av DC i blod og milt og analysere langtidsvirkning av behandlingen med MVA-BN, ble celler i blod og milt analysert ved en alder på 2 uker. På dette tidspunkt hadde de behandlede dyr ca. dobbelt antall av CD1 lc+-celler i milten enn ved en alder på 1 uke, men en enkel behandling med virus ved fødsel førte til en tre ganger økning i antall av disse celler i milten 2 uker senere (fig. 2). Lignende effekter ble sett i blod med unntak av at CDllc7CD8a+ var ca. fire ganger høyere. En enkel behandling med MVA-BN 7 dager etter fødsel førte til en økning av CD1 lc+/CD8a+ fra 13-40 ganger med en mindre dramatisk virkning på CDllc<+->cellene. Som forventet hadde to vaksinasjoner ved fødsel og på dag 7 en signifikant virkning på CD1 lc+-celler. De forskjellige virkninger er vist i fig. 2.

Andre sett av eksperimenter: En ukes gamle mus som ble vaksinert ved fødsel med 2,5 x 10 TCID50med MVA-BN viste en forskjellig sammensetning av immunologisk relevante cellepopulasjoner i milt og blod enn kontrollmus (tabell 1). I blod var det en økning i CD8 positiv lymfocyttpopulasjonen så vel som en økning i antallet NK-celler. Antallet CD1 lc positive celler var ca. 3 ganger høyere enn i kontroller og prosentandelen av B-celler (B220 og CD 19 dobbelpositive celler) var signifikant redusert. I milten var det totale antall celler ikke forskjellig mellom immuniserte dyr og kontroller. I kontrast til blodet hadde milten til vaksinerte dyr mer CD4 positive T-lymfocytter enn kontroller og antallet NK-celler var ikke øket. I likhet med blodet ble det relative antall CD8 positive lymfocytter øket og antall B-celler redusert. Prosentandelen av CDllc positive celler var ca. 3 ganger høyere enn i kontroller. Vi gjenkjente først en forskjell i prosentandelen av dendrittiske celler på dag 5 etter vaksinasjonen med MVA-BN, når antallet av CD1 lc positive celler i milten på 4 ubehandlede kontroller var 3,6 %, sammenlignet med 4,8 % i 4 MVA-BN-vaksinerte mus. Den samme mengde av UV-inaktivert MVA-BN forårsaket ingen signifikant forandring i cellepopulasjonen etter vaksinasjon av neonatale mus sammenlignet med kontroller (data ikke vist). Den initiale vaksinasjonsdosen ble valgt tilfeldig. Etter titrering av inokulum valgte vi en standard dose på 2,5 x IO<6>TCID50for vaksinasjon (10 ganger mindre enn det initiale eksperiment). Ved denne dose ble maksimale antall av DC indusert (tabell 2).

(ii) MVA-BN induserer fortrinnsvis plasmacytoid dendrittiske celler (pDC).

I henhold til andre forfattere ble CDllc positive celler som også uttrykte CD45RA eller CD45R betraktet som pDC (Asselin-Paturel et al., 2001, Nat Immunol, 12: 1144). Det ble reist spørsmålet om MVA-BN induserte en økning i pDC. Et ytterligere eksperiment ble utført i hvilke også CD45RA eller CD45R på CDllc positive ble analysert. Prosentandelen av CDllc og CD45R dobbel positiv celle var signifikant høyere i MVA-BN-behandlede mus (5,6 + 0,7 %) enn i begge kontrollgrupper (ubehandlet 3,0 + 0,3 %, p = 0,01; UV-inaktivert MVA-BN 3,0 + 0,2 %, p = 0,006. Mann-Whitney U-test).

(iii) Neonatale mus behandlet med MVA-BN har eleverte nivåer av serum FK3-L

Flt3-L er en hematopoetisk faktor som fører til økte nivåer av DC hos voksne dyr. I mennesker og muligens mus er den rikeste kilde for denne faktor aktiverte T-celler. For å bestemme om det eleverte antall av DC kunne være resultatet av indusert Flt3-L, ble serum fra MVA-BN-behandlede mus sammenlignet med falskt behandlede dyr for nærvær av denne faktor. Dyr behandlet på dag 2 og 5 hadde dobbelt så høye nivåer av Flt3-L i serum sammenlignet med serum fra falskt behandlede dyr. Følgelig er Flt3-L én av faktorene som kunne gjøres ansvarlig for det forhøyede antall av DC (fig. 3).

Tidsforløpet til Flt3-L-induksjon i nyfødte mus ble vurdert etter administrering av MVA-BN. I nyfødte induserte MVA-BN-vaksinasjon en økning i Flt3-L-konsentrasjonen innen 24 timer. Induksjonen nådde et maksimum etter 48 timer og var fremdeles tilstede på dag 7, det tidspunkt hvor miltceller vanligvis ble analysert og motstand mot HSV-1 ble testet (se nedenfor). I de vaksinerte dyr var Flt3-L-konsentrasjonen i serum to ganger øket 24 timer og 48 timer etter vaksineringen, sammenlignet med alderstilpassede kontrolldyr.

Eksempel 2

(i) MVA-BN-behandlede neonatale mus overlever en utfordring med 100-500 LDsoav HSV-1

Grupper av mus ble behandlet med standard dose av MVA-BN 1 eller 2 dager etter fødsel og utfordret ved en alder på 7-8 dager med 100-500 LD50av Herpes simplex virus 1 (HSV-1) (fig. 4). MVA-BN-behandlede mus overlevde utfordringen med HSV-1, mens alle kontrollmusene døde innen 5-6 dager etter inokulering av utfordringsvirus.

For ytterligere å understøtte disse observasjoner ble 9 utfordringseksperimenter utført med 40 MVA-BN-behandlede og 45 kontrollmus. Mer enn 80 % av de virusbehandlede mus overlevde utfordringen, mens alle kontrollmusene døde (fig. 5).

I et separat sett av eksperimenter ble musene behandlet ved fødsel med MVA-BN (2,5xl0<6>TCIDso/mus). På dag 8 ble en utfordring med enten 10<3>(1 LD50) eller 10<5>(100 LD50) PFU av HSV-1 utført. Etter MVA-BN-vaksinering overlevde 65 % av musene en viral dose som drepte 100 % av kontrollmusene (100 LD50) og 90 % overlevde ved en dose som drepte 45,5 % av kontrollene (1 LD50). I ytterligere eksperimenter ble en gruppe på 7 mus vaksinert med UV-inaktiverte MVA-BN infisert med HSV-1. 5 av dem døde innen 7 dager. De gjenværende to dyrene sluttet å vokse og døde på dag 22 og 29. Derfor nådde mus behandlet med MVA-BN en tilstand av øket motstand mot HSV-1 som var assosiert med levende MVA-BN men ikke med inaktivert MVA-BN.

I kontrolleksperimenter utført med mus som ikke har funksjonelle T-celler ble det bestemt at beskyttelsen mot HSV-1 etter vaksinasjon med MVA-BN ikke skyldes kryssreagerende cytotoksiske T-lymfocytter indusert av MVA-BN.

Det ble testet om DC-celler var ansvarlig for beskyttelse av mus fra HSV-1 etter vaksinasjon med MVA-BN. I denne hensikt ble naive 8 dager gamle mus utfordret med 5x10<4>PFU HSV-1 4 timer etter overføring av celler fra MVA-behandlede mus. I et første eksperiment ble splenocytter fra 8 dager gamle mus behandlet på dag 1 i livssyklus med MVA-BN adskilt i DC-rike (lav tetthet) og DC-fattige (høy tetthet) fraksjoner. Mus som mottok 5x10<6>celler fra den DC-rike fraksjonen overlevde utfordringen til 50 % mens alle musene som mottok ti ganger mindre DC-rik suspensjon eller ubehandlede mus døde innen 5 dager. En annen tilnærming ble gjort ved å overføre positivt isolerte CD1 lc positive celler fra 8 dager gamle mus behandlet på dag 1 i sitt liv med MVA-BN til naive alderstilpassede mus. En suspensjon på 2xl0<6>splenocytter som inneholder mer enn 80 % CDllc positive celler fra MVA-BN-behandlede mus beskyttet naive mus fra HSV-1-infeksjon. I motsetning til dette døde 4 ubehandlede kullkammerater så vel som 8 ytterligere ubehandlede dyr etter utfordringen. Videre viste ikke mus som mottok den samme mengde av miltceller eller mus som mottok 1 miltekvivalent (50x10<6>celler) fra den negative fraksjonen øket motstand mot HSV-1. Således er CD1 lc positive celler i stand til å beskytte mus mot HSV-1.

Etter administrering av MVA ble korttids beskyttende virkninger i området på ca.

24 timer beskrevet i kjent teknikk (Vilsmeier, B., Berl. Munch. Tierårztl. Wschr. 112 (1999), 329-333). Skjønt virus brukt i nevnte publikasjon ikke er virus som ikke er i stand til å bli replikert til infeksiøse etterkommervirus i det neonatale eller prenatale dyr anvendt, ble det testet om virkningsmåten som beskrevet i Vilsmeier er lik virkningsmåten beskrevet i foreliggende søknad. Mer spesielt beskrev Vilsmeier at MVA, særlig inaktiver MVA, induserer en paramunitet i ca. 24 timer. For å undersøke om disse paramunitets virkning ene også teller for de beskyttende virkninger som beskrevet i foreliggende anvendelse ble mus, 24 timer gamle, vaksinert enten med MVA-BN eller med inaktivert MVA-BN. I en alder av 7 dager ble musene utfordret med letal dose av HSV-1 (10<5>PFU HSF-lf). Uvaksinerte kontrollmus døde 6 dager etter utfordringen. Heller ikke mus vaksinert med inaktivert MVA-BN var beskyttet mot utfordringen med HSV-1. Antall DC-celler i disse musene var ikke hevet. I motsetning var mus vaksinert med ikke-inaktivert MVA-BN signifikant beskyttet mot en utfordring med HSV-1. 30 dager etter utfordringen var mer enn 80 % av musene fremdeles i live. 2 dager etter vaksineringen ble forhøyet serum Flt3-L funnet i serum. Forhøyede antall av DC ble funnet i milten. Den forhøyede Flt3-L var assosiert med forhøyede antall DC. Dette

konfirmerer at paramunitetsvirkninger ikke er ansvarlig for den observerte beskyttelse. (ii) MVA-BN induserer en spesifikk immunitet i nyfødte som varer inntil voksen alder 1 dag gamle C57Bl/6-mus (gruppestørrelse på 18) ble vaksinert (i.p) med MVA-BN (2,5x10<7>TCID5o). Fire uker etter vaksinering, da musene ble vurdert som voksne, ble de utfordret med en letal dose (lxl0<4>TCID50) av vaccinia Western Reserve (VV-WR). Med unntak av ett dyr overlevde alle andre MVA-BN-vaksinerte dyr. I motsetning til dette døde alle placebovaksinerte dyr innen 7 dager og alvorlige kliniske symptomer, så som opprotet pels, vekttap og redusert aktivitet. Dette er en klar demonstrasjon på at MVA-BN-vaksinering ikke bare er sikker hos neonatale dyr, men er i stand til å indusere beskyttende immunrespons mot en letal vaccinia (beslektet virus til MVA-BN) infeksjon.

Claims

1. Anvendelse av modifisert vacciniavirus Ankara (MVA), hvori MVA-et er stammen MVA-BN deponert ved European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK) med deponeringsnummeret V00083008 eller derivater derav hvori nevnte Ankara stamme MVA-BN eller dens derivater erkarakterisert(i) ved å være i stand til reproduserende replikasjon i hønseembryofibroblaster (CEF) og i baby hamster nyrecellelinjen BHK, men ingen evne til reproduserende replikasjon i humane cellelinjer, og (ii) ved en manglende evne til å reprodusere i en musestamme som ikke er i stand til å produsere modne B- og T-celler og som sådan er alvorlig immunkompromittert og meget utsatt for et reproduserende virus, til fremstilling av et legemiddel for behandlingen av et neonatalt dyr inkludert et menneske, hvori MVA er et virus som abortivt infiserer det neonatale dyret, inkludert menneske, og hvori behandlingen induserer eller forsterker modningen av immunsystemet, hvori nevnte modning er korrelert med en økning av antallet av dendrittiske celler eller deres forløperceller.

2. Anvendelse som ifølge krav 1, hvori den humane cellelinjen er HaCat eller HeLa.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvori forløpercellene av de dendrittiske cellene er plasmacytoide dendrittiske celle forløpere.

4. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 3, hvori forsterkingen av modningen av immunsystemet er korrelert med en minst 1,5 ganger økning i konsentrasjonen av Flt3-L to dager etter administreringen av MVA.

5. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 4, hvori legemidlet blir administrert ved oral, nasal, intramuskulær, intraperitoneal, intradermal, intrautero og/eller subkutan applikasjon.

6. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 5, hvori legemidlet blir administrert i en terapeutisk effektiv mengde i en første inokulering ("preaktiveringsinokulering") og i en andre inokulering ("forsterkerinokulering").

7. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 6, hvori legemidlet blir administrert til dyret, inkludert et menneske, i en mengde på minst IO<1>TCID50(vevskulturinfeksiøs dose) av MVA.

8. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 7, hvori virusgenomet omfatter minst én heterolog nukleinsyresekvens.

9. Anvendelse ifølge krav 8, hvori den heterologe nukleinsyresekvensen er valgt fra en sekvens som koder for minst ett antigen, antigenepitop, og/eller terapeutisk forbindelse.

10. Anvendelse ifølge krav 8, hvori den heterologe nukleinsyresekvensen koder for et protein valgt fra interferon, IL-12, Flt3-L og GM-CSF.