MXPA04010353A - Virus de la vaccina modificada ankara para la vacunacion de neonatos. - Google Patents

Virus de la vaccina modificada ankara para la vacunacion de neonatos.

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Abstract

La invencion se refiere al uso de un virus para la preparacion de un medicamento para la vacunacion o tratamiento de un animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano, en donde el virus es capaz de infectar las celulas del animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano, pero no es capaz de ser replicado a virus de progenie infecciosa en el animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano. El virus es preferentemente un Virus de la Vaccinia Modificada Ankara. En particular, la invencion se refiere a la vacunacion de neonatos contra infecciones con virus que pertenecen al mismo grupo de virus que el virus utilizado para la vacunacion. Ademas, la invencion se refiere a la vacunacion de neonatos contra antigenos seleccionados de los antigenos anteriores y antigenos tumorales, en donde el antigeno tumoral y/o el antigeno extrano son diferentes de los antigenos asociados con el virus. La invencion se refiere ademas al uso de virus como se definio anteriormente para incrementar el nivel de factores que activan las celulas dendriticas o sus celulas precursoras, y/o para incrementar el numero de celulas dendriticas o sus celulas precursoras, y/o para incrementar la produccion y/o contenido celular de un interferon (IFN) o IL-12.

Description

VIRUS DE LA VACCINA MODIFICADA ANKARA PARA LA VACUNACIÓN DE NEONATOS CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere al uso de un virus para la preparación de un medicamento para la vacunación o tratamiento de un animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano, en donde el virus es capaz de infectar las células del animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano, pero no es capaz de ser replicado a virus de progenie infecciosa en el animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano. El virus es preferentemente un Virus Modificado de la Vaccinia Ankara. En particular, la invención se refiere a la vacunación de neonatos contra infecciones con virus que pertenecen al mismo grupo de virus que el virus utilizado para la vacunación. Además, la invención se refiere a la vacunación de neonatos contra antígenos seleccionados de antígenos extraños y antígenos tumorales, en donde el antígeno tumoral y/o el antígeno extraño son diferentes de los antígenos asociados con el virus. La invención se refiere además al uso de los virus como se definieron anteriormente para incrementar el nivel de factores que activan las células dendríticas o células precursoras, y/o para incrementar el número de células dendríticas o sus células precursoras y/o para incrementar la producción y/o el contenido celular de un interferon (IFN) o IL-12.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION El ambiente natural de los animales y los seres humanos contiene una gran variedad de agentes infecciosos tales como virus, bacterias u hongos. Muchos de estos agentes infecciosos pueden provocar enfermedades en los hospederos infectados. Bajo circunstancias normales el hospedero infectado se recupera de la enfermedad inducida por el agente infeccioso después de un cierto periodo de tiempo. Esta recuperación es debida al sistema inmune de un animal o de un ser humano. El sistema inmune es la parte del cuerpo humano o animal que es responsable de eliminar el agente infeccioso. La respuesta inmune es dividida en una reacción específica y una reacción no específica (innata) aunque ambas cooperan estrechamente. La respuesta inmune no específica es la defensa inmediata contra una amplia variedad de sustancias extrañas y agentes infecciosos . En la respuesta inmune innata contra virus, el Interferon (IFN) -a e IFN-ß son absolutamente esenciales para controlar la replicación del virus inicial y para activar las células asesinas naturales (NK) para la muerte inmediata de las células infectadas.
Los patógenos bacterianos o parásitos intracelulares inducen IL-12 que regula IFN-? en las células NK y/o algunos subgrupos de células T. Las células NK activadas por IFN-? pueden ahora matar a los patógenos intracelulares. Además, IFN-? también activa los macrófagos y los habilita para matar patógenos internalizados . Por mucho la fuente más rica de INF-a/ß en una base por célula son las células dendríticas (DC) , una población celular especializada estratégicamente distribuida a todo lo largo del cuerpo. DC plasmocitoides o CDllc+ CD8+ están entre las mejores productoras de IFN-a/ß. CD8+ DC que son infectadas con patógenos no virales intracelulares son las células cruciales capaces de secretar IL-12 esencial para los primeros pasos en la defensa inmune. Una respuesta inmune específica puede ser inducida contra una sustancia extraña particular (antígeno) después de una fase de demora, cuando el organismo es retado con esta sustancia por primera vez. El inicio de la respuesta inmune específica es coordinado también por DC. Existe un tráfico constante de estas células a partir de la periferia hacia los órganos linfoides secundarios, los nodulos linfáticos o el bazo donde las células T y B vírgenes recirculan. El antígeno que es llevado por DC a estos órganos hace posible la activación de las células T y B vírgenes para volverse células T y B efectoras. Para esto, las DC no solamente llevan el antígeno, sino la plasticidad del reconocimiento del patógeno permite la activación de diferentes genes en DC y de este modo un aprestamiento ajustado al patógeno de las células T. La respuesta inmune específica es altamente eficiente y es responsable del hecho de que un individuo quien se recupera de una infección específica esté protegido contra esta infección específica. De este modo, una segunda infección con el mismo o un agente infeccioso muy similar, provoca síntomas mucho más leves o ausencia de síntomas del todo, puesto que existe ya una "inmunidad específica pre-existente" para este agente. Tal inmunidad y la memoria inmunológica, respectivamente, persisten por un tiempo prolongado, en algunos casos incluso de por vida. En consecuencia, la inducción de una memoria inmunológica puede ser utilizada para la vacunación, por ejemplo para proteger a un individuo contra la infección con un patógeno específico. Para la vacunación, el sistema inmune es retado con una vacuna que por sí misma es menos dañina que el agente patógeno contra el cual va a ser inducida una respuesta inmune . La vacuna comprende o expresa epitopos que son encontrados en o expresados por el agente contra el cual se realiza la vacunación. El organismo, de este modo, es inmunizado contra el agente que contiene el epitopo que es parte de la vacuna. Las vacunas típicas son virus atenuados o inactivados (por ejemplo las vacunas de la poliomielitis o de la viruela), proteínas recombinantes (por ejemplo proteína S del virus de la hepatitis B, recombinante) , toxinas bacterianas inactivadas por calor (toxina de Clostridium tetani) o polisacáridos de la pared capsular de las bacterias (Streptococcus pneu oniae) . Ya que las enfermedades infecciosas pueden conducir a condiciones muy críticas en neonatos y lactantes, existe un interés para vacunar a niños o animales neonatos tan pronto como sea posible. Los ejemplos para las condiciones contra las cuales es deseable la vacunación son las infecciones por poxvirus, incluyendo de la viruela. No obstante, los intentos para vacunar exitosamente a los neonatos son impedidos por el hecho de que el sistema inmune de los mamíferos neonatos no está todavía maduro. Se piensa que el sistema inmune de los infantes neonatos y de los animales mamíferos madura gradualmente en un cierto periodo de tiempo. Para humanos la maduración ocurre durante el primer año de vida. Esta es la razón para el hecho de que el grupo de edad neonatal es dejado abierto a diversas infecciones durante este primer año (Gans et al., J. Am. Med. Assoc. (1998) 280, 527-532). Mas particularmente, los infantes neonatos tienen función deteriorada de células B, deficiencias en la presentación de antígeno primario por las células dendríticas y la proliferación limitada de células T (Gans et al., J. Am. Med. Assoc. (1998) 280, 527-532). Poco después del nacimiento los niveles de células T en el bazo son 1,000 veces menores que en adultos. Con el fin de lograr al menos una inmunización débil se sugirió utilizar ya sea los virus replicantes o formulaciones que comprenden un adyuvante para la inmunización. No obstante, con los virus en replicación existe siempre el riesgo de que el sistema inmune inmaduro pueda llegar a agobiarse por la infección del virus o las vacunas virales vivas, ya que las células T son necesarias para el despejo viral (Hassett et al., J. Virol. (1997) 71, 7881-7888). Ya que existe una producción reducida de citocinas por las células T cooperadoras Th-1 en neonatos, la respuesta por los infantes es predominantemente Th-2. En consecuencia, las células T citotóxicas no son reclutadas y el despejo viral no es logrado. La situación de los animales mamíferos es muy similar a la situación en humanos, por ejemplo, el sistema inmune después del nacimiento no está todavía maduro. En ratones neonatos, el número de células T CD4+ esplénicas es de 80, 000, y aquel de las células T CD8+ 1000 veces menor que en bazos de adultos. Además, el sistema que produce el interferón (IFN) está inmaduro en estos ratones. Por lo tanto, los ratones neonatos son incapaces de controlar de manera eficiente la expansión de patógenos intracelulares por IFN en el sitio de infección. Además, el bajo número y posiblemente la etapa de activación inadecuada de las células inmunes están demasiado limitadas para enfrentarse con los patógenos que se expanden rápidamente o los virus en replicación utilizados para la vacunación. Debido al riesgo asociado con las vacunas virales vivas no se recomienda vacunar animales neonatos, incluyendo humanos, con virus en replicación. Por ejemplo se recomienda no vacunar a los neonatos contra la viruela con cepas del virus de la vaccinia que han sido utilizadas hasta la erradicación de la viruela, tales como las cepas Elstee, Copenhagen y NYCBH. De acuerdo a recomendaciones recientes en los Estados Unidos, bebés menores de 12 meses de edad no deben ser vacunados con vacunas de la viruela comercializadas hasta hoy. La vacunación de neonatos con formulaciones que contienen un adyuvante, tiene la desventaja de que son introducidas numerosas sustancias dañinas dentro del cuerpo. De este modo, una vacunación en neonatos humanos es únicamente realizada en casos de emergencia, por ejemplo en el caso de la infección por virus de la hepatitis B. En resumen, se debe notar que el sistema inmune no está maduro al nacer. Ya que la vacunación con virus competentes a la replicacion o formulaciones que comprenden un adyuvante tienen desventajas significativas, los infantes no son vacunados antes de la edad de 2 meses en Alemania (Empfehlung der Stándigen Impfkommission STICO, 2001) o 6 semanas en los Estados Unidos (ACIP "Recommended Childhood Immunization Schedule, United States") . El retraso en el desarrollo del sistema inmune es compensado en parte por la transferencia de anticuerpos maternos de la madre al lactante durante el embarazo o mediante alimentación con la leche materna. No obstante, no todos los infantes son alimentados con leche materna debido a diversas razones. De este modo, existe un periodo de tiempo muy crítico de aproximadamente 6 a 8 semanas en humanos durante los cuales el infante que tiene un sistema inmune inmaduro y de este modo no completamente funcional, no recibe anticuerpos maternos, y durante los cuales una vacunación es usualmente no exitosa o también peligrosa. La situación es muy similar en animales mamíferos, en particular para animales económicamente importantes tales como vacas o animales de compañía tales como gatos y perros. Para reducir costos, la cantidad de leche que la ternera recibe de la madre es frecuentemente reducida de manera drástica. En vez de esto la ternera recibe una mezcla de leche en polvo, alimento concentrado iniciador y específico, algunas veces ya en la primera semana después del nacimiento. En consecuencia, la ternera no recibe la cantidad y variedad necesaria de anticuerpos maternos, de modo que el sistema inmune inmaduro es muy susceptible a las infecciones. Además, los criadores quienes crían terneras y aquellos quienes las engordan para producción de carne frecuentemente no son los mismos. A las 4 a 6 semanas de edad las terneras de diferentes granjas de criadores son mezcladas y enviadas a otras granjas para la producción de carne. A este tiempo los anticuerpos maternos están bajos y el sistema inmune no está completamente desarrollado sino que los animales están expuestos a nuevos agentes infecciosos bajo condiciones de estrés. Esto incrementa el riesgo de infecciones que podrían ser prevenidas por vacunación. Una situación similar puede ser encontrada en instalaciones de cría de ganado o de perros donde la presión infecciosa es alta.
OBJETIVO DE LA INVENCION Un objetivo de la presente invención es proporcionar los medios para vacunar humanos y animales neonatos, respectivamente, contra antígenos extraños y antígenos que están asociados con enfermedades en humanos y animales, respectivamente. Más par icularmente, un objetivo de la presente invención es proporcionar medios que permitan la maduración acelerada del sistema inmune de animales y humanos neonatos. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar los medios que permitan la vacunación de animales neonatos, incluyendo humanos, contra infecciones por poxvirus, en particular contra la viruela.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION De acuerdo a la presente invención se encontró inesperadamente que es posible vacunar de manera segura y eficiente y/o tratar a animales neonatos o prenatales, incluyendo humanos, con virus que son capaces de infectar las células de los animales neonatos o prenatales, incluyendo un humano, pero no capaces de replicarse en células hasta virus de progenie infecciosa. En particular, se ha mostrado que los virus utilizados de acuerdo a la presente invención, tales como MVA, en particular MVA-BN y sus derivados (ver más adelante) , pueden ser administrados a neonatos sin mostrar efectos dañinos . La vacunación del animal con el virus conduce a una respuesta inmune específica contra el virus utilizado para la vacunación y/o para üna vacunación general contra antígenos extraños y antígenos tumorales, como se explica más adelante con más detalle. Además, los virus utilizados de acuerdo a la presente invención conducen a una inducción y/o mejoramiento de la maduración del sistema inmune, que está asociada con un incremento en el número de células dendríticas y factores tales como interferones . La vacunación con los virus utilizados de acuerdo a la presente invención es posible incluso si la formulación que se administra al animal no comprende un adyuvante. En resumen, los virus que son utilizados de acuerdo a la presente invención (i) promueven una respuesta inmune efectiva en neonatos, (ii) pueden ser administrados sin la necesidad de un adyuvante y (iii) no llevan el riesgo de agobiar al organismo . De acuerdo a la presente invención el efecto protector es ejercido por al menos 5 días, preferentemente por al menos 7, 14 ó 28 días después de la primera vacunación. Los virus que son "capaces de infectar células" son virus que albergan, sobre la superficie viral, estructuras capaces de interactuar con las células hospederas, a un grado tal que el virus o al menos el genoma viral se llega a incorporar dentro de la célula hospedera. Aunque los virus utilizados de acuerdo a la presente invención son capaces de infectar la célula hospedera, éstos no son capaces de ser replicados a virus de progenie infecciosa en las células infectadas. En el contexto de la presente invención el término "virus no capaz de ser replicado a virus de progenie infecciosa en dichas células" se refiere a los virus, el genoma de los cuales es al menos parcialmente transcrito y traducido en proteínas virales o incluso replicado, no obstante, no empaquetado en partículas virales infecciosas. De este modo, los virus utilizados de acuerdo a la presente invención son virus que conducen a infecciones abortivas en el hospedero. Las infecciones abortivas pueden ocurrir por dos razones: de acuerdo a la primera alternativa una célula puede ser susceptible a la infección pero puede no ser permisiva para la multiplicación del virus, por ejemplo debido al hecho de que no todos los genes virales necesarios para la multiplicación del virus en dicha célula son expresados y/o están presentes en el genoma viral. Un ejemplo para este tipo de virus de acuerdo a la presente invención en células humanas es el Virus Modificado de la Vaccinia Ankara (MVA) , el cual es explicado con más detalle más adelante. De acuerdo a la segunda alternativa una infección abortiva puede también resultar de la infección de células con virus defectuosos, los cuales carecen de un complemento de los genes virales. Un ejemplo para tal virus de acuerdo a la presente invención para células humanas es DISC-HSVl (virus del Herpes simple de ciclo simple deshabilitado) , por ejemplo un virus del Herpes simple, el cual está restringido a un ciclo simple de infección (Dilloo et al., Blood 1997, 89: 119-127). Este virus carece del gen para la glucoproteína H esencial (gH) , pero puede ser desarrollado a un título alto en una línea de células de complementación que expresan gH. En las líneas de células de no complementación son permisivas para el desarrollo del virus del herpes, éste está restringido a un ciclo simple de replicación, que conduce a la liberación de virus no infecciosos. El término "no capaz de replicarse" se refiere preferentemente a los virus que no se replican del todo en las células del animal vacunado. No obstante, también esos virus están dentro del alcance de la presente solicitud que muestran una actividad menor de replicación residual, que es controlada por el sistema inmune inmaduro del neonato. El virus de acuerdo a la presente invención puede ser cualquier virus que sea capaz de infectar células del animal, pero no capaz de replicarse hasta un virus de progenie infecciosa en dichas células. Se debe entender que un virus que es capaz de infectar células de una primera especie animal, pero que no es capaz de replicarse a virus de progenie infecciosa en dichas células, puede comportarse de manera diferente en una segunda especie animal. Por ejemplo, para humanos MVA-BN y sus derivados (ver más adelante) son virus que son capaces de infectar células de humano pero que no son capaces de replicarse a virus de progenie infecciosa en células humanas. Los mismos virus pueden replicarse en pollos, por ejemplo, en pollos MVA-BN puede no ser un virus que no sea capaz de replicarse hasta virus de progenie infecciosa en las células de pollo. Es conocido para la persona de experiencia en la técnica cuál virus tiene que ser elegido para una especie animal específica. Una prueba que permite determinar si un virus es capaz o no es capaz de ser replicado en un animal neonato o prenatal se describe en el documento WO02/42480 y utiliza la cepa de ratones AGR129. Los resultados obtenidos en este modelo de ratones son indicativos para humanos. De este modo, el término "no capaz de replicarse hasta virus de progenie infecciosa" como se utiliza en la presente solicitud, corresponde al término "falla para replicarse in vivo" como se utiliza para ratones en WO02/42480. Más detalles sobre esta prueba se dan más adelante . Los virus de acuerdo a la presente invención son preferentemente capaces de replicarse en al menos un tipo de células de al menos una especie animal. De este modo, es posible amplificar el virus antes de la administración al animal que va a ser vacunado y/o tratado. A manera de ejemplo, se hace referencia a MVA-BN que puede ser amplificado en células CEF pero que es un virus que no es capaz de ser replicado a virus de progenie infecciosa en humanos neonatos o prenatales . En este contexto se debe notar que los virus química o físicamente inactivados no tienen todas las propiedades de esta modalidad preferida ya que los virus inactivados son capaces de infectar las células del animal neonato o prenatal, incluyendo un humano y no son capaces de ser replicados a virus de progenie infecciosa en el animal neonato o prenatal , incluyendo un humano, pero estos virus no son capaces de replicarse en al menos un tipo de células de al menos una especie animal. Preferentemente el virus es un virus de ADN. Más preferentemente, para las células de mamífero, en particular para células humanas, el virus de ADN se selecciona del virus DISC-Hepes y el Virus Modificado de la Vaccinia Ankara (MVA) . El Virus Modificado de la Vaccinia Ankara (MVA) está relacionado al virus de la Vaccinia, un miembro del género Orthopoxvirus en la familia Poxviridae. MVA ha sido generado por 516 pases en serie sobre fibroblastos de embrión de pollo de la cepa Ankara del virus de la vaccinia (CVA) (para una revisión ver Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14
[1975]). Como consecuencia de estos pases a largo plazo el virus MVA resultante suprimió aproximadamente 31 kilobases de su secuencia genómica y, por lo tanto, fue descrito como una célula altamente hospedera restringida a células de ave (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol . 72, 1031-1038
[1991]). Se mostró, en una variedad de modelos animales, que el MVA resultante era significativamente avirulento (Mayr, A. & Danner, K.
[1978] Dev. Biol. Stand. 41: 225-34). Adicionalmente, esta cepa de MVA ha sido probada en pruebas clínicas como vacuna para inmunizar contra la enfermedad de la viruela humana (Mayr et al., Zbl. Bakt . Hyg. I, Abt . Org. B 167, 375-390
[1987], Stickl et al., Dtsch. Med. schr. 99, 2386-2392
[1974]). Estos estudios involucraron más de 120,000 humanos, incluyendo pacientes en riesgo alto, y probaron que, en comparación a las vacunas basadas en Vaccinia, MVA tenía virulencia o infectividad disminuidas al tiempo que mantenía buena inmunogenicidad. Las cepas preferidas de acuerdo a la presente invención son MVA 575, depositada én la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC) con el número de depósito V00120707 y MVA-BN, depositado en la misma institución con el número de depósito V000083008, y derivados del mismo. Si éste está destinado a vacunar/tratar humanos, MVA-BN y sus derivados son particularmente preferidos.
Las propiedades de las cepas de MVA particularmente preferidas, preferentemente las cepas más preferidas para humanos, tales como MVA-BN y sus derivados, pueden ser resumidas como sigue : (i) capacidad de replicacion productiva en fibroblastos de embrión de pollo (CEF) y en la línea celular BHK, pero no la capacidad de replicacion productiva en la línea de células humanas HaCat, (ii) la falla para replicarse in vivo, (iii) la inducción de una más alta inmunogenicidad en comparación a la cepa conocida MVA 575 (ECACC V00120707) en un modelo de reto letal y/o (iv) la inducción de al menos sustancialmente el mismo nivel de inmunidad en los regímenes de aprestamiento con virus de la vaccinia/refuerzo con virus de la vaccinia cuando se comparan los regímenes de aprestamiento de ADN/refuerzo con virus de la vaccinia. Las cepas MVA preferidas de acuerdo a la presente invención tienen la propiedad (ii) de fallar en replicarse en el organismo, el cual va a ser vacunado o tratado y/o en el sistema de prueba correspondiente como se explica más adelante y preferentemente una adicional de las propiedades anteriores, más preferentemente dos adicionales de las propiedades anteriores. Más preferidas son las cepas MVA que tienen todas las propiedades anteriores. Un ejemplo para una cepa MVA que tiene todas las propiedades anteriores en humanos es MVA-BN. Los derivados preferidos de MVA-BN son derivados que tienen además de la característica (ii) al menos una de las propiedades anteriores, más preferentemente al menos dos de las propiedades anteriores. Los más preferidos son los derivados de MVA-BN que tienen todas las propiedades anteriores. Para una información detallada respecto a los ensayos utilizados para determinar si una cepa de MVA tiene una o más de las características anteriores (i) a (iv) se hace referencia a WO02/42480. Esta publicación también describe cómo pueden ser obtenidos los virus que tienen las propiedades deseadas. En particular, el documento WO02/42480 proporciona una definición detallada de las características de MVA-BN y de un derivado de MVA-BN, y describe con detalle los ensayos biológicos que son utilizados para determinar si una cepa de MVA es MVA-BN o un derivado del mismo. En otras palabras, las características de MVA-BN, la descripción de los ensayos biológicos que permiten evaluar si una cepa MVA es MVA-BN o un derivado del mismo, y los métodos que permiten obtener MVA-BN o un derivado del mismo, son descritos en el documento O02/42480. En lo subsiguiente se resume brevemente cómo una persona experta en la técnica llega a las cepas de MVA que tienen una o más de las características anteriores y cómo él puede probar si una cepa de MVA dada tiene una o más de dichas características, y es de este modo un virus más preferido de acuerdo a la presente invención. No se pretende que el siguiente resumen limite la relevancia del documento WO02/42480 para la presente solicitud a la siguiente información. Más bien, el documento WO02/42480 es incorporado en la presente por referencia, en su totalidad. El término "no capaz de replicación reproductiva" en la línea celular HaCAT (Boukamp et al. 1988, J Cell Biol . 106(3): 761-71) es utilizado en la presente solicitud como se define en el documento O02/42480. De este modo, un virus que es "no capaz de replicación reproductiva" en la línea celular HaCat es un virus que muestra una proporción de amplificación menor de 1 en la línea de células humanas HaCat . Preferentemente, la proporción de amplificación del virus utilizado como un vector de acuerdo a la invención es 0.8 o menor en la línea de células humanas HaCat. La "proporción de amplificación" de un virus es la proporción del virus producido a partir de una célula infectada (Salida) a la cantidad originalmente utilizada para infectar las células en primer lugar (Entrada) ("proporción de amplificación"). Una proporción "1" entre la Salida y la Entrada define una condición de amplificación en donde la cantidad del virus producido a partir de las células infectadas es la misma que la cantidad inicialmente utilizada para infectar las células. El término "derivado" de los virus como se depositan bajo ECACC V00083008 se refiere preferentemente a los virus que muestran esencialmente las mismas características de replicación que la cepa depositada pero que muestra diferencias en una o más partes de su genoma. Los virus que tienen las mismas "características de replicación" que el virus depositado, son virus que se replican con proporciones de amplificación similares que la cepa depositada en las células CEF y las líneas celulares BHK, HeLa, HaCat y 143B y que muestran una replicación similar in vivo como se determina en el modelo de ratón transgénico AGR129 (ver más adelante) . El término "falla para replicarse in vivo" se utiliza en la presente solicitud como se define en WO02/42480. De este modo, dicho término se refiere a los virus que no se replican en humanos y en el modelo de ratón, como se explica en WO02/42480. Los ratones utilizados en WO02/42480 son incapaces de producir células B y T maduras (ratones AGR129) . En particular MVA-BN y sus derivados no matan ratones AGR129 en un periodo de tiempo de al menos 45 días, más preferentemente dentro de al menos 60 días, lo más preferentemente dentro de 90 días después de la infección de los ratones con 107 ufp de virus administrado intraperitonealmente. Preferentemente, los virus que muestran "falla para replicarse in vivo" son además caracterizados porque no puede ser recuperado ningún virus de los órganos o tejidos de los ratones AGR129 45 días, preferentemente 60 días y lo más preferentemente 90 días después de la infección de los ratones con 107 ufp de virus administrados intraperitonealmente. En vez de los ratones AGR129 puede ser utilizado cualquier otra cepa de ratón que sea incapaz de producir células B y T maduras, y como tal está severamente comprometida en su sistema inmune y es altamente susceptible a un virus que se replica. Los detalles del experimento de reto letal utilizado para determinar si una cepa MVA tiene "una más alta inmunogenicidad en comparación a la cepa conocida MVA 575" se explican en el documento WO02/42480. En tal modelo de reto letal, los ratones no vacunados mueren después de la infección con las cepas de la vaccinia competentes en replicación, tales como la cepa de Reserva Occidental L929 TK+ o IHD-J. La infección con el virus de la vaccinia competente en replicación es denominada como "reto" en el contexto de la descripción del modelo de reto letal . Cuatro días después del reto los ratones son usualmente sacrificados y el título viral en los ovarios es determinado mediante los ensayos de placa estándar utilizando células VERO. El título viral es determinado para ratones no vacunados y para ratones vacunados con MVA-BN y sus derivados. Más específicamente MVA-BN y sus derivados están caracterizados porque en esta prueba después de la vacunación con 102 TCID50/ml de virus, los títulos del virus en ovario son reducidos por al menos 70%, preferentemente por al menos 80%, más preferentemente por al menos 90% en comparación a los ratones no vacunados. En una modalidad preferida los virus de acuerdo a la presente invención, tales como MVA, en particular MVA-BN y sus derivados, son útiles para la administración del aprestador/refuerzo . Los virus, en particular cepas de MVA que son lo más preferentemente utilizadas en la presente invención, tales como MVA-BN y sus derivados, así como los virus recombinantes correspondientes que albergan secuencias heterólogas, pueden ser utilizados para aprestar o preparar primeramente de manera eficiente y luego reforzar las respuestas inmunes en' animales nativos, así como en animales con inmunidad pre-existente a los poxvirus. De este modo, el virus más preferido de acuerdo a la presente invención induce al menos sus ancialmente el mismo nivel de inmunidad en los regímenes de aprestamiento con virus de la vaccinia/refuerzo con virus de la vaccinia en comparación a los regímenes de aprestamiento con ADN/aprestamiento con el virus de la vaccinia. Un virus de la vaccinia, en particular una cepa de MVA es considerado como inductor al menos sustancialmente del mismo nivel de inmunidad en los regímenes de aprestamiento del virus de la vaccinia/refuerzo con el virus de la vaccinia cuando se compara a los regímenes de aprestamiento con ADN/refuerzo con virus de la vaccinia si la respuesta de CTL, como se mide en uno del "ensayo 1" y "ensayo 2" como se describe en el documento WO02/42480, preferentemente en ambos ensayos, es al menos sustancialmente la misma en los regímenes de aprestamiento con virus de la vaccinia/refuerzo con virus de la vaccinia cuando se comparan los regímenes de aprestamiento con ADN/refuerzo con virus de la vaccinia. Más preferentemente, la respuesta CTL después de la administración del aprestamiento con virus de la vaccinia/refuerzo con virus de la vaccinia es más alta al menos en uno de los ensayos, cuándo se compara" a los regímenes de aprestamiento con ADN/refuerzo con virus de la vaccinia. Más preferentemente, la respuesta CTL es más alta en ambos ensayos. El virus utilizado de acuerdo a la presente invención puede ser un virus no recombinante , tal como MVA, por ejemplo un virus que no contiene secuencias nucleotídicas heterólogas . Un ejemplo de un virus de la vaccinia no recombinante es el MVA-BN y sus derivados. Alternativamente, el virus puede ser un virus recombinante, tal como un MVA recombinante que contiene secuencias nucleotídicas adicionales, que son heterólogas para el virus . El término "heterólogo" como se utiliza en la presente solicitud se refiere a cualquier combinación de secuencias de ácido nucleico que no es normalmente encontrada íntimamente asociada con el virus en la naturaleza, tal virus es también llamado "virus recombinante" . La secuencia de ácido nucleico heterólogo es preferentemente seleccionada de una secuencia que codifica para al menos un antígeno, epitopo antigénico, proteínas benéficas y/o compuesto terapéutico. El término "proteínas benéficas" como se utiliza en la presente solicitud se refiere a cualesquiera proteínas que sean de auxilio en la protección de un" animal contra un antígeno seleccionado de antígeno tumoral y antígeno extraño, en donde el antígeno tumoral y el antígeno extraño son diferentes de los antígenos asociados con el virus. Alternativamente y de manera más particular las "proteínas benéficas" son activas en el incremento del nivel de los factores que activan las células dendríticas y/o se activan conforme se incrementa el número de células dendríticas y/o se activan conforme se incrementa la producción y/o el contenido celular de un interferón (IFN) o IL-12. De este modo, los ejemplos para tales proteínas benéficas son interferones tales como IFN-alfa o IFN-beta, IL-12, Flt-3-L y/o GM-CSF. Los epitopos antigénicos pueden ser cualesquiera epitopos para los cuales tenga sentido el inducir una respuesta inmune. Los ejemplos para epitopos antigénicos son epitopos provenientes de Plasmodium falciparu , Mycobacterias , virus de la Influenza, provenientes de virus seleccionados de la familia de Flavivirus, Paramyxovírus, virus de la Hepatitis, virus de la inmunodeficiencia humana o de virus que provocan fiebre hemorrágica tales como Hantavirus o Filovirus, por ejemplo virus Ebola o Marburg. De este modo, por ejemplo, si un MVA reco binante que expresa epitopos heterólogos es utilizado para vacunar a neonatos de acuerdo a la presente invención, el resultado de este tratamiento no es solamente una vacunación general debida a la maduración acelerada del sistema sino también una vacuna específica contra el epitopo heterologo expresado a partir del MVA heterologo. Un "compuesto terapéutico" codificado por el ácido nucleico heterologo en el virus recombinante puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico terapéutico tal como un ácido nucleico antisentido o un péptido o proteína con actividad biológica deseada. La inserción de la secuencia de ácido nucleico heteróloga es preferentemente en una región no esencial del genoma viral. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico heterólogo es insertada en un sitio de supresión de origen natural del genoma viral (para el MVA descrito en PCT/EP96/02926) . Los métodos de cómo insertar las secuencias heterologas dentro del genoma viral, tal como un genoma poxviral , son conocidos para una persona de experiencia en la técnica. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica y una vacuna que comprende un virus de acuerdo a la presente invención tal como MVA, por ejemplo, para inducir una respuesta inmune en un cuerpo animal viviente, incluyendo un cuerpo humano. La composición farmacéutica puede incluir en general uno o más portadores, aditivos, antibióticos, conservadores, adyuvantes, diluyentes y/o estabilizadores farmacéuticamente aceptable y/o aprobados. Tales sustancias auxiliares pueden ser agua, solución salina, glicerol, etanol, agentes humectantes o emulsificantes, sustancias amortiguadoras de pH, o similares. Los portadores adecuados son típicamente moléculas grandes, lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos , ácidos polilácticos , ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipidíeos, o similares. Para la preparación de vacunas, el virus o sus recombinantes es convertido a una forma fisiológicamente aceptable. Tales métodos son conocidos para una persona de experiencia en la técnica. Para MVA y otros poxvirus la vacuna puede ser preparada con base en la experiencia en la preparación de vacunas de poxvirus utilizadas para la vacunación contra la viruela (como se describe por Stickl, H. et al.
[1974] Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392). Por ejemplo, el virus purificado es almacenado a -80°C con un título de 5 x 10a TCID50/ral formulado en Tris aproximadamente 10 mM, cloruro de sodio 140 mM pH 7.4. Para la preparación de dosis de vacuna, por ejemplo, 101-108 partículas de virus tales como MVA son liofilizadas en 100 mi de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) en presencia de 2% de peptona y 1% de albúmina humana en una ampolleta, preferentemente una ampolleta de vidrio. Alternativamente, las dosis de vacuna pueden ser producidas por la liofilización gradual del virus en una formulación. Esta formulación puede contener aditivos adicionales tales como manitol, dextrano, azúcar, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona u otros aditivos tales como antioxidantes o gas inerte, estabilizadores o proteínas recombinantes (por ejemplo albúmina sérica humana) adecuada para la administración in vivo. La ampolleta de vidrio es luego sellada y puede ser almacenada entre 4°C y a la temperatura ambiente por varios meses. No obstante, siempre y cuando no exista necesidad, la ampolleta se almacena preferentemente a temperaturas por debajo de -20°C. Para la vacunación o terapia el liofilizado puede ser disuelto en 0.1 a 0.5 mi de una solución acuosa, preferentemente solución salina fisiológica o amortiguador de Tris, y administrada ya sea sistémicamente o localmente, por ejemplo mediante administración parenteral , intramuscular o cualquier otra vía de administración conocida para la persona de experiencia en la técnica. El modo de administración, la dosis y el número de administraciones pueden ser optimizadas por aquellos expertos en la técnica de una manera conocida. El virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA puede ser administrado mediante la aplicación oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal , intradérmica, intra-uterina y/o subcutánea. En animales pequeños la inoculación para la inmunización es preferentemente realizada parenteral o nasalmente, mientras que en animales o humanos más grandes es preferida una inoculación subcutánea, intramuscular u oral . MVA se administra preferentemente en una dosis de 101 TCID50 (dosis infecciosa del cultivo de tejidos) hasta 109 TCID50. Como se señaló anteriormente el virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA, tal como el MVA-BN y sus derivados, puede ser administrado en una cantidad terapéuticamente efectiva en una primera inoculación ("inoculación de aprestamiento" ) y en una segunda inoculación ("inoculación de refuerzo"). En el contexto de la presente invención el término "animal" cubre también a los seres humanos. Más en general, el animal es un animal vertebrado, preferentemente un animal mamífero, incluyendo un humano. Los ejemplos específicos para animales son mascotas tales como perros, gatos, animales económicamente importantes tales como terneras, ganado, ovejas, cabras, caballos, cerdos y otros animales tales como ratones, ratas'. Para estas especies animales y para humanos, el MVA y el DISC-HSV son virus particularmente preferidos. La invención puede también ser utilizada para aves económicamente importantes tales como pavos, patos, gansos y gallinas, si los virus que son utilizados son capaces desinfectar las células de las aves, pero no capaces de ser replicados a virus de progenie infecciosa en dichas células. El término "animales domésticos" como se utiliza en la presente descripción se refiere preferentemente a animales mamíferos domésticos, más preferentemente perros, gatos, terneras, reses, ovejas, cabras, cerdos, caballos, venados . De acuerdo a una primera alternativa los virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA-BN y sus derivados pueden ser utilizados como vacunas específicas, por ejemplo para promover una respuesta inmune que protege al neonato vacunado contra enfermedades provocadas por un virus virulento que pertenece al mismo grupo viral, familia o género que el virus que fue utilizado para la vacunación. A manera de ejemplo MVA como se definió anteriormente, en particular MVA-BN y sus derivados, puede ser utilizado para vacunar humanos neonatos contra infecciones por poxvirus, en particular contra la viruela. MVA, en particular MVA-BN y sus derivados, puede también ser' utilizado para vacunar animales vertebrados contra infecciones por poxvirus, de importancia veterinaria. De acuerdo a esta primera alternativa el virus utilizado para la vacunación puede ser un virus no recombinante, tal como MVA-BN o sus derivados, o un virus recombinante que alberga los genes en el genoma viral que no son encontrados de manera natural en dicho genoma. Preferentemente, el virus recombinante alberga genes adicionales que son de auxilio en la estimulación de la respuesta inmune. Los ejemplos para este tipo de genes son genes de citocina y genes de interferón. De acuerdo a una segunda pero relacionada alternativa, los neonatos son vacunados con un virus recombinante que alberga una secuencia de ácido nucleico heterologa como se define anteriormente, para inducir una respuesta inmune contra la secuencia de aminoácidos expresada de la secuencia heterologa de ácido nucleico. A manera de ejemplo, la secuencia de ácido nucleico puede codificar para un antígeno o un epitopo antigénico como se definió anteriormente. Los ejemplos de un virus recombinante de acuerdo a esta modalidad, son el MVA recombinante, en particular VA-BN recombinante o un derivado del mismo, que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para los antígenos provenientes de (i) virus diferentes del MVA, tales como VIH-1, VIH-2, Denguevirus, Virus del Nilo Occidental, Virus de la Encefalitis Japonesa, virus del sarampión, (ii) antígenos tumorales, (iii) bacterias, (iv) hongos. Si el antígeno expresado del virus recombinante es por ejemplo un antígeno del VIH, es posible utilizar el virus recombinante para inducir una respuesta inmune en el neonato vacunado contra el VIH y prevenir el SIDA. En un sentido más amplio el virus recombinante que expresa el antígeno o el epitopo antigénico se utiliza para inducir una respuesta inmune contra el agente del cual es derivada la secuencia heteróloga y/o contra el agente que comprende el antígeno o epitopo antigénico. De acuerdo a una tercera alternativa se ha encontrado inesperadamente que los virus que son capaces de infectar las células de los animales neonatos o prenatales, incluyendo un humano, pero no capaces de replicarse a virus de progenie infecciosa en el animal neonato o prenatal, incluyendo un humano, pueden ser utilizados para la preparación de un medicamento para la protección de un animal, en particular un animal neonato, incluyendo un humano, contra un antígeno seleccionado del antígeno tumoral y antígeno extraño, en donde el antígeno tumoral y/o el antígeno extraño son diferentes de los antígenos asociados con el virus . De acuerdo a esta tercera alternativa, los neonatos vacunados con los virus de acuerdo a la presente invención, en particular con VA, tal como MVA-BN y sus derivados, son protegidos contra un reto con antígenos extraños tales como agentes infecciosos. De este modo, los virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA son una vacuna general para neonatos, por ejemplo mediante la vacunación de los neonatos con los virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA, el sistema inmune de los neonatos puede ser competente para enfrentar antígenos extraños tales como virus. En la sección de ejemplos esto es ejemplificado para la vacunación con MVA y un reto subsiguiente con el virus del Herpes simple tipo 1. De este modo, si el virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA, es utilizado para la vacunación de neonatos, los animales vacunados están más protegidos contra antígenos extraños que los animales no vacunados en el primer lapso de tiempo crítico hasta que se establece un sistema inmune funcional y maduro. De acuerdo a la presente invención "el antígeno tumoral y/o el antígeno extraño es diferente de los antígenos asociados con el virus" . Este término va a ser interpretado ya que de acuerdo a esta modalidad la invención no está principalmente destinada al uso de un virus tal como MVA para inducir una respuesta inmune contra el virus mismo. Más bien, el virus es utilizado para inducir una respuesta inmune o al ' menos una estimulación inmune en general que protege al hospedero contra antígenos extraños y antígenos tumorales, respectivamente, que no están asociados con el virus. El término "antígenos asociados con el virus" se refiere a epitopos y antígenos de la partícula viral y a antígenos y epitopos sobre la superficie de una célula infectada con el virus, que son el resultado de la expresión del genoma viral . En el contexto de esta modalidad el término "antígeno extraños" se refiere a cualesquiera antígenos y epitopos que no son de manera natural una parte o un componente del cuerpo animal. Los antígenos extraños son especialmente antígenos y epitopos provenientes de agentes infecciosos y toxinas. Los agentes infecciosos típicos son virus tales como herpesvirus, retrovirus, rabiesvirus, rabdovirus, adenovirus; bacterias tales como Salmonella, Micoplasma, Meningococos, Haemophilus; priones u hongos. La invención no es solamente de interés para vacunar animales contra antígenos extraños sino que, en una modalidad alternativa, es también adecuada para vacunar contra antígenos tumorales . ""Antígenos tumorales" son antígenos asociados con ciertas enfermedades tumorales. Los antígenos tumorales son más frecuentemente antígenos codificados por el genoma del hospedero que desarrolla el tumor. De este modo, en un sentido estricto los antígenos tumorales no son antígenos extraños. No obstante, los antígenos tumorales son encontrados en cantidades significativas en tumores, mientras que la cantidad de antígenos tumorales en los tejidos normales es significativamente menor, y lo más frecuentemente no son encontrados antígenos tumorales del todo en el tejido normal. Los ejemplos para antígenos tumorales son conocidos para la persona de experiencia en la técnica e incluyen, por ejemplo, los antígenos MA.GE. El MVA es efectivo contra estos antígenos tumorales, ya que la vacunación de los animales conduce a una activación y/o maduración acelerada del sistema inmune, que puede conducir luego a la destrucción de las células tumorales. El término "protección contra un antígeno" se refiere al desarrollo de una respuesta inmune, que es dirigida contra el antígeno extraño o tumoral . Si el antígeno extraño es un agente infeccioso, el hospedero es protegido contra dicho agente, por ejemplo, el hospedero desarrolla una respuesta inmune contra dicho antígeno. En consecuencia, la infección con el agente infeccioso conduce a una enfermedad menos severa o a falta de enfermedad del todo. El término "protección" no se debe entender en el sentido de que exista siempre un 100% de protección contra el antígeno extraño o tumoral, más bien, el término "protección" como se utiliza en la presente solicitud se refiere a cualquier efecto benéfico que ayude al animal a enfrentar el antígeno extraño y el antígeno tumoral, respectivamente . De acuerdo a la presente invención, tal efecto protector es ejercido por al menos 5 días, prefere temente por al menos 7, 14 ó 28 días después de la primera vacunación. En otras palabras, el animal vacunado y/o tratado es protegido por ejemplo contra un antígeno extraño si el animal entra en contacto con dicho antígeno después de 5, 7, 14 y 28 días, respectivamente. En el contexto de la presente invención, el efecto de la vacunación de los neonatos con el virus de acuerdo a la presente invención, en particular con MVA, puede ser explicado por la inducción o mejoramiento de la maduración del sistema inmune y/o la activación del sistema inmune. En el contexto de la presente invención el término "inducción o mejoramiento de la maduración del sistema inmune" se refiere entre otros al incremento acelerado de las células dendríticas o sus precursores en vacunas con relación a los controles . Los términos "aceleración de la maduración" del sistema inmune, un "mejoramiento de la maduración" del sistema inmune, son utilizados intercambiablemente en esta descripción. La "activación del sistema inmune" está caracterizada por la expresión de moléculas y hormonas, sobre la superficie de las células, que facilitan la interacción o el tráfico célula/célula, y/o por la secreción de dichas moléculas y hormonas por las células. Los receptores específicos captan estas señales y responden. Los marcadores de activación son entre otros Flt3-L, IL-12, IP -alfa, MHC-II y CD8 , en particular CD8alfa (ver más adelante) . El desarrollo/maduración acelerada del sistema inmune está correlacionada con un incremento del nivel de factores que activan y/o movilizan las células dendríticas (DC) o sus células precursoras, y/o un incremento en el número de células dendríticas y sus células precursoras, y/o un incremento en la producción y/o contenido celular de un interferón o IL-12. Un ejemplo para células precursoras DC que son inducidas por el virus de acuerdo a la presente invención, en particular por MVA, son los precursores de DC plasmocitoides que son muy importantes para la defensa contra las infecciones virales y que parecen producir IFN aß. Más específicamente, el mejoramiento de la maduración del sistema inmune es preferentemente definido por un incremento de al menos 2 veces en los marcadores superficiales encontrados sobre DC, tales como MHC-II, CD40 y/o CD80/8S. Preferentemente, tal incremento puede ser medido en la sangre. Además, los marcadores para caracterizar un aumento de la maduración del sistema inmune son Flt3-L, IL-12, IFN-alfa, MHC-II y CD8a (ver más adelante) . Además, la maduración acelerada del sistema inmune es preferentemente correlacionada con al menos un incremento de 1.5 veces, preferentemente con un incremento de al menos 2.0 veces en el número de células positivas a CDllc en la sangre y/o en el bazo, 7 días después de la administración de MVA-BN a animales neonatos, en comparación a los animales control que no han recibido MVA-BN. Además, el aumento de la maduración del sistema inmune puede ser correlacionado preferentemente con al menos un incremento de 1.5 veces, más preferentemente un incremento de al menos 2.0 veces de la concentración de Flt3-L dos días después de la vacunación de neonatos con los virus de acuerdo a la presente invención, cuando se compara a controles de igual edad. En este contexto, se debe notar que existe una asociación entre el fenotipo y la función de las poblaciones de DC murinas y humanas que pueden ser caracterizadas por su fenotipo superficial (Hochrein et al. 2002. Hum. Immunol. 63: 1103). Las DC en la sangre pueden ser detectadas utilizando citometría de flujo, utilizando una gama de marcadores superficiales (MacDonald et al . 2002. Blood. 100: 4512) que también permite que sean identificadas poblaciones específicas de DC, tales como las DC plasmocitoides (Dzionek et al. 2002. Hum. Immunol. 63: 1133; Dzionek et al. 2000. J. Immunol. 165: 6037). Utilizando técnicas similares, las DC pueden también ser detectadas en otros tejidos humanos (Summers et al. 2001, Am. J. Pathol. 159: 285).
De acuerdo a la presente invención los virus como se definen anteriormente pueden también ser utilizados para tratar animales neonatales o prenatales para incrementar el nivel de factores que activan y/o movilizan las células dendríticas (DC) o sus células precursoras, y/o un incremento en el número de células dendríticas y sus células precursoras y/o un incremento en la producción y/o el contenido celular de un interferón o IL-12. Se ha demostrado que después de la vacunación con MVA-BN las células dendríticas plasmocitoides elaboran significativamente más IL-12 y tienen una producción incrementada de IFN-alfa y una supra-regulación de MHC-II y CD8a. El incremento de IL-12 después de la administración de los virus utilizados de acuerdo a la presente invención es preferentemente de 2 veces, más preferentemente 100 veces, 500 veces, 1000 veces, 2500 veces ó 5000 veces. El incremento de la concentración de Flt3-L dos días después de la vacunación de neonatos con los virus de acuerdo a la presente invención, lo más preferentemente con MVA-BN o sus derivados, es preferentemente de 1.5 veces, más preferentemente 2.0 veces cuando se compara a los controles de igual edad. El término "activación de células dendríticas o sus precursores" se refiere a la maduración de DC a las células presentadoras de antígeno, a través de las etapas celulares definidas por la enfermedad, impulsadas por hormonas y estímulos. Los intermediarios de DC son denominados precursores. Estas DC inmaduras llegan a la periferia. Diferentes estímulos (antigénicos) activan la DC. Los marcadores de activación, los cuales son suprarregulados en células dendríticas activadas, son entre otros Flt3-L, IL-12, IFN-alfa, MHC-II y CD8a (ver más adelante) . Se notó que las hormonas tales como GM-CSF conducen a DC más inmaduras en la periferia. Debido a que GM-CSF conduce a más precursoras de DC en la médula ósea, en sangre y órganos periféricos (y las células tienen que moverse hacia allí) , este fenómeno ha sido denominado "movilización de células dendríticas o sus precursores" . Esta definición es también utilizada en la presente descripción . En consecuencia, la vacunación de animales incluyendo un humano es especialmente útil, si está destinada a incrementar el nivel de factores que activan las células dendríticas (DC) o sus células precursoras, y para incrementar el número de células dendríticas o sus células precursoras y/o para incrementar la producción y/o el contenido celular de un interferón o IL-12. Los factores que activan las células dendríticas comprenden entre otras Flt3-L (Lyman et al., Cell 1993, 75: 1157-1167) y GM-CSF. Los interferones típicos de acuerdo a la presente invención son IFN-alfa e IFN-beta. Los virus utilizados de acuerdo a la presente invención inducen Flt3-L y se asume que algunos de los efectos benéficos observados son debidos a dicha inducción. En el contexto de la presente solicitud un animal o humano neonato es definido como un animal o humano que no tiene todavía un sistema inmune maduro. A todo lo largo de esta especificación los términos "animal neonato" y "animal neonatal" son utilizados como sinónimos. Un sistema inmune maduro es caracterizado por la habilidad para activad completamente el sistema inmune innato y por el hecho de que todas las funciones de las células T y B conocidas y los productos están en su sitio. En particular los isotipos de inmunoglobulina tales como IgA e IgE. De este modo, un sistema inmune inmaduro está caracterizado por un menor número de células T, células B y células dendríticas con relación a los adultos, por una producción de IFN, que es baja en comparación a los adultos, y por el hecho de que los órganos linfoides secundarios no están completamente maduros. Más específicamente, un "neonatal" o "neonato" en el contexto de la presente invención puede ser definido como un animal infante que tiene un número de células CD4+ esplénicas que es preferentemente al menos 2 veces, más preferentemente al menos 20 veces, más preferentemente al menos 200 veces, más preferentemente al menos 2,000 veces, lo más preferentemente al menos 20,000 menor que el número promedio de las células CD4+ esplénicas en adultos. En ratones el sistema inmune es maduro a la edad de 4 semanas. En humanos la madurez es probablemente a los 6 meses a 1 año. En gatos y perros el sistema inmune es maduro usualmente a la edad de 6 meses, en terneras, ovejas y cerdos, a la edad de 4-12 semanas. La vacunación con el virus de acuerdo a la presente invención, en particular con MVA es preferentemente realizada antes de que el sistema inmune esté maduro. No obstante, ya que la madurez se desarrolla casi exponencialmente después del nacimiento, se prefiere más vacunar con el virus de acuerdo a la presente invención, en particular con MVA tan tempranamente después del nacimiento como sea posible. Ya que en todos los animales domésticos relevantes y en humanos el sistema inmune está maduro no antes de 4 semanas después del nacimiento, es preferible en general que la vacunación con el virus de la presente invención, en particular con MVA, se realice preferentemente dentro de 4 semanas después del nacimiento, más preferentemente dentro de 2 semanas después del nacimiento, aún más preferentemente dentro de 1 semana después del nacimiento, lo más preferentemente dentro de 3 días después del nacimiento. Estos términos generales son aplicables a todos los animales domésticos importantes, en particular a todos los animales mamíferos domésticos importantes, incluyendo humanos. La persona experta en la técnica estará enterada del hecho de que incluso animales más viejos pueden ser considerados como neonatos/recién nacidos en el contexto de la presente invención y que, de este modo, la vacunación puede también ser exitosamente llevada a cabo con animales más viejos, cuando el sistema inmune no está todavía maduro 4 semanas después del nacimiento. De este modo, en humanos la vacunación puede ser llevada a cabo dentro de 6 meses después del nacimiento, más preferentemente dentro de 3 meses después del nacimiento, más preferentemente dentro de los 2 meses después del nacimiento, más preferentemente dentro de las 4 semanas después del nacimiento, más preferentemente dentro de 2 semanas después del nacimiento, aún más preferentemente dentro de 1 semana después del nacimiento, lo más preferentemente dentro de los 3 días después del nacimiento . Ya que los mejores efectos del virus de acuerdo a la presente invención, en particular VA como una vacuna general son observados si el virus es administrado a un sistema inmune inmaduro, puede preferirse vacunar incluso animales prenatales incluyendo humanos. La vacunación prenatal puede ser deseable en animales económicamente importantes tales como ganado o cerdos. Si la placenta permite pasar al virus el neonato puede ser vacunado simplemente vacunando al animal madre. De este modo, la vacunación del animal madre para vacunar al neonato es particularmente promisoria en un animal que tiene una placenta endoteliocorialis, tal como los perros, gatos, ratas y ratones, o que tiene una placenta hemocorialis , tales como primates incluyendo los humanos . En animales que tienen una placenta corionepitelialis, tales como reses y ovejas o que tienen la placenta sindesmocorialis, tales como los cerdos y caballos, la vacunación de los neonatos puede ser preferentemente realizada mediante administración in útero. Por supuesto, este modo de administración puede también ser realizado para animales que tengan una placenta endoteliocorialis o hemocorialis. Ya que los virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA conducen a una maduración acelerada del sistema inmune, y ya que los virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA son de este modo útiles como una vacuna general, los animales vacunados son protegidos contra una variedad de enfermedades. Más específicamente, los virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA, pueden ser utilizados para vacunar gatos para el bienestar general y contra herpes felino o peritonitis infecciosa felina. Los virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA pueden ser utilizados en perros para el bienestar general y contra enfermedades asociadas al tracto respiratorio (virales) . Los virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA pueden ser utilizados en cerdos para el bienestar general y contra infecciones por Haemophilus o Mycoplasma, especialmente en cerdos de engorda. Como se señala, es preferida una modalidad para utilizar los virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA, en animales neonatos o nonatos para proteger al animal contra un antígeno extraño y/o antígeno tumoral, en donde el antígeno tumoral es diferente de los antígenos asociados con el virus utilizado para la vacunación. No obstante, esta modalidad no está restringida a los animales neonatos y nonatos. Más bien, en una modalidad alternativa, la invención puede ser llevada a cabo para animales de todas las edades, ya que puede ser observado un efecto benéfico también en animales adultos. De este modo, de acuerdo a esta modalidad los virus como se definieron anteriormente, en particular MVA-BN y sus derivados son útiles para proteger un animal, incluyendo un humano, contra un antígeno seleccionado del antígeno tumoral y el antígeno extraño, en donde el antígeno tumoral y/o el antígeno extraño es diferente de los antígenos asociados con el virus. Como se señaló anteriormente, los virus utilizados de acuerdo a la presente invención son capaces de infectar células del animal, pero no capaces de ser replicados a virus de progenie infecciosa en dichas células. Toda la información, definiciones, incluyendo la definición de la duración del efecto protector, los ejemplos así como las modalidades preferidas, más preferidas y las más preferidas dadas anteriormente para neonatos, también aplican para la actual modalidad de acuerdo en la cual el virus puede también ser administrado a adultos. En contraste a los neonatos, el sistema inmune de los animales adultos ha madurado ya. No obstante, puede ser que el sistema inmune se debilite debido a ciertas enfermedades o simplemente debido a la edad del animal. Especialmente en personas inmunocomprometidas y en personas ancianas la administración de los virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA, al animal, puede tener un efecto benéfico, entre otras cosas al incrementar el nivel de factores que activan y/o movilizan las células dendríticas (DC) o sus células precursoras y/o al incrementar el número de células dendríticas o sus células precursoras y/o al incrementar la producción y/o contenido celular de un interferón o IL-12. De este modo, incluso en animales adultos la administración de los virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA puede conducir a una competencia incrementada del sistema inmune para enfrentar antígenos extraños y/o antígenos tumorales. En otras palabras, los virus utilizados de acuerdo a la presente invención son útiles para la activación del sistema inmune en general. La invención se refiere además a los virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA para la preparación de un medicamento para ser administrado a un animal, incluyendo un humano, en donde dicho medicamento incrementa el nivel de factores que activan las células dendríticas y/o incrementa el número de células dendríticas y/o incrementa la producción y/o el contenido celular de un interferón (IFN) o IL-12. Todas las definiciones dadas anteriormente para las otras modalidades son también aplicables para la presente modalidad. De acuerdo a esta modalidad, la invención no está dirigida principalmente a inducir una protección contra los antígenos extraños y/o antígenos tumorales. Más bien, esta modalidad está dirigida a tratar las condiciones y enfermedades caracterizadas por un bajo nivel de factores que activan las células dendríticas y/o por un número insuficiente o demasiado bajo de células dendríticas y/o por una producción baja y/o un bajo contenido celular de un interferón (IFN) o IL-12. De este modo, de acuerdo a esta modalidad el tratamiento con los virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA, podría proteger contra alergias o enfermedades autoinmunes . Nuevamente, este tratamiento es particularmente promisorio si los virus de acuerdo a la presente invención, en particular VA, son administrados a animales neonatos. Adicionalmente , de acuerdo a una modalidad adicional el virus de acuerdo a la presente invención, tal como el MVA, en particular MVA-BN y sus derivados, es particularmente útil para inducir respuestas inmunes en animales i munocomprómetidos, por ejemplo monos (CD4 < 400/µ1 de sangre) infectados con SIV, o en humanos inmunocomprometidos . El término "inmunocomprometidos" describe la condición del sistema inmune de un individuo, que muestra únicamente respuestas inmunes incompletas o tiene una eficiencia reducida en la defensa contra agentes infecciosos. La invención se refiere además a un método para proteger un animal, incluyendo un humano, contra un antígeno seleccionado del antígeno tumoral y del antígeno extraño, por la administración de un virus de acuerdo a la presente invención, en particular el virus Modificado de la Vaccinia Ankara (MVA) , en donde el antígeno tumoral y/o el antígeno extraño es diferente de los antígenos asociados con el virus. En una modalidad adicional la invención se refiere a un método para el tratamiento de un animal. incluyendo un humano, para incrementar el nivel de los factores que activan las células dendríticas y/o para incrementar el número de células dendríticas y/o incrementar la producción y/o el contenido celular de un interferón (IFN) o IL-12, que comprende la administración de un virus Modificado de la Vaccinia Ankara (MVA) .
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION El uso de un virus para la preparación de un medicamento para la vacunación o tratamiento de un animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano, en donde el virus es capaz de infectar las células del animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano, pero no capaz de ser replicado a virus de progenie infecciosa en el animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano. El método para el tratamiento o vacunación de un animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano, que comprende la administración de un virus, en donde el virus es capaz de infectar las células del animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano, pero no capaz de ser replicado a virus de progenie infecciosa en el animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano. El virus para la vacunación o tratamiento de un animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano, en donde el virus es capaz de infectar las células del animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano, pero no capaz de ser replicado a virus de progenie infecciosa en el animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano. El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde el virus es un virus de ADN. El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde el virus se selecciona de los Herpesvirus DISC y del virus Modificado de la Vaccinia Ankara (MVA) . El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde la cepa de MVA es MVA-BN, depositada en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC) con el número de depósito V00083008, y derivados del mismo. El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde el MVA es administrado mediante la ruta de aplicación oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal , intradérmica, intrauterina y/o subcutánea. El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde el MVA es administrado en una cantidad terapéuticamente efectiva en una primera inoculación ("inoculación de aprestamiento" ) y en una segunda inoculación ("inoculación de refuerzo").
El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde el MVA es administrado al animal, incluyendo un humano, en una cantidad de al menos 101 TCID50 (dosis infecciosa de cultivo de tejido). El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde la vacunación es contra una infección por poxvirus . El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde la infección por poxvirus es una infección por viruela. El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde el genoma del virus comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heterólogo. El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde la secuencia de ácido nucleico heterólogo se selecciona de una secuencia que codifica por al menos un antígeno, epitopo antigénico y/o un compuesto terapéutico . El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde la vacunación es contra el agente del cual se deriva la secuencia heteróloga, o el agente que comprende al menos un antígeno o epitopo antigénico. El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde la vacunación es para proteger al animal, incluyendo un humano, contra un antígeno seleccionado del antígeno tumoral y del antígeno extraño, en donde el antígeno tumoral y/o el antígeno extraño es diferente de los antígenos asociados con el virus. El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde el antígeno extraño se selecciona de agentes infecciosos y toxinas. El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde el agente infeccioso se selecciona de virus, bacterias, priones y hongos. El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde la vacunación o tratamiento se utiliza para inducir o mejorar la maduración y/o la activación del sistema inmune. El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde el tratamiento es utilizado (i) para incrementar el nivel de factores que activan y/o movilizan las células dendríticas o sus células precursoras, (ii) para incrementar el número de células dendríticas o sus células precursoras, o (iii) para incrementar la producción y/o contenido celular de un interferón (IFN) o IL-12. El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde el factor que activa las células dendríticas es Flt3-L y/o GM-CSF.
El uso, el método o el virus como se describieron anteriormente, en donde el interferón es IFNa y/o ???ß. La composición farmacéutica que comprende un virus como se definió anteriormente. La vacuna que comprende un virus como se definió anteriormente .
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1A: Ratones neonatos fueron inyectados una vez dentro de 24-48 horas del nacimiento con 106 ufp de MVA o HSV-1 DISC o tratadas con solución salina fisiológica (cloruro de sodio) como controles. A los 7 días de edad, se utilizó CDllc, un marcador DC universal se utilizó para determinar estas células en sangre periférica mediante citometría de flujo. Se muestran también la desviación media y estándar de 3 a 5 experimentos . Figura IB: Experimento como en la Figura No obstante, las células CDllc fueron determinadas en bazo mediante citometría de flujo. Figura 1C: Experimento como en la Figura No obstante, las células CDllc fueron determinadas en fluido peritoneal mediante citometría de flujo. Figura 2 : Se vacunaron ratones con MVA-BN como se indica en la columna izquierda. Después de dos semanas el porcentaje de células positivas a CDllc+ simples y CDllc+/CD8+ doble en bazo y en sangre periférica, se determinó mediante citometria de flujo. Figura 3: Ratones neonatos fueron inyectados con MVA o cloruro de sodio como control en el día uno y 5 de edad. En el día 8, se determinó Flt3-L murino en suero de estos ratones mediante ELISA y los valores se dan como pg/ml. Figura 4: Ratones neonatos fueron inyectados una vez dentro de 24-48 horas del nacimiento con 106 ufp de MVA o tratados con cloruro de sodio como controles . A los 7 días de edad, todos los ratones fueron expuestos a lOOx LD50 de la cepa F de HSV-1. El número de animales supervivientes fue monitorizado por 21 días. Figura 5: Se trataron ratones como en la Figura . Los datos representan 9 diferentes experimentos de reto con 100 LD50 de HSV-1. Ninguno de los animales control sobrevivió al reto. Figura 6 : La supervivencia de ratones adultos vacunados en el primer día de vida con MVA-BN después de un reto con vaccinia letal . Tres carnadas de 6 cachorros de 1 día de edad (18 ratones) se vacunaron con MVA-BN (2.5 x 107 TCID50) y a las 4 semanas (ratones adultos) se retaron con una dosis letal de vaccinia. La vacunación con MVA-BN indujo claramente una inmunidad protectora en ratones neonatos que duró hasta la etapa adulta.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustrarán adicionalmente la presente invención. Podrá ser comprendido por una persona de experiencia en la técnica que los ejemplos proporcionados de ningún modo pueden ser interpretados de una manera que limite a estos ejemplos la aplicabilidad de la tecnología proporcionada por la presente invención.
EJEMPLO 1 (i) MVA-BN y DISC-HSV inducen DC del fenotipo CDllc* y CD8+ en animales neonatos Primer grupo de experimentos : Ratones neonatos son inmunodeficientes de manera natural debido a que el sistema IFN no está maduro. El número y el estado de activación de DC, los mejores productores de IFN conocidos hoy en día, no han sido analizados. Las DC pueden ser inducidas in vi tro así como in vivo mediante una variedad de estímulos. En estos estudios se probó si una replicación de MVA-BN controlada pudiera inducir DC y se analizó su fenotipo. Se inyectaron grupos de ratones con 106 unidades formadoras de placa (u.f.p.) de MVA-BN o solución salina únicamente dentro de 1 a 2 días después del nacimiento y en algunos casos 5 días después del nacimiento. Células sanguíneas y de bazo provenientes de ratones individuales de ambos grupos fueron analizadas mediante FACS y los datos se compararon. Datos de 7 a 8 ratones individuales indicaron que el tratamiento con MVA-BN incrementó las células CDllc+ 2 a 3 veces, acompañado con expresión incrementada de MHC II y presencia incrementada de células T del tipo CD4 o CD8. De manera interesante, CD19/54, un marcador para células B maduras disminuyó indicando que estas células emigraron en órganos diferentes del bazo o que las precursoras de las células B fueron reclutadas tempranamente a otras líneas, principalmente DC del fenotipo plasmocitoide, que lleva marcadores tempranos de células B (B220) . Los datos provenientes de tres diferentes experimentos indicaron reproducibilidad y diferencias significativas. Los experimentos con DISC-HSV-1, una vacuna viral controlada en replicación, diferente, indujeron cantidades similares de células CDllc+ después del aprestamiento o preparación neonatal . Los resultados se resumen en las Figuras 1A-C.
Para investigar adicionalmente las subpoblaciones de DC en sangre y en bazo, y para analizar el efecto a largo plazo del tratamiento con MVA-BN, las células en sangre y en bazo fueron analizadas a las 2 semanas de edad. En este punto, los animales tratados tuvieron aproximadamente dos veces el número de células CDllc+ en bazo que a una semana de edad, pero un tratamiento simple con el virus al nacimiento condujo a un número elevado 3 veces de estas células en el bazo, 2 semanas después (Figura 2) . Efectos similares fueron observados en sangre con la excepción de que CDllc+/CD8a+ fueron aproximadamente 4 veces mayores. Un tratamiento simple con MVA-BN a los 7 días del nacimiento condujo a un incremento de CDllc+/CD8a+ de 13 a 40 veces con un efecto menos dramático sobre las células CDllc+. Como se esperaba, dos vacunaciones al nacimiento y al día 7 tuvieron un efecto significativo sobre las células CDllc+. Los diversos efectos se muestran en la Figura 2. Segundo grupo de experimentos : Ratones de una semana de edad que fueron vacunados al nacimiento con 2.5 x 107 TCID50 de MVA-BN mostraron una composición diferente de las poblaciones de células inmunológicamente relevantes en bazo en sangre que los ratones control (Tabla 1) . En sangre existió un incremento en la población de linfocitos a CD8, así como un incremento en el número de células NK.
El número de células positivas a CDllc fue aproximadamente 3 veces mayor que en controles, y el porcentaje de células B (células positivas doblemente a B220 y CD19) fue significativamente disminuido. En el bazo el número total de células no difirió entre los animales inmunizados y los controles. En contraste a la sangre, el bazo de los animales vacunados tuvo más linfocitos T positivos a CD4 que los controles, y el número de células NK no fue incrementado. Similar a la sangre el número relativo de linfocitos positivos a CD8 fue incrementado, y el número de células B disminuyó. El porcentaje de células positivas a CDllc fue aproximadamente 3 veces mayor que en controles. Se reconoció primeramente una diferencia en el porcentaje de células dendríticas en el día 5 después de la vacunación con MVA-BN, cuando el número de células positivas a CDllc en el bazo de 4 controles no tratados, fue de 3.6%, en comparación a 4.8% en 4 ratones vacunados con MVA-BN. La misma cantidad de MVA-BN inactivado por UV no provocó ningún cambio significativo en las poblaciones celulares después de la vacunación en ratones neonatos en comparación a los controles (datos no mostrados) . La dosis de vacunación inicial fue elegida arbitrariamente. Después de la titulación del inoculo se seleccionó una dosis estándar de 2.5 x 105 TCID50 para la vacunación (10 veces menos que en el experimento inicial) . A esta dosis fueron inducidos números máximos de DC (Tabla 2) .
Tabla 1. Cambios inducidos en células sanguíneas y de bazo en ratones neonatos, 1 semana después de la inmunización con 2.5 x 107 TCID50 de MVA-BN Parámetro Sangre Bazo NaCl MVA-BN p* NaCl MVA-BN p* Células totales 17.9+1.9 24.1 ±2.6 0.105 x 106 %CD1 1c 5.4+1.3 18.6+1.5 0.001 2.8+0.1 7.9+0.8 0.001 %CD11c/CD8a 0.5+0.1 2.7+0.3 0.001 1.1+0.1 4.6+0.7 0.002 %CD4/CD3 16.9+1.1 16.1±1.5 0.999 4.8±0.3 8.1±1.5 0.004 %CD8a/CD3 6.0+0.9 10.3+0.9 0.002 4.7+0.3 8.4±1.1 0.002 %NK1.1/DX5 16.4+1.2 24.4+3.3 0.032 2.5+0.3 2.4+0.2 0.862 %CD19/B220 22.3+0.5 8.4+0.8 0.001 16.2+1.3 8.6+0.9 0.004 Prueba U de Mann-Whitney Tabla 2 . Inducción de células positivas a CDllc en el bazo de ratones wt de 1 día de edad y ratones con perturbaciones dirigidas a los genes, dentro de los 7 días después del tratamiento con MVA.
Cepa del Dosis de Controles MVA-BN Proporción ratón MVA %CDllc %CDllc (TCIDso) wta 2.5xl07 2.8 7.9 2.8 wt 2.5xl06 2.1 11.9 5.6 wt 2.5xl05 2.5 6.6 2.6 RAGb 2.5xl07 4.2 5.4 1.3 AG1290 2.5xl03 2.6 2.7 1.0 Wt= ya sea ratones C57BL/6 ó 129 Sv/Ev. supresión de ratones RAG en el gen de activación de recombinación (por ejemplo células T y B no funcionales) . c perturbaciones dirigidas al gen AG129 del receptor de IFN Tipo I (IFN-a y ß) y Tipo II (IFN-?) (ii) MVA-BN indujo preferentemente células dendríticas plasmacitoides (pDC) De acuerdo a otros autores las células positivas a CDllc que también expresaron CD45RA y CD45R fueron consideradas como pDC (Asselin-Paturel , et al. 2001, Nat Immunol, 12: 1144). Se lanzó la pregunta de si MVA-BN inducía un incremento de pDC. Fue realizado un experimento adicional en el cual también se analizaron las positivas a CD45RA o CD45R sobre CDllc. El porcentaje de células doblemente positivas a CDllc y CD45R fue significativamente mayor en ratones tratados con MVA-BN (5.6 ± 0.7%) que en ambos grupos control (no tratados 3.0 ± 0.3%, p = 0.01; MVA-BN inactivado por UV 3.0 ± 0.2%, p = 0.006. Prueba U de Mann-Whithney) . (iii) Ratones neonatos tratados con MVA-BN tienen niveles elevados de Flt3-L en suero Flt3-L es un factor hematopoyético que conduce a niveles incrementados de DC en animales adultos. En humanos y posiblemente en ratones la fuente más rica de este factor son las células T activadas . Para determinar si los números elevados de DC podrían ser el resultado de Flt3-L inducido, el suero de ratones tratados con MVA-BN fue comparado a ratones pseudotratados para la presencia de este factor. Los animales tratados en el día 2 y 5 tuvieron dos veces los niveles de Flt3-L en el suero, cuando se comparó al suero de animales pseudotratados. De aquí que, Flt3-L es uno de los factores que podría ser hecho responsable de los números elevados de DC (Figura 3) . El curso del tiempo de la inducción del Flt3-L en ratones neonatos fue evaluado después de la administración de MVA-BN. En neonatos, la vacunación con MVA-BN indujo un incremento en la concentración de Flt3-L dentro de 24 horas. La inducción alcanzó un máximo después de 48 horas y estuvo todavía presente en el día 7, el tiempo cuando las células del bazo fueron usualmente analizadas, y se probó la resistencia contra HSV-1 (ver más adelante) . En los ratones vacunados la concentración de Flt3-L en el suero fue incrementada dos veces 24 horas y 48 horas después de la vacunación, en comparación con los animales control de igual edad.
EJEMPLO 2 (i) Los ratones neonatos tratados con MVA-BN sobreviven a un reto con 100 a 500 LD50 del HSV-1 Grupos de ratones fueron tratados con la dosis estándar de MVA-BN uno o 2 días después del nacimiento y retados a los 7-8 días de edad con 100 a 500 LD50 del virus 1 del Herpes simple (HSV-1) (Figura 4) . Los ratones tratados con MVA-BN sobrevivieron al reto con HSV-1, mientras que todos los ratones control murieron dentro de 5 a 6 días después de la inoculación con el virus de reto. Para apoyar adicionalmente estas observaciones, se realizaron 9 experimentos de reto con 40 ratones tratados con MVA-BN y 45 ratones control. Más de 80% de los ratones tratados con virus sobrevivieron al reto, mientras que todos los ratones control murieron (Figura 5) . En un grupo separado de experimentos los ratones fueron tratados al nacer con VA-BN (2.5xl06 TCID50/ratón) . En el día 8 se realizó un reto ya sea con 103 (1 LD50) o 105 (100 LD50) de ufp de HSV-1. Después de la vacunación con MVA-BN, 65% de los ratones sobrevivieron a una dosis viral que mató 100% de los ratones control (100 LD50) y 90% sobrevivieron a una dosis que mató 45.5% de los controles (1 LD50) . En experimentos adicionales, un grupo de 7 ratones vacunados con MVA-BN inactivado por UV, fueron infectados con HSV-1. Cinco de ellos murieron dentro de 7 días. Los 2 animales restantes dejaron de crecer y murieron al día 22 y 29. Por lo tanto, los ratones tratados con MVA-BN alcanzaron un estado de resistencia incrementada contra el HSV-1, que estuvo asociada con MVA-BN vivo, pero no MVA-BN inactivado. En experimentos control realizados con ratones que no tienen células T funcionales, se determinó que la protección contra el HSV-1 después de la vacunación con MVA-BN no fue debida a los linfocitos T citotóxicos de reactividad cruzada, inducidos por MVA-BN. Se probó si las células DC eran responsables para la protección de ratones a partir del HSV-1 después de la vacunación con MVA-BN. Para este fin ratones de 8 días de edad, intactos, fueron retados con 5 x 104 ufp de HSV-1, 4 horas después de la transferencia de las células desde los ratones tratados con MVA. En un primer experimento, los esplenocitos provenientes de ratones de 8 días de edad tratados a 1 día de vida con MVA-BN, fueron separados en la fracción rica en DC (baja densidad) y pobre en DC (alta densidad) . Los ratones que recibieron 5 x 106 células de la fracción rica en DC sobrevivieron al reto al 50%, mientras que todos los ratones que recibieron 10 veces menos suspensión rica en DC o los ratones no tratados, murieron dentro de 5 días. Un segundo procedimiento fue realizado mediante la transferencia de la células positivas a CDllc aisladas positivamente a partir de ratones de 8 días tratados a 1 día de vida con MVA-BN para ratones intactos de igual edad. Una suspensión de 2 x 106 esplenocitos que contenía más del 80% de células positivas a CDllc provenientes de ratones tratados con MVA-BN, protegieron a los ratones intactos de la infección por el HSV-1. En contraste, 4 carnadas no tratadas así como 8 animales adicionales no tratados murieron después del reto. Además, los ratones que recibieron la misma cantidad de células esplénicas o los ratones que recibieron un equivalente esplénico (5 x 106 células) de la fracción negativa, no mostraron resistencia incrementada contra el HSV-1. De este modo, las células positivas a CDllc son capaces de proteger a los ratones contra el HSV-1. Después de la administración de MVA a corto plazo, fueron descritos los efectos protectores en el intervalo de aproximadamente 24 horas en la técnica anterior (Vilsmeier, B., Berl . Munich. Tier rztl. Wschr. 112 (1999), 329-333). Aunque los virus utilizados en dicha publicación no son virus que sean capaces de ser replicados a virus de progenie infecciosa en los animales neonatos o nonatos utilizados, se probó si el modo de acción como se describe en Vilsmeier, es similar al modo de acción descrito en la presente solicitud. Más particularmente, Vilsmeier describe que el MVA, en particular el MVA inactivado, induce a una paramunidad por aproximadamente 24 horas. Para probar si el efecto de paramunidad explica también los efectos protectores como se describen en la presente solicitud, ratones de 24 horas de nacidos fueron vacunados ya sea con MVA-BN o con el MVA-BN inactivado. A los 7 días de edad, los ratones fueron retados con una dosis letal de HSV-1 (105 ufp de HSF-lf) . Los ratones control no vacunados murieron 6 días después del reto. También, los ratones vacunados con el MVA-BN inactivado no fueron protegidos contra un reto con HSV-1. El número de células DC en estos ratones no fue elevado. En contraste, los ratones vacunados con el MVA-BN no inactivado fueron significativamente protegidos contra un reto con el HSV-1. 30 días después del reto más del 80% de los ratones estaban todavía vivos. Dos días después de la vacunación se encontró Flt3-L elevado en suero. En el bazo se encontraron números elevados de DC . El Flt3-L aumentado estuvo asociado con los números elevados de DC. Esto confirma que los efectos de paramunidad no son responsables de la protección observada. (ii) MVA-BN induce una inmunidad específica en neonatos que dura hasta la etapa adulta Ratones C57B1/6 de un día de edad (tamaño del grupo de 18) fueron vacunados (intraperitonealmente) con MVA-BN (2.5 x 107 TCID50) . Cuatro semanas después de la vacunación, cuando los ratones fueron considerados adultos éstos fueron retados con una dosis letal (1 x 104 TCID50) de Reserva de la Vaccinia Occidental (W-WR) . Con excepción de un animal todos los otros animales vacunados con MVA-BN, sobrevivieron. En contraste, todos los animales vacunados con placebo murieron dentro de 7 días y demostraron síntomas clínicos severos tales como pelo erizado, pérdida de peso y actividad reducida. Claramente esta es una demostración clara de que la vacunación con MVA-BN no es únicamente segura en animales neonatos, sino que es capaz de inducir una respuesta inmune protectora contra una infección letal de la vaccinia (virus relacionado al MVA-BN) .

Claims (25)

REIVINDICACIONES
1. El uso de un virus para la preparación de un medicamento para proteger a un animal, incluyendo un humano, contra un antígeno seleccionado de antígeno tumoral y antígeno extraño, en donde el antígeno es diferente de los antígenos asociados con el virus y en donde el virus es capaz de infectar las células del animal, incluyendo un humano, pero no capaz de ser replicado a virus de progenie infecciosa en dichas células.
2. El uso según la reivindicación 1, en donde el efecto protector es ejercido por al menos 14 días.
3. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el animal, incluyendo un humano, es un animal neonato o prenatal, incluyendo un humano . 4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el virus es un virus
Modificado de la Vaccinia Ankara (MVA) .
5. El uso según la reivindicación 4, en donde la cepa de MVA es MVA-BN, depositada en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC) con el número de depósito V00083008, y derivados del mismo.
6. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el genoma del virus comprende al menos una secuencia heteróloga de ácido nucleico.
7. El uso según la reivindicación 11, en donde la secuencia heteróloga de ácido nucleico se selecciona de una secuencia que codifica para al menos un antígeno, epitopo antigénico y/o un compuesto terapéutico
8. El uso o el virus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el MVA es administrado al animal, incluyendo un humano, en una cantidad de al menos 101 TCID5o (dosis infecciosa de cultivo de tejidos).
9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , en donde el medicamento comprende MVA como se define según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, y es administrado con una cantidad terapéuticamente efectiva de MVA en una primera inoculación ("inoculación de aprestamiento" ) y en una segunda inoculación ("inoculación de refuerzo" ) .
10. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el medicamento comprende may es administrado al animal, incluyendo un humano, en una cantidad de al menos 101 TC1D50 (dosis infecciosa en cultivo de tejidos) de MVA.
11. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el antígeno extraño se selecciona de agentes infecciosos y toxinas .
12. El uso según la reivindicación 11, en donde el agente infeccioso se selecciona de virus, bacterias, priones y hongos .
13. El uso según la reivindicación 12, en donde el virus se selecciona de herpesvirus, retrovirus, rabiesvirus, rhabdovirus y adenovirus.
14. El uso de un virus para la preparación de un medicamento para la vacunación o tratamiento de un animal, incluyendo un humano, en donde el virus es capaz de infectar las células del animal, incluyendo el humano, pero que no es capaz de ser replicado a virus de progenie infecciosa en dichas células, en donde la vacunación o tratamiento es (i) para inducir o mejorar la maduración del sistema inmune, (ii) para incrementar el nivel de factores que activan y/o movilizan las células dendríticas o sus células precursoras, (iii) para incrementar el número de células dendríticas o sus células precursoras, o (iv) para incrementar la producción y/o contenido celular de un interferón (IFN) o IL-12.
15. El uso según la reivindicación 14, en donde el animal, incluyendo un humano, es un animal neonato o prenatal, incluyendo un humano.
16. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en donde el factor que activa las células dendríticas es Flt3-L y/o GM-CSF.
17. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde el interferón es IFNa
18. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde el virus es un virus como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.
19. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en donde la administración es realizada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.
20. El uso de un virus Modificado de la Vaccinia Ankara (MVA) para la preparación de un medicamento para la vacunación o tratamiento de un animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano, en donde el virus es capaz de infectar las células del animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano, pero no es capaz de ser replicado a virus de progenie infecciosa en el animal neonatal o prenatal, incluyendo un humano.
21. El uso según las reivindicación 20, en donde el MVA es el virus como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7. i 22. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21, en donde la administración es realizada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.
.V
23. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en donde la vacunación es contra una infección por poxvirus.
24. El uso según la reivindicación 23, en donde la infección por poxvirus es una infección por viruela.
25. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en donde el VA comprende una secuencia de ácido nucleico, en particular una secuencia que codifica para al menos un antígeno y/o un epitopo antigénico, y en donde la vacunación es contra el agente a partir del cual es derivada la secuencia heteróloga de ácido nucleico, o el agente que comprende al menos un antígeno o epitopo antigénico.
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