DE60314823T2 - Modifizierte variante des vaccinia ankara virus als impfstoff für neugeborene - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Virus zur Herstellung eines Arzneimittels für die Impfung oder Behandlung eines neonatalen Tiers, einschließlich des Menschen, wobei das Virus in der Lage ist, die Zellen des neonatalen Tiers, einschließlich des Menschen, zu infizieren, jedoch nicht zu infektiösen Virusnachkommen im neonatalen Tier, einschließlich des Menschen, repliziert werden kann. Bei dem Virus handelt es sich um ein modifiziertes Vacciniavirus Ankara.
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung von MVA mit der oben angegebenen Bedeutung zur Erhöhung der Konzentration von Faktoren, die dendritische Zellen oder deren Vorläuferzellen aktivieren und/oder zur Erhöhung der Anzahl an dendritischen Zellen oder deren Vorläuferzellen und/oder zur Erhöhung der Produktion und/oder des Zellgehalts eines Interferons (IFN) oder von IL-12.
  • Stand der Technik
  • Die natürliche Umgebung von Tieren und Menschen enthält viele verschiedene infektiöse Agentien, wie beispielsweise Viren, Bakterien oder Pilze. Viele dieser infektiösen Agentien können Krankheiten im infizierten Wirt hervorrufen. Unter normalen Umständen erholt sich der infizierte Wirt von der durch das infektiöse Agens induzierten Krankheit nach einem gewissen Zeitraum. Diese Erholung ist auf das Immunsystem des Tiers bzw. des Menschen zurückzuführen.
  • Das Immunsystem stellt denjenigen Teil des menschlichen bzw. tierischen Körpers dar, der für die Beseitigung des infektiösen Agens verantwortlich ist. Die Immunantwort teilt sich dabei in eine spezifische und eine unspezifische (angeborene) Reaktion, obwohl beide Reaktionen eng zusammenarbeiten. Die unspezifische Immunantwort stellt dabei den unmittelbaren Abwehrmechanismus gegen viele verschiedene Fremdstoffe und infektiöse Agentien dar. Bei der angeborenen Immunantwort gegen Viren sind Interferon (IFN)-α und IFN-β absolut notwendig zur Kontrolle der ersten Virusreplikation und zur Aktivierung natürlicher Killer-(NK)-Zellen zum sofortigen Abtöten infizierter Zellen. Intrazelluläre bakterielle oder parasitäre Krankheitskeime induzieren IL-12, das IFN-γ in NK-Zellen und/oder einigen T-Zellen-Untergruppen heraufreguliert. Intrazelluläre Krankheitskeime können dann von durch IFN-γ aktivierten NK-Zellen abgetötet werden. Zudem aktiviert IFN-γ auch Makrophagen und ermöglicht diesen, internalisierte Krankheitskeime abzutöten.
  • Bei weitem die reichste Quelle für IFN-α/β, bezogen auf eine einzelne Zelle, stellen dendritische Zellen (DC) dar, bei denen es sich um eine über den gesamten Körper strategisch verteilte spezialisierte Zellpopulation handelt. Plasmozytoid-DC oder CD11c+-CD8+-DC gehören zu den besten Produzenten von IFN-α/β. Mit intrazellulären nichtviralen Krankheitskeimen infizierte CD8+-DC stellen die kritischen Zellen dar, die in der Lage sind, das für die frühen Schritte der Immunabwehr essentielle IL-12 zu sezernieren.
  • Eine spezifische Immunantwort läßt sich gegen einen bestimmten Fremdstoff (Antigen) nach einer Verzögerungsphase, bei der der Organismus erstmals durch diesen Stoff herausgefordert („challenged") wird, induzieren. Der Start der spezifischen Immunantwort wird auch von DC koordiniert. Dabei gibt es einen ständigen Verkehrsfluß dieser Zellen von der Peripherie zu den sekundären lymphoiden Organen, den Lymphknoten bzw. der Milz, wo naive T- und B-Zellen rezirkulieren. Antigen, das von DC zu diesen Organen geführt wird, ermöglicht die Aktivierung naiver T- und B-Zellen, so daß diese zu T- und B- Effektorzellen werden. Hierzu tragen die DC nicht nur das Antigen, sondern die Plastizität der Krankheitskeimerkennung gestattet die unterschiedliche Genaktivierung in DC und somit ein an den Krankheitskeim angepaßtes Priming von T-Zellen.
  • Die spezifische Immunantwort ist hocheffizient und dafür verantwortlich, daß ein Individuum, das sich von einer spezifischen Infektion erholt, gegen diese spezifische Infektion geschützt ist. Somit verursacht eine zweite Infektion mit dem gleichen oder einem sehr ähnlichen infektiösen Agens wesentlich mildere Symptome oder gar keine Symptome, da bereits eine „vorexistierende spezifische Immunität" gegenüber diesem Agens vorliegt. Eine derartige Immunität bzw. das immunologische Gedächtnis hält über einen langen Zeitraum an, in manchen Fällen sogar lebenslang. Dementsprechend läßt sich die Induktion eines immunologischen Gedächtnisses für die Impfung, d.h. zum Schutz eines Individuums gegen eine Infektion mit einem spezifischen Krankheitskeim, verwenden.
  • Bei der Impfung wird das Immunsystem durch einen Impfstoff herausgefordert, der selbst weniger schädlich als der Krankheitskeim, gegen den eine Immunantwort induziert werden soll, ist. Der Impfstoff umfaßt oder exprimiert dabei Epitope, die im Agens, gegen das die Impfung durchgeführt wird, angetroffen oder davon exprimiert werden. Somit wird der Organismus gegen das das Epitop, das Teil des Impfstoffs ist, enthaltende Agens immunisiert.
  • Bei den Impfstoffen handelt es sich typischerweise um abgeschwächte oder inaktivierte Viren (z.B. die Impfstoffe gegen Polio oder das Pockenvirus), rekombinante Proteine (z.B. rekombinantes Hepatitis-B-Virus-S-Protein), hitzeinaktivierte Bakterientoxine (Clostridium tetani-Toxin) oder Polysaccharide der Bakterienkapselwand (Streptococcus pneumoniae).
  • Da Infektionskrankheiten zu sehr kritischen Zuständen bei Neugeborenen und Säuglingen führen könnten, besteht ein Interesse daran, Kinder oder neugeborene Tiere so früh wie möglich zu impfen. Zu Leiden, gegen die eine Impfung wünschenswert ist, gehören beispielsweise Pockenvirusinfektionen, einschließlich der Pockenkrankheit. Allerdings werden Versuche zur erfolgreichen Impfung von Neugeborenen dadurch behindert, daß das Immunsystem von neugeborenen Säugern noch nicht ausgereift ist. Man nimmt an, daß das Immunsystem von neugeborenen Kindern und Säugetieren über einen bestimmten Zeitraum allmählich reift. Beim Menschen findet diese Reifung während des ersten Lebensjahrs statt. Dies ist der Grund dafür, daß die Altersgruppe der Neugeborenen während dieses ersten Jahrs verschiedenen Infektionen ausgesetzt ist (Gans et al., J. Am. Med. Assoc. (1998) 280, 527-532). Insbesondere weisen neugeborene Kinder eine beeinträchtigte B-Zellfunktion, Mängel bei der Präsentation primärer Antigene durch dendritische Zellen und eine beschränkte T-Zellproliferation auf (Gans et al., J. Am. Med. Assoc. (1998) 280, 527-532). Kurz nach der Geburt liegen die Spiegel von T-Zellen in der Milz um das 1000fache niedriger als in Erwachsenen. Um wenigstens eine schwache Immunisierung zu erreichen, wurde vorgeschlagen, entweder replizierende Viren oder ein Adjuvans enthaltende Formulierungen zur Immunisierung zu verwenden. Allerdings besteht bei Replikationsviren stets die Gefahr, daß das unreife Immunsystem von der Virusinfektion bzw. den Lebendvirusimpfstoffen überwältigt wird, da für die virale Clearence T-Zellen notwendig sind (Hassett et al., J. Virol. (1997) 71, 7881-7888). Da in Neugeborenen eine reduzierte Produktion von Cytokinen durch Th-1-T-Helferzellen vorliegt, besteht die Reaktion der Kinder vorwiegend aus Th-2. Folglich werden keine cytotoxischen T-Zellen eingesetzt, und keine virale Clearence wird erzielt.
  • Die Situation bei Säugetieren ist sehr ähnlich zu der Situation beim Menschen, d.h. das Immunsystem ist nach der Geburt noch nicht ausgereift. In neugeborenen Mäusen liegt die Anzahl an CD4+-T-Zellen in der Milz um das 80.000fache und die der CD8+-T-Zellen um das 1000fache niedriger als in der Milz von erwachsenen Tieren. Zudem ist das Interferon (IFN) produzierende System in diesen Mäusen nicht ausgereift. Daher sind neugeborene Mäuse nicht in der Lage, die Expansion intrazellulärer Krankheitskeime über IFN an der Infektionsstelle effizient zu kontrollieren. Darüber hinaus ist die geringe Zahl und möglicherweise unzureichende Aktivierungsstufe der Immunzellen zu limitiert, um mit den schnell expandierenden Krankheitskeimen oder für die Impfung verwendeten replizierenden Viren fertigzuwerden.
  • Von Kovarik et al. (Virology (2001) 285, 12-20) wird die Induktion von erwachsenen Tieren ähnlichen Reaktionen mit Antikörper, Th1 und cytotoxischen T-Zellen in einem Immunisierungsmodell der Frühphase des Mauslebens unter Verwendung des vom Copenhagen-Stamm abgeleiteten und auf Vaccinia beruhenden Stamms NYVAC(K1L) offenbart. Allerdings repliziert dieser Stamm in menschlichen Zellen.
  • Aufgrund des mit Lebendvirusimpfstoffen assoziierten Risikos wird nicht empfohlen, neugeborene Tiere, einschließlich Menschen, mit replizierenden Viren zu impfen. Beispielsweise wird nicht empfohlen, Neugeborene gegen Pocken mit den Vacciniavirusstämmen, die bis zur Ausrottung der Pockenkrankheit verwendet wurden, wie z.B. den Stämmen Elstee, Copenhagen und NYCBH, zu impfen. Nach neueren Empfehlungen in den USA sollten Babys im Alter von weniger als 12 Monaten die bislang kommerzialisierten Pockenimpfstoffe nicht erhalten.
  • Die Impfung von Neugeborenen mit Formulierungen, die ein Adjuvans enthalten, hat den Nachteil, daß dabei zahlreiche schädigende Substanzen in den Körper eingeführt werden. Somit wird eine Impfung bei menschlichen Neugeborenen nur in Notfällen, z.B. im Falle der Infektion mit Hepatitis-B-Virus, durchgeführt.
  • Zusammenfassend sollte festgehalten werden, daß das Immunsystem bei der Geburt nicht ausgereift ist. Da die Impfung mit replikationskompetenten Viren oder ein Adjuvans enthaltenden Formulierungen signifikante Nachteile aufweist, werden Kleinkinder unter 2 Monaten in Deutschland (Empfehlung der Ständigen Impfkommission STICO, 2001) bzw. unter 6 Wochen in den USA (ACIP "Recommended Childhood Immunization Schedule, United States") nicht geimpft.
  • Die Verzögerung bei der Entwicklung des Immunsystems wird teilweise durch die Übertragung mütterlicher Antikörper von der Mutter auf den Säugling während der Schwangerschaft oder durch Stillen ausgeglichen. Allerdings werden aus verschiedenen Gründen nicht alle Kleinkinder gestillt. Somit liegt beim Menschen ein sehr kritischer Zeitraum von etwa 6-8 Wochen vor, während dessen das Kleinkind mit einem unausgereiften und nicht voll funktionsfähigen Immunsystem keine mütterlichen Antikörper erhält und während dessen eine Impfung üblicherweise nicht erfolgreich oder zu gefährlich ist.
  • Die Situation ist bei Säugetieren, insbesondere bei wirtschaftlich wichtigen Tieren, wie beispielsweise Rindern oder Haustieren, wie z.B. Katzen und Hunden sehr ähnlich. Um die Kosten zu verringern, wird die Menge an Milch, die das Kalb von der Mutter erhält, häufig drastisch reduziert. Stattdessen erhält das Kalb ein Gemisch aus Milchpulver, Starterfutter und spezifischem Futterkonzentrat, manchmal bereits in der ersten Woche nach der Geburt. Folglich erhält das Kalb nicht die notwendige Menge und Vielfältigkeit mütterlicher Antikörper, so daß das nicht ausgereifte Immunsystem für Infektionen sehr anfällig ist. Weiterhin halten Bauern, die Kälber züchten, diese häufig nicht gleichzeitig für die Fleischproduktion. Im Alter von 4 bis 6 Wochen werden Kälber von unterschiedlichen Zuchthöfen zusammengebracht und zur Fleischproduktion zu anderen Bauernhöfen transportiert. Zu dieser Zeit ist die Konzentration mütterlicher Antikörper gering und das Immunsystem noch nicht voll entwickelt, doch werden die Tiere neuen infektiösen Agenzien unter Streßbedingungen ausgesetzt. Dadurch erhöht sich die Gefahr von Infektionen, die durch eine Impfung verhindert werden könnten. Eine ähnliche Situation findet sich bei Katzen- oder Hundezuchtbetrieben, wo ein hoher Infektionsdruck vorliegt.
  • Aufgabe der Erfindung
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Mitteln, die die beschleunigte Reifung des Immunsystems neugeborener Tiere und Menschen gestatten.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde unerwarteterweise festgestellt, daß die Möglichkeit besteht, neugeborene Tiere, einschließlich Menschen, mit Viren, die in der Lage sind, Zellen des neugeborenen Tiers, einschließlich des Menschen, zu infizieren, jedoch in den Zellen nicht unter Erhalt von infektiösen Virusnachkommen replizieren können, sicher und effizient zu impfen und/oder zu behandeln. Insbesondere konnte gezeigt werden, daß MVA, insbesondere MVA-BN und seine Derivate (siehe unten) Neugeborenen verabreicht werden können, ohne daß dabei irgendwelche schädlichen Wirkungen zu sehen sind. Die Impfung des Tiers mit dem Virus führt zu einer spezifischen Immunantwort gegen das für die Impfung verwendete Virus und/oder zu einer allgemeinen Impfung gegen Fremdantigene und Tumorantigene, wie unten ausführlicher beispielhaft erläutert ist. Zudem führt das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete MVA zu einer Induktion und/oder Verbesserung der Reifung des Immunsystems, was mit einer Erhöhung der Anzahl dendritischer Zellen und Faktoren, wie z.B. Interferonen, verbunden ist. Dabei ist die Impfung mit dem gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten MVA möglich, selbst wenn die Formulierung, die dem Tier verabreicht wird, kein Adjuvans enthält.
  • Zusammengefaßt läßt sich sagen, daß die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Viren (i) eine wirksame Immunantwort in Neugeborenen hervorrufen, (ii) ohne die Notwendigkeit für ein Adjuvans verabreicht werden können und (iii) kein Risiko einer Überwältigung des Organismus tragen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Schutzeffekt mindestens 5 Tage, vorzugsweise mindestens 7, 14 oder 28 Tage, nach der ersten Impfung ausgeübt.
  • Bei Viren, die „in der Lage sind, Zellen zu infizieren", handelt es sich um Viren, die auf der viralen Oberfläche Strukturen tragen, die mit den Wirtszellen in einem solchen Ausmaß Wechselwirken können, daß das Virus oder wenigstens das virale Genom in die Wirtszelle eingebaut wird. Obwohl das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete MVA in der Lage ist, die Wirtszelle zu infizieren, kann es nicht in den infizierten Zellen unter Erhalt von Virusnachkommen repliziert werden. In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Virus, das nicht in den Zellen unter Erhalt von infektiösen Virusnachkommen repliziert werden kann" auf Viren, deren Genom wenigstens teilweise in virale Proteine transkribiert und translatiert oder sogar repliziert, jedoch nicht in infektiöse Viruspartikel verpackt wird. Somit handelt es sich bei dem gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten MVA um ein Virus, das zu abortiven Infektionen im Wirt führt. Abortive Infektionen können aus zweierlei Gründen auftreten: nach der ersten Alternative kann eine Zelle zwar für die Infektion anfällig sein, braucht jedoch nicht für die Vervielfachung des Virus permissiv zu sein, beispielsweise aufgrund der Tatsache, daß nicht alle notwendigen viralen Gene für die Vervielfachung des Virus in der Zelle exprimiert werden und/oder im viralen Genom vorhanden sind. Bei dem gemäß der vorliegenden Erfindung in menschlichen Zellen verwendeten Virus handelt es sich um das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA), das unten ausführlicher erläutert wird. Eine abortive Infektion kann auch von der Infektion von Zellen mit defekten Viren, denen ein vollständiges Komplement viraler Gene fehlt, herrühren. Ein Beispiel für ein solches Virus für menschliche Zellen ist DISC-HSV1 („Disabled Single-Cycle Herpes Simplex Virus"), d.h. ein Herpes-Simplex-Virus, das auf einen einzigen Infektionszyklus beschränkt ist (Dilloo et al., Blood 1997, 89: 119-127). Diesem Virus fehlt das Gen für das essentielle Glycoprotein H (gH), es kann jedoch in einer gH exprimierenden komplementierenden Zellinie zu einem hohen Titer kultiviert werden. In nichtkomplementierenden Zellinien, die für Herpesviruswachstum permissiv sind, ist es auf einen einzigen Replikationszyklus beschränkt, was zur Freisetzung von nichtinfektiösem Virus führt. Der Ausdruck „kann nicht repliziert werden" bezieht sich vorzugsweise auf Viren, die überhaupt nicht in den Zellen des geimpften Tiers replizieren. Allerdings liegen auch diejenigen MVA-Viren im Umfang der vorliegenden Anmeldung, die eine geringe Restreplikationsaktivität zeigen, die vom nichtausgereiften Immunsystem des Neugeborenen kontrolliert wird.
  • Bei dem MVA gemäß der vorliegenden Erfindung kann es sich um ein beliebiges MVA handeln, das in der Lage ist, die Zellen des Tiers zu infizieren, das jedoch nicht in den Zellen unter Erhalt infektiöser Virusnachkommen repliziert werden kann. Dabei versteht sich, daß ein Virus, das in der Lage ist, Zellen einer ersten Tierspezies zu infizieren, das jedoch nicht in den Zellen unter Erhalt von infektiösen Virusnachkommen repliziert werden kann, sich in einer zweiten Tierspezies anders verhalten kann. Beispielsweise stellen beim Menschen MVA-BN und seine Derivate (siehe unten) Viren dar, die in der Lage sind, Zellen des Menschen zu infizieren, die jedoch nicht in menschlichen Zellen unter Erhalt von infektiösen Virusnachkommen repliziert werden können. Die gleichen Viren können in Hühnern replizieren, d.h. in Hühnern braucht MVA-BN kein Virus zu sein, das in Zellen des Huhns nicht unter Erhalt von infektiösen Virusnachkommen repliziert werden kann. Dem Fachmann ist bekannt, welches Virus für eine spezifische Tierspezies gewählt werden muß. Ein Test, der es gestattet, zu bestimmen, ob ein Virus in einem neugeborenen oder pränatalen Tier repliziert werden kann oder nicht, ist aus der WO 02/42480 bekannt und verwendet den Mausstamm AGR129. Die in diesem Mausmodell erhaltenen Ergebnisse lassen auf die Situation beim Menschen schließen. Somit entspricht der Ausdruck „nicht unter Erhalt von infektiösen Virusnachkommen repliziert werden können", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, dem Ausdruck „kann nicht in vivo replizieren", wie er für Mäuse in der WO 02/42480 verwendet wird. Dieser Test ist unten ausführlicher beschrieben. Die Viren gemäß der vorliegenden Erfindung können vorzugsweise in wenigstens einer Art von Zellen von wenigstens einer Tierspezies repliziert werden. Somit ist es möglich, das Virus vor Verabreichung an das Tier, das geimpft und/oder behandelt werden soll, zu amplifizieren. Beispielhaft wird hier auf MVA-BN verwiesen, das in CEF-Zellen amplifiziert werden kann, bei den es sich jedoch um ein Virus handelt, das im neugeborenen Menschen nicht unter Erhalt von infektiösen Virusnachkommen repliziert werden kann. In diesem Zusammenhang sollte angemerkt werden, daß chemisch oder physikalisch inaktivierte Viren nicht alle Eigenschaften dieser bevorzugten Ausführungsform aufweisen, da inaktivierte Viren in der Lage sind, die Zellen des neugeborenen Tiers, einschließlich des Menschen, zu infizieren, und im neugeborenen Tier, einschließlich des Menschen, nicht unter Erhalt von infektiösen Virusnachkommen repliziert werden können, daß diese Viren jedoch nicht in der Lage sind, in wenigstens einer Art von Zellen von wenigstens einer Tierspezies zu replizieren.
  • Bei Säugerzellen, insbesondere menschlichen Zellen, handelt es sich bei dem DNA-Virus um das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA).
  • Das MVA (Modified Vaccinia Ankara)-Virus ist mit dem Vacciniavirus, einem Mitglied der Gattung Orthopoxvirus in der Familie Poxviridae, verwandt. MVA wurde durch 516 serielle Passagierungen des Ankara-Stamms von Vacciniavirus (CVA) auf Hühnerembryofibroblasten erzeugt (siehe Übersichtsartikel von Mayr, A., et al., Infection 3, 6-14 [1975]). Als Folge dieser Langzeitpassagierungen deletierte das erhaltene MVA-Virus etwa 31 Kilobasen seiner genomischen Sequenz und wurde daher als stark wirtszellenbeschränkt auf Vogelzellen beschrieben (Meyer, H., et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 [1991]). Es konnte in verschiedenen Tiermodellen gezeigt werden, daß das erhaltene MVA in signifikanter Weise avirulent war (Mayr, A. & Danner, K. [1978] Dev. Biol. Stand. 41: 225-234). Darüber hinaus wurde dieser MVA-Stamm in klinischen Versuchen als Impfstoff zur Immunisierung gegen die menschliche Pockenkrankheit getestet (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). Diese Untersuchungen wurden mit über 120 000 Menschen, einschließlich Hochrisikopatienten, durchgeführt und zeigten, daß im Vergleich mit Impfstoffen auf Vacciniabasis MVA eine verringerte Virulenz oder Infektiösität aufwies und dabei eine gute Immunogenität bewahrte.
  • Bevorzugte Stämme gemäß der vorliegenden Erfindung sind MVA 575, bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) mit der Hinterlegungsnummer V00120707 hinterlegt, und MVA-BN, bei der gleichen Behörde mit der Hinterlegungsnummer V000083008 hinterlegt, sowie Derivate davon. Falls die Impfung/Behandlung von Menschen vorgesehen ist, sind MVA-BN und seine Derivate besonders bevorzugt.
  • Die Eigenschaften besonders bevorzugter MVA-Stämme, vorzugsweise der am stärksten bevorzugten Stämme für Menschen, wie z.B. MVA-BN und seiner Derivate, lassen sich wie folgt zusammenfassen:
    • (i) Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) und in der Zellinie BHK, jedoch keine Fähigkeit zur reproduktiven Replikation in der menschlichen Zellinie HaCat,
    • (ii) Unfähigkeit zur Replikation in vivo,
    • (iii) Induktion einer höheren Immunogenität im Vergleich mit dem bekannten Stamm MVA 575 (ECACC V00120707) in einem lethalen Challenge-Modell und/oder
    • (iv) Induktion wenigstens weitgehend des gleichen Niveaus an Immunität in Vacciniavirus-„Prime"-/Vacciniavirus-„Boost"-Regimes im Vergleich mit DNA-Prime-/Vacciniavirus-Boost-Regimes.
  • Die bevorzugten MVA-Stämme zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung weisen die Eigenschaft (ii) Unfähigkeit zur Replikation im Organismus, der geimpft oder behandelt werden soll, und/oder im entsprechenden Testsystem, wie unten erläutert, sowie vorzugsweise eine weitere der obigen Eigenschaften, stärker bevorzugt zwei weitere der obigen Eigenschaften auf. Am stärksten bevorzugt sind MVA-Stämme, die alle obigen Eigenschaften aufweisen. Ein Beispiel für einen MVA-Stamm mit allen obigen Eigenschaften beim Menschen ist MVA-BN. Bevorzugte Derivate von MVA-BN sind Derivate, die zusätzlich zu Merkmal (ii) wenigstens eine der obigen Eigenschaften, stärker bevorzugt wenigstens zwei der obigen Eigenschaften aufweisen. Am stärksten bevorzugt sind MVA-BN-Derivate mit allen obigen Eigenschaften.
  • Hinsichtlich ausführlicher Angaben bezüglich der zur Bestimmung davon, ob ein MVA-Stamm ein oder mehrere der obigen Merkmale (i) bis (iv) aufweist, verwendeten Tests wird auf die WO 02/42480 verwiesen. In dieser Veröffentlichung wird auch offenbart, wie Viren mit den gewünschten Eigenschaften erhalten werden können. Insbesondere liefert die WO 02/42480 eine ausführliche Definition der Merkmale von MVA-BN sowie eines Derivats von MVA-BN und offenbart ausführlich die biologischen Test, die verwendet werden, um zu bestimmen, ob es sich bei einem MVA-Stamm um MVA-BN oder ein Derivat davon handelt. Mit anderen Worten: die Merkmale von MVA-BN, die Beschreibung biologischer Tests, die die Beurteilung, ob es sich bei einem MVA-Stamm um MVA-BN oder ein Derivat davon handelt, gestatten sowie Verfahren, die die Gewinnung von MVA-BN oder eines Derivats davon gestatten, sind in der WO 02/42480 offenbart. Im folgenden wird kurz zusammengefaßt, wie der Fachmann zu den MVA-Stämmen mit einem oder mehreren der obigen Merkmale gelangt und wie er testen kann, ob ein gegebener MVA-Stamm eines oder mehrere der Merkmale aufweist und somit ein ganz besonders bevorzugtes Virus gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt. Dabei soll die folgende Zusammenfassung nicht so verstanden werden, als daß sie die Relevanz der WO 02/42480 für die vorliegende Anmeldung hinsichtlich der folgenden Angaben beschränkt. Stattdessen wird die WO 02/42480 hiermit durch Bezugnahme voll inhaltlich aufgenommen.
  • Der Ausdruck „unfähig zur reproduktiven Replikation" in der Zellinie HaCAT (Boukamp et al., 1988, J. Cell. Biol. 106(3): 761-771) wird in der vorliegenden Anmeldung wie in der WO 02/42480 definiert verwendet. Somit handelt es sich bei einem Virus, das in der Zellinie HaCAT „unfähig zur reproduktiven Replikation" ist, um ein Virus, das ein Amplifikationsverhältnis von weniger als 1 in der menschlichen Zellinie HaCat zeigt. Vorzugsweise beträgt die Amplifikationsrate des als erfindungsgemäßer Vektor verwendeten Virus 0,8 oder weniger in der menschlichen Zellinie HaCat. Das „Amplifikationsverhältnis" eines Virus ist dabei das Verhältnis des von einer infizierten Zelle produzierten Virus („Output") zu ursprünglich zur ersten Infektion der Zellen verwendeten Menge („Input") („Amplifikationsverhältnis"). Ein Verhältnis von „1" zwischen Output und Input definiert einen Amplifikationsstatus, wobei die Menge an von den infizierten Zellen produziertem Virus die gleiche ist wie die Menge, die anfangs zur Infektion der Zellen verwendet wurde. Der Begriff „Derivate” der Viren, wie sie unter ECACC V00083008 hinterlegt sind, bezieht sich vorzugsweise auf Viren, die im wesentlichen die gleiche Replikationscharakteristik wie der hinterlegte Stamm, aber Unterschiede in einem oder mehreren Teilen seines Genoms zeigen. Bei Viren mit der gleichen „Replikationscharakteristik" wie das hinterlegte Virus handelt es sich um Viren, die mit ähnlichen Amplifikationsverhältnissen wie der hinterlegte Stamm in CEF-Zellen und den Zellinien BHK, HeLa, HaCat und 143B replizieren und die eine ähnliche Replikation in vivo zeigen, wie sie im transgenen Mausmodell AGR129 bestimmt wurde (siehe unten).
  • Der Ausdruck „Unvermögen zur Replikation in vivo" wird in der vorliegenden Anmeldung wie in der WO 02/42480 definiert verwendet. Somit bezieht sich der Ausdruck auf Viren, die weder im Menschen noch im Mausmodell, wie in der WO 02/42480 erläutert, replizieren. Die in der WO 02/42480 verwendeten Mäuse sind unfähig, reife B- und T-Zellen zu produzieren (AGR129-Mäuse). Insbesondere töten MVA-BN und seine Derivate keine AGR129-Mäuse innerhalb eines Zeitraums von wenigstens 45 Tagen, stärker bevorzugt innerhalb von wenigstens 60 Tagen, am stärksten bevorzugt innerhalb von wenigstens 90 Tagen nach der Infektion der Mäuse mit 107 pfu intraperitoneal verabreichtem Virus. Vorzugsweise sind die Viren, die „Unvermögen zur Replikation in vivo" zeigen, weiter dadurch gekennzeichnet, daß kein Virus aus Organen oder Geweben der AGR129-Mäuse 45 Tage, bzw. 60 Tage und am stärksten bevorzugt 90 Tage nach der Infektion der Mäuse mit 107 pfu intraperitoneal verabreichtem Virus wiedergewonnen werden kann.
  • Statt der AGR129-Mäuse kann jeder andere beliebige Mausstamm verwendet werden, der keine reifen B- und T-Zellen produzieren kann und somit stark immungeschwächt und für ein replizierendes Virus hochanfällig ist.
  • Die Einzelheiten des zur Bestimmung, ob ein MVA-Stamm „eine höhere Immunogenität im Vergleich mit dem bekannten Stamm MVA 575" aufweist, verwendeten lethalen Challenge-Experiments sind in der WO 02/42480 erläutert. Bei einem solchen lethalen Challenge-Modell sterben nicht geimpfte Mäuse nach der Infektion mit replikationskompetenten Vacciniastämmen, wie z.B. dem Western Reserve-Stamm L929 TK+ oder IHD-J. Die Infektion mit replikationskompetenten Vacciniaviren wird im Zusammenhang mit der Beschreibung des lethalen Challenge-Modells als „Challenge" bezeichnet. Die Mäuse werden üblicherweise 4 Tage nach dem Challenge getötet und der Virustiter in den Ovarien über Standard-Plaque-Assays unter Verwendung von VERO-Zellen bestimmt. Der Virustiter wird dabei für nicht geimpfte Mäuse und für mit MVA-BN und seinen Derivaten geimpfte Mäuse bestimmt. Insbesondere sind MVA-BN und seine Derivate dadurch gekennzeichnet, daß in diesem Test nach der Impfung mit 102 TCID50/ml Virus die Ovarien-Virustiter um wenigstens 70%, vorzugsweise um wenigstens 80%, stärker bevorzugt um wenigstens 90% im Vergleich mit nicht geimpften Mäusen reduziert sind.
  • In einer bevorzugten verwendeten Ausführungsform eignen sich MVA, insbesondere MVA-BN und seine Derivate, für die Prime/Boost-Verabreichung. Die Viren, insbesondere MVA-Stämme, die am stärksten bevorzugt in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie z.B. MVA-BN und seine Derivate ebenso wie entsprechende rekombinante Viren, die heterologe Sequenzen enthalten, lassen sich für ein wirksames erstes Primen und anschließendes Boosten von Immunantworten in nativen Tieren ebenso wie in Tieren mit einer bereits existierenden Immunität gegenüber Pockenviren verwenden. Somit induziert das am stärksten bevorzugte Virus gemäß der vorliegenden Erfindung wenigstens weitgehend das gleiche Immunitätsniveau in Vacciniavirus-Prime-/Vacciniavirus-Boost-Regimen im Vergleich zu DNA-Prime-/Vacciniavirus-Boost-Regimen.
  • Es wird angenommen, daß ein Vacciniavirus, insbesondere ein MVA-Stamm, wenigstens weitgehend das gleiche Immunitätsniveau in Vacciniavirus-Prime-/Vacciniavirus-Boost-Regimen im Vergleich zu DNA-Prime-/Vacciniavirus-Boost-Regimen induziert, falls die CTL-Antwort, wie sie in einem aus „Assay 1" und „Assay 2", wie sie in der WO 02/42480 offenbart sind, vorzugsweise in beiden Assays, gemessen wird, wenigstens weitgehend zu der in Vacciniavirus-Prime-/Vacciniavirus-Boost-Regimen im Vergleich zu DNA-Prime-/Vacciniavirus-Boost-Regimen identisch ist. Stärker bevorzugt ist die CTL-Antwort nach Vacciniavirus-Prime-/Vacciniavirus-Boost-Verabreichung höher in wenigstens einem der Assays im Vergleich zu DNA-Prime-/Vacciniavirus-Boost-Regimen. Am stärksten bevorzugt ist die CTL-Antwort höher in beiden Assays.
  • Bei dem gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Virus kann es sich um ein nichtrekombinantes MVA, d.h. ein Virus, das keine heterologen Nukleotidsequenzen enthält, handeln. Bei MVA-BN und seinen Derivaten handelt es sich um ein Beispiel für ein nichtrekombinantes Vacciniavirus. Andererseits kann das Virus ein rekombinantes MVA sein, das zusätzliche Nukleotidsequenzen, die zum Virus heterolog sind, enthält.
  • Der Begriff „heterolog", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bezieht sich auf eine beliebige Kombination von Nukleinsäuresequenzen, die in der Natur normalerweise nicht in enger Assoziation mit dem Virus angetroffen wird, wobei ein solches Virus auch „rekombinantes Virus" genannt wird.
  • Die heterologe Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise aus einer für wenigstens ein Antigen, antigenes Epitop, vorteilhafte Proteine und/oder eine therapeutische Verbindungen codierenden Sequenz ausgewählt.
  • Der Begriff „vorteilhafte Proteine", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bezieht sich auf alle Proteine, die beim Schutz eines Tiers gegen ein aus Tumorantigen und Fremdantigen ausgewähltes Antigen, wobei das Tumorantigen und das Fremdantigen sich von den mit dem Virus assoziierten Antigenen unterscheiden, behilflich sind. Als Alternative und insbesondere sind die „vorteilhaften Proteine" bei der Erhöhung der Konzentration von Faktoren, die dendritische Zellen aktivieren, und/oder bei der Erhöhung der Anzahl dendritischer Zellen und/oder bei der Erhöhung der Produktion und/oder des Zellgehalts eines Interferons (IFN) oder IL-12 aktiv. Somit stellen Interferone, wie z.B. IFN-alpha oder IFN-beta, IL-12, Flt3-L und/oder GMCSF Beispiele für derartige vorteilhafte Proteine dar.
  • Bei den antigenen Epitopen kann es sich um beliebige Epitope handeln, gegen die die Induktion einer Immunantwort Sinn macht. Beispiele für antigene Epitope sind Epitope aus Plasmodium falciparum, Mykobakterien, Grippevirus, aus Viren, ausgewählt aus der Familie der Flaviviren, Paramyxoviren, Hepatitisviren, menschlichen Immunschwächeviren, oder aus Viren, die hämorrhagisches Fieber verursachen, wie z.B. Hantaviren oder Filoviren, d.h. Ebola- oder Marburgvirus. Falls beispielsweise ein heterologe Epitope exprimierendes rekombinantes MVA zur Impfung von Neugeborenen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, so führt diese Behandlung nicht nur zu einer allgemeinen Impfung aufgrund der beschleunigten Reifung des Immunsystems, sondern auch zu einer spezifischen Impfung gegen das von dem heterologen MVA exprimierte heterologe Epitop.
  • Bei einer von der heterologen Nukleinsäure in dem rekombinanten Virus codierten „therapeutischen Verbindung" kann es sich beispielsweise um eine therapeutische Nukleinsäure, wie z.B. eine Antisense-Nukleinsäure, oder ein Peptid oder Protein mit der gewünschten biologischen Aktivität handeln.
  • Die Insertion heterologer Nukleinsäuresequenz erfolgt vorzugsweise in einem nichtessentiellen Bereich des Virusgenoms. Als Alternative wird die heterologe Nukleinsäuresequenz an einer natürlich vorkommenden Deletionstelle des Virusgenoms (für MVA in der PCT/EP96/02926 ) offenbart) insertiert. Dem Fachmann sind Verfahren zur Insertion heterologer Sequenzen in das Virusgenom, wie z.B. ein Pockenvirusgenom, bekannt.
  • In der vorliegenden Erfindung wird ebenso eine pharmazeutische Zusammensetzung sowie ein Impfstoff, umfassend MVA, z.B. zur Induktion einer Immunantwort in einem lebenden Tierkörper, einschließlich des Menschen, beschrieben.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann allgemein einen oder mehrere pharmazeutisch unbedenkliche und/oder zugelassene Trägerstoffe, Zusatzstoffe, Antibiotika, Konservierungsstoffe, Adjuvantien, Verdünnungsmittel und/oder Stabilisatoren enthalten. Bei solchen Hilfsstoffen kann es sich um Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin, Ethanol, Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH puffernde Substanzen oder dergleichen handeln. Geeignete Trägerstoffe sind typischerweise große, langsam metabolisierte Moleküle, wie z.B. Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäurecopolymere, Lipidaggregate oder dergleichen.
  • Zur Herstellung von Impfstoffen werden das Virus bzw. seine Rekombinanten in eine physiologisch unbedenkliche Form umgewandelt. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Bei MVA kann der Impfstoff auf der Grundlage der Erfahrung bei der Herstellung von Pockenvirusimpfstoffen, die zur Impfung gegen Pocken verwendet wurden, durchgeführt werden (wie bei Stickl, H., et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392) beschrieben). Beispielsweise wird das gereinigte Virus mit einem in etwa 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,4 formulierten Titer von 5 × 108 TCID50/ml bei –80°C gelagert. Zur Herstellung von Impfstoffinjektionen werden z.B. 101–108 Partikel des Virus, wie z.B. MVA, in 100 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS [= Phosphate-Buffered Saline]) in Gegenwart von 2% Pepton und 1% menschlichem Albumin in einer Ampulle, vorzugsweise einer Glasampulle, lyophilisiert. Als Alternative können die Impfstoffinjektionen durch schrittweises Gefriertrocknen des Virus in einer Formulierung produziert werden. Dabei kann diese Formulierung zusätzliche Zusatzstoffe, wie z.B. Mannit, Dextran, Zucker, Glycin, Lactose oder Polyvinylpyrrolidon, oder andere Zusatzstoffe, wie z.B. Antioxidantien oder Inertgas, Stabilisatoren oder rekombinante Proteine (z.B. menschliches Serumalbumin), die zur in-vivo-Verabreichung geeignet sind, enthalten. Die Glasampulle wird dann verschlossen und kann mehrere Monate zwischen 4°C und Raumtemperatur gelagert werden. Allerdings wird die Ampulle, solange kein Bedarf besteht, vorzugsweise bei Temperaturen unterhalb von –20°C gelagert.
  • Zur Impfung oder Therapie kann das Lyophilisat in 0,1 bis 0,5 ml einer wäßrigen Lösung, vorzugsweise physiologischer Kochsalzlösung oder Tris-Puffer, gelöst und entweder systemisch oder lokal, d.h. durch Verabreichung auf parenteralem, intramuskulärem oder einem anderen Weg der Verabreichung, der dem Facharzt bekannt ist, verabreicht werden. Die Art der Verabreichung, die Dosis sowie die Anzahl der Verabreichungen können vom Fachmann in bekannter Weise optimiert werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung verwendetes MVA kann durch orale, nasale, intramuskuläre, intravenöse, intraperitoneale, intradermale und/oder subkutane Applikation verabreicht werden. Bei kleinen Tieren erfolgt die Inokulation zur Immunisierung vorzugsweise parenteral oder nasal, wohingegen bei größeren Tieren oder dem Menschen eine subkutane, intramuskuläre oder orale Inokulation bevorzugt ist.
  • MVA wird vorzugsweise in einer Dosis von 101 TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose [infektiöse Gewebekulturdosis]) bis 109 TCID50 verabreicht.
  • Wie oben dargelegt, können MVA, wie z.B. MVA-BN und seine Derivate, in einer therapeutisch wirksamen Menge in einer ersten Inokulation („priming inoculation") und in einer zweiten Inokulation („boosting inoculation") verabreicht werden.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung schließt der Begriff „Tier" auch den Menschen ein. Ganz allgemein handelt es sich bei dem Tier um ein Wirbeltier, vorzugsweise ein Säugetier, einschließlich des Menschen. Spezifische Beispiele für Tiere sind Haustiere, wie z.B. Hunde, Katzen, wirtschaftlich wichtige Tiere, wie z.B. Kälber, Rinder, Schafe, Ziegen, Pferde, Schweine, und andere Tiere, wie z.B. Mäuse, Ratten. Für diese Tierspezies sowie für den Menschen ist MVA das bevorzugte Virus. Die Erfindung kann auch für wirtschaftlich wichtige Vögel, wie z.B. Truthähne, Enten, Gänse und Legehühner verwendet werden, falls Viren verwendet werden, die zur Infektion der Zellen des Vogels in der Lage sind, jedoch nicht in den Zellen unter Erhalt von infektiösen Virusnachkommen repliziert werden können.
  • Der Begriff „Haustiere” [„domestic animals"], wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich vorzugsweise auf Säugerhaustiere, stärker bevorzugt auf Hunde, Katzen, Kälber, Rinder, Schafe, Ziegen, Schweine, Pferde, Hirsche.
  • Beispielsweise können MVA, insbesondere MVA-BN und seine Derivate, als spezifische Impfstoffe verwendet werden, d.h. um eine Immunantwort hervorzurufen, die das geimpfte Neugeborene gegen durch ein virulentes Virus, das zur gleichen Virusgruppe, -familie oder -gattung wie das Virus, das zur Impfung verwendet wurde, gehört, verursachte Krankheiten schützt. Beispielsweise lassen sich MVA mit der oben angegebenen Bedeutung, insbesondere MVA-BN und seine Derivate, zur Impfung neugeborener Menschen gegen Pockenvirusinfektionen, insbesondere gegen die Pockenkrankheit, verwenden. MVA, insbesondere MVA-BN und seine Derivate, können auch zur Impfung von Wirbeltieren gegen Pockenvirusinfektionen von tierärztlicher Bedeutung verwendet werden. Bei dem zur Impfung verwendeten Virus kann es sich um ein nichrekombinantes Virus, wie z.B. MVA-BN oder seine Derivate, oder ein rekombinantes Virus, das im viralen Genom Gene trägt, die natürlicherweise nicht in dem Genom angetroffen werden, handeln. Das rekombinante Virus trägt dabei zusätzliche Gene, die bei der Stimulierung der Immunantwort behilflich sind. Beispiele für diese Art von Genen sind Cytokingene und Interferongene.
  • Weiterhin können beispielsweise Neugeborene mit einem rekombinanten Virus geimpft werden, das eine heterologe Nukleinsäuresequenz mit der oben angegebenen Bedeutung trägt, um eine Immunantwort gegen die von der heterologen Nukleinsäuresequenz exprimierte Aminosäuresequenz zu induzieren. Dabei kann die Nukleinsäuresequenz beispielsweise für ein Antigen oder ein antigenes Epitop mit der oben angegebenen Bedeutung codieren. Beispiele für ein rekombinantes Virus sind rekombinantes MVA, insbesondere rekombinantes MVA-BN oder ein Derivat davon, die eine heterologe Nukleinsäure umfassen, die für Antigene aus (i) anderen Viren als MVA, wie z.B. HIV-1, HIV-2, Denguevirus, West-Nile-Virus, Japanese Enzephalitisvirus, Masernvirus, (ii) Tumorantigenen, (iii) Bakterien, (iv) Pilzen codiert. Falls es sich beispielsweise bei dem von dem rekombinanten Virus exprimierten Antigen um ein HIV-Antigen handelt, besteht die Möglichkeit, das rekombinante Virus zur Induktion einer Immunantwort im geimpften Neugeborenen gegen HIV und zur Vorbeugung von AIDS zu verwenden. Im weiteren Sinne wird das das Antigen oder antigene Epitop exprimierende rekombinante Virus zur Induktion einer Immunantwort gegen das Agens, von dem die heterologe Sequenz stammt, und/oder gegen das Agens, das das Antigen oder antigene Epitop umfaßt, verwendet.
  • Erfindungsgemäß wurde drittens unerwarteterweise festgestellt, daß Viren, die in der Lage sind, die Zellen des neugeborenen Tiers, einschließlich des Menschen, zu infizieren, die jedoch nicht im neugeborenen Tier, einschließlich des Menschen, unter Erhalt von infektiösen Virusnachkommen repliziert werden können, zur Herstellung eines Arzneimittels zum Schutz eines neugeborenen Tiers, einschließlich des Menschen, gegen ein aus Tumorantigen und Fremdantigen ausgewähltes Antigen, wobei sich das Tumorantigen und/oder das Fremdantigen von dem mit dem Virus assoziierten Antigen unterscheiden, verwendet werden können.
  • Erfindungsgemäß sind mit MVA, wie z.B. MVA-BN und seinen Derivaten, geimpfte Neugeborene gegen ein Challenge mit Fremdantigenen, wie z.B. infektiösen Agentien, geschützt. Somit handelt es sich gemäß der vorliegenden Erfindung bei MVA um einen allgemeinen Impfstoff für Neugeborene, d.h. durch Impfen der Neugeborenen mit MVA wird das Immunsystem der Neugeborenen kompetenter im Umgang mit Fremdantigenen, wie z.B. Viren. Dies wird im Beispielteil beispielhaft für die Impfung mit MVA und ein nachfolgendes Challenge mit Herpes-simplex-Virus Typ 1 dargestellt. Somit sind, falls MVA für die Impfung von Neugeborenen verwendet wird, die geimpften Tiere in der kritischen Zeitspanne, bis ein funktionsfähiges und reifes Immunsystem etabliert ist, besser gegen Fremdantigene geschützt als nicht geimpfte Tiere.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung „unterscheidet sich das Tumorantigen und/oder das Fremdantigen von den mit Virus assoziierten Antigenen". Dieser Ausdruck soll so interpretiert werden, daß erfindungsgemäß MVA nicht in erster Linie zur Induktion einer Immunantwort gegen das Virus selbst verwendet werden soll. Stattdessen wird das Virus zur Induktion einer Immunantwort oder wenigstens einer allgemeinen Immunstimulierung verwendet, die den Wirt gegen Fremdantigene bzw. Tumorantigene, die nicht mit dem Virus assoziiert sind, schützt. Dabei bezieht sich der Ausdruck „mit dem Virus assoziierte Antigene" auf Epitope und Antigene des Viruspartikels sowie auf Antigene und Epitope auf der Oberfläche einer mit dem Virus infizierten Zelle, die das Ergebnis der Expression des viralen Genoms sind.
  • Im Zusammenhang mit dieser Ausführungsform bezieht sich der Begriff „Fremdantigene" auf alle Antigene und Epitope, die natürlicherweise nicht Teil oder Bestandteil des Tierkörpers sind. Dabei handelt es sich bei Fremdantigenen vor allem um Antigene und Epitope aus infektiösen Agentien und Toxine. Typische infektiöse Agentien sind Viren, wie z.B. Herpesviren, Retroviren, Tollwutviren, Rhabdoviren, Adenoviren, Bakterien, wie z.B Salmonellen, Mykoplasma, Meningicoccus, Hämophilus, Prione oder Pilze.
  • Die Erfindung ist nicht nur zur Impfung von Tieren gegen Fremdantigene interessant, sondern eignet sich in einer alternativen Ausführungsform auch zur Impfung gegen Tumorantigene. „Tumorantigene" sind Antigene, die mit bestimmten Tumorerkrankungen assoziiert sind. Dabei handelt es sich bei Tumorantigenen am häufigsten um Antigene, die von dem Genom des Wirts, der den Tumor entwickelt, codiert werden. Somit handelt es sich im strengen Sinne bei Tumorantigenen nicht um Fremdantigene. Allerdings werden Tumorantigene in beträchtlichen Mengen in Tumoren angetroffen, während die Menge von Tumorantigenen in normalen Geweben deutlich geringer sind und sehr häufig gar keine Tumorantigene im normalen Gewebe angetroffen werden. Beispiele für Tumorantigene sind dem Fachmann bekannt und beinhalten z.B. die MAGE-Antigene. MVA ist gegen diese Tumorantigene wirksam, da die Impfung von Tieren zu einer Aktivierung und/oder beschleunigten Reifung des Immunsystems führt, was dann zur Zerstörung von Tumorzellen führen kann.
  • Der Ausdruck „schützt gegen ein Antigen" bezieht sich auf die Entwicklung einer Immunantwort, die gegen das Fremd- oder Tumorantigenen gerichtet ist. Falls es sich bei dem Fremdantigen um ein infektiöses Agens handelt, wird der Wirt gegen das Agens geschützt, d.h. der Wirt entwickelt eine Immunantwort gegen das Antigen. Folglich führt die Infektion mit dem infektiösen Agens zu einer weniger schweren Krankheit oder zu gar keiner Krankheit. Dabei soll der Begriff „schützt" nicht so verstanden werden, daß immer ein 100%iger Schutz gegen das Fremd- bzw. Tumorantigen vorliegt. Stattdessen bezieht sich der Begriff „Schutz", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, auf alle vorteilhaften Effekte, die dem Tier beim Umgang mit dem Fremdantigen bzw. dem Tumorantigen helfen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein solcher Schutzeffekt wenigstens 5 Tage, vorzugsweise wenigstens 7, 14 oder 28 Tage nach der ersten Impfung ausgeübt. Mit anderen Worten: das geimpfte und/oder behandelte Tier ist z.B. gegen ein Fremdantigen geschützt, wenn das Tier mit dem Antigen nach 5, 7, 14 bzw. 28 Tagen in Kontakt kommt.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann die Wirkung der Impfung von Neugeborenen mit MVA über die Induktion oder Verbesserung der Reifung des Immunsystems und/oder die Aktivierung des Immunsystems erklärt werden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Induktion oder Verbesserung der Reifung des Immunsystems" unter anderem auf die beschleunigte Zunahme an dendritischen Zellen oder deren Vorläufer in geimpften Individuen relativ zu Kontrollindividuen. Die Ausdrücke „Beschleunigung der Reifung" des Immunsystems und „Verbesserung der Reifung" des Immunsystems werden dabei in dieser Beschreibung wechselseitig verwendet.
  • Die „Aktivierung des Immunsystems" ist durch die Expression von Molekülen und Hormonen, die die Zell/Zell-Wechselwirkung oder das Trafficking erleichtert, auf der Oberfläche von Zellen und/oder durch die Sekretion der Moleküle und Hormone durch die Zellen gekennzeichnet. Dabei nehmen spezifische Rezeptoren diese Signale auf und reagieren. Zu Aktivierungsmarkern gehören unter anderem Flt3-L, IL-12, IFN-alpha, MHC-II und CD8, insbesondere CD8-alpha (siehe unten).
  • Die beschleunigte Entwicklung/Reifung des Immunsystems wird mit einem Anstieg der Konzentration von Faktoren, die dendritische Zellen (DC) oder deren Vorläuferzellen aktivieren und/oder mobilisieren, und/oder einer Erhöhung der Anzahl dendritischer Zellen und ihrer Vorläuferzellen und/oder einem Anstieg der Produktion und/oder des Zellgehalts eines Interferons oder IL-12 korreliert. DC-Vorläuferzellen, die von MVA induziert werden, sind beispielsweise plasmocytoide DC-Vorläufer, die für die Abwehr gegen Virusinfektionen sehr wichtig sind und IFN-α/β zu produzieren scheinen.
  • Insbesondere ist die Verbesserung der Reifung des Immunsystems vorzugsweise durch einen wenigstens zweifachen Anstieg der auf DC angetroffenen Oberflächenmarker, wie z.B. MHC-II, CD40 und/oder CD80/86, definiert. Vorzugsweise kann ein derartiger Anstieg im Blut gemessen werden. Weitere Marker zur Kennzeichnung einer Verbesserung der Reifung des Immunsystems sind Flt3-L, IL-12, IFN-alpha, MHC-II und CD8a (siehe unten). Zudem wird die beschleunigte Reifung des Immunsystems vorzugsweise mit einer wenigstens 1,5fachen Erhöhung, vorzugsweise einer wenigstens 2,0fachen Erhöhung der Anzahl an CD11c-positiven Zellen im Blut und/oder der Milz 7 Tage nach Verabreichung von MVA-BN an neugeborene Tiere im Vergleich zu Kontrolltieren, die kein MVA-BN erhalten haben, korreliert. Zudem kann die Verbesserung der Reifung des Immunsystems vorzugsweise mit einem wenigstens 1,5fachen Anstieg, stärker bevorzugt mit einem wenigstens 2,0fachen Anstieg der Konzentration von Flt3-L zwei Tage nach der Impfung von Neugeborenen mit Viren gemäß der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu vom Alter her passenden Kontrollen korreliert werden.
  • In diesem Zusammenhang sollt angemerkt werden, daß es einen Zusammenhang zwischen dem Phänotyp und der Funktion von DC-Populationen der Maus und des Menschen gibt, der sich über deren Oberflächenphänotyp charakterisieren läßt (Hochrein et al., 2002. Hum. Immunol. 63: 1103). DC läßt sich im Blut mittels Durchflußcytometrie unter Verwendung einer Reihe von Oberflächenmarkern (MacDonald et al. 2002. Blond. 100: 4512) nachweisen, die auch die Identifizierung spezifischer Populationen von DC, wie z.B. der plasmacytoiden DC, gestatten (Dzionek et al. 2002. Hum Immunol. 63: 1133; Dzionek et al. 2000. J. Immunol. 165: 6037). Mit ähnlichen Techniken lassen sich DC auch in anderen menschlichen Geweben nachweisen (Summers et al. 2001. Am. J. Pathol. 159: 285).
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung könnten die Viren, wie sie oben definiert sind, auch zur Behandlung von neugeborenen Tieren verwendet werden, um die Konzentration von Faktoren, die dendritische Zellen (DC) oder deren Vorläuferzellen aktivieren und/oder mobilisieren, und/oder die Anzahl dendritischer Zellen und ihrer Vorläuferzellen und/oder die Produktion und/oder den Zellgehalt eines Interferons oder von IL-12 zu erhöhen. Es konnte gezeigt werden, daß nach der Impfung mit MVA-BN die plasmacytoiden dendritischen Zellen wesentlich mehr IL-12 produzieren und eine erhöhte IFN-α-Produktion sowie eine Hochregulierung von MHC-II und CD8a aufweisen. Die Erhöhung von IL-12 nach Verabreichung der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Viren beträgt vorzugsweise das 2fache, stärker bevorzugt das 100fache, 500fache, 1000fache, 2500fache oder 5000fache. Der Anstieg der Konzentration von Flt3-L zwei Tage nach der Impfung von Neugeborenen mit MVA, am stärksten bevorzugt mit MVA-BN oder seinen Derivaten, ist vorzugsweise 1,5fach, stärker bevorzugt 2,0fach im Vergleich mit vom Alter her passenden Kontrollen.
  • Der Ausdruck „Aktivierung dendritischer Zellen oder ihrer Vorläufer" bezieht sich auf die Reifung von DC zu Antigen präsentierenden Zellen über schlecht definierte Zellstadien, die durch Hormone und Reize gesteuert werden. Die Zwischenstufen von DC werden Vorläufer genannt. Diese unreifen DC erreichen die Peripherie. Unterschiedliche (antigene) Reize aktivieren DC. Aktivierungsmarker, die in aktivierten dendritischen Zellen heraufreguliert sind, sind unter anderem Flt3-L, IL-12, IFN-alpha, MHC-II und CD8a (siehe unten).
  • Es wurde festgestellt, daß Hormone, wie z.B. GM-CSF, zu mehr unreifen DC in der Peripherie führen. Da GM-CSF zu mehr DC-Vorläufer in Knochenmark, Blut und peripheren Organen führt (und die Zellen dorthin wandern müssen), wurde dieses Phänomen „Mobilisierung dendritischer Zellen oder ihrer Vorläufer" genannt. Diese Definition wird auch in der vorliegenden Beschreibung verwendet.
  • Dementsprechend ist die Impfung von Tieren, einschließlich des Menschen, vor allem dann sinnvoll, falls die Konzentration von Faktoren, die dendritische Zellen (DC) oder deren Vorläuferzellen aktivieren, und/oder die Anzahl dendritischer Zellen oder ihrer Vorläuferzellen und/oder die Produktion und/oder den Zellgehalt eines Interferons oder IL-12 erhöht werden sollen.
  • Zu Faktoren, die dendritische Zellen aktivieren, gehören unter anderem Flt3-L (Lyman et al., Cell 1993, 75: 1157-1167) und GM-CSF. Typische Interferone gemäß der vorliegenden Erfindung sind IFN-alpha und IFN-beta. Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Viren induzieren Flt3-L, wobei man annimmt, daß einige der beobachteten vorteilhaften Effekte auf diese Induktion zurückzuführen sind.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung wird ein neugeborenes Tier oder ein neugeborener Mensch als ein Tier bzw. Mensch definiert, der noch kein reifes Immunsystem aufweist. In der gesamten vorliegenden Beschreibung werden die Begriffe „neugeborenes Tier" und „neonatales Tier" synonym verwendet. Ein reifes Immunsystem wird durch die Fähigkeit zur vollständigen Aktivierung des angeborenen Immunsystems sowie durch die Tatsache, daß alle bekannten T- und B-Zellfunktionen und -produkte, insbesondere Immunglobulin-Isotypen, wie z.B. IgA und IgE, bereits vorliegen, gekennzeichnet. Somit ist ein unreifes Immunsystem durch eine geringe Zahl von T-Zellen, B-Zellen und dendritischen Zellen relativ zu Erwachsenen, durch eine IFN-Produktion, die im Vergleich mit Erwachsenen niedrig ist, sowie durch die Tatsache, daß die sekundären lymphoiden Organe noch nicht vollständig ausgereift sind, gekennzeichnet. Insbesondere kann ein „Neonatales" oder „Neugeborenes" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung als ein sehr junges Tier definiert werden, dessen Anzahl an CD4+-Zellen der Milz vorzugsweise um wenigstens das 2fache, stärker bevorzugt um wenigstens das 20fache, stärker bevorzugt wenigstens das 200fache, stärker bevorzugt wenigstens das 2000fache, am stärksten bevorzugt wenigstens das 20 000fache niedriger liegt als die durchschnittliche Zahl an CD4+-Zellen in der Milz in Erwachsenen.
  • In Mäusen ist das Immunsystem im Alter von 4 Wochen reif. Beim Menschen liegt die Reife wahrscheinlich nach 6 Monaten bis 1 Jahr vor. Bei Katzen und Hunden ist das Immunsystem üblicherweise im Alter von 6 Monaten, bei Kälbern, Schafen und Schweinen im Alter von 4-12 Wochen ausgereift. Die Impfung mit MVA erfolgt vorzugsweise während der Zeit, bevor das Immunsystem ausgereift ist. Da die Reife sich jedoch fast exponentiell nach der Geburt entwickelt, ist es am stärksten bevorzugt, mit MVA so früh wie möglich nach der Geburt zu impfen. Da in allen relevanten Haustieren und beim Menschen das Immunsystem nicht früher als 4 Wochen nach der Geburt ausgereift ist, ist allgemein bevorzugt, daß die Impfung mit MVA vorzugsweise innerhalb von 4 Wochen nach der Geburt, stärker bevorzugt innerhalb von 2 Wochen nach der Geburt, noch stärker bevorzugt innerhalb 1 Woche nach der Geburt, am stärksten bevorzugt innerhalb von 3 Tagen nach der Geburt erfolgt. Diese allgemeinen Bedingungen gelten für alle wichtigen Haustiere, insbesondere für alle wichtigen Säugerhaustiere, einschließlich den Menschen. Der Fachmann ist sich der Tatsache bewußt, daß selbst ältere Tiere als Neugeborene/Neonatale im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung angesehen werden können und daß die Impfung somit auch bei älteren Tieren erfolgreich durchgeführt werden kann, wenn das Immunsystem 4 Wochen nach der Geburt noch nicht ausgereift ist. Somit kann beim Menschen die Impfung innerhalb von 6 Monaten nach der Geburt, stärker bevorzugt innerhalb von 3 Monaten nach der Geburt, stärker bevorzugt innerhalb von 2 Monaten nach der Geburt, stärker bevorzugt innerhalb von 4 Wochen nach der Geburt, stärker bevorzugt innerhalb von 2 Wochen nach der Geburt, noch stärker bevorzugt innerhalb von 1 Woche nach der Geburt, am stärksten bevorzugt innerhalb von 3 Tagen nach der Geburt, durchgeführt werden.
  • Beispielsweise können pränatale Tiere, einschließlich Menschen, geimpft werden, da die besten Wirkungen von MVA als allgemeiner Impfstoff beobachtet werden, wenn das Virus einem unreifen Immunsystem verabreicht wird. Eine pränatale Impfung kann bei wirtschaftlich wichtigen Tieren, wie z.B. Rindern oder Schweinen, wünschenswert sein. Falls die Plazenta das Virus durchläßt, kann das pränatale Individuum einfach durch Impfen des Muttertiers geimpft werden. Somit ist die Impfung des Muttertiers zur Impfung des pränatalen Individuums besonders vielversprechend bei einem Tier mit einer Plazenta endotheliochorialis, wie z.B. Hunden, Katzen, Ratten und Mäusen, oder mit einer Plazenta haemochorialis, wie z.B. Primaten, einschließlich des Menschen. Bei Tieren mit einer Plazenta chorionepithelialis, wie z.B. Rindern und Schafen, oder mit einer Plazenta syndesmochorialis, wie z.B. Schweinen und Pferden, läßt sich die Impfung von pränatalen Individuen mittels in-utero-Verabreichung durchführen. Natürlich läßt sich diese Art der Verabreichung auch bei einem Tier mit einer Plazenta endotheliochorialis bzw. haemochorialis durchführen.
  • Da MVA zu einer beschleunigten Reifung des Immunsystems führt und MVA sich somit als allgemeiner Impfstoff eignet, sind die geimpften Tiere gegen verschiedene Krankheiten geschützt. Insbesondere läßt sich MVA zur Impfung von Katzen für das allgemeine Wohlbefinden sowie gegen Katzenherpes oder infektiöse Katzen-Peritonitis verwenden. Bei Hunden kann MVA für das allgemeine Wohlbefinden sowie gegen (virale) Krankheiten im Zusammenhang mit den Atemwegen verwendet werden. Bei Schweinen kann MVA für das allgemeine Wohlbefinden sowie gegen Infektionen mit Haemophilus oder Mykoplasma verwendet werden, vor allem in der Schweinemast.
  • Wie beispielhaft dargelegt, kann MVA in Neugeborenen oder pränatalen Tieren zum Schutz des Tiers gegen ein Fremdantigen und/oder ein Tumorantigen verwendet werden, wobei sich das Tumorantigen von den mit dem für die Impfung verwendeten Virus assoziierten Antigenen unterscheidet. Allerdings ist dies nicht auf neugeborene und pränatale Tiere beschränkt, sondern läßt sich für Tiere aller Altersgruppen durchführen, da ein vorteilhafter Effekt auch bei erwachsenen Tieren beobachtet werden kann. So eignen sich MVA, insbesondere MVA-BN und seine Derivate zum Schutz eines Tiers, einschließlich des Menschen, gegen ein aus Tumorantigen und Fremdantigen ausgewähltes Antigen, wobei sich das Tumorantigenen und/oder das Fremdantigen von den mit dem Virus assoziierten Antigenen unterscheiden. Wie oben dargelegt, ist MVA in der Lage, Zellen des Tiers zu infizieren, kann jedoch nicht in den Zellen unter Erhalt von infektiösen Virusnachkommen repliziert werden. Alle Angaben, Definitionen, einschließlich der Definition der Dauer des Schutzeffekts, und Beispiele, die für Neugeborene angegeben sind, gelten ebenso für Erwachsene.
  • Im Gegensatz zu Neugeborenen ist das Immunsystem von erwachsenen Tieren bereits ausgereift. Trotzdem könnte es vorkommen, daß das Immunsystem aufgrund bestimmter Krankheiten oder einfach aufgrund des Alters des Tiers geschwächt wird. Vor allem bei immungeschwächten Menschen und bei älteren Individuen kann die Verabreichung von MVA an das Tier einen vorteilhaften Effekt haben, unter anderem indem die Konzentration von Faktoren, die dendritische Zellen (DC) oder deren Vorläuferzellen aktivieren und/oder mobilisieren, und/oder die Anzahl dendritischer Zellen oder ihrer Vorläuferzellen und/oder die Produktion und/oder der Zellgehalt eines Interferons oder IL-12 erhöht wird. Somit kann selbst bei erwachsenen Tieren die Verabreichung von MVA zu einer erhöhten Kompetenz des Immunsystems beim Umgang mit Fremdantigenen und/oder Tumorantigenen führen. Mit anderen Worten: MVA eignet sich für die Aktivierung des Immunsystems allgemein, obwohl dies nicht Teil der beanspruchten Erfindung ist.
  • Die Erfindung betrifft ferner MVA zur Herstellung eines einem neugeborenen Tier, einschließlich des Menschen, zu verabreichenden Arzneimittels, wobei das Arzneimittel die Konzentration von Faktoren, die dendritische Zellen aktivieren, und/oder die Anzahl dendritischer Zellen und/oder die Produktion und/oder den Zellgehalt eines Interferons (IFN) oder IL-12 erhöht. Alle oben für die anderen Ausführungsformen angegebenen Definitionen gelten ebenso für die vorliegende Ausführungsform. Gemäß dieser Ausführungsform zielt die Erfindung nicht in erster Linie auf die Induktion eines Schutzes gegen Fremdantigene und/oder Tumorantigene ab, sondern die vorliegende Ausführungsform richtet sich auf die Behandlung von Leiden und Krankheiten, die durch eine niedrige Konzentration von Faktoren, die dendritische Zellen aktivieren, und/oder durch eine unzureichende oder zu niedrige Anzahl dendritischer Zellen und/oder durch eine geringe Produktion und/oder einen geringen Zellgehalt eines Interferons (IFN) oder von IL-12 gekennzeichnet sind. So könnte gemäß der vorliegenden Ausführungsform die Behandlung mit MVA gegen Allergien oder Autoimmunkrankheiten schützen. Dabei ist diese Behandlung wiederum besonders vielversprechend, wenn MVA neugeborenen Tieren verabreicht wird.
  • Beispielsweise eignet sich MVA, insbesondere MVA-BN und seine Derivate, besonders zur Induktion von Immunantworten in immungeschwächten Tieren, z.B. mit SIV infizierten Affen (CD4 < 400/μl Blut), oder in immungeschwächten Menschen. Der Begriff „immungeschwächt" beschreibt dabei den Status des Immunsystems eines Individuums, das nur unvollständige Immunantworten zeigt oder eine reduzierte Effizienz bei der Abwehr gegen infektiöse Agentien aufweist.
  • Beispielsweise läßt sich MVA in einem Verfahren zum Schutz eines Tiers, einschließlich des Menschen, gegen ein aus Tumorantigenen und Fremdantigen ausgewähltes Antigen durch Verabreichung eines Virus gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere des modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) verwenden, wobei sich das Tumorantigen und/oder das Fremdantigen von den mit dem Virus assoziierten Antigenen unterscheidet.
  • Zusätzlich kann beispielsweise MVA in einem Verfahren zur Behandlung eines Tiers, einschließlich des Menschen verwendet werden, um die Konzentration von Faktoren, die dendritische Zellen aktivieren, und/oder die Anzahl dendritischer Zellen und/oder die Produktion und/oder den Zellgehalt eines Interferons (IFN) oder von IL-12 zu erhöhen, wobei das Verfahren die Verabreichung eines modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) umfaßt.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Verwendung eines modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) zur Herstellung eines Arzneimittels für die Impfung oder Behandlung eines neonatalen Tiers, einschließlich des Menschen, wobei das MVA in der Lage ist, die Zellen des neonatalen Tiers, einschließlich des Menschen, zu infizieren, jedoch nicht in dem neonatalen Tier, einschließlich des Menschen, unter Erhalt von infektiösen Virusnachkommen repliziert werden kann, wobei die Behandlung die Reifung des Immunsystems induziert oder verbessert.
  • Verwendung wie oben, wobei es sich bei dem MVA-Stamm um MVA-BN, hinterlegt mit der Hinterlegungsnummer V00083008 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), und Derivate davon handelt.
  • Verwendung wie oben, wobei MVA durch orale, nasale, intramuskuläre, intravenöse, intraperitoneale, intradermale und/oder subkutane Applikation verabreicht wird.
  • Verwendung wie oben, wobei MVA in einer therapeutisch wirksamen Menge in einer ersten Inokulation („priming inoculation") und in einer zweiten Inokulation („boosting inoculation") verabreicht wird.
  • Verwendung wie oben, wobei MVA dem Tier, einschließlich des Menschen, in einer Menge von mindestens 101 TCID50 („Tissue Culture Infectious Dose") verabreicht wird.
  • Verwendung wie oben, wobei das MVA-Genom wenigstens eine heterologe Nukleinsäuresequenz umfaßt.
  • Verwendung wie oben, wobei die heterologe Nukleinsäuresequenz aus einer für wenigstens ein Antigen, antigenes Epitop und/oder eine therapeutische Verbindung codierenden Sequenz ausgewählt ist.
  • Verwendung wie oben, wobei die Impfung oder Behandlung zur Induktion oder Verbesserung der Reifung und/oder Aktivierung des Immunsystems verwendet wird.
  • Verwendung wie oben, wobei die Behandlung verwendet wird, um (i) die Konzentration von Faktoren, die dendritische Zellen oder deren Vorläuferzellen aktivieren und/oder mobilisieren, zu erhöhen, (ii) die Anzahl dendritischer Zellen oder ihrer Vorläuferzellen zu erhöhen oder (iii) die Produktion und/oder den Zellgehalt eines Interferons (IFN) oder von IL-12 zu erhöhen.
  • Verwendung wie oben, wobei es sich bei dem Faktor, der dendritische Zellen aktiviert, um Flt3-L und/oder GM-CSF handelt.
  • Verwendung wie oben, wobei es sich beim dem Interferon um IFN-α und/oder IFN-β handelt.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1A: Neugeborene Mäuse wurden einmal innerhalb von 24-48 h nach der Geburt mit 106 p.f.u. MVA oder DISC HSV-1 injiziert oder mit physiologischer Kochsalzlösung (NaCl) als Kontrollen behandelt. Bei einem Alter von 7 Tagen wurde CD11c, ein Pan-DC-Marker, verwendet, um diese Zellen im peripheren Blut mittels Durchflußcytometrie zu bestimmen. Dargestellt sind jeweils Mittelwert und Standardabweichung von 3 bis 5 Experimenten.
  • 1B: Experiment wie in 1A. Allerdings wurden CD11c-Zellen in der Milz mittels Durchflußcytometrie bestimmt.
  • 1C: Experiment wie in 1A. Allerdings wurden CD11c-Zellen in Peritonealflüssigkeit mittels Durchflußcytometrie bestimmt.
  • 2: Mäuse wurden mit MVA-BN, wie in der linken Spalte angegeben, geimpft. Nach 2 Wochen wurde der Prozentanteil einfach positiver (CD11c+) und doppelt positiver (C11c+/CD8+) Zellen in der Milz und im Blut mittels Durchflußcytometrie bestimmt.
  • 3: Neugeborene Mäuse wurden mit MVA oder NaCl als Kontrolle an Lebenstag 1 und 5 injiziert. An Tag 8 wurde Maus Flt3-L im Serum dieser Mäuse mittels ELISA bestimmt, wobei die Werte in pg/ml angegeben sind.
  • 4: Neugeborene Mäuse wurden einmal innerhalb von 24-48 Stunden nach der Geburt mit 106 p.f.u. MVA injiziert oder mit NaCl als Kontrollen behandelt. Im Alter von 7 Tagen wurden alle Mäuse 100 × LD50 HSV-1-Stamm F ausgesetzt. Die Anzahl überlebender Tiere wurde 21 Tage verfolgt.
  • 5: Die Mäuse wurden wie in 4 behandelt. Die Daten repräsentieren 9 verschiedene Challenge-Experimente mit 100 LD50 HSV-1. Keines der Kontrolltiere überlebte das Challenge.
  • 6: Überleben von am ersten Lebenstag mit MVA-BN geimpften erwachsenen Mäusen nach einem lethalen Vaccinia-Challenge. Drei Würfe von jeweils 6 1 Tag alten Babys (18 Mäuse) wurden mit MVA-BN (2,5 × 10 TCID50) geimpft und im Alter von 4 Wochen (erwachsene Mäuse) einem Challenge mit einer Lethaldosis von Vaccinia ausgesetzt: die MVA-BN-Impfung induzierte eindeutig eine Schutzimmunität in neonatalen Mäusen, die bis zum Erwachsenenalter andauerte.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • (i) MVA-BN und DISC-HSV induziert DC des CD11c+- und CD8+-Phänotyps in neugeborenen Tieren.
  • Erste Versuchsreihe: neugeborene Mäuse sind natürlicherweise immungeschwächt, da das IFN-System noch nicht ausgereift ist. Die Anzahl und der Aktivierungszustand von DC, dem besten, gegenwärtig bekannten Produzenten von IFN, wurde bislang nicht analysiert. DC lassen sich in vitro ebenso wie in vivo mit verschiedenen Reizen induzieren. In diesen Untersuchungen wurde getestet, ob eine kontrollierte MVA-BN-Replikation DC induzieren könnte, wobei deren Phänotyp analysiert wurde. Gruppen von Mäusen wurden mit 106 Plaque bildenden Einheiten (p.f.u. [plaque forming units]) MVA-BN oder mit lediglich Kochsalzlösung innerhalb von nur 1-2 Tagen nach der Geburt und in einigen Fällen 5 Tage nach der Geburt injiziert. Blut und Milzzellen aus individuellen Mäusen beider Gruppen wurden mittels FACS analysiert und die Daten verglichen.
  • Daten aus 7 bis 8 individuellen Mäusen zeigten, daß durch die Behandlung mit MVA-BN CD11c+-Zellen um das 2-3fache anstiegen, was von einer erhöhten Expression von MHCII und einem erhöhten Vorhandensein von T-Zellen des CD4- oder CD8-Typs begleitet wurde. Interessanterweise nahm CD19/54, ein Marker für reife B-Zellen, ab, was darauf hindeutet, daß diese Zellen in andere Organe als die Milz auswanderten oder daß Vorläufer von B-Zellen früh zu anderen Linien abkommandiert wurden, besonders DC des plasmocytoiden Phänotyps, der frühe B-Zellmarker trägt (B220).
  • Daten aus drei unterschiedlichen Experimenten wiesen auf Reproduzierbarkeit und signifikante Unterschiede hin. In Experimenten mit DISC-HSV-1, einem anderen replikationskontrollierten viralen Impfstoff, wurden ähnliche Mengen an CD11c+-Zellen nach neonatalem Priming induziert.
  • Die Ergebnisse sind in 1A-C zusammengefaßt.
  • Um Subpopulationen von DC in Blut und Milz weiter zu untersuchen und den Langzeiteffekt der Behandlung mit MVA-BN zu analysieren, wurden Zellen im Blut und in der Milz bei einem Lebensalter von 2 Wochen analysiert. Zu diesem Zeitpunkt wiesen behandelte Tiere etwa die doppelte Anzahl an CD11c+-Zellen in der Milz als im Alter von einer Woche auf, doch führte eine einzelne Behandlung mit dem Virus bei der Geburt 2 Wochen später zu einer dreifach erhöhten Anzahl dieser Zellen in der Milz (2). Ähnliche Effekte wurden im Blut beobachtet, mit Ausnahme, daß CD11c+/CD8a+ etwa 4mal höher lagen. Eine einzelne Behandlung mit MVA-BN 7 Tage nach der Geburt führte zu einem Anstieg von CD11c+/CD8a+ von 13 auf das 40fache mit einem weniger dramatischen Effekt auf die CD11c+-Zellen. Wie erwartet hatten zwei Impfungen bei der Geburt sowie an Tag 7 einen signifikanten Effekt auf CD11c+-Zellen. Die verschiedenen Effekte sind in 2 dargestellt.
  • Zweite Versuchsreihe: Mäuse im Alter von einer Woche, die bei der Geburt mit 2,5 × 107 TCID50 MVA-BN geimpft worden waren, zeigten eine andere Zusammensetzung immunologisch relevanter Zellpopulationen in der Milz und im Blut als Kontrollmäuse (Tabelle 1). Im Blut gab es einen Anstieg der CD8-positiven Lymphozytenpopulation ebenso wie einen Anstieg der Anzahl an NK-Zellen. Die Anzahl CD11c-positiver Zellen war etwa 3mal höher als in Kontrollen, wobei der Prozentanteil von B-Zellen (B220- und CD19-doppelt positive Zellen) signifikant reduziert war. In der Milz gab es keinen Unterschied zwischen immunisierten Tieren und Kontrollen hinsichtlich der Gesamtzahl von Zellen. Im Gegensatz zum Blut wies die Milz geimpfter Tiere mehr CD4-positive T-Lymphozyten als die Kontrollen auf, wobei die Anzahl an NK-Zellen nicht erhöht war. Ähnlich wie beim Blut war die relative Anzahl CD8-positiver Lymphozyten erhöht und die Anzahl an B-Zellen reduziert. Der Prozentanteil CD11c-positiver Zellen lag etwa 3mal höher als bei den Kontrollen. Von uns wurde ein Unterschied des Prozentanteils dendritischer Zellen erstmals am Tag 5 nach der Impfung mit MVA-BN erkannt, als die Anzahl CD11c-positiver Zellen in der Milz von 4 unbehandelten Kontrollen 3,6% betrug, verglichen mit 4,8% in 4 MVA-BN-geimpften Mäusen. Die gleiche Menge an UV-inaktiviertem MVA-BN ergab keine signifikante Änderung der Zellpopulationen nach Impfung neonataler Mäuse im Vergleich mit Kontrollen (Daten nicht gezeigt). Die erste Impfdosis wurde willkürlich gewählt. Nach der Titration des Inokulums wurde eine Standarddosis von 2,5 × 106 TCID50 zur Impfung verwendet (10mal weniger als im ersten Experiment). Bei dieser Dosis wurden maximale Anzahlen von DC induziert (Tabelle 2). Tabelle 1. In Blut und Milzzellen in neugeborenen Mäusen eine Woche nach Immunisierung mit 2,5 × 107 TCID50 MVA-BN induzierte Änderungen
    Parameter % Blut Milz
    NaCl MVA-BN P* NaCl MVA-BN P*
    Gesamtzellen × 106 17,9±1,9 24,1±2, 0,10
    6 5
    %CD11c 5,4±1,3 18,6±1, 0,00 2,8±0,1 7,9±0,8 0,00
    5 1 1
    %CD11c/CD8α 0,5±0,1 2,7±0,3 0,00 1,1±0,1 4,6±0,7 0,00
    1 2
    %CD4/CD3 16,9±1,1 16,1±1, 0,99 4,8±0,3 8,1±1,5 0,00
    1 5 9 4
    %CD8α/CD3 6,0±0,9 10,3±0, 0,00 4,7±0,3 8,4+1,1 0,00
    9 2 2
    %NK1,1/DX5 16,4±1,2 24,4±3, 0,03 2,5±0,3 2,4±0,2 0,86
    2 3 2 2
    %CD19/B220 22,3±0,5 8,4±0,8 0,00 16,2±1, 8,6±0,9 0,00
    5 1 3 4
    * Mann-Whitney U-Test
    Tabelle 2. Induktion CD11c-positiver Zellen in der Milz von 1 Tag alten Wt-Mäusen und Mäusen mit Unterbrechungen von Zielgenen innerhalb von 7 Tagen nach der MVA-Behandlung.
    Mausstamm MVA-Dosis (TCID50) Kontrollen %CD11c MVA-BN %CD11c Verhältnis
    wta 2,5 × 107 2,8 7,9 2,8
    wt 2,5 × 106 2,1 11,9 5,6
    wt 2,5 × 105 2,5 6,6 2,6
    RAGb 2,5 × 10 4,2 5,4 1,3
    AG129c 2,5 × 103 2,6 2,7 1,0
    a Wt = entweder C57BL/6- oder 129 Sv/Ev-Mäuse.
    b RAG-Mäusedeletion in rekombinationsaktivierendem Gen (d.h. keine funktionsfähigen T- und B-Zellen).
    c AG129 mit Unterbrechungen der Zielgene für IFN-Rezeptor Typ I (IFN-α und -β) und Typ II (IFN-γ)
  • (ii) MVA-BN induziert vorzugsweise plasmazytoide dendritische Zellen (pDC).
  • Nach anderen Autoren wurden CD11c-positive Zellen, die auch CD45RA oder CD45R exprimierten, als pDC betrachtet (Asselin-Paturel et al. 2001, Nat Immunol, 12: 1144). Dabei wurde gefragt, ob MVA-BN eine Erhöhung von pDC induzierte. Ein weiteres Experiment wurde durchgeführt, bei dem auch CD45RA oder CD45R auf CD11c-Positiven analysiert wurden. Der Prozentanteil an doppelt positiven Zellen (CD11c und CD45R) lag deutlich höher in mit MVA-BN behandelten Mäusen (5,6±0,7%) als in beiden Kontrollgruppen (unbehandelt 3,0±0,3%, p = 0,01; UV-inaktivierte MVA-BN 3,0±0,2%, p = 0,006. Mann-Whitney U-Test).
  • (iii) Mit MVA-BN behandelte neonatale Mäuse weisen erhöhte Konzentrationen an Serum-Flt3-L auf
  • Flt3-L ist ein hämatopeotischer Faktor, der zu erhöhten Niveaus von DC in erwachsenen Tieren führt. Beim Menschen und möglicherweise bei Mäusen stellen aktivierte T-Zellen die reichste Quelle für diesen Faktor dar. Um zu bestimmen, ob die erhöhte Anzahl von DC das Ergebnis von induziertem Flt3-L sein könnte, wurde Serum von MVA-BN-behandelten Mäusen hinsichtlich des Vorhandenseins dieses Faktors mit scheinbehandelten Tieren verglichen. Dabei wiesen an Tag 2 und 5 behandelte Tiere das doppelte Niveau von Flt3-L im Serum im Vergleich mit dem Serum scheinbehandelter Tiere auf. Somit handelt es sich bei Flt3-L um einen der Faktoren, die für die erhöhte Anzahl von DC verantwortlich gemacht werden könnte (3).
  • Der zeitliche Verlauf der Flt3-L-Induktion in neugeborenen Mäusen wurde nach Verabreichung von MVA-BN bewertet. Bei Neugeborenen induzierte die MVA-BN-Impfung einen Anstieg der Flt3-L-Konzentration innerhalb von 24 Stunden. Die Induktion erreichte ein Maximum nach 48 Stunden und war noch an Tag 7 vorhanden, dem Zeitpunkt, zu dem Milzzellen üblicherweise analysiert und die Widerstandskraft gegen HSV-1 getestet wurde (siehe unten). In den geimpften Mäusen war die Flt3-L-Konzentration im Serum 24 Stunden und 48 Stunden nach der Impfung um das zweifache erhöht, verglichen mit vom Alter her passenden Kontrolltieren.
  • Beispiel 2
  • (i) Mit MVA-BN-behandelte neonatale Mäuse überleben ein Challenge mit 100 bis 500 LD50 HSV-1
  • Gruppen von Mäusen wurden jeweils mit der Standarddosis von MVA-BN einen oder 2 Tage nach der Geburt behandelt und im Alter von 7-8 Tagen einem Challenge mit 100 bis 500 LD50 Herpes-Simplex-Virus 1 (HSV-1) unterzogen (4). Mit MVA-BN behandelte Mäuse überlebten das Challenge mit HSV-1, wohingegen alle Kontrollmäuse innerhalb von 5-6 Tagen nach Inokulation des Challenge-Virus starben.
  • Um diese Beobachtungen weiter zu unterstützen, wurden 9 Challenge-Experimente mit 40 MVA-BN-behandelten und 45 Kontrollmäusen durchgeführt. Mehr als 80% der mit Virus behandelten Mäuse überlebten das Challenge, während alle Kontrollmäuse starben (5).
  • In einer separaten Versuchsreihe wurden die Mäuse bei der Geburt mit MVA-BN behandelt (2,5 × 106 TCID50/Maus). An Tag 8 wurde ein Challenge mit entweder 103 (1 LD50) oder 105 (100 LD50) PFU HSV-1 durchgeführt. Nach der MVA-BN-Impfung überlebten 65% der Mäuse eine Virusdosis, die 100% der Kontrollmäuse (100 LD50) tötete, und 90% überlebten eine Dosis, die 45,5% der Kontrollen (1 LD50) tötete. In weiteren Experimenten wurde eine Gruppe von 7 mit UV-inaktiviertem MVA-BN geimpften Mäusen mit HSV-1 infiziert. Fünf von diesen starben innerhalb von 7 Tagen. Die verbliebenen 2 Tiere hörten auf zu wachsen und starben an Tag 22 bzw. 29. Somit erreichten mit MVA-BN behandelte Mäuse einen Zustand erhöhter Resistenz gegen HSV-1, der mit lebendem MVA-BN, jedoch nicht mit inaktiviertem MVA-BN assoziiert war.
  • In mit Mäusen die keine funktionsfähigen T-Zellen besitzen, durchgeführten Kontrollexperimenten wurde bestimmt, daß der Schutz gegen HSV-1 nach Impfung mit MVA-BN nicht auf kreuzreagierende, durch MVA-BN induzierte zytotoxische T-Lymphozyten zurückzuführen war.
  • Es wurde getestet, ob DC-Zellen für den Schutz von -Mäusen vor HSV-1 nach Impfung mit MVA-BN verantwortlich waren. Hierzu wurden naive 8 Tage alte Mäuse einem Challenge mit 5 × 104 PFU HSV-1 4 Std. nach Übertragung von Zellen von MVA-behandelten Mäusen unterzogen. In einem ersten Experiment wurden Milzzellen aus 8 Tage alten, an Tag 1 mit MVA-BN behandelten Mäusen in DC-reiche (geringe Dichte) und DC-arme (hohe Dichte) Fraktionen getrennt. Mäuse, die 5 × 106 Zellen aus der DC-reichen Fraktion erhielten, überlebten das Challenge zu 50%, wohingegen alle Mäuse, die 10mal weniger DC-reiche Suspension erhielten, bzw. unbehandelte Mäuse innerhalb von 5 Tagen starben. Ein zweiter Ansatz wurde durchgeführt, indem positiv isolierte CD11c-positive Zellen aus 8 Tage alten, an Lebenstag 1 mit MVA-BN behandelten Mäusen auf naive, vom Alter her passende Mäuse übertragen wurden. Eine Suspension von 2 × 106 Milzzellen mit mehr als 80% CD11c-positiven Zellen aus MVA-BN-behandelten Mäusen schützte die naiven Mäuse vor einer HSV-1-Infektion. Im Gegensatz dazu starben 4 unbehandelte Tiere aus dem gleichen Wurf ebenso wie 8 weitere unbehandelte Tiere nach dem Challenge. Weiterhin zeigten Mäuse, die die gleiche Menge an Milzzellen erhielten, bzw. Mäuse, die ein Milzäquivalent (50 × 106 Zellen) von der negativen Fraktion erhielten, keine erhöhte Resistenz gegenüber HSV-1. Somit sind CD11c-positive Zellen in der Lage, Mäuse vor HSV-1 zu schützen.
  • Im Stand der Technik sind kurzzeitige Schutzeffekte im Bereich von etwa 24 Stunden nach Verabreichung von MVA beschrieben (Vilsmeier, B., Berl. Mönch. Tierärztl. Wschr. 112 (1999), 329-333). Obwohl es sich bei den in der genannten Veröffentlichung verwendeten Viren nicht um Viren handelt, die nicht in dem verwendeten neonatalen oder pränatalen Tier unter Erhalt von infektiösen Virusnachkommen repliziert werden können, wurde getestet, ob die Wirkungsweise, wie sie bei Vilsmeier offenbart ist, Ähnlichkeit mit der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Wirkungsweise besitzt. Insbesondere wird bei Vilsmeier offenbart, daß MVA, insbesondere inaktiviertes MVA, eine Paramunität über einen Zeitraum von etwa 24 Stunden induziert. Um zu testen, ob der Paramunitätseffekt auch zu den Schutzeffekten, wie sie in der vorliegenden Anmeldung offenbart sind, beiträgt, wurden Mäuse 24 Stunden nach der Geburt entweder mit MVA-BN oder mit inaktiviertem MVA-BN geimpft. An Tag 7 wurden die Mäuse einem Challenge mit einer Lethaldosis HSV-1 (105 PFU HSF-1f) unterzogen. Nicht geimpfte Kontrollmäuse starben 6 Tage nach dem Challenge. Ebenso waren die mit inaktiviertem MVA-BN geimpften Mäuse gegen ein Challenge mit HSV-1 nicht geschützt. Die Anzahl an DC-Zellen in diesen Mäusen war nicht erhöht. Im Gegensatz dazu waren die mit nicht inaktiviertem MVA-BN geimpften Mäuse in signifikanter Weise gegen ein Challenge mit HSV-1 geschützt. 30 Tage nach dem Challenge waren noch mehr als 80% der Mäuse am Leben. Zwei Tage nach der Impfung wurden erhöhte Konzentrationen an Serum-Flt3-L im Serum gefunden. In der Milz wurde eine erhöhte Anzahl von DC gefunden. Die Flt3-L-Steigerung war mit der erhöhten Anzahl von DC assoziiert. Dies bestätigt, daß Paramunitätseffekte nicht für den beobachteten Schutz verantwortlich sind.
  • (ii) MVA-BN induziert eine spezifische Immunität in Neugeborenen, die bis zum Erwachsensein andauert
  • Ein Tag alte C57BI/6-Mäuse (Größe der Gruppe: 18) wurden mit MVA-BN (2,5 × 107 TCID50) geimpft (i.p.). Vier Wochen nach der Impfung wurden die Mäuse als erwachsen betrachtet und einer Lethaldosis (1 × 104 TCID50) Vaccinia Western Reserve (VV-WR) unterzogen. Mit Ausnahme eines Tiers überlebten alle anderen mit MVA-BN geimpften Tiere. Im Gegensatz dazu starben alle plazebogeimpften Tiere innerhalb von 7 Tagen und zeigten schwere klinische Symptome, wie z.B. gesträubtes Fell, Gewichtsverlust und reduzierte Aktivität. Hierbei handelt es sich eindeutig um eine klare Demonstration, daß eine MVA-BN-Impfung bei neugeborenen Tieren nicht nur sicher ist, sondern eine schützende Immunantwort gegen eine lethale Infektion mit Vaccinia (mit MVA-BN verwandtes Virus) induzieren kann.

Claims (12)

  1. Verwendung eines modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines neonatalen Tiers, einschließlich des Menschen, wobei es sich bei dem MVA um ein Virus handelt, das das neonatale Tier, einschließlich den Menschen, abortiv infiziert, und wobei die Behandlung die Reifung des Immunsystems induziert oder verbessert.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem MVA um den Stamm MVA-BN, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer V00083008 bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC) in Salisbury (Großbritannien), oder Derivate davon handelt, wobei die Derivate dahingehend gekennzeichnet sind, daß sie (i) zur reproduktiven Replikation in Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) sowie der Babyhamster-Nierenzellinie BHK, jedoch nicht in einer menschlichen Zellinie in der Lage sind und (ii) in einem Mausstamm, der keine reifen B- und T-Zellen produzieren kann und somit stark immungeschwächt und für ein replizierendes Virus hochanfällig ist, nicht replizieren können.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei es sich bei der menschlichen Zellinie um HaCat oder HeLa handelt.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Verbesserung der Reifung des Immunsystems mit einem Anstieg der Anzahl an dendritischen Zellen und deren Vorläuferzellen korreliert ist.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei es sich bei den Vorläuferzellen der dendritischen Zellen um Vorläufer plasmazytoider dendritischer Zellen handelt.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Verbesserung der Reifung des Immunsystems mit einem mindestens 1,5-fachen Anstieg der Flt3-L-Konzentration zwei Tage nach Verabreichung von MVA korreliert ist.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Arzneimittel durch orale, nasale, intramuskuläre, intravenöse, intraperitoneale, intradermale, Intrautero- und/oder subkutane Applikation verabreicht wird.
  8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Arzneimittel mit einer therapeutisch wirksamen Menge in einer ersten Inokulation ("priming inoculation") und in einer zweiten Inokulation ("boosting inoculation") verabreicht wird.
  9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Arzneimittel dem Tier, einschließlich des Menschen, in einer Menge von mindestens 101 TCID50 ("tissue culture infectious dose") MVA verabreicht wird.
  10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Virusgenom wenigstens eine heterologe Nukleinsäuresequenz umfaßt.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die heterologe Nukleinsäuresequenz aus einer für wenigstens ein Antigen, antigenes Epitop und/oder eine therapeutische Verbindung codierenden Sequenz ausgewählt ist.
  12. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die heterologe Nukleinsäuresequenz für ein aus Interferon, IL-12, Flt3-L und GM-CSF ausgewähltes Protein codiert.
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