CN100540051C - 用于接种新生儿的改良的安卡拉痘苗病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒用于制备药物的用途，所述药物用于接种或治疗新生的或产前的动物(包括人)，其中所述病毒能感染新生的或产前的动物(包括人)的细胞，但不能在新生的或产前的动物(包括人)的体内复制成感染性子代病毒。优选病毒为改良的安卡拉痘苗病毒。本发明具体涉及接种新生儿以抵抗与接种所用病毒属于相同病毒组的病毒的感染。另外，本发明涉及接种新生儿以抵抗选自外源抗原和肿瘤抗原的抗原，其中肿瘤抗原和/或外源抗原不同于与病毒相关的抗原。本发明还涉及如上文所限定的病毒提高能活化树突细胞或其前体细胞的因子水平和/或增加树突细胞或其前体细胞数目和/或提高干扰素(IFN)或IL-12的生成和/或细胞性含量的用途。

Description

用于接种新生儿的改良的安卡拉痘苗病毒
本发明涉及病毒用于制备药物的用途，所述药物用于接种或治疗新生的或产前的(neonatal or prenatal animal)动物(包括人)，其中所述病毒能感染新生的或产前的动物(包括人)的细胞，但不能在新生的或产前的动物(包括人)的体内复制成感染性子代病毒。优选病毒为改良的安卡拉痘苗病毒(Modified Vaccinia Virus Ankara)。
本发明具体涉及接种新生儿以抵抗与接种所用病毒属于相同病毒组的病毒的感染。另外，本发明涉及接种新生儿以抵抗选自外源抗原和肿瘤抗原的抗原，其中肿瘤抗原和/或外源抗原不同于与病毒相关的抗原。本发明还涉及如上文所限定的病毒提高使树突细胞或其前体细胞活化的因子的水平和/或增加树突细胞或其前体细胞数目和/或提高干扰素(IFN)或IL-12的生成和/或细胞性含量(cellular content)的用途。
发明背景
动物和人类的天然环境含有多种感染因子，如病毒、细菌或真菌。其中很多感染因子可导致被感染宿主患病。在正常情况下，被感染宿主在一段时间之后可以从感染因子诱发的疾病中恢复。这种恢复归功于动物或人类的免疫系统。
免疫系统是人或动物身体的一部分，它负责消灭感染因子。免疫应答分为两种，即特异性和非特异性(天然(innate))反应，但这两者密切合作。非特异性免疫应答是抗多种外源物质和感染因子的即发型防御。在抗病毒的天然免疫应答中，干扰素(IFN)-α和IFN-β是控制最初的病毒复制并活化自然杀伤(NK)细胞以立即杀死感染细胞所必需。细胞内的细菌或寄生虫病原体诱导IL-12，而IL-12上调NK细胞和/或一些T细胞亚群中的IFN-γ。被IFN-γ活化的NK细胞即可杀死细胞内病原体。另外，IFN-γ也能活化巨噬细胞并使它们能杀死被内化的病原体。
迄今为止IFN-α/β最丰富的来源是树突细胞(DC)，该细胞是一种能策略地分布于全身的特化细胞群体。其中，浆细胞样DC或CD11c+CD8+DC是最佳的IFN-α/β生产者。被细胞内非病毒病原体感染的CD8+DC是能分泌免疫防御早期步骤所至关重要的IL-12的关键细胞。
一旦生物体首次受到具体外源物质(抗原)的攻击，一段时间后可诱发抗所述物质的特异性免疫应答。特异性免疫应答的起始也需要DC的协作。这些细胞不断地从外周淋巴器官转移至次级淋巴器官、淋巴结或脾脏，在那里使原初(naive)T和B细胞再循环。DC所携带的运送至这些器官的抗原将原初T细胞和B细胞活化为效应T细胞和B细胞。为此，DC不仅携带抗原，而且其识别病原体的可塑性(plasticity)允许DC中不同的基因被活化，从而允许T细胞的被病原体调节的引发(priming)。
特异性免疫应答是高效率的，它负责保护从一种具体感染中恢复的个体抵抗所述具体感染。从而，再次被相同或极类似感染因子感染仅导致很轻微的症状或根本不表现症状，这是因为已存在针对该感染因子的“现成的特异性免疫力”。所述免疫力和免疫记忆各自持续较长时间，有时甚至持续终生。因此，免疫记忆的诱发可用于接种，即保护个体使其免受具体病原体的感染。
为了进行接种，免疫系统用疫苗攻击，所述疫苗自身应比欲诱发的免疫应答所抗的病原体的害处要小。疫苗含有或表达那些出现在接种所针对的感染因子表面或由该感染因子表达的表位。因此，生物体可以被包含表位的疫苗免疫，从而抵抗含有该表位的感染因子的感染。
典型的疫苗是减毒病毒或灭活病毒(如脊髓灰质炎疫苗或天花病毒疫苗)、重组蛋白(如重组乙肝病毒S-蛋白)、热灭活的细菌毒素(破伤风梭菌(Clostridium tetani)毒素)或细菌荚膜壁多糖(肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae))。
由于传染病会在新生儿和乳儿中造成很严重的疾病，因此，有必要尽可能早地接种幼小或新生的动物。需要接种的疾病的例子有痘病毒感染，包括天花病毒感染。然而，新生哺乳动物的免疫系统尚未成熟，这一事实使成功接种新生儿的尝试受阻。据认为新生婴儿和哺乳动物的免疫系统需要经过一段时间才能逐渐成熟。对于人类而言，在生命的第一年内逐渐成熟。这就是新生年龄组在周岁前对多种感染易感的原因(Gans等，J.Am.Med.Assoc.(1998)280，527-532)。更具体地，新生婴儿的B-细胞功能微弱，树突细胞的初级抗原呈递有缺陷，T细胞增殖也是有限的(Gans等，J.Am.Med.Assoc.(1998)280，527-532)。刚出生时，脾脏中的T细胞水平比成人低1000倍。为了获得至少是微弱的免疫，有人建议使用复制型病毒或含有佐剂的制剂来免疫。然而，使用复制病毒总是存在风险，由于T细胞是病毒清除所必需的，不成熟的免疫系统可能被病毒感染或活病毒疫苗所制服(Hassett等，J.Virol.(1997)71，7881-7888)。由于新生儿体内Th-1辅助T细胞的细胞因子生成较弱，婴儿的反应主要是Th-2型。结果，不能征集细胞毒T细胞，也就无法清除病毒。
哺乳动物的情况与人的情况很类似，即出生后的免疫系统尚未成熟。在新生小鼠中，脾脏CD4+T细胞的数目为80,000，CD8+T细胞的数目比成年小鼠脾脏中的低1000倍。另外，这些小鼠中的干扰素(IFN)生产系统不成熟。因此，新生小鼠不能通过IFN有效控制感染位点的细胞内病原体的扩增。此外，免疫细胞的低数目和有可能不足的活化期十分有限，以致于不能应付快速扩增的病原体或接种所用的复制病毒。
由于与活病毒疫苗有关的风险，不推荐用复制病毒接种新生动物，包括人。例如，建议不要用已被使用直至天花灭绝的痘苗病毒株，如病毒株Elstee、Copenhagen和NYCBH接种新生儿以抵抗天花病毒。根据美国最近的推荐，年龄小于12个月的幼儿不应接种迄今为止可以买到的天花病毒疫苗。
用含有佐剂的制剂接种新生儿的缺点是大量有害物质被导入体内。因此，只有在紧急情况下，例如在乙肝病毒感染时才会接种人类新生儿。
概括地说，应注意出生时免疫系统并不成熟。由于用有复制能力的病毒或含有佐剂的制剂接种具有显著的缺点，德国年龄小于2个月(Empfehlungder standigen Impfkommission STICO，2001)或美国6周龄以下(ACIP“Recommended Childhood Immunization Schedule，United Sates”)的婴儿不能被接种。
通过妊娠过程中或母乳喂养时从母亲转移至乳儿的母体抗体，可以部分补偿免疫系统发育的延迟。然而，因多种原因，不是所有的婴儿都能接受母乳喂养。因此，对人而言，有一段约6-8周的非常关键的时期，在这段时间内，具有不成熟因而功能不完全的免疫系统的婴儿不接受母体抗体，此时，接种通常是不成功的，或者十分危险。
在哺乳动物，特别是有重要经济价值的动物，如奶牛或陪伴动物，如猫和狗中，情况非常类似。为了降低花费，小牛从母牛处接受的牛奶的量经常急剧减少。取而代之的是，小牛接受奶粉、起子(starter)和特殊浓缩饲料的混合物，有时在出生后一周即开始食用所述混合物。结果，小牛未接受必需量和种类的母体抗体，以致于不成熟的免疫系统对感染非常敏感。另外，喂养小牛的农夫和将它们养成肉牛的农夫经常是不同的人。来自不同养牛场的4至6周龄小牛被集中到一起，运送至其它农场用于产肉。此时，母体抗体水平低，免疫系统尚未发育完全，但动物在胁迫条件下被暴露于新的感染因子。这增加了感染风险，而接种可以防止所述风险。在感染压力大的养猫或养狗场也可发现类似的情况。
发明目的
本发明的目的是提供分别接种新生人和动物的方法，所述接种针对的是外源抗原和分别与人和动物疾病相关的抗原。更具体地，本发明的目的是提供使新生动物和人的免疫系统加速成熟的方法。本发明的另一个目的是提供能接种新生动物，包括人以抵抗痘病毒感染，特别是抗天花病毒感染的方法。
发明详述
根据本发明，我们意外发现可以用病毒安全而有效地接种和/或治疗新生的或产前的动物(包括人)，其中所述病毒能感染新生的或产前的动物(包括人)的细胞，但不能在所述细胞中复制成感染性的子代病毒。特别地，我们已证实本发明使用的病毒，如MVA，特别是MVA-BN及其衍生物(见下文)可以施用给新生儿，而未显示出任何有害的效果。用病毒接种动物导致抗接种所用病毒的特异性免疫应答和/或抗外源抗原和下文将详细解释的肿瘤抗原的一般性接种。另外，本发明所用的病毒能诱发和/或增强免疫系统的成熟，这与树突细胞数目和诸如干扰素的因子的增加有关。即使给动物施用的制剂不含有佐剂，用本发明所用的病毒接种也是可能的。
简单地说，本发明所用的病毒能(i)在新生儿中引发有效的免疫应答，(ii)无需佐剂即可被施用和(iii)不具有制服生物体的风险。
根据本发明，第一次接种之后，产生的保护作用可维持至少5天，优选至少7、14或28天。
“能感染细胞”的病毒是表面具有能与宿主细胞相互作用的结构的病毒，所述相互作用的程度能使病毒或至少病毒基因组掺入宿主细胞。尽管本发明所用病毒能感染宿主细胞，但它们不能在感染细胞中复制成感染性子代病毒。在本发明的上下文中，术语“不能在所述细胞中复制成感染性子代病毒的病毒”指的是：其基因组至少部分被转录和翻译成病毒蛋白质或甚至被复制，然而，不能被包装成感染性病毒颗粒的病毒。因此，本发明所用病毒是能导致宿主中的失败感染的病毒。发生失败感染的原因有两个：根据第一个原因，细胞可能对感染敏感，但在所述细胞中复制病毒必需的病毒基因并不是全都能被表达和/或存在于病毒基因组中，因此，该细胞可能不允许病毒复制。针对人细胞的本发明此类病毒的例子是下文将要详细解释的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。根据第二个原因，失败感染也可以是用缺损病毒感染细胞而引起的，所述缺损病毒缺乏病毒基因的全补充物。针对人细胞的本发明此类病毒的例子是DISC-HSV1(缺损的单-周期单纯疱疹病毒)，即局限于单个感染周期的单纯疱疹病毒(Dilloo等，Blood 1997，89：119-127)。该病毒缺乏必需的糖蛋白H(gH)基因，但能在表达gH的补充细胞系中生长至高滴度。在允许疱疹病毒生长的非-补充细胞系中，局限于单个感染周期，导致释放非感染性病毒。术语“不能被复制”优选指在接种动物的细胞中根本不能复制的病毒。然而，显示出能被新生儿不成熟的免疫系统所控制的微弱残留复制活性的病毒也落入本申请的范围之内。
本发明的病毒可以是任何能感染动物细胞，但不能在所述细胞中复制成感染性子代病毒的病毒。应理解能感染第一种动物的细胞，但不能在所述细胞中复制成感染性子代病毒的病毒在第二种动物中可能有不同的表现。例如，对于人而言，MVA-BN及其衍生物(见下文)是能感染人细胞，但不能在人细胞中复制成感染性子代病毒的病毒。相同的病毒可在鸡中复制，即在鸡中，MVA-BN是能在鸡细胞中复制成感染性子代病毒的病毒。本领域技术人员已知针对特定动物种类选择何种病毒。测定病毒是否能在新生的或产前的动物中复制的试验公开于WO02/42480，该试验使用了AGR129小鼠品系。该小鼠模型获得的结果对人也有指示作用。因此，本申请所用术语“不能复制成感染性子代病毒”对应于WO02/42489中针对小鼠所用的术语“不能在体内复制”。下文将描述该试验的细节。本发明的病毒优选能在至少一种动物的至少一种细胞中复制。因此，可以在给欲接种和/或治疗的动物给药前扩增病毒。有关例子可参见MVA-BN，该病毒能在CEF细胞中扩增，但在新生的或产前的人中，是不能复制成感染性子代病毒的病毒。在此上下文中，应注意被化学或物理灭活的病毒不具有该优选实施方案的所有特性，因为灭活的病毒能感染新生的或产前的动物(包括人)的细胞，不能在新生的或产前的动物(包括人)中复制成感染性子代病毒，但这些病毒不能在至少一种动物的至少一种细胞中复制。
优选病毒是DNA病毒。对于哺乳动物细胞，特别是人细胞而言，更优选DNA病毒选自DISC-疱疹病毒和改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。
改良安卡拉痘苗病毒(MVA)病毒与痘病毒科正痘病毒属的成员痘苗病毒相关。在鸡胚成纤维细胞上对安卡拉痘苗病毒株(CVA)连续进行516次传代即可产生MVA(有关评述可参见Mayr，A等，Infection 3，6-14[1975])。长期传代的后果是：所得MVA病毒缺失了约31kb的基因组序列，因此，据描述其宿主细胞仅局限于鸟细胞(Meyer，H等，J.Gen.Virol.72，1031-1038[1991])。已证实所得MVA在多种动物模型中显然是无毒力的(Mayr，A.& Danner，K.[1978]Dev.Biol.Stand.41：225-34)。另外，已在临床试验中将MVA毒株用作抗人类天花病的接种用疫苗(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B 167，375-390[1987]，Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392[1974])。这些研究涉及到120,000多个人，包括高风险的患者，这些研究证实：与基于痘苗病毒的疫苗相比，MVA的毒力或感染性减低，但却保持了良好的免疫原性。
本发明优选的毒株是保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)、保藏号为V00120707的MVA 575，以及保藏于同一保藏机构、保藏号为V000083008的MVA-BN以及它们的衍生物。
对于人而言特别优选的MVA毒株，优选为最优选的毒株，如MVA-BN及其衍生物的特性概述如下：
(i)能在鸡胚成纤维细胞(CEF)和细胞系BHK中生殖复制，但不能在人细胞系HaCat中生殖复制，
(ii)不能在体内复制，
(iii)与已知毒株MVA 575(ECACC V00120707)相比，在致死攻击模型中能诱发较高的免疫原性和/或
(iv)与DNA-引发/痘苗病毒加强的方案相比，痘苗病毒引发/痘苗病毒加强的方案能诱发至少基本上相同的免疫力水平。
本发明的优选MVA毒株具有特性(ii)，即不能在欲接种或治疗的生物体和/或下文解释的相应检测系统中复制，优选还具有一个上述的其它特性，更优选还具有两个上述的其它特性。最优选的是具有上述所有特性的MVA毒株。对人类而言，具有上述所有特性的MVA毒株的例子是MVA-BN。MVA-BN的优选衍生物是除了特性(ii)外，还具有至少一个上述特性，更优选至少两个上述特性的衍生物。最优选的是具有上述所有特性的MVA-BN衍生物。
与测定MVA毒株是否具有一个或多个上述特性(i)至(iv)所用试验有关的详细信息可参见WO02/42480。该出版物还公开了如何获得具有所需特性的病毒。WO02/42480特别提供了MVA-BN和MVA-BN衍生物之特性的详细定义，并详细公开了测定MVA毒株是MVA-BN还是其衍生物所用的生物学试验。换句话说，WO02/42480中公开了MVA-BN的特性，有关评价MVA毒株是MVA-BN还是其衍生物所用生物学试验的描述，以及获得MVA-BN或其衍生物的方法。下文简短概述了本领域技术人员如何获得具有一个或多个上述特性的MVA毒株，以及他们如何检测给定的MVA毒株是否具有一个或多个所述特性，并由此判断所述毒株是否是本发明的最优选病毒。不应将下文的概述理解成对WO02/42480的限制。取而代之的是，将WO02/42480全文列入本文作为参考。
在本申请中，所用术语“不能在细胞系HaCAT中生殖复制”(Boukamp等，1988，J Cell Biol 106(3)：761-71)的定义与WO02/42480中的相同。因此，“不能在细胞系HaCat中生殖复制”的病毒是在人细胞系HaCat中扩增比率低于1的病毒。在人细胞系HaCat中，用作本发明载体的病毒的扩增率优选为0.8或更低。病毒的“扩增比率”是由感染细胞产生的病毒(输出Output)与在第一场所感染细胞的病毒最初用量(输入Input)的比率(“扩增比率”)。输出和输入之间的比率为“1”定义了下述扩增状况：其中由感染细胞产生的病毒量与感染细胞的病毒的最初用量相等。保藏号为ECACC V00083008的病毒的“衍生物”优选指复制特性与保藏的毒株实质上相同，但其基因组的一个或多个部分显示出差别的病毒。与保藏病毒具有相同“复制特性”的病毒是在CEF细胞和细胞系BHK、HeLa、HaCat和143B中以与保藏毒株类似的扩增比率复制，而在AGR120转基因小鼠模型中检测(见下文)，显示出类似的体内复制的病毒。
本申请中所用术语“不能在体内复制”的定义与WO02/42480中的相同。因此，所述术语指的是如WO02/42480中所解释的不能在人和小鼠模型中复制的病毒。WO02/42480中所用的小鼠不能产生成熟的B-和T-细胞(AGR 129小鼠)。特别地，MVA-BN及其衍生物不能在用腹膜内施用的107pfu病毒感染小鼠之后的至少45天，更优选至少60天，最优选90天的时间内杀死AGR129小鼠。优选显示出“不能在体内复制”之特性的病毒的进一步的特征在于：在用腹膜内施用的107pfu病毒感染小鼠45天，优选60天，最优选90天之后，从AGR129小鼠的器官或组织中未回收到病毒。
也可以使用任何其它小鼠品系来替代AGR129小鼠，所述小鼠品系不能产生成熟的B和T细胞，因此严重地无免疫应答，并且对复制病毒高度易感。
WO02/42480中解释了测定MVA毒株是否具有“比已知毒株MVA575更高的免疫原性”所用的致死攻击实验的细节。在所述致死攻击模型中，在用有复制能力的痘苗病毒株，如Western Reserve毒株L929TK+或IHD-J感染之后，未接种的小鼠死亡。在致死攻击模型描述的上下文中，用有复制能力的痘苗病毒感染被称为“攻击”。攻击后4天，小鼠通常被杀死，通过使用VERO细胞的标准噬斑试验测定卵巢中的病毒滴度。测定未接种小鼠和用MVA-BN及其衍生物接种的小鼠的病毒滴度。更具体地，MVA-BN及其衍生物的特征在于：在此试验中，用102TCID50/ml病毒接种之后，卵巢病毒滴度较未接种的小鼠相比降低了至少70％，优选降低至少80％，更优选降低至少90％。
在优选实施方案中，本发明的病毒，如MVA，特别是MVA-BN及其衍生物可用于引发/加强给药。可以先使用病毒，特别是本发明最优选使用的MVA毒株，如MVA-BN及其衍生物以及携有异源序列的相应重组病毒有效引发天然动物以及对痘病毒有现成的免疫力的动物中的免疫应答，然后再加强所述免疫应答。因此，与DNA-引发/痘苗病毒加强的方案相比，本发明最优选的病毒能在痘苗病毒引发/痘苗病毒加强的方案中诱发至少基本上相同的免疫力水平。
如果经WO02/42480中公开的“试验1”和“试验2”之一，优选为这两个试验测定，与DNA-引发/痘苗病毒加强的方案相比，痘苗病毒引发/痘苗病毒加强方案中的CTL反应至少基本上相同，即可认为与DNA-引发/痘苗病毒加强的方案相比，痘苗病毒，特别是MVA毒株能在痘苗病毒引发/痘苗病毒加强方案中引发至少基本上相同的免疫力。更优选与DNA-引发/痘苗病毒加强的方案相比，在至少一个试验中，痘苗病毒引发/痘苗病毒加强给药之后的CTL反应较高。最优选两个试验中的CTL反应都比较高。
本发明使用的病毒可以是非重组病毒，如MVA，即不含有异源核苷酸序列的病毒。非-重组痘苗病毒的例子是MVA-BN及其衍生物。或者，病毒可以是重组病毒，如含有其它对病毒而言为异源的核苷酸序列的重组MVA。
本申请所用术语“异源的”指的是一般与天然病毒不密切相关的任意核酸序列组合，也将所述病毒称为“重组病毒”。
异源核酸序列优选选自编码至少一种抗原、抗原表位、有益蛋白质和/或治疗性化合物的序列。
本申请所用术语“有益蛋白质”指的是任何有助于保护动物以使其免受选自肿瘤抗原和外源抗原的抗原攻击的蛋白质，其中肿瘤抗原和外源抗原不同于与病毒相关的抗原。或者，更特别地，“有益蛋白质”能有效增加可活化树突细胞的因子的水平，和/或能有效增加树突细胞的数目，和/或能有效增加干扰素(IFN)或IL-12的生成和/或细胞性含量。因此，所述有益蛋白质的例子是干扰素，如IFN-α或IFN-β，IL-12，Flt-3-L和/或GM-CSF。
抗原表位可以是任何能诱发免疫应答的表位。抗原表位的例子是得自下述生物体的表位：恶性疟虫(Plasmodium falciparum)，分枝杆菌(Mycobacteria)，流感病毒，选自黄病毒科、副粘病毒、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒的病毒或导致出血热的病毒，如汉坦病毒或线状病毒，即Ebola病毒或Marburg病毒。因此，例如，如果根据本发明使用表达异源表位的重组MVA接种新生儿，该治疗的结果不仅仅因为其使免疫系统的成熟加速而成为一般性的接种，还是抗异源MVA所表达的异源表位的特异性接种。
由重组病毒中的异源核酸编码的“治疗性化合物”可以是例如治疗性核酸，如反义核酸或具有所需生物活性的肽或蛋白质。
优选将异源核酸序列插入病毒基因组的非-必需区。或者，将异源核酸序列插入病毒基因组的天然缺失位点(有关MVA的情况公开于PCT/EP96/02926中)。本领域技术人员已知如何将异源序列插入病毒基因组，如痘病毒基因组。
本发明还提供了含有本发明的病毒，如MVA、例如用于在活的动物体，包括人体中诱发免疫应答的药物组合物和疫苗。
药物组合物一般包括一种或多种药物可接受的和/或准许的载体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。所述辅助物质可以是水、盐水、甘油、乙醇、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。适当载体一般是代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。
为了制备疫苗，应将病毒或其重组体转变为生理可接受的形式。转变方法是本领域技术人员已知的。对MVA和其它痘病毒而言，可基于制备抗天花接种所用痘病毒疫苗的经验(如Stickl，H等，[1974]Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392所述)来制备疫苗。例如，将纯化的病毒以5×108TCID50/ml的滴度配制于约10mM Tris，140mM NaCl pH7.4中，并储存于-80℃。为了制备疫苗注射剂，可在安瓿，优选为玻璃安瓿中，将例如101-108个病毒(如MVA)颗粒冻干于100ml含有2％蛋白胨和1％人白蛋白的磷酸缓冲盐水(PBS)内。或者，通过逐步冷冻干燥制剂中的病毒来生产疫苗注射剂。该制剂中可含有其它添加剂，如甘露糖醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或其它添加剂，如抗氧化剂或惰性气体，稳定剂或适于体内给药的重组蛋白质(如人血清白蛋白)。然后密封玻璃安瓿，将其储存于4℃至室温几个月。然而，只要不需要用，优选将安瓿储存于低于-20℃的温度下。
为了接种或治疗，可将冻干物溶解于0.1至0.5ml水溶液，优选为生理盐水或Tris缓冲液，再通过非肠道、肌内或本领域技术人员已知的任何其它给药途径，全身性或局部施用所述液体。本领域技术人员可以已知的方式最优化给药模式、剂量和给药次数。
可通过口服、鼻、肌内、静脉内、腹膜内、皮内、子宫内和/或皮下给药施用本发明的病毒，特别是MVA。在小动物中，优选通过非肠道或鼻进行免疫接种，而在较大的动物或人中，优选皮下、肌内或口服接种。
优选以101TCID50(组织培养感染因子量)至109TCID50的剂量施用MVA。
如上文所指出的，可在首次接种(“引发接种”)和二次接种(“加强接种”)中施用治疗有效量的本发明病毒，特别是MVA，如MVA-BN及其衍生物。
在本发明的上下文中，术语“动物”也覆盖人类。更一般地，动物是脊椎动物，优选为包括人的哺乳动物。动物的具体例子有如狗、猫的宠物，有重要经济价值的动物，如小牛、牛、绵羊、山羊、马、猪和其它动物，如小鼠、大鼠。对于这些动物和人来说，MVA和DISC-HSV是特别优选的病毒。如果使用的病毒能感染鸟的细胞，但不能在所述细胞中复制成感染性子代病毒，本发明还可用于有重要经济价值的鸟类，如火鸡、鸭、鹅和母鸡。
本说明书中所用术语“家养动物”优选指哺乳类家养动物，更优选指狗、猫、小牛、牛、绵羊、山羊、猪、马、鹿。
根据第一个可替代的实施方案，可将本发明的病毒、特别是MVA-BN及其衍生物用作特异性的疫苗，即用于引发能保护被接种的新生儿以使其免于疾病的免疫应答，所述疾病是由与接种所用病毒属于同一病毒组、科或属的强毒病毒所引起的。例如，可以使用上文所定义的MVA，特别是MVA-BN及其衍生物接种新生婴儿以抵抗痘病毒感染，特别是抗天花病毒感染。也可以使用MVA，特别是MVA-BN及其衍生物接种脊椎动物以抵抗在兽医学上很重要的痘病毒感染。根据第一个可替代的实施方案，用于接种的病毒可以是非-重组病毒，例如MVA-BN或其衍生物，或者是在病毒基因组中携有非天然地存在于所述基因组中的基因的重组病毒。优选重组病毒携有有助于刺激免疫应答的其它基因。此类基因的例子是细胞因子基因和干扰素基因。
根据第二个但相关的可替代实施方案，用携有如上文所定义的异源核酸序列的重组病毒接种新生儿，以诱发抗异源核酸序列所表达的氨基酸序列的免疫应答。例如，核酸序列可编码如上文所定义的抗原或抗原表位。该实施方案中的重组病毒的例子是含有编码抗原的异源核酸的重组MVA，特别是重组MVA-BN或其衍生物，所述抗原来自(i)除MVA以外的病毒，如HIV-1，HIV-2，登革病毒，西尼罗病毒，日本乙型脑炎病毒，麻疹病毒，(ii)肿瘤抗原，(iii)细菌，(iv)真菌。如果重组病毒所表达的抗原是例如HIV抗原，即可使用重组病毒在被接种的新生儿中诱发抗HIV和防AIDS的免疫应答。在较宽泛的意义上，使用表达抗原或抗原表位的重组病毒诱发抗衍生出所述异源序列的感染因子和/或含有抗原或抗原表位的感染因子的免疫应答。
根据第三个可替代的实施方案，我们意外发现可以使用能感染新生的或产前的动物(包括人)的细胞，但不能在新生的或产前的动物(包括人)的体内复制成感染性子代病毒的病毒制备药物，用于保护动物，特别是新生动物(包括人)，使其抗选自肿瘤抗原和外源抗原的抗原，其中肿瘤抗原和/或外源抗原不同于与病毒相关的抗原。
根据第三个可替代的实施方案，用本发明的病毒，特别是MVA，如MVA-BN及其衍生物接种的新生儿受到保护，能够抵抗外源抗原，如感染因子的攻击。因此，本发明的病毒，特别是MVA是新生儿的一般性疫苗，即通过用本发明的病毒，特别是MVA接种新生儿，新生儿的免疫系统更有能力对付外源抗原，如病毒。在实施例部分，所举的例子是用MVA接种，随后用1型单纯疱疹病毒攻击。因此，如果将本发明的病毒，特别是MVA用于接种新生儿，在关键的一段时间内，接种动物比未接种的动物更能受到抗外源抗原的保护作用，一直到建立起功能性的和成熟的免疫系统为止。
根据本发明，“肿瘤抗原和/或外源抗原不同于与病毒相关的抗原”。该术语应被理解成：根据此实施方案，本发明主要不想使用如MVA的病毒诱发抗病毒本身的免疫应答。取而代之的是使用病毒诱发能保护宿主以分别抗与病毒不相关的外源抗原和肿瘤抗原的免疫应答或至少是一般性的免疫刺激。术语“与病毒相关的抗原”指的是病毒颗粒的表位和抗原以及被病毒感染的细胞表面因病毒基因组表达所产生的抗原和表位。
在此实施方案的上下文中，术语“外源抗原”指的是任何不是动物体的天然部分或组分的抗原和表位。特别地，外源抗原是得自感染因子和毒素的抗原和表位。典型的感染因子是病毒，如疱疹病毒、逆转录病毒、狂犬病毒、弹状病毒、腺病毒；细菌，如沙门氏菌、支原体、脑膜炎球菌、嗜血杆菌；朊病毒或真菌。
本发明的兴趣不仅在于接种动物以抵抗外源抗原，在可替代的实施方案中，还适于接种动物以抵抗肿瘤抗原。“肿瘤抗原”是与某些肿瘤疾病相关的抗原。肿瘤抗原是肿瘤患者的基因组所编码的最常见的抗原。因此，严格说来，肿瘤抗原不是外源抗原。然而，肿瘤抗原在肿瘤中以显著的量出现，而正常组织中肿瘤抗原的量显著较低，最常见的情况是在正常组织中根本发现不了肿瘤抗原。肿瘤抗原的例子是本领域技术人员已知的，包括例如MAGE抗原。由于接种动物能导致免疫系统的活化和/或加速成熟，随后导致肿瘤细胞的破坏，因此，MVA能有效地抗这些肿瘤抗原。
术语“抵抗抗原的保护作用”是指产生针对外源或肿瘤抗原的免疫应答。如果外源抗原是感染因子，宿主则受到抵抗所述感染因子的保护作用，即宿主产生了抗所述抗原的免疫应答。因此，感染因子的感染导致较不严重的疾病或根本不导致疾病。不应将术语“保护”理解成总有抗外源或肿瘤抗原的100％保护作用。取而代之的是，本申请所用术语“保护”指的是任何有助于动物分别对付外源抗原和肿瘤抗原的有益效果。
根据本发明，在首次接种之后，这种保护作用能发挥至少5天，优选为至少7，14或28天。换句话说，如果动物分别在5，7，14和28天之后与所述抗原接触，被接种和/或治疗的动物受到保护，能例如抗外源抗原。
在本发明的上下文中，诱发或增强免疫系统成熟和/或活化免疫系统可以解释用本发明的病毒，特别是用MVA接种新生儿的效果。在本发明的上下文中，术语“诱发或增强免疫系统成熟”特别地指与对照相比，能快速增加接种者体内的树突细胞或其前体。在本说明书中，术语“免疫系统的加速成熟”和“增强免疫系统的成熟”可以互换使用。
“活化免疫系统”的特征在于细胞表面能减轻细胞/细胞相互作用或运输的分子和激素的表达和/或细胞分泌出所述分子和激素。特定的受体接收这些信号并作出反应。特别的活化标记为Flt3-L，IL-12，IFN-α，MHC-II和CD8，特别是CD8α(见下文)。
免疫系统的加速发育/成熟与活化和/或移动(morbilization)树突细胞(DC)或其前体细胞的因子的水平增加，和/或树突细胞及其前体细胞数目的增加，和/或干扰素或IL-12的生成和/或细胞性含量增加相关。被本发明的病毒，特别是MVA诱导的DC前体细胞的例子是浆细胞样DC前体，它对抗病毒感染的防御非常重要，并且似乎能产生IFNα/β。
更具体地，增强免疫系统成熟的定义优选为DC上存在的表面标记，如MHC-II，CD40和/或CD80/86至少增加2倍。优选在血液中可检测到所述增加。其它可表征增强免疫系统成熟的标记是Flt3-L，IL-12，IFN-α，MHC-II和CD8(见下文)。另外，加速免疫系统成熟优选与下述现象相关，即与未接受MVA-BN的对照动物相比，给新生动物施用MVA-BN 7天之后，血液和/或脾脏中CD11c阳性细胞的数目至少增加1.5倍，优选至少增加2.0倍。另外，增强免疫系统成熟优选与下述现象相关，即与年龄匹配的对照相比，用本发明的病毒接种新生儿2天之后，Flt3-L的浓度至少增加1.5倍，更优选至少增加2.0倍。
在此上下文中，应注意能以其表面表型表征的鼠和人DC群体的表型和功能之间有关联(Hochrein等，2002.Hum.Immunol.63：1103)。使用一系列表面标记(MacDonald等，2002.Blood.100：4512)的流式细胞计数可以测定血液中的DC，所述标记也可鉴定出特殊的DC群体，如浆细胞样DC(Dzionek等，2002.Hum Immunol.63：1133；Dzionek等，2000.J.Immunol.165：6037)。使用类似的技术，也可检测出其它人组织中的DC(Summers等，2001.Am.J.Pathol.159：285)。
根据本发明，也可以使用如上文所定义的病毒来治疗新生的或产前的动物，以使活化和/或移动树突细胞(DC)或其前体细胞的因子的水平增加，和/或树突细胞及其前体细胞数目增加，和/或干扰素或IL-12的生成和/或细胞性含量增加。已阐明用MVA-BN接种之后，浆细胞样树突细胞制备出显著更多的IL-12，所产生的IFN-α增加，并能上调MHC-II和CD8a。施用本发明所用病毒之后IL-12的增加倍数优选为2倍、更优选为100倍、500倍、1000倍、2500倍或5000倍。与年龄匹配的对照相比，用本发明的病毒，最优选用MVA-BN或其衍生物接种新生儿2天之后，Flt3-L的浓度增加倍数优选为1.5倍，更优选为2.0倍。
术语“活化树突细胞或其前体”指的是通过由激素和刺激物驱动的尚不清楚的细胞期，DC成熟为抗原呈递细胞。DC的中间体被称为前体。这些不成熟的DC到达外周。不同的(抗原性)刺激物活化DC。在被活化的树突细胞中被上调的活化标记特别地是Flt3-L，IL-12，IFN-α，MHC-II和CD8a(见下文)。
应注意激素如GM-CSF导致外周产生更多不成熟的DC。因为GM-CSF导致骨髓、血液和外周器官(细胞不得不迁移至此)中产生更多的DC前体，该现象被称为“树突细胞或其前体的移动”。该定义也用于本说明书中。
因此，如果欲使活化树突细胞(DC)或其前体细胞的因子的水平增加，和/或树突细胞或其前体细胞数目增加，和/或干扰素或IL-12的生成和/或细胞性含量增加，接种动物(包括人)特别有用。
能活化树突细胞的因子具体包括Flt3-L(Lyman等，Cell 1993，75：1157-1167)和GM-CSF。本发明的典型干扰素是IFN-α和IFN-β。本发明所用的病毒诱导Flt3-L，假定因所述诱导而观察到一些有益效果。
在本申请的上下文中，新生动物或人被定义为尚不具有成熟免疫系统的动物或人。成熟免疫系统的特征在于能完全活化先天免疫系统，并且所有已知的T和B细胞功能和产物皆已到位，特别是免疫球蛋白同种型，如IgA和IgE。因此，不成熟的免疫系统的特征在于相对于成年动物或人而言，T细胞、B细胞和树突细胞的数目较少，IFN的产量也较低，次级淋巴器官未完全成熟。更具体地，本发明上下文中的“新生儿”的定义为：与成年动物的脾脏CD4+细胞平均数目相比，具有的脾脏CD4+细胞数目优选要少至少2倍，更优选少至少20倍，更优选少至少200倍，更优选少至少2,000倍，最优选少至少20,000倍的新生动物。
对4周龄的小鼠而言，免疫系统是成熟的。对人而言，可能需要6个月至1年才能成熟。对猫和狗而言，免疫系统通常在6月龄时成熟，对小牛、绵羊和猪而言，免疫系统在4-12周龄时成熟。优选在免疫系统成熟之前，用本发明的病毒，特别是MVA进行接种。然而，由于在出生后成熟速度几乎呈指数增长，因此最优选在出生后尽可能早地用本发明的病毒，特别是MVA进行接种。由于在所有相关的家养动物和人中，免疫系统不会在早于出生后4周的时间内成熟，一般优选在出生后4周内，更优选在出生后2周内，甚至更优选在出生后1周内，最优选在出生后3天内，用本发明的病毒，特别是MVA进行接种。这些一般性的期限可用于所有重要的家养动物，特别是所有重要的家养哺乳动物，包括人。本领域技术人员应意识到下述事实：在本发明的上下文中，甚至年龄较大的动物也被当成是新生动物，因此，当出生4周后免疫系统仍不成熟时，也可对年龄较大的动物进行成功接种。因此，对人而言，可以在出生后6个月内，更优选在出生后3个月内，更优选在出生后2个月内，更优选在出生后4周内，更优选在出生后2周内，甚至更优选在出生后1周内，最优选在出生后3天内进行接种。
由于如果将病毒施用于不成熟的免疫系统，将能观察到本发明的病毒，特别是MVA作为一般性疫苗的最佳效果，优选接种甚至尚未出生的动物，包括人。对有重要经济价值的动物，如牛或猪而言，必需进行出生前接种。如果胎盘允许病毒通过，简单地通过接种母体动物即可接种出生前的动物。因此，在具有胎盘内皮绒毛膜的动物，如狗、猫、大鼠和小鼠中或具有胎盘血绒毛膜的动物，如包括人的灵长类动物中，接种母体动物以接种出生前动物非常有应用前景。在具有胎盘绒毛膜上皮的动物，如牛和绵羊中或具有胎盘韧带绒毛膜的动物，如猪和马中，优选通过子宫给药接种出生前动物。当然，对于具有胎盘内皮绒毛膜或血绒毛膜的动物而言，也可进行这种给药方式。
由于本发明的病毒，特别是MVA能导致免疫系统的加速成熟，并且由于本发明的病毒，特别是MVA因此可用作一般性的疫苗，故被接种的动物受到抗多种疾病的保护。更具体地，可以使用本发明的病毒，特别是MVA接种猫以利于一般性的健康和抗猫疱疹病毒或猫感染性腹膜炎。可以给狗使用本发明的病毒，特别是MVA以利于一般性的健康和抗呼吸道相关(病毒)疾病。可以给猪，特别是增肥的猪使用本发明的病毒，特别是MVA以利于一般性的健康和抗嗜血杆菌或支原体感染。
应指出优选实施方案是在新生的或产前的动物中使用本发明的病毒，特别是MVA，以保护所述动物，使其抗外源抗原和/或肿瘤抗原，其中肿瘤抗原不同于与接种所用病毒相关的抗原。然而，该实施方案并不局限于新生的或产前的动物。取而代之的是，在另一个实施方案中，本发明可以对所有年龄的动物实施，因为也可以在成年动物中观察到有益效果。因此，根据该实施方案，如上文所定义的病毒，特别是MVA-BN及其衍生物可用于保护动物(包括人)以抵抗选自肿瘤抗原和外源抗原的抗原，其中肿瘤抗原和/或外源抗原不同于与病毒相关的抗原。如上所述，本发明所用的病毒能感染动物细胞，但不能在所述细胞中复制成感染性的子代病毒。上文针对新生儿给出的所有信息、定义，包括对保护作用期限的定义，实施例以及优选、更优选和最优选的实施方案也适用于本实施方案，根据此实施方案，病毒也可施用于成年动物。
与新生动物相反，成年动物的免疫系统已经成熟。不过，由于某些疾病或仅仅因为动物的年龄，动物免疫系统可能被削弱。特别是在无免疫应答的群体和老年群体中，给动物施用本发明的病毒，特别是MVA可特别地通过增加活化和/或移动树突细胞(DC)或其前体细胞的因子的水平，和/或增加树突细胞或其前体细胞的数目，和/或增加干扰素或IL-12的生成和/或细胞性含量，而具有有益效果。因此，甚至在成年动物中，施用本发明的病毒，特别是MVA可导致免疫系统对付外源抗原和/或肿瘤抗原的能力提高。换句话说，本发明所用的病毒可用于一般性地活化免疫系统。
本发明还涉及用于制备给动物(包括人)施用的药物的本发明的病毒，特别是MVA，其中所述药物能增加活化树突细胞的因子的水平，和/或增加树突细胞的数目，和/或增加干扰素(IFN)或IL-12的生成和/或细胞性含量。上文给出的所有针对其它实施方案的定义也可用于本实施方案。根据此实施方案，本发明的主要目的不是诱发抗外源抗原和/或肿瘤抗原的保护作用。取而代之的是，此实施方案的目的是治疗疾病，所述疾病的特征为：活化树突细胞的因子水平低，和/或树突细胞的数目不足或太少，和/或干扰素(IFN)或IL-12的生成和/或细胞性含量低。因此，根据此实施方案，用本发明的病毒，特别是MVA治疗能保护动物使其免受变态反应或自身免疫病。如果给新生动物施用本发明的病毒，特别是MVA，该治疗也非常有应用前景。
另外，根据另一个实施方案，本发明的病毒，如MVA，特别是MVA-BN及其衍生物可特别地用于在无免疫应答的动物，如被SIV感染的猴(CD4＜400/μl血液)或无免疫应答的人中诱发免疫应答。术语“无免疫应答”描述了个体的免疫系统状况，它仅显示出不完全的免疫应答，或抗感染因子的防御效力降低。
本发明还涉及通过施用本发明的病毒，特别是改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，保护动物(包括人)以抵抗选自肿瘤抗原和外源抗原的抗原的方法，其中肿瘤抗原和/或外源抗原不同于与病毒相关的抗原。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗动物(包括人)以增加活化树突细胞的因子的水平，和/或增加树突细胞的数目，和/或增加干扰素(IFN)或IL-12的生成和/或细胞性含量的方法，所述方法包括施用改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。
发明简述
病毒用于制备药物的用途，所述药物用于接种或治疗新生的或产前的动物(包括人)，其中所述病毒能感染新生的或产前的动物(包括人)的细胞，但不能在新生的或产前的动物(包括人)的体内复制成感染性子代病毒。
治疗或接种新生的或产前的动物(包括人)的方法，所述方法包括施用病毒，其中所述病毒能感染新生的或产前的动物(包括人)的细胞，但不能在新生的或产前的动物(包括人)的体内复制成感染性子代病毒。
接种或治疗新生的或产前的动物(包括人)的病毒，其中所述病毒能感染新生的或产前的动物(包括人)的细胞，但不能在新生的或产前的动物(包括人)的体内复制成感染性子代病毒。
如上所述的用途、方法或病毒，其中病毒是DNA病毒。
如上所述的用途、方法或病毒，其中病毒选自DISC-疱疹病毒和改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。
如上所述的用途、方法或病毒，其中MVA毒株是保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)，保藏号为V00083008的MVA-BN及其衍生物。
如上所述的用途、方法或病毒，其中通过口服、鼻、肌内、静脉内、腹膜内、皮内、子宫内和/或皮下给药施用MVA。
如上所述的用途、方法或病毒，其中在首次接种(“引发接种”)和二次接种(“加强接种”)中施用治疗有效量的MVA。
如上所述的用途、方法或病毒，其中给动物(包括人)施用其量至少为101TCID50(组织培养感染因子量)的MVA。
如上所述的用途、方法或病毒，其中接种用于抵抗痘病毒感染。
如上所述的用途、方法或病毒，其中痘病毒感染是天花病毒感染。
如上所述的用途、方法或病毒，其中病毒基因组含有至少一个异源核酸序列。
如上所述的用途、方法或病毒，其中异源核酸序列选自编码至少一种抗原、抗原表位和/或治疗性化合物的序列。
如上所述的用途、方法或病毒，其中接种用于抵抗衍生出所述异源序列的感染因子或含有至少一种抗原或抗原表位的感染因子。
如上所述的用途、方法或病毒，其中接种是为了保护动物(包括人)以抵抗选自肿瘤抗原和外源抗原的抗原，其中肿瘤抗原和/或外源抗原不同于与病毒相关的抗原。
如上所述的用途、方法或病毒，其中外源抗原选自感染因子和毒素。
如上所述的用途、方法或病毒，其中感染因子选自病毒、细菌、朊病毒和真菌。
如上所述的用途、方法或病毒，其中使用接种或治疗以诱发或增强免疫系统的成熟和/或活化。
如上所述的用途、方法或病毒，其中使用治疗(i)增加活化和/或移动树突细胞或其前体细胞的因子的水平，(ii)增加树突细胞或其前体细胞的数目，或(iii)增加干扰素(IFN)或IL-12的生成和/或细胞性含量。
如上所述的用途、方法或病毒，其中活化树突细胞的因子是Flt3-L和/或GM-CSF。
如上所述的用途、方法或病毒，其中干扰素是IFNα和/或IFNβ。
含有上述病毒的药物组合物。
含有上述病毒的疫苗。
附图简述
图1A：在出生后24-48小时内，用106p.f.u.MVA或DISC HSV-1注射新生小鼠一次，或用生理盐水(NaCl)处理新生小鼠以用作对照。在出生后7天，通过流式细胞计数，用全DC标记CD11c测定外周血中的这些细胞。图中显示出3至5次实验的平均和标准误差。
图1B：与图1A相同的实验。然而，通过流式细胞计数测定脾脏中的CD11c细胞。
图1C：与图1A相同的实验。然而，通过流式细胞计数测定腹膜液中的CD11c细胞。
图2：如左栏所示，用MVA-BN接种小鼠。2周后，通过流式细胞计数测定脾脏和血液中CD11c+单和CD11c+/CD8+双阳性细胞的百分比。
图3：在1和5天龄时，用MVA或作为对照的NaCl注射新生小鼠。8天龄时，通过ELISA测定这些小鼠血清中的鼠Flt3-L，所给出的数值单位为pg/ml。
图4：在出生24-48小时之内，用106p.f.u.MVA注射新生小鼠一次，或用NaCl处理以用作对照。7天龄时，将所有小鼠暴露于100×LD50HSV-1毒株F。监测存活小鼠的数目达21天。
图5：按图4的方法处理小鼠。数据表示用100LD50 HSV-1的9次不同的攻击实验。没有对照动物在攻击中存活。
图6：在出生当天用MVA-BN接种，随后进行致死痘苗病毒攻击的成年小鼠的存活。用MVA-BN(2.5×107TCID50)接种3窝、每窝各6只1天龄幼仔(18只小鼠)，4周龄(成年小鼠)时，用致死剂量的痘苗病毒进行攻击。MVA-BN接种显然能在新生小鼠中诱发保护性的免疫力，该免疫力一直能持续到成年期。
实施例
下述实施例将进一步阐明本发明。本领域技术人员应能较好地理解：不能以任何方式将所提供的实施例解释成本发明提供的技术仅限于用在这些实施例中。
实施例1
(i)MVA-BN和DISC-HSV在新生动物中诱导CD11c+和CD8+表型的DC
第一套实验：新生小鼠的IFN系统不成熟，因此具有天生的免疫缺陷。目前已知为IFN最佳生产者的DC的数目和活化状态尚未被分析。通过多种刺激物可在体外及体内诱导DC。在这些研究中，检测了受控的MVA-BN复制是否能诱导DC，并且分析了它们的表型。在出生后1-2天内，有些情况下在出生后5天，用106噬斑形成单位(p.f.u.)的MVA-BN或仅用盐水注射小鼠组。通过FACS分析两组中各个小鼠的血液和脾细胞，并比较数据。
7至8只小鼠的数据表明用MVA-BN治疗使CD11c+细胞增加2-3倍，伴随着MHC II表达的增加以及CD4或CD8型T细胞存在量的增加，成熟B细胞的标记CD19/54的减少表示这些细胞迁移至除脾脏以外的器官中，或者表示B细胞前体早就征集至其它谱系，特别是携有早期B细胞标记(B220)的浆细胞表型的DC中。
三个不同实验的数据显示出再现性和显著差异。用不同的复制受控的病毒疫苗DISC-HSV-1进行的实验在新生儿引发之后，诱发出类似量的CD11c+细胞。
结果简述于图1A-C。
为了进一步研究血液和脾脏中的DC亚群并分析用MVA-BN治疗的长期效果，分析2周龄动物血液和脾脏中的细胞。在此时间点，经治疗动物的脾脏中的CD11c+细胞数目约两倍于1周龄动物，但在出生时用病毒单次治疗导致2周后脾脏中这些细胞的数目增加3倍(图2)。在血液中也观察到类似的效果，不同之处在于CD11c+/CD8a+约高4倍。在出生后7天用MVA-BN单次治疗导致CD11c+/CD8a+增加13至40倍，而对CD11c+细胞的效果较不显著。正如所预期的，在出生时和第7天进行的两次接种对CD11c+细胞具有显著效果。多种效果示于图2。
第二套实验：与对照小鼠相比，在出生时用2.5×107TCID50MVA-BN接种的1周龄小鼠的脾脏和血液中显示出不同的免疫相关细胞群体的组合(表1)。在血液中，CD8阳性淋巴细胞群体增加，NK细胞的数目也有所增加。CD11c阳性细胞的数目约比对照高3倍，B-细胞(B220和CD19双阳性的细胞)的百分比显著降低。经免疫动物和对照之间脾脏中的细胞总数不变。与血液中相反，接种动物的脾脏比对照具有更多的CD4阳性T淋巴细胞，NK细胞的数目未增加。与血液类似，CD8阳性淋巴细胞的相对数目增加，而B-细胞数目减少。与对照相比，CD11c阳性细胞的百分比约高3倍。当4只未治疗的对照的脾脏中CD11c阳性细胞的数目为3.6％，而4只经MVA-BN接种的小鼠中的相应数值为4.8％时，我们首先认为：用MVA-BN接种5天后，树突细胞的百分比有差异。与对照相比，相同量的经UV-灭活的MVA-BN在接种新生小鼠之后不会导致细胞群体发生任何显著改变(数据未显示)。可以任意选择最初的接种剂量。滴定接种物之后，我们选择标准剂量2.5×106TCID50进行接种(比最初实验低10倍)。此剂量可诱导最多数目的DC(表2)。
表1.用2.5×107TCID50 MVA-BN免疫接种1周后，在新生小鼠血液和脾脏细胞中诱导的改变
  参数％              血NaCl       MVA-BN     P<sup>*</sup>              脾NaCl       MVA-BN    P<sup>*</sup>
  Total cells x10<sup>6</sup>％CD11c％CD11c/CD8α％CD4/CD3％CD8α/CD3％NK1.1/DX5％CD19/B220 5.4±1.3   18.6±1.5  0.0010.5±0.1   2.7±0.3   0.00116.9±1.1  16.1±1.5  0.9996.0±0.9   10.3±0.9  0.00216.4±1.2  24.4±3.3  0.03222.3±0.5  8.4±0.8   0.001   17.9±1.9  24.1±2.6 0.1052.8±0.1   7.9±0.8  0.0011.1±0.1   4.6±0.7  0.0024.8±0.3   8.1±1.5  0.0044.7±0.3   8.4±1.1  0.0022.5±0.3   2.4±0.2  0.86216.2±1.3  8.6±0.9  0.004
*Mann-Whitney U-检验
表2.1天龄wt小鼠和用MVA治疗后7天内的、基因被定向破坏的小鼠脾脏中CD11c阳性细胞的诱导
  小鼠株   MVA剂量(TCID<sub>50</sub>)   对照％CD11c   MVA-BN％CD11c   比
  wt<sup>a</sup>wtwtRAG<sup>b</sup>AG.129<sup>c</sup>   2.5x10<sup>7</sup>2.5x10<sup>6</sup>2.5x10<sup>5</sup>2.5x10<sup>7</sup>2.5x10<sup>3</sup>   2.82.12.54.22.6   7.911.96.65.42.7   2.85.62.61.31.0
aWt＝C57BL/6或129Sv/Ev小鼠。
b重组活化基因缺失的RAG小鼠(即没有功能性的T和B细胞)。
cI型(IFN-α和-β)和II型(IFN-γ)IFN受体基因被定向破坏的AG129。
(ii)MVA-BN优先诱导浆细胞样树突细胞(pDC)
根据其它作者的看法，将也表达CD45RA或CD45R的CD11c阳性细胞看成是pDC(Asselin-Paturel等，2001，Nat Immunol，12：1144)。我们想知道MVA-BN是否能诱使pDC增加。为此进行了进一步的实验，其中分析了CD11c阳性细胞上的CD45RA或CD45R。与两个对照组(未治疗组3.0±0.3％，p＝0.01；UV-灭活的MVA-BN治疗组3.0±0.2％，p＝0.006，Mann-Whitney U-试验)相比，经MVA-BN治疗的小鼠中，CD11c和CD45R双阳性细胞的百分比显著较高(5.6±0.7％)。
(iii)用MVA-BN治疗的新生小鼠具有升高的血清Flt3-L水平
Flt3-L是导致成年动物DC水平提高的造血因子。在人以及可能在小鼠中，该因子最丰富的来源是活化的T细胞。为了测定DC数目的增加是否是诱导的Flt3-L造成的，比较经MVA-BN治疗的小鼠的血清与经模拟治疗的动物的血清中该因子的存在。与经模拟治疗的动物的血清相比，在第2和第5天接受治疗的动物的血清中具有2倍的Flt3-L水平。因此，Flt3-L可能是一种负责增加DC数目的因子(图3)。
施用MVA-BN之后，评价新生小鼠中Flt3-L诱导的时间进程。在新生小鼠中，MVA-BN接种在24小时内诱导Flt3-L浓度的增加。48小时之后，诱导达到最大值，第7天时仍存在诱导，而第7天通常是分析脾细胞并检测HSV-1抗性的时间(见下文)。与年龄匹配的对照动物相比，在经接种的小鼠中，接种后24小时和48小时，血清中的Flt3-L浓度增加2倍。
实施例2
(i)经MVA-BN治疗的新生小鼠能在100至500LD50HSV-1的攻击中存活
出生后1或2天，用标准剂量的MVA-BN治疗小鼠组，并在7-8天龄时用100至500LD50单纯疱疹病毒1(HSV-1)进行攻击(图4)。经MVA BN治疗的小鼠能在HSV1攻击中存活，而所有对照小鼠都在接种攻击病毒后的5-6天内死亡。
为了进一步支持这些观察结果，用40只经MVABN治疗的小鼠和45只对照小鼠进行9次攻击实验。80％以上经病毒治疗的小鼠能在攻击中存活，而对照小鼠全部死亡(图5)。
在分开的一套实验中，用MVA-BN治疗出生时的小鼠(2.5×106TCID50/小鼠)。第8天，用103(1LD50)或105(100LD50)PFU HSV-1进行攻击。用MVA-BN接种之后，65％的小鼠能在可杀死100％对照小鼠的病毒剂量(100LD50)中存活，而90％的小鼠能在可杀死45.5％对照小鼠的剂量(1LD50)中存活。在其它实验中，用HSV-1感染以7只为一组的、用UV-灭活MVA-BN接种过的小鼠。其中的5只在7天内死亡。其余2只动物停止生长并在第22和29天死亡。因此，用MVA-BN治疗的小鼠已获得增加的HSV-1抗性，这与活的MVA-BN，而不是灭活的MVA-BN相关。
在用不具有功能性T细胞的小鼠所做的对照实验中，已测定用MVA-BN接种后的抗HSV-1保护作用不是MVA-BN诱导的交叉-反应的细胞毒T-淋巴细胞所致。
检测用MVA-BN接种之后，DC细胞是否负责保护小鼠以使其免受HSV-1感染。为此，从经MVA治疗的小鼠中转移细胞4小时之后，用5×104PFUHSV-1攻击首次用于实验的8天龄小鼠。在第一个实验中，将出生当天用MVA-BN治疗过的8天龄小鼠的脾细胞分成DC富集(低密度)和DC贫瘠(高密度)组分。从DC富集组分中接受了5×106个细胞的小鼠50％能在攻击中存活，而所有接受了少10倍的DC富集悬浮液的小鼠或未经治疗的小鼠都在5天内死亡。第二种方法是：将从出生当天用MVA-BN治疗过的8天龄小鼠中正分离的CD11c阳性细胞转移至首次用于实验的年龄匹配的小鼠体内。含有80％以上来自MVA-BN治疗小鼠的CD11c阳性细胞的2×106脾细胞悬浮液能保护首次用于实验的小鼠，使其免受HSV-1感染。相反，4只未经治疗的幼鼠以及其它8只未经治疗的动物在攻击后死亡。另外，接受相同量脾细胞的小鼠或从阴性组分中接受相当于1个脾脏的细胞量(50×106个细胞)的小鼠未显示出增加的HSV-1抗性。因此，CD11c阳性细胞能保护小鼠，使其免受HSV-1感染。
现有技术中已描述：施用MVA之后，在约24小时的时间范围内，有短期的保护作用(Vilsmeier，B.，Berl.Munch.Tierarztl.Wschr.112(1999)，329-333)。尽管所述出版物中所用的病毒不是不能在所用新生的或产前的动物体内复制成感染性子代病毒的病毒，检测Vilsmeier所公开的作用模式是否类似于本申请所描述的作用模式。更具体地，Vilsmeier公开了MVA，特别是灭活的MVA能诱导paramunity约达24小时。为了检测paramunity作用是否也能被看成是本申请公开的保护作用，用MVA-BN或灭活的MVA-BN接种出生24小时的小鼠。用致死剂量的HSV-1(105PFU HSF-1f)攻击7天龄小鼠。未接种的对照小鼠在攻击6天后死亡。用灭活的MVA-BN接种的小鼠也未获得抗HSV-1攻击的保护。这些小鼠中的DC细胞数目未提高。相反，用未灭活的MVA-BN接种的小鼠获得了抗HSV-1攻击的显著保护作用。攻击30天后，80％以上的小鼠仍然存活。接种2天后，在血清中发现了升高的血清Flt3-L。脾脏中的DC数目增加。增强的Flt3-L与DC数目增加有关。这进一步证实了paramunity作用不负责所观察到的保护作用。
(ii)MVA-BN在新生动物中诱导一直持续至成年期的特异性免疫力
用MVA-BN(2.5×107TCID50)(腹膜内)接种1天龄C57BI/6小鼠(组的大小为18)。接种后4周，当认为小鼠成年时，用致死剂量(1×104TCID50)的痘苗病毒Western Reserve(VV-WR)攻击这些小鼠。除了一只动物外，所有其它经MVA-BN接种的动物都能存活。相反，所有用安慰剂接种的动物都在7天内死亡，并表现出严重的临床症状，如毛皮发皱、体重减轻和活力下降。显然，这能清楚地阐明MVA-BN接种不仅对新生动物是安全的，而且能诱导抗致死痘苗病毒(MVA-BN的相关病毒)感染的保护性免疫应答。

Claims (29)

1.改良安卡拉痘苗病毒(MVA)在制备用于治疗或接种新生动物包括新生儿的药物中的用途，其中所述治疗用于诱导或促进免疫系统的成熟。
2.根据权利要求1的用途，其中所述MVA毒株是保藏于英国Salisbury的欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)，保藏号为V00083008的MVA-BN，其中所述病毒的特征在于(i)能在鸡胚成纤维细胞(CEF)中增殖性复制但不能在人细胞系HaCat、Hela或143B中增殖性复制，和(ii)不能在这样的小鼠品系中复制，所述小鼠品系不能产生成熟B和T细胞。
3.根据权利要求1或2的用途，其中对免疫系统成熟的促进作用与树突细胞及其前体细胞的数目增加相关。
4.根据权利要求3的用途，其中树突细胞的前体细胞是浆细胞样树突细胞前体。
5.根据权利要求1-4任一项的用途，其中对免疫系统成熟的促进作用与给予MVA之后2天FIt3-L的浓度增加至少1.5倍相关。
6.根据权利要求1至5中任一项的用途，其中所述药物是通过口服、鼻、肌内、静脉内、腹膜内、皮内、子宫内和/或皮下给药来施用的剂型。
7.根据权利要求1至6中任一项的用途，其中所述药物在首次接种(“引发接种”)和二次接种(“加强接种”)中以治疗有效量施用。
8.根据权利要求1至7中任一项的用途，其中所述药物含有MVA，并且所述MVA施用给动物包括人的量至少为101TCID50(组织培养感染因子量)。
9.根据权利要求1至8中任一项的用途，其中所述病毒基因组包含至少一种异源核酸序列。
10.根据权利要求9的用途，其中所述异源核酸序列选自编码至少一种抗原，抗原表位和/或治疗性化合物的序列。
11.根据权利要求9的用途，其中所述异源核酸序列编码选自干扰素，IL-12，Fit-3L或GM-CSF的蛋白质。
12.根据权利要求1至11中任一项的用途，其中所述治疗或接种用于诱导针对用于接种的病毒的特异性免疫反应。
13.根据权利要求12的用途，其中所述治疗或接种用于抵抗痘病毒感染。
14.根据权利要求13的用途，其中所述痘病毒感染是天花病毒感染。
15.根据权利要求9或10的用途，其中所述接种用于诱导针对异源核酸序列所来源的因子或含有至少一种抗原或抗原表位的因子的免疫反应。
16.根据权利要求15的用途，其中所述异源核酸序列编码来自以下物质的抗原：肿瘤，细菌，真菌或除MVA以外的病毒。
17.根据权利要求15或16的用途，其中所述异源核酸所来源的病毒选自HIV-1，HIV-2，登革病毒，西尼罗病毒，日本乙型脑炎病毒或麻疹病毒。
18.根据权利要求17的用途，其中所述异源核酸编码HIV抗原并且所述药物用于诱导抗HIV的免疫反应。
19.保藏于英国Salisbury的欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)，保藏号为V00083008的改良安卡拉痘苗(MVA)毒株MVA-BN在制备用于接种或治疗包括人在内的动物的药物中的用途，其中所述病毒的特征在于(i)能在鸡胚成纤维细胞(CEF)中增殖性复制但不能在人细胞系HaCat、HeLa或143B中增殖性复制，和(ii)不能在这样的小鼠品系中复制，所述小鼠品系不能产生成熟B和T细胞，其中所述治疗或接种用于保护包括人在内的动物以抵抗肿瘤抗原或外源抗原，其中所述肿瘤抗原或外源抗原不同于所述MVA病毒粒子的表位和抗原以及作为所述MVA病毒基因组表达结果存在于被所述MVA病毒感染的细胞表面的抗原和表位。
20.根据权利要求19的用途，其中所述药物是通过口服、鼻、肌内、静脉内、腹膜内、皮内、子宫内和/或皮下给药来施用的剂型。
21.根据权利要求19或20的用途，其中所述药物在首次接种(“引发接种”)和二次接种(“加强接种”)中以治疗有效量施用。
22.根据权利要求19至21中任一项的用途，其中所述药物含有MVA，并且所述MVA施用给动物包括人的量至少为101TCID50(组织培养感染因子量)。
23.根据权利要求19至22中任一项的用途，其中所述病毒基因组包含至少一种异源核酸序列。
24.根据权利要求23的用途，其中所述异源核酸序列选自编码至少一种抗原，抗原表位和/或治疗性化合物的序列。
25.根据权利要求24的用途，其中所述异源核酸序列编码选自干扰素，IL-12，Fit-3L或GM-CSF的蛋白质。
26.根据权利要求19的用途，其中所述外源抗原选自感染因子和毒素。
27.根据权利要求26的用途，其中所述感染因子选自病毒、细菌、朊病毒和真菌。
28.根据权利要求27的用途，其中所述病毒选自疱疹病毒、逆转录病毒、狂犬病毒、弹状病毒和腺病毒。
29.权利要求19-28中任一项的用途，其中所述保护作用显示至少14天。
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