KR100880765B1 - 변형된 백시니아 바이러스 안카라(ｍｖａ)의 변형 균주 - Google Patents

변형된 백시니아 바이러스 안카라(ｍｖａ)의 변형 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대부분의 포유류 특히 인간에 대한 발병성이 크게 감소되면서도 백신 같은 치료제의 제조용으로서 허가된 연속계대 세포주의 세포내에서 성장하는 변형된 백시니아 바이러스 안카라(MVA)의 새로운 균주를 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 상기 적응된 MVA 균주를 생산하는 방법도 제공한다. 적응된 MVA 는 예컨대, 비경구적 면역화를 위해 벡터계로 사용될 수 있거나 혹은, 면역계의 비특이성분들의 항원보강제나 조절제로서 활성 혹은 비활성 형태로 사용될 수 있다.

Description

변형된 백시니아 바이러스 안카라(ＭＶＡ)의 변형 균주 {ALTERED STRAIN OF THE MODIFIED VACCINIA VIRUS ANKARA (MVA)}
본 발명은 많은 포유류, 특히 인간에 대해 크게 감소된 발병독성을 갖는 한편, 백신 같은 치료제의 제조용으로 허가된 연속계대 세포주의 세포 내에서 성장하는 변형된 백시니아 바이러스 안카라(MVA)의 새로운 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 적응된 MVA 균주를 생성하는 방법에도 관계한다. MVA 는 예컨대, 비경구적 면역화를 위해 벡터계로서 사용될 수 있거나 혹은, 면역계의 비특이성분들의 항원보강제(adjuvant)나 조절제로서 활성 혹은 비활성 형태로 사용될 수 있다.
생명체는 계속해서 감염원들 즉, 박테리아, 바이러스, 진균류 혹은 기생충 등에 의해 감염위협을 받고 있다. 면역계는 감염원 및 이에 의해 생성된 기타 독성 분자들을 파괴 및 제거함으로써 생명체가 이들 인자에 의해 영구적으로 감염되는 것을 방지한다. 면역계는 특이적 및 비특이적 부분으로 나뉠 수 있으나, 두 부분은 밀접하게 연관되어 있다. 비특이적 면역반응은 광범위한 종류의 외래 물질 및 감염원에 대한 즉시방어를 가능하게 한다. 대조적으로, 특이적 면역반응은 유기체가 최초로 물질에 의한 침입을 받을 때 일정한 지체단계(lag phase)후에 일어난다. 그러나, 특이적 면역반응은 매우 효율적이다. 특이적 면역반응은 특정 감염으로부터 회복된 개인이 비록 다른 감염성 질환에 대해서는 그렇지 않으나, 상기 특정 감염에 대해서는 보호를 받는다는 사실에 관여한다. 대체로, 동일 혹은 매우 유사한 감염원에 의한 2차감염은 훨씬 경미한 증세를 일으키거나 혹은 증세를 전혀 일으키지 않는다. 면역성은 장시간 지속되며 어떤 경우 일생동안 지속되기도 한다. 이 면역학적 기억은 유기체에 무해하거나 혹은 비활성화된 형태의 감염원을 접종하여 특이적 면역성을 유발하는 백신접종에 이용된다. 가끔 항원보강제를 백신에 첨가시켜 이러한 특이적 면역 반응을 증강시킨다.
감염성 질환 및 면역성에 대한 지식의 대부분은 천연두의 연구에서 얻어진 것이다. 이 질환은 오르토폭스 (Orthopox) 바이러스속 멤버인 바리올라 (variola) 바이러스에 의해 발병한다. 거의 2세기 전부터, 천연두에 대한 면역화를 일으키는 코폭스(cowpox)로의 예방접종이 시작되었다. 후기의 면역화는 백시니아 (Vaccinia) 바이러스를 이용하여 수행되었다. 1950년대 초, 대부분의 기술공업국들은 백시니아 바이러스를 이용한 백신접종에 의해 풍토성 천연두를 제거하였다. 그러나, 백시니아 바이러스를 이용한 천연두 백신접종은 때때로 심각한 합병증 예컨대, 백신접종 후 뇌염을 유발하거나 전신 우두 (generalized Vaccinia) 혹은 접촉감염을 가져왔다.
이러한 합병증을 나타내지 않는 새로운 백신을 안톤 메이어(Anton Mayr)가 개발하였다. 폭스 (pox) 백신은 폭스 바이러스 변형된 백시니아 바이러스 안카라(MVA)로 구성되고 이는 백신접종에 관련된 다른 합병증을 일으키지 않고 약 150 000 회의 백신접종에서 천연두에 대해 비경구 백신접종을 위해 사용되었다. 면역학적 결핍증을 갖는 어린이들에서도 심각한 부작용을 나타내지 않았다. MVA 는 닭 태아 섬유아세포 배양에서 575회 계대 후 본래의 백시니아 바이러스 안카라의 돌연변이 및 선택에 의해 수득되었다. 상기 MVA의 안전도는 생물학적, 화학적 및 물리적 특성에 의해 반영된다. MVA는 게놈 내에 6개의 결실을 갖고 감소된 분자량을 가지며, 포유류 세포에서 크게 약독화되어 있다. 즉 DNA와 단백질이 합성되지만 실질적으로는 바이러스 입자가 생성되지 않는다. 안톤 메이어에 의해 개발된 변형된 백시니아 바이러스 안카라는 유럽 세포배양물 기탁기관 (ECACC; Salisbury, UK)에 수탁번호 V 94012707 로 기탁되었다.
천연두에 대한 백신접종은 매우 성공적이었다. 1979년에, 세계보건기구(WHO)는 천연두의 완전근절을 선언했다. 따라서, 어린이에 대한 대량 백신접종은 중단되었고 실험실의 연구자 및 일부 국가의 군 내부에서만 백신접종이 시행되고 있다.
천연두 근절과 함께, 인간에서 폭스 감염의 주원인도 제거되었다. 그러나, 일부 비인간 폭스바이러스 중에는 숙주특이성이 감소된 것도 있으며 예컨대, 이들은 전형의 숙주 (예, 우두에서는 소) 에서 뿐만 아니라 다른 동물들 (예, 쥐 및 고양이 등)에서도 감염을 일으키기도 한다. 인체 역시 이들 경로를 통해 감염될 수 있다. 집단 중 일부는 천연두에 대해 더이상 면역성이 없어, 동물종의 오르토폭스 감염이 이들에게 위험할 수도 있다. 가축류가 인체감염의 주 원인이다. 따라서, 오르토폭스바이러스에 대한 가축의 백신접종에 대한 중요성이 증가하는 추세이다. 또한, MVA는 예컨대 핵산서열을 그들이 발현되는 타겟세포 속에 전달하기 위한 유전자치료에 대한 벡터로서 중요성을 가지기도 한다.
MVA의 대수적 증식에서, 1차 혹은 2차 닭 태아 섬유아세포의 세포배양이 필요하다. 세포는 10일 내지 12일 동안 배양한 달걀로부터 수득된다. 달걀이 생물학적 다양성을 갖기 때문에, 세포배양 시스템용으로 얻은 세포도 세포 수준에서 다양하다. 또한, 닭의 태아 "섬유아세포 배양"에서 다른 세포타입 예컨대 상피세포가 발견되는 것우가 종종 있다. 이러한 세포 다양성은 또한 닭의 태아 섬유아세포 내에서 생성되는 바이러스의 변형을 가져온다. 따라서, 세포배양계를 표준화 및 유효화 하여 일정한 고품질 MVA 의 생산을 보장하기는 어렵다. 더욱더, 배양된 달걀 내에 이미 존재하는 미생물 혹은 바이러스에 의해 세포배양계가 오염되는 것을 완전히 배제할 수 없는 것이다. MVA가 바이러스-오염된 세포에서 성장할 때, MVA는 오염 바이러스와 재조합되기도 한다. 따라서, 새롭고 예상할 수 없는 특징을 갖는 MVA가 발생하기도 한다. 대규모의 현탁 배양에서의 바이러스 제조에 있어서, 1차 혹은 2차 닭 태아 섬유아세포는 또한 크게 적합하지 않다. 덧붙여서, 초구배 원심분리법에 따른 MVA의 정제 및 농축이 바람직하다. 그러나, MVA를 1차 혹은 2차 닭 태아 섬유아세포 상에서 배양할 경우 이러한 정제가 어렵다. 최종적으로, 점점 많은 수의 환자가 달걀 알부민에 대해 알러지를 일으키고 있다. 비록 시험관 내 배양조건에서 알러지 발생 가능성을 크게 감소시키고 있으나, 알러지반응의 위험을 완벽히 배제할 수는 없다.
결론적으로, 한편으로는 MVA를 여러 문제를 일으키는 1차 혹은 2차 닭 태아 섬유아세포에서만 효과적으로 증식시킬 수 있고, 그러나 다른 한편으로는 그것의 백신으로서 대량 이용에 의해서 인체에 대한 MVA의 안전한 이용이 보여져 왔다.
본 발명의 목적은 균질한 MVA 바이러스 입자를 생성하기 위한 조건을 제공하는 것이다. 또한, 상기 조건은 MVA 의 용이하고 대규모의 생산이 가능해야 한다.
상기 목적 및 기타의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 연속계대 세포주의 세포 내에서의 성장할 수 있게 적응된 MVA 균주를 제공하고, 상기 균주는 치료제의 생산에 허가된 것이다.
본 발명에 따르면, 최초로 MVA 의 효율적인 대규모 생산이 가능하다. 연속계대 세포주의 세포는 균질하며 이들의 특성이 안정하므로, 이들 세포주로부터 수득된 MVA 역시 예기되는 특성과 함께 균질성을 갖는다. 더욱더, 미생물에 의한 오염의 위험을 억제할 수 있고 달걀 단백질에 의한 MVA 제조시의 오염(닭 태아 섬유아세포 상의 MVA 배양시 발견되는)도 배제할 수 있다. 영구 세포주의 취급도 편리하며 따라서 산업적 응용 측면에서 크게 적합하다.
본 발명의 바람직한 구현에서, MVA는 백신 생산에 허가되는 포유류 세포주의 세포 내에서 성장하도록 적응된다. 놀랍게도 베로 (Vero) 세포주 같은 포유류 세포주에 적응된 MVA는 인체 및 기타 광범위한 포유류에 대해 감소된 독성을 가지는 것으로 나타났다. 따라서, MVA는 크게 약독화되어 있다. 즉 DNA 및 단백질은 합성되나 실질적으로 바이러스 입자는 생성되지 않으므로 질병유발력은 사실상 제거되는 결과를 얻는다. 따라서, 본 발명에 따른 MVA는 인체 및 광범위한 포류류에 대한 백신으로도 매우 적합하다. 그러므로, MVA는 특히 수의학 분야에서 적용할 수 있다.
또한 본 발명은 MVA 균주 수득 방법을 제공한다. 본 발명의 구현에 따르면, 치료학적 물질의 생산을 위하여 허가되는 세포주의 세포가 야생형 MVA에 감염된다. 바람직하게, 고감염다중도(MOI) 즉, 세포당 다수의 바이러스가 이 감염에 이용된다. 이어서, 바이러스가 수득되고 동일 세포주의 새로운 세포들이 새로 생성된 바이러스로 감염된다. MVA가 상기 세포주에 적응될 때까지 상기 방법을 반복한다 (연속 계대). 감염 72시간 후 적응(adaptation)에 도달하면, 바이러스 역가는 공급바이러스 역가에 비교할 때 적어도 1 내지 9배, 바람직하게는 10 내지 99배, 더욱 바람직하게는 100 내지 106 배, 가장 바람직하게는 107 내지 1010 배 증가한다. 적응은 제한된 계대(passage)수 후에 도달된다.
"성장에 적응된" 이란 감염에 의해 생성된 바이러스의 양 (생성량)이 본래에 세포 감염에 이용된 바이러스의 양(공급량)에 비교하여 더 증가함을 의미한다. 이 경우 생성량/공급량의 비가 1보다 크다.
ECACC (Salsbury, UK)에 기탁된 MVA의 "유도체" (기탁번호 99101431 및/또는 프로비저널 액서션 번호 01021411)란 기탁된 균주의 성장 속도와 실질적으로 같은 성장속도로 베로 세포에서 성장할 수 있게 적응되었지만, 상기 기탁된 균주와 비교하여 게놈에 있어서 적어도 하나의 차이점을 갖는 것을 말한다.
"면역계" 란 기본적으로 외래 물질 및 미생물에 대한 유기체의 방어에 관여하는 복합체를 말한다. 이것은 수개의 세포 유형, 예컨대 임파구 및 백혈구로부터 유발된 기타 세포들을 포함한 세포부, 및 펩티드와 항체, 보체 인자 및 사이토킨 같은 단백질을 포함하는 체액부로 구분된다.
"면역반응" 이란 외래 물질 혹은 미생물이 유기체 내에 들어갈 때의 면역계의 반응을 말한다. 일반적으로, 면역반응은 특이적 및 비특이적 반응으로 구분되나, 양쪽은 밀접하게 연관된다. 비특이적 면역반응은 광범위한 종류의 외래물질 및 감염원에 대한 즉각적 방어로 간주된다. 특이적 면역반응은, 지체단계 후 외래 물질에 대해 일어나고 상기 물질에 대한 고특이성을 갖는, 외래 물질에 대한 유기체의 고효율적 방어메카니즘이라고 특징화할 수 있다. 특이적 면역 반응은 특정 감염으로부터 회복된 대상자가 추후의 특정 감염에 대해 보호받는 현상에 관여한다.
"면역계의 활성제" 란 면역반응을 일으키거나 증강시킬 수 있는 임의 물질을 말한다.
"면역계의 억제제" 란 면역반응을 감소시키거나 저해시킬 수 있는 임의 물질을 말한다.
"면역계의 안정화제" 란 면역반응을 일정수준으로 지속시킬 수 있는 임의 물질을 말한다.
본 발명자는 베로 세포주(ATCC No. CCL-81)라고 하는 아프리카 녹색 원숭이 세포주에 적응되는 2가지의 바람직한 MVA 균주를 제공한다. 베로 세포에서 100회 계대된 MVA-균주를 "베로-MVA"라고 하고, 이는 유럽 세포배양물 기탁기관 (ECACC; Salisbury, UK)에 수탁번호 99101431 로 기탁되었다. 베로 세포주 내에서 200회 계대한 후의 MVA 균주를 "베로-MVA-200" 이라고 하고, 이는 역시 ECACC 에 프로비저널 액서션 번호 01021411 로 기탁되었다.
상술한 바와 같이 수득된 MVA는 허가된 세포주의 세포를 적절한 조건하에 배양하고, MVA로 이들 세포를 감염시키고, 상기 세포에 의해 생성된 바이러스 입자들을 수득함으로써 더 증식된다. 따라서, MVA는 효율적으로 및 쉽게 대규모로 증식될 수 있다. 놀랍게도, 본 발명의 MVA는 HL, HEP-2 혹은 HeLA 를 포함하는 인간 세포주 같은 베로 세포이외의 세포에서도 독성증가를 보이지 않는다.
본 발명의 또다른 구현에서, MVA는 적어도 하나의 이종성 핵산서열 즉, MVA 게놈 내에서 자연적으로 발견되지 않는 핵산 서열 (재조합 MVA) 을 포함한다. 바람직하게, 이종성 핵산서열은 유전자, 더 바람직하게는 면역화 단백질을 코딩하는 유전자, 가장 바람직하게는 말라리아, 광견병 및/또는 간염에 대해 면역화하는 단백질을 코딩하는 유전자이다. 상기 이종성 핵산서열의 발현은 바람직하게는 백시니아 바이러스 프로모터, 더 바람직하게는 MVA-소유 프로모터의 전사 조절 하에 있다. 더 바람직한 본 발명의 구현에서, 이종성 핵산서열은 MVA 게놈 내에서 자연적으로 발생하는 결실위치에 삽입된다 (PCT/EP96/02926 에 기술됨).
재조합 MVA는 타겟 세포 내에 핵산서열을 도입하기 위해 사용되며, 상기 핵산서열은 타겟 세포에 동종성이거나 이종성이다. 이종성 핵산서열의 타겟 세포로의 도입은 시험관 내에서 이종성 핵산, 상기 헥산서열에 의해 코딩된 펩타이드 및/또는 폴리펩티드 및/또는 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법은 숙주세포를 재조합 MVA로 감염하고, 감염된 숙주세포를 적절한 조건하에서 배양하고, 및 선택적으로 상기 숙주세포에 의해 생성된 펩티드 및/또는 단백질을 단리 및/또는 농축하는 단계를 포함한다.
또한, 동종성 혹은 이종성 서열의 도입은 시험관 내 및 바람직하게는 생체 내 유전자치료에 적용할 수 있다. 시험관 내 및 생체 외 유전자 치료 각각에 있어서, 세포는 치료할 환자로부터 단리되어 재조합 MVA로 형질전환되고 다시 세포를 채취한 대상자에게 재도입된다. 생체 내 유전자 치료의 경우, 재조합 MVA를 인체를 포함하는 동물 생체에 직접 투여한다. 본 발명의 바람직한 구현에서, 재조합 MVA는 항원 혹은 항원성 에피토프를 발현한다. 가장 바람직하게, 상기 벡터는 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 마이코박테리아(Mycobacteria), 헤르페스 바이러스(Herpes virus), 독감(Influenza) 바이러스, 간염 혹은 인체 면역결핍 바이러스로부터의 항원결정기를 발현한다.
본 발명의 MVA는 -놀랍게도-여전히 크게 약독화된 상태이므로, MVA는 인간을 포함한 광범위한 종류의 포유류를 면역화하는데 이상적이다. 따라서, 본 발명은 폭스(pox)감염, 특히 오르토폭스(orthopox) 감염에 대한, 인체를 포함하는 동물 생체의 면역화용 MVA 함유 백신을 제공한다. 백신은 MVA 이외에도 하나 이상의 첨가제 예컨대, 항생제, 보존제 혹은 안정화제를 더 포함할 수 있다. 백신은, 예를 들어 동물을 오르토폭스 감염에 대해, 예컨대 고양이 폭스에 대해 고양이를, 팔다리결손증(ectromelia)에 대해 생쥐를 혹은 낙타 폭스에 대해 낙타를 면역화시키기 위한 수의학 분야에 특히 응용가능하다. 면역화는 바람직하게는 비경구적 방식으로 실행된다.
백신내 항원결정기의 면역화 효과는 종종 소위 항원보강제를 첨가하여 강화된다. 항원보강제는 백신의 항원결정기에 대해 더 강한 특이적 면역반응을 일으키는 비특이적 방식으로 면역계를 공동 자극시킨다. 본 발명의 또다른 구현예에 따르면, MVA는 항원보강제로 사용되어 백신의 항원결정기에 대한 면역반응을 공동자극시킨다. 이 경우, MVA는 비활성화된 것이 바람직하다. MVA의 비활성화는 예컨대 열이나 화학약품에 의해 수행되기도 한다. 바람직하게, MVA는 β-프로피오락톤에 의해 비활성화된다. 본 발명의 상기 구현예에서, 비활성화된 MVA는 수많은 감염성 질환에 대해 면역성을 증대시킬 목적으로 백신에 첨가되기도 한다.
감염시, 환자의 면역계, 신경계, 호르몬계 및 혈관계는 서로 밀접하게 작용한다. 이 상호작용은 비특이적 면역계의 요소들, 예컨대, 인터페론 및 인터루킨 같은 사이토킨에 의해 조정될 수 있다. 폭스 바이러스는 면역계의 조정에 영향을 미칠 수 있다 (스위스 Vet 11/99, 13-17). 그러므로, 본 발명의 또다른 구현예에서, MVA 및 바람직하게는 비활성화된 MVA는 비특이적 (선천성) 면역계의 세포성 및 체액성 요소를 조정하기 위해 인간을 포함한 포유류에 이용된다. 바람직하게, MVA는 생체조절자 역할을 하여, 면역계의 기능장애를 없애고 몸의 자기방어기전을 활성화, 안정화 및/또는 억제시킨다. 가장 바람직하게는, MVA는 바이러스 감염 예컨대, 헤르페스, B 또는 C 형 간염 바이러스 등에 의한 감염시, 만성 염증성(inflammatory) 질환 및/또는 종양치료를 돕기 위한 경우에 생체조절자로 사용된다. MVA는 또한 스트레스를 받거나 혹은 신생아와 같이 감염에 영향받기 쉬운 경우의 면역계를 안정화시키기 위해 이용될 수 있다. 활성 및/또는 바람직하게는 비활성 MVA는 전신으로, 예컨대 근육내로 및/또는 국소적으로, 예컨대 점막 및/또는 피부를 통해 적용될 수도 있다.
결론적으로, 본 발명은 대체로 야생형 MVA 와 동일한 응용분야에 사용되면서도, 닭 태아 섬유아세포 내에서 야생형 MVA의 증식에 의해 일어나는 문제들을 해결할 수 있는 MVA 균주를 제공하는 것이다.
본 발명은 특히 다음의 내용을 각각 혹은 조합으로 포함한다;
치료물질의 제조를 위해 허가된 연속계대 세포주의 세포 내에서 성장하기 위해 적응된, 변형된 백시니아 바이러스 안카라(MVA).
포유류 세포주의 세포 내에서 성장하기 위해 적응된 상기 MVA.
세포주는 백신 제조를 위해 허가된 것인 상기 MVA.
상기 허가된 세포주는 베로 세포주인 상기 MVA.
상기 허가된 세포주는 베로 세포주 ATCC No. CCL-81 인 상기 MVA.
유럽 세포배양물 기탁기관 (ECACC; Salisbury, UK)에 수탁번호 99101431 로서 기탁된 것 및/또는 그의 유도체인 상기 MVA.
ECACC (Salisbury, UK)에 프로비저널 액서션 번호 01021411 로서 기탁된 것 및/또는 그의 유도체인 상기 MVA.
적어도 하나의 이종성 핵산 서열을 포함하는 상기 MVA.
치료용 단백질 및/또는 말라리아, 간염 및/또는 광견병 감염에 대한 면역화를 위한 펩티드 같은 항원결정기를 코딩하는 이종성 핵산서열을 포함하는 상기 MVA.
상기 MVA에 의해 감염된 숙주 세포.
상기 MVA 및/또는 이 MVA의 DNA를 포함하는 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물.
백신인 상기 약제학적 조성물.
인체를 포함하는 동물의 생체를 면역화시키기 위한 상기 백신.
오르토폭스 감염에 대해 면역화시키기 위한 상기 백신.
고양이 폭스 감염에 대해 고양이를, 팔다리결손증 감염에 대해 생쥐를 및/또는 낙타 폭스 감염에 대해 낙타를 면역화시키기 위한 상기 백신.
MVA는 비특이적 면역계의 활성제, 억제제 및/또는 안정화제인 상기 약제학적 조성물.
상기 MVA 및/또는 이 MVA의 DNA를 항원보강제로서 포함하는 상기 약제학적 조성물.
상기 재조합 MVA 및/또는 재조합 MVA의 DNA를 포함하는 상기 약제학적 조성물.
유전자 치료에 사용하기 위한 상기 약제학적 조성물.
타겟 세포를 상기 MVA로 감염시키는 단계를 포함하는, 동종성 및/또는 이종성 핵산 서열을 타겟 세포에 도입하는 방법.
(a) 허가된 세포주의 세포를 야생형 MVA, 바람직하게는 ECACC에 수탁번호 V 94012707 로서 기탁된 MVA로 감염시키는 단계, (b) 바이러스를 수득하는 단계, (c) 동일한 세포주의 새로운 세포를 새롭게 생성된 바이러스로 감염시키는 단계, 및 선택적으로 (d) 바이러스가 상기 세포주의 세포 내에서 성장하도록 적응하게 될 때까지 (b)단계 및 (c)단계를 반복하는 단계를 포함하는, 상기 MVA 균주의 수득 방법.
허가된 세포주의 세포를 적절한 조건 하에서 배양하는 단계, 상기 세포주를 상기 MVA로 감염시키는 단계 및 상기 세포에 의해 생성된 바이러스 입자들을 수득하는 단계를 포함하는, 상기 MVA의 바이러스 입자를 제조하는 방법.
상기 세포주는 ECACC에 수탁번호 99101431 로서 기탁된 MVA 및/또는 ECACC에 프로비저널 액서션 번호 01021411 로서 기탁된 기탁한 MVA 또는 그 균주 중의 하나의 유도체에 의해 감염되는 상기 방법.
상기 재조합 MVA로 숙주세포를 감염시키는 단계, 감염된 숙주세포를 적절한 조건하에 배양하는 단계, 및 선택적으로, 상기 숙주세포에 의해 생성된 핵산서열, 펩티드 및/또는 단백질을 단리 및/또는 농축하는 단계를 포함하는, 핵산서열, 펩티드 폴리펩티드 및/또는 단백질을 제조하는 방법.
상기 MVA에 관련된 질병이나 질환의 치료 혹은 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 상기 MVA 의 용도.
인체를 포함하는 동물의 생체 면역화용 백신을 제조하기 위한 상기 MVA 의 용도.
비특이적 면역계의 활성제, 억제제 및/또는 안정화제를 제조하기 위한 상기 MVA 의 용도.
항원보강제를 제조하기 위한 상기 MVA 의 용도.
백신으로서의 상기 MVA 의 용도.
항원보강제로서의 상기 MVA 의 용도.
비특이적 면역계의 활성제, 억제제 및/또는 안정화제로서의 상기 MVA 의 용도.
필요한 대상체에게 치료학적 유효량의 상기 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인체를 포함하는 동물의 생체를 면역화시키는 방법.
타겟 세포를 상기 MVA 및/또는 MVA의 DNA로 감염시키는 것을 포함하는, 타겟 세포에 동종성 및/또는 이종성 핵산 서열을 도입하는 방법.
상기 약제학적 조성물을 인체를 포함하는 동물의 생체에 투여하는 것을 포함하는, 인체를 포함하는 동물 생체의 면역계를 활성화, 억제 및/또는 안정화하는 방법.
상기 MVA를 항원보강제로서 인체를 포함하는 동물의 생체에 투여하는 것을 포함하는 백신 내의 항원결정기에 대한 특이적 면역반응을 강화하는 방법. 치료물질의 제조를 위해 허가된 세포주의 세포를 감염시키는 단계, 상기 세포주에 의해 생성된 바이러스 입자를 수득하는 단계, 및 선택적으로, 상기 MVA의 원하는 성장특성이 상기 세포 내에서 수득될 때까지 상기 단계들을 반복하는 단계를 포함하는 방법으로 수득가능한, 연속계대 세포주의 세포 내에서 성장하도록 적응된 변형된 백시니아 바이러스 안카라.
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다음의 실시예는 본 발명을 더 상세히 설명하기 위한 것이다. 당업자라면 여기서의 실시예가 단지 예시를 위한 것이며 본 발명에 따른 기술의 응용이 이들 실시예에 국한되지 않는다는 사실을 이해할 수 있다.
실시예 1: 베로 세포에 대한 MVA의 적응 및 상기 MVA 균주의 특성분석
1. 베로 세포에 대한 MVA의 적응
안톤 메이어가 개발한 변형된 백시니아 바이러스 안카라인 야생형 MVA는 ECACC에 수탁번호 V 94012707 로서 기탁되었다. 야생형 MVA 는 베로 세포 내에서 바이러스의 연속 계대로 상기 베로 세포 내에서 성장하도록 적응되었다 (표 1 참조). 고정 베로 세포주 (WHO 접종 스톡 ECACC 수탁번호 88020401) 의 세포 클론 ATCC-No. CCL-81 를 계대 번호 148 내지 165 (WHO 접종 로트, 마스터 및 워킹 뱅크) 까지 사용했다. 세포를 얼리(Earle) MEM (ICN), pH7.4-7.6 및 5% 혈청 치환 BMS (바이로크롬사) 로 구성된 배지에서 증식시켰다. 당업자에게 공지된 기술에 따라, 상기 워킹뱅크의 세포는 항상 세포를 1:2 내지 1:4 로 나누어서 접종했다. 배지는 약 250 000 개의 세포/ml 를 함유했다. 세포를 각각 관(2ml), 록스(Roux) 디쉬(100ml) 및 플라스틱 디쉬(각각 6 및 40ml)에서 증식시켰다. 대체로, 16 내지 24시간 후에 세포들이 융합성 (confluent) 단층을 형성했다. 이어서, 배지를 별도의 첨가물 없이 단순 얼리 MEM 으로 교체했다.
야생형 MVA의 적응을 위해, 관배양계를 사용했다. 계대 결과를 표 1 및 2 에 요약한다. 베로 세포는 10 MOI (감염다중도) 의 야생형 MVA에 의해, 즉 평균 10개의 바이러스 입자/베로 세포로 감염되었다. 시작할 때의 야생형 MVA는 닭 태아 섬유아세포 내에서의 575회의 계대 후에도, 유전적으로 동종의 플라그-정제된 MVA (역가:107.75 KID50/ml) 이었다. 24시간 후, 상기 융합성 단층의 90%의 베로 세포가 독성과정에 의하여 파괴되었다 (50% 독성, 40% 용혈). 세포의 동결 및 해빙 후, 생성된 바이러스가 함유된 배지와 세포 데드리투스(dedritus)를 수득했고 이 혼합물 0.2ml를 배양관 내의 베로 세포 단층 상에 접종했다(2차 계대). 이 과정을 200회 반복했다. 3차 계대 후, 독성효과는 더 이상 관찰되지 않았으며 반면에, 4 내지 6일의 후감염 기간 (p.inf.) 내의 세포 라운딩 및 용혈을 특징으로 하는 가벼운 세포병변효과(CPE)가 나타났다. 바이러스 역가는 101,0KID50/ml 이었다. 비록 매우 비효율적이지만 베로 세포 내의 MVA의 증식이 시작되었다는 것으로 결론을 내렸다. 5차 계대 후, 4 내지 5일의 p.inf. 뒤 완료된 전형적인 CPE가 관측되었다. 바이러스 역가는 3차 계대 후의 101.0KID50/ml 로부터 5차 계대 후의 104.0KID50/ml 로 증가하였다. 따라서, 바이러스는 베로 세포 내에서 더욱 효율적으로 증식되었다. 계대 번호 5번 내지 11번에서, 더욱 빨리 완료된 CPE를 관측하였고 바이러스 역가는 매 계대마다 증가하였다. 계대번호 11번에서, 107.5KID50/ml 의 고평기 (plateau) 에 도달하였다. 따라서, 11회 계대 후 베로 세포에 대한 MVA의 적응이 달성되었다. 다음 30회의 추가 계대에서, 모든 계대의 결과가 동일하였고 높은 재현성을 나타내었다; CPE는 이미 24시간에 p.inf 을 개시했고 모든 세포는 3일 p.inf 후에 영향을 받았다. 그 때, 20%의 베로 세포가 라운드화되고 80%는 용혈되었다. 3일 p.inf. 후에, 바이러스 역가는 항상 107.75KID50/ml 정도였다. 15차 계대 후, 바이러스는 항상 2일 내지 3일 p.inf. 뒤에 수득되었고, 10 MOI 이 아닌 1 MOI 만 세포 감염에 사용되었다 (표 2). 후속의 추가 계대에서, MVA의 성장특성이 약간 달라졌다. 200 회 계대에서 최적의 바이러스 역가가 더 증가해 1010KID50/ml 에 도달했다.
결과적으로, 바이러스는 베로 세포 내에서 지수적 양상으로 재현가능하게 성장한다. 놀랍게도, 상기 성장특성은 야생형 MVA의 특성과 다르다. 따라서, 새로운 MVA 균주가 연속 계대에 의해 수득되었다. 상기 새로운 균주를 "베로-MVA" 라고 하며 베로 세포 내 200 회 계대 후를 "베로-MVA-200" 이라고 하였다.
베로-MVA 및 베로-MVA-200을 모두 대량으로 배양했다. 보관용으로 베로-MVA는 원심분리로 농축하고 2.5% 폴리겔린에 재현탁하여 2ml의 유리병에 넣어 동결건조하였다. 동결건조 후의 역가는 여전히 108.5KID50/ml 이상이었다. 동결건조된 베로-MVA 및 베로-MVA-200 을 오염 및 독성 검사하고 +4℃ 에서 보관했다.
2. 베로-MVA의 생물학적 특성의 특성분석
베로-MVA (100 회 계대) 및 베로-MVA-200 (200 회 계대)의 생물학적 특성을 야생형 MVA의 특성과 비교했다 (표 3 및 표 5). 이에, 당업자에게 공지된 기술을 응용하였다. 본 발명자는 베로 세포를 제외하고 바이러스의 숙주 범위는 변화가 없었으며 인간 혹은 동물에 대한 독성도 증가하지 않았음을 입증했다. 여전히 베로-MVA 는 비허용(non-permissive) 숙주세포 내의 증식 실패를 특징으로 한다.
백시니아 바이러스의 얼스트리(Elstree) 균주의 바이러스 입자와 비교되는 베로-MVA의 바이러스 입자의 주요 동일성은 얼스트리(Elstree) 균주에 대해 얻어진 항체의 교차반응성으로 나타났다. 얼스트리 균주는 천연두 백신접종을 위해 WHO에서 권장한 백시니아 균주이다. 얼스트리 균주에 대해 얻어진 토끼의 폴리클로날 과면역(hyperimmune) 혈청을 베로-MVA에 첨가했다. 100KID50/ml 의 베로 MVA는 1:512 희석농도의 혈청으로 완전중화되었다. 동일량의 백시니아 얼스트리 균주를 중화하기 위해서는 2배 진한 희석 혈청(1:256)이 필요하였다. 따라서, 백시니아 면역혈청으로 베로-MVA를 여전히 효과적으로 중화시킬 수 있다.
베로-MVA, 베로-MVA-200 및 야생형 MVA를 표 3, 4 및 5에서 나타낸 다수의 추가시험으로 통해 비교했다. 본 발명자는 인간을 포함한 포유류에 대한 베로-MVA 및 베로-MVA-200의 독성이 야생형 MVA와 비교하여 증가하지 않았음을 입증했다. 또한, 베로-MVA 및 베로-MVA-200는 인간을 포함한 포유류에서 전염성이나 독성이 없다는 점도 증명했다. 놀랍게도, 베로-MVA의 세포특이성은 베로 세포를 제외하고, 야생형 MVA의 특이성과 다소 동일했다: 베로-MVA는 야생형 MVA와 마찬가지로 인간 세포주의 세포 (표 4 참조: HL-, HEP-2-, HeLa-세포) 내에서 사실상 비효율적으로 증식한다. 따라서, 인간 세포 및 아프리카 녹색 원숭이의 세포가 계통학적으로 밀접한 관계가 있다해도, 베로-MVA는 인간 세포 내에서는 증식력을 얻지 못하였다. 다른 시험들에서도 큰 차이점은 발견되지 않았다.
또한, 야생형 MVA 및 베로-MVA-200의 물리적, 화학적 및 생물학적 특성을 비교했다(표 5). 본래 안카라에서 단리된 폭스 바이러스의 게놈과 비교할 때, 닭 태아 섬유아세포 배양에서 성장하는 야생형 MVA는 좌측 역방위 (inverted) 말단부위에 3개의 결실이 있는 반면, 베로-MVA-200은 좌측 말단부위에 4개의 결실이 있었다. 따라서, 베로 세포 내의 야생형 MVA의 계대 배양이 추가 결실을 가져왔다.
베로-MVA 를 오르토폭스 감염에 대해 가축류를 면역화시키는데 사용했다. 동물혈청을 수거하여 중화시험을 행했다. 본 발명자는 동물이 고역가의 항체를 생성함을 발견했다. 항체 역가는 적어도 111일 기간동안 안정했다. 또한 항체는 플라크-감소 시험에서 MVA의 바이러스 입자를 시험관 내에서 중화시킬 수 있는 것으로 나타났다. 결론적으로, 베로-MVA는 가축류 및 인간의 오르토폭스 감염에 대한 백신으로서 사용할 수 있다.
베로 세포에 대한 MVA의 적응
계대 넘버 세포 배양 최고 바이러스 역가(log10/ml) 결과 결론
1 24시간 후 독성효과 2,0 나머지 바이러스가 접종됨. 단순 계대 구역(zone) 및 사이토킨 생성 현상
3 독성없음, 4-6일후 중간 CPE 1,0 나머지 바이러스가 접종됨? 바이러스 증식 시작
5 전형적인 CPE, 4-5일후 완료 4,0 바이러스 증식 증가
11 3일후 CPE 완료 7,5 대수적인 바이러스 증식 적응 성공
12-42* 24시간 후 CPE 시작, 3일후 완료 7,75 재현가능한 바이러스의 증식 베로-MVA
43-100* 24시간 후 CPE 시작, 3일후 완료 8,0 재현가능한 바이러스의 증식 베로-MVA
100-200* 24시간 후 CPE 시작, 3일후 완료 10,0 재현가능한 바이러스의 증식 베로-MVA-200 얻음
* 11 회 계대 후 10 MOI 대신 1 MOI 만 접종됨.
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베로 세포에 대한 MVA의 적응 기간동안 바이러스 역가의 변화
계대 넘버 [p.inf 일]후 수득 역가/ml(log10/ml)
1 1 < 2,0
2 3 2,0
3 5 1,0
5 5 4,0
8 4 6,5
11 3 7,5
18 2 8,0
19 2 7,75
20 3 8,0
25 2 7,75
29 2 7,75
30 3 7,75
31 3 8,0
45 2 7,75
51 3 7,75
60 2 8,0
66 2 7,75
68 2 8,0
75 3 8,0
100 2 8,0
200 2 10,0
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야생형 MVA 및 베로-MVA의 생물학적 특성의 비교
마커 야생형 MVA 베로-MVA(100 회 계대) 베로-MVA-200
단층 세포 배양의 CPE (1MOI 접종됨) 5일후 세포의 라운딩 및 용혈 (90% CPE) 5일후 세포의 라운딩 및 용혈 (100% CPE) 3일 내지 5일후 세포의 라운딩 및 용혈 (100% CPE)
최적 수득 역가 108,0KID50/ml 107,75KID50/ml 1010,0KID50/ml
비허용 세포계 내에서의 바이러스 증식 실패 있음 있음 있음
인간 및 동물에서의 감소된 독성 있음 있음 있음: 전혀 독성없음
전염성 없음 없음 없음
융모요막 상의 1차 플라그의 특성 괴사없이 증식노드(node) 없음 괴사없이 증식노드 없음 괴사없이 증식노드 없음
적혈구응집 (닭 적혈구) 음성 음성 음성
베타-프로피오락톤에 의한 비활성화 0.05%의 1차 약동학 0.05%의 1차 약동학 0.04-0.05%의 1차 약동학
VSV-새끼생쥐 유발 시험시의 방어효과 있음 있음 있음
인간 및 동물에 대한 독성 없음 없음 없음
사이토킨 자극 인터페론α, IL-2, 및 12, CSA 인터페론α, IL-2, 및 12, CSA 인터페론α및γ, IL-1, 2, 및 12, CSA
식균세포, 자연 살세포, 및 T-임파구의 활성화 있음 있음 있음, 증가됨
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여러 세포배양계에서의 베로-MVA 및 야생형 MVA의 KID50/ml 증식율 [log10/ml]
세포 배양계 베로-MVA (31 회 베로-계대) 야생형 MVA (1차 닭 태아 섬유아세포에서의 575 회 계대)
1) 베로 (아프리카 녹색 원숭이의 신장세포) 8,0 4,5
1차 닭 태아 섬유아세포 4,5 8,5
1,2) HL (인간 폐) 3,0 2,5
1,2) HEP-2 (인간 편평세포암종) 3,0 2,5
1,2) HeLA (인간 자궁경부암) 2,75 2,75
1,2) BHK (햄스터 신장세포) 5,75 5,25
1,2) MDBK(소 신장세포) 3,5 3,5
1,2) PK-15 (돼지 신장세포) 3,25 3,5
1) 괄호 안의 조직 및 종으로부터 유래된 연속계대 세포주. 2) 의학 미생물학 연구소 (독일 뮌헨)의 컬렉션에서 구한 세포주.
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야생형 MVA (닭 태아 섬유아세포(CEF)내에서의 572 회 계대) 및 베로-MVA-200 (베로 세포 내에서의 200 회 계대)의 비교
마커 야생형 MVA 베로-MVA-200
유전적 마커(안카라에서 단리된 폭스 바이러스 균주와의 비교) 좌측 말단부위 (역방위 반복 말단) 에 3개의 결실 좌측 말단부위에 4개의 결실
게놈크기는 208 에서 178kb 로 감소됨 게놈크기가 172kb 로 추가 감소됨
최초 게놈 분자량의 15% 감소 최초 게놈 분자량의 20% 감소
인터페론 수용체의 소실 수용체, 예, IL-1β 의 수용체의 추가 소실
세포성 마커 T-헬퍼 세포 (CD4, CD8, CD25) 의 활성화 세포독성 T-임파구의 활성화 증가
NK 세포의 활성화 NK 세포의 활성화 증가
포유류 세포에서의 증식 실패 (BHK 세포 제외) 세포배양계 내 숙주스펙트럼의 추가 협소화
사이토카인 인터페론α, IL-2, IL-12 인터페론 α 및 γ, IL-1,2,12
바이러스 역가 CEF: 109,5KID50/ml 베로 세포: 104,0KID50/ml CEF: 104,5KID50/ml 베로 세포: 109,5KID50/ml
면역계 특이적 면역계의 활성 감소 비특이적 면역계의 활성 향상
인간 및 동물에 대한 독성 낮음 없음
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Figure 112002030069138-pct00001
Figure 112002030069138-pct00002
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Claims (39)

  1. 베로(Vero) 세포주의 세포 내에서 성장하도록 적응된, 변형된 백시니아 바이러스 안카라(modified vaccinia virus Ankara, MVA)의 약독화주로써,
    (a) 야생형 MVA를 베로 세포주의 세포에 감염시키는 단계;
    (b) 상기 감염된 세포에 의해 생산된 바이러스 입자를 수득하는 단계: 및
    (c) 상기 수득한 바이러스를 베로 세포주의 새로운 세포에 감염시키고 상기 세포로부터 생산된 바이러스를 수득하는 단계를 포함하며, 상기 단계 (c)가 바이러스 역가(titer)에 관한 '생성량(Output)/공급량(Input) 비'가 1을 초과할 때까지 반복되는 제조공정에 의해 수득되며,
    상기 야생형 MVA와 비교하여 하기의 특징을 갖는, MVA:
    (a) 닭 태아 섬유아세포에서의 최대 바이러스 역가가 104.5 KID50/㎖ 또는 그 미만임;
    (b) 베로 세포주의 세포에서의 바이러스 증식율에 관한 '생성량(Output)/공급량(Input) 비'가 1을 초과함; 및
    (c) 베로 세포주의 세포에서의 성장 적응 후 최대 바이러스 역가가 107.5 KID50/㎖ 또는 그 이상임(여기서 상기 '공급량'은 '베로 세포에 감염시키기 위해 최초로 사용된 바이러스의 양'이고, 상기 '생성량'은 '감염으로 생성된 바이러스 양'이다).
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  5. 제1항에 있어서,
    상기 베로 세포주는 베로 세포주 ATCC No. CCL-81인 것을 특징으로 하는 MVA.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 MVA가 유럽 세포배양물 기탁기관(ECACC) (Salisbury, UK)에 수탁번호 99101431로 기탁된 것임을 특징으로 하는 MVA.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 MVA가 유럽 세포배양물 기탁기관(ECACC) (Salisbury, UK)에 프로비저널 액서션 번호 01021411로 기탁된 것임을 특징으로 하는 MVA.
  8. 제1항, 또는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 이종성 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 MVA.
  9. 제8항에 있어서,
    치료 단백질 및 항원결정기를 코딩하는 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이종성 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 MVA.
  10. 삭제
  11. 제 1항에 따른 MVA 및 이 MVA의 DNA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 오르토폭스(Orthopox)에 의해 유발되는 감염성 질환에 대한 인간을 포함한 동물의 면역 반응을 유발하기 위한 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 백신인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 11항에 있어서,
    고양이 폭스 감염에 대해 고양이를, 팔다리결손증 감염에 대해 생쥐를, 또는 낙타 폭스 감염에 대해 낙타를 면역화시키기 위한 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  16. 제11항에 있어서,
    MVA 및 이 MVA의 DNA는 비특이적 면역계의 활성제, 억제제 및 안정화제 중 하나 이상으로 작용하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  17. 제1항에 따른 MVA 및 이 MVA의 DNA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 항원보강제(adjuvant)로서 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 시스템 촉진용 약제학적 조성물.
  18. 제8항에 따른 재조합 MVA 및 이 재조합 MVA의 DNA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 치료용 약제학적 조성물.
  19. 삭제
  20. 타겟 세포를 제8항에 따른 MVA로 감염시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 동종성 또는 이종성 핵산 서열을 인체 세포를 제외한 타겟 세포에 도입하는 방법.
  21. 베로(Vero) 세포주의 세포 내에서 성장하도록 적응된, 변형된 백시니아 바이러스 안카라(modified vaccinia virus Ankara, MVA)의 약독화주를 수득 또는 제조하기 위한 방법으로써,
    (a) 야생형 MVA를 베로 세포주의 세포에 감염시키는 단계,
    (b) 상기 감염된 세포에 의해 생산된 바이러스 입자를 수득하는 단계, 및
    (c) 상기 수득한 바이러스를 베로 세포주의 새로운 세포에 감염시키고 상기 세포로부터 생산된 바이러스를 수득하는 단계를 포함하며, 상기 단계 (c)가 바이러스 역가(titer)에 관한 '생성량(Output, 감염으로 생성된 바이러스 양)/공급량(Input, 베로 세포에 감염시키기 위해 최초로 이용된 바이러스 양) 비'가 1을 초과할 때까지 반복됨을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 야생형 MVA가 유럽 세포배양물 기탁기관(ECACC)(Salisbury, UK)에 기탁번호 V94012707로 기탁된 MVA임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1항, 또는 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 MVA의 바이러스 입자를 생산하는 방법으로서,
    (a) 베로 세포주의 세포를 배양하는 단계;
    (b) 제 1항, 또는 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 MVA를 상기 세포에 감염시키는 단계; 및
    (c) 상기 감염된 세포로부터 생산된 바이러스 입자를 수확하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 핵산서열, 펩티드 및 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 인자를 제조하는 방법으로서,
    (a) 제 8항에 따른 재조합 MVA로 숙주세포를 감염시키는 단계,
    (b) 상기 감염된 숙주세포를 배양하는 단계, 및
    (c) 상기 숙주세포에 의해 생산된 핵산서열, 펩티드 또는 단백질 중 어느 하나를 단리하거나, 농축하거나, 단리하고 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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  32. 인체를 제외한 동물의 생체를 면역화시키는 방법으로서, 필요한 동물의 체내에 치료학적 유효량의 제11항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 동종성 또는 이종성 핵산서열을 인체 세포를 제외한 타겟 세포에 도입하는 방법으로서, 타겟 세포를 제8항에 따른 MVA 및 이 MVA의 DNA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 감염시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 인체를 제외한 동물 생체의 비특이적 면역계의 활성화, 억제 또는 안정화 방법으로서, 제16항에 따른 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 백신 내의 항원결정기에 대한 특이적 면역반응을 강화하는 방법으로서, 제1항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 MVA를 항원보강제로서 인체를 제외한 동물의 생체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 유럽 세포배양물 기탁기관(ECACC)(Salisbury, UK)에 수탁번호 99101431로 기탁된 MVA.
  37. 유럽 세포배양물 기탁기관(ECACC)(Salisbury, UK)에 프로비저널 액서션 번호 01021411로 기탁된 MVA.
  38. 제 1항에 있어서, 상기 야생형 MVA가 유럽 세포배양물 기탁기관(ECACC)(Salisbury, UK)에 기탁번호 V94012707로 기탁된 MVA임을 특징으로 하는 MVA.
  39. 제 1항에 있어서, 상기 특징 (c)의 최대 바이러스 역가가 107.5 내지 1010.0 KID50/㎖임을 특징으로 하는 MVA.
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