CZ293690B6 - Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) - Google Patents

Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) Download PDF

Info

Publication number
CZ293690B6
CZ293690B6 CZ20023061A CZ20023061A CZ293690B6 CZ 293690 B6 CZ293690 B6 CZ 293690B6 CZ 20023061 A CZ20023061 A CZ 20023061A CZ 20023061 A CZ20023061 A CZ 20023061A CZ 293690 B6 CZ293690 B6 CZ 293690B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
mva
ankara
vaccinia virus
modified
type
Prior art date
Application number
CZ20023061A
Other languages
English (en)
Inventor
Anton Mayr
Original Assignee
Bavarian Nordic A/S
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bavarian Nordic A/S filed Critical Bavarian Nordic A/S
Publication of CZ293690B6 publication Critical patent/CZ293690B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C12N7/08—Inactivation or attenuation by serial passage of virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A61K39/285—Vaccinia virus or variola virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24161—Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Řešení se týká nových kmenů modifikovaného viru vakcinie typu Ankara, které mají silně sníženou virulenci pro většinu savců, zejména lidí, ale přesto rostou v buňkách kontinuální buněčné linie. Jsou to kmeny modifikovaného viru vakcinie typu Ankara adaptované pro růst v buňkách buněčné linie Vero. Řešení dále zahrnuje způsob přípravy adaptovaných kmenů MVA. Dále se řešení týká vakcíny pro imunizaci živého živočišného organizmu včetně lidského obsahující tyto nové kmeny MVA. Adaptovaný modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) lze použít například pro parenterální imunizaci, jako vektorový systém, nebo v aktivované nebo inaktivované formě jako pomocnou látku, nebo jako regulátor nespecifických složek imunitního systému.ŕ

Description

Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA)
Oblast techniky
Předložený vynález se týká nových kmenů modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (Modified Vaccinia Virus Ankara - MVA), který má silně sníženou virulenci pro většinu savců, zejména lidí, ale nicméně roste v buňkách kontinuální buněčné linie schválené pro přípravu terapeutického přípravku, jako je vakcína. Vynález se dále týká způsobu přípravy adaptovaných kmenů MVA. MVA lze použít například k parenterální imunizaci, jako vektorový systém, nebo v aktivní nebo inaktivované formě jako pomocnou látku nebo jako regulátor nespecifických složek imunitního systému.
Dosavadní stav techniky
Organismus je neustále vystaven účinku infekčního prostředí činidel jako jsou bakterie, viry, houby nebo paraziti. Imunitní systém chrání organizmus od permanentní infekce způsobené těmito činidly destrukci a eliminaci těchto infekčních činidel a toxických molekul, které produkují. Imunitní systém lze rozdělit na část specifickou a část nespecifickou i když obě jsou velmi úzce svázány. Nespecifická imunitní odpověď umožňuje okamžitou obranu proti širokému rozsahu cizorodých látek a infekčních činidel. Naproti tomu specifická imunitní odpověď je zvýšena až ve zpožděné fázi, když organizmus je vystaven účinku látky poprvé. Avšak specifická imunitní odpověď je vysoce účinná. Specifická imunitní odpověď zodpovídá za skutečnost, že jednotlivec, který se uzdraví ze specifické infekce je proti této infekci chráněný, ale stále náchylný na jiné infekční nemoce. Všeobecně druhá infekce tím samým nebo podobným infekčním činidlem způsobuje slabší příznaky nebo vůbec žádné. Imunita přetrvává dlouhou dobu, v některých případech také po celý život. Tato imunologická paměť je použita pro vakcinaci, kde organizmus je vystaven účinku neškodné nebo inaktivované formy infekčního činidla za účelem vyvolání specifické imunity. Někdy se do vakcín zabudují pomocné přísady, aby se zvýšila specifická imunitní odpověď.
Mnoho ze znalostí o infekčních nemocích a imunitě pochází ze studia pravých neštovic. Nemoc je způsobena virem variola, členu z rodu orthopoxvirů. Skoro před dvěma stoletími bylo zahájeno profylaktické očkování kravskými neštovicemi, jehož výsledkem bylo očkování proti pravým neštovicím. Pozdější imunizace byla provedena virem vakcinie. Začátkem padesátých let minulého století mnohé průmyslové země, vymýtily endemické pravé neštovice za použití vakcinace s virem vakcinie. Avšak, vakcinaci pravých neštovic virem vakcinie došlo někdy k vážným komplikacím, jako post-vakcinační encefalitidě, generálizováným pravým neštovicím nebo kontaktní infekci.
Nová vakcína, která nevykazuje tyto nevýhody byla vyvinuta Antonem Mayrem. Vakcína proti neštovicím sestává z poxviru označeného jako Modifikovaný Virus Vakcinie typu Ankara (Modified Vaccinia Virus Ankara -MVA) a byla použita pro parenterální vakcinaci proti pravým neštovicím v asi 150 000 případech bez toho, že by způsobila jakékoliv komplikace v souvislosti s vakcinaci. Ani děti s imunologickými nedostatečnostmi nevykazovaly žádné vedlejší účinky. Tento modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) byl získán mutaci a selekcí původního viru vakcinie typu Ankara po 575 pasážích ve fibroblastových kulturách kuřecích embryí. Bezpečnost tohoto modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) je prokázaná jeho biologickými, chemickými a biologickými charakteristikami. Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) má sníženou molekulovou hmotnost, šest delecí v genomu, a je silně oslabený pro savčí buňky, například DNA a protein jsou syntetizovány ale ve skutečnosti nejsou produkované žádné virové částice (partikule). Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara(MVA) vyvinutý Antonem Mayrem byl uložený v Evropské sbírce mikroorganizmů (ECACC), Salisbury, UK, pod číslem V 94012707.
-1 CZ 293690 B6
Očkování proti pravým neštovicím bylo velice úspěšné. V roce 1979 vyhlásila Světová zdravotnická organizace pravé neštovice za vymýcené. Vzhledem k tomu bylo hromadné očkování dětí přerušené a očkovány jsou jen laboratorní pracovníci a členové ozbrojených složek v některých 5 zemích.
Vymýcením pravých neštovic byla odstraněna hlavní příčina infekci neštovic u lidí. Avšak některé viry neštovic netypické pro lidi mají sníženou specificitu na hostitele tj. způsobují infekce nejen u svého specifického hostitele např. kravské neštovice u krávy, ale také u jiných zvířat ío například potkanů a koček. Touto cestou mohou být také infikováni lidé. Protože část populace již není imunní proti pravým neštovicím mohou být pro ně infekce viry neštovic některých druhů zvířat nebezpečné. Hlavním zdrojem nákazy pro lidi jsou domácí zvířata. Vzhledem k tomu má rostoucí význam očkování domácích zvířat proti virům neštovic. Navíc může být modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) významný jako vektor v genové terapii tj. přenáší sekvence 15 nukleových kyselin do cílové buňky, kde jsou exprimovány.
Pro logaritmické rozmnožování modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) jsou zapotřebí buněčné kultury primárních nebo sekundárních fibroblastů kuřecích embryí. Buňky se získají z kuřecích vajec inkubovaných 10 až 12 dní. Protože vajíčka jsou biologicky proměnná, 20 také buňky získané pro systém buněčné kultury jsou proměnné, na buněčné úrovni. Navíc ve fibroblastové kultuře kuřecích embryí jsou často nalezeny jiné typy buněk jako buňky epiteliální. Tato změna buněk má za následek také změnu virů produkovaných ve fibroblastech kuřecích embryí. Proto je těžké standardizovat a potvrdit systém buněčných kultur a zaručit konstantně vysokou kvalitu produkovaného modifikovaného viru vakcinie Ankara (MVA). Dále nemůže být 25 úplně vyloučena kontaminace systému buněčných kultur mikroorganizmy nebo viry, které již jsou přítomny v inkubovaném vajíčku. Když se modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) pěstuje na buňkách kontaminovaných viry může se tento rekombinovat s kontaminujícím virem. Přitom se může generovat modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) s novými a nepředvídatelnými charakteristikami. Pro výrobu viru ve velkém v suspenzí kultuře, nejsou 30 nejvhodnější primární nebo sekundární fibroblasty kuřecích embryí. Čistění a koncentrování modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) ultracentrifugou by bylo výhodné. Avšak takovéto čištění je těžké, když se modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) kultivuje na primárních nebo sekundárních fibroblastech kuřecích embryí. Navíc se u vzrůstajícího počtu pacientů vyvinula alergie na albumin z kuřecích embryí. Přestože in vitro podmínky kultivace 35 velmi silně redukují alergický potenciál, riziko alergické reakce nelze úplně vyloučit.
Takže na jedné straně lze modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) účinně pěstovat jenom na primárních nebo sekundárních fibroblastech kuřecích embryí způsobujících řadu nevýhod, ale na druhé straně byla ukázaná bezpečná rozsáhlá aplikace modifikovaného viru 40 vakcinie typu Ankara (MVA) u lidí jeho rozsáhlou aplikací jako vakcíny.
Cílem předloženého vynálezu je poskytnutí podmínek pro výrobu homogenních virových částic modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA), tj. podmínek jež umožní snadnou výrobu modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) ve velkém.
K dosažení předchozího a jiných výhod, předložený vynález poskytuje kmen modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA), který je adaptovaný pro pěstování na kontinuálních buněčných liniích, které jsou schváleny pro výrobu terapeutických přípravků.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je změněný kmen modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) adaptovaný pro růst v buňkách kontinuální buněčné linie, získatelný vymezeným počtem
-2CZ 293690 B6 pasáží zahrnujících a) infikování buněk buněčné linie Věro a b) sběr virových částic produkovaných uvedenými buněčnými liniemi, přičemž počet pasáží je 100 nebo 200.
Význakem předmětného vynálezu je dále, že buněčnou linií je buněčná linie Věro ATCC č. CCL-81.
Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle předmětného vynálezu je uložený v ECACC pod číslem 99101431.
Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle předmětného vynálezu je uložený v ECACC pod číslem 01021411.
Význakem vynálezu je dále, že modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle předmětného vynálezu může obsahovat alespoň jednu heterologní sekvenci nukleové kyseliny s výhodou heterologní sekvenci nukleové kyseliny jíž je gen kódující terapeutický protein a/nebo antigenní determinantu.
Dalším význakem vynálezu je hostitelská buňka infikovaná modifikovaným virem vakcinie typu Ankara (MVA) podle předmětného vynálezu.
Význakem vynálezu je dále vakcína pro imunizaci živého živočišného organizmu včetně lidského obsahující MVA podle předmětného vynálezu.
Vakcína podle vynálezu je určena zejména pro imunizaci proti orthopox infekci.
Vakcína pro imunizaci koček proti kočičím neštovicím, myší proti ektromelii a/nebo velbloudů proti velbloudím neštovicím.
Vynález dále zahrnuje farmaceutickou kompozici, obsahující MVA podle předmětného vynálezu.
Význakem vynálezu je dále farmaceutická kompozice, obsahující MVA jako aktivátor, potlačovatel a/nebo stabilizátor nespecifického imunitního systému.
Dalším význakem vynálezu je farmaceutická kompozice obsahující modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) jako kostimulátor imunitního systému nespecifickým způsobem.
Význakem vynálezu je také způsob získání kmene modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) podle předmětného vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se
a) buňky buněčné linie Věro infikují standardním typem MVA, s výhodou MVA uloženého v ECACC pod číslem V94012707,
b) provede sběr virů, načež se
c) čerstvé buňky stejné buněčné linie infikují nově produkovanými viry,
d) a poté se kroky b) a c) opakují až do dosažení adaptace virů na růst v buňkách řečené buněčné linie.
Dále je význakem vynálezu způsob pomnožení modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) pro přípravu virových Částic MVA podle předmětného vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se
a) buňky buněčné linie Věro kultivují za vhodných podmínek,
- J CZ 293690 B6
b) tato buněčná linie se infikuje modifikovaným virem vakcinie typu Ankara (MVA) a
c) sbírají se virové částice produkované těmito buňkami.
Při způsobu pomnožení modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) podle vynálezu se buněčná linie s výhodou infikuje modifikovaným virem vakcinie typu Ankara (MVA) podle předmětného vynálezu uloženým v ECACC pod číslem 99101431 nebo MVA uloženým v ECACC pod číslem 01021411.
Vynález dále zahrnuje použití modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) podle předmětného vynálezu pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení nebo prevenci nemoci nebo poruchy, která reaguje na MVA.
Dále vynález zahrnuje použití modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) podle předmětného vynálezu pro výrobu farmaceutické kompozice obsahující MVA jako aktivátor, potlačovatel a/nebo stabilizátor nespecifického imunitního systému.
Vynález rovněž zahrnuje použití modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) podle předmětného vynálezu pro výrobu farmaceutické kompozice obsahující MVA jako kostimulátor imunitního systému nespecifickým způsobem.
Význakem vynálezu je také použití modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) podle předmětného vynálezu pro výrobu vakcíny pro imunizaci živých zvířecích organizmů, včetně lidských.
Dále je význakem vynálezu modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle předmětného vynálezu pro použití jako vakcína pro imunizaci živého zvířecího organizmu včetně lidského.
Význakem vynálezu je dále modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle předmětného vynálezu pro použití jako aktivátor, potlačovatel a/nebo stabilizátor nespecifického imunitního systému živého zvířecího organizmu včetně lidského a pro použití jako kostimulátor imunitního systému nespecifickým způsobem pro zvýšení specifické imunitní odpovědi na antigenní determinantu ve vakcíně.
Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle předloženého vynálezu může také obsahovat alespoň jednu heterologní sekvenci nukleové kyseliny kódující například terapeutický protein a/nebo antigenní determinantu jako je peptid imunizující proti infekci malárii, hepatitidě a/nebo vzteklině.
Kompozice, s výhodou farmaceutická kompozice může kromě výše popsaného MVA obsahovat MVA a/nebo DNA této MVA. Farmaceutická kompozice může obsahovat modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) a/nebo DNA modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) jako pomocnou látku. Farmaceutická kompozice může obsahovat rekombinantní modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) a/nebo DNA rekombinantního modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA). Popsaná farmaceutická kompozice může být použita v genové terapii.
Způsob přípravy sekvence nukleové kyseliny, peptidů, polypeptidu a/nebo proteinu, zahrnuje infikování hostitelské buňky výše popsaným rekombinantním modifikovaným virem vakcinie typu Ankara (MVA), kultivaci infikované hostitelské buňky za vhodných podmínek a podle potřeby izolaci a/nebo obohacení sekvence nukleové kyseliny, peptidů a/nebo proteinu produkovaného hostitelskou buňkou.
Imunizace živého zvířecího organizmu včetně lidského, spočívá v podávání terapeuticky účinného množství výše popsané farmaceutické kompozice potřebné osobě.
-4CZ 293690 B6
Zavedení homologické a/nebo heterologní sekvence nukleové kyseliny do cílové buňky zahrnuje infikování cílové buňky výše popsaným modifikovaným virem vakcinie typu Ankara (MVA) a/nebo DNA modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA).
Aktivace, potlačení a/nebo stabilizace imunitního systému živého zvířecího organizmu včetně lidského spočívá v podávání výše uvedené farmaceutické kompozice živému zvířecímu organizmu včetně lidského.
Zvýšení specifické imunitní odpovědi na antigenní determinantu ve vakcíně spočívá v podávání modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) jako pomocné látky živému zvířecímu organizmu, včetně lidského.
Podle předloženého vynálezu je poprvé možná efektivní výroba modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) ve velkém. Protože buňky kontinuální buněčné linie jsou homogenní a jejich charakteristiky jsou stabilní, také vlastnosti modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) jsou homogenní a předvídatelné. Dále riziko kontaminace mikroorganizmy může být hlídané a kontaminace modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) proteiny z kuřecího vejce, lze vyloučit jak bylo zjištěno při kultivaci modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) na fibroblastech kuřecích embryí. Manipulace s permanentní buněční linii je pohodlná a proto velice výhodná pro průmyslovou aplikaci.
Ve výhodném provedení podle vynálezu, modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) je adaptovaný pro pěstování v buňkách savčí buněčné linie, která je schválená pro výrobu vakcíny. Bylo s překvapením zjištěno, že modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) adaptovaný na savčí buněčnou linii jako je buněčná linie Věro má sníženou virulenci pro lidi a také pro široký okruh jiných savců. Podle toho je virus vakcinie typu Ankara (MVA) silně oslabený tj. DNA a protein jsou syntetizovány, ale ve skutečnosti nejsou produkovány žádné virové Částice, čehož výsledkem je skutečnost, že je eliminována schopnost vyvolání nemoci. Vzhledem ktomu je modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle vynálezu také velice vhodný jako vakcína pro lidi a pro široký okruh savců. Proto je také modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) speciálně použitelný ve veterinární oblasti.
Dále je předložen způsob získání kmene modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) podle vynálezu. Podle tohoto význaku vynálezu jsou buňky buněčné linie schválené pro výrobu terapeutické substance infikovány standardním typem modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA). S výhodou se používá vysoká multiplicita infekce (MOI- Multiplicity of Infection) tj. pro tuto infekci se používá velký počet virů na jednu buňku. Potom se viry sesbírají a čerstvé buňky tytéž buněčné linie se infikují nově produkovanými viry. Tento postup se opakuje (sériové pasážování) dokud není modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) adaptovaný na uvedenou buněčnou linii. Adaptace se dosáhne, když po 72 hodinách po infekci, je titr viru alespoň o 1- až 9- násobě, s výhodou, 10- až 99- násobně, nejvýhodněji 100 až 106 násobně a nej výhodněji 107 až 1010 násobně zvětšený v porovnání s výchozím titrem viru. Adaptace se dosáhne po vymezeném počtu pasáží.
„Adaptovaný k růstu“ (pěstování) znamená, že množství virů produkovaných z jedné infekce (výstup) je zvětšeno v porovnání s množstvím virů původně použitých k infikování buněk (vstup). V tomto případě je poměr výstup/vstup větší jako 1.
„Derivát“ modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) deponovaného ve sbírce mikroorganizmů ECACC, Salisbury, UK pod číslem 99101431 a/nebo pod číslem 01021311 značí modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) adaptovaný pro růst na Věro buňkách rychlostí, která je v podstatě stejná jako rychlost růstu deponovaného kmene, ale má alespoň jeden rozdíl v genomu v porovnání s deponovaným kmenem.
-5 CZ 293690 B6
Termín „imunitní systém“ v zásadě označuje komplex mechanizmů zúčastňujících se obrany organizmu proti cizorodým látkám a mikroorganizmům. Je rozdělený na část buněčnou zahrnující různé typy buněk jako lymfocyty a jiné buňky odvozené od buněk bílých krvinek, a část humorální zahrnující peptidy a proteiny jako protilátky, komplementové faktory a cytokiny.
Termín „imunitní odpověď“ označuje reakci imunitního systému když do organizmu vnikne cizorodá látka nebo mikroorganizmus. Obecně je imunitní odpověď rozdělena na specifickou a nespecifickou reakci i když obě jsou úzce svázané. Nespecifická odpověď je okamžitá obrana vůči širokému spektru cizorodých látek a infekčních činidel. Specifická imunitní odpověď může být charakterizovaná jako vysoce účinný obranný mechanizmus organizmu proti cizorodé látce, která je vyvolaná proti uvedené látce po časové prodlevě a je vysoce specifická pro danou látku. Specifická imunitní odpověď je odpovědna za fenomén, že jedinec, který překonal specifickou infekci je proti této infekci v budoucnu chráněn.
„Aktivátor imunitního systému“ znamená jakoukoliv látku, která je schopna vyprovokovat nebo zlepšit imunitní odpověď.
„Potlačovatel imunitního systému“ znamená jakoukoliv látku, která je schopná snížit nebo inhibovat imunitní odpověď.
„Stabilizátor imunitního systému“ znamená jakoukoliv látku, která je schopná udržet imunitní odpověď na konstantní úrovni.
Vynálezce předkládá dva výhodné kmeny modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA), které jsou adaptované na buněčnou linii afrických zelených opic (kočkodanů) označovaná jako buněčná linie Věro (ATCC č. CCL-81 (Američan Type Culture Collection No. CCL-81)). Kmen modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) pasážovaného na Věro buňkách 100 krát byl označený jako „Vero-MVA“ a uložený v Evropské sbírce mikroorganizmů, Salisbury, UK, pod číslem 99101431. Kmen MVA po 200 pasážích na Věro buňkách byl nazván „Vero-MVA-200“ a uložený v Evropské sbírce mikroorganizmů, Salisbury, UK, pod číslem 01021411.
Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA), získaný jak popsáno výše je dále amplifikovaný kultivací buněk schválených buněčných linií za vhodných podmínek, infikováním buněk s MVA a sesbíráním (sklizením) produkovaných virových částic. Takto může být MVA účinně a lehce rozšiřován ve velkém. Překvapující je, že modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle vynálezu nevykazuje zvýšenou virulenci v jiných buňkách než Věro buňkách, například lidských buněčných liniích, včetně HL, HEP-2 nebo HeLA.
Dalším význakem předloženého vynálezu je modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) obsahující alespoň jednu heterologní sekvenci nukleové kyseliny tj. sekvenci nukleové kyseliny, která se přirozeně nenachází v genomu MVA (rekombinantní MVA). S výhodou je heterologní sekvence nukleové kyseliny gen, výhodněji gen kódující imunizační protein a nejvýhodněji kódující imunizační protein proti malárii, vzteklině a/nebo hepatitidě. Exprese uvedené heterologní sekvence nukleové kyseliny je s výhodou pod transkripční kontrolou promotoru viru vakcinie, s výhodou MVA promotoru. Dalším význakem vynálezu je, že heterologní sekvence nukleové kyseliny je vložená v přirozeně se v MVA genomu vyskytujícím místě delece (viz PCT/EP96/02926).
Rekombinantní modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) se používá k zavedení sekvence nukleové kyseliny do cílové buňky, přičemž sekvence nukleové kyseliny je k cílové buňce homologická nebo heterologní. Zavedení heterologní sekvence nukleové kyseliny do cílové buňky se může použít k výrobě heterologních nukleových kyselin, peptidů a/nebo polypeptidů a/nebo proteinu kódovaných uvedenou sekvenci nukleové kyseliny in vitro. Tato metoda zahrnuje infikování hostitelské buňky rekombinantní MVA, kultivaci infikované hostitelské buňky za
-6CZ 293690 B6 vhodných podmínek a podle volby izolace a/nebo obohacení peptidu a/nebo proteinu produkovaného řečenou hostitelskou buňkou.
Navíc, zavedení homologické nebo heterologní sekvence může být použito k in vitro a výhodně k in vivo genové terapii. Pro in vitro a ex vivo genovou terapii, se izolují buňky z jedince, který má být ošetřen, transformují se s rekombinantním modifikovaným virem vakcinie typu Ankara (MVA) a vrátí jedinci, od kterého byly buňky odebrány. Pro in vivo genovou terapii se rekombinantní MVA přímo podává živému živočišnému tělu včetně lidského těla. Podle výhodného provedení vynálezu rekombinantní MVA exprimuje antigen nebo antigenní epitop. V nejvýhodnějšim provedení uvedený vektor exprimuje antigenní determinantu Plasmodia falciparum, Mycobacteria, Herpes virus, Influenza virus, hepatitidy, nebo viru získaného selhání imunity (HIV).
Protože modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle vynálezu je překvapivě stále ještě silně oslabený, je MVA ideální k imunizaci širokého výběru savců, včetně lidí. Tímto předložený vynález poskytuje vakcínu obsahující MVA pro imunizaci živých zvířat, včetně lidí proti infekci poxviry, zejména orthopoxviry. Vakcína může kromě MVA obsahovat jednu nebo dvě přísady jako antibiotikum, konzervační prostředek nebo stabilizátor. Vakcína je zejména použitelná ve veterinární oblasti například k imunizaci zvířat proti neštovicovým infekcím jako koček proti kočičím neštovicím, myší proti ektromelii nebo velbloudů proti velbloudím neštovicím. Imunizace se s výhodou provádí parenterálně.
Imunizační účinek antigenní determinanty ve vakcíně je často posílený přidáním tzv. pomocné látky - adjuvans. Pomocná látka působí jako kostimulátor imunitního systému nespecifickým způsobem, vyvolávajíce silnější specifickou imunitní reakci proti antigenní determinantně vakcíny. Podle dalšího provedení vynálezu se modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) používá jako pomocná látka - adjuvans- ke kostimulaci imunitní odpovědi proti antigenní determinantě nějaké vakcíny. V tomto případě je výhodnější, když je modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) inaktivovaný. Inaktivace modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) se provádí buď teplem, nebo chemikáliemi. Výhodná je inaktivace MVA β-propiolaktonem. Podle tohoto provedení vynálezu se může přidat k vakcínám proti řadě infekčních nemocí ke zvýšení imunity vůči nim.
V případě infekce úzce spolupracují imunitní, nervový, hormonální a vaskulámí systém jedince. Tyto interakce mohou být regulovány prvky nespecifického imunitního systému, například cytokiny jako jsou interferony a interleukiny. Viry neštovic mohou ovlivnit regulaci imunitního systému (Swiss Vet. 11/99, 13-17). Podle dalšího provedení vynálezu je modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA), a to s výhodou inaktivovaný, používaný u savců včetně lidí k regulaci buněčných a humorálních elementů nespecifického (vrozeného) imunitního systému. Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) se s výhodou používá jako bio-regulátor, přičemž dysfunkce imunitního systému jsou eliminovány a vlastní obranný mechanizmus organizmu těla je aktivovaný, stabilizovaný a/nebo potlačený. Velmi výhodné je použití modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) jako bio-regulátoru v případě virových infekcí například herpesviry, viry hepatitidy B nebo C, v případě chronických zánětlivých nemocí a/nebo na podporu nádorové terapie. MVA lze rovněž použít na stabilizaci imunitního systému v případě zvýšené náchylnosti k infekcím jako v případě stresu nebo u novorozenců. Aktivní a/nebo s výhodou inaktivovaný modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) může být aplikovaný systemicky například intramuskulárně a/nebo lokálně přes sliznice a/nebo kůži.
Závěrem lze říct, že předložený vynález poskytuje kmeny modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA), které lze použít ve stejných aplikacích jako standardní typ MVA ale eliminují problémy, způsobené amplifikaci standardního typu MVA ve fibroblastech kuřecích embryí.
-7CZ 293690 B6
Příklady provedení
Následující příklady ilustrují předložený vynález aniž se na ně omezuje. Lidem znalým v oboru je jasné, že uvedená technologie není omezena jen na tyto příklady.
Příklad 1
Adaptace modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) na Věro buňky a charakterizace uvedeného kmene (MVA)
1. Adaptace modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) na Věro buňky
Standardní typ MVA vyvinutý Antonem Mayrem, kterým je modifikovaný vir vakcinie typu Ankara, byl uložený v Evropské sbírce mikroorganizmů (ECACC) pod číslem V94012707. Standardní typ MVA byl adaptovaný k růstu na Věro buňkách mnohonásobným pasážováním viru na Věro buňkách (tab. 1). Klon buňky ATCC-č. CCL-81 stacionární buněčné linie Věro (WHO banka buněk (seed stock ECACC č. 88020401) byl použitý v pasáži č. 148 až 165 (WHO očkovací šarže (seed lot), Master and Working Bank). Buňky byly pomnoženy v médiu sestávajícím zEarlova MEM činidla (ICN), pH 7,4 až 7,6 a 5 % sérové náhrady BMS (Biochrom). Technikou známou pro znalé v oboru, byly vždy stejné buňky z šarže (Working Bank) naočkovány dělením buněk 1:2 až 1:4. Médium obsahovalo přibližně 250 000 buněk na ml. Buňky byly pomnoženy ve zkumavkách (2ml), na Rouxových miskách (lOOml) a plastikových miskách (6 a případně 40ml). Buňky vytvořily po 16 až 24 hodinách souvislou vrstvu skládající se z jedné řady buněk tzv. jednovrstevný porost. Potom bylo médium nahrazeno čistým Earlovým MEM činidlem bez přísad.
Pro adaptaci standardního typu MVA byl použitý kultivační systém ve zkumavkách. Výsledky pasáží jsou shrnuté v tab. 1 a tab. 2. Věro buňky byly infikovány s 10 MOI (multiplicita infekce) standardního MVA, v průměru 10 virových částic na jednu Věro buňku. Standardní typ MVA, se kterým se začalo pracovat byl geneticky homogenní, čištěný MVA po 575 pasážích ve fibroblastech kuřecích embryí (titr: 107’75 KIDso/ml). Po 24 hodinách 90 % Věro buněk, ze souvislé vrstvy skládající se zjedné řady buněk (jednovrstevný porost) bylo zničeno toxickými procesy (50% toxicitou, 40% lýzou). Médium a povrch buněk po zmrazení a rozmražení buněk, obsahující produkované viry, byl sebrán a 0,2ml směsi byly naočkovány na jednovrstvový porost Věro buněk v kultivačních zkumavkách (2. pasáž). Tento postup byl zopakován 200 krát. Po třetí pasáži již nebyl pozorován žáden toxický účinek, zatímco byl pozorován mírný cytopatický efekt (CPE) charakterizovaný zaokrouhlením buněk a lyži v období 4 až 6 dnů po infekci (p.inf.). Titr viru byl 101,0 KID5o/ml. Usoudilo se, že začala proliferace MVA ve Věro buňkách avšak velmi málo účinně. Po páté pasáži, byl pozorován typický cytopatický efekt (CPE), který byl dokončen po 4 až 5 dnech po infekci (p.inf.). Titr viru se zvýšil z 1O1,0 KID5o/ml pro třetí pasáži na 1O4 0 KID5o/ml po páté pasáži. Podle toho se virus již amplifikoval účinněji ve Věro buňkách. V pasážích č. 5 až 11 byl dokončený cytopatický efekt pozorován stále dříve a titr viru vzrostl s každou pasáží. Při pasáži č. 11 byla dosažena hladina 107’5 KID5o/ml. Podle toho po jedenácti pasážích byla dosažena adaptace MVA na Věro buňky. V následujících dalších 30 pasážích byly výsledky pro každé pasáže stejné a vysoce reprodukovatelné: cytopatický efekt (CPE) začal již 24 hodin po infekci (p.inf.) a všechny buňky byly zasaženy po třech dnech po infekci (p.inf.). Přitom 20 % Věro buněk bylo zaokrouhlených a 80 % lyžovaných. Po třech dnech po infekci (p.inf.) byl titr víru pořád kolem 107’73 KID50/ml. Po patnácté pasáži byly viry vždy sebrány po dvou až třech dnech po infekci a jenom 1 MOI namísto 10 MOI bylo použito pro infikování buněk (tab. 2). V následujících dodatečných pasážích se růstové charakteristiky MVA měnily jen slabě. Pozoruhodné je, že optimální titr viru se dále zvýšil a dosáhl 1010 KIDjo/ml při 200. pasáži.
-8CZ 293690 B6
Závěrem lze říct, že virus roste na Věro buňkách reprodukovatelně exponenciálně. Uvedená růstová charakteristika je překvapivě odlišná od charakteristik standardního typu MVA. Podle toho lze říct, že opakujícím se pasážováním byl získán nový kmen. Tento nový kmen byl označen jak „Vero-MVA“ a po 200. pasáži na Věro buňkách jako „Vero-MVA-200“.
Vero-MVA a Vero-MVA-200 byly kultivovány ve větším množství. Pro skladování byl VeroMVA koncentrován odstředěním, resuspendováním v 2,5% polygelinu a lyofilizován v 2ml lékovkách. Titr po lyofilizaci byl stále nejméně 108,5 KIDso/ml. Lyofilizovaný Vero-MVA a Vero-MVA-200 byly kontrolovány na nečistoty a toxicitu a skladovány při +4 °C.
2. Charakterizace biologických vlastností Vero-MVA
Biologické vlastnosti Vero-MVA (pasáž 100) a Vero-MVA-200 (pasáž 200) byly porovnávány s charakteristikami standardními typu MVA (tabulka 3 a tabulka 5). Přitom byly použité techniky známé odborníkům v oboru. Vynálezce ukázal, že se nezměnilo ani spektrum hostitele viru mimo pro Věro buňky, ani nebyl zvýšená virulence pro lidi nebo zvířata. Vero-MVA je charakterizovaný abortivním rozmnožováním vnepermisivních hostitelských buňkách.
Základní identita virových částic (partikulí) Vero-MVA ve srovnání s virovými částicemi (partikulemi) viru vakcinie kmene Elstree byla ukázaná zkříženou reaktivitou protilátek vyvolaných proti kmeni Elstree. Kmen Elstree je kmen vakcinie doporučený Světovou zdravotnickou organizací (WHO) pro očkování proti pravým neštovicím. Polyklonální hyperimunní sérum králíků proti kmeni Elstree bylo přidáno k Vero-MVA. lOOKID5o/ml Vero-MVA bylo úplně neutralizováno při zředění séra 1:512. Dvojnásobné zředění séra bylo potřebné k neutralizaci stejného množství kmene Elstree viru vakcinie (1:256). Podle toho Vero-MVA může být účinné neutralizován sérem imunním proti vakcinie.
Vero-MVA, Vero-MVA-200 a standardní typ MVA byly porovnány v řadě dalších testů ukázaných v tabulkách 3, 4 a 5. Ukazuje se, že virulence Vero-MVA, Vero-MVA-200 pro savce, včetně lidí není zvýšená ve srovnáním se standardním typ MVA. Bylo rovněž ukázáno, že Vero-MVA a Vero-MVA-200 nejsou pro savce včetně lidí nakažlivé nebo toxické. Bylo překvapující, že Vero-MVA byl víceméně identická co do specifičnosti se standardním typem MVA kromě pro Věro buňky: Vero-MVA se v buňkách lidských buněčných liniích (viz tabulka 4: HL-, HEP-2-, a HeLa-buňky) amplifikuje skoro tak neúčinně jako standardní typ MVA. Přesto, že lidské buňky a buňky afrických zelených opic (kočkodanů) jsou fylogeneticky úzce příbuzné, u Vero-MVA buněk nebyla zjištěna schopnost amplifikace v lidských buňkách. Ani v dalších testech nebyly viděny podstatné rozdíly.
Dále byly srovnávány fyzikální, chemické a biologické charakteristiky standardního typu MVA a Vero-MVA (tabulka 5). Zatímco standardní typ MVA pěstovaný na buněčných kulturách fibroblastů kuřecích embryí má ve srovnání s genomem viru pravých neštovic původně izolovaného v Ankaře, tři delece v levé obrácené koncové oblasti, Vero-MVA-200 má čtyři delece v levé koncové oblasti. Tudíž, pasážování standardního typu MVA na Věro buňkách vedlo k další deleci.
Vero-MVA byl použitý k imunizaci domácích zvířat proti infekci orthopoxvirem. Sérum zvířat bylo posbírané a byl proveden neutralizační test. Ukázalo se, že zvířata vyprodukovala protilátky s vysokým titrem. Titry protilátek byl stabilní po období alespoň 111 dní. Ukázalo se rovněž, že protilátky byly schopné neutralizovat in vitro virové částice (partikule) MVA v plakovém testu. Závěrem je, že Vero-MVA lze použít jako vakcínu proti infekci orthopoxviry u domácích zvířat a lidí.
-9CZ 293690 B6
Tabulka 1
Adaptace modifikovaného viru vakcinie (MVA) na Věro buňky
Pasáž č. Buněčná kultura Nejvyšší titr viru [logl0/ml] Výsledek Závěry
1 Toxický účinek po 24 hodinách 2,0 Zbytky naočkovaných virů Slepé pasáže
3 Žádná toxicita mírný cytopatický efekt po 4-6 dnech 1,0 Zbytky naočkovaných virů Začátek pomnožování viru Fenomén tvorby zón a cytokinu
5 Typický cytopatický efekt ukončený po 4-5 dnech 4,0 Zvýšené pomnožování viru
11 CPE-cytopatický efekt dokončen po 3 dnech 7,5 Logaritmické pomnožování viru Úspěšná adaptace
12-42* CPE-cytopatický efekt začíná po 24 hod, ukončen po 3 dnech 7,75 Reprodukovatelné pomnožování viru Vero-MVA
43-100* CPE-cytopatický efekt začíná po 24 hod, ukončen po 3 dnech 8,0 Reprodukovatelné pomnožování viru Vero-MVA
100-200* CPE-cytopatický efekt začíná po 24 hod, ukončen po 3 dnech 10,0 Reprodukovatelné pomnožování víru Výsledek Vero-MVA-200
Pojedenácté pasáži naočkováno jenom 1 MOI namísto 10 MOI
Tabulka 2
Změna titru viru v průběhu adaptace MVA na Věro buňky
Pasáž č. Sběr po [dny po infekci] Titr na ml [logio/ml]
1 1 <2,0
2 3 2,0
3 5 1,0
5 5 4,0
8 4 6,5
11 3 7,5
18 2 8,0
19 2 7,75
20 3 8,0
25 2 7,75
29 2 7,75
30 3 7,75
31 3 8,0
45 2 7,75
51 3 7,75
60 2 8,0
66 2 7,75
-10CZ 293690 B6
Tabulka 2 - pokračování
Pasáž č. Sběr po [dny po infekci] Titr na ml [logio/ml]
68 2 8,0
75 3 8,0
100 2 8,0
200 2 10,0
Tabulka 3
Porovnání biologických charakteristik standardního typu MVA a Vero-MVA
Markér Standardní typ MVA Vero-MVA (100, pasáží) Vero-MVA-200
CPE v monolayer buněčné kultuře (1MOI seeded) Zaokrouhlování a lýze buněk po 5 dnech (90 % buněk cytopatický efekt-CPE) Zaokrouhlování a lýze po 5 dnech (100% cytopatický efekt-CPE) Zaokrouhlování a lýze buněk po 3 až 5 dnech (100 % cytopatický efektCPE)
Titr optimální sběru 1080 KIDjo/ml 107’75 KIDS0/ml 10'°’oKID5o/ml
Abortivní reprodukce viru na nepermisivních buněčných systémech Ano Ano Ano
Snížená virulence pro lidi a zvířata Ano Ano Ano
Hemaglutinace (kuřecí erytrocyty) Ne Ne Ne
Charakter primárních plaků na chorioalantoidní membráně Žádné proliferační uzly bez nekrózy Žádné proliferační uzly bez nekrózy Žádné proliferační uzly bez nekrózy
Inaktivace β-propiolaktcnem Kinetika prvního řádu pro 0,05 % Kinetika prvního řádu pro 0,05 % Kinetika prvního řádu pro 0,04-0,05%
Ochranný účinek Ano Ano Ano
Toxicita pro lidi a zvířata Ne Ne Ne
Stimulace cytokinú Interferon alfa, IL-2 a 12, CSA Interferon alfa, 1L-2 a 12 CSA Interferon alfa a gama. IL1,2 a 12, CSA
Aktivace fagocytózy, NK-buněk (přirozených zabíječských buněk), a T-lymfocytú Ano Ano Ano, zvýšená
Tabulka 4
Rychlost pomnožování v KID50/ml Vero-MVA a standardního typu MVA na různých buněčných kultivačních systémech [logi0/ml]
Buněčný kultivační systém Vero-MVA (31. Vero-pasáž) Standardní typ MVA (575. pasáž v primárních fibroblastech kuřecích embryí)
υ Věro (buňky z ledvin afrických zelených opic) 8,0 4,5
Primární fibroblasty kuřecích embryí 4,5 8,5
UJ HL (lidské plíce) 3,0 2,5
HEP-2 (lidský epidermoidní karcinom) 3,0 2,5
-11 CZ 293690 B6
Tabulka 4 - pokračování
Buněčný kultivační systém Vero-MVA (31. Vero-pasáž) Standardní typ MVA (575. pasáž v primárních fibroblastech kuřecích embryí)
M) HeLa (lidský karcinom děložního čípku) 2,75 2,75
l,2) BHK (buňky z ledvin křečka) 5,75 5,25
l,2) MDBK (bovinní ledvinové buňky) 3,5 3,5
1>2) PK-15 (buňky z vepřových ledvin) 3,25 3,5
1) Kontinuální buněčné linie z tkání a druhů uvedených v závorkách.
2) Buněčné linie obdržené ze sbírky Ústavu pro lékařskou mikrobiologii vMnichově, Německo.
Tabulka 5 ío Porovnání standardního typu MVA (572. pasáž na fibroblastech kuřecích embryí (CEF)) s VeroMVA-200 (200. pasáž na Věro buňkách)
Druhy znaků Standardní typ MVA Vero-MVA-200
Genetické znaky (srovnání s kmenem neštovic izolovaného v Ankaře) 3 delece v levé terminální oblasti (obrácená terminální repetice) 4 delece v levé terminální oblasti
Velikost genomu redukovaná z 208 na 178 kb Další redukce velikosti genomu na 172 kb
Ztráta 15 % molekulové hmotnosti původního genomu Ztráta 20 % molekulové hmotnosti původního genomu
Ztráta receptoru pro interferon Další ztráta receptorů např. pro IL-1 β
Buněčné znaky Aktivace pomocných buněk (CD4, CD8, CD25) Zvýšená aktivace cytotoxických T-lymfocytů
Aktivace NK-buněk Zvýšená aktivace NK-buněk
Abortivní rozmnožování v savčích buňkách (mimo BHK buněk) Další zúžení hostitelského spektra v buněčném kultivačním systému
Cytokiny Interferon a, IL-2, IL-12 Interferon a a γ, IL-1,2, 12
Titr viru CEP: 109’5 KIDjo/ml Věro buňky: 1040 KID50/ml CEF: 104·5 KID3o/ml Věro buňky: 109’5 KID5o/ml
Imunitní systém Snížení aktivity specifického imunitního systému Zvýšená aktivita nespecifického imunitního systému
Virulence pro lidi a zvířata nízká žádná
- 12CZ 293690 B6

Claims (23)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) adaptovaný pro růst v buňkách kontinuální buněčné linie, získatelný vymezeným počtem pasáží zahrnujících a) infikování buněk buněčné linie Věro a b) sběr virových částic produkovaných uvedenými buněčnými liniemi, přičemž počet pasáží je 100 nebo 200.
  2. 2. Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle nároku 1, vyznačený tím, že buněčná linie je buněčná linie Věro ATCC CCL-81.
  3. 3. Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle nároku 1, uložený v ECACC pod číslem 99101431.
  4. 4. Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle nároku 1, uložený v ECACC pod číslem 01021411.
  5. 5. Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle nároků 1 až 4 obsahující alespoň jednu heterologní sekvenci nukleové kyseliny.
  6. 6. Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle nároku 5 obsahující heterologní sekvenci nukleové kyseliny jíž je gen kódující terapeutický protein a/nebo antigenní determinantu.
  7. 7. Hostitelská buňka infikovaná modifikovaným virem vakcinie typu Ankara (MVA) podle kteréhokoliv nároku 1 až 6.
  8. 8. Vakcína pro imunizaci živého živočišného organizmu včetně lidského, vyznačená t í m, že obsahuje MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.
  9. 9. Vakcína podle nároku 8 pro imunizaci proti orthopox infekci.
  10. 10. Vakcína podle nároku 8 nebo 9 pro imunizaci koček proti kočičím neštovicím, myší proti ektromelii a/nebo velbloudů proti velbloudím neštovicím.
  11. 11. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.
  12. 12. Farmaceutická kompozice podle nároku 11, vyznačená tím, že obsahuje MVA jako aktivátor, potlačovatel a/nebo stabilizátor nespecifického imunitního systému.
  13. 13. Farmaceutická kompozice podle nároku 11, vyznačená tím, že obsahuje modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) jako kostimulátor imunitního systému nespecifickým způsobem.
  14. 14. Způsob získání kmene modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) podle nároků 1 až 6, vyznačený tím, že se
    a) buňky buněčné linie Věro infikují standardním typem MVA, s výhodou MVA uloženého v ECACC pod číslem V94012707,
    b) provede sběr virů, načež se
    - 13 CZ 293690 B6
    c) čerstvé buňky stejné buněčné linie infikují nově produkovanými viry,
    d) a poté se kroky b) a c) opakují až do dosažení adaptace virů na růst v buňkách řečené buněčné linie.
  15. 15. Způsob pomnožení modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) pro přípravu virových částic MVA podle kteréhokoliv z nároků laž 6, vyznačený tím, že se
    a) buňky buněčné linie Věro kultivují za vhodných podmínek,
    b) tato buněčná linie se infikuje modifikovaným virem vakcinie typu Ankara (MVA) a
    c) sbírají se virové částice produkované těmito buňkami.
  16. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačený tím, že se buněčná linie infikuje modifikovaným virem vakcinie typu Ankara (MVA) podle nároku 3 nebo 4.
  17. 17. Použití modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení nebo prevenci nemoci nebo poruchy, která reaguje na MVA.
  18. 18. Použití podle nároku 17, kde farmaceutická kompozice obsahuje MVA jako aktivátor, potlačovatel a/nebo stabilizátor nespecifického imunitního systému.
  19. 19. Použití podle nároku 17, kde farmaceutická kompozice obsahuje MVA jako kostimulátor imunitního systému nespecifickým způsobem.
  20. 20. Použití modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 pro výrobu vakcíny pro imunizaci živých zvířecích organizmů, včetně lidských.
  21. 21. Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle nároků 1 až 6 pro použití jako vakcína pro imunizaci živého zvířecího organizmu včetně lidského.
  22. 22. Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle nároků 1 až 6 pro použití jako aktivátor, potlačovatel a/nebo stabilizátor nespecifického imunitního systému živého zvířecího organizmu včetně lidského.
  23. 23. Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) podle nároků 1 až 6 pro použití jako kostimulátor imunitního systému nespecifickým způsobem pro zvýšeni specifické imunitní odpovědi na antigenní determinantu ve vakcíně.
CZ20023061A 2000-03-14 2001-03-10 Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) CZ293690B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200000410 2000-03-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ293690B6 true CZ293690B6 (cs) 2004-07-14

Family

ID=8159327

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20023061A CZ293690B6 (cs) 2000-03-14 2001-03-10 Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA)

Country Status (25)

Country Link
US (1) US6682743B2 (cs)
EP (1) EP1263936B1 (cs)
JP (1) JP4759201B2 (cs)
KR (1) KR100880765B1 (cs)
CN (1) CN1291012C (cs)
AT (1) ATE305030T1 (cs)
AU (1) AU780696B2 (cs)
BR (1) BR0109158A (cs)
CA (1) CA2397675C (cs)
CZ (1) CZ293690B6 (cs)
DE (1) DE60113512T2 (cs)
DK (1) DK1263936T3 (cs)
EE (1) EE05633B1 (cs)
ES (1) ES2249430T3 (cs)
HK (1) HK1052725B (cs)
HU (1) HU228691B1 (cs)
IL (3) IL150736A0 (cs)
MX (1) MXPA02008873A (cs)
NO (1) NO20024246L (cs)
NZ (1) NZ521270A (cs)
PL (1) PL205922B1 (cs)
RU (1) RU2280075C2 (cs)
SI (1) SI1263936T1 (cs)
UA (1) UA84388C2 (cs)
WO (1) WO2001068820A1 (cs)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EE05680B1 (et) 2000-11-23 2013-10-15 Bavarian Nordic A/S Muundatud vaktsiiniaviirus, selle valmistamine ja kasutamine, seda sisaldav farmatseutiline kompositsioon ning vaktsiin
US7628980B2 (en) 2000-11-23 2009-12-08 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
WO2004022729A1 (en) * 2002-09-05 2004-03-18 Bavarian Nordic A/S Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions
US7445924B2 (en) 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
US7097842B2 (en) 2000-11-23 2006-08-29 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
EP1357127A1 (de) * 2002-04-10 2003-10-29 Immusystems GmbH CD4+ T-Lymphozyten spezifische Hepatitis C Virus-Epitope
AU2003239805B2 (en) 2002-04-19 2009-09-10 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
JP4895505B2 (ja) * 2002-05-16 2012-03-14 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 変異ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）ゲノム中の挿入部位としての遺伝子間領域
AU2004291024B2 (en) 2003-02-20 2009-09-17 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Novel insertion sites in pox vectors
EP1518932A1 (en) * 2003-09-29 2005-03-30 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Modified vaccinia virus Ankara (MVA) mutant and use thereof
US7423155B2 (en) 2003-11-14 2008-09-09 3M Innovative Properties Company N-sulfonyldicarboximide containing tethering compounds
DE602004009743T2 (de) * 2003-11-24 2008-08-28 Bavarian Nordic A/S Promotoren zur Expression in modifiziertem Vaccinia Virus Ankara
DE102004003572A1 (de) * 2004-01-23 2005-08-18 Bavarian Nordic A/S Monoparamunitätsinducer basierend auf attenuierten Myxomaviren des Kaninchens
WO2006113927A2 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 University Of Washington Immunogenic vaccinia peptides and methods of using same
EP1835031A1 (en) 2006-03-14 2007-09-19 Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt für Sera und Impfstoffe Use of a recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA) for the treatment of type I hypersensitivity in a living animal including humans
US7607323B1 (en) 2007-10-16 2009-10-27 Hall Charles F Curl resistant shirt collar and method of fabricating same
US8691502B2 (en) 2008-10-31 2014-04-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
US9005632B2 (en) 2009-11-20 2015-04-14 Takeda Vaccines, Inc. Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs against influenza virus subtypes or strains
US9011874B2 (en) 2009-11-20 2015-04-21 Takeda Vaccines, Inc. Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs
US20110159031A1 (en) * 2009-12-22 2011-06-30 Baxter International Inc. Vaccine to Influenza A Virus
WO2012151272A2 (en) 2011-05-02 2012-11-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
DE102013004595A1 (de) 2013-03-15 2014-09-18 Emergent Product Development Germany Gmbh RSV-Impfstoffe
WO2015077717A1 (en) 2013-11-25 2015-05-28 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the dna methylation status
WO2015085147A1 (en) 2013-12-05 2015-06-11 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
KR20230076867A (ko) 2013-12-20 2023-05-31 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신생항원 백신과의 병용 요법
WO2015138471A1 (en) * 2014-03-10 2015-09-17 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Heat inactivated poxvirus improves vaccination results
WO2016100977A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Methods for profiling the t-cel- receptor repertoire
US10975442B2 (en) 2014-12-19 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
NL2014148B1 (en) 2015-01-16 2017-01-05 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Combination vaccine for camelids.
EP3261669B1 (en) * 2015-02-25 2022-08-03 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Use of inactivated nonreplicating modified vaccinia virus ankara (mva)as monoimmunotherapy or in combination with immune checkpoint blocking agents for solid tumors
MX2017014700A (es) 2015-05-20 2018-08-15 Broad Inst Inc Neoantigenos compartidos.
TWI750122B (zh) 2015-06-09 2021-12-21 美商博德研究所有限公司 用於贅瘤疫苗之調配物及其製備方法
FR3042121A1 (fr) 2015-10-08 2017-04-14 Jean-Marc Limacher Composition anti-tumorale
WO2017184590A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 The Broad Institute Inc. Improved hla epitope prediction
WO2018140391A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide
EP3624851A1 (en) 2017-05-15 2020-03-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
WO2018211419A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
WO2020051766A1 (zh) 2018-09-11 2020-03-19 上海市公共卫生临床中心 一种广谱抗流感疫苗免疫原及其应用
WO2020072700A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hla single allele lines
WO2020131586A2 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
IL308018A (en) 2021-04-30 2023-12-01 Kalivir Immunotherapeutics Inc Oncolytic viruses for different MHC expression
WO2023077147A2 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Pellis Therapeutics, Inc. T-cell vaccines for patients with reduced humoral immunity
WO2023220283A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Pellis Therapeutics, Inc. Poxvirus adjuvant for t-cell vaccination
WO2024015892A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 The Broad Institute, Inc. Hla-ii immunopeptidome methods and systems for antigen discovery

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1341245C (en) * 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
DE4405841C1 (de) * 1994-02-23 1995-01-05 Mayr Anton Prof Dr Med Vet Dr Multipotente Paramunitätsinducer auf der Basis von Kombinationen von Pockenviruskomponenten, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
UA68327C2 (en) 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
CN1275916A (zh) * 1997-10-15 2000-12-06 旭化成工业株式会社 用于在贮藏/运输中保持血栓调节素含水注射剂质量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU780696B2 (en) 2005-04-14
IL150736A (en) 2008-06-05
CA2397675A1 (en) 2001-09-20
US20030013190A1 (en) 2003-01-16
KR100880765B1 (ko) 2009-02-02
DE60113512D1 (de) 2006-02-02
NO20024246D0 (no) 2002-09-05
JP4759201B2 (ja) 2011-08-31
IL188667A (en) 2011-09-27
HK1052725A1 (en) 2003-09-26
ES2249430T3 (es) 2006-04-01
BR0109158A (pt) 2003-04-22
AU5826901A (en) 2001-09-24
NZ521270A (en) 2003-06-30
RU2002124622A (ru) 2004-03-27
ATE305030T1 (de) 2005-10-15
JP2003526362A (ja) 2003-09-09
IL188667A0 (en) 2008-04-13
MXPA02008873A (es) 2003-02-10
EE200200507A (et) 2004-02-16
PL205922B1 (pl) 2010-06-30
CN1418248A (zh) 2003-05-14
EP1263936B1 (en) 2005-09-21
PL357378A1 (en) 2004-07-26
UA84388C2 (ru) 2008-10-27
DK1263936T3 (da) 2006-02-13
WO2001068820A1 (en) 2001-09-20
RU2280075C2 (ru) 2006-07-20
NO20024246L (no) 2002-09-05
IL150736A0 (en) 2003-02-12
HUP0300120A2 (en) 2003-05-28
HK1052725B (zh) 2007-03-23
DE60113512T2 (de) 2006-06-22
EE05633B1 (et) 2013-02-15
US6682743B2 (en) 2004-01-27
CA2397675C (en) 2012-11-13
KR20030032928A (ko) 2003-04-26
CN1291012C (zh) 2006-12-20
HU228691B1 (en) 2013-05-28
EP1263936A1 (en) 2002-12-11
HUP0300120A3 (en) 2010-01-28
SI1263936T1 (sl) 2006-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6682743B2 (en) Altered strain of the modified vaccinia virus ankara (MVA)
JP5690214B2 (ja) 新生仔予防接種用変異ワクシニアウイルスアンカラ
US8372622B2 (en) Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
US20030224018A1 (en) Modified Vaccinia Virus Ankara for the vaccination of neonates
DE102005027956B4 (de) Hochattenuierte Poxvirusstämme, Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung als Paramunitätsinducer oder zur Herstellung von Vektor-Vakzinen
Mikhael et al. Effectiveness Of The Pigeon Pox Vaccine On The Chicken Vaccinated With Avian Influenza Vaccine
US20110064769A1 (en) Vv promoter-driven overexpression of recombinant antigens

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20140310