CN1275916A - 用于在贮藏/运输中保持血栓调节素含水注射剂质量的方法 - Google Patents

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Abstract

用于在贮藏和运输中保持非冷冻或非冷冻干燥的液体剂型的血栓调节素含水注射剂质量的方法,其特征在于该血栓调节素的含水注射剂被制备成一种pH值在5与7.0范围内的水溶液,含有有效量的可溶性血栓调节素和在5至7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分,其中该血栓调节素水溶液具有下列特征a)或b),即,a)它进一步含有一种表面活性剂,被无菌灌装在容器中,或者b)它由无菌灌装在注射器容器中的预灌装注射器制剂组成,以排除其中任何实质上的气体空间。

Description

用于在贮藏/运输中保持 血栓调节素含水注射剂质量的方法
申请的工业领域
本发明涉及用于在贮藏/运输中保持非冷冻或非冷冻干燥的液体剂型的血栓调节素含水注射剂质量的方法，还涉及在贮藏/运输中稳定的血栓调节素含水注射剂。
现有技术
血栓调节素(以下有时简写为TM)是这样一种物质，它具有与凝血酶特异性结合的功能，通过凝血酶显著加速蛋白C的活化。蛋白C由一种维生素K依赖性蛋白质组成，它在凝固纤维蛋白溶解系统中起到重要作用，它是受凝血酶对活化蛋白C的作用而被活化的。已知活化蛋白C会使活体血液凝固系统中的活化凝固因子V和VIII失活，还已知它参与了纤溶酶原激活物的产生，这显示了具有血栓溶解作用(见Koji Suzuki《医学进展》125卷，901(1983))。
因此认为，血栓调节素通过凝血酶加速蛋白C的活化，产生大量活化的蛋白C，表现出对血液凝固的抑制作用和血栓溶解功能，可用作抗凝剂和血栓溶解剂。迄今，血栓调节素已经预期用于下列疾病的治疗和预防：急性冠状综合征(ACS)，例如心肌梗塞和不稳定型心绞痛；冠状循环重建术；血栓形成，例如急性与慢性脑血栓和急性与慢性动脉与静脉外周血栓；外周血管梗阻，例如伯格病和雷诺病；阻塞性动脉硬化；血管炎症，例如系统性红斑狼疮(SLE)、Becet病和川崎病；心手术继发的功能失调；器官移植继发的并发症；血管内凝血病(DIC)；心绞痛；一过性脑缺血发作；妊娠中毒；糖尿病；肝静脉闭塞性疾病(VOD)，例如暴发性肝炎或骨髓移植后的静脉闭塞性疾病和深部静脉血栓形成(DVT)。
过去，血栓调节素被证实和分离为一种糖蛋白，出现在包括人在内的动物血管内皮细胞上。本发明的发明人小组已经成功地第一次对其进行了克隆。因此，发明人已经利用基因工程技术，对来自人肺cDNA文库的具有信号肽的人血栓调节素前体进行了基因克隆，由此分析了血栓调节素的整个基因序列，搞清楚了它的具有575个残基的氨基酸序列包括一个18个氨基酸残基的信号肽(见日本特许公开昭64-6219A)。已知具有被分割的信号肽的成熟血栓调节素由五个结构域组成，也就是说，NH2端结构域(第1至226个氨基酸残基，从NH2端开始计算)、具有6个EGF样结构的结构域(第227至462个残基)、富含0-糖基化作用位点的结构域(第463至498个残基)、跨膜结构域(第499至521个残基)和胞质结构域，分别从NH2端开始计算顺序，其中，表现出相当于全长血栓调节素的活性的区段、即最小活性单元，从NH2端开始计算，是由具有6个EGF样结构的结构域中第四、五和六个EGF样结构组成的区段(见M.Zushi等《生物化学杂志》246，10351-10353(1989))。
已经证实，至少这样一种除去跨膜结构域而制得的血栓调节素具有易溶于水的性质，即使不使用任何表面活性剂(以下有时称之为“可溶性血栓调节素”)，例如，应用基因重组技术能够得到仅由三个结构域组成的血栓调节素，即NH2端结构域、具有6个EGF样结构的结构域和富含0-糖基化作用位点的结构域，也就是说，由来自序列表SEQID NO：1序列的第19至516个氨基酸残基的氨基酸序列组成，所得到的重组血栓调节素所具有的活性与天然血栓调节素相同(日本特许公开昭64-6219A)。
顺便而言，正如在很多情况下所认为的，基因可因所受到的检查而发生自然的和人工突变，例如分离等，人也不例外，也发现有多形态突变，其中证实，由上述575个氨基酸残基组成的氨基酸序列构成了人血栓调节素前体的两个突变体，其中一个的第473个氨基酸残基由Val组成，另一个的该氨基酸残基由Ala组成。这在编码该氨基酸的碱基序列中分别相当于第1418位点的T与C突变(Wen等《生物化学》26，4350-4357(1987))。不过，它们的确在活性和物理性质上彼此没有显示出差异，可以看作是大体上相同的。因此，上述由SEQ IDNO：1序列的氨基酸序列构成的人血栓调节素被看作是由SEQ ID NO：2序列的氨基酸序列组成的血栓调节素肽的多形体之一，二者应当被判定为彼此在大体上是相同的。
另一方面，血栓调节素制剂目前在实际应用中已经可以以冷冻干燥的药物剂型稳定地分装。不过也发现，在含有血栓调节素的水溶液的冷冻干燥过程中，一部分、尽管是微量的血栓调节素因变性作用(denaturization)而转化为聚合物质，生成一种聚合物，其中若干血栓调节素分子发生缔合作用。为了解决这个问题，发明人进行了彻底研究，由此发现，血栓调节素因冷冻干燥而引起的变性作用是能够被防止的，就该发明曾申请过专利(日本特许公开平6-321805A)。
发明所要解决的问题
尽管有上述情况，仍然需要提供新颖的非冷冻或非冷冻干燥剂型的制剂，使用简单，易于使用，生产成本较低。
解决问题的方式
本发明的发明人研究了得到血栓调节素的含水注射剂的可能性，它能够避免冷冻干燥过程，在实际使用时无需溶解操作，并为研制出不是冷冻干燥制剂的新制剂而进行了努力。含水注射剂首先需要其在5℃至室温下贮藏长时间阶段后的残余能力不应当降低可观的程度(即长期稳定性)，尽管如此，研究显示，达到该长期稳定性并非易事。令我们惊奇的是，进一步发现含水注射剂在某些情况下通过摇动可以变浑浊。有充分理由相信，液体制剂在分装时可能受到不同强度水平的摇动运动，例如在运输时。常规的冷冻干燥粉剂不会遇到这个问题。因此我们承认，在含水注射剂抗摇动的稳定性上面临新的意外的问题。注射剂中任何不溶物的存在有时候可以给患者带来致命的意外伤害，特别是对循环器官疾患的患者，因此，避免上述含水注射剂因摇动而发生浑浊的抗摇动稳定性问题是一个需要克服的巨大障碍。
总之，迄今难以制备能够允许以液体剂型贮藏/运输长时间阶段的含水注射剂，因为通过简单地将血栓调节素溶于水，决不可能得到长期稳定性和抗摇动稳定性令人满意的任何注射剂，尽管含水注射剂所具有的优点在于它能够方便地对患者给药，在实际使用时无需任何在注射用水中溶解的操作，而且制备经济，由于排除了冷冻干燥的操作，比常规的冷冻干燥制剂也更易于制备。
发明人为避免上述问题而进行了彻底研究，发现在一定条件下，所有这些问题都是能够解决的，从而完成了本发明。
因此，本发明提供了用于在贮藏和运输中保持非冷冻或非冷冻干燥的液体剂型的血栓调节素含水注射剂质量的方法，其特征在于该血栓调节素的含水注射剂被制备成一种pH值在5至7.0范围内的水溶液，它含有(a)有效量的可溶性血栓调节素和在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分，其中该血栓调节素水溶液具有下列特征a)或b)，即，
a)它进一步含有一种表面活性剂，被无菌灌装在容器中，或者
b)它由无菌灌装在注射器容器中的预灌装注射器制剂组成，以排除其中任何实质上的气体空间。
因此，第一种根据本发明的用于保持含水注射剂质量的方法的实施方式在于，将血栓调节素的含水注射剂以液体剂型贮藏/运输长时间阶段，该注射剂的特征在于它被制备成一种pH值在5至7.0范围内的水溶液，含有有效量的可溶性血栓调节素、在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分和一种表面活性剂，被无菌灌装在容器中。
第二种根据本发明的用于保持含水注射剂质量的方法的实施方式在于，将血栓调节素的含水注射剂以液体剂型贮藏/运输长时间阶段，该注射剂的特征在于它被制备成一种pH值在5至7.0范围内的水溶液，含有有效量的可溶性血栓调节素和在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分，由无菌灌装在注射器容器中的预灌装注射器制剂组成，以排除其中任何实质上的气体空间。
第三种根据本发明的用于保持含水注射剂质量的方法的可取实施方式在于，将血栓调节素的含水注射剂以液体剂型贮藏/运输长时间阶段，该注射剂的特征在于它被制备成一种pH值在5至7.0范围内的水溶液，含有有效量的可溶性血栓调节素、在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分和一种表面活性剂，由无菌灌装在注射器容器中的预灌装注射器制剂组成，以排除其中任何实质上的气体空间。
本发明也提供了用于实现非冷冻或非冷冻干燥剂型的血栓调节素含水注射剂的长期稳定性和抗摇动稳定性的方法，其特征在于该血栓调节素的含水注射剂被制备成一种pH值在5至7.0范围内的水溶液，它含有有效量的可溶性血栓调节素和在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分，其中该血栓调节素水溶液具有下列特征a)或b)，即，
a)它进一步含有一种表面活性剂，被无菌灌装在容器中，或者
b)它由无菌灌装在注射器管中的预灌装注射器制剂组成，以排除其中任何实质上的气体空间。
根据本发明的方法中所用的非冷冻或非冷冻干燥液体剂型的血栓调节素含水注射剂被制备成一种pH值在5至7.0范围内的水溶液，它含有有效量的可溶性血栓调节素和在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分，具有良好的长期贮藏稳定性和抗摇动稳定性，适用于长时间贮藏/运输，其特征在于该血栓调节素水溶液的pH值在5至7.0范围内，且具有下列特征a)或b)，即，
a)它进一步含有一种表面活性剂，被无菌灌装在容器中，或者
b)它由无菌灌装在注射器管中的预灌装注射器制剂组成，以排除其中任何实质上的气体空间。
因此，根据本发明的血栓调节素含水注射剂的第一方面在于非冷冻或非冷冻干燥液体剂型的血栓调节素含水注射剂，具有良好的长期贮藏稳定性和抗摇动稳定性，适用于长时间贮藏/运输，其特征在于该血栓调节素含水注射剂的pH值在5至7.0范围内，含有有效量的可溶性血栓调节素、在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分和一种表面活性剂，被无菌灌装在容器中。
根据本发明的血栓调节素含水注射剂的第二方面在于非冷冻或非冷冻干燥液体剂型的血栓调节素含水注射剂，具有良好的长期贮藏稳定性和抗摇动稳定性，适用于长时间贮藏/运输，其特征在于该血栓调节素含水注射剂是一种pH值在5至7.0范围内的预灌装注射器制剂，含有有效量的可溶性血栓调节素和在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分，被无菌灌装在注射器容器中，以排除其中任何实质上的气体空间。
根据本发明的血栓调节素含水注射剂的第三方面在于非冷冻或非冷冻干燥液体剂型的血栓调节素含水注射剂，具有良好的长期贮藏稳定性和抗摇动稳定性，适用于长时间贮藏/运输，其特征在于该血栓调节素含水注射剂是一种pH值在5至7.0范围内的预灌装注射器制剂，含有有效量的可溶性血栓调节素、在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分和一种表面活性剂，被无菌灌装在注射器容器中，以排除其中任何实质上的气体空间。
本申请说明书中所用的术语“血栓调节素”没有任何特殊的限制，指的是所有具有这样一种功能的物质，它与凝血酶结合，加速凝血酶对蛋白C的活化作用。在本说明书的上下文中，术语“可溶性血栓调节素”指的是表现上述“血栓调节素”活性的物质，即使在没有表面活性剂的存在下也易溶于水，其在注射用水中所表现出来的可取溶解度例如可以是至少1mg/ml，优选为至少3mg/ml，尤其优选为至少6mg/m1。作为可溶性血栓调节素的可取实例，可以列举的是用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其非还原态分子量为66000±10000的肽，它表现出加速凝血酶活化蛋白C的功能，且可溶于注射用水，浓度至少为6mg/m1。作为其他可取的可溶性血栓调节素，例如由这样一种氨基酸序列构成的肽，该序列包括由序列表SEQ ID NO：1中第19位点至第29位点氨基酸残基组成的氨基酸序列，这种肽表现出加速凝血酶活化蛋白C的功能，且可溶于水。可取的可溶性血栓调节素的进一步实例包括由下列i)和ii)组成的组，即，
i)由这样一种氨基酸序列构成的血栓调节素，该序列由序列表SEQID NO：1中第19位点至第516位点氨基酸残基组成，和
ii)由这样一种氨基酸序列构成的血栓调节素，其中在组成该序列的氨基酸残基中，上面给出的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被置换或被除去，或者向其中加入一个或多个氨基酸残基，
且表现出加速凝血酶活化蛋白C的功能。
作为可溶性血栓调节素，可以进一步列举的是由至少包括具有6个EGF样结构的结构域中第4、5和6个结构的氨基酸序列构成的肽，顺序从NH2端开始计算，它们被认为构成了血栓调节素的最小活性单元(例如，人血栓调节素序列表SEQ ID NO：1和序列表SEQ ID NO：2中第367至480位点)。其中尤其优选的可溶性血栓调节素是可以由转化细胞产生的肽，该转化细胞是利用一种载体将编码序列表SEQ IDNO：1或序列表SEQ ID NO：2的氨基酸序列的DNA片段转染给宿主细胞而得到的。作为一个可从转化细胞得到的肽的优选实例，即可溶性血栓调节素，可以列举的是由这样一些氨基酸序列构成的肽，该氨基酸序列由序列表SEQ ID NO：1和序列表SEQ ID NO：2第19至516位点组成。根据各具体宿主细胞的不同，其他的肽可以包括信号肽本身保持下来者，由序列表SEQ ID NO：1和序列表SEQ ID NO：2第17至第516位点氨基酸序列构成，及其混合物。当然，这些肽在水中具有相当高的溶解度，足以满足上述指定的溶解度要求。这些肽仅具有上述氨基酸序列就足够了，无论具有糖基链与否都没有限制。甚至利用从人尿等得到的可溶性肽也是可能的。类似地，肽中糖基链的加入位点和加入程度可因各具体宿主细胞而异，对这种肽的使用没有限制。由序列表SEQ ID NO：1和序列表SEQ ID NO：2第367位点至第480位点氨基酸残基组成的肽本身具有较高的抗摇动稳定性，在任何情况下都可以得到可取的含水制剂，然而，可以理解的是，有必要通过诉诸根据本发明的工艺来提高具有上述分子量的血栓调节素的抗摇动稳定性，即在非还原态下为66000±10000，例如，由序列表SEQ ID NO：1第19位点至第516位点残基的氨基酸序列构成的可溶性血栓调节素、由序列表SEQ ID NO：2第19位点至第516位点残基的氨基酸序列构成的可溶性血栓调节素、通过转染编码序列表SEQ ID NO：1中所述氨基酸序列的DNA片段给宿主细胞而得到的可溶性血栓调节素和通过转染编码序列表SEQ ID NO：2中所述氨基酸序列的DNA片段给宿主细胞而得到的可溶性血栓调节素。
可以列举的宿主细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)、COS-1、COS-7、VERO(ATCC CCL-81)、BHK、犬MDCK和仓鼠AV-12-664，以及来源于人的细胞，例如HeLa、WI38和人293。作为CHO细胞，DHFR-CHO细胞是更优选的。
在基因操作过程中，经常使用微生物，例如大肠埃希氏杆菌等，其中可取的是选择适合于每种目的的宿主-载体系统，因此也应当为上述每种宿主细胞选择适当的载体系统。
除了为得到纯化产物所进行的纯化工艺以外，基因重组工艺中用到的每种血栓调节素基因已被克隆，利用基因重组工艺制备血栓调节素的实例已被公开(见日本特许公开昭64-6219 A、平2-255699 A、平5-213998 A、平5-310781 A和平7-155176以及《生物化学杂志》264，10351-10353(1989))。因此，根据本发明所用的血栓调节素可以利用上述引用文献所述工艺或相应工艺进行制备。例如，日本特许公开昭64-6219 A公开了具有质粒psV2TMJ2的大肠埃希氏杆菌K-12菌株DH5(ATCC保藏号为67283)，该质粒含有编码全长血栓调节素的DNA，而本发明申请人于1996年6月19日在位于日本Tsukuba市Ibaragi县Higashi 1 Chome 1-3号的国立生命科学和人体技术研究所再次保藏了同一菌株(大肠埃希氏杆菌DH5/psV2TMJ2)。保藏号为FERM BP-5570。使用这种编码全长血栓调节素的DNA作为原料，通过已知的基因操作技术可以得到根据本发明所用的可溶性血栓调节素。
尽管根据本发明所用的可溶性血栓调节素可以通过已知工艺或相应工艺制备，为此也可能指的是下述文献，例如上面给出的Yamamoto等(日本特许公开昭64-6219 A比较实施例)和日本特许公开平5-213998 A。因此，得到编码序列表SEQ ID NO：1氨基酸序列的DNA的可能方法是利用基因操作工艺加工人血栓调节素基因，如果必要的话再进行修饰。这种修饰可以包括按照《酶学方法》100，468(1983)，学术出版社所述的方法，进行编码序列表SEQ ID NO：1第473位点氨基酸(尤其是第1418位点碱基)的密码子的位点特异性突变，得到编码序列表SEQ ID NO：2氨基酸序列的DNA。例如，使用含有序列表SEQID NO：3碱基序列的DNA片段和含有序列表SEQ ID NO：5所示碱基序列的用于突变的合成DNA，进行上述位点特异性突变，得到编码序列表SEQ ID NO：2氨基酸序列的DNA。所得DNA然后例如能够整合到中国仓鼠卵巢细胞内，得到对应的转化细胞，选择其中有关细胞进行培养，由其培养混合物得到可溶性血栓调节素，用已知工艺进行纯化。如前所述，可取的是将编码序列表SEQ ID NO：1氨基酸序列的DNA转染给宿主细胞。用于制备根据本发明所用的可溶性血栓调节素的工艺不应当仅限于上述操作，还可能有很多变例，例如包括从组织、组织培养混合物、人尿等提取血栓调节素或可溶性血栓调节素，随后进行纯化，如果必要的话进一步用蛋白酶处理。
上述工艺从上清液或培养混合物分离和纯化可溶性血栓调节素可以用已知方法进行(例如Buichi Horio编《蛋白质、酶的基本实验方法》)。基于血栓调节素与色谱固定相载体之间相互作用的离子交换色谱法的使用也是优选的，载体上固定了带有与血栓调节素相反离子电荷的官能团。基于对血栓调节素的特异性亲和力的亲和色谱法也是可取的例证。作为所用吸附剂的可取实例，可以列举的是血栓调节素抗体和凝血酶抗体，它们可以构成血栓调节素配体。对这些抗体来说，可以利用能够识别适当功能或适当表位的血栓调节素抗体，其实例包括公开在日本特许公报平5-42920 B和日本特许公开昭64-45398 A及平6-205692 A中。而且，利用凝胶过滤色谱法和超滤工艺得到所需分子大小的血栓调节素。而且，还可以利用基于固定相载体与血栓调节素疏水性位点之间的疏水性相互作用的疏水性色谱法，在固定相载体上结合有疏水性基团。上述工艺可以适当地结合使用。根据各具体的应用，可以适当地选择可溶性血栓调节素的纯化程度，不过可取的是将其纯化为这样一种程度，例如通过电泳法仅得到一条带，优选为SDS-PAGE，或者例如通过凝胶渗透HPLC或反相HPLC仅得到一个峰。
纯化操作的具体例证可以是在进行纯化时将血栓调节素活性也作为一个参数加以考虑的工艺，例如，将上清液或培养混合物用Q-琼脂糖凝胶-FF离子交换柱处理，收集表现出血栓调节素活性的部分，然后用二异丙基磷酰凝血酶琼脂糖(DIP-TB)进行适当的纯化，收集表现出更高血栓调节素活性的部分，然后进行凝胶渗透色谱法，收集血栓调节素活性部分，以得到纯的可溶性血栓调节素产物(见Gomi等：《血液》75，1396-1399(1990))。作为反映血栓调节素活性的参数，例如可以利用血栓调节素加速蛋白C活化的活性。作为另一种纯化工艺，其例证可以是下列方法：
对血栓调节素进行离子交换色谱法，所用离子交换树脂经过适当选择，对血栓调节素表现出更好的吸附性能。一种尤其优选的方法利用Q-琼脂糖凝胶-FF，它先用含有0.18M NaCl的0.02M Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)平衡过。例如用含有0.3M NaCl的0.02M Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)适当洗涤，可以将所保留的血栓调节素洗脱出来，得到血栓调节素粗产物。
然后，纯化该产物的步骤例如可以是亲和色谱法，在所用树脂上结合有一种对血栓调节素具有特异性亲和力的物质。作为优选的实例，可以列举的是DIP-凝血酶-琼脂糖凝胶柱和具有抗血栓调节素单克隆抗体的柱子。DIP-凝血酶-琼脂糖凝胶柱例如可以预先用含有100mMNaCl和0.5mM氯化钙的20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)进行平衡，于是柱子上装有上述粗产物，然后适当洗涤，随后例如用含有1.0M NaCl和0.5mM氯化钙的20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.4)进行洗脱，得到可溶性血栓调节素的纯化产物。在抗血栓调节素单克隆抗体柱的情况下，柱子装填有已用这样一种方法处理过的琼脂糖凝胶4B(Pharmacia公司)，使预先被CNBr活化的琼脂糖凝胶颗粒与0.1M NaHCO3缓冲溶液(pH＝8.3)接触，缓冲溶液中含有0.5M NaCl和溶解其中的抗血栓调节素单克隆抗体，由此使抗血栓调节素单克隆抗体结合在琼脂糖凝胶颗粒上。然后，将柱子预先例如用含有1.0M NaCl的20mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.3)平衡，然后适当洗涤，再例如用含有0.3M NaCl的100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH＝3.0)洗脱所保留的血栓调节素。
然后将所得到的纯化可溶性血栓调节素溶液装入阳离子交换树脂柱，优选为一种强酸型阳离子交换树脂，例如SP-琼脂糖凝胶-FF(Pharmacia公司)，树脂一般在下述条件下已被平衡，例如比电导率为25-34ms/cm，pH值为3-4，不过根据盐浓度、pH的测定精度和分子种类，条件也可以不同。上述比电导率值更优选地可以是在30±3ms/cm范围内，pH值优选地可以是在3.0-3.7范围内，更优选为3.5±0.1。优选使用适当浓度的一种盐的缓冲溶液，其中在各种可能的条件下，可以列举的是pH为3-4的50-150mM缓冲溶液，含有0.25-0.32M、优选0.3±0.1M NaCl。尽管对缓冲溶液的种类没有限制，不过例如可以选择甘氨酸-HCl、柠檬酸-柠檬酸二钠、柠檬酸钠和乙酸。更具体的例证可以是含有300mM NaCl的100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH＝3.5)。使用便携式电导率计(Toa Electronics Ltd.仪器P-系列CM-11P型，标准转化温度为25℃)易于测定比电导率。
然后使例如含有300mM NaCl的100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH＝3.5，比电导率＝31ms/cm)开始通过如上制备的柱子，收集280nm吸收峰开始上升至其下降结束的洗脱液得到洗脱部分，该吸收峰是来自仅通过空白部分的吸收，洗脱部分然后用适当的缓冲溶液中和，由此可以得到可溶性TM的高纯度产物，其纯化程度是它基本上不含有来源于血清和抗体的物质。如下所述，使用该柱已被证实能够有效地除去来源于血清和抗体的物质，具有良好的再现性。当然，利用超滤法可以进行适当浓缩。
而且，还优选利用凝胶过滤法进行缓冲溶液的交换。例如，聚丙烯酰胺葡聚糖S-300或S-200柱先用含有50mM NaCl的20mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.3)平衡过，装入经超滤法浓缩的高纯度产物，柱子用含有50mM NaCl的20mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.3)分级展开，然后在进行活性检查时收集显示出加速凝血酶活化蛋白C活性的部分，进行缓冲溶液的交换，由此可以得到高纯度产物。
在很多纯化方法中，根据本发明所用的含水注射剂应当是无需任何特殊操作即可得到的，例如加入和调整，而可以使用含有缓冲组分和表面活性剂的溶液，以达到最终的对应于本发明所规定的pH等条件。不过一般来说，向所得可溶性血栓调节素溶液中加入必要组分的操作简单易行，是优选的。
对根据本发明所用的缓冲组分没有特殊的限制，任何能调节pH值在5至7.0范围内并在该范围内发挥缓冲作用的组分都可以使用。而且，优选的pH范围为5.5-6.5。例如，可以使用各自为有效量的一种或多种，选自由磷酸、羧酸和/或其水溶性盐组成的组。作为羧酸和/或其水溶性盐，可以列举的是选自下组的一种或多种：乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、酒石酸、富马酸、苹果酸和/或它们的水溶性盐，其中特别优选的是磷酸、乙酸和/或它们的水溶性盐。对水溶性盐没有特殊的限制，只要是药学上可接受的即可，例如包括钠盐和钾盐。
对根据本发明所用的容器没有特殊的限制，只要容器的材料和结构适合于无菌灌装即可。可以列举的是玻璃注射器(带有可进行无菌灌装的橡胶帽和橡胶活塞)、玻璃小瓶(带塞子)和玻璃安瓿以及由可塑性树脂制成的容器。本发明一个最优选的实施方式在于预灌装在注射器容器中的注射器制剂。预灌装注射器制剂是通过预先在注射器容器中灌装含水注射剂而制备的，能够以这种状态本身贮藏/运输，其中该注射器容器可以带有、也可以不带有注射针头。当它不具有注射针头时，通常在注射前才装上注射针头。可以认为，向注射器内的含水制剂本身施加高压，使其穿过皮肤给药，而不使用注射针头。这里，含水制剂在前端的注射出口可以是窄口结构。提高内部压力的方法例如可以使用压缩气体(氮、氦、二氧化碳等)和弹簧的压力。
在选择在上述pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分时，可以优选地选择这样的缓冲组分及其用量，使该制剂在待灌装容器灌装待检查缓冲组分前后和所灌装的容器在50℃下加热处理96小时前后的pH值变化不会超过±0.3的程度，如下述检查方法1所规定的，不过该条件可能会受到缓冲组分种类、浓度和待灌装的各具体容器的影响。对上面例举的典型缓冲组分来说，所用的浓度范围一般至少是0.01mM、优选至少是1mM，一般至多是1000mM、优选至多是200mM、尤其优选至多是25mM或至多是20mM。优选的是玻璃容器预先进行硫处理。可以用聚硅氧烷涂在玻璃注射器的内表面上。
在制备用于根据本发明的含水注射剂的基于磷酸盐的缓冲溶液的实施方式中，将预定浓度的磷酸二氢钠水溶液(NaH2PO4或其12水合物)和同样为预定浓度的磷酸氢二钠水溶液(Na2HPO4或其二水合物)各以一定的量混合，以调节pH为预期的值。或者，还可能是向一定浓度的磷酸二氢钠水溶液中滴加氢氧化钠水溶液，以调节所得溶液的pH为预期的值。还可能是滴加稀盐酸或稀磷酸，以实现pH值的微量调节。在通常以乙酸盐缓冲液为代表的羧酸盐缓冲溶液的情况下，将预定浓度的乙酸水溶液和同样为预定浓度的乙酸钠水溶液各以一定的量混合，以调节pH为预期的值。或者，还可能是向一定浓度的乙酸水溶液中滴加一定浓度的氢氧化钠水溶液，以调节pH为预期的值。还可能是滴加稀乙酸，以实现pH值的微量调节。
根据本发明的含水注射剂的pH值通常在5.0至7.0范围内，优选为5.5至6.5。尤其优选的pH值约为6.0。优选的pH范围例如5.5-6.0。
当磷酸盐缓冲溶液的浓度在0.2至200mM范围内变化时，观察到含水血栓调节素制剂活性在pH 7.3下大大降低，其中缓冲溶液的浓度越高，所检测到的活性降低得越多。例如，制剂的残余活性在200mM浓度下降低得更多。不过对磷酸盐缓冲溶液来说，当pH值的严格对照在5-7.0范围内时，可以使含水血栓调节素制剂的热稳定性(长期稳定性)达到良好的质量。优选的是将pH调节在5.5-6.5，特别是在约6.0下。当pH调节在尽可能接近7.0的值时，pH值即使发生微小变动也可对含水血栓调节素制剂的热稳定性产生影响，因此，优选应当避免这种pH调节。
在乙酸盐缓冲溶液中，即使缓冲溶液浓度在0.2至200mM的大范围内变化，缓冲溶液浓度对血栓调节素制剂质量也没有影响。在磷酸盐与乙酸盐的混合缓冲溶液中，在5.0至7.0的pH范围内的热稳定性质量达到良好。
在除乙酸盐以外的羧酸盐缓冲溶液中，在与乙酸盐缓冲溶液相同的浓度范围和pH范围内达到了相当于乙酸盐缓冲溶液的热稳定性。当向磷酸盐缓冲溶液中加入乙酸盐缓冲组分和/或羧酸盐缓冲组分时，所达到的热稳定性相当。
作为根据本发明加入的表面活性剂，非离子型表面活性剂是优选的，例如聚山梨醇酯类，如聚山梨醇酯80(商品名为“吐温80”)和聚山梨醇酯20(商品名为“吐温20”)；聚氧乙烯氢化蓖麻油，如聚氧乙烯氢化蓖麻油60(商品名为“HCO-60”和商品名为“Cremophor RH60”)和聚氧乙烯氢化蓖麻油50(商品名为“HCO-50”和商品名为“Cremophor RH 50”)；聚氧乙烯蓖麻油(商品名为“CO-60TX”、“CO-50TX”和“Cremophor EL”等)；环氧乙烷/环氧丙烷聚合物，如聚氧乙烯(160)-聚氧丙烯(30)甘醇(商品名为“Pluronic F68”等)和脱水山梨醇倍半油酸酯。可能使用至少一种选自上组的表面活性剂，并允许将它们结合使用。
至于摇动稳定性，加入至少0.01重量％聚山梨醇酯80(商品名为“吐温80”)和至少0.1重量％聚氧乙烯氢化蓖麻油(商品名为“HCO-60”)与聚氧乙烯(160)-聚氧丙烯(30)甘醇(商品名为“PluronicF68”)，能够达到浊化防护作用。聚山梨醇酯80(商品名为“吐温80”)仅加入0.01重量％即可达到浊化防护作用，因此是尤其优选的。
对根据本发明所用的表面活性剂浓度来说，通常可以例证的是至少0.001重量％的浓度，优选为至少0.01重量％，但是不超过1重量％，优选为不超过0.1重量％。
根据本发明的含水血栓调节素制剂除了上述成分以外，还可以进一步含有添加剂，包括等渗剂(例如氯化钠等)和防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯等)，作为第三种组分。
对实际在含水血栓调节素制剂中加入添加成分的方式没有特殊的限制，如上所示，可以利用这样一种操作，直接向含有血栓调节素的水溶液中加入，或者预先溶于水、注射用水或适当的缓冲溶液，将所得溶液加入到血栓调节素溶液中。
在制备含水血栓调节素制剂的一个优选实施方式中，用血栓调节素在水、注射用水或适当缓冲溶液中的溶液灌装注射器、安瓿或小瓶，灌装溶液的浓度为0.05mg或以上、优选为0.1mg或以上、尤其优选为1mg或以上每1ml。血栓调节素含量的上限没有特殊限制，可以例证的是血栓调节素浓度例如不超过15mg、优选为不超过10mg、尤其优选为不超过6mg每1ml。用常规工艺将含有上述浓度血栓调节素和其他添加成分的水溶液、例如0.3ml-10ml无菌灌装在上述容器中，由此可以得到血栓调节素含水注射剂的药物产品。对容器灭菌可以使用普通的操作，例如干热灭菌、高压灭菌和γ-射线灭菌。例如，可以使用高于250℃超过30分钟的干热条件、高于121℃超过20分钟的高压灭菌条件和剂量为20-60kGy(千戈瑞)的γ-射线照射条件。灭菌方法中，干热法通常用于玻璃制安瓿和小瓶，高压法通常用于小瓶的橡胶塞。注射器灭菌通常使用γ-射线灭菌法，不过也可以使用高压法。待灌装在容器内的血栓调节素水溶液一般优选使其通过孔径为0.22或0.2微米的灭菌滤器。根据本发明的血栓调节素含水注射剂是用无菌过滤的血栓调节素水溶液无菌灌装灭菌容器而制备的。也优选将所得到的血栓调节素含水注射剂用纸张或卡纸盒包装。
根据本发明的血栓调节素含水注射剂优选可以以预灌装的注射器制剂的形式存在，如上所示，不过它也可以贮藏在安瓿或小瓶内。在安瓿制剂的情况下，优选的是使用已经被硫处理过的安瓿。得到硫处理过的安瓿的方法是，使安瓿容器与SO2气体接触，或者可取地将硫酸铵水溶液喷淋在安瓿容器内壁上，再使所得容器接受热处理。可以例证的方法通常是喷淋1-10％硫酸铵溶液，随后在630-700℃温度下加热处理。一般来说，经过如此处理的安瓿容器预先还要作进一步处理，例如在安瓿洗涤机等上，用超声波在湿润状态下处理，随后水洗，然后在300-350℃温度下干热灭菌几分钟，再灌装注射剂。
现在对本发明第二种实施方式的方法进行说明，即，其中将血栓调节素含水注射剂以液体剂型贮藏/运输长时间阶段的方法，该血栓调节素含水注射剂的特征在于它被制备成一种pH值在5至7.0范围内的水溶液，含有有效量的可溶性血栓调节素和在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分，它由无菌灌装在注射器中的预灌装注射器制剂组成，以排除其中任何实质上的气体空间。
对可溶性血栓调节素、缓冲组分和血栓调节素含水注射剂的定义与前述相同。
对根据本发明所用的注射器来说，优选可以使用商用注射器，一般来说，可以例证的是预灌装注射器用注射器管，其内径约为8.6mm、6.3mm或4.6mm。尽管是根据血栓调节素水溶液的灌装量而进行选择的，考虑到摇动稳定性，最优选的还是内径约为4.6mm者，不过约6.3mm内径的注射器管也是够用的。对内径约为8.6mm的注射器管来说，灌装含水制剂后保持气体空间的比例至多为50体积％是必要的。因此，内径约为8.6mm的注射器管是能够确保其摇动稳定性的，只要其中的气体空间比例在灌装含水制剂后保持至多50体积％即可。
根据容器的具体形状和内径，血栓调节素含水注射剂因其表面张力可以基本上不受到摇动。在本说明书的上下文中，“受摇动部分”确指容器的一部分，存在于此部分容器内的血栓调节素含水注射剂在容器摇动时可产生本质上为摇动的运动，容器的摇动条件是幅度5cm，频率180转每分钟，温度25℃。容器内“气体空间的比例”是用体积差除以受到摇动的容器部分体积计算得到的值，以百分率表示，该体积差是从受摇动部分体积中减去存在于受摇动部分内血栓调节素含水注射剂的体积而计算得到的。存在于受摇动部分内血栓调节素含水注射剂的量、即容器内含水注射剂可移动的量可以通过下述方法确定，例如，重复进行确定并测量容器内含水制剂的量的实验，在上述条件下摇动两分钟后保持容器的纵轴和横轴固定，将灌装了血栓调节素含水注射剂的容器以这样一种状态保持5秒钟后，容器内含水制剂已向下移动。与此同时，也可以确定受摇动部分，以测定其体积。在注射器形式简单的情况下，受摇动部分当然由注射器和塞子(和帽)之间所界定的空间组成。在约4.6mm内径的注射器情况下，基本上不发生摇动，也就不必考虑气体空间的比例。
通常，用一种普通方式将血栓调节素含水注射剂灌装用帽密封的注射器管中，然后安装塞子。向注射器管内安装塞子的工艺例如可以是真空安装，并使用排气管(或套管)。
当注射器管用真空安装塞子密封时，气体空间的比例可相对容易地调节在例如不高于15体积％的数值。因此，对根据本发明优选实施方式所规定的“排除任何实质上的气体空间”的理解是，该气体空间的比例通常不高于15体积％。气体空间比例也优选不高于10体积％，更优选为不高于5体积％。借助于内径约为至少8.6mm的适合于皮下注射或肌内注射的预灌装注射器用注射器管(容量一般为几ml，优选为不超过2ml，更优选为不超过1ml，尤其优选为不超过0.5ml)，易于获得摇动稳定性优良的预灌装注射器制剂，只要气体空间比例保持低于上述值即可。
除了上面说明的注射器管以外，在考虑加入表面活性剂时，小瓶和安瓿也可以用作容器。普通的小瓶和安瓿具有相当大的内径，因此，减小和调整它们的气体空间比例是相当困难的。因此，当应当精确地调整气体空间比例时，优选地避免使用小瓶和安瓿。
如上制备的血栓调节素含水注射剂表现出长期稳定性，因此，它在5℃下经过12个月、优选为18个月，能够保留原始活性的至少约80％。在某些情况下，可以允许贮藏/运输经过长时间阶段，甚至超过两年，优选为多达三年，只要满足某些其他条件即可。
根据本发明的血栓调节素含水注射剂即使在这样的条件下也不会发生浑浊，即，在25℃下以幅度5cm、频率180转每分钟摇动一个月。因此，表现出上述足够稳定性的根据本发明的血栓调节素含水注射剂能够以液体形式贮藏/运输长时间阶段。
根据本发明的血栓调节素含水注射剂的贮藏/运输条件可以包括高于导致其冷冻的温度而又不高于室温，具体来说，是0℃至20℃，优选为5℃左右。可允许的持续时间一般可以长达12个月，优选为18个月，更优选为两年。
根据本发明的血栓调节素含水注射剂提供了皮下和肌内注射的给药方式。因此，本发明的第四方面在于血栓调节素的预灌装注射器制剂经由皮下或肌内注射用于对患者给药的方法。
本发明的第五方面在于保持可溶性血栓调节素的血液浓度的方法，其特征在于含有有效量可溶性血栓调节素的持续性血栓调节素含水注射剂经由皮下或肌内注射对患者给药，给药频率为每2至5天一次。
本发明的第六方面在于含有可溶性血栓调节素作为活性成分的持久性血栓调节素含水注射剂，经由皮下或肌内注射对患者给药，给药频率为每2至5天一次。
由于血栓调节素存在于血管内皮细胞的表面上，其作用部位也仅限于血管内，公认的是血栓调节素通过静脉内注射给药可带来直接的作用，因此是最优选的。例如日本特许公开昭64-6219公开了一个静脉内点滴注射的实例。
不过，仍有必要研制一种药剂等，它是按照惯例还没有被发现的，并且根据患者状况和实用方便，可以允许进行适当的选择。
在迄今为止的报道和出版物中，一直没有明确的是，有意将血栓调节素经由静脉内注射以外的途径对患者给药。因此，本发明的发明人对此进行了研究，第一次发现，血栓调节素的血液浓度是能够被提升的，方法是将由这样一种氨基酸序列构成的可溶性血栓调节素通过皮下注射对患者给药，该氨基酸序列由序列表SEQ ID NO：1第19位点至第516位点的氨基酸残基组成(将编码序列表SEQ ID NO：1的氨基酸序列的DNA片段转染给宿主细胞，得到该可溶性血栓调节素)，特别是还发现，该血栓调节素血液浓度的保持时间明显长于由这样一种氨基酸序列构成的可溶性血栓调节素，该氨基酸序列由序列表SEQ IDNO：1第367位点至第480位点的氨基酸残基组成。
因此，本发明提供了一种优选的持续性血栓调节素药剂。
上述持久性药剂进一步包含局部麻醉剂，这也是可取的。进一步的防腐剂成分也是优选的。
局部麻醉剂的优选实例包括盐酸普鲁卡因和苯甲醇。通常，局部麻醉剂的给药量例如可以是在0.5-10％范围内，优选为1-5％，以注射剂总重计。
如果必要的话，可允许注射剂含有氨基酸、盐、碳水化合物、表面活性剂、白蛋白、明胶等，如日本特许公开昭64-6219 A和平6-321805A等所公开。防腐剂的加入也是可取的，其优选实例包括对羟基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸酯混合物。通常，防腐剂的量例如可以是在0.01-1.0％范围内，优选为0.1-0.3％，以注射剂总重计。
对根据本发明的持续性药剂中所用的可溶性血栓调节素来说，每种可溶性血栓调节素都可以混入，没有任何特殊的限制，其中特别优选的是由这样一种氨基酸序列构成的可溶性血栓调节素，该氨基酸序列由序列表SEQ ID NO：1第19位点至第516位点的氨基酸残基组成；由这样一种氨基酸序列构成的可溶性血栓调节素，该氨基酸序列由序列表SEQ ID NO：2第19位点至第516位点的氨基酸残基组成；将编码序列表SEQ ID NO：1氨基酸序列的DNA片段转染给宿主细胞所得到的可溶性血栓调节素；和将编码序列表SEQ ID NO：2氨基酸序列的DNA片段转染给宿主细胞所得到的可溶性血栓调节素。
根据本发明药剂的可持续能力可以由下列事实得到例证，血液浓度的半衰期至少是16小时，血浆中的平均保留时间(MRT)至少是36小时。
根据本发明的可持续性药剂优选为所提供的含水注射剂剂型。根据本发明的持续性药剂可以是以冷冻干燥产品的形式分装的，给药时溶解于水，不过最方便的是使用预灌装的注射器制剂，其制备方法如上所述，用血栓调节素含水注射剂无菌灌装注射器管，制成皮下或肌内注射药物。
在制备根据本发明的持久性制剂时，混入添加剂的实际操作方式没有特殊的限制。因此例如，将添加剂混合到血栓调节素水溶液中，或者预先将添加剂溶于水、注射用水或适当的缓冲溶液，然后将所得溶液以适当比例混合，制成含水注射剂。例如，将每1ml水、注射用水或适当缓冲溶液中含有0.05-15mg、优选为0.1-6mg可溶性血栓调节素以及上述添加剂的水溶液灌装在注射器管或小瓶中，有时候灌装在安瓿中，灌装量例如0.5-10ml，由此制得的制剂用作血栓调节素的含水注射剂，或者在小瓶和安瓿的情况下，所制得的制剂可以进一步进行冷冻干燥。通常，所得到的持久性药剂可以含有例如0.01至100mg的可溶性血栓调节素。
根据本发明的血栓调节素含水注射剂的给药频率可以按照惯例，每天1至3次，不过也可能选择例如每2-5天一次的给药频率。尤其是在皮下或肌内注射的情况下，由于它的持久能力，优选的给药频率例如每2-5天一次。对每次给药的剂量来说，静脉内点滴注射允许给以最大可允许剂量，一次性注入血管的单次给药剂量通常例如每kg体重至多1mg可溶性血栓调节素。最小剂量可以例如每1kg体重至少为0.001mg，优选为至少0.005mg。单次皮下或肌内注射的剂量上限是由一次注射量液体载体中活性成分的最大可溶解量所决定的。适合于皮下或肌内注射的典型剂量一般是几毫升，优选为至多2ml，更优选为至多1ml，尤其优选为至多0.5ml。因此，剂量以通过皮下或肌内注射单次给药的可溶性血栓调节素重量表示，通常例如可以是20mg或以下，其中单次给药的最小有效量例如可以是至少0.001mg每1kg体重，优选为至少0.005mg每1kg体重，如上所示。
根据本发明的持久性血栓调节素制剂通过给药能够发挥其持久能力，不仅经由皮下途径，而且经由肌内途径，其中优选的是皮下注射。
根据本发明，能够显著延长保持血栓调节素血液浓度的持续时间，能够减少给药频率，由此所提供的可溶性血栓调节素药剂的起效量小于常规的静脉内注射剂。该药剂能够减少注射引起的患者疼痛，有时候也可允许患者自己进行注射，因此患者治疗颇为方便。
根据本发明的可溶性血栓调节素含水注射剂的急性毒性检查揭示，通过静脉内注射对每组五只雄性+雌性SD大鼠给药，没有发现致死的情况，血栓调节素的剂量为180mg/kg。以同样的180mg/kg剂量皮下注射给药也没有看到致死的情况。
附图的简要说明
图1显示可溶性血栓调节素对大鼠给药后可溶性血栓调节素血浆浓度的暂时变化。图中，IV表示静脉内注射，SC表示皮下注射。
序列表的自由原文
序列表SEQ ID NO：1中的其他信息指的是人血栓调节素的部分氨基酸序列。
序列表SEQ ID NO：2中的其他信息指的是人血栓调节素的部分氨基酸序列。
序列表SEQ ID NO：3中的其他信息指的是人血栓调节素基因的部分碱基序列。
序列表SEQ ID NO：4中的其他信息指的是人血栓调节素基因的部分碱基序列。
序列表SEQ ID NO：5中的其他信息指的是用于突变的合成DNA。
实施例
下面将通过实施例和对比例对本发明进行具体描述，其中注意，本发明并不限于此。
参考例1
按照Yamamoto等人的方法(日本特许公开昭64-6219说明书实施例10公开的方法)得到实施例中所用的可溶性血栓调节素。因此，将序列表SEQ ID NO：3的DNA整合到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内，得到被转染的细胞，培养该转染细胞，制得可溶性血栓调节素。
参考例2
利用强碱型阴离子交换树脂进行初步纯化
参考例1中得到的11升培养物上清液在负20℃下冷冻后，融化，通过孔径为0.2μm的滤膜(MILLIPACK 20，Millipore公司产品)过滤。
将过滤后的培养物上清液装上Q-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia公司供应，直径20mm，高6.5cm)，柱子预先用含有150mM NaCl的20mMTris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)平衡。然后，柱子用含有180mM NaCl的20mM乙酸盐缓冲液洗涤，然后进一步用含有180mM NaCl的20mMTris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)洗涤，再用含有300mM NaCl的20mMTris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)洗脱，收集从280nm吸收峰开始上升到洗脱0.5柱体积的洗脱部分，作为初步纯化产物。
参考例3
利用亲和柱(凝血酶柱)进行主要的纯化
将参考例2中得到的400ml洗脱部分用含有100mM NaCl和0.5mM氯化钙的20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)透析。透析后，所得透析溶液装上DIP-凝血酶-琼脂糖凝胶柱(06-148-1O35，PAESE LOREI公司供应，直径50mm，高6cm)，柱子预先用含有100mM NaCl和0.5mM CaCl2的20mM Tris缓冲溶液(pH 7.4)平衡。用含有200mM NaCl和0.5mM CaCl2的20mM Tris缓冲溶液(pH 7.4)洗涤后，用含有1.0M NaCl和0.5mMCaCl2的20mM Tris缓冲溶液(pH 7.4)开始洗脱，收集从280nm吸收峰开始上升到其下降的洗脱部分，作为主要的纯化产物。
参考例4
利用亲和柱(抗体B)进行主要的纯化
亲和柱是如下制备的：
首先得到抗血栓调节素单克隆抗体B，其方法是对产生该抗体的杂交瘤经培养所得培养物上清液进行纯化，或者是对一种组织适合性动物、例如裸鼠的腹膜杂交瘤经培养所得腹水进行纯化，纯化方法是分离和纯化操作，例如盐析、离子交换色谱或蛋白A柱的使用。其次，按照Pharmacia手册的操作(《亲和色谱原理与方法》)，将所纯化的抗血栓调节素单克隆抗体B溶于含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3缓冲溶液(pH 8.3)，将该溶液与CNBr活化的琼脂糖凝胶4B(52-1153-00-AI，Pharmacia产品)接触，使抗血栓调节素单克隆抗体4B与琼脂糖凝胶4B偶联，得到与抗血栓调节素单克隆抗体(抗体B)偶联的琼脂糖4B。将该与抗血栓调节素抗体(抗体B)偶联的琼脂糖4B装柱，制得单克隆抗体(抗体B)柱。
将参考例2中得到的400ml洗脱部分装上单克隆抗体(抗体B)柱(直径50mm，高6cm)，柱子预先用含有1.0M NaCl的20mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.3)平衡。然后，使用含有1.0M NaCl的20mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.3)流过柱子，再用100mM乙酸盐缓冲溶液(pH 5.0)洗涤，用含有0.3M NaCl的100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH 3.0)开始洗脱，收集从280nm吸收峰开始上升到其下降的洗脱部分，作为主要的纯化产物。
参考例5
利用强酸型离子交换柱进行高纯度纯化
(1)凝血酶柱洗脱液(SP不吸附的部分)的纯化
将参考例3中得到的200ml洗脱液用100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH 3.5)稀释，用1.0M甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH 2.0)调节所稀释的溶液pH为3.5。将该经过稀释和pH调节的洗脱液装上SP-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia供应，直径26mm，高3cm)，柱子预先用含有300mM NaCl的100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(比电导率为31ms/cm，pH 3.5)平衡。用含有300mM NaCl的100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(同上)开始洗涤，收集从280nm吸收峰开始上升到其下降的洗脱部分，用500mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.3)中和一次，至pH为7.0，得到高纯度产物。
(2)单克隆抗体柱洗脱液的纯化(SP不吸附的部分)
将参考例4中得到的180ml洗脱液用1.0M甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH2.0)处理，调节其pH为3.5，然后装上SP-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia供应，直径26mm，高3cm)，柱子预先用含有300mM NaCl的100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(同上)平衡。用含有300mM NaCl的100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(同上)开始洗涤，收集从280nm吸收峰开始上升到其下降的洗脱部分，用500mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.3)中和一次，至pH为7.0，得到高纯度产物。
(3)凝血酶柱洗脱液的纯化(SP吸附的部分)
将参考例3中得到的200ml洗脱液用100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH 3.5)稀释，用1.0M甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH 2.0)调节所稀释的溶液pH为3.5。将该经过稀释和pH调节的洗脱液装上SP-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia供应，直径26mm，高3cm)，柱子预先用含有100mM NaCl的100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH 3.5)平衡。用含有100mM NaCl的100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH 3.5)洗涤柱子，用100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH 3.5)洗脱，收集从280nm吸收峰开始上升到其下降的洗脱部分，用500mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.3)中和一次，至pH为7.0，得到高纯度产物。
(4)抗体柱洗脱液的纯化(SP吸附的部分)
将参考例4中得到的180ml洗脱液用100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH 3.5)稀释，用1.0M甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH 2.0)调节所稀释的溶液pH为3.5。将该经过稀释和pH调节的洗脱液装上SP-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia供应，直径26mm，高3cm)，柱子预先用含有100mM NaCl的100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH 3.5)平衡。用含有100mM NaCl的100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH 3.5)洗涤柱子，用含有300mM NaCl的100mM甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH 3.5)洗脱，收集从280nm吸收峰开始上升到其下降的洗脱部分，用500mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.3)中和一次，至pH为7.0，得到高纯度产物。
参考例6
用聚砜中空纤维浓缩高纯度产物
将参考例5中得到的高纯度产物用聚砜中空纤维(旭化成工业株氏会社供应)浓缩，每支长1m，预先用含有50mM NaCl的20mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.3)处理使其湿润，由此得到相应数量的浓缩试样，每份为5ml。
参考例7
用凝胶过滤柱交换高纯度产物的缓冲溶液
将每份参考例6中得到的5ml浓缩高纯度产物装上聚丙烯酰胺葡聚糖S-300柱(Pharmacia公司，直径16mm，高90cm)，柱子预先用含有50mM NaCl的20mM磷酸盐缓冲溶液(pH 7.3)平衡。该柱用含有50mMNaCl的20mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.3)进行展开，于是得到洗脱部分。按照检测方法1检查每部分的血栓调节素加速凝血酶活化蛋白C的活性，收集表现出该活性的部分，由此得到高纯度产物的经过交换的缓冲溶液。
在下面给出的实施例和对比例中，所用每种高纯度血栓调节素产物是按照参考例2、4、5(2)、6和7的顺序进行纯化的。对调节缓冲溶液浓度和使用除磷酸钠缓冲溶液以外的缓冲组分来说，缓冲组分的交换方法是用每种缓冲溶液分别透析上面得到的高纯度产物。通过进一步加入适当浓度的缓冲溶液，来调节血栓调节素的浓度。加入适量稀盐酸或氢氧化钠溶液进行pH的调节。
所得血栓调节素确实可溶于注射用水，浓度至少为6mg/ml。用下面给出的操作也确定其分子量为66000±10000(非还原态)：分子量的测定
使用梯度电泳凝胶(SDS聚丙烯酰胺梯度凝胶，商品名为PAGEL，5/20％，Atto公司；凝胶大小为90×73×1.0mm)，在25℃、恒定电流20mA下，以非还原态进行电泳分析90分钟，在测定血栓调节素的分子量时使用一种分子量标准(小分子量电泳试剂盒：Pharmacia产品，在一只小瓶内含有磷酸化酶b(分子量＝94000)、牛血清白蛋白(分子量＝67000)、卵白蛋白(分子量＝43000)、羰基脱水酶(分子量＝30000)、胰蛋白酶抑制剂(分子量＝20100)、α-乳白蛋白(分子量＝14400)和蔗糖)。考马斯艳蓝进行染色。
参考例8
以下述方法得到由序列表SEQ ID NO：1第367位点至第480位点残基的氨基酸构成的可溶性血栓调节素：将按照日本特许公开平5-213998 A实施例1-(l)-(b)给出的操作得到的质粒用其实施例1-(2)所述方法转染给细胞，然后用其实施例3-(3)给出的操作进行纯化，于是完成缓冲溶液的交换，以得到可溶性血栓调节素的高纯度产物。
所得可溶性血栓调节素确实可溶于注射用水，浓度至少为6mg/ml。用上面给出的操作也进一步确定其分子量为25000±5000(非还原态)。
对调节缓冲溶液浓度和使用除磷酸钠缓冲溶液以外的缓冲组分来说，缓冲组分的交换方法是用每种缓冲溶液分别透析上面得到的高纯度产物。通过进一步加入适当浓度的缓冲溶液，来调节血栓调节素的浓度。加入适量稀盐酸或氢氧化钠溶液进行pH的调节。
参考例9
以下述方法得到由序列表SEQ ID NO：2第19位点至第516位点残基的氨基酸构成的可溶性血栓调节素：按照《酶学方法》100，468(1983)，学术出版社所述的方法，使用具有序列表SEQ ID NO：5碱基序列的用于突变的合成DNA，对具有序列表SEQ ID NO：3碱基序列的DNA片段进行位点特异性突变，使其突变为编码序列表SEQ ID NO：2氨基酸序列的DNA，然后进行参考例1至7的操作，得到上面确定的可溶性血栓调节素。
所得可溶性血栓调节素确实可溶于注射用水，浓度至少为6mg/ml。用上面给出的操作也进一步确定其分子量为66000±10000(非还原态)。
对调节缓冲溶液浓度和使用除磷酸钠缓冲溶液以外的缓冲组分来说，缓冲组分的交换方法是用每种缓冲溶液分别透析上面得到的高纯度产物。通过进一步加入适当浓度的缓冲溶液，来调节血栓调节素的浓度。加入适量稀盐酸或氢氧化钠溶液进行pH的调节。
实施例1
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为0.2mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿(内径为12mm)中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品。该产品“受摇动部分”中的“气体空间比例”约为35体积％。
实施例2
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为0.2mM，向其中加入NaCl和聚氧乙烯氢化蓖麻油(商品名为HCO-60)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.1％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例3
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，乙酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例4
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，乙酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚氧乙烯氢化蓖麻油(商品名为HCO-60)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.1％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例5
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，乙酸钠缓冲溶液的浓度为200mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例6
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，乙酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为5.5。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例7
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，乙酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为5.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例8
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，乙酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例9
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，乙酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为5.5。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例10
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为lmg/ml，乙酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为5.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例11
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，乙酸钠缓冲溶液的浓度为0.2mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例12
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，乙酸钠缓冲溶液的浓度为0.2mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为5.5。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例13
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，乙酸钠缓冲溶液的浓度为0.2mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为5.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例14
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为200mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例15
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为200mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为5.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例16
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例17
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为5.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例18
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例19
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为5.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例20
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液和乙酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为7.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例21
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液和乙酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.5。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例22
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液和乙酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例23
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液和乙酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为5.5。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例24
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液和乙酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为5.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例25
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，丙二酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例26
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，琥珀酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例27
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，戊二酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例28
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，酒石酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例29
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，富马酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例30
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，苹果酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例31
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，丙酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例32
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例33
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，柠檬酸钠缓冲溶液和丙酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例34
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，柠檬酸钠缓冲溶液和戊二酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例35
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，柠檬酸钠缓冲溶液和琥珀酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例36
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，柠檬酸钠缓冲溶液和酒石酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例37
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，柠檬酸钠缓冲溶液和富马酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例38
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，柠檬酸钠缓冲溶液和苹果酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例39
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，丙酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例40
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl和聚氧乙烯氢化蓖麻油(HCO-60)，使它们的浓度分别固定在150mM和1％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例41
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl和聚氧乙烯氢化蓖麻油(HCO-60)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.1％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例42
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl和聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)甘醇(商品名：Pluronic F68)，使它们的浓度分别固定在150mM和1％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例43
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl和聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)甘醇(商品名：Pluronic F68)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.1％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例44
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入聚山梨醇酯80(吐温80)，使其浓度固定在0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例45
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在5％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例46
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例47
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在15％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例48
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在25％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例49
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为8.6mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在5％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例50
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为8.6mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例51
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为8.6mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在15％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例52
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为8.6mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在25％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例53
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每0.5ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例54
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每0.5ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在15％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例55
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每0.5ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在30％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例56
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每0.5ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在40％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例57
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每0.5ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(标准型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为8.6mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在40％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例58
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每0.5ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(标准型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为8.6mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在50％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例59
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每0.5ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(0.5ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，带针头)中，每管内径为4.6mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例60
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每0.5ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(0.5ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，带针头)中，每管内径为4.6mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在15％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例61
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每0.3ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(0.5ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，带针头)中，每管内径为4.6mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在15％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例62
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每0.3ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(0.5ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，带针头)中，每管内径为4.6mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在35％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例63
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每0.3ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(0.5ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，带针头)中，每管内径为4.6mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在50％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例64
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为5.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例65
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为5.5。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例66
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.5。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例67
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为7.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例68
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例69
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为200mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例70
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，乙酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例71
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，乙酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例72
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，乙酸钠缓冲溶液的浓度为200mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例73
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为0.1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例74
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为0.3mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例75
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为3mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为6mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例76
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为6mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为12mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例77
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为3mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为6mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每0.5ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在15％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例78
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为6mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为12mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每0.5ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在15％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例79
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例80
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为3mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为6mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例81
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为6mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为12mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每0.5ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在15％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例82
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为6mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为12mM，向其中加入NaCl和聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每0.5ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在15％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例83
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液和乙酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例84
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液和丙酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例85
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液和戊二酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例86
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液和琥珀酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例87
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液和酒石酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例88
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液和富马酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例89
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液和苹果酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例90
制备一水溶液，以调节参考例9的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
实施例91
制备一水溶液，以调节参考例9的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
实施例92
制备一水溶液，以调节参考例8的可溶性血栓调节素(由序列表SEQID NO：1第367位点至第480位点氨基酸残基组成)浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
对比例1
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为7.3。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
对比例2
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
对比例3
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为0.2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
对比例4
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，乙酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
对比例5
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为200mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为7.3。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
对比例6
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为7.3。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
对比例7
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为7.3。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
对比例8
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液和乙酸钠缓冲溶液的浓度分别为20mM和20mM，向其中加入NaCl和聚山梨醇酯80(吐温80)，使它们的浓度分别固定在150mM和0.01％，此时调其pH为7.3。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
对比例9
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为7.3。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品。受摇动部分内的气体空间比例为35％。
对比例10
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为7.3。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
对比例11
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每0.5ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(标准型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为8.6mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在60％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
对比例12
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每0.5ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(标准型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为8.6mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在70％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
对比例13
制备一水溶液，以调节参考例7的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为7.3。将每1ml所制备的水溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。
对比例14
制备一水溶液，以调节参考例9的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
对比例15
制备一水溶液，以调节参考例8的可溶性血栓调节素浓度为1mg/ml，磷酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，向其中加入NaCl，使其浓度固定在150mM，此时调其pH为6.0。将每2ml上面得到的水溶液灌装在2ml容量安瓿中，密封，制得含有可溶性血栓调节素的含水注射剂安瓿产品(气体空间比例＝35％)。
试验例1
按照下面给出的检查方法1操作，测定了实施例1至4和对比例1至4的每种血栓调节素含水注射剂的活性保存率(即百分残余活性)，用于评价热稳定性。判定为“通过”的制剂是，在50℃下保持96小时后，用检查方法1测定其残余活性值至少为66％。按照Arrhenius绘图的预测，假定残余活性至少为66％的制剂在5℃下保存时具有至少80％的残余活性，寿命为三年。另一方面，按照下面给出的检查方法2操作进行抗摇动稳定性的评价。被判定令检查方法1和2都满意的制剂综合评价为“合适”，其他记为“不合适”。结果总结在表1中。
表1
对比例 实施例
1 2 3 4 1 2 3 4
缓冲溶液(浓度) Na-PO4 1)(20mM) Na-PO4(20mM) Na-PO4(0.2mM) Na-Ac2)(20mM) Na-PO4(0.2mM) Na-PO4(0.2mM) Na-Ac(20mM) Na-Ac(20mM)
贮藏的pH条件 7.3 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0
表面活性剂(浓度) 无 无 无 无 吐温80(0.01％) HCO-60(0.1％) 吐温80(0.01％) HCO-60(0.1)
检查方法1 55.4 79.1 83.4 86.7 84.7 85.4 87.8 84.4
％残余活性
检查方法2 浑浊-- 浑浊-- 浑浊2.93098.4 浑浊2.93099.6 澄清3)0.000100.6 澄清0.002101.0 澄清0.002101.8 澄清0.002102.5
外观浊度％残余活性
评价 不合适 不合适 不合适 不合适 合适 合适 合适 合适
注：1)：Na-PO4＝磷酸钠缓冲液
2)：Na-Ac＝乙酸钠缓冲液
3)：澄清＝无色透明
如表1所示，在pH 6.0下，所有既含有磷酸钠缓冲溶液又含有乙酸钠缓冲溶液的制剂在热稳定性试验中的百分残余活性都高于66％，而pH为7.3的对比例1制剂低于66％。当存在一种表面活性剂时，即吐温80或HCO-60，所得含水注射剂在摇动稳定性试验中不变浑浊，综合评价为“合适”。
《检查方法1》
热稳定性试验(在50℃下加热96小时)
使供试含水注射剂受到50℃热处理96小时，测定血栓调节素的活性，以评估活性保存率(百分残余活性)，方法是假定不受到热处理的冷冻贮藏的制剂原始值为100％，将所观察到的热处理注射剂的活性值与之比较。
通过观察血栓调节素含水制剂加速凝血酶活化蛋白C的功能(APC测定)来进行该制剂活性的测定。将含有可溶性血栓调节素的含水注射剂适当稀释，制得适当的样本溶液，其中含有0.35至1.4ng血栓调节素，取5μl样本溶液，加入到37.5μl50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.5)中，该缓冲溶液还含有100mM NaCl、3mM氯化钙、0.1％牛血清白蛋白(Sigma公司供应)和0.225 NIHU人凝血酶(Sigma公司供应)，混合物在37℃下保持15分钟，向其中加入7.5μl约300μg/ml的牛蛋白C(Life Technologies公司供应)，所得混合物再在37℃下保持30分钟，以活化蛋白C。然后，向该混合物中加入含有约100μl/ml肝素的约7.5μl水溶液(Wako Pure Chemical Ind.，Ltd.供应)和约6μl/ml抗凝血酶III(Life Technologies公司)，以终止反应。然后向该混合物中加入含有100μg/ml合成底物(Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA)的500μl溶液，所得混合物在37℃下保持20分钟。然后加入50μl乙酸以终止该底物剪切反应。检查反应混合物，用荧光分光光度计观察激发波长380nm、发射波长440nm下的荧光强度，测定表现出来的活化蛋白C的量，由此通过与标准血栓调节素活性的参考制剂比较，计算血栓调节素的活性。
《检查方法2》
抗摇动稳定性试验(每分钟180次往复摇动)
使供试含水注射剂受到25℃恒温摇动器的摇动处理，其条件是幅度为5cm，每分钟往复180转，时间一个月，以观察摇动处理前后的外观变化。如果必要的话，测定血栓调节素的浊度(650nm下的吸光度)和残余活性。往复运动的方向是固定的，平行于试管的纵轴。血栓调节素活性测定的实际操作与检查方法1相同。
试验例2
利用检查方法1和2对实施例3、5至13和对比例1的含水注射剂进行试验，以相似方式评估对它们的总体评价。结果总结在表2中。表2
对比例1                                                       实施例
    3     5     6     7     8     9     10     11     12     13
缓冲溶液(浓度)   Na-PO4 1)(20mM) Na-Ac2)(20mM) Na-Ac(200mM) Na-Ac(20mM) Na-Ac(20mM) Na-Ac(2mM) Na-Ac(2mM) Na-Ac(2mM) Na-Ac(0.2mM) Na-Ac(0.2mM) Na-Ac(0.2mM)
贮藏的pH条件   7.3 6.0 6.0 5.5 5.0 6.0 5.5 5.0 6.0 5.5 5.0
表面活性剂(浓度)   无 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.O1％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(O.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％)
检查方法1％残余活性 55.4 87.8 85.4 90.3 75.1 85.4 79.0 75.7 84.4 80.9 77.4
检查方法2外观浊度％残余活性 浑浊-- 澄清3)-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清--
评价   不合适 合适 合适 合适 合适 合适 合适 合适 合适 合适 合适
注：1)：Na-PO4＝磷酸钠缓冲液
2)：Na-Ac＝乙酸钠缓冲液
3)：澄清＝无色透明
如表2所示，缓冲溶液浓度的改变对乙酸钠缓冲溶液的浓度在0.2至200mM范围内变化是没有影响的，所有含水制剂在热稳定性试验中的残余活性都高于66％。在0.01％吐温80的存在下，摇动稳定性试验中没有发生浑浊，所得含水注射剂的总体评价表现为“合适”。
试验例3
利用检查方法1和2对实施例14至19和对比例5至7的含水注射剂进行试验，以相似方式评估对它们的总体评价。结果总结在表3中。表3
对比例5 实施例 对比例6 实施例 对比例7     实施例
    14     15     16     17     18     19
缓冲溶液(浓度) Na-PO4 1)(200mM) Na-PO4(200mM) Na-PO4(200mM) Na-PO4(20mM) Na-PO4(20mM) Na-PO4(20mM) Na-PO4(2mM) Na-PO4(2mM) Na-PO4(2mM)
贮藏的pH条件 7.3 6.0 5.0 7.3 6.0 5.0 7.3 6.0 5.0
表面活性剂(浓度) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％)
检查方法1％残余活性 7.1 73.7 67.8 54.1 88.2 72.3 63.2 86.8 70.3
检查方法2外观浊度％残余活性 澄清3)-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清--
评价 不合适 合适 合适 不合适 合适 合适 不合适 合适 合适
注：1)：Na-PO4＝磷酸钠缓冲液
3)：澄清＝无色透明
如表3所示，在pH 7.3下，缓冲溶液浓度的改变对磷酸钠缓冲溶液的浓度在2至200mM范围内变化是有影响的，不过所有含水制剂在热稳定性试验中的残余活性都高于66％，只要制剂的pH是在5.0-6.0范围内。在0.01％吐温80的存在下，摇动稳定性试验中没有发生浑浊，所得含水注射剂的总体评价表现为“合适”。
试验例4
利用检查方法1和2对实施例20至24和对比例1和8的含水注射剂进行试验，以相似方式评估对它们的总体评价。结果总结在表4中。表4
          对比例                       实施例
    1     8     20     21     22     23     24
缓冲溶液(浓度) Na-PO4 1)(20mM) Na-PO4(20mM)，Na-Ac2)(20mM) Na-PO4(20mM)，Na-Ac(20mM) Na-PO4(20mM)，Na-Ac(20mM) Na-PO4(20mM)，Na-Ac(20mM) Na-PO4(20mM)，Na-Ac(20mM) Na-PO4(20mM)，Na-Ac(20mM)
贮藏的pH条件   7.3 7.3 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0
表面活性剂(浓度) 无 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％)
检查方法1％残余活性 55.4 59.8 68.9 74.2 81.3 80.7 71.3
检查方法2外观浊度％残余活性 浑浊-- 澄清3)-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清--
评价   不合适 不合适 合适 合适 合适 合适 合适
注：1)：Na-PO4＝磷酸钠缓冲液
2)：Na-Ac＝乙酸钠缓冲液
3)：澄清＝无色透明
如表4所示，所有pH值在5.0-7.0范围内的含水注射剂在热稳定性试验中的残余活性都高于66％，此时缓冲组分、即磷酸钠缓冲溶液和乙酸钠缓冲溶液的浓度都调为20mM，含水制剂的pH在5.0至7.3范围内变化。在5.5-6.5的pH范围内，含水制剂在热稳定性中的残余活性高于73％，假定这相当于制剂在5℃下贮藏的寿命，保存了原始活性的至少80％。特别是pH为5.5和6.0的制剂的残余活性高达80％以上。另一方面，pH 7.3下的残余活性低于66％(对比例1和8)。在0.01％吐温80的存在下，摇动稳定性试验中没有发生浑浊，所得含水注射剂的总体评价表现为“合适”。
试验例5
利用检查方法1和2对实施例25至32和对比例1和2的含水注射剂进行试验，以相似方式评估对它们的总体评价。结果总结在表5中。表5
         对比例                                                实施例
    1     2     25     26     27     28     29     30     31     32
缓冲溶液(浓度) Na-PO4 1)(20mM)     Na-PO4(20mM) 丙二酸钠(20mM) 琥珀酸钠(20mM) 戊二酸钠(20mM) 酒石酸钠(20mM) 富马酸钠(20mM) 苹果酸钠(20mM) 丙酸钠(20mM) 柠檬酸钠(20mM)
贮藏的pH条件 7.3     6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0  6.0 6.0 6.0
表面活性剂(浓度) 无 无 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％)  吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％)
检查方法1％残余活性 55.4 79.1 85.9 81.7 82.4 74.5 77.3 77.0 79.2 74.5
检查方法2外观浊度％残余活性 浑浊-- 浑浊-- 澄清3)-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清--
评价 不合适    不合适 合适 合适 合适 合适 合适  合适 合适 合适
注：1)：Na-PO4＝磷酸钠缓冲液
3)：澄清＝无色透明
如表5所示，当pH固定在6.0时，即使将缓冲溶液改为20mM不同羧酸盐，所有残余活性也都高于66％。在0.01％吐温80的存在下，摇动稳定性试验中没有发生浑浊，所得含水注射剂的总体评价表现为“合适”。
试验例6
利用检查方法1和2对实施例33至38和对比例1和2的含水注射剂进行试验，以相似方式评估对它们的总体评价。结果总结在表6中。表6
        对比例                                          实施例
    1     2     33     34     35     36     37     38
缓冲溶液(浓度)   Na-PO4 1)(20mM) Na-PO4(20mM) Na-PO4(20mM)，丙酸钠(20mM) Na-PO4(20mM)，戊二酸钠(20mM)   Na-PO4(20mM)，琥珀酸钠(20mM)   Na-PO4(20mM)，酒石酸钠(20mM) Na-PO4(20mM)，富马酸钠(20mM) Na-P04(20mM)，苹果酸钠(20mM)
贮藏的pH条件 7.3   6.0 6.0 6.0   6.0   6.0 6.0 6.0
表面活性剂(浓度) 无 无 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％)   吐温80(0.01％)   吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％)
检查方法1％残余活性 55.4 79.1 78.0 76.1 82.1 81.3 72.6 84.3
检查方法2外观浊度％残余活性 浑浊-- 浑浊-- 澄清3)-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清-- 澄清--
评价 不合适   不合适 合适 合适   合适   合适 合适 合适
注：1)：Na-PO4＝磷酸钠缓冲液
3)：澄清＝无色透明
如表6所示，当pH固定在6.0时，即使向磷酸钠缓冲溶液中加入不同羧酸盐缓冲组分，所有残余活性也都高于66％。在0.01％吐温80的存在下，摇动稳定性试验中没有发生浑浊，所得含水注射剂的总体评价表现为“合适”。
试验例7
利用检查方法1和2对实施例18、39至43和对比例9的含水注射剂进行试验，以相似方式评估对它们的总体评价。结果总结在表7中。表7
对比例9                                                   实施例
    39     18     40     41     42     43     44
缓冲溶液(浓度) Na-PO4 1)(2mM) Na-PO4(2mM) Na-PO4(2mM) Na-PO4(2mM)   Na-PO4(2mM)   Na-PO4(2mM)   Na-PO4(2mM)   Na-PO4(20mM)
贮藏的pH条件 7.3 6.0 6.0 6.0   6.0   6.0   6.0   6.0
表面活性剂(浓度) 无 吐温80(0.1％) 吐温80(0.01％) HCO-60(1％)   HCO-60(0.1％)   PluronicF68(1％)   PluronicF68(0.1％)   吐温80(0.01％)
检查方法1％残余活性 不合适 合格 合格 合格 合格 合格 合格 合格
检查方法2外观浊度％残余活性 浑浊1.29990.8 澄清3)-0.00897.6 澄清-0.01087.0 澄清0.01787.8 澄清-0.00393.8 澄清0.010101. 7 澄清-0.00493.2 澄清
评价 不合适 合适 合适 合适   合适   合适   合适   合适
注：1)：Na-PO4＝磷酸钠缓冲液
3)：澄清＝无色透明
如表7所示，不含表面活性剂的含水制剂(对比例9)在摇动稳定性试验中变浑浊，而摇动含有不同浓度的不同表面活性剂的试样则没有发生浑浊。浓度为0.1％的商品名为吐温80的表面活性剂和浓度为0.1％的商品名为HCO-60及Pluronic F68的表面活性剂达到足够的效果。没有观察到氯化钠的影响。
试验例8
利用检查方法1和2对实施例45至63和对比例10至12的含水注射剂进行试验，以相似方式评估对它们的总体评价。结果总结在表8中。表8
               对比例                                                           实施例
    10     11     12     45     46     47     48     49     50     51     52
缓冲溶液(浓度)   Na-PO4 1)(2mM)     Na-PO4(2mM)     Na-PO4(2mM)   Na-PO4(2mM)     Na-PO4(2mM)    Na-PO4(2mM)   Na-PO4(2mM)     Na-PO4(2mM)     Na-PO4(2mM)     Na-pO4(2mM)   Na-PO4(2mM)
贮藏的pH条件   7.3     6.0     6.0   6.0     6.0    6.0    6.0     6.0     6.0     6.0     6.0
气体空间比例(％)   10     60     70   5     10    15    25     5     10     15     25
检查方法1％残余活性 不合适 合格 合格 合格 86.5 合格 合格 合格 合格 合格 93.2
检查方法2外观浊度％残余活性 澄清3)0.012- 浑浊0.12492.9 浑浊0.18295.3 澄清0.00497.8 澄清0.00698.6 澄清0.01996.8 澄清0.01093.2 澄清0.00593.2 澄清0.00892.7 澄清0.01090.7 澄清0.04992.7
评价   不合适     不合适     不合适   合适     合适    合适   合适     合适     合适     合适     合适
注：1)：Na-PO4＝磷酸钠缓冲液
3)：澄清＝无色透明表8(续)
                                                         实施例
    53     54     55     56     57     58     59     60     61     62     63
缓冲溶液(浓度)  Na-PO4 1)(2mM)  Na-PO4(2mM)  Na-PO4(2mM)  Na-PO4(2mM)  Na-PO4(2mM)  Na-PO4(2mM)  Na-PO4(2mM)  Na-PO4(2mM)  Na-PO4(2mM)  Na-PO4(2mM)  Na-PO4(2mM)
贮藏的pH条件     6.0    6.0    6.0     6.0     6.0     6.0    6.0     6.0   6.0     6.0     6.0
气体空间比例(％)     10    15    30     40     40     50    10     15   15     35     50
检查方法1％残余活性 合格 合格 合格 80.9 合格 合格 合格 合格 合格 合格 合格
检查方法2外观浊度％残余活性 clear3)0.00596.5 clear0.01895.8 clear0.01396.8 clear0.01897.8 clear0.01697.2 clear0.04592.8 clear0.020- clear0.005- clear0.022- clear0.015- clear0.014-
评价    合适    合适   合适     合适     合适     合适    合适     合适   合适     合适     合适
注：1)：Na-PO4＝磷酸钠缓冲液
3)：澄清＝无色透明
如表8所示，当受摇动部分内气体空间比例低于50体积％时，在摇动稳定性试验中没有发生浑浊，而在对比例11和12中，它们的气体空间比例分别为60体积％和70体积％，摇动后观察到了浑浊的发生。在pH值调为6.0的情况下，热稳定性试验中的残余活性高于66％，所得含水注射剂表现出来的总体评价为“合适”。
试验例9
利用检查方法1和2对实施例46和64至72和对比例10的含水注射剂进行试验，以相似方式评估对它们的总体评价。结果总结在表9中。表9
对比例10                                                               实施例
    46     64     65     66     67     68     69     70     71     72
缓冲溶液(浓度)   Na-PO4 1)(2mM)     Na-PO4(2mM)    Na-PO4(2mM)    Na-PO4(2mM)     Na-PO4(2mM)     Na-PO4(2mM)     Na-PO4(20mM)     Na-PO(200mM)    Na-Ac2)(2mM)     Na-Ac(20mM)     Na-Ac(200mM)
贮藏的pH条件     7.3     6.0    5.0    5.5     6.5     7.0     6.0     6.0     6.0     6.0     6.0
气体空间比例(％)     10     10    10    10     10     10     10     10     10     10     10
检查方法1％残余活性 不合适 86.5 66.2 75.9 75.9 67.2 79.6 74.6 92.4 88.4 91.8
检查方法2外观浊度％残余活性 澄清3)0.012- 澄清0.00698.6 澄清0.02087.9 澄清0.02294.8 澄清0.01390.9 澄清0.01393.0 澄清0.007- 澄清0.016- 澄清0.014- 澄清0.015- 澄清0.016-
评价     不合适     合适    合适    合适     合适     合适     合适     合适     合适     合适     合适
注：1)：Na-PO4＝磷酸钠缓冲液
2)：Na-Ac＝乙酸钠缓冲液
3)：澄清＝无色透明
如表9所示，磷酸钠缓冲溶液或乙酸钠缓冲溶液的浓度在2-200mM范围内的改变是没有影响的，当pH在5.0-7.0范围内调节时，热稳定性试验中的所有残余活性都高于66％。在气体空间比例固定为10％的情况下，摇动稳定性试验中没有观察到浑浊的发生，所得含水注射剂表现出来的总体评价为“合适”。
试验例10
利用检查方法1和2对实施例46、73至82、90至92和对比例13至15的含水注射剂进行试验，以相似方式评估对它们的总体评价。结果总结在表10中。表10
对比例13                                                             实施例
    73     74     46     75     76     77     78     79     80     81
缓冲溶液(浓度)   Na-PO4 1)(20mM)     Na-PO4(2mM)     Na-PO4(2mM)     Na-PO4(2mM)     Na-PO4(6mM)     Na-PO4(12mM)     Na-PO4(6mM)     Na-PO4(12mM)     Na-PO4(2mM)     Na-PO4(6mM)     Na-PO4(12mM)
贮藏的pH条件     7.3     6.0     6.0     6.0     6.0     6.0     6.0     6.0     6.0     6.0     6.0
表面活性剂(浓度)     无     无     无     无     无     无     无     无     吐温80(0.01％)     吐温80(0.01％)     吐温80(0.01％)
检查方法1％残余活性 51.9 89.1 84.4 86.5 合格 合格 69.9 82.2 合格 合格 合格
检查方法2外观浊度％残余活性 澄清3)0.00487.9 澄清0.00994.5 澄清0.01497.8 澄清0.00698.6 澄清0.01589.8 澄清0.01995.2 澄清0.04299.4 澄清0.028101.9 澄清0.00495.6 澄清0.00296.7 澄清0.00296.9
评价     不合适     合适     合适     合适     合适     合适     合适     合适     合适     合适     合适
注：1)：Na-PO4＝磷酸钠缓冲液
3)：澄清＝无色透明表10(续)
                      实施例 对比例14
    82     90     91     92
缓冲溶液(浓度)   Na-PO4 1)(12mM)   Na-PO4(20mM)     Na-PO4(2mM)   Na-PO4(20mM)   Na-PO4(20mM)
贮藏的pH条件     6.0   6.0     6.0   6.0   6.0
表面活性剂(浓度)     Cremo-phor EL(0.01％)   吐温80(0.01％)     无   吐温80(0.01％) 无
检查方法1％残余活性 合格 合格 合格 合格 合格
检查方法2外观浊度％残余活性 澄清3)0.00094.8 澄清-- 澄清 澄清-- 浑浊--
评价     合适   合适     合适   合适   不合适
注：1)：Na-PO4＝磷酸钠缓冲液
3)：澄清＝无色透明
如表10所示，血栓调节素至少在0.1mg/ml至6mg/ml范围内的变化是没有影响的，当调pH为6.0时，所有残余活性都高于66％。当气体空间比例固定在10-15％时，在摇动稳定性试验中没有发生浑浊，所得含水注射剂表现出来的总体评价为“合适”。
根据对比例14，参考例9的可溶性血栓调节素确实也存在摇动稳定性问题。实施例90和91的结果证实，使用参考例9的可溶性血栓调节素，根据本发明也得到了具有优良热稳定性和摇动稳定性的可溶性血栓调节素含水注射剂。
实施例92使用了参考例8的可溶性血栓调节素，得到了具有优良热稳定性和摇动稳定性的含水注射剂。
试验例11
利用下面给出的用于测定促进稳定性的检查方法3对实施例1、3和79至82和对比例6和13的含水注射剂进行试验，其中残余活性是在20℃下贮藏后测定的。结果总结在表11中。表11
    对比例                                       实施例
    6     13     1     3     79     80     81     82
缓冲溶液(浓度)   Na-PO4 1)(20mM)     Na-PO4(20mM)   Na-PO4(0.2mM)     Na-Ac2)(20mM) Na-PO4(2mM) Na-PO4(6mM) Na-PO4(12mM) Na-PO4(12mM)
贮藏的pH条件     7.3     7.3   6.0     6.0 6.0 6.0 6.0 6.0
表面活性剂(浓度)      吐温80(0.01％) 无   吐温80(0.01％)     吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％) Cremo-phor EL(0.01％)
检查方法3％残余活性，在0个月后3个月后6个月后 10067.152.4 10081.863.2 10092.573.7 10097.580.1 10092.886.4 10094.485.6 10093.484.9 10094.082.5
注：1)：Na-PO4＝磷酸钠缓冲液
2)：Na-Ac＝乙酸钠缓冲液
如表11所示，实施例1、3和79至82的含水注射剂显然是稳定的，而对比例6和13的残余活性在20℃下贮藏6个月后分别降至52.4％和63.2％。
《检查方法3》
促进稳定性试验(在20℃下贮藏6个月)
将供试含水注射剂在20℃下贮藏6个月，由此测定血栓调节素的残余活性。进行血栓调节素活性测定的方式与检查方法1相同。
试验例12
利用下面给出的用于测定长期稳定性的检查方法4对实施例1和3的含水注射剂进行试验，其中血栓调节素残余活性是在5℃下贮藏后测定的。进行血栓调节素活性测定的方式与检查方法1相同。结果总结在表12中。表12
    实施例
    1     3
缓冲溶液(浓度) Na-PO4 1)(0.2mM) Na-Ac2)(20mM)
贮藏的pH条件 6.0 6.0
表面活性剂(浓度) 吐温80(0.01％) 吐温80(0.01％)
检查方法3％残余活性，在0个月后3个月后6个月后9个月后 10097.393.197.9 100105.3101.5107.6
注：1)：Na-PO4＝磷酸钠缓冲液
2)：Na-Ac＝乙酸钠缓冲液
实施例1和3的含水注射剂在5℃下贮藏9个月后，血栓调节素活性没有任何降低。
《检查方法4》
长期稳定性试验(在5℃下贮藏9个月)
将供试含水注射剂在5℃下贮藏9个月，由此测定血栓调节素的残余活性。进行血栓调节素活性测定的方式与检查方法1相同。
试验例13
将下面给出的试验溶液或试验制剂对9-10周龄的雄性SD大鼠经由尾静脉或背部皮下途径给药，以适当的时间间隔进行血液采集。
1)用于静脉内注射的试验溶液
用于静脉内注射的试验溶液的制备方法是，分别调节参考例7的可溶性血栓调节素高纯度产物的浓度为10μg/ml、50μg/ml和250μg/ml，调节磷酸钠缓冲溶液的浓度为10mM，向其中加入浓度为150mM的NaCl和浓度为0.01％的聚山梨醇酯80(吐温80)，此时调pH为7.4。表13给出了这些试验溶液的每次给药剂量。
2)用于皮下注射的试验溶液A
该试验溶液的制备方法是，分别调节参考例7的可溶性血栓调节素高纯度产物的浓度为10μg/ml、50μg/ml和250μg/ml，调节磷酸钠缓冲溶液的浓度为10mM，向其中加入浓度为150mM的NaCl、浓度为0.01％的聚山梨醇酯80(吐温80)、浓度为40mg/ml的药典苯甲醇和浓度为浓度为0.3％的对羟基苯甲酸甲酯，此时调pH为7.4，得到试验溶液A。表13给出了这些试验溶液的每次给药剂量。
3)用于皮下注射的试验溶液B
该试验溶液的制备方法是，分别调节参考例7的可溶性血栓调节素高纯度产物的浓度为10μg/ml、50μg/ml和250μg/ml，调节磷酸钠缓冲溶液的浓度为10mM，向其中加入浓度为150mM的NaCl、浓度为0.01％的聚山梨醇酯80(吐温80)、浓度为40mg/ml的药典盐酸普鲁卡因和浓度为浓度为0.3％的对羟基苯甲酸甲酯，此时调pH为7.4，得到试验溶液B。
4)用于皮下注射的试验制剂C
该试验溶液的制备方法是，调节参考例7的可溶性血栓调节素高纯度产物的浓度为250μg/ml，调节磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入浓度为150mM的NaCl，此时调pH为6.0。将每1ml该溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在10％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。在该预灌装注射剂上安装活塞杆(由聚丙烯制成的1ml长型注射器用活塞，Becton-Dickinson公司供应)和注射针头(26G×1/2”，Terumo公司供应)，得到用于皮下注射的现成的试验制剂C。
5)用于皮下注射的试验制剂D
该试验溶液的制备方法是，调节参考例7的可溶性血栓调节素高纯度产物的浓度为250μg/ml，调节磷酸钠缓冲溶液的浓度为2mM，向其中加入浓度为150mM的NaCl和浓度为0.01％的聚山梨醇酯80(吐温80)，此时调pH为6.0。将每0.5ml该溶液灌装在玻璃注射器管(长型1ml注射器，Becton-Dickinson公司制造，不带针头)中，每管内径为6.3mm，前端带有橡胶帽(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)，管子用真空安装在注射器内的橡胶塞(碱性高弹体：溴丁基橡胶，West公司制造)密封，通过调节真空度使气体空间比例固定在15％，制得含有可溶性血栓调节素的注射用预灌装注射器制剂。在该预灌装注射剂上安装活塞杆(由聚丙烯制成的1ml长型注射器用活塞，Becton-Dickinson公司供应)和注射针头(26G×1/2”，Terumo公司供应)，得到用于皮下注射的现成的试验制剂D。表13
给药途径 供试溶液 浓度(μg/ml) 给药量(ml/kg) 剂量(μg/kg) 注射次数
静脉内静脉内静脉内 用于i.v.注射的试验溶液用于i.v.注射的试验溶液用于i.v.注射的试验溶液 1050250 111 1050250 三次三次三次
皮下皮下皮下 用于s.c.注射的试验溶液A用于s.c.注射的试验溶液A用于s.c.注射的试验溶液A 1050250 111 1050250 三次三次三次
给药后用酶连免疫吸附测定法(EuSA)测定每个时间点的可溶性血栓调节素血液浓度，结果如图1所示。利用ELISA的已知工艺进行血栓调节素测定的实际操作，该工艺中将作为固定相抗体的R4B6与作为标记抗体的R4D1偶联(日本特许公开平6-205692 A)。表14给出了基于血栓调节素血液浓度值的变化过程的一些药动学参数。
表14
给药途径 供试溶液 剂量(μg/kg) Tmax(hr) Cmax(ng/ml) T1/2(hr) AUC(0-∞)(μg hr/ml) MRT(hr)
静脉内静脉内静脉内 用于i.v.注射的试验溶液用于i.v.注射的试验溶液用于i.v.注射的试验溶液 1050250 000 322.71346.26138.3 6.17.87.2 2.0210.7544.79 6.17.97.2
皮下皮下皮下 用于s.c.注射的试验溶液A用于s.c.注射的试验溶液A用于s.c.注射的试验溶液A 1050250 32.223.48.3 21.4140.3661.5 17.419.916.7 1.067.0142.67 38.438.836.6
如表14所示，发现经由皮下途径给药的平均残留时间(MRT)在所有剂量下都大于经由静脉内途径给药。另外也证实，如图1所示，皮下给药保持血液浓度的持久时间显著长于静脉内给药。皮下给药的T1/2值确实可以长达16小时或以上。
在皮下注射试验溶液B给药组和皮下制剂C和D给药组中，得到了几乎与皮下试验溶液A相同的结果。这些事实证明，皮下给药所达到的保持有效血栓调节素血液浓度水平的作用比作为常规实践的经由静脉内途径给药更好。发现皮下给药在所有剂量下的生物利用度(BA)值都高于50％，说明可吸收性更好。
当用于皮下给药的试验溶液的pH值在3.0-7.4范围内变化时，血液浓度没有明显区别。改变所给药的试验溶液的离子强度(NaCl强度在0至4.8％范围内变化)，该有效药剂的血液浓度没有明显改变。序列表<110>旭化成工业株式会社<120>用于在贮藏/运输中保持血栓调节素含水注射剂质量的方法<130>ASAHI-TM<150>JP 9/281659<151>1997-10-15<150>JP 9/308525<151>1997-11-11<160>5<210>1<211>516<212>PRT<213>人工序列<220><223>人血栓调节素的部分氨基酸序列<400>1Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly1               5                  10                  15Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu
         20                  25                  30His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala
     35                  40                  45Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser
 50                  55                  60Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly65                  70                  75                  80Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys
             85                  90                  95Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr
        100                 105                 110Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn
    115                 120                 125Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu
130                 135                 140Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val145                 150                 155                 160Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg
            165                 170                 175Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr
        180                 185                 190Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro
    195                 200                 205Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys
210                 215                 220Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro225                 230                 235                 240Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys
            245                 250                 255Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala
        260                 265                 270Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys
    275                 280                 285Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly
290                 295                 300Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln305                 310                 315                 320His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys
            325                 330                 335Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr
        340                 345                 350Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro
    355                 360                 365Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr
370                 375                 380Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu385                 390                 395                 400Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp
            405                 410                 415Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile
        420                 425                 430Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly
    435                 440                 445Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys
450                 455                 460Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys465                 470                 475                 480Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro
            485                 490                 495Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu
        500                 505                 510Val His Ser Gly
    515<210>2<211>516<212>PRT<213>人工序列<220><223>人血栓调节素的部分氨基酸序列<400>2Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly1               5                  10                  15Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu
         20                  25                  30His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala
     35                  40                  45Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser
 50                  55                  60Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly65                  70                  75                  80Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys
             85                  90                  95Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr
        100                 105                 110Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn
    115                 120                 125Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu
130                 135                 140Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val145                 150                 155                 160Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg
            165                 170                 175Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr
        180                 185                 190Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro
    195                 200                 205Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys
210                 215                 220Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro225                 230                 235                 240Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys
            245                 250                 255Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala
        260                 265                 270Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys
    275                 280                 285Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly
290                 295                 300Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln305                 310                 315                 320His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys
            325                 330                 335Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr
        340                 345                 350Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro
    355                 360                 365Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr
370                 375                 380Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu385                 390                 395                 400Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp
            405                 410                 415Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile
        420                 425                 430Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly
    435                 440                 445Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys
450                 455                 460Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly Thr Asp Cys465                 470                 475                 480Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro
            485                 490                 495Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu
        500                 505                 510Val His Ser Gly
    515<210>3<211>1548<212>DNA<213>人工序列<220><223>人血栓调节素基因的部分碱基序列<400>3atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgcaccc 60gcagagccgc agccgggtgg cagccagtgc gtcgagcacg actgcttcgc gctctacccg 120ggccccgcga ccttcctcaa tgccagtcag atctgcgacg gactgcgggg ccacctaatg 180acagtgcgct cctcggtggc tgccgatgtc atttccttgc tactgaacgg cgacggcggc 240gttggccgcc ggcgcctctg gatcggcctg cagctgccac ccggctgcgg cgaccccaag 300cgcctcgggc ccctgcgcgg cttccagtgg gttacgggag acaacaacac cagctatagc 360aggtgggcac ggctcgacct caatggggct cccctctgcg gcccgttgtg cgtcgctgtc 420tccgctgctg aggccactgt gcccagcgag ccgatctggg aggagcagca gtgcgaagtg 480aaggccgatg gcttcctctg cgagttccac ttcccagcca cctgcaggcc actggctgtg 540gagcccggcg ccgcggctgc cgccgtctcg atcacctacg gcaccccgtt cgcggcccgc 600ggagcggact tccaggcgct gccggtgggc agctccgccg cggtggctcc cctcggctta 660cagctaatgt gcaccgcgcc gcccggagcg gtccaggggc actgggccag ggaggcgccg 720ggcgcttggg actgcagcgt ggagaacggc ggctgcgagc acgcgtgcaa tgcgatccct 780ggggctcccc gctgccagtg cccagccggc gccgccctgc aggcagacgg gcgctcctgc 840accgcatccg cgacgcagtc ctgcaacgac ctctgcgagc acttctgcgt tcccaacccc 900gaccagccgg gctcctactc gtgcatgtgc gagaccggct accggctggc ggccgaccaa 960caccggtgcg aggacgtgga tgactgcata ctggagccca gtccgtgtcc gcagcgctgt 1020gtcaacacac agggtggctt cgagtgccac tgctacccta actacgacct ggtggacggc 1080gagtgtgtgg agcccgtgga cccgtgcttc agagccaact gcgagtacca gtgccagccc 1140ctgaaccaaa ctagctacct ctgcgtctgc gccgagggct tcgcgcccat tccccacgag 1200ccgcacaggt gccagatgtt ttgcaaccag actgcctgtc cagccgactg cgaccccaac 1260acccaggcta gctgtgagtg ccctgaaggc tacatcctgg acgacggttt catctgcacg 1320gacatcgacg agtgcgaaaa cggcggcttc tgctccgggg tgtgccacaa cctccccggt 1380accttcgagt gcatctgcgg gcccgactcg gcccttgtcc gccacattgg caccgactgt 1440gactccggca aggtggacgg tggcgacagc ggctctggcg agcccccgcc cagcccgacg 1500cccggctcca ccttgactcc tccggccgtg gggctcgtgc attcgggc              1548<210>4<211>1548<212>DNA<213>人工序列<220><223>人血栓调节素基因的部分碱基序列<400>4atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgcaccc 60gcagagccgc agccgggtgg cagccagtgc gtcgagcacg actgcttcgc gctctacccg 120ggccccgcga ccttcctcaa tgccagtcag atctgcgacg gactgcgggg ccacctaatg 180acagtgcgct cctcggtggc tgccgatgtc atttccttgc tactgaacgg cgacggcggc 240gttggccgcc ggcgcctctg gatcggcctg cagctgccac ccggctgcgg cgaccccaag 300cgcctcgggc ccctgcgcgg cttccagtgg gttacgggag acaacaacac cagctatagc 360aggtgggcac ggctcgacct caatggggct cccctctgcg gcccgttgtg cgtcgctgtc 420tccgctgctg aggccactgt gcccagcgag ccgatctggg aggagcagca gtgcgaagtg 480aaggccgatg gcttcctctg cgagttccac ttcccagcca cctgcaggcc actggctgtg 540gagcccggcg ccgcggctgc cgccgtctcg atcacctacg gcaccccgtt cgcggcccgc 600ggagcggact tccaggcgct gccggtgggc agctccgccg cggtggctcc cctcggctta 660cagctaatgt gcaccgcgcc gcccggagcg gtccaggggc actgggccag ggaggcgccg 720ggcgcttggg actgcagcgt ggagaacggc ggctgcgagc acgcgtgcaa tgcgatccct 780ggggctcccc gctgccagtg cccagccggc gccgccctgc aggcagacgg gcgctcctgc 840accgcatccg cgacgcagtc ctgcaacgac ctctgcgagc acttctgcgt tcccaacccc 900gaccagccgg gctcctactc gtgcatgtgc gagaccggct accggctggc ggccgaccaa 960caccggtgcg aggacgtgga tgactgcata ctggagccca gtccgtgtcc gcagcgctgt 1020gtcaacacac agggtggctt cgagtgccac tgctacccta actacgacct ggtggacggc 1080gagtgtgtgg agcccgtgga cccgtgcttc agagccaact gcgagtacca gtgccagccc 1140ctgaaccaaa ctagctacct ctgcgtctgc gccgagggct tcgcgcccat tccccacgag 1200ccgcacaggt gccagatgtt ttgcaaccag actgcctgtc cagccgactg cgaccccaac 1260acccaggcta gctgtgagtg ccctgaaggc tacatcctgg acgacggttt catctgcacg 1320gacatcgacg agtgcgaaaa cggcggcttc tgctccgggg tgtgccacaa cctccccggt 1380accttcgagt gcatctgcgg gcccgactcg gcccttgccc gccacattgg caccgactgt 1440gactccggca aggtggacgg tggcgacagc ggctctggcg agcccccgcc cagcccgacg 1500cccggctcca ccttgactcc tccggccgtg gggctcgtgc attcgggc              1548<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>突变用合成DNA<400>5aatgtggcgg gcaagggccg a                                           21

Claims (21)

1、用于在贮藏和运输中保持非冷冻或非冷冻干燥的液体剂型的血栓调节素含水注射剂质量的方法，其特征在于该血栓调节素的含水注射剂被制备成一种pH值在5至7.0范围内的水溶液，含有有效量的可溶性血栓调节素和在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分，其中该血栓调节素水溶液具有下列特征a)或b)，即，
a)它进一步含有一种表面活性剂，被无菌灌装在容器中，或者
b)它由无菌灌装在注射器容器中的预灌装注射器制剂组成，以排除其中任何实质上的气体空间。
2、如权利要求1所要求保护的方法，其中将血栓调节素的含水注射剂以液体剂型贮藏/运输长时间阶段，该注射剂的特征在于它被制备成一种pH值在5至7.0范围内的水溶液，含有(a)有效量的可溶性血栓调节素、在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分和一种表面活性剂，被无菌灌装在容器中。
3、如权利要求1所要求保护的方法，其中将血栓调节素的含水注射剂以液体剂型贮藏/运输长时间阶段，该注射剂的特征在于它被制备成一种pH值在5至7.0范围内的水溶液，含有有效量的可溶性血栓调节素和在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分，由无菌灌装在注射器容器中的预灌装注射器制剂组成，以排除其中任何实质上的气体空间。
4、如权利要求1至3任意一项所要求保护的方法，其中将血栓调节素的含水注射剂以液体剂型贮藏/运输长时间阶段，该注射剂的特征在于它被制备成一种pH值在5至7.0范围内的水溶液，含有有效量的可溶性血栓调节素、在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分和一种表面活性剂，由无菌灌装在注射器容器中的预灌装注射器制剂组成，以排除其中任何实质上的气体空间。
5、如权利要求1至4任意一项所要求保护的方法，其中该可溶性血栓调节素是一种肽，该肽的特征在于用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其还原态的分子量为66000±10000，表现出加速凝血酶活化蛋白C的功能，可溶于注射用水，浓度至少为6mg/m1。
6、如权利要求1至5任意一项所要求保护的方法，其中该可溶性血栓调节素表现出加速凝血酶活化蛋白C的功能，由下列i)或ii)组成，即，
i)由这样一种氨基酸序列构成的血栓调节素，该序列由序列表SEQID NO：1中第19位点至第516位点氨基酸残基组成，或
ii)由这样一种氨基酸序列构成的血栓调节素，其中在组成该序列的氨基酸残基中，上面给出的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被置换或被除去，或者向其中加入一个或多个氨基酸残基。
7、如权利要求1至6任意一项所要求保护的方法，其中该可溶性血栓调节素是下组中的任意一种：构成该可溶性血栓调节素的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO：1第19位点至第516位点氨基酸残基组成、构成该可溶性血栓调节素的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO：2第19位点至第516位点氨基酸残基组成、通过转染编码序列表SEQ ID NO：1中给出的氨基酸序列的DNA片段给宿主细胞而得到的可溶性血栓调节素和通过转染编码序列表SEQ ID NO：2中给出的氨基酸序列的DNA片段给宿主细胞而得到的可溶性血栓调节素。
8、如权利要求1至7任意一项所要求保护的方法，其中该缓冲组分由基于磷酸盐和乙酸盐的缓冲组分中的至少一种组成。
9、如权利要求1至8任意一项所要求保护的方法，其中该水溶液的pH值在5.5至6.5范围内。
10、如权利要求1和3至9任意一项所要求保护的方法，其中该预灌装注射器制剂是无菌灌装在注射器容器中的，以排除其中任何实质上的气体空间，该制剂的特征在于血栓调节素水溶液占据注射器容器的量使其中剩余的气体空间以气体空间比例表示，不超过15体积％。
11、如权利要求1和3至10任意一项所要求保护的方法，其中用于该预灌装注射器制剂的该注射器容器的内径为8.6mm或以下。
12、一种非冷冻或非冷冻干燥的液体剂型的血栓调节素含水注射剂，具有优良的长期贮藏稳定性和抗摇动稳定性，适合于长时间阶段贮藏/运输，其特征在于该血栓调节素含水注射剂的pH值在5至7.0范围内，含有有效量的可溶性血栓调节素、在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分和一种表面活性剂，被无菌灌装在容器中。
13、一种非冷冻或非冷冻干燥的液体剂型的血栓调节素含水注射剂，具有优良的长期贮藏稳定性和抗摇动稳定性，适合于长时间阶段贮藏/运输，其特征在于该血栓调节素含水注射剂是pH值在5至7.0范围内的预灌装注射器制剂，含有有效量的可溶性血栓调节素和在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分，被无菌灌装在注射器容器中，以排除其中任何实质上的气体空间。
14、一种非冷冻或非冷冻干燥的液体剂型的血栓调节素含水注射剂，具有优良的长期贮藏稳定性和抗摇动稳定性，适合于长时间阶段贮藏/运输，其特征在于该血栓调节素含水注射剂是pH值在5至7.0范围内的预灌装注射器制剂，含有有效量的可溶性血栓调节素、在5与7.0之间的pH范围内发挥缓冲作用的缓冲组分和一种表面活性剂，被无菌灌装在注射器容器中，以排除其中任何实质上的气体空间。
15、如权利要求13或14所要求保护的血栓调节素含水注射剂，其中该预灌装注射器制剂是用于皮下注射或肌内注射的。
16、如权利要求12至15任意一项所要求保护的血栓调节素含水注射剂，其中该可溶性血栓调节素是下组中的任意一种：构成该可溶性血栓调节素的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO：1第19位点至第516位点氨基酸残基组成、构成该可溶性血栓调节素的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO：2第19位点至第516位点氨基酸残基组成、通过转染编码序列表SEQID NO：1中给出的氨基酸序列的DNA片段给宿主细胞而得到的可溶性血栓调节素和通过转染编码序列表SEQ ID NO：2中给出的氨基酸序列的DNA片段给宿主细胞而得到的可溶性血栓调节素。
17、如权利要求12至16任意一项所要求保护的血栓调节素含水注射剂，其中该缓冲溶液的pH在5.5至6.5范围内。
18、如权利要求13至17任意一项所要求保护的血栓调节素含水注射剂，其中该预灌装注射器制剂是无菌灌装在注射器容器中的，以排除其中任何实质上的气体空间，该制剂的特征在于血栓调节素水溶液占据注射器容器的量使其中剩余的气体空间以气体空间比例表示，不超过15体积％。
19、如权利要求13至18任意一项所要求保护的血栓调节素含水注射剂，其中用于该预灌装注射器制剂的该注射器容器的内径为8.6mm或以下。
20、保持可溶性血栓调节素的血液浓度的方法，其特征在于使用一种血栓调节素含水注射剂，该制剂含有有效量的表现出持续效力的可溶性血栓调节素，通过皮下或肌内注射对患者给药，给药频率为每2至5天一次。
21、如权利要求20所要求保护的方法，其中该可溶性血栓调节素是下组中的任意一种：构成该可溶性血栓调节素的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO：1第19位点至第516位点氨基酸残基组成、构成该可溶性血栓调节素的氨基酸序列由序列表SEQ ID NO：2第19位点至第516位点氨基酸残基组成、通过转染编码序列表SEQ ID NO：1中给出的氨基酸序列的DNA片段给宿主细胞而得到的可溶性血栓调节素和通过转染编码序列表SEQ ID NO：2中给出的氨基酸序列的DNA片段给宿主细胞而得到的可溶性血栓调节素。
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