KR20010031153A - 트롬보모듈린 수용액 주사제의 저장 및 유통시의 품질유지 방법 - Google Patents

트롬보모듈린 수용액 주사제의 저장 및 유통시의 품질유지 방법 Download PDF

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도모요 무라따
가즈히사 쯔루따
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야마모토 카즈모토
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Abstract

본 발명은 동결 또는 동결 건조되지 않은 액상 트롬보모듈린 수용액 주사제의 저장 및 유통시의 품질 유지 방법으로서, 유효량의 가용성 트롬보모듈린과, pH 5 이상, 7.0 이하에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분을 함유시킨 트롬보모듈린 수용액의 pH가 5 이상 7.0 이하이고, (a) 이 트롬보모듈린 수용액은, 다시 계면 활성제를 함유하여, 용기에 무균 충전되어 있는 것, 또는 (b) 이 트롬보모듈린 수용액이 실질적인 공극부를 존재시키지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전 실린지 제제인 것, 중 어느 하나를 특징으로 하는 트롬보모듈린 수용액 주사제를 액상으로 장기간 저장 및 유통시키는 방법으로서, 사용시에 용해하는 수고를 덜어주는 장기 안정성 및 진탕 안정성이 우수한 수용성 주사제가 제공되는 것이다.

Description

트롬보모듈린 수용액 주사제의 저장 및 유통시의 품질 유지 방법{Method for Keeping the Quality of Aqueous Parenteral Solution of Thrombomodulin in Storage and Distribution}
〈산업상의 이용 분야〉
본 발명은, 동결 또는 동결 건조되지 않은 액상 트롬보모듈린 수용액 주사제의 저장 및 유통시의 품질 유지 방법 또는 저장 및 유통에 있어서 안정한 트롬보모듈린 수용액 주사제에 관한 것이다.
〈종래 기술〉
트롬보모듈린(이하, TM이라 약칭하는 수가 있다)은 트롬빈과 특이적으로 결합하여 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 현저히 촉진하는 작용을 갖는 물질이다. 프로테인 C는 혈액 응고선용계에서 중요한 역할을 하고 있는 비타민 K 의존성 단백질이며, 트롬빈의 작용에 의해 활성화되어 활성형 프로테인 C가 된다. 이 활성형 프로테인 C는 생체내에서 혈액 응고계 인자의 활성형 제V인자 및 활성형 제VIII 인자를 실활시키며, 혈전 용해 작용을 갖는 플라스미노겐 활성화제의 생산에 관여하고 있다는 것이 알려져 있다〔스즈끼 히로시, 의학의 발자취, 제125권, 901페이지(1983년)].
따라서, 트롬보모듈린은 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하여 항혈액 응고 작용과 혈전 용해 작용을 나타내는 활성형 프로테인 C를 대량으로 생산시키는 것으로 항혈액 응고제 또는 혈전 용해제로서 유용하다고 되어 있다. 또한, 종래 트롬보모듈린의 용도로서는, 예를 들면 급성 관상동맥 증후군(ACS; acute coronary syndrome)(예를 들면, 심근 경색, 불안정 협심증, 관상동맥 혈행 재건술 등), 혈전증(예를 들면, 급성 또는 만성의 뇌혈전증, 동맥 또는 정맥의 급성 또는 만성의 말초 혈전증 등), 색전증(예를 들면, 급성 또는 만성의 뇌색전증, 동맥 또는 정맥의 급성 또는 만성의 말초 색전증 등), 말초 혈관 폐색증(예를 들면, 버져병, 레이노병 등), 폐색성 동맥 경화증, 혈관염(예를 들면, 전신성 에리테마토데스(SLE), 베체트병, 가와사키병 등), 심장 수술에 속발하는 기능성 장해, 이식장기의 합병증, 혈관내 혈액 응고 증후군(DIC), 협심증, 일과성 뇌허혈 발작, 임신 중독증, 당뇨병, 간 VOD(Liver veno-occlusive disease: 극증간염 또는 골수 이식 후의 간정맥 폐색증), 심부 정맥 혈전증(DVT; Deep venous thrombosis) 등의 질환의 치료 및 예방에 이용되는 것이 기대되고 있다.
종래, 트롬보모듈린은 인간을 비롯한 여러가지의 동물종의 혈관 내피 세포상에 발현하고 있는 당단백질로서 발견되었지만, 일군의 발명자들에 의해 비로소 클로닝에 성공하였다. 즉, 유전공학적 방법을 이용하여 인간의 폐 cDNA 라이브러리에서 시그널 펩티드를 포함하는 사람 트롬보모듈린 전구체 유전자를 클로닝하고, 트롬보모듈린의 전체 유전자 서열을 해석하여 18 아미노산 잔기의 시그널 펩티드를 포함하는 575 잔기의 아미노산 서열이 밝혀졌다(특개소 64-6219호 공보). 시그널 펩티드가 절단된 성숙 트롬보모듈린은 그 성숙 펩티드의 N 말단측에서 N 말단 영역(1-226번째), 6개의 EGF 유사 구조를 갖는 영역(227-462번째), O 형 당쇄 부가 영역(463-498번째), 막 관통 영역(499-521) 및 세포질내 영역(522-557번째)의 5개의 영역으로 구성되어 있으며, 전체 길이의 트롬보모듈린과 동일 활성을 갖는 부분(즉, 최소 활성 단위)은 6개의 EGF 유사 구조를 갖는 영역 중 N 말단측에서 4, 5, 6번째의 EGF 유사 구조로 이루어지는 부분이라는 것이 알려져 있다〔M.Zushi등, J. Bio1. Chem., 246, 10351-10353(1989)〕.
적어도, 막 관통 영역을 함유하지 않도록 제조된 트롬보모듈린에 있어서는 계면 활성제 비존재 하에서도 완전히 용해될 수 있는 성질(이하, 가용성이라 하는 수가 있다)을 가지며, 예를 들면 N 말단 영역과 6개의 EGF 유사 구조를 갖는 영역과 O형 당쇄 부가 영역의 3개의 영역만으로 이루어지는(즉, 서열 번호 1의 19 내지 516 위치의 아미노산 서열로 이루어지는) 트롬보모듈린은 재조합 기술의 응용에 의해 수득될 수 있고 그 재조합 트롬보모듈린은 천연의 트롬보모듈린의 활성을 갖고 있다는 것이 확인되었다(특개소 64-6219호 공보).
덧붙여, 유전자에 있어서는, 자연의 변이 또는 수득시의 변이에 의해 많은 경우에서 확인되는 바와 같이, 사람에게서도 다형성의 변이가 발견되고 있으며, 상술한 575 잔기의 아미노산 서열로 이루어지는 사람 트롬보모듈린 전구체의 제473 위치의 아미노산에 있어서 Val과 Ala이라는 것이 현재 확인되어 있다. 이 아미노산을 코딩하는 염기 서열에 있어서는, 제1418 위치에 있어서, 각각 T와 C의 변이에 상당한다〔Wen등, Biochemistry 26, 4350-4357 (1987)〕. 그러나, 활성 및 물성에 있어서는 전혀 차이가 없어 양자는 실질적으로 동일하다고 생각될 수 있다. 따라서, 상술한 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 트롬보모듈린은 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 트롬보모듈린의 다형성 펩티드이기 때문에 실질적으로 동일하다고 판단될 수 있다.
그런데, 이 트롬보모듈린은 의약 조성물로서 넓고 안정적으로 공급되는 경우에는 동결 건조 제제로서 공급되고 있다. 이 동결 건조 과정에서, 트롬보모듈린 함유 용액을 동결 건조했더니, 미량이기는 하지만 일부가 변성에 의해 고분자화되어 트롬보모듈린 분자 몇개가 회합된 다량체가 생성된다는 것이 밝혀졌다. 이 과제를 해결하기 위해서 본 발명자들은 예의 검토한 결과, 아미노산 또는 그의 염류를 첨가함으로써 동결 건조시 트롬보모듈린의 변성이 방지된다는 것을 확인하고 먼저 출원한 바있다(특개평 6-321805호 공보).
〈발명이 해결하고자 하는 과제〉
그러나, 간편하게 사용할 수 있으며 제조 비용이 경제적인 동결 건조 제제 이외의 새로운 제제를 제공하는 것이 요망되었다.
〈과제를 해결하기 위한 수단〉
본 발명자들은, 동결 건조 제제 이외의 새로운 제제를 개발할 목적으로, 동결 건조 공정을 행하지 않고, 사용시 용해할 필요가 없는 트롬보모듈린의 수용액 주사용 제제의 개발을 검토하였다. 트롬보모듈린의 수용액 주사용 제제에 필요한 품질로서는 첫째로, 5 ℃ 내지 실온에서의 장기 보존시에 잔존 역가가 크게 저하되지 않는 것(장기 안정성)이 필요한데, 조사 결과 이 장기 안정성을 얻는 것은 용이하지 않았다. 그리고, 의외로 수용액 주사용 제제를 진탕했을 때 백탁을 발생시키는 경우가 있다는 것이 확인되었다. 수송 등의 유통 과정에서 정도의 차이는 있지만 제제가 진탕되리라는 것은 충분히 예상되어 분체인 종래의 동결 건조 제제에서는 전혀 문제가 되지 않는다. 따라서, 전혀 예상되지 않았던 진탕 안정성에 관한 과제가 본 발명자들에 의해 새롭게 확인되었다. 주사제에 있어서 불용물이 존재하는 것은 특히 순환기 질환을 가진 환자에게 있어서 치명적인 문제를 야기할 가능성이 있어, 진탕에 의해 백탁되어 불용물이 발생하는 진탕 안정성에 관한 문제는 매우 큰 장해이다.
이상을 정리하면, 수용액 주사제는 동결 건조 제제에 비하면 사용시에 주사용 증류수로 용해할 필요 없이 간편하게 투여할 수 있으며, 제조 공정에서 동결 건조 조작을 필요로 하지 않아 제조상 간편하며 경제적이라는 등의 이점이 있지만, 상술한 바와 같이 단순히 트롬보모듈린을 용액으로 하는 것만으로는 장기 안정성이 떨어지고 진탕 안정성도 만족스럽지 않아, 장기간 저장 및 유통시킬 수 있는 수용액 주사제를 제조하는 데 어려움이 있었다.
본 발명자들은 상기 문제를 해결하기 위하여 예의 연구를 행한 결과, 특정한 조건에 의해 이러한 문제점을 전부 해결할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 동결 또는 동결 건조되지 않은 액상 트롬보모듈린 수용액 주사제의 저장 및 유통시 품질 유지 방법으로서, 유효량의 가용성 트롬보모듈린과 pH 5 내지 7.0 에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분을 함유하는 트롬보모듈린 수용액의 pH가 5 내지 7.0 이고, (a) 이 트롬보모듈린 수용액이 추가로 계면 활성제를 함유하여 용기에 무균 충전되어 있거나, 또는 (b) 이 트롬보모듈린 수용액이 실질적인 공극부가 존재하지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전(prefilled) 실린지 제제인 것을 특징으로 하여 트롬보모듈린 수용액 주사제를 액상으로 장기간 저장 및 유통시키는 것을 포함하는 방법이다.
따라서, 본 발명의 저장 및 유통시의 품질 유지 방법의 제1 형태는, 유효량의 가용성 트롬보모듈린, pH 5 내지 7.0 의 완충 능력을 갖는 완충액 성분 및 계면 활성제를 함유하고, pH가 5 내지 7.0 인 트롬보모듈린 수용액이 용기에 무균 충전되어 있는 것을 특징으로 하여 트롬보모듈린 수용액 주사제를 액상으로 장기간 저장 및 유통시키는 것을 포함하는 상기에 기재한 방법이다.
또한, 본 발명의 제2 형태는, 유효량의 가용성 트롬보모듈린과 pH 5 내지 7.0 에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분을 함유하고, pH가 5 내지 7.0 인 트롬보모듈린 수용액이 실질적인 공극부가 존재하지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전 실린지 제제인 것을 특징으로 하여 트롬보모듈린 수용액 주사제를 액상으로 장기간 저장 및 유통시키는 것을 포함하는 상기 기재 방법이다.
또한, 바람직한 본 발명의 제3 형태는, 유효량의 가용성 트롬보모듈린, pH 5 내지 7.0 에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분 및 계면 활성제를 함유하고, pH가 5 내지 7.0 인 트롬보모듈린 수용액이 실질적인 공극부가 존재하지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전 실린지 제제인 것을 특징으로 하여 트롬보모듈린 수용액 주사제를 액상으로 장기간 저장 및 유통시키는 것을 포함하는 상기에 기재한 방법이다.
또한, 본 발명의 방법은 유효량의 가용성 트롬보모듈린과 pH 5 내지 7.0 의 사이에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분을 함유하는 트롬보모듈린 수용액의 pH가 5 내지 7.0 이고, (a) 이 트롬보모듈린 수용액이 추가로 계면 활성제를 함유하여 용기에 무균 충전되어 있거나 또는 (b) 이 트롬보모듈린 수용액이 실질적인 공극부가 존재하지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전 실린지 제제인 것을 특징으로 하는, 동결 또는 동결 건조되지 않은 액상 트롬보모듈린 수용액의 장기간 및 진탕에서의 안정화 방법이다.
본 발명의 방법에 사용되는 트롬보모듈린 수용액 주사제는 유효량의 가용성 트롬보모듈린과 pH 5 내지 7.0 에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분을 함유하는 트롬보모듈린 수용액의 pH가 5 내지 7.0 이고, (a) 이 트롬보모듈린 수용액이 추가로 계면 활성제를 함유하여 용기에 무균 충전되어 있거나 또는 (b) 이 트롬보모듈린 수용액이 실질적인 공극부가 존재하지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전 실린지 제제인 것을 특징으로 하는, 장기 안정성 및 진탕 안정성에 있어서 우수하여 액상으로 장기 저장 및 유통시키기 위한 동결 또는 동결 건조되지 않은 트롬보모듈린 수용액 주사제이다.
즉, 트롬보모듈린 수용액 주사제의 제1 형태로서는, 유효량의 가용성 트롬보모듈린, pH 5 내지 7.0 에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분 및 계면 활성제를 함유하고, pH가 5 내지 7.0 인 트롬보모듈린 수용액이 용기에 무균 충전되어 있는 것을 특징으로 하는, 장기 안정성 및 진탕 안정성에 있어서 우수하여 액상으로 장기 저장 및 유통시키기 위한 동결 또는 동결 건조되지 않은 트롬보모듈린 수용액 주사제이다.
또한, 트롬보모듈린 수용액 주사제의 제2 형태로서는, 유효량의 가용성 트롬보모듈린과 pH 5 내지 7.0 에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분을 함유하고, pH가 5 내지 7.0 인 트롬보모듈린 수용액이 실질적인 공극부가 존재하지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전 실린지 제제인 것을 특징으로 하는, 장기 안정성 및 진탕 안정성에 있어서 우수하여 액상으로 장기 저장 및 유통시키기 위한 동결 또는 동결 건조되지 않은 트롬보모듈린 수용액 주사제이다.
또한, 트롬보모듈린 수용액 주사제의 제3 형태로서는, 유효량의 가용성 트롬보모듈린, pH 5 내지 7.0 에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분 및 계면 활성제를 함유하고, pH가 5 내지 7.0 인 트롬보모듈린 수용액이 실질적인 공극부가 존재하지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전 실린지 제제인 것을 특징으로 하는, 장기 안정성 및 진탕 안정성에 있어서 우수하여 액상으로 장기 저장 및 유통시키기 위한 동결 또는 동결 건조되지 않은 트롬보모듈린 수용액 주사제이다.
본 발명에서 트롬보모듈린이란 트롬빈과 결합하여 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용을 갖는 물질이며 특별히 한정되지 않는다. 가용성 트롬보모듈린이란 상기한 트롬보모듈린으로서의 활성을 가져 계면 활성제 비존재 하에서도 용이하게 용해될 수 있는 물질이며, 예를 들면 주사용 증류수에 대하여, 적어도 1 ㎎/㎖ 이상, 바람직하게는 3 ㎎/㎖ 이상, 특히 바람직하게는 6 ㎎/㎖ 이상의 용해성이 얻어지는 것이 바람직하다. 또한, 가용성 트롬보모듈린으로서는, 예를 들면, 분자량(비환원 상태에서의 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동법에 의한 측정)이 6.6만±1만이고, 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용을 가지며, 주사용 증류수에 적어도 6 ㎎/㎖의 농도로서 용해 가능한 가용성 펩티드를 바람직한 예로 들 수 있다. 다른 가용성 트롬보모듈린으로는, 서열 번호 1의 19-29의 아미노산 서열을 함유하는 아미노산 서열로 이루어지며, 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용을 가지며, 가용성인 펩티드인 가용성 트롬보모듈린이 예시된다. 또 다른 가용성 트롬보모듈린으로서는, (i) 서열 번호 1의 19 내지 516의 아미노산 서열로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린, 또는 (ii) 상기 아미노산 서열의 1개 또는 여러개의 아미노산이 치환, 결실, 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용을 갖는 가용성 트롬보모듈린 중 어느 하나도 바람직한 예로서 표시된다.
또한, 트롬보모듈린으로는, 통상 트롬보모듈린의 최소 활성 단위로 되어 있는 6개의 EGF 유사 구조를 갖는 영역 중, N 말단측에서 적어도 4, 5, 6번째의 구조(예를 들면, 인간형 트롬보모듈린의 경우, 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 367 내지 480 위치)를 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 들 수 있다. 이 중에서 특히 바람직한 가용성 트롬보모듈린으로는, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 벡터에 의해 숙주 세포에 도입하여 제조되는 형질 전환 세포가 생산할 수 있는 펩티드를 들 수 있다. 이 형질 전환 세포가 생산할 수 있는 펩티드(가용성 트롬보모듈린)로는 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 19 내지 516 위치의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 바람직한 예로서 들 수 있다. 그 밖에 숙주 세포에 따라서 시그널 부분이 그대로 존재하거나 또는 상기 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 17 내지 516 위치의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 또는 이들의 혼합물이어도 좋다. 물론 이러한 펩티드는 매우 용해성이 높은 것으로 상술한 용해성을 충분히 갖는 것이다. 또한, 이러한 펩티드는 상기한 아미노산 서열을 가지면 되는 것으로, 당쇄가 부가되거나 부가되지 않아도 좋으며, 특별히 한정되는 것이 아니다. 또한, 인간뇨 등으로부터 수득할 수 있는 가용성 펩티드도 이용할 수가 있다. 숙주 세포의 종류에 따라, 당쇄의 종류 또는 부가 위치나 부가의 정도는 차이가 있으나 모두 이용할 수 있다. 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 367 내지 480 위치로 이루어지는 펩티드 자체는 진탕 안정성이 높아, 그 점에서는 어쨌든 바람직한 수용액 제제가 되지만, 상기한 분자량(비환원 상태에서 6.6만±1만)의 가용성 트롬보모듈린, 예를 들면 상술한 서열 번호 1의 19 내지 516의 아미노산 서열로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린, 서열 번호 2의 19 내지 516의 아미노산 서열로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 숙주 세포에 형질감염시켜 얻어지는 가용성 트롬보모듈린, 또는 서열 번호 2에 기재한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 숙주 세포에 형질감염시켜 얻어지는 가용성 트롬보모듈린 중 어느 하나의 가용성 트롬보모듈린에 있어서는 본 발명의 구성에 의해 진탕 안정성를 높일 필요가 있다고 이해된다.
숙주 세포로서 차이니즈 햄스터 난소(CHO)세포, COS-1 세포, COS-7 세포, VERO(ATCC CCL-81) 세포, BHK 세포, 개의 신장 유래 MDCK 세포, 햄스터 AV-12-664 세포 및 인간 유래 세포로서 HeLa 세포, WI38 세포, 인간 293 세포 등을 들 수 있다. CHO 세포에 있어서는, DHFR-CHO 세포가 보다 바람직하다.
또한, 유전자 조작의 과정에서, 대장균 등의 미생물도 많이 사용되어 각각에 적합한 숙주-벡터계를 사용하는 것이 바람직하며, 상술한 숙주 세포에 있어서도 적절한 벡터계를 선택할 수가 있다.
유전자 재조합 기술에 사용하는 트롬보모듈린의 유전자는 클로닝되어 있고, 트롬보모듈린의 유전자 재조합 기술을 이용한 제조 예가 개시되어 있으며, 나아가 그 정제품을 얻기 위한 정제 방법도 알려져 있다(특개소 64-6219호 공보, 특개평 2-255699호 공보, 특개평 5-213998호 공보, 특개평 5-310787호 공보, 특개평 7-155176호 공보, J.Biol. Chem., 264, 10351-10353, 1989). 따라서 본 발명의 트롬보모듈린은, 상기 문헌에 기재되어 있는 방법을 이용함으로써 또는 이러한 기재 방법에 준거하여 제조할 수가 있다. 예를 들면 특개소 64-6219호 공보에서는, 전체 길이의 트롬보모듈린을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드 psV2TMJ2를 포함하는 이. 콜라이(Escherichia coli) K-12 균주 DH5(ATCC 기탁 번호 67283호)를 개시하고 있지만, 본 출원인은 다시 동일 균주(Escherichia coli DH5/psV2TMJ2)를 일본국 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1방 3고에 소재한 통상 산업성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소(쯔쇼 산교쇼 고교 기쥬쯔잉 세메 고가꾸 고교 기쥬쯔 겡뀨쇼)에 1996년 6월 19일에 기탁하였다. 수탁 번호는 FERM BP-5570이다. 이 전체 길이의 트롬보모듈린을 코딩하는 DNA를 원료로 하여, 공지된 유전자 조작 기술에 의해 본 발명의 트롬보모듈린을 제조할 수가 있다.
본 발명에 사용되는 가용성 트롬보모듈린은 종래 공지된 방법 또는 그것에 준하여 제제하면 되는데, 예를 들면 상기 야마모토등의 방법(특개소 64-6219호 공보, 실시예 참조) 또는 특개평 5-213998호 공보를 참고로 할 수 있다. 즉 인간 유래의 트롬보모듈린 유전자를 유전자 조작 기술에 의해 처리하여, 예를 들면 서열 번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 수득하고, 다시 필요에 따라 변형시키는 것도 가능하다. 이 변형으로, 예를 들면 서열 번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 얻기 위하여, 서열 번호 1의 아미노산 서열 제473 위치의 아미노산을 코딩하는 코돈(특히, 제1418 위치의 염기)에, 문헌[Method In Enzymo1ogy, 제100권, 제468페이지(1983), Academic Press]에 기재된 방법에 따라 부위 특이적 변이를 유발시킨다. 예를 들면 서열 번호 3의 염기 서열을 포함하는 DNA 단편 및 서열 번호 5로 표시된 염기 서열을 갖는 변이용 합성 DNA를 이용하여 상기 부위 특이적 변이를 유발시켜 서열 번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 얻을 수 있다. 이와 같이 제조한 DNA를, 예를 들면 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 도입하여 세포를 형질전환시키고 적절히 선택하여, 이 세포를 배양하여 얻은 배양액으로부터 공지된 방법에 의해 정제된 가용성 트롬보모듈린을 제조할 수 있다. 상술한 바와 같이 서열 번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA로 상기 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 트롬보모듈린의 생산 방법은 상기한 방법으로 한정되는 것이 아니며, 예를 들면 트롬보모듈린 또는 가용성 트롬보모듈린을 생산하는 조직 또는 조직 배양액 또는 인간뇨 등으로부터 추출 정제하거나, 또는 필요에 따라 다시 단백질 분해 효소에 의해 절단 처리하는 것도 가능하다.
이어서, 상기에 의해 수득된 배양 상등액 또는 배양물로부터의 트롬보모듈린의 단리 정제 방법은 공지된 방법〔호리오 다께이찌 편집: 단백질·효소의 기초 실험법〕에 준하여 행할 수 있다. 예를 들면, 트롬보모듈린과 반대 전하를 갖는 관능기를 고정화시킨 크로마토그래피 담체와 트롬보모듈린 사이의 상호 작용을 이용한 이온 교환 크로마토그래피의 사용도 바람직하다. 또한, 트롬보모듈린과의 특이적 친화성을 이용한 친화도 크로마토그래피도 바람직한 예로 들 수 있다. 흡착체의 바람직한 예로, 트롬보모듈린의 리간드인 트롬빈 또는 트롬보모듈린의 항체의 이용을 들 수 있다. 이러한 항체로서는, 적절한 성질 또는 적절한 에피토프를 인식하는 트롬보모듈린의 항체를 이용할 수가 있으며, 예를 들면 특공평 5-42920호 공보, 특개소 64-45398호 공보, 특개평 6-205692호 공보 등에 기재된 예를 들 수 있다. 또한, 트롬보모듈린의 분자 크기를 이용한 겔여과 크로마토그래피 또는 한외 여과를 들 수 있다. 또한, 소수성기를 고정시킨 크로마토그래피 담체와 트롬보모듈린이 갖는 소수성 부위 사이의 소수 결합을 이용한 소수성 크로마토그래피를 들 수 있다. 이러한 방법은 적절하게 조합될 수 있다. 정제 정도는 사용 목적 등에 따라 선택될 수 있지만, 예를 들면 전기 영동, 바람직하게는 SDS-PAGE의 결과가 단일 밴드로서 얻어지거나 단리 정제품의 겔여과 HPLC 또는 역상 HPLC의 결과가 단일 피크가 될 때까지 정제하는 것이 바람직하다.
정제법을 구체적으로 예시하면, 트롬보모듈린 활성을 지표로 정제하는 방법을 들 수 있으며, 예를 들면 이온 교환 컬럼의 Q-세파로스 FF에서 배양 상등액 또는 배양물을 조정제하여 트롬보모듈린 활성을 갖는 분획을 회수하고, 계속하여 친화도 컬럼의 DIP-TB(diisopropylphospory1 thrombin agarose)에서 주정제하여 트롬보모듈린 활성이 강한 분획을 회수하여 회수 분획을 농축하고, 겔여과하여 트롬보모듈린 활성 분획을 순수품으로서 수득하는 정제 방법[고미등; Blood, 75, 1396-1399, 1990]을 들 수 있다. 지표가 되는 트롬보모듈린 활성으로는, 예를 들면 트롬빈에 의한 프로테인 C 활성화의 촉진 활성을 들 수 있다. 그 밖에, 바람직한 정제법을 예시하면 이하와 같다.
트롬보모듈린과 양호한 흡착 조건을 갖는 적당한 이온 교환 수지를 선정하여 이온 교환 크로마토그래피 정제를 한다. 특히 바람직한 예로서는, 0.18 M NaCl을 포함하는 0.02 M 트리스 염산 완충액(pH 7.4)으로 평형화한 Q-세파로스 FF를 이용하는 방법이다. 적절하게 세정한 후, 예를 들면 0.3 M NaCl을 포함하는 0.02 M 트리스 염산 완충액(pH 7.4)으로 용출하여 조정제품의 트롬보모듈린을 얻을 수 있다.
이어서, 예를 들면 트롬보모듈린과 특이적 친화성을 갖는 물질을 수지에 고정화시켜 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있다. 바람직한 예로서 DIP-트롬빈-아가로스 컬럼과 항트롬보모듈린 모노클로날 항체 컬럼을 들 수 있다. DIP-트롬빈-아가로스 컬럼은, 예를 들면 100 mM NaCl 및 0.5 mM 염화 칼슘을 포함하는 20 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.4)으로 미리 평형화시키고 상기한 조정제품을 충전하고 적절히 세정하고, 예를 들면 1.0 M NaCl 및 0.5 mM 염화 칼슘을 포함하는 20 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.4)으로 용출하여 정제품인 트롬보모듈린을 수득할 수가 있다. 또한 항트롬보모듈린 모노클로날 항체 컬럼에 있어서는, 미리 CNBr에 의해 활성화된 세파로스 4B(파마시아사)에 항트롬보모듈린 모노클로날 항체를 용해시킨 0.5 M NaCl 함유 0.1 M NaHCO3완충액(pH 8.3)을 접촉시켜 세파로스 4B에 항트롬보모듈린 모노클로날 항체를 커플링시킨 수지를 충전한 컬럼을, 예를 들면 1.0 M NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충액(pH 7.3)으로 미리 평형화하여 적절한 세정 후, 예를 들면 0.3 M NaCl을 포함하는 100 mM 글리신 염산 완충액(pH 3.0)으로써 용출시키는 방법이 예시된다.
이어서, 얻어진 상기 정제된 가용성 트롬보모듈린 용액을 염농도, pH의 측정 정확도 및 TM의 분자종에 따라 상이하지만, 통상 예를 들면 비전도도 25 내지 34 ms/㎝, pH 3 내지 4의 조건하에 평형화시킨 양이온 교환체, 바람직하게는 강양이온 교환체인 SP-세파로스 FF(파마시아사)에 충전한다. 상기한 비전도도로서는, 30±3 ms/㎝이 보다 바람직하며, pH는 3.0 내지 3.7이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 pH 3.5±0.1의 조건이 예시된다. 이러한 조건은, 적당한 농도의 염을 첨가한 완충액을 사용하는 것이 바람직하며, 여러가지의 태양을 생각할 수 있는데, 예를 들면 0.25 내지 0.32 M, 바람직하게는 0.3±0.1 M의 NaCl를 포함하는 50 내지 150 mM의 pH 3 내지 4의 완충액이 예시된다. 완충액의 종류로서는 특히 한정되지 않지만, 예를 들면, 글리신염산, 시트르산-시트르산 2나트륨, 시트르 나트륨, 아세트산이 예시된다. 상기한 조건을 더욱 구체적으로 나타내면, 300 mM NaCl을 포함하는 100 mM 글리신 염산 완충액(pH 3.5)이 예시된다. 비전도도는, 예를 들면 휴대용 전도도계(도아 덴파 고교 가부시끼가이샤 제품, P 시리즈 CM-11P, 환산 기준 온도 25도)에 의해 간단히 측정할 수가 있다.
상기한 컬럼을 예를 들면 300 mM NaCl을 포함하는 100 mM 글리신 염산 완충액(pH 3.5, 비전도도 31 ms/㎝)로 세정을 개시하여, 280 nm 흡광도 피크의 상승시부터 하락 종료시까지의 통과 분획을 얻고, 적당한 완충액으로 중화하여, 혈청 유래물 및 항체 유래물을 실질적으로 함유하지 않은 정도까지 정제된 가용성 TM을 고순도 정제품으로서 수득할 수가 있다. 후술하는 바와 같이, 이 컬럼을 사용하면 혈청 유래물 또는 항체 유래물을 고효율 및 양호한 재현성으로 제거할 수 있다는 것이 확인된다. 물론, 이들은 적절하게 한외 여과에 의해 농축할 수가 있다.
또한, 겔여과에 의한 완충액 교환을 행하는 것도 바람직하다. 예를 들면, 50 mM NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충액(pH 7.3)으로 평형화시킨 Sephacryl S-300 컬럼 또는 S-200 컬럼에 한외 여과에 의해 농축한 고순도 정제품을 충전하고, 50 mM NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충액(pH 7.3)으로 전개 분획화하여, 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화 촉진 활성을 확인하고 활성 분획을 회수하여 완충액 교환한 고순도 정제품을 수득할 수가 있다.
대부분의 정제 공정에서는 염류를 함유하는 용출액 등을 이용하므로 최종적으로 본 발명에 합치되는 pH 또는 완충액 성분 또는 계면 활성제를 포함하는 용액을 이용할 수 있으면, 특히 최종적으로 첨가 또는 조제를 필요로 하지 않고, 본 발명의 수용액 주사용 제제가 되는데, 통상은 가용성 트롬보모듈린에 본 발명에 필요한 성분 등을 추가하는 방법이 간편하여 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서의 완충액 성분은 pH를 5 내지 7.0으로 조정할 수 있어 상기 pH의 사이에서 완충 능력을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 더욱 바람직하게는, pH 5.5 내지 6.5가 예시된다. 예를 들면 인산, 카르복실산 및(또는) 그의 수용성 염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 유효량이 이용된다. 카르복실산 및(또는) 그의 수용성 염으로, 예를 들면 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 타르타르산, 푸마르산, 말산 및(또는) 그의 수용성 염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상을 들 수 있으며, 특히 바람직하게는 인산, 아세트산 및(또는) 이들의 수용성 염 등을 들 수 있다. 수용성 염으로 제제학적으로 허용되는 것이면 특별한 제한은 없으며, 예를 들면 나트륨염, 칼륨염 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 용기로서는, 무균 충전에 알맞은 재료 및 형태이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 유리제 실린지(고무제 캡 및 고무제 스토퍼에 의한 무균 충전) 또는 유리제 바이알(마개 부착), 유리제 앰플을 들 수 있으며, 그 밖에 각각의 플라스틱 제품을 이용할 수도 있다. 본 발명에 있어서, 실린지 용기에 봉입시킨 기충전 실린지 제제로서 제공되는 것이 가장 바람직한 태양이다. 기충전 실린지 제제는 미리 수용액 주사제가 실린지 용기에 충전된 상태로 저장 및 유통되는 제제이며, 용기에 주사 바늘이 미리 부착되거나 부착되어 있지 않아도 좋으며, 주사바늘이 달려 있지 않은 경우에는, 사용시에 필요에 따라 주사바늘을 부착하여 사용하는 것이 통상적이다. 또한, 주사 바늘을 사용하지 않고, 기충전 실린지 내의 수용액 주사제 자체의 압력을 높여 피부를 투과시키는 방법도 들 수 있다. 이 경우에, 기충전 실린지 전방의 수용액 주사제의 사출구는 비교적 좁게 하는 것이 바람직하며, 압력을 높이는 방법으로는, 예를 들면 가스(질소 가스, 헬륨 가스, 탄산 가스 등) 또는 스프링 등에 의한 압력을 이용하는 방법을 들 수 있다.
상기한 pH 에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분은 그 종류 외에 농도 또는 무균 충전하는 용기의 종류와도 관계있지만, 예를 들면 사용이 예정된 용기에, 검토할 완충액을 충전 예정량(예를 들면 1 ㎖ 또는 0.5 ㎖ 등)을 충전하여, 후술하는 측정법 1에 기재한 50 ℃ 96 시간의 가열 처리를 한 후의 pH 변동을 ±0.3 이내로 억제할 수 있는 완충액 성분의 종류 또는 농도를 선택하는 것이 바람직하다. 상술한 대표적인 완충액 성분에 있어서, 사용되는 농도로서는 통상 0.1 mM 이상, 바람직하게는 1 mM 이상이 예시되며, 상한으로서 통상 1000 mM 이하, 바람직하게는 200 mM 이하, 특히 바람직하게는 25 mM 이하 또는 20 mM 이하가 예시된다. 유리 제품이 미리 황 처리되어 있는 것도 바람직하다. 또한, 유리제 실린지의 내벽은 실리콘 코팅되어 있어도 좋다.
본원 발명의 수용액 주사용 제제를 위한 완충액의 제조 방법의 예로는, 인산염 완충액의 경우에는, 인산이수소나트륨(NaH2PO4또는 그의 2수염)의 소정 농도의 수용액과 인산수소이나트륨(Na2HPO4또는 그의 12수염)의 소정 농도의 수용액을 소정량씩 혼합하여 목적으로 하는 pH로 조정한다. 또는, 인산 이수소나트륨(NaH2PO4또는 그의 2수염)의 소정 농도의 수용액에 수산화 나트륨 수용액을 적하하여 목적하는 pH로 조정하여도 좋다. 또한 pH의 미조정을 위하여, 묽은 염산 또는 인산을 적하하여도 좋다. 아세트산염 완충액으로 대표되는 카르복실산염 완충액의 경우에는, 아세트산의 소정 농도의 수용액과 아세트산 나트륨의 소정 농도의 수용액을 소정량씩 혼합하여 목적하는 pH로 조정한다. 또는 아세트산의 소정 농도의 수용액에, 수산화 나트륨 수용액을 적하하여 목적하는 pH로 조정하여도 좋다. 또한 pH의 미조정을 위하여 묽은 아세트산을 적하하여도 좋다.
본 발명의 수용액 주사용 제제의 pH는, 통상 5.0 내지 7.0 이고, 바람직하게는 5.5 내지 6.5이다. 특히 바람직한 pH는 약 6.0 이다. 또한, 5.5 내지 6.0의pH가 바람직한 예이다.
인산염 완충액에 있어서는, 그 농도를 0.2 내지 200 mM의 넓은 농도 범위에서 흔들었더니, pH 7.3에서는 인산염 완충액 농도에 의한 영향이 커서, 인산염 완충액 농도가 클수록 역가의 저하가 나타나는데, 예를 들면 200 mM에서는 잔존역가를 크게 감소시킨다. 그러나, 인산염 완충액을 이용하는 경우에도, pH를 5 내지 7.0의 범위에서 엄밀히 관리하면 열안정성(장기 안정성)에 있어서 바람직한 품질이 얻어진다. pH 5.5 내지 6.5, 특히 약 pH 6.0으로 설정하는 것이 바람직하며, 너무 pH 7.0에 가깝게 설정한 경우에는 약간의 변동으로 열안정성에 영향을 끼치기 때문에 피하는 것이 바람직하다.
아세트산염 완충액에 있어서는, 그 농도를 0.2 내지 200 mM의 넓은 농도 범위에서 흔들어도 완충액 농도에 의한 영향은 없으며, 인산염과 아세트산염을 조합한 완충액에 있어서는, pH 5.0 내지 7.0의 범위에서 열안정성에 있어서 바람직한 품질이 된다.
또한 아세트산 이외의 카르복실산염 완충액에 있어서도, 아세트산염 완충액과 동일한 농도 및 pH 범위에서 아세트산염 완충액과 동등한 열안정성을 나타낸다. 또한 인산염 완충액에 다시 아세트산염 완충액 성분 또는 카르복실산염 완충액 성분을 첨가하여도 동등한 열안정성을 나타낸다.
또한 본 발명에 있어서의 계면 활성제로서는, 예를 들면 비이온성 계면 활성제가 바람직하며, 예를 들면 폴리솔베이트류[폴리솔베이트 80(상품명: Tween 80), 폴리솔베이트 20(상품명: Tween 20) 등], 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유류[폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60(상품명: HCO-60, 상품명: 크레모포르 RH 60), 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 50(상품명: HCO-50, 상품명: 크레모포르 RH 50) 등], 폴리옥시에틸렌 피마자유류[상품명: CO-60 TX, 상품명: CO-50 TX, 상품명: 크레모포르 EL 등], 에틸렌옥사이드프로필렌옥사이드 중합체[폴리옥시에틸렌(160)폴리옥시프로필렌(30)글리콜(상품명: 풀루로닉 F68)등], 세스키올레인산 소르비탄을 들 수 있다. 이러한 계면 활성제는 복수를 혼합하여 사용할 수 있고, 상기한 군으로부터 선택된 1종 이상을 이용할 수 있다.
진탕 안정성에 있어서, 폴리솔베이트 80(상품명: Tween 80)은 적어도 0.01 %에서, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60(상품명: HCO-60) 및 폴리옥시에틸렌(160)폴리옥시프로필렌(30)글리콜(상품명: 플루로닉 F68)은 적어도 0.1 %에서 백탁 방지 효과를 나타낸다. 폴리 솔베이트 80 (상품명: Tween 80)은 0.01 % 첨가로도 백탁 방지 효과를 나타내어, 특히 바람직한 예로서 들 수 있다.
본 발명에서 이용하는 계면 활성제의 농도는 통상 0.001 % 이상, 바람직하게는 0.01 % 이상이 예시되고, 상한으로서는 통상 1 % 이하, 바람직하게는 0.1 % 이하가 예시된다.
상기 첨가물 외에 본 발명에 있어서는, 제3 성분으로서 등장화제(예를 들면, 염화나트륨 등), 방부제(예를 들면 파라옥시벤조산에스테르류 등) 등을 첨가하여도 좋다.
상술한 바와 같이, 첨가 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 첨가물을 직접 트롬보모듈린 함유 용액에 첨가하는 방법, 또는 미리 첨가물을 물, 주사용증류수 또는 적당한 완충액에 용해시켜 첨가하는 방법 등을 들 수 있다.
또한, 예를 들면 제제화 공정에서는, 실린지, 앰플 또는 바이알에 물, 주사용 증류수 또는 적당한 완충액 1 ㎖당 트롬보모듈린을 0.05 ㎎ 이상, 바람직하게는 0.1 ㎎ 이상, 특히 바람직하게는 1 ㎎ 이상 첨가하는 것을 바람직한 예로서 들 수 있다. 트롬보모듈린의 첨가량의 상한으로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 15 ㎎ 이하, 적합하게는 10 ㎎ 이하, 특히 바람직하게는 6 ㎎ 이하가 예시된다. 이들 농도의 트롬보모듈린 및 상기 첨가물을 함유하는 용액을, 예를 들면 0.3 내지 10 ㎖ 무균 상태에서 충전하여 통상법에 의해 수용액 주사용 제제로서 제조할 수 있다. 우선 용기를 멸균하기 위해서는, 통상법, 예를 들면 건열 멸균, 오토 클레이브, γ선 멸균을 사용할 수 있고, 건열 멸균으로서는, 예를 들면 250 ℃ 이상에서 30분 이상, 오토 클레이브로서는, 예를 들면 121 ℃ 20분 이상, γ선 멸균으로서는, 예를 들면 20 내지 60 kGy(킬로그레이) 조사량의 γ선을 조사하는 방법을 들 수 있다. 멸균에 있어서는, 유리제 앰플 또는 바이알은 건열 멸균을 채용하는 것이 보통이고, 또한 바이알의 고무 마개에 대해서는 오토 클레이브를 채용하는 것이 보통이다. 실린지에 대해서는 오토 클레이브를 사용할 수도 있지만, 통상은 γ선 멸균을 채용하는 것이 보통이다. 또한, 용기에 충전하는 트롬보모듈린 수용액은 통상 0.22 또는 0.2 마이크론의 여과 멸균용 필터로 여과하는 것이 바람직하다. 멸균한 용기에 멸균 여과한 트롬보모듈린 수용액을 무균 조건하에 충전하여 본 발명의 주사제로 제조한다. 이 주사제는 필름 또는 상자에 포장되어 있는 것도 바람직하다.
본원 발명의 수용액 주사용 제제로서는, 상술한 바와 같이 바람직하게는 기충전 실린지가 예시되며, 바이알 또는 앰플이어도 좋으며, 특히 앰플을 이용하는 경우에는, 시판되고 있는 황 처리 앰플을 이용하는 것이 바람직하다. 황 처리앰플은 SO2가스를 접촉시키거나 바람직하게는 황산 암모늄 수용액을 불어 넣은 후 가열 처리하여 제조된다. 통상, 1 내지 10 %의 황산 암모늄 수용액을 불어 넣은 후, 630 내지 700 ℃에서 가열 처리하는 방법이 예시된다. 통상, 이들은 사용하기 전에 앰플 세정기 등에 의해 물을 부가한 상태에서 초음파 처리 후 물세정하고, 이어서 건조 멸균를 위하여 300 내지 350 ℃ 정도에서 수분간 가열한 후 사용된다.
또한, 본 발명의 제2 태양인 유효량의 가용성 트롬보모듈린 및 pH 5 내지 7.0에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분을 함유하고, pH가 5 내지 7.0인 트롬보모듈린 수용액이 실질적인 공극부가 존재하지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전 제제인 것을 특징으로 하는 트롬보모듈린 수용액 주사제를 액상으로 장기간 저장 및 유통시키는 것으로 이루어진 방법에 관하여 설명하면, 이하와 같다.
가용성 트롬보모듈린 또는 완충액 성분 및 트롬보모듈린 수용액 주사제에 관한 정의는 상술한 바와 같다.
본 발명에 있어서의 실린지 용기로서는 시판되고 있는 주사용 실린지를 이용하는 것이 바람직한데, 통상 내경(직경) 약 8.6 mm, 약 6.3 mm, 약 4.6 mm 등의 기충전 실린지용 실린지 용기가 예시된다. 트롬보모듈린 수용액의 충전량에 의해 선택되지만, 진탕 안정성 측면에서는 약 4.6 mm의 실린지 용기가 가장 바람직하고, 약 6.3 mm의 실린지 용기도 충분히 바람직하다. 약 8.6 mm의 실린지 용기에 있어서는, 공극부 비율을 50 % 이하로 하는 것이 필요하여, 결국 약 8.6 mm 이하의 실린지 용기에 있어서는 공극부 비율을 50 % 이하로 하면 진탕 안정성이 확보된다.
용기의 형상 또는 내경에 따라서는, 상기 트롬보모듈린 수용액 주사제는 그 표면 장력에 의해 실질적으로 진탕되지 않는 수가 있다. 본 발명에서 진탕 가능 부위란, 25 ℃에서 진폭 5 ㎝, 180 왕복/분의 진탕 조건에 있어서, 진탕에 의해 상기 트롬보모듈린 수용액 주사제가 이동하여 실질적으로 진탕될 수 있는 실질적인 용기의 부위를 말하고, 공극부 비율이란 용기의 진탕 가능 부위의 용적에서 용기의 진탕 가능 부위에 존재하는 트롬보모듈린 수용액의 존재량을 뺀 공극 용적을 용기의 진탕 가능 부위의 용적으로 나눈 백분율을 의미한다. 진탕 가능 부위의 트롬보모듈린 수용액의 존재량은, 예를 들면 트롬보모듈린 수용액을 충전한 용기를 상기 진탕 조건에서 2분간 진탕한 후 상하 좌우의 상이한 방향을 연직선 방향으로 유지한 채 5 초 정치 후에 용기 아래쪽으로 이동하고 있는 용액량을 확인, 측정하는 실험을 반복함으로써, 진탕 가능, 즉 이동 가능한 용액의 존재량을 확인할 수 있다. 또한 동시에 진탕 가능 부위를 확인할 수 있어 그 용적을 산출하는 것이 좋다. 물론, 용기의 형상이 단순한 실린지의 경우, 진탕 가능 부위는 실린지 및 스토퍼(및 캡)에 의해 둘러싸인 공간 자체이다. 특히, 약 4.6 mm의 실린지 용기에서는 실질적인 진탕이 이루어지지 않아 특별히 공극부 비율을 고려할 필요가 없다.
통상, 캡이 부착된 실린지 용기에 통상의 방법에 의해 수용액 주사제를 충전한 후 스토퍼를 타전하는데, 타전 방법으로서는, 진공 타전 또는 벤트 튜브 방식(또는 슬리브 방식)을 채용할 수가 있다.
상술한 진공 타전 등에 의해 타전할 때는 비교적 용이하게 공극부 비율을 예를 들면 15 % 이하로 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서 실질적인 공극부가 존재하지 않는다는 것은, 전형적으로는 공극부 비율이 15 % 이하의 경우가 바람직한 예로서 이해된다. 또한, 공극부 비율이 10 % 이하인 경우도 바람직하며, 5 % 이하인 경우도 바람직하다. 피하 주사 또는 근육 주사에 적합한 기충전 실린지용 실린지 용기(통상 수 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖ 이하, 더욱 바람직하게는 1 ㎖ 이하, 특히 바람직하게는 0.5 ㎖ 이하), 예를 들면 적어도 약 8.6 mm 이하의 내경을 갖는 실린지 용기에 있어서는, 상술한 공극부 비율로 하면, 진탕 안정성이 우수한 기충전 실린지 제제가 용이하게 제조된다.
또한, 상기한 실린지 용기 외에, 계면 활성제의 첨가를 고려하면 , 바이알 또는 앰플을 용기로서 이용할 수 있다. 통상의 바이알 또는 앰플은 내경이 비교적 큰 것으로, 공극부 비율을 저하시키거나 조정하는 것이 비교적 곤란하기 때문으로, 공극부 비율을 엄밀히 조절할 필요가 있는 경우에는 피하는 것이 좋다.
이렇게 하여 얻어지는 수용액 주사제는, 장기 안정성으로서, 5 ℃에서 적어도 12개월, 바람직하게는 18개월 동안 약 80 % 이상의 역가를 유지할 수 있는 것으로서, 그 밖의 조건이 충족되면 경우에 따라서는, 2년, 바람직하게는 3년까지 저장 및 유통할 수 있는 경우도 예상된다.
또한, 25 ℃에서 진폭 5 ㎝, 180 왕복/분, 1개월 간의 진탕 조건에 있어서도 백탁을 발생시키는 일이 없는 것이다. 이러한 충분한 안정성을 갖는 본 발명의 수용액 주사제는, 액상으로 장기간 저장 및 유통할 수가 있다.
본 발명의 저장 및 유통 온도는 트롬보모듈린 수용액 주사제가 동결되지 않는 온도 이상, 실온 이하이고, 구체적으로는 0 ℃보다 높고 20 ℃ 이하인 것이 예시되며, 바람직하게는 5 ℃ 전후가 예시된다. 기간은 온도 등의 조건에 따라 다르지만, 통상 12개월, 바람직하게는 18개월, 더욱 바람직하게는 2년 정도가 예시된다.
또한, 본 발명에 있어서는, 피하 투여 또는 근육 주사에 이용하는 경우도 제공된다. 즉, 본 발명의 제4 태양으로서는, 상술한 기충전 실린지 제제를 피하 투여용 또는 근육 주사용에 이용하는 것이다.
또한, 본 발명의 제5의 태양으로서는, 가용성 트롬보모듈린을 유효 성분으로 하는 수용액 주사제로서, 1회/2 내지 5일의 간격으로 피하 또는 근육 주사하기 위한 지속성 제제를 사용하는 것을 특징으로 하는 가용성 트롬보모듈린의 혈중 농도를 지속시키는 방법이다.
또한, 본 발명의 제6 태양으로서는, 가용성 트롬보모듈린을 유효 성분으로 하는 수용액 주사제로서, 1회/2 내지 5일의 간격으로 피하 또는 근육 주사하기 위한 지속성 제제이다.
트롬보모듈린은 원래 혈관 내피 세포 표면에 존재하는 것이며, 그 작용 부위는 혈관내이므로, 트롬보모듈린을 투여하는 경우에는 정맥 주사로 행하는 것이 직접적이라고 종래부터 가장 바람직하게 믿어지고 있었다. 예를 들면, 특개소 64-6219호 공보에는 점적 정맥 주사의 예가 기재되어 있다.
그러나, 환자의 용태나 편의성에 적합한 선택 방법이 될 수 있는 다른 편리한 종래에 없는 제제 등의 개발은 필요하다.
지금까지의 보고 또는 발표에서는, 트롬보모듈린이 정맥 투여 이외의 투여에 의해 적극적으로 사용되는 것이 반드시 명확하지 않았으나, 본 발명자들이 확인한 바, 서열 번호 1의 19 내지 516 위치의 아미노산 서열로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린(서열 번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 숙주 세포에 형질감염시켜 얻어지는 가용성 트롬보모듈린)을 피하 투여하면, 가용성 트롬보모듈린의 혈중 농도가 확인될 뿐 아니라, 특히 서열 번호 1의 367 내지 480 위치의 아미노산 서열로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린과 비교하여도, 혈중 트롬보모듈린 농도가 현저히 지속되는 것이 비로소 확인되었다.
따라서, 본 발명에 따르면 바람직한 지속성 제제가 제공된다.
이 지속성 제제에는 추가로 국부 마취제를 함유시키는 것도 바람직하다. 또는 방부제를 함유시키는 것도 바람직하다.
이 국부 마취제로서, 염산 프로카인 또는 벤질알콜을 바람직한 예로서 들 수 있다. 국부 마취제의 첨가량은 통상 주사액량의 0.5 내지 10 %, 바람직하게는 1 내지 5 %가 예시된다.
또한 필요에 따라서, 특개평 6-321805호 공보, 특개소 64-6219호 공보 등에 개시된 바와 같이 아미노산, 염류, 당질, 계면 활성제, 알부민, 젤라틴 등을 첨가하여도 좋고, 방부제를 첨가하는 것도 바람직하며, 예를 들면 파라옥시벤조산에스테르류를 바람직한 예로서 들 수 있고, 파라옥시벤조산 에틸 또는 파라옥시벤조산 메틸, 또는 파라옥시벤조산에스테르류의 혼합물을 특히 바람직한 예로서 들 수 있다. 방부제의 첨가량은 통상 0.01 내지 1.0 %이고, 바람직하게는 0.1 내지 0.3 %이다.
본 발명의 지속성 제제에 사용되는 가용성 트롬보모듈린으로서는, 가용성 트롬보모듈린이면 전부 사용 가능하고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 서열 번호 1의 19 내지 516의 아미노산 서열로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린, 서열 번호 2의 19 내지 516의 아미노산 서열로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린, 서열 번호 1에 기재한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 숙주 세포에 형질감염시켜 얻어지는 가용성 트롬보모듈린 또는 서열 번호 2에 기재의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 숙주 세포에 형질감염시켜 얻어지는 가용성 트롬보모듈린 중 어느 하나의 가용성 트롬보모듈린을 바람직한 예로서 들 수 있다.
본 발명의 지속성으로서는, 예를 들면 혈중 농도 반감기(T1/2)가 16 시간 이상인 것 또는 평균 혈장 체류 시간(MRT)이 36 시간 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 지속성 제제는 주사액의 형태로 제공되는 것이 바람직하다. 본 발명의 지속성 제제로서는 동결 건조 제제를 사용시에 용해시켜 사용하는 형태로 제공하는 것도 고려되지만, 상술한 트롬보모듈린 수용액 주사제가 무균 충전된 기충전 실린지 제제를 그대로 피하용 또는 근육내 주사제로서 이용하는 것이 매우 바람직하다.
본 발명의 지속성 제제를 제조할 때, 이들 첨가물의 첨가 방법은 특별히 한정되지 않는다. 첨가물을 직접 트롬보모듈린 함유 용액에 첨가하거나, 미리 첨가물을 물, 주사용 증류수 또는 적당한 완충액에 용해시켜 상호 첨가 혼합하는 방법으로 용액을 제조한다. 예를 들면, 실린지 또는 바이알, 경우에 따라서는 앰플에 물, 주사용 증류수 또는 적당한 완충액 1 ㎖당 O.O5 내지 15 ㎎, 적합하게는 0.1 내지 6 ㎎의 트롬보모듈린 및 상기 첨가물을 함유하는 용액을, 예를 들면 0.5 내지 10 ㎖ 충전하여 그대로 수용액 주사용 제제로서 제조하거나, 바이알 또는 앰플에 있어서는 동결 건조할 수도 있다. 통상 이 지속성 제제에는, 가용성 트롬보모듈린을 O.O1 내지 1OO ㎎ 함유시킬 수 있다.
본 발명의 트롬보모듈린 수용액 주사제 또는 지속성 제제의 투여 횟수는, 통상과 같이, 1일 1 내지 3회 투여로 해도 좋지만, 예를 들면 1회/2 내지 5일 투여로서 투여할 수도 있다. 특히 피하 주사 또는 근육 주사의 경우에는, 지속성이기 때문에 예를 들면 1회/2 내지 5일 투여로서 투여하는 것이 특히 바람직하다. 혈관 주사시의 1회 투여량으로서는, 점적 정맥 주사로 최대량을 투여할 수 있지만, 혈관내 원샷 투여에 있어서의 1회 투여량으로서는, 통상은 가용성 트롬보모듈린으로서 1 ㎎/kg (체중) 이하가 예시된다. 최저량으로서는 통상, 0.001 ㎎/kg(체중) 이상, 바람직하게는 0.005 ㎎/kg(체중) 이상이 예시된다. 피하 주사 또는 근육 주사의 경우 1회 투여량은 피하 주사 또는 근육 주사가 가능한 액량에 용해시킬 수 있는 양이 상한이 된다. 피하 주사 또는 근육 주사에 알맞은 액량으로서는, 통상 수 ㎖, 바람직하게는 2 ㎖ 이하, 더욱 바람직하게는 1 ㎖ 이하, 특히 바람직하게는 0.5 ㎖ 이하가 예시된다. 따라서, 피하 주사 또는 근육 주사의 경우 1회 투여량으로서는, 가용성 트롬보모듈린으로서 20 ㎎ 이하가 통상이고, 최저량은 상기와 같이 0.001 ㎎/kg(체중) 이상, 바람직하게는 0.005 ㎎/kg (체중) 이상이 예시된다.
본 발명의 지속성 제제는 피하 투여하거나 근육내 투여하여도 마찬가지로 지속성이 발휘되지만, 특히 피하 투여가 바람직하다.
본 발명에 따르면, 혈중 농도 지속 시간을 현저하게 연장시키는 것이 가능하여, 투여 회수를 감소시킬 수 있음과 동시에, 정맥 주사제에 비하여 소량으로 유효한 가용성 트롬보모듈린 제제를 제공하는 것이 가능해진다. 환자의 주사시의 아픔을 경감시켜, 경우에 따라서는 자기 주사도 가능해지는 것으로, 환자의 통원 등의 편리가 현저히 공헌하는 것이다.
그런데, 본 발명의 가용성 트롬보모듈린 수용액 주사제의 급성 독성을 조사했더니, 각군 5마리의 자웅 SD 래트를 이용하여, 트롬보모듈린 양으로서 180 ㎎/kg의 용량을 정맥내 투여하여도 사망예는 어느 경우에도 발견되지 않았다. 또한 180 ㎎/kg의 용량으로 피하 주사를 행하였을 때도 사망예는 어느 경우에도 발견되지 않았다.
도 1은 래트에 가용성 트롬보모듈린을 투여한 경우의 혈장중 가용성 트롬보모듈린 농도의 경시 변화를 나타내는 것이다. 또, IV는 정맥 주사를 나타내고, SC는 피하 주사를 나타낸다.
〈서열표〉
서열 번호 1의 다른 정보는 사람 트롬보모듈린의 부분적인 아미노산 서열이다.
서열 번호 2의 다른 정보는 사람 트롬보모듈린의 부분적인 아미노산 서열이다.
서열 번호 3의 다른 정보는 사람 트롬보모듈린 유전자의 부분적인 염기 서열이다.
서열 번호 4의 다른 정보는 사람 트롬보모듈린 유전자의 부분적인 염기 서열이다.
서열 번호 5의 다른 정보는 변이용의 합성 DNA 이다.
〈실시예〉
이하, 실시예 및 비교예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해서 한정되는 것이 아니다.
〈참고예 1〉
실시예에 사용하는 가용성 트롬보모듈린은 상기 야마모토들의 방법(특개소 64-6219호 공보의 실시예 10에 기재한 방법)에 의해 수득하였다. 즉 서열 번호 3의 DNA를 차이니즈 햄스터 난소(CHO)세포에 도입하여 형질 전환 세포로 하고, 이 세포의 배양에 의해 가용성 트롬보모듈린을 생산하였다.
〈참고예 2〉
강음이온 교환 수지 컬럼에 의한 조정제
참고예 1에서 수득한 -20 ℃ 동결 배양 상등액 11 L을 용해하여, 0.2 ㎛의 멤브레인 필터(밀리포어사, 밀리팩 20)로 여과하였다.
여과한 배양 상등액을 150 mM NaCl를 포함하는 20 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.4)으로 평형화한 Q-세파로스(파마시아사) 컬럼(직경 90 mm, 높이 6.5 ㎝)에 로딩하였다. 이어서, 180 mM NaCl을 포함하는 20 mM 아세트산염 완충액으로 세정하고, 다시 180 mM NaCl을 포함하는 20 mM 트리스 염산 완충액(pH7.4)으로 세정하여, 300 mM NaCl을 포함하는 20 mM 트리스 염산 완충액(pH7.4)으로 용출을 개시하여, 용출액의 280 nm 흡광도 피크의 상승시로부터 0.5 컬럼 용량까지의 용출액을 조정제품으로서 수득하였다.
〈참고예 3〉
친화도 컬럼(트롬빈 칼럼)에 의한 주정제
참고예 2에서 얻어진 용출 분획 400 ㎖을 100 mM NaCl 및 0.5 mM 염화 칼슘을 포함하는 20 mM 트리스 완충액(pH 7.4)에 대하여 투석하였다. 투석 후, 100 mM NaCl 및 0.5 mM 염화 칼슘을 포함하는 20 mM 트리스 완충액(pH 7.4)으로 평형화한 DIP-트롬빈-아가로스(PAESE LOREI사, 06-148-1035, 직경 50 mm, 높이 6 ㎝)에 로딩하였다. 200 mM NaCl 및 0.5 mM 염화 칼슘을 포함하는 20 mM 트리스 완충액(pH 7.4)으로 세정후, 1.0 M NaCl 및 0.5 mM 염화 칼슘을 포함하는 20 mM 트리스 완충액(pH 7.4)으로 용출을 개시하여, 용출액의 280 nm 흡광도 피크의 상승시부터 하락시까지의 용출액을 주정제품으로서 수득하였다.
〈참고예 4〉
친화도 컬럼(항체 B)에 의한 주정제
친화도 컬럼은 이하와 같이 제작하였다. 즉, 항트롬보모듈린 모노클로날 항체 B는, 그 항체를 생산하는 하이브리도마를 배양함으로써 얻은 배양 상등액, 또는, 하이브리도마를 조직적합성 동물, 누드 마우스 등의 복강내에서 증식시켜 얻은 복수에서 염석, 이온 교환 크로마토그래피, 프로테인 A 컬럼 등의 분리 정제 조작에 의해 정제하였다. 이어서, 파마시아사의 방법(Affinity Chromatography principles ＆ methods)에 따라, 정제 항트롬보모듈린 모노클로날 항체 B를 0.5 M NaCl 함유 0.1 M NaHCO3완충액(pH 8.3)에 용해하여, CNBr-활성화된 세파로스 4B(파마시아사, 52-1153-00-AI)와 접촉 반응시켜, 세파로스 4B에 항트롬보모듈린 모노클로날 항체 B를 커플링하여, 항트롬보모듈린 모노클로날(항체 B) 결합 세파로스 4B를 제작하였다. 이어서 이 항트롬보모듈린 모노클로날(항체 B) 결합 세파로스 4B를 컬럼에 충전하여 모노클로날(항체 B)컬럼을 제작하였다.
참고예 2에서 얻어진 용출 분획 400 ㎖을, 1.0 M NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 모노클로날 항체(항체 B)컬럼(직경 50 mm, 높이 6 ㎝)에 로딩하였다. 1.0 M NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충액(pH 7.3)을 흘리고, 다시 100 mM 아세트산염 완충액(pH 5.0)을 흘려 세정하고, 0.3 M NaCl을 포함하는 100 mM 글리신 염산 완충액(pH 3.0)으로 용출을 개시하여, 용출액의 280 nm 흡광도 피크의 상승시부터 하락시까지의 용출액을 주정제품으로서 수득하였다.
〈참고예 5〉
강양이온 교환 수지 컬럼에 의한 고순도 정제
1. 트롬빈 칼럼 용출액의 정제(SP 비흡착 분획)
참고예 3에서 얻어진 용출액 200 ㎖에 100 mM 글리신 염산 완충액(pH 3.5)을 첨가하여 희석한 용액을, 이어서 1.0 M 글리신 염산 완충액(pH 2.0)으로 pH 3.5로 조정하였다. 이 희석 pH 제조한 용출액을 300 mM NaCl을 포함하는 100 mM 글리신염산 완충액(비전도도 31 ms/㎝, pH 3.5)으로 평형화한 SP-세파로스(파마시아사)컬럼(직경 26 mm, 높이 3 ㎝)에 로딩하였다. 300 mM NaCl을 포함하는 100 mM 글리신염산 완충액(상동)으로 세정을 개시하여, 세정액의 280 nm 흡광도 피크의 상승시부터 하락시까지의 세정액을 얻고, 즉시 500 mM 인산염 완충액(pH 7.3)으로 pH 7로 중화하여, 중화한 세정액을 고순도 정제품으로서 수득하였다.
2. 모노클로날 항체 컬럼 용출액의 정제(SP 비흡착 분획)
참고예 4에서 얻어진 용출액 180 ㎖을 1.0 M 글리신 염산 완충액(pH 2.0)으로 pH 3.5로 제조한 용액을, 300 mM NaCl을 포함하는 100 mM 글리신 염산 완충액(상동)으로 평형화한 SP-세파로스(파마시아사) 컬럼(직경 26 mm, 높이 3 ㎝)에 로딩하였다. 300 mM NaCl을 포함하는 100 mM 글리신 염산 완충액(상동)으로 세정을 개시하여, 세정액의 280 nm 흡광도 피크의 상승시부터 하락시까지의 세정액을 얻고, 즉시 500 mM 인산염 완충액(pH 7.3)으로 pH 7로 중화하여, 중화한 세정액을 고순도 정제품으로서 수득하였다.
3. 트롬빈 칼럼 용출액의 정제(SP 흡착 분획)
참고예 3에서 얻어진 용출액 200 ㎖에 100 mM 글리신 염산 완충액(pH 3.5)을 첨가하여 희석한 용액을, 이어서 1.0 M 글리신 염산 완충액(pH 2.0)으로 pH 3.5로 제조하였다. 이 희석, pH 제조한 용액을, 100 mM NaCl을 포함하는 100 mM 글리신 염산 완충액(pH 3.5)으로 평형화한 SP-세파로스(파마시아사) 컬럼(직경 26 mm, 높이 3 ㎝)에 로딩하였다. 100 mM NaCl을 포함하는 100 mM 글리신 염산 완충액(pH 3.5)으로 세정하여, 300 mM NaCl을 포함하는 100 mM 글리신 염산 완충액(pH 3.5)으로 용출하여, 용출액의 280 nm 흡광도 피크의 상승시부터 하락시까지의 용출액을 얻고, 즉시 500 mM 인산염 완충액(pH 7.3)으로 pH 7로 중화하여, 중화한 용출액을 고순도 정제품으로서 수득하였다.
4. 항체 컬럼 용출액의 정제(SP 흡착 분획)
참고예 4에서 얻어진 용출액 180 ㎖에 100 mM 글리신 염산 완충액(pH 3.5)을 첨가하여 희석한 용액을, 이어서 1.0 M 글리신 염산 완충액(pH 2.0)으로 pH 3.5로 제조하였다. 이 희석, pH 제조한 용액을 100 mM NaCl을 포함하는 100 mM 글리신 염산 완충액(pH 3.5)으로 평형화한 SP-세파로스(파마시아사) 컬럼(직경 26 mm, 높이 3 ㎝)에 로딩하였다. 100 mM NaCl을 포함하는 100 mM 글리신 염산 완충액(pH 3.5)으로 세정하여, 300 mM NaCl을 포함하는 100 mM 글리신 염산 완충액(pH 3.5)으로 용출하여, 용출액의 280 nm 흡광도 피크의 상승시부터 하락시까지의 용출액을 얻고, 즉시 500 mM 인산염 완충액(pH 7.3)으로 pH 7로 중화하여, 중화한 용출액을 고순도 정제품으로서 수득하였다.
〈참고예 6〉
폴리술폰 공중사에 의한 고순도 정제품의 농축
참고예 5에서 얻어진 고순도 정제품을 각각, 50 mM NaCl을 포함하는 20 mM 인산염 완충액(pH 7.3)으로 습윤화한 1 m의 폴리술폰 공중사(아사히 가세이 고교사 제품)를 이용하여 농축하여, 각각 5 ㎖의 농축액을 수득하였다.
〈참고예 7〉
겔여과 컬럼에 의한 고순도 정제품의 완충액 교환
참고예 6에서 얻어진 각각의 농축액 5 ㎖을, 50 mM NaCl을 포함하는 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.3)으로 평형화한 각각의 Sephacryl S-300컬럼(파마시아사, 직경 16 mm, 높이 90 ㎝)에 로딩하였다. 50 mM NaCl을 포함하는 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.3)으로 전개하여 분획하였다. 각 분획은 측정법 1의 트롬빈에 의한 프로테인 C 활성화를 촉진하는 활성 측정 방법에 의해 활성을 확인하고 활성 분획을 회수하여 완충액 교환한 고순도 정제품을 수득하였다.
이하의 실시예 및 비교예에서는, 참고예 2, 4, 5의 2, 6, 7의 순에 의해 정제한 트롬보모듈린 고순도 정제품을 이용하였다. 또한, 완충액 성분의 농도를 조정하는 경우 또는 인산나트륨 완충액 이외의 완충액 성분을 이용하는 경우에는, 상기에서 얻어진 고순도 정제품을 각 완충액에 대하여 투석하여 완충액 성분을 교환하였다. 또한, 적당한 농도의 완충액을 첨가하는 것으로 트롬보모듈린 농도를 조정하였다. pH는 묽은 염산 또는 수산화 나트륨 수용액을 적량 첨가함으로써 조정하였다.
수득된 트롬보모듈린은, 주사용 증류수에 적어도 6 ㎎/㎖의 농도에서 가용성이라는 것이 확인되었다. 또한, 이하의 분자량의 측정에 의해, 6.6만±1만(비환원 상태)이라는 것이 확인되었다.
〈분자량의 측정〉
전기영동용 구배 겔(SDS 폴리아크릴아미드 농도 구배겔, 상품명: 파젤 5/20 %, 아트사 제품, 겔 사이즈 90×73×1.0 mm)로써, 비환원 상태에 있어서, 25 ℃, 20 mA의 정전류에서 약 90 분 간 영동을 행하여, 분자량 표준 물질〔파마시아사 제품, 저분자 전기 영동용 키트: 1 바이알 중에 포스포릴라제 b (분자량 94,000), 소혈청 알부민(분자량 67,000), 난백 알부민(분자량 43,000), 카르보닐 안 히드라아제(분자량 30,000), 트립신 억제제(분자량 20,100), α-락트알부민(분자량 14,400) 및 자당 포함〕와의 비교에 의해, 트롬보모듈린의 분자량을 측정하였다. 염색은 쿠마시 브릴리언트 블루 염색에 의한다.
〈참고예 8〉
서열 번호 1의 367 내지 480 위치의 아미노산으로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린을 이하와 같이 수득하였다. 즉 특개평 5-213998호 공보의 실시예1-(1)-(b)에 기재된 방법으로 수득한 플라스미드를 실시예1-(2)에 기재된 방법에 따라 세포에 형질감염시켜 실시예 3-(3)에 기재된 방법에 따라 정제하고, 다시 완충액 교환하여 고순도 정제품을 수득하였다.
수득된 트롬보모듈린은, 주사용 증류수에 적어도 6 ㎎/㎖의 농도에서 가용성이라는 것이 확인되었다. 또한, 상기한 분자량의 측정에 의해, 2.5만±0.5만(비환원 상태)이라는 것이 확인되었다.
완충액 성분의 농도를 조정하는 경우 또는 인산나트륨 완충액 이외의 완충액 성분을 이용하는 경우에는, 상기에서 얻어진 고순도 정제품을 각 완충액에 대하여 투석하여 완충액 성분을 교환하였다. 또한, 적당한 농도의 완충액을 첨가하여 트롬보모듈린 농도를 조정하였다. pH는 묽은 염산 또는 수산화 나트륨수용액을 적량 첨가함으로써 조정하였다.
〈참고예 9〉
서열 번호 2의 19 내지 516 위치의 아미노산으로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린을 이하와 같이 수득하였다. 즉, 메소드 인 엔자이몰로지(Method in Enzymology), 제100권, 제468페이지(1983년), 아카데믹 프레스(Acade㎖c Press)에 기재된 방법에 따라, 서열 번호 3의 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을, 서열 번호 5에 표시된 염기 서열을 갖는 변이용 합성 DNA를 이용하여 부위 특이적 변이를 유발하여 서열 번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA로 하고, 이하 참고예 1 내지 7에 준하여, 상기한 트롬보모듈린을 수득하였다.
수득된 트롬보모듈린은, 주사용 증류수에 적어도 6 ㎎/㎖의 농도에서 가용성이라는 것이 확인되었다. 또한, 상기한 분자량의 측정에 의해, 6.6만±1만(비환원 상태)이라는 것이 확인되었다.
완충액 성분의 농도를 조정하는 경우 또는 인산나트륨 완충액 이외의 완충액 성분을 이용하는 경우에는, 상기에서 얻어진 고순도 정제품을 각 완충액에 대하여 투석하여 완충액 성분을 교환하였다. 또한, 적당한 농도의 완충액을 첨가함으로써 트롬보모듈린 농도를 조정하였다. pH는 묽은 염산 또는 수산화 나트륨수용액을 적량 첨가함으로써 조정하였다.
〈실시예 1〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 0.2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80(상품명: Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플(내경 12 mm)에 2 ㎖ 분주하여 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다. 이 때의 진탕 가능 부위에 있어서의 공극부 비율은 약 35 % 이었다.
〈실시예 2〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖로, 인산나트륨 완충액 농도를 0.2 mM로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60(상품명: HCO-60)을 0.1 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 3〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖로, 아세트산 나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80(Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 4〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 아세트산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60 (HCO-60)을 0.1 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 5〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 아세트산나트륨 완충액 농도를 200 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80(Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 6〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 아세트산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시, NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80(Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 5.5로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 7〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖로, 아세트산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시, NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 5.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 8〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 아세트산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 9〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 아세트산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 5.5로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 10〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 아세트산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 5.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 11〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 아세트산나트륨 완충액 농도를 0.2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 12〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 아세트산나트륨 완충액 농도를 0.2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 5.5로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖ 용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 13〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 아세트산나트륨 완충액 농도를 0.2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80(Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 5.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖ 용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 14〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 200 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 15〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 200 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 5.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 16〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 17〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 5.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 18〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80(Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 19〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80(Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 5.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 20〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로, 아세트산나트륨 완충액 농도가 20 mM가 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 7.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 21〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충 농도를 20 mM으로, 아세트산나트륨 완충액 농도가 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.5로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 22〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로, 아세트산나트륨 완충액 농도가 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 23〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로, 아세트산나트륨 완충액 농도가 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 5.5로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖ 용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 24〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로, 아세트산나트륨 완충액 농도가 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 5.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 25〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 말론산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl를 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 26〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 숙신산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 27〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 글루타르산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 28〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 타르타르산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80(Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 29〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 푸마르산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 30〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 말산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 31〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 프로피온산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 32〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 구연산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 33〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로, 프로피온산나트륨 완충액 농도가 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.0 1 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 34〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 0 mM으로, 글루타르산나트륨 완충액 농도가 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ml 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 35〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로, 숙신산나트륨 완충액 농도가 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 36〉
참고예7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액을 20 mM으로, 타르타르산나트륨 완충액 농도가 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 37〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로, 푸마르산나트륨 완충액이 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 38〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로, 말산나트륨 완충액이 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 39〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80(Tween 80)을 0.1 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 40〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60 (HCO-60)을 1 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 41〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60 (HCO-60)을 0.1 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 42〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜(상품명: 플루로닉 F68)을 1 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 43〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜(플루로닉 F68)을 0.1 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 44〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈실시예 45〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 5 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 46〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 47〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 15 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 48〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 25 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 49〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 8.6 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 스탠다드(표준) 타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 5 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 50〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 8.6 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 스탠다드(표준) 타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 1 O %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 51〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 8.6 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 스탠다드(표준) 타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 15 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 52〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 8.6 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 스탠다드(표준) 타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 25 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼 (웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 53〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 0.5 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 1 O %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 54〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 0.5 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 15 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 55〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 0.5 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 30 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 56〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 0.5 ml 분주하고, 공극부 비율이 40 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 57〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 8.6 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ml스탠다드(표준) 타입 실린지, 바늘없음)에 0.5 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 40 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 58〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 8.6 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 스탠다드(표준) 타입 실린지, 바늘없음)에 0.5 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 50 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 59〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 4.6 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 0.5 ㎖실린지, 바늘부)에 0.5 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 60〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 4.6 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 0.5 ㎖실린지, 바늘부)에 0.5 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 15 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 61〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 4.6 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 0.5 ㎖실린지, 바늘부)에 0.3 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 15 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 62〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 4.6 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 0.5 ㎖실린지, 바늘부)에 0.3 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 35 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 63〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 4.6 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 0.5 ㎖실린지, 바늘부)에 0.3 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 50 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 64〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 5.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여, 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 65〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 5. 5으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 66〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6. 5으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 67〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 7.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 68〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 69〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 200 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡톤·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 1 O %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 70〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 아세트산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 71〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 아세트산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지 (벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 72〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 아세트산나트륨 완충액 농도를 200 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 73〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 0.1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 1O %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 74〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 0.3 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 1 O %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 75〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 3 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 6 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 76〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 6 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 12 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 77〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 3 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 6 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 0· 5 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 15 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 78〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 6 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 12 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 O.5 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 15 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 79〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 80〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 3 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 6 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 81〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 6 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 12 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80(Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입, 바늘없음)에 0.5 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 15 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 82〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 6 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 12 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리옥시 에틸렌 피마자유(크레모포르 EL)를 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ml 롱타입 실린지, 바늘없음)에 0.5 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 15 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 83〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 0 mM으로, 아세트산나트륨 완충액 농도가 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 84〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로, 프로피온산나트륨 완충액 농도가 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 85〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로, 글루타르산나트륨 완충액 농도가 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 86〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 0 mM으로, 숙신산나트륨 완충액 농도가 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 87〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로, 타르타르산나트륨 완충액 농도가 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 88〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로, 푸마르산나트륨 완충액이 2 0 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 89〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로, 말산나트륨 완충액이 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 90〉
참고예9의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다. (공극부 비율: 35 %)
〈실시예 91〉
참고예 9의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈실시예 92〉
참고예 8의 트롬보모듈린(서열 번호 1의 367 내지 480 위치의 아미노산으로 이루어진)의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈비교예 1〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후 pH를 7.3으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ml 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈비교예 2〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈비교예 3〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 0.2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈비교예 4〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 아세트산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈비교예 5〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도가 200 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 7.3으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈비교예 6〉
참고예7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 7.3으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈비교예 7〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80(Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 7.3으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈비교예 8〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로, 아세트산나트륨 완충액 농도가 20 mM이 되도록 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 7.3으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈비교예 9〉
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 7.3으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다. 이 때의 진탕 가능 부위에서의 공극부 비율은 35 % 이었다.
〈비교예 10〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 7.3으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈비교예 11〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 8.6 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 스탠다드(표준) 타입 실린지, 바늘없음)에 0.5 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 60 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈비교예 12〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 8.6 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 스탠다드(표준) 타입 실린지, 바늘없음)에 0.5 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 70 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈비교예 13〉
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 7.3으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 10 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다.
〈비교예 14〉
참고예 의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈비교예 15〉
참고예 8의 트롬보모듈린의 농도를 1 ㎎/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 20 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM 가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을 2 ㎖용 앰플에 2 ㎖ 분주하고 밀봉하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제를 제조하였다(공극부 비율: 35 %).
〈시험예 1〉
실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 4의 수용액 주사용 제제를, 하기 측정법 1에 의해 열안정성에 관한 역가의 잔존율(잔존 역가 %)을 측정하였다. 측정법 1에서는, 50 ℃ 96 시간 보존 후의 역가가 66% 이상인 것을 적합이라고 판정하였다. 또 아레니우스 플로트에 의한 예측으로부터, 50 ℃ 96 시간 보존 후의 역가가 66 % 이상인 것은, 5 ℃ 보존에서 80 % 이상 역가를 유지하고 있는 기간이 3년으로 추정된다. 또한, 측정법 2에 의해 진탕 안정성 시험에 관한 평가를 행하였다. 그리고, 측정법 1과 측정법 2의 측정 결과 모두에서 만족할만한 결과를 얻은 것에 대하여, 종합 평가로서 적합, 부적합을 판단하였다. 그 결과를 표 1에 나타냈다.
보존시의 완충액 농도, 조성 보존시의 pH 계면 활성제 농도,종류 측정법 1 측정법 2 종합 평가
잔존 역가(%) 외관 탁도 잔존 역가(%)
비교예 1 20 mM인산나트륨 7.3 없음 55.4 백탁 부적합
비교예 2 20 mM인산나트륨 6.0 없음 79.1 백탁 부적합
비교예 3 0.2 mM인산나트륨 6.0 없음 83.4 백탁 2.930 98.4 부적합
실시예 1 0.2 mM인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 84.7 무색 투명 0.000 100.6 적합
실시예 2 0.2 mM인산나트륨 6.0 0.1 %HCO-60 85.4 무색 투명 0.002 101.0 적합
비교예 4 20 mM아세트산나트륨 6.0 없음 86.7 백탁 2.930 99.6 부적합
실시예 3 20 mM아세트산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 87.8 무색 투명 0.002 101.8 적합
실시예 4 20 mM아세트산나트륨 6.0 0.1 %HCO-60 84.4 무색 투명 0.002 102.5 적합
즉, 인산 나트륨 완충액 및 아세트산 나트륨 완충액 모두 pH 6.0에서는, 열안정성에 있어서의 잔존 역가가 전부 66 % 이상이었으나, pH 7.3의 비교예 1에서는 66 % 이하였다. 또한, 0.01 % Tween 80 또는 0.1 % HCO-60의 계면 활성제가 병존한 경우에, 진탕 안정성에 있어서 백탁을 발생시키지 않아, 종합 평가가「적합」인 수용액 주사용 제제가 제조되었다.
〈측정법 1〉 열안정성 시험(50 ℃에서 96 시간 가열 처리)
측정할 수용액 주사용 제제를, 50 ℃에서 96 시간 가열 처리를 행하여, 이하의 순서로 트롬보모듈린 역가를 측정하여, 열처리하지 않고 동결 보존하고 있는 시료의 역가를 100 %로 하고, 열 처리한 시료의 역가 잔존율(잔존 역가 %)을 비교하였다.
트롬보모듈린 역가의 측정은, 트롬빈에 의한 프로테인 C 활성화를 촉진하는 작용(APC 측정법)으로 측정하였다. 즉, 100 mM의 NaCl, 3 mM의 염화 칼슘, 0.1 %의 소혈청 알부민(시그마사), 0.225 NIHU의 사람 트롬빈(시그마사)을 포함하는 50 mM 트리스 염산 완충액(pH 8.5) 37.5 μL에, 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 제제로부터 적절하게 제조한 시료 용액 5μL(단, 시료 용액 5μL 중의 트롬보모듈린 양을 0.35 내지 1.4 ng의 범위가 되도록 적절한 희석율로 희석한다)를 첨가하여 37 ℃에서 15분 정치하고, 약 300 μg/㎖의 소 프로테인 C(라이프 테크놀로지사)를 7.5 μL 첨가하여 37 ℃에서 다시 30분 정치하여 프로테인 C을 활성화시켰다. 이어서, 약 1OO μg/㎖의 헤파린(와코쥰야쿠 고교사)와 약 6 μg/㎖의 안티트롬빈 III(라이프 테크놀로지스사)를 포함하는 용액 7.5 μL을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이어서, 합성 기질(BOC-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA) 100 μg/㎖을 포함하는 기질 반응액 500 μL을 첨가하여 37 ℃에서 20 분간 정치하였다. 아세트산 50 μL을 첨가하여 기질 절단 반응을 정지시켰다. 반응액을 형광 광도계를 이용하여 여기 파장 380 nm, 발광 파장 440 nm에서 형광 강도를 측정하여 생성된 활성형 프로테인 C량을 구하고, 다시 트롬보모듈린 역가 표준물질과 비교하여 트롬보모듈린 역가를 계산하였다.
〈측정법 2〉 진탕 안정성 시험(180 왕복/분의 진탕 처리)
측정되는 수용액 주사용 제제를, 25 ℃의 항온 진탕기 중에서 진폭 5 ㎝, 1분 동안 180 왕복의 조건으로 1개월간 진탕 처리를 하여 처리 전후의 외관 변화를 관찰하였다. 필요에 따라 탁도(650 nm 에서의 흡광도) 및 트롬보모듈린 역가의 잔존율을 측정하였다. 또, 진탕 방향은 용기의 장축과 평행 방향으로 하였다. 트롬보모듈린 역가의 측정법은, 측정법 1과 동일 측정법에 의하였다.
〈시험예 2〉
실시예 3, 5 내지 13 및 비교예 1의 수용액 주사용 제제에 대하여, 상술한 측정법 1 및 측정법 2의 측정을 행하여, 마찬가지로 종합 평가를 행하였다. 그 결과를 표 2에 나타냈다.
보존시의 완충액 농도, 조성 보존시의pH 계면 활성제 농도, 종류 측정법 1 측정법 2 종합 평가
잔존 역가(%) 외관 탁도 잔존 역가(%)
비교예 1 20 mM인산나트륨 7.3 없음 55.4 백탁 부적합
실시예 5 200 mM아세트산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 85.4 무색 투명 적합
실시예 3 20 mM아세트산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 87.8 무색 투명 적합
실시예 6 20 mM아세트산나트륨 5.5 0.01 %Tween80 90.3 무색 투명 적합
실시예 7 20 mM아세트산나트륨 5.0 0.01 %Tween80 75.1 무색 투명 적합
실시예 8 2 mM아세트산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 85.4 무색 투명 적합
실시예 9 2 mM아세트산나트륨 5.5 0.01 %Tween80 79.0 무색 투명 적합
실시예 10 2 mM아세트산나트륨 5.0 0.01 %Tween80 75.7 무색 투명 적합
실시예 11 0.2 mM아세트산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 84.4 무색 투명 적합
실시예 12 0.2 mM아세트산나트륨 5.5 0.01 %Tween80 80.9 무색 투명 적합
실시예 13 0.2 mM아세트산나트륨 5.0 0.01 %Tween80 77.4 무색 투명 적합
즉, 아세트산 나트륨 완충액의 농도를 0.2 내지 200 mM의 넓은 농도 범위에서 흔들었지만, 완충액 농도에 의한 영향은 없고, pH를 5.0 내지 6.0의 범위로 하면, 열안정성에 있어서의 잔존 역가는 전부 66 % 이상이었다. 또한, 0.01 % TW-een80이 병존한 경우에, 진탕 안정성에 있어서 백탁을 발생시키는 일이 없어 종합평가가「적합」인 수용액 주사용 제제가 제조되었다.
〈시험예 3〉
실시예 14 내지 19 및 비교예 5 내지 7의 수용액 주사용 제제에 대하여, 상술한 측정법 1 및 측정법 2의 측정을 행하여, 마찬가지로 종합 평가를 행하였다. 그 결과를 표 3에 나타냈다.
보존시의 완충액 농도, 조성 보존시의pH 계면 활성제 농도, 종류 측정법 1 측정법 2 종합 평가
잔존 역가(%) 외관 탁도 잔존 역가(%)
비교예 5 200 mM인산나트륨 7.3 0.01 %Tween80 7.1 무색 투명 부적합
실시예 14 200 mM인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 73.7 무색 투명 적합
실시예 15 200 mM인산나트륨 5.0 0.01 %Tween80 67.8 무색 투명 적합
비교예 6 20 mM인산나트륨 7.3 0.01 %Tween80 54.1 무색 투명 부적합
실시예 16 20 mM인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 88.2 무색 투명 적합
실시예 17 20 mM인산나트륨 5.0 0.01 %Tween80 72.3 무색 투명 적합
비교예 7 2 mM인산나트륨 7.3 0.01 %Tween80 63.2 무색 투명 부적합
실시예 18 2 mM인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 86.8 무색 투명 적합
실시예 19 2 mM인산나트륨 5.0 0.01 %Tween80 70.3 무색 투명 적합
즉, 인산 나트륨 완충액의 농도를 2 내지 200 mM의 넓은 농도 범위에서 흔들 었더니, pH 7.3에서는 완충액 농도에 의한 영향이 있어, 농도가 짙어질수록 역가의 저하가 나타나 66 %를 밑돌았으나(비교예 5 내지 7), pH를 5.0 내지 6.0의 범위로 하면, 열안정성에 있어서의 잔존 역가는 모두 66 % 이상이었다. 또한, 0.01 % Tween 80이 병존한 경우에, 진탕 안정성에 있어서 백탁을 발생시키는 일이 없어 종합 평가가「적합」인 수용액 주사용 제제가 제조되었다.
〈시험예 4〉
실시예 20 내지 24 및 비교예 1, 8의 수용액 주사용 제제에 대하여, 상술한 측정법 1 및 측정법 2의 측정을 행하여, 마찬가지로 종합 평가를 행하였다. 그 결과를 표 4에 나타냈다.
보존시의 완충액 농도, 조성 보존시의 pH 계면 활성제 농도, 종류 측정법 1 측정법 2 종합 평가
잔존 역가(%) 외관 탁도 잔존 역가(%)
비교예 1 20 mM인산나트륨 7.3 없음 55.4 백탁 부적합
비교예 8 20 mM인산나트륨20 mM아세트산나트륨 7.3 0.01 %Tween80 59.8 무색 투명 부적합
실시예 20 20 mM인산나트륨20 mM아세트산나트륨 7.0 0.01 %Tween80 68.9 무색 투명 적합
실시예 21 20 mM인산나트륨20 mM아세트산나트륨 6.5 0.01 %Tween80 74.2 무색 투명 적합
실시예 22 20 mM인산나트륨20 mM아세트산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 81.3 무색 투명 적합
실시예 23 20 mM인산나트륨20 mM아세트산나트륨 5.5 0.01 %Tween80 80.7 무색 투명 적합
실시예 24 20 mM인산나트륨20 mM아세트산나트륨 5.0 0.01 %Tween80 71.3 무색 투명 적합
즉, 인산 나트륨 완충액, 아세트산 나트륨 완충액의 농도를 모두 20 mM 으로 조정하고, pH를 5.0 내지 7.3으로 하여 흔들었더니, pH가 5.0 내지 7.0의 범위에서는 열안정성에서의 잔존 역가는 모두 66 % 이상이었다. pH를 5.5 내지 6.5의 범위로 하면, 열안정성에서의 잔존 역가는 73 % 이상이며, 이것은 5 ℃ 보존에서 80 % 이상 역가를 유지하고 있는 기간이 4년으로 추정되었다. 특히 pH 5.5 및 6.0에서의 잔존 역가는 80 % 이상으로 높았다. 한편 pH 7.3에서는 66 %를 밑돌았다 (비교예 1, 8). 또한, 0.01 % Tween 80이 병존한 경우으로, 진탕 안정성에 있어서 백탁을 발생시키지 않아 종합 평가가「적합」인 수용액 주사용 제제가 제조되었다.
〈시험예 5〉
실시예 25 내지 32 및 비교예 1, 2의 수용액 주사용 제제에 대하여 상술한 측정법 1 및 측정법 2의 측정을 행하여, 마찬가지로 종합 평가를 행하였다. 그 결과를 표 5에 나타냈다.
보존시의 완충액 농도, 조성 보존시의 pH 계면 활성제 농도, 종류 측정법 1 측정법 2 종합 평가
잔존 역가(%) 외관 탁도 잔존 역가(%)
비교예 1 20 mM인산나트륨 7.3 없음 55.4 백탁 부적합
비교예 2 20 mM인산나트륨 6.0 없음 79.1 백탁 부적합
실시예 25 20 mM말론산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 85.9 무색 투명 적합
실시예 26 20 mM숙신산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 81.7 무색 투명 적합
실시예 27 20 mM글루타르산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 82.4 무색 투명 적합
실시예 28 20 mM타르타르산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 74.5 무색 투명 적합
실시예 29 20 mM푸마르산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 77.3 무색 투명 적합
실시예 30 20 mM말산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 77.0 무색 투명 적합
실시예 31 20 mM프로피온산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 79.2 무색 투명 적합
실시예 32 20 mM시트르산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 74.5 무색 투명 적합
즉, 완충액 성분을 20 mM의 각종 카르복실산염으로 바꾸어도 pH를 6.0으로 조정하면, 열안정성에 있어서의 잔존 역가는 전부 66 % 이상이었다. 또한, 0.01 % Tween80이 병존된 경우에, 진탕 안정성에서 백탁을 발생시키지 않아 종합 평가가 「적합」인 수용액 주사용 제제가 제조되었다.
〈시험예 6〉
실시예 33 내지 38 및 비교예 1, 2의 수용액 주사용 제제에 대하여 상술한 측정법 1 및 측정법 2의 측정을 행하여, 마찬가지로 종합 평가를 행하였다. 그 결과를 표 6에 나타냈다.
보존시의 완충액농도, 조성 보존시의 pH 계면 활성제농도, 종류 측정법 1 측정법 2 종합평가
잔존 역가(%) 외관 탁도 잔존역가(%)
비교예 1 20 mM인산나트륨 7.3 없음 55.4 백탁 부적합
비교예 2 20 mM인산나트륨 6.0 없음 79.1 백탁 부적합
실시예 33 20 mM인산나트륨20 mM프로피온산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 78.0 무색 투명 적합
실시예 34 20 mM인산나트륨20 mM글루타르산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 76.1 무색 투명 적합
실시예 35 20 mM인산나트륨20 mM숙신산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 82.1 무색 투명 적합
실시예 36 20 mM인산나트륨20 mM타르타르산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 81.3 무색 투명 적합
실시예 37 20 mM인산나트륨20 mM푸마르산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 72.6 무색 투명 적합
실시예 38 20 mM인산나트륨20 mM말산나트륨 6.0 84.3 무색 투명
즉, 인산 나트륨 완충액에 각종 카르복실산염의 완충액 성분을 첨가하여도 pH를 6.0으로 조정하면, 열안정성에서의 잔존 역가는 모두 66 % 이상이었다. 또, 0.01 % Tween80이 병존된 경우에 진탕 안정성에서 백탁을 발생시키지 않아 종합 평가가 「적합」인 수용액 주사용 제제가 제조되었다.
〈시험예 7〉
실시예 18, 39 내지 43, 44 및 비교예 9의 수용액 주사용 제제에 대하여 상 술한 측정법 1 및 측정법 2의 측정을 행하였다. 그 결과를 표 7에 나타냈다.
보존시의 완충액 농도, 조성 보존시의 pH 계면 활성제 농도, 종류 측정법 1 측정법 2 종합 평가
잔존 역가(%) 외관 탁도 잔존 역가(%)
비교예 9 2 mM인산나트륨 7.3 없음 부적합 백탁 1.299 90.8 부적합
실시예 39 2 mM인산나트륨 6.0 0.1 %Tween80 적합 무색 투명 -0.008 97.6 적합
실시예 18 2 mM인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 적합 무색 투명 -0.010 87.0 적합
실시예 40 2 mM인산나트륨 6.0 1 %HCO-60 적합 무색 투명 0.017 87.8 적합
실시예 41 2 mM인산나트륨 6.0 0.1 %HCO-60 적합 무색 투명 -0.003 93.8 적합
실시예 42 2 mM인산나트륨 6.0 1 %플루로닉 F68 적합 무색 투명 0.010 101.7 적합
실시예 43 2 mM인산나트륨 6.0 0.1 %플루로닉 F68 적합 무색 투명 -0.004 93.2 적합
실시예 44 20 mM인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 적합 무색 투명 적합
즉, 계면 활성제의 종류와 농도를 바꾸어 진탕 안정성을 측정했더니, 계면 활성제가 없으면 외관이 백탁된(비교예 9) 것에 비하여 계면 활성제를 넣은 것은 백탁이 방지되었다. 계면 활성제 농도는 상품명: Tween80은 0.1 %이고, 상품명: HCO-60 및 상품명: 플루로닉 F68은 0.1 %로 충분히 효과가 있었다. 또 식염의 영향은 없었다.
〈시험예 8〉
실시예 45 내지 63 및 비교예 10 내지 12의 수용액 주사용 제제에 관해서, 상술한 측정법 1 및 측정법 2의 측정을 행하여, 마찬가지로 종합 평가를 행하였다. 그 결과를 표 8에 나타냈다.
보존시의 완충액 농도, 조성 보존시의 pH 공극율 비율(%) 측정법 1 측정법 2 종합 평가
잔존 역가(%) 외관 탁도 잔존 역가(%)
비교예 10 2 mM 인산나트륨 7.3 10 부적합 무색 투명 0.012 부적합
비교예 11 2 mM 인산나트륨 6.0 60 적합 백탁 0.124 92.9 부적합
비교예 12 2 mM 인산나트륨 6.0 70 적합 백탁 0.182 95.3 부적합
실시예 45 2 mM 인산나트륨 6.0 5 적합 무색 투명 0.004 97.8 적합
실시예 46 2 mM 인산나트륨 6.0 10 86.5 무색 투명 0.006 98.6 적합
실시예 47 2 mM 인산나트륨 6.0 15 적합 무색 투명 0.019 96.8 적합
실시예 48 2 mM 인산나트륨 6.0 25 적합 무색 투명 0.010 93.2 적합
실시예 49 2 mM 인산나트륨 6.0 5 적합 무색 투명 0.005 93.2 적합
실시예 50 2 mM 인산나트륨 6.0 10 적합 무색 투명 0.008 92.7 적합
실시예 51 2 mM 인산나트륨 6.0 15 적합 무색 투명 0.010 90.7 적합
실시예 52 2 mM 인산나트륨 6.0 25 93.2 무색 투명 0.049 92.7 적합
실시예 53 2 mM 인산나트륨 6.0 10 적합 무색 투명 0.005 96.5 적합
실시예 54 2 mM 인산나트륨 6.0 15 적합 무색 투명 0.018 95.8 적합
실시예 55 2 mM 인산나트륨 6.0 30 적합 무색 투명 0.013 96.8 적합
실시예 56 2 mM 인산나트륨 6.0 40 80.9 무색 투명 0.018 97.8 적합
실시예 57 2 mM 인산나트륨 6.0 40 적합 무색 투명 0.016 97.2 적합
실시예 58 2 mM 인산나트륨 6.0 50 적합 무색 투명 0.045 92.8 적합
실시예 59 2 mM 인산나트륨 6.0 10 적합 무색 투명 0.020 적합
실시예 60 2 mM 인산나트륨 6.0 15 적합 무색 투명 0.005 적합
실시예 61 2 mM 인산나트륨 6.0 15 적합 무색 투명 0.022 적합
실시예 62 2 mM 인산나트륨 6.0 35 적합 무색 투명 0.015 적합
실시예 63 2 mM 인산나트륨 6.0 50 적합 무색 투명 0.014 적합
즉, 진탕 가능 부위에서의 공극부 비율을 50 % 이하로 했을 경우에는 진탕 안정성에서 백탁을 발생시키지 않았으나, 60 %의 비교예 11, 70 %의 비교예 12에서는 진탕에 의해 백탁이 발생되었다. pH를 6.0으로 했을 경우에는 열안정성에서의 잔존 역가는 66 % 이상이 되어 종합 평가가 「적합」인 수용액 주사용 제제가 제조되었다.
〈시험예 9〉
실시예 46, 64 내지 72 및 비교예 10의 수용액 주사용 제제에 대하여 상술한 측정법 1 및 측정법 2의 측정을 행하여, 마찬가지로 종합 평가를 행하였다. 그 결과를 표 9에 나타냈다.
보존시의 완충액 농도, 조성 보존시의 pH 공극부 비율(%) 측정법 1 측정법 2 종합 평가
잔존 역가(%) 외관 탁도 잔존역가(%)
비교예 10 2 mM 인산나트륨 7.3 10 부적합 무색 투명 0.012 부적합
실시예 46 2 mM 인산나트륨 6.0 10 86.5 무색 투명 0.006 98.6 적합
실시예 64 2 mM 인산나트륨 5.0 10 66.2 무색 투명 0.020 87.9 적합
실시예 65 2 mM 인산나트륨 5.5 10 75.9 무색 투명 0.022 94.8 적합
실시예 66 2 mM 인산나트륨 6.5 10 75.9 무색 투명 0.013 90.9 적합
실시예 67 2 mM 인산나트륨 7.0 10 67.2 무색 투명 0.013 93.0 적합
실시예 68 20 mM 인산나트륨 6.0 10 79.6 무색 투명 0.007 적합
실시예 69 200 mM 인산나트륨 6.0 10 74.6 무색 투명 0.016 적합
실시예 70 2 mM 아세트산나트륨 6.0 10 92.4 무색 투명 0.014 적합
실시예 71 20 mM 아세트산나트륨 6.0 10 88.4 무색 투명 0.015 적합
실시예 72 200 mM 아세트산나트륨 6.0 10 91.8 무색 투명 0.016 적합
즉, 인산나트륨 완충액 또는 아세트산나트륨 완충액의 농도를 2 내지 200 mM의 넓은 농도 범위에서 완충액 농도에 의한 영향은 없고, pH가 5.0 내지 7.0의 범위로 하면, 열안정성에 있어서의 잔존 역가는 모두 66 % 이상이었다. 또한, 공극부 비율을 10 %로 한 경우에, 진탕 안정성에 있어서 백탁을 발생시키는 일이 없어, 종합 평가가「적합」인 수용액 주사용 제제가 제조되었다.
〈시험예 10〉
실시예 46, 73 내지 82, 90 내지 92 및 비교예 13 내지 15의 수용액 주사용 제제에 대하여 상술한 측정법 1 및 측정법 2의 측정을 행하여, 마찬가지로 종합 평가를 행하였다. 그 결과를 표 10에 나타냈다.
보존시의 완충액 농도, 조성 보존시의 pH 계면 활성제의 농도, 종류 측정법 1 측정법 2 종합 평가
잔존 역가(%) 외관 탁도 잔존 역가(%)
비교예 13 20 mM 인산나트륨 7.3 없음 51.9 무색 투명 0.004 87.9 부적합
실시예 73 2 mM 인산나트륨 6.0 없음 89.1 무색 투명 0.009 94.5 적합
실시예 74 2 mM 인산나트륨 6.0 없음 84.4 무색 투명 0.014 97.8 적합
실시예 46 2 mM 인산나트륨 6.0 없음 86.5 무색 투명 0.006 98.6 적합
실시예 75 6 mM 인산나트륨 6.0 없음 적합 무색 투명 0.015 89.8 적합
실시예 76 12 mM 인산나트륨 6.0 없음 적합 무색 투명 0.019 95.2 적합
실시예 77 6 mM 인산나트륨 6.0 없음 69.9 무색 투명 0.042 99.4 적합
실시예 78 12 mM 인산나트륨 6.0 없음 82.2 무색 투명 0.028 101.9 적합
실시예 79 2 mM 인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 적합 무색 투명 0.004 95.6 적합
실시예 80 6 mM 인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 적합 무색 투명 0.002 96.7 적합
실시예 81 12 mM 인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 적합 무색 투명 0.002 96.9 적합
실시예 82 12 mM 인산나트륨 6.0 0.01 %크레모포르EL 적합 무색 투명 0.000 94.8 적합
실시예 90 20 mM 인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 적합 무색 투명 적합
실시예 91 2 mM 인산나트륨 6.0 없음 적합 무색 투명 적합
실시예 92 20 mM 인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 적합 무색 투명 적합
비교예 14 20 mM 인산나트륨 6.0 없음 적합 백탁 부적합
즉, 적어도 0.1 내지 6 ㎎/㎖의 범위에서, 트롬보모듈린농도에 의한 영향은 없고, pH를 6.0으로 조정하면 열안정성에 있어서의 잔존 역가는 전부 66 % 이상이었다. 또한, 공극부 비율을 10 내지 15 %로 한 경우에, 진탕 안정성에 있어서 백탁을 발생시키는 일이 없어, 종합 평가가「적합」인 수용액 주사제가 제조되었다.
비교예 14에 따르면, 참고예 9의 가용성 트롬보모듈린에서도 진탕 안정성의 문제가 존재하는 것이 확인되고, 실시예 90, 91의 결과에 따르면, 참고예 9의 가용성 트롬보모듈린에 있어서도, 본 발명의 구성에 의해 열안정성 및 진탕 안정성에 우수한 수용액 주사제가 제조되는 것이 확인되었다.
참고예 8의 가용성 트롬보모듈린을 이용한 실시예 92에 있어서, 열안정성 및 진탕 안정성에 우수한 수용액 주사제가 제조되었다.
〈시험예 11〉
실시예 1, 3, 79 내지 82 및 비교예 6, 13의 수용액 주사용 제제에 대하여 하기 측정법 3에 의해 가속 안정성(20 ℃ 보존)에 관한 잔존 역가를 측정하였다. 그 결과를 표 11에 나타냈다.
보존시의 완충액 농도, 조성 보존시의 pH 계면 활성제농도, 종류 측정법 3 잔존 역가(%)
0개월 3개월 6개월
비교예 6 20 mM 인산나트륨 7.3 0.01 %Tween80 100 67.1 52.4
비교예 13 20 mM 인산나트륨 7.3 없음 100 81.8 63.2
실시예 1 0.2 mM 인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 100 92.5 73.7
실시예 3 20 mM 아세트산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 100 97.5 80.1
실시예 79 2 mM 인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 100 92.8 86.4
실시예 80 6 mM 인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 100 94.4 85.6
실시예 81 12 mM 인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 100 93.4 84.9
실시예 82 12 mM 인산나트륨 6.0 0.01 %크레모포르EL 100 94.0 82.5
즉, 20 ℃ 6개월 보존 후, 비교예 6에서는 52.4 %까지, 비교예 13에서는 63.2%까지 역가가 저하하였지만, 실시예 1, 3, 79 내지 82는 유의하게 안정되었다.
〈측정법 3〉 가속 안정성 시험(20 ℃에서 6개월간 보존)
측정하는 수용액 주사용 제제를 20 ℃에서 6개월간 보존하여, 트롬보모듈린 역가의 잔존율을 측정하였다. 트롬보모듈린 역가는 측정법 1과 마찬가지로 측정하였다.
〈시험예 12〉
실시예 1, 3의 수용액 주사용 제제에 대하여, 하기 측정법 4에 의해 장기 안정성(5 ℃ 보존)에 관한 잔존 역가를 측정하였다. 트롬보모듈린 역가는 측정법 1과 마찬가지로 측정하였다. 그 측정 결과를 표 12에 나타냈다.
보존시의 완충액 농도, 조성 보존시의 pH 계면 활성제농도, 종류 측정법 3 잔존 역가(%)
0개월 3개월 6개월 9개월
실시예 1 0.2 mM 인산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 100 97.3 93.1 97.9
실시예 3 20 mM 아세트산나트륨 6.0 0.01 %Tween80 100 105.3 101.5 107.6
실시예 1, 3은 5 ℃, 9개월 보존 후에도 역가의 저하가 나타나지 않았다.
〈측정법 4〉 장기 안정성 시험(5 ℃에서 9개월간 보존)
측정할 수용액 주사용 제제를 5 ℃에서 9 개월 간 보존하여 트롬보모듈린 역가의 잔존율을 측정하였다. 트롬보모듈린 역가는 시험예 1과 마찬가지로 측정하였다.
〈시험예 13〉
9 내지 10 주령의 SD계 웅성 래트(일본 챨스 리버사)의 꼬리 정맥 또는 등 피하에, 하기 피험액 또는 제제를 투여하고, 경시적으로 채혈을 행하였다.
1. 정맥내 주사용 피검액:
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 10 μg/ml, 50 μg/㎖, 250 μg/㎖의 각농도로, 인산 나트륨 완충액 농도를 10 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80(Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 7.4으로 조정하여, 정맥내 주사용 피검액으로 하였다. 투여량은 표 13에 나타낸 바와 같다.
2. 피하 주사용 피검액 A:
참고예 7의 트롬보모듈린의 농도를 10 μg/㎖, 50 μg/㎖, 250 μg/㎖의 각농도로, 인산 나트륨 완충액 농도를 10 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80(Tween 80)을 0.01 %, 약전 벤질알코올을 40 ㎎/㎖, 파라옥시벤조산메틸을 0.3 %가 되도록 첨가한 후, pH를 7.4으로 조정하여 피하 주사용 피검액 A로 하였다. 투여량은 표 13에 나타낸 바와 같다.
3. 피하 주사용 피검액 B:
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 10 μg/㎖, 50 μg/㎖, 250 μg/㎖의 각 농도로, 인산나트륨 완충액 농도를 10 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80(Tween 80)을 0.01%, 약전 염산프로카인을 40 ㎎/㎖, 파라옥시벤조산메틸을 0.3 %가 되도록 첨가한 후, pH를 7.4으로 조정하여, 피하 주사용 피검액 B로 하였다.
4. 피하 주사용 투여 제제 C:
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 250 μg/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지, 바늘없음)에 1 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 1 O %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다. 이 제제로, 플런저 로드(plunger rod) (벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지용, 조성: 폴리프로필렌)과 주사바늘(데루모사제, 26 G× 1/2")을 장착하여 피하 주사용 투여 제제 C로 하였다.
5. 피하 주사용 투여 제제 D:
참고예 7의 트롬보모듈린농도를 250 μg/㎖으로, 인산나트륨 완충액 농도를 2 mM으로 조정하고, 다시 NaCl을 150 mM, 폴리 솔베이트 80 (Tween 80)을 0.01 %가 되도록 첨가한 후, pH를 6.0으로 조정하였다. 이 수용액을, 선단부에 캡(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 장착한 내경 6.3 mm의 유리제 실린지(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖롱타입, 바늘없음)에 0.5 ㎖ 분주하고, 공극부 비율이 15 %가 되도록 진공도를 조정하고, 스토퍼(웨이스트사 제품, 기본 조성: 브로모부틸 고무)을 진공 타전하여 트롬보모듈린을 함유하는 수용액 주사용 기충전 실린지 제제를 제조하였다. 이 제제으로, 프랜져 로드(벡튼·디킨슨사 제품, 1 ㎖ 롱타입 실린지용, 조성: 폴리프로필렌)과 주사바늘(데루모사제, 26 G× 1/2")을 장착하여, 피하 주사용투여제제 D로 하였다.
투여 방법 피검액 농도(㎍/㎖) 투여액량(㎖/㎏) 투여량(㎍/㎏) n수
정맥내 정맥내 주사용 1050250 111 1050250 333
피하 피하 주사용 피검액 A 1050250 111 1050250 333
각 시점의 혈장 중의 가용성 트롬보모듈린 농도를 효소 면역 측정법(ELISA)으로 측정하여 그 값을 도 1에 나타냈다. 본 측정법에서는, 고상화 항체로서 R4B6를, 표지 항체로서 R4D1을 조합한 ELISA에 의한 공지된 농도 측정법을 실시하여 행하였다 (특개평 6-205692호 공보). 혈장 중 농도 추이에서 구한 약품 속도론적 파라미터를 표 14에 나타냈다.
투여 방법 피검액 투여량(㎍/㎏) Tmax(hr) Cmax(ng/㎖) T1/2(hr) AUC(0-∞)(㎍ hr/㎖) MRT(hr)
정맥내 정맥내 주사용 1050250 0 322.71346.26138.3 6.17.87.2 2.0210.7544.79 6.17.97.2
피하 피하 주사용 피검액 A 1050250 32.223.48.3 21.4140.3661.5 17.419.916.7 1.067.0142.67 38.438.836.6
표 14에 나타낸 바와 같이, 피하 주사용 피검액 A에서는, 어느 투여량에서도 MRT(평균 체류 시간)은 피하 투여쪽이 정맥내 투여보다도 크며, 덧붙여 도 1에서 밝혀진 바와 같이, 피하 투여가 정맥내 투여에 비하여 혈중 농도 지속 시간이 현저히 길다는 것이 판명되었다. 또한 피하 투여에 의해 T1/2이 16 시간 이상으로 지속될 수 있다는 것이 확인되었다.
피하 주사용 피검액 B 및 피하 주사용 투여 제제 C, D의 각 투여군에 있어서도, 피하 주사용 피검액 A와 거의 동일한 결과가 얻어졌다. 이것으로부터 피하 투여경로는 종래의 정맥내 투여 경로에 비하여 유효한 치료 수준을 유지하기 위한 혈중 농도의 유지가 이루어진다는 것이 확인되었다. 또한, 피하 투여시의 BA(생물학적이용율) 값은 어느 용량에 있어서도 50 % 이상으로 양호한 흡수가 인정되었다.
피하 투여하는 약제의 pH를 3.0 내지 7.4로 하였지만, 특별한 혈중 농도의 변화는 나타나지 않았다. 또한, 약제의 이온 강도를 변화(NaCl 농도를 0 내지 4.8 %로 변화)시켰으나, 특별한 혈중 농도의 변화는 나타나지 않았다.
SEQUENCE LISTING
〈110〉 ASAHI KASEI KOGYO KABUSHIKI KAISHA
〈120〉 Method for maintaining the qualityof aqueous injection
preparation of thrombomodulin over its storage/transportation
〈130〉 ASAHI-TM
〈150〉 JP 9/281659
〈151〉 1997-10-15
〈150〉 JP 9/308523
〈151〉 1997-11-11
〈160〉 5
〈210〉 1
〈211〉 516
〈212〉 PRT
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 partial amino acid sequences of a human thrombomodulin
〈400〉 1
Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly
1 5 10 15
Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu
20 25 30
His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala
35 40 45
Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser
50 55 60
Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly
65 70 75 80
Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys
85 90 95
Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr
100 105 110
Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn
115 120 125
Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu
130 135 140
Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val
145 150 155 160
Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg
165 170 175
Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr
180 185 190
Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro
195 200 205
Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys
210 215 220
Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro
225 230 235 240
Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys
245 250 255
Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala
260 265 270
Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys
275 280 285
Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln
305 310 315 320
His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys
325 330 335
Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr
340 345 350
Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro
355 360 365
Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr
370 375 380
Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu
385 390 395 400
Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp
405 410 415
Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile
420 425 430
Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly
435 440 445
Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys
450 455 460
Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys
465 470 475 480
Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro
485 490 495
Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu
500 505 510
Val His Ser Gly
515
〈210〉 2
〈211〉 516
〈212〉 PRT
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 partial amino acid sequences of a human thrombomodulin
〈400〉 2
Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly
1 5 10 15
Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu
20 25 30
His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala
35 40 45
Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser
50 55 60
Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly
65 70 75 80
Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys
85 90 95
Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr
100 105 110
Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn
115 120 125
Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu
130 135 140
Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val
145 150 155 160
Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg
165 170 175
Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr
180 185 190
Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro
195 200 205
Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys
210 215 220
Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro
225 230 235 240
Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys
245 250 255
Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala
260 265 270
Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys
275 280 285
Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln
305 310 315 320
His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys
325 330 335
Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr
340 345 350
Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro
355 360 365
Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr
370 375 380
Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu
385 390 395 400
Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp
405 410 415
Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile
420 425 430
Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly
435 440 445
Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys
450 455 460
Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly Thr Asp Cys
465 470 475 480
Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro
485 490 495
Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu
500 505 510
Val His Ser Gly
515
〈210〉 3
〈211〉 1548
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 partial base sequences of a human thrombomodulin gene
〈400〉 3
atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgcaccc 60
gcagagccgc agccgggtgg cagccagtgc gtcgagcacg actgcttcgc gctctacccg 120
ggccccgcga ccttcctcaa tgccagtcag atctgcgacg gactgcgggg ccacctaatg 180
acagtgcgct cctcggtggc tgccgatgtc atttccttgc tactgaacgg cgacggcggc 240
gttggccgcc ggcgcctctg gatcggcctg cagctgccac ccggctgcgg cgaccccaag 300
cgcctcgggc ccctgcgcgg cttccagtgg gttacgggag acaacaacac cagctatagc 360
aggtgggcac ggctcgacct caatggggct cccctctgcg gcccgttgtg cgtcgctgtc 420
tccgctgctg aggccactgt gcccagcgag ccgatctggg aggagcagca gtgcgaagtg 480
aaggccgatg gcttcctctg cgagttccac ttcccagcca cctgcaggcc actggctgtg 540
gagcccggcg ccgcggctgc cgccgtctcg atcacctacg gcaccccgtt cgcggcccgc 600
ggagcggact tccaggcgct gccggtgggc agctccgccg cggtggctcc cctcggctta 660
cagctaatgt gcaccgcgcc gcccggagcg gtccaggggc actgggccag ggaggcgccg 720
ggcgcttggg actgcagcgt ggagaacggc ggctgcgagc acgcgtgcaa tgcgatccct 780
ggggctcccc gctgccagtg cccagccggc gccgccctgc aggcagacgg gcgctcctgc 840
accgcatccg cgacgcagtc ctgcaacgac ctctgcgagc acttctgcgt tcccaacccc 900
gaccagccgg gctcctactc gtgcatgtgc gagaccggct accggctggc ggccgaccaa 960
caccggtgcg aggacgtgga tgactgcata ctggagccca gtccgtgtcc gcagcgctgt 1020
gtcaacacac agggtggctt cgagtgccac tgctacccta actacgacct ggtggacggc 1080
gagtgtgtgg agcccgtgga cccgtgcttc agagccaact gcgagtacca gtgccagccc 1140
ctgaaccaaa ctagctacct ctgcgtctgc gccgagggct tcgcgcccat tccccacgag 1200
ccgcacaggt gccagatgtt ttgcaaccag actgcctgtc cagccgactg cgaccccaac 1260
acccaggcta gctgtgagtg ccctgaaggc tacatcctgg acgacggttt catctgcacg 1320
gacatcgacg agtgcgaaaa cggcggcttc tgctccgggg tgtgccacaa cctccccggt 1380
accttcgagt gcatctgcgg gcccgactcg gcccttgtcc gccacattgg caccgactgt 1440
gactccggca aggtggacgg tggcgacagc ggctctggcg agcccccgcc cagcccgacg 1500
cccggctcca ccttgactcc tccggccgtg gggctcgtgc attcgggc 1548
〈210〉 4
〈211〉 1548
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 patial base sequences of a human thrombomodulin gene
〈400〉 4
atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgcaccc 60
gcagagccgc agccgggtgg cagccagtgc gtcgagcacg actgcttcgc gctctacccg 120
ggccccgcga ccttcctcaa tgccagtcag atctgcgacg gactgcgggg ccacctaatg 180
acagtgcgct cctcggtggc tgccgatgtc atttccttgc tactgaacgg cgacggcggc 240
gttggccgcc ggcgcctctg gatcggcctg cagctgccac ccggctgcgg cgaccccaag 300
cgcctcgggc ccctgcgcgg cttccagtgg gttacgggag acaacaacac cagctatagc 360
aggtgggcac ggctcgacct caatggggct cccctctgcg gcccgttgtg cgtcgctgtc 420
tccgctgctg aggccactgt gcccagcgag ccgatctggg aggagcagca gtgcgaagtg 480
aaggccgatg gcttcctctg cgagttccac ttcccagcca cctgcaggcc actggctgtg 540
gagcccggcg ccgcggctgc cgccgtctcg atcacctacg gcaccccgtt cgcggcccgc 600
ggagcggact tccaggcgct gccggtgggc agctccgccg cggtggctcc cctcggctta 660
cagctaatgt gcaccgcgcc gcccggagcg gtccaggggc actgggccag ggaggcgccg 720
ggcgcttggg actgcagcgt ggagaacggc ggctgcgagc acgcgtgcaa tgcgatccct 780
ggggctcccc gctgccagtg cccagccggc gccgccctgc aggcagacgg gcgctcctgc 840
accgcatccg cgacgcagtc ctgcaacgac ctctgcgagc acttctgcgt tcccaacccc 900
gaccagccgg gctcctactc gtgcatgtgc gagaccggct accggctggc ggccgaccaa 960
caccggtgcg aggacgtgga tgactgcata ctggagccca gtccgtgtcc gcagcgctgt 1020
gtcaacacac agggtggctt cgagtgccac tgctacccta actacgacct ggtggacggc 1080
gagtgtgtgg agcccgtgga cccgtgcttc agagccaact gcgagtacca gtgccagccc 1140
ctgaaccaaa ctagctacct ctgcgtctgc gccgagggct tcgcgcccat tccccacgag 1200
ccgcacaggt gccagatgtt ttgcaaccag actgcctgtc cagccgactg cgaccccaac 1260
acccaggcta gctgtgagtg ccctgaaggc tacatcctgg acgacggttt catctgcacg 1320
gacatcgacg agtgcgaaaa cggcggcttc tgctccgggg tgtgccacaa cctccccggt 1380
accttcgagt gcatctgcgg gcccgactcg gcccttgccc gccacattgg caccgactgt 1440
gactccggca aggtggacgg tggcgacagc ggctctggcg agcccccgcc cagcccgacg 1500
cccggctcca ccttgactcc tccggccgtg gggctcgtgc attcgggc 1548
〈210〉 5
〈211〉 21
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 synthetic DNA for mutation
〈400〉 5
aatgtggcgg gcaagggccg a 21

Claims (21)

  1. 동결 또는 동결 건조되지 않은 액상 트롬보모듈린 수용액 주사제의 저장 및 유통시의 품질 유지 방법으로서, 유효량의 가용성 트롬보모듈린과, pH 5 내지 7.0 사이에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분을 함유하는 트롬보모듈린 수용액의 pH가 5 내지 7.0 이고, (a) 이 트롬보모듈린 수용액이 추가로 계면 활성제를 함유하여 용기에 무균 충전되어 있거나, 또는 (b) 이 트롬보모듈린 수용액이 실질적인 공극부가 존재하지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전 실린지 제제인 것을 특징으로 하여 트롬보모듈린 수용액 주사제를 액상으로 장기간 저장 및 유통시키는 것을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 유효량의 가용성 트롬보모듈린, pH 5 내지 7.0 에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분 및 계면 활성제를 함유하고, pH가 5 내지 7.0 인 트롬보모듈린 수용액이 용기에 무균 충전되어 있는 것을 특징으로 하여 트롬보모듈린 수용액 주사제를 액상으로 장기간 저장 및 유통시키는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 유효량의 가용성 트롬보모듈린, pH 5 내지 7.0 에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분을 함유하고, pH가 5 내지 7.0 인 트롬보모듈린 수용액이 실질적인 공극부가 존재하지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전 실린지 제제인 것을 특징으로 하여 트롬보모듈린 수용액 주사제를 액상으로 장기간 저장 및 유통시키는 것을 포함하는 방법.
  4. 제1 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 가용성 트롬보모듈린, pH 5 내지 7.0 에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분 및 계면 활성제를 함유하고, pH가 5 내지 7.0 인 트롬보모듈린 수용액이 실질적인 공극부가 존재하지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전 실린지 제제인 것을 특징으로 하여 트롬보모듈린 수용액 주사제를 액상으로 장기간 저장 및 유통시키는 것을 포함하는 방법.
  5. 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 트롬보모듈린이, 6.6만±1만의 분자량(비환원 상태에서의 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동법에 의해 측정)을 갖고, 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용을 가지며, 주사용 증류수에 6 ㎎/㎖ 이상의 농도로서 용해 가능한 가용성 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 트롬보모듈린이
    (i) 서열 번호 1의 19 내지 516의 아미노산 서열로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린 또는 (ii) 상기 아미노산 서열의 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 방법.
  7. 제1 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 트롬보모듈린이 서열 번호 1의 19 내지 516의 아미노산 서열로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린, 서열 번호 2의 19 내지 516의 아미노산 서열로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린, 서열 번호 1에 기재한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 숙주 세포에 형질감염시켜 얻어지는 가용성 트롬보모듈린 또는 서열 번호 2에 기재한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 숙주 세포에 형질감염시켜 얻어지는 가용성 트롬보모듈린인 방법.
  8. 제1 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 완충액 성분이 인산염 완충액 성분 또는 아세트산염 완충액 성분중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 완충액의 pH가 5.5 내지 6.5인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 및 3항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적인 공극부가 존재하지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전 실린지 제제가 실린지 용기내의 트롬보모듈린 수용액의 존재량이 공극부 비율로서 15 % 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 및 3항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 기충전 실린지 제제를 위한 실린지 용기의 내경이 8.6 ㎜ 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 유효량의 가용성 트롬보모듈린, pH 5 내지 7.0 에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분 및 계면 활성제를 함유하고, pH가 5 내지 7.0 인 트롬보모듈린 수용액이 용기에 무균 충전되어 있는 것을 특징으로 하는, 장기 안정성 및 진탕 안정성이 우수하며, 액상으로 장기간 저장 및 유통시키기 위한 동결 또는 동결 건조되지 않은 트롬보모듈린 수용액 주사제.
  13. 유효량의 가용성 트롬보모듈린 및 pH 5 내지 7.0 에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분을 함유하고, pH가 5 내지 7.0 인 트롬보모듈린 수용액이 실질적인 공극부가 존재하지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전 실린지 제제인 것을 특징으로 하는, 장기 안정성 및 진탕 안정성이 우수하며, 액상으로 장기간 저장 및 유통시키기 위한 동결 또는 동결 건조되지 않은 트롬보모듈린 수용액 주사제.
  14. 유효량의 가용성 트롬보모듈린 및 pH 5 내지 7.0 에서 완충 능력을 갖는 완충액 성분 및 계면 활성제를 함유하고, pH가 5 내지 7.0 인 트롬보모듈린 수용액이 실질적인 공극부가 존재하지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전 실린지 제제인 것을 특징으로 하는, 장기 안정성 및 진탕 안정성이 우수하며, 액상으로 장기간 저장 및 유통시키기 위한 동결 또는 동결 건조되지 않은 트롬보모듈린 수용액 주사제.
  15. 제13항 또는 14항에 있어서, 상기 기충전 실린지 제제가 피하 주사용 또는 근육 주사용 제제인 트롬보모듈린 주사제.
  16. 제12 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 트롬보모듈린이 서열 번호 1의 19 내지 516의 아미노산 서열로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린, 서열 번호 2의 19 내지 516의 아미노산 서열로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린, 서열 번호 1에 기재한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 숙주 세포에 형질감염시켜 얻어지는 가용성 트롬보모듈린 또는 서열 번호 2에 기재한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 숙주 세포에 형질감염시켜 얻어지는 가용성 트롬보모듈린인 트롬보모듈린 수용액 주사제.
  17. 제12 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서, 완충액의 pH가 5.5 내지 6.5인 것을 특징으로 하는 트롬보모듈린 수용액 주사제.
  18. 제13 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적인 공극부가 존재하지 않도록 실린지 용기에 무균 충전되어 있는 기충전 실린지 제제가 실린지 용기내의 트롬보모듈린 수용액의 존재량이 공극부 비율로서 15 % 이하인 것을 특징으로 하는 트롬보모듈린 수용액 주사제.
  19. 제13 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, 기충전 실린지 제제를 위한 실린지 용기의 내경이 8.6 ㎜ 이하인 것을 특징으로 하는 트롬보모듈린 수용액 주사제.
  20. 가용성 트롬보모듈린을 유효 성분으로 하는 수용액 주사제로서, 1회/2 내지 5일의 간격으로 피하 또는 근육내 주사하기 위한 지속성 제제를 사용하는 것을 특징으로 하는 가용성 트롬보모듈린의 혈중 농도를 지속시키는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 가용성 트롬보모듈린이 서열 번호 1의 19 내지 516의 아미노산 서열로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린, 서열 번호 2의 19 내지 516의 아미노산 서열로 이루어지는 가용성 트롬보모듈린, 서열 번호 1에 기재한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 숙주 세포에 형질감염시켜 얻어지는 가용성 트롬보모듈린 또는 서열 번호 2에 기재한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 숙주 세포에 형질감염시켜 얻어지는 가용성 트롬보모듈린인 방법.
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