ES2281137T3 - Metodo para mantener la calidad de un preparado de inyeccion acuoso de trombomodulina durante su almacenamiento y transporte. - Google Patents

Abstract

Utilización de una solución acuosa que tiene un valor de pH en una gama de 5 a 7, 0 y que contiene una trombomodulina soluble en una cantidad efectiva y un componente o componentes tampón que muestran acción tampón en una gama de pH entre 5 y 7, 0 en la que la solución acuosa de trombomodulina tiene una de las siguientes características a) o b) a saber: a) que contiene además un tensoactivo y ha sido llenada asépticamente en un contenedor, o bien b) que consiste en un preparado en jeringa pre-llenada de manera aséptica en un contenedor en forma de jeringa, excluyendo cualquier espacio de gas sustancial en su interior, para mantener la calidad de un preparado acuoso de trombomodulina para inyección en forma de líquido no congelado o no liofilizado a lo largo de su periodo de almacenamiento y transporte.

Description

Método para mantener la calidad de un preparado de inyección acuoso de trombomodulina durante su almacenamiento y transporte.

Sector técnico al que pertenece la invención

La presente invención se refiere a un método para mantener la calidad de un preparado para inyección acuosa de trombomodulina en un líquido no congelado o no liofilizado, durante su almacenamiento y transporte, y se refiere también a un preparado de inyección acuoso de trombomodulina que es estable durante su almacenamiento y transporte.

Anterioridades

La trombomodulina (a continuación, se abreviará en algunos casos TM) es una sustancia que tiene la función de acoplarse específicamente con la trombina y acelerar de modo notable la activación de la proteína C por la trombina. La proteína C consiste en una proteína dependiente de la vitamina K que juega un importante papel en el sistema de fibrinólisis de coagulación y que es activada por la acción de la trombina en la proteína C activada. Se sabe que la proteína C activada inactivará los factores de coagulación activados V y VIII en el sistema de coagulación de la sangre de un cuerpo vivo y que participa en la producción de activador plasminógeno que muestra función trombolítica (ver Koji Suzuki, "Igaku-no Ayumi (Progress in Medical Science)", vol. 125, 901 (1983).

Por lo tanto, se ha reconocido que la trombomodulina acelera la activación de proteína C por trombina para producir una gran cantidad de proteína C activada que muestra acción inhibitoria a la coagulación de la sangre y de la función trombolítica que es útil como anticoagulante y como agente trombolítico. Por lo tanto, se ha esperado utilizar la trombomodulina para objetivos de terapia y de profilaxis de síndromes coronarios agudos (ACS), por ejemplo, infarto de miocardio y angina inestable, para reconstrucción de la circulación coronaria; para terapias y profilaxis de trombosis, tales como trombosis cerebral aguda y crónica y trombosis periféricas agudas y crónicas arteriales y venosas; obstrucción de vasos sanguíneos periféricos, tales como la enfermedad de Buerger y enfermedad de Raynaud; arteriosclerosis obstructiva; inflamación de vasos sanguíneos, tal como lumpus eritematodes (SLE) sistémico, enfermedad de Becet y enfermedad de Kawasaki; y para terapias y profilaxis de desórdenes funcionales posteriores a la cirugía cardíaca, complicaciones que resultan en transplante de órganos, enfermedad por coagulación intravascular (DIC), angina de pecho, ataque isquémico cerebral transitorio, toxicosis gestacional, diabetes, enfermedades oclusivas de las venas del hígado (VOD), tal como enfermedades veno-oclusivas que siguen a la hepatitis fulminante o después de transplante de tuétano de hueso y trombosis venosa profunda (DVT).

Anteriormente, se confirmó y se aisló la trombomodulina como glicoproteína que aparecía en las células endotreliales de vasos sanguíneos de animales, incluyendo humanos. El presente grupo de inventores de la presente invención ha conseguido clonarla por primera vez. Por lo tanto, los inventores han llevado a cabo el clonado de genes de un precursor de la trombomodulina humana que tiene un péptido de señal de la biblioteca de DNAC de pulmón humano utilizando una técnica de ingeniería genética, de manera que la totalidad de la secuencia de gen de la trombomodulina fue analizada y su secuencia de aminoácidos que tienen 575 residuos incluyendo un péptido señal de 18 residuos de aminoácidos fue objeto de determinación (ver patente japonesa Kokai Sho 64-6219 A). Se sabe que una trombomodulina madura con el péptido señal cortado se compone de cinco dominios, es decir, el dominio terminal NH_{2} (residuos de aminoácidos 1 a 226, en el orden del terminal NH_{2}), dominio que tiene seis estructuras de tipo EGF (residuos de 227 a 462), dominio de lugar rico de O-glicosilado (residuos 463 a 498), dominio transmembrana (residuos 499 a 521) y el dominio citoplásmico, enumerado respectivamente en orden secuencial desde el terminal NH_{2}, de manera que el segmento que muestra la actividad correspondiente al de la trombomodulina de longitud completa, es decir, la unidad menos activa de la misma, está constituido por el segmento que comprende las estructuras cuarta, quinta y sexta similares a EGF en el dominio que tiene seis estructuras de tipo EGF enumeradas en el orden desde el terminal NH_{2} (ver M.Zushi y otros, J. Biol. Chem., 246, 10351-10353 (1989)).

Se ha confirmado que, como mínimo, una trombomodulina, preparada a efectos de eliminar el dominio transmembrana, tiene la naturaleza de ser claramente disuelta en agua, incluso sin utilización de tensoactivo (a continuación, se indicará en algunos casos como "trombomodulina soluble") y, por ejemplo, una trombomodulina compuesta de tres dominios solamente, es decir, el dominio de terminal NH_{2}, el dominio que tiene seis estructuras similares a EGF y el dominio con un lugar rico en O-glicosilado, es decir, compuesto de la secuencia de aminoácidos desde los residuos de aminoácidos 19 a 516 del listado de secuencia SEQ ID NO:1, que se puede obtener aplicando tecnología de recombinación de genes y que la trombomodulina recombinante obtenida de esta manera tiene una actividad que es igual que la trombomodulina natural (Patente Japonesa Kokai Sho 64-6219 A).

A este respecto, se ha reconocido, en muchos casos, que los genes pueden estar afectados de mutaciones naturales y artificiales debido a trabajo de inspección, por ejemplo, su aislamiento, etc., sin excepción en humanos en los que también se ha descubierto una mutación polimórfica, en la que se confirmaron dos mutantes del precursor de la trombomodulina humana, precursora constituidos por la secuencia de aminoácido compuesta por los 575 residuos de aminoácidos antes mencionados, de manera que el residuo de aminoácido en el lugar 473 consiste en Val, por una parte, y en el que el residuo de aminoácido consiste en Ala, por otra. Esto corresponde, en la secuencia base que codifica estos aminoácidos, a mutaciones de T y C en el lugar 1418, respectivamente (Wen y otros, Biochemistry, 26, 4350-4357 (1987)). No obstante, no muestran diferencia en la actividad y en las características físicas entre sí, y se pueden considerar como sustancialmente idénticos. Por lo tanto, la trombomodulina humana antes mencionada, constituida por la secuencia de aminoácido de la secuencia indicada en SEQ ID NO:1, se considera como uno de los polimorfos del péptido de la trombomodulina compuesto de la secuencia de aminoácidos del listado SEQ ID NO:2 y ambos deben ser evaluados como sustancialmente idénticos entre sí.

Por otra parte, se han distribuido corrientemente preparados de trombomodulina de manera continuada para utilización práctica en un producto farmacéutico medicinal liofilizado. Mientras tanto, se ha descubierto que, en el proceso de liofilizado de una solución acuosa que contiene trombomodulina, una parte de la trombomodulina se convierte, si bien en una cantidad pequeña, en una materia polímera debido a una desnaturalización, formando un polímero en el que se mantienen en asociación varias moléculas de trombomodulina. Para resolver este problema, los inventores han realizado eficaces investigaciones, de manera que han llegado al descubrimiento de que la desnaturalización de la trombomodulina después de su liofilización puede ser impedida, habiéndose solicitado patente por ello con anterioridad (Patente Japonesa Kokai Hei 6-321805 A).

Problema a resolver por la invención

A pesar de las circunstancias, se han generado peticiones para conseguir un nuevo preparado en forma no congelada o no liofilizada que se puede utilizar de manera simple y fácil, y que se puede producir con menores costes de producción.

Medios para resolver el problema

Los inventores de la presente invención han investigado la posibilidad de realizar un preparado de inyección acuosa de trombomodulina, que puede conseguir evitar la incorporación de un proceso de liofilizado y eliminar la necesidad de un proceso de disolución en la utilización práctica, con un intento de desarrollar una nueva preparación distinta de la preparación de liofilización. Si bien sería una primera exigencia para un preparado para inyección acuosa que su potencia residual, después de almacenamiento a lo largo de un periodo de tiempo a 5ºC hasta temperatura ambiente, no disminuyera en medida considerable (es decir, estabilidad de largo plazo), las investigaciones realizadas han demostrado que no es fácil conseguir esta estabilidad a largo plazo. Para sorpresa de los inventores, se descubrió adicionalmente que un preparado para inyección acuosa puede adquirir turbidez, en algunos casos, por agitación del mismo. Es bastante esperable que un preparado líquido sea sometido a movimientos de agitación, aunque a diferentes niveles de intensidad, durante su distribución, por ejemplo, durante el transporte. Este problema no aparece en preparados convencionales liofilizados en polvo. Por lo tanto, se observó un nuevo e inesperado problema por los inventores por cuanto estabilidad contra sacudidas de un preparado para inyección acuosa. La presencia de materias insolubles en un preparado para inyección puede provocar ocasionalmente un accidente mortal en pacientes, en particular, si tienen desórdenes en órganos circulatorios y, por lo tanto, los problemas de estabilidad contra sacudidas para obviar la aparición de turbidez en las sacudidas de un preparado para inyección acuosa que se ha mencionado son una seria dificultad que debe ser superada.

Como resumen, ha sido una dificultad hasta el momento la preparación de una inyección acuosa que pueda permitir su almacenamiento/transporte en forma líquida a lo largo de un prolongado periodo de tiempo, puesto que cualquier preparado para inyección satisfactoria con respecto a la estabilidad a largo plazo y estabilidad contra las sacudidas no puede ser sometido por la simple disolución de trombomodulina en agua, a pesar de las circunstancias de que un preparado para inyección acuoso tiene características ventajosas en el sentido de que se puede administrar de forma conveniente a un paciente sin necesitar ningún procedimiento de disolución en agua para inyección en su utilización práctica, y que puede ser fabricado de manera económica y fácil debido a la eliminación del proceso de liofilización, en comparación con los preparados convencionales liofilizados.

Los inventores han llevado a cabo profundas investigaciones para obviar los problemas anteriormente descritos y han descubierto que todos estos problemas podían ser solucionados manteniendo un cierto estado, lo cual ha conducido a la presente invención.

Por lo tanto, la presente invención da a conocer un método para mantener la calidad de un preparado para inyección de tipo acuoso de trombomodulina en un líquido no congelado o no liofilizado durante su almacenamiento y transporte, caracterizándose porque el preparado para inyección acuosa de trombomodulina es preparado como solución acuosa con un valor de pH comprendido aproximadamente entre 5 y 7,0 y conteniendo (a) trombomodulina soluble en una cantidad efectiva y un componente tampón que revela una acción tampón en una gama de pH entre 5 y 7,0, de manera que la solución acuosa de trombomodulina tiene o bien la característica a) o bien b) siguientes:

a)

contiene adicionalmente un tensoactivo y se llena de forma aséptica en su contenedor, o bien

b)

consiste en un preparado de jeringa llenada previamente de forma aséptica en un contenedor en forma de jeringa, que excluye cualquier espacio sustancial de gas en su interior.

Por lo tanto, la primera forma de realización del método para mantener la calidad de un preparado para inyección acuosa, según la presente invención, consiste en que el preparado para inyección acuosa de trombomodulina, que se caracteriza porque se prepara como solución acuosa que tiene un valor de pH comprendido entre 5 y 7,0 y que contiene trombomodulina soluble en una cantidad efectiva, un componente tampón que muestra una acción tampón en una gama de pH entre 5 y 7,0 y un tensoactivo, y que es llenada en un contenedor de forma aséptica, es almacenada y transportada de forma líquida durante un largo periodo de tiempo.

La segunda forma de realización del método para mantener la calidad de un preparado para inyección acuosa, según la presente invención, consiste en que el preparado para inyección acuosa de trombomodulina, que se caracteriza porque es preparado como solución acuosa con un valor de pH comprendido entre 5 y 7,0 y que contiene una trombomodulina soluble en una cantidad efectiva y un componente tampón que proporciona una acción tampón en una gama de pH entre 5 y 0,7 y consiste en un preparado en forma de jeringa pre-llenada de manera aséptica en un contenedor de jeringa, excluyendo cualquier espacio sustancial de gas en su interior, siendo almacenado/transportado en forma líquida durante un largo periodo de tiempo.

La tercera forma de realización favorable del método para mantener la calidad de un preparado para inyección acuosa según la presente invención consiste en que el preparado para inyección acuosa de trombomodulina, que se caracteriza porque es preparado en forma de solución acuosa y tiene un valor de pH comprendido entre 5 y 7,0 y que contiene una trombomodulina soluble en una cantidad efectiva, un componente tampón que muestra una acción de tampón en una gama de pH entre 5 y 7,0 y un tensoactivo, y que consiste en un preparado de jeringa pre-llenada que se llena asépticamente en un contenedor de jeringa, excluyendo cualquier espacio sustancial para gas en su interior, es almacenado/transportado en forma líquida a lo largo de un prolongado periodo de tiempo.

La presente invención da a conocer también un método para conseguir estabilidad a largo plazo y estabilidad contra sacudidas de un preparado para inyección acuosa de trombomodulina en forma no congelada o no liofilizada, caracterizándose porque el preparado para inyección acuosa de trombomodulina es preparado en una solución acuosa que tiene un valor de pH en una gama comprendida entre 5 y 7,0 y que contiene una trombomodulina soluble en una cantidad efectiva y un componente tampón que muestra una acción de tampón en una gama de pH entre 5 y 7,0, de manera que la solución acuosa de trombomodulina tiene cualquiera de las siguientes características a) o b), es decir:

a)

contiene además un tensoactivo y es llenada asépticamente en un contenedor o bien

b)

consiste en un preparado en jeringa pre-llenada por llenado aséptico en un recipiente de jeringa, excluyendo cualquier espacio sustancial para un gas en su interior.

El preparado para inyección acuosa de trombomodulina a utilizar en el método de la presente invención, en forma no congelada o no liofilizada, preparado como solución acuosa que tiene un valor de pH en una gama de 5 a 7,0 y que contiene trombomodulina soluble en una cantidad efectiva y un componente tampón que proporciona una acción tampón en un pH comprendido entre 5 y 7,0, es superior en estabilidad a largo plazo y en estabilidad contra las sacudidas y es adecuado para su almacenamiento/transporte a lo largo de un prolongando periodo de tiempo, y se caracteriza porque la solución acuosa de trombomodulina tiene un valor de pH en una gama comprendida entre 5 y 7,0 y tiene cualquiera de las siguientes características a) o b), es decir,

a)

contiene además un tensoactivo y es llenada asépticamente en un contenedor o bien

b)

consiste en un preparado en jeringa pre-llenada por llenado aséptico en un recipiente de jeringa, excluyendo cualquier espacio sustancial para un gas en su interior.

Por lo tanto, el primer aspecto del preparado para inyección acuosa de trombomodulina, según la presente invención, consiste en un preparado para inyección acuosa de trombomodulina en forma no congelada o no liofilizada, superior en cuanto a estabilidad durante largo tiempo de almacenamiento y estabilidad contra sacudida y adecuado para almacenamiento o transporte durante un largo periodo de tiempo, caracterizándose porque el preparado de inyección acuosa de trombobolina tiene un valor de pH en una gama comprendida entre 5 y 7,0, contiene trombomodulina soluble en una cantidad efectiva, un componente tampón que muestra una acción de tampón en una gama de pH comprendida entre 5 y 7,0 y un tensoactivo, y que ha sido llenado en un contenedor de forma aséptica.

El segundo aspecto del preparado para inyección de tipo acuoso de trombomolubina según la presente invención consiste en un preparado para inyección acuosa de trombomogublina en forma líquida no congelada o no liofilizada, superior en estabilidad a largo plazo en cuanto a almacenamiento y estabilidad contra sacudidas, siendo adecuado para almacenamiento/transporte durante un largo periodo de tiempo, caracterizándose porque el preparado de inyección acuosa de trombomodulina es un preparado de jeringa pre-llenada que tiene un valor de pH en una gama de 5 a 7,0, contiene una trombomodulina soluble en una cantidad efectiva y un componente tampón que muestra una acción tampón en una gama de pH comprendida entre 5 y 7,0, y que es llenado en un contenedor de jeringa de manera aséptica a efectos de eliminar cualquier espacio sustancial de gas en su interior.

El tercer aspecto del preparado de inyección acuosa de trombomodulina según la presente invención, consiste en un preparado de inyección acuosa de trombomodulina en forma líquida no congelada o no liofilizada, superior en estabilidad en almacenamiento a largo plazo y estabilidad contra sacudidas y adecuado para su almacenamiento/transporte a lo largo de un prolongado periodo de tiempo, caracterizándose porque el preparado para inyección acuosa de trombomoludina es un preparado de jeringa pre-llenada que tiene un valor de pH en una gama de 5 a 7,0, contiene una trombomodulina soluble en una cantidad efectiva o un tampón que muestra una acción de tampón en una gama de pH comprendida entre 5 y 7,0 y un tensoactivo, y que es llenado en un contenedor de jeringa de forma aséptica, de forma que excluye cualquier espacio sustancial para gas en su interior.

El término "trombomodulina", que se utiliza en la descripción de la presente solicitud de patente, se refiere, sin restricción específica, a toda sustancia que tenga función de ser unida a la trombina para producir la aceleración de la activación de la proteína C por la trombina. En el contexto de esta descripción, el término "trombomodulina soluble" se refiere a una sustancia que muestra actividad como la "trombomodulina" antes mencionada y que es soluble en agua fácilmente, incluso en ausencia de tensoactivo, y que puede mostrar favorablemente una solubilidad, por ejemplo, de 1 mg/ml como mínimo, preferentemente 3 mg/ml como mínimo, y de manera especialmente preferente 6 mg/ml como mínimo, en el agua para la inyección. Como ejemplos favorables de la trombomodulina soluble, se pueden citar péptidos que tienen peso molecular, determinado por electroforesis de gel de SDS-poliacriamida en estado no reducido, de 66.000 \pm 10.000, mostrando una función para acelerar la activación de proteína C por trombina y soluble en agua para inyección como mínimo con una concentración de 6 mg/ml. Como otras trombomodulinas solubles favorables, se pueden citar los péptidos constituidos por secuencias de aminoácidos que incluyen la secuencia de aminoácidos compuesta de residuos de aminoácidos, desde el lugar 19 al lugar 29 de la secuencia SEQ ID NO:1, mostrando una función para acelerar la activación de la proteína C por trombina y soluble en agua. Otros ejemplos de trombomodulina solubles favorables incluyen las que consisten en trombomodulinas que están constituidas por una secuencia de aminoácidos compuesta de los residuos de aminoácidos desde el lugar 19 al lugar 516 en el estado de secuencia SEQ ID NO:1 y que muestran una función de aceleración de la activación de la proteína C por trombina.

En cuanto a la trombomodulina soluble, se pueden indicar adicionalmente péptidos constituidos por secuencias de aminoácidos que incluyen como mínimo las estructuras 4, 5 y 6 enumeradas en el orden de secuencias desde el terminal NH_{2}, que se consideran como constitutivas de la unidad activa más reducida de trombomodulina, en el dominio que tiene seis estructuras tipo EGF (por ejemplo, las de los números 367 a 480 en el listado de secuencias SEQ ID NO: 1 y el listado de secuencias SEQ ID NO: 2 para trombomodulina humana). Son trombomodulinas solubles especialmente preferentes entre aquellas los péptidos que pueden ser producidos por células transformadas obtenidas por transfección del segmento de DNA que codifica para la secuencia de aminoácidos del listado de secuencia SEQ ID NO: 1 o del listado de secuencia SEQ ID NO: 2 a una célula hospedante utilizando un vector. Como ejemplo preferente de los péptidos que se pueden obtener a partir de las células transformadas, a saber, trombomodulinas solubles, se pueden indicar los péptidos constituidos por las secuencias de aminoácidos compuestas de los lugares 19 a 516 de los listados se secuencias SEQ ID NO: 1 y del listado de secuencia SEQ ID NO: 2. Otros pueden incluir, de acuerdo con cada célula hospedante específica, aquellos en los que el péptido señal permanece como tal y están constituidos por las secuencias de aminoácido desde el lugar nº 17 al nº 516 del listado de secuencia SEQ ID NO: 1 y del listado de secuencia SEQ ID NO: 2, y mezclas de ellos. Desde luego, estos péptidos tienen solubilidades muy elevadas en el agua, lo cual es suficiente para satisfacer la solubilidad requerida que se ha explicado anteriormente. Es suficiente que estos péptidos que tengan solamente la secuencia de aminoácidos antes mencionada y no se plantea restricción para la misma, de manera que no es importante si son cadenas glicosiladas o no. Es posible incluso utilizar péptidos solubles que se pueden obtener a partir de orina humana y similares. Si bien el tipo, el lugar de adición y el grado de adición de la cadena glicosilada en el péptido pueden ser distintos de acuerdo con cada célula huésped específica, no queda restringida la utilización de dicho péptido. Los péptidos compuestos de los residuos de aminoácidos desde el lugar nº 367 al lugar nº 480 del listado de secuencia SEQ ID NO: 1 y del listado de secuencia SEQ ID NO: 2 tienen una elevada estabilidad contra las sacudidas y, en cualquier caso, pueden resultar en un preparado acuoso favorable, si bien se tiene que comprender que es necesario incrementar la estabilidad contra las sacudidas recurriendo a la técnica de acuerdo con la presente invención, para las trombomodulinas solubles que tengan el peso molecular antes mencionado, es decir, 66.000 \pm 10.000 en estado no reducido, por ejemplo, la trombomodulina soluble constituida por la secuencia de residuos de aminoácidos desde el lugar 19 al lugar 516 del listado de secuencias SEQ ID NO: 1, la trombomodulina soluble constituida por la secuencia de aminoácidos de los residuos desde el lugar nº 19 al lugar nº 516 del listado de secuencia SEQ ID NO: 2, la trombomodulina soluble obtenida por transfección de un segmento de DNA que codifica para la secuencia de aminoácidos descrita en el listado de secuencias SEQ ID NO: 1 a una célula hospedante y la trombomodulina soluble obtenida por transfección de un segmento de DNA que codifica para la secuencia de aminoácidos descrita en el listado de secuencia SEQ ID NO: 2 a una célula hospedante.

Para la célula hospedante, se pueden enumerar células, por ejemplo, de ovario de hámster chino (CHO), COS-1, COS-7, VERO (ATCC CCL-81), BHK, MDCK de origen canino y AV-12-664 de hámster, y también células de origen humano tales como HeLa, WI38 y 293 de origen humano. En cuanto a la célula CHO, la célula DHFRCHO es más preferente.

Durante la manipulación de los genes, se utilizan frecuentemente varios microorganismos, tales como Escherichia coli y similares, de manera que es favorable escoger un sistema de vector hospedante adaptado para cada objetivo y, por lo tanto, un sistema de vector adecuado debería ser seleccionado también para cada una de las células hospedantes antes mencionadas.

El gen de cada trombomodulina a incorporar en la técnica de recombinación genética ha sido clonado y se han dado conocer ejemplos de producción utilizando la técnica de recombinación genética para trombomodulina, además de la técnica de purificación para obtener un producto purificado (ver Patente Japonesa Kokai Sho 64-6219 A, Hei 2-255699 A, Hei 5-213998 A, Hei 5-310787 A y Hei 7-155176 A, así como J. Biol Chem., 264, 10351-10353 (1989)). Por lo tanto, la trombomodulina a utilizar de acuerdo con la presente invención se puede producir utilizando las técnicas descritas en la literatura antes mencionada o por medio de una técnica que corresponda a las mismas. Por ejemplo, se da a conocer en la Patente Japonesa Kokai Sho 64-6219 A la cepa DH5 de Escherichia coli K-12 (con nº de depósito ATCC 67283) que tiene el plásmido psV2TMJ2 que contiene el DNA que codifica para la longitud completa de una trombomodulina, mientras que el solicitante de la presente invención depositó nuevamente la misma cepa (Escherichia coli DH5/psV2TMJ2) en el Institute of Life Engineering of Agency of Industrial science and Technology del Ministerio de Comercio Internacional e Industria en 1-3, Higashi 1 Chome, Ciudad de Tsukuba, Prefectura Ibaragi, Japón, en 19 de junio de 1996. El nº de recibo fue FERM BP-5570. Utilizando como material inicial este DNA que codifica para la longitud completa de trombomodulina, la trombomodulina soluble a utilizar de acuerdo con la presente invención puede ser obtenida por una técnica conocida de manipulación de genes.

Si bien la trombomodulina soluble a utilizar de acuerdo con la presente invención puede ser producida por una técnica conocida o una técnica que corresponda a la misma, es posible por tanto hacer referencia a literatura, por ejemplo, Yamamoto y otros (Patente Japonesa Kokai Sho 64-6219 A, ver ejemplos) y Patente Japonesa Kokai Hei 5-213998 A indicada anteriormente. Por lo tanto, es posible obtener el DNA que codifica para la secuencia de aminoácido de la secuencia según listado SEQ ID NO: 1, procesando el gen de una trombomodulina humana por una técnica de manipulación de genes y, si es necesario, modificarla. Esta modificación puede incluir una mutación específica del lugar del codon que codifica para el aminoácido en el lugar 473 del listado de secuencia SEQ ID NO: 1 (especialmente la base del lugar 1418) para obtener el DNA que codifica para la secuencia de aminoácidos del listado de secuencia SEQ ID NO: 2, de acuerdo con el método descrito en Method in Enzymology, 100 468 (1983), Academic Press. Por ejemplo, utilizando un fragmento de DNA que contiene las secuencia base del listado de secuencia SEQ ID NO: 3 y un DNA sintético para mutación conteniendo la secuencia base mostrada en el listado de secuencia SEQ ID NO: 5, se lleva a cabo la mutación específica de lugar antes mencionada para obtener el DNA que codifica para la secuencia de aminoácidos del listado de secuencia SEQ ID NO: 2. El DNA obtenido de este modo puede ser integrado, por ejemplo, en células de ovario de hámster chino para obtener células transformadas correspondientes, entre las que células escogidas de modo pertinente son cultivadas y, a partir de la mezcla de cultivo de las mismas, se obtiene la trombomodulina soluble purificada por una técnica conocida. Es favorable, tal como se ha indicado anteriormente, que el DNA que codifica la secuencia de aminoácidos del listado de secuencia SEQ ID NO: 1 es transfectado a la célula hospedante. La técnica para producir la trombomodulina soluble a utilizar, de acuerdo con la presente invención, no se debe restringir solamente a los procesos antes descritos sino que son posibles muchas alternativas, incluyendo, por ejemplo, el recurso a una técnica en la que la trombomodulina o trombomodulina soluble es extraída de un tejido, a partir de la mezcla de cultivo de tejidos, a partir de la orina humana u otros, con purificación subsiguiente y, si es necesario, con tratamiento posterior mediante una encima proteolítica.

El aislamiento y purificación de la trombomodulina soluble procedente del sobrenadante o de la mezcla de cultivo de la técnica anterior se puede llevar a cabo según una técnica conocida (ver, por ejemplo, "Fundamental Experimental Methods with Proteins, Enzymes", editado por Buichi Horio). También es preferible la utilización de cromatografía de intercambio de iones basada en la interacción entre la trombomodulina y un portador de fase estacionaria de cromatografía sobre el que se fija un grupo funcional con carga iónica inversa a la de la trombomodulina. Asimismo, se puede indicar favorablemente como ejemplo cromatografía de afinidad basada en la afinidad específica a la trombomodulina. Como ejemplo favorable de adsorbente a utilizar se pueden indicar anticuerpos de trombomodulina y de trombina, que pueden constituir un ligando de la trombomodulina. Para estos anticuerpos, los de trombomodulina capaces de reconocer una función adecuada o un epítopo adecuado pueden ser utilizados, incluyéndose entre los ejemplos los que se dan a conocer, por ejemplo, en una publicación de Patente Japonesa Hei 5-42920 B y Patente Japonesa Kokai Sho 64-45398 A y Hei 6-205692 A. Además, una cromatografía por filtrado de gel y una técnica de ultrafiltrado realizada con respecto al tamaño molecular de la trombomodulina. Además, se puede utilizar una cromatografía hidrofóbica basada en la interacción hidrofóbica entre el portador de la fase estacionaria sobre la que está unido un grupo hidrofóbico y el lugar hidrofóbico de la trombomodulina. Las técnicas anteriormente mencionadas pueden ser utilizadas con una combinación adecuada. El grado de purificación de la trombomodulina soluble se puede seleccionar adecuadamente de acuerdo con cada aplicación específica, si bien es favorable purificarla hasta un grado tal que se obtenga una banda única, por ejemplo, por electroforesis, preferentemente, SDS-PAGE, o que se obtenga un pico único, por ejemplo, por HPLC de permeación de gel o HPLC de fase inversa.

Como ejemplo concreto de los procedimientos de purificación, se puede utilizar una técnica en la que la purificación se lleva a cabo teniendo en cuenta la actividad de trombomodulina como parámetro, de manera que, por ejemplo, el sobrenadante de la mezcla de cultivo es tratado por Q-Sefarosa-FF de una columna de intercambio iónico para recoger fracciones que muestran una actividad de trombomodulina, que son sometidas a continuación a la purificación adecuada por medio de diisopropilfosforil trombin agarosa (DIP-TB), seguido de recogida de fracciones que muestran mayor actividad de trombomodulina, que sean sometidas a continuación a cromatografía de permeación de gel para llevar a cabo la recogida de fracciones activas de trombomodulina, a efectos de obtener un producto de trombomodulina soluble puro (ver Gomi y otros, Blood, 75, 1396-1399 (1990)). Como parámetro para la actividad de trombomodulina se puede utilizar, por ejemplo, la actividad de trombomodulina para acelerar la activación de la proteína C. Otra técnica de purificación se puede indicar por el método siguiente a título de ejemplo:

La trombomodulina es sometida a cromatografía de intercambio iónico utilizando una resina de intercambio iónico seleccionada adecuadamente, que muestra un mejor rendimiento de adsorción para la trombomodulina. Un método especialmente preferente utiliza una Q-Sefarosa-FF equilibrada con solución de tampón 0,02 M Tris-HCl (pH=7,4) conteniendo 0,18 M NaCl. La trombomodulina retenida puede ser eluida después de haber sido lavada adecuadamente utilizando, por ejemplo, solución tampón 0,02 M Tris-HCl (pH=7,4) conteniendo 0,3 M NaCl, para obtener un producto en crudo de trombomodulina.

A continuación, este producto puede ser sometido a una etapa de purificación, por ejemplo, por cromatografía de afinidad utilizando una resina sobre la que se une una sustancia que tiene una afinidad específica para la trombomodulina. Como ejemplos preferentes, se pueden indicar una columna de DIP-trombina-agarosa y una columna con un anticuerpo monoclonal antitrombomodulina. La columna de DIP-trombina-agarosa puede ser tratada preliminarmente por equilibrado, por ejemplo, con una solución tampón 20 mM Tris-HCl(pH = 7,4) conteniendo 100 mM NaCl y 0,5 mM cloruro cálcico, después de lo cual la columna es cargada con el producto en crudo antes mencionado, seguido de un lavado adecuado con una elución subsiguiente, por ejemplo, con una solución tampón de 20 mM Tris-HCl (pH = 7,4) conteniendo 1,0 M NaCl y 0,5 mM cloruro cálcico, obteniendo un producto purificado de la trombomodulina soluble. En el caso de la columna de anticuerpo monoclonal antitrombomodulina, la columna es llenada con Sefarosa 4B (de la firma Pharmacia) que ha sido tratada de manera tal que las partículas de Sefarosa en estado activado preliminarmente por CNBr son llevadas a establecer contacto con una solución tampón de 0,1 M NaHCO_{3} (pH = 8,3) conteniendo 0,5 M NaCl y un anticuerpo monoclonal antitrombomodulina disuelto en la misma, a efectos de provocar que el anticuerpo monoclonal antitrombomodulina quede unido a las partículas de Sefarosa. A continuación, la columna es equilibrada de antemano, por ejemplo, con una solución tampón de fosfato 20 mM (pH = 7,3) conteniendo 1,0 M NaCl, seguido del lavado adecuado, antes de que la trombomodulina retenida es eluida, por ejemplo, con una solución tampón de 100 mM glicerina-HCl (pH = 3,0) conteniendo 0,3 M NaCl.

La solución obtenida de este modo de la trombomodulina soluble purificada es cargada a continuación en una columna llena de una resina de intercambio catiónico, preferentemente una resina de intercambio catiónico fuertemente ácida, tal como SP-Sefarosa FF (de la firma Pharmacia), que ha sido equilibrada en general en un estado, por ejemplo, de una conductividad específica de 25-34 ms/cm y un valor de pH de 3-4, si bien variable de acuerdo con la concentración de la sal, exactitud de la determinación del pH y especie de la molécula. El valor de la conductividad específica antes mencionado puede encontrarse más preferentemente en una gama de 30 \pm 3 ms/cm y el valor del pH puede encontrarse preferentemente en una gama de 3,0-3,7, más preferentemente de 3,5 \pm 0,1. Si bien es preferible utilizar una solución tampón que contenga disuelta en la misma una sal con la concentración adecuada, de manera que, entre estados diferentes posibles, se puede indicar una solución tampón de, por ejemplo, 50-150 mM con un pH de 3-4 conteniendo 0,25-0,32 M, preferentemente 0,3\pm0,1 M NaCl. Si bien no existe restricción en cuanto al tipo de la solución tampón, ésta puede ser seleccionada, por ejemplo, entre glicina-HCl, ácido cítrico-citrato disódico, citrato sódico y ácido acético. De manera concreta, se puede indicar como ejemplo una solución tampón de 100 mM glicerina-HCl (pH = 3,5) conteniendo 300 mM NaCl. La conductividad específica se puede determinar fácilmente utilizando un medidor de la conductividad de tipo portátil (Modelo P-serie CM-11P, aparato de la firma Toa Electronics Ltd., con temperatura estándar de conversión de 25ºC).

La columna preparada del modo indicado es puesta en marcha para pasar por la misma, por ejemplo, una solución tampón de glicina-HCl 100 mM (pH = 3,5, conductividad específica = 31 ms/cm) conteniendo 300 mM NaCl, con lo que se obtiene una fracción eluyente por recogida del eluyente que ha pasado desde el inicio de elevación del pico de absorbancia de 280 nm desde la absorbancia para la fracción pasada simplemente en blanco hasta el final de su descenso, que es neutralizada a continuación con una solución tampón adecuada, de manera que se puede obtener un producto de alta pureza de TM soluble purificado hasta un grado tal que sustancialmente no tiene contenido de las sustancias originadas a partir del suero y del anticuerpo. Tal como se describirá más adelante, se ha confirmado que la eliminación de las sustancias originadas en el suero y del anticuerpo pueden ser eliminadas de manera eficaz con mejor capacidad de reproducción utilizando esta columna. Desde luego, se pueden concentrar de manera adecuada por medio de ultra-filtrado.

Además, es también preferible llevar a cabo el intercambio de la solución tampón por medio de filtrado de gel. Por ejemplo, una columna de Sephacryl S-300 ó S-200, que ha sido equilibrada con una solución de tampón fosfato 20 mM (pH = 7,3) conteniendo 50 mM NaCl, es cargada con un producto de alta pureza concentrado por ultra filtrado, y la columna es sometida a fraccionado de revelado con una solución tampón de fosfato 20 mM (pH 7,3) conteniendo 50 mM NaCl, seguido de recogida de las fracciones que muestran actividad para aceleración de la activación de la proteína C por trombina cuando se examina dicha actividad y llevando a cabo intercambio de la solución tampón, de manera que se puede obtener un producto de gran pureza.

En muchos procesos de purificación, el preparado de inyección acuosa a utilizar de acuerdo con la presente invención se debe obtener sin necesidad de ningún proceso especial, tal como, adición y ajuste, cuando puede ser utilizada una solución que contiene el componente o componentes tampón y el tensoactivo o tensoactivos, permitiendo conseguir finalmente las condiciones de pH, etc. correspondientes a las prescritas de acuerdo con la presente invención. No obstante, en general, una práctica de adición de los componentes necesarios, etc. a la solución de trombomodulina soluble resultante es simple y conveniente y resulta preferente.

Para el componente o componentes tampón a utilizar de acuerdo con la presente invención, no existe restricción especial pudiéndose utilizar cualquiera que permita el ajuste del pH a un valor comprendido en una gama de 5 a 7,0 y que muestre una acción de tampón dentro de esta gama. Además, una gama preferente de pH consiste en 5,5-6,5. Por ejemplo, uno o varios tipos seleccionados entre el grupo que consiste en ácido fosfórico, ácidos carboxílicos y/o sales solubles en agua de los mismos pueden ser utilizados, cada uno de ellos, en una cantidad efectiva. Como ácidos carboxílicos y/o sales solubles en agua de los mismos, se pueden enumerar, por ejemplo, uno o varios seleccionados del grupo que consiste en ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido malónico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido málico y/o sales de los mismos solubles en agua, de manera que se da preferencia especial al ácido fosfórico, ácido acético y/o sales solubles en agua de los mismos. No existe restricción especial en cuanto a las sales solubles en agua, siempre que sean farmacéuticamente permitidas, y pueden incluir, por ejemplo, sales sódicas y potásicas.

Para el contenedor a utilizar de acuerdo con la presente invención, no hay restricción especial siempre que el material del contenedor y su configuración estén adaptados para permitir su llenado aséptico. Se puede indicar como ejemplo una jeringa de vidrio (dotada de una caperuza de goma y tapón de goma para permitir el llenado aséptico), un vial de vidrio (con tapón) y una ampolla de vidrio, así como los realizados en una resina de material plástico. Una realización más preferente de la presente invención consiste en un preparado prellenado en jeringa, efectuándose el llenado en un contenedor de jeringa. Se prepara un producto para prellenado de jeringa por llenado de una solución para inyección acuosa preliminarmente en un contenedor de jeringa que puede ser almacenado/transportado en esta situación, de manera que el contenedor de jeringa puede estar dotado o no de una aguja de inyección. Cuando no tiene aguja de inyección, se incorpora una aguja de inyección al mismo, habitualmente en el momento de su inyección. Se puede considerar la administración del preparado por penetración a través de la piel, aplicando alta presión a un preparado acuoso contenido en la jeringa, sin utilizar aguja de inyección. En este caso, la salida para la inyección del preparado acuoso en el extremo frontal puede estar configurado preferentemente en forma de un orificio estrecho. En cuanto a medios para incrementar la presión interna, se puede utilizar, por ejemplo, la fuerza de presión de un gas comprimido (nitrógeno, helio, dióxido de carbono, etc.) y un resorte.

Al seleccionar el componente o componentes tampón que muestran acción tampón en la gama de pH que se ha mencionado anteriormente, se puede seleccionar preferentemente un componente o componentes tampón y una cantidad de los mismos de manera que el valor del pH del preparado cargado no quede alterado más allá de \pm 0,3 antes y después del llenado del contenedor asignado para su llenado con el componente o componentes tampón a examinar, y el contenedor llenado de este modo es sometido a tratamiento de calentamiento a 50ºC durante 96 horas, tal como se indica en el Método de Examen 1 que se describe más adelante, si bien este estado puede quedar influido por el tipo de componente tampón, su concentración y cada uno de los recipientes específicos a llenar. En cuanto a componentes típicos para el tampón, según el ejemplo que se ha mostrado anteriormente, la concentración a utilizar se puede encontrar en una gama, en general, de como mínimo 0,01 mM, preferentemente como mínimo 1 mM, en general, hasta un valor máximo de 1.000 mM, preferentemente como máximo 200 mM, y especialmente preferente 25 mM o como máximo 20 mM. Es preferible que el contenedor de vidrio sea sometido previamente a un tratamiento con azufre. La jeringa de vidrio puede ser tratada mediante un recubrimiento de siliconas en toda su superficie interior.

En una realización de preparación de la solución tampón basada en fosfato para el preparado para inyección acuosa según la presente invención, se mezclaron entre sí una solución acuosa de difosfato ácido sódico (NaH_{2} PO_{4} o su hidrato 12) de una concentración predeterminada y una solución acuosa de monofosfato ácido sódico (NaH_{2} HPO_{4} o su dihidrato) asimismo de una concentración predeterminada, cada una en una cantidad definida para ajustar el pH al valor previsto. De manera alternativa, es también posible añadir una solución acuosa de hidróxido sódico gota a gota a una solución acuosa de difosfato ácido de sodio con una concentración definida para ajustar el pH de la solución resultante al valor previsto. También es posible añadir ácido clorídico diluido o bien ácido fosfórico diluido gota a gota para llevar a cabo un ajuste fino del valor del pH. En el caso de una solución tampón con una sal de un ácido carboxílico, típicamente representado por un tampón de acetato se mezclan entre sí una solución acuosa de ácido acético con una concentración predeterminada y una solución acuosa de acetato sódico también con una concentración predeterminada, cada una en una cantidad definida para ajustar el pH al valor previsto. De manera alternativa, también es posible añadir una solución acuosa de hidróxido sódico de concentración definida gota a gota a una solución acuosa de ácido acético con una concentración definida para ajustar el pH al valor previsto. También es posible utilizar la adición gota a gota de ácido acético diluido para llevar a cabo un ajuste fino del valor del pH.

El preparado para inyección acuosa según la presente invención tiene habitualmente un valor de pH en una gama de 5,0 a 7,0, preferentemente de 5,5 a 6,5. De manera especialmente preferente, tiene un pH de valor 6,0 aproximadamente. Una gama de pH preferente consiste, aproximadamente, en 5,5-6,0.

Cuando la concentración de una solución de tampón fosfato ha sido variada dentro de una amplia gama de 0,2 a 200 mM, se observa una gran influencia en la reducción de la actividad del preparado de trombomodulina en solución acuosa a un pH de 7,3, de manera que cuanto mayor es la concentración de la solución tampón, mayor es la reducción de la actividad detectada. Por ejemplo, la actividad residual del preparado se reduce en mayor medida para una concentración de 200 mM. No obstante, para la solución de tampón fosfato, se puede obtener una calidad favorable con respecto a la estabilidad térmica (estabilidad a largo plazo) del preparado de trombomodulina en solución acuosa cuando se efectúa un control riguroso del valor de pH dentro de una gama de 5-7,0. Es preferible ajustar el pH a 5,5-6,5, en particular a 6,0 aproximadamente. Cuando se efectúa el ajuste del pH a un valor lo más próximo posible a 7,0, se puede provocar influencia en la estabilidad térmica del preparado de trombomodulina en solución acuosa, incluso por una fluctuación mínima en el valor de pH y, por lo tanto, se debe evitar preferentemente dicho ajuste del pH.

En una solución tampón de acetato, no se encuentra influencia de la concentración de la solución tampón en la calidad del preparado de trombomodulina, aunque la concentración de la solución tampón se varíe dentro de una amplia gama de 0,2 a 200 mM. En una solución tampón de una combinación de fosfato y acetato, se consigue una calidad favorable con respecto a la estabilidad térmica en una gama de pH de 5,0 a 7,0.

En una solución tampón de una sal de un ácido carboxílico distinta a acetato, se consigue una estabilidad térmica comparable a la de una solución de tampón acetato con la misma gama de concentración que la gama de pH de la solución tampón de acetato. Cuando se añade un componente de tampón de acetato y/o un componente tampón de una sal de ácido carboxílico a una solución de tampón fosfato, se consigue una estabilidad térmica comparable.

Como tensoactivo a incorporar, según la presente invención, se prefiere un tensoactivo no iónico, por ejemplo, polisorbatos, tales como polisorbato 80 (de la marca comercial "Tween 80") y polisorbato 20 (de marca comercial "Tween 20"); aceites de ricino hidrogenados con polioxietileno, tal como aceite de recino 60 hidrogenado con polioxietileno (de la marca comercial "HCO-60" y de la marca comercial Cremophor RH 60) y aceite de ricino 50 hidrogenado con polietileno (de la marca comercial "HCO-50" y "Cremophor RH 50"), aceites de recino de polioxietileno (de las marcas comerciales "CO-60TX", "CO-50TX" y "Cremophor EL" etc.), polímeros de óxido de etileno/óxido de propileno, tales como polioxietileno(160)-polioxipropileno(30) glycol (de marca comercial "Pluronic F68" etc.) y sesquioleato de sorbitan. Es posible utilizar como mínimo uno de los tensoactivos seleccionados entre el grupo indicado anteriormente con permiso de utilización de los mismos en combinación.

En cuanto a la estabilidad en agitación, se puede obtener un efecto preventivo de turbidez por la adición mínima de 0,01% en peso para el polisorbato 80 (de la marca comercial "Tween 80") o como mínimo el 0,1% en peso del aceite de recino hidrogenado por polioxietileno (de marca comercial "HCO-60") y el polioxietileno(160)polioxipropileno(30) glicol (de marca comercial "Pluronic F68"). El polisorbato 80 (de marca comercial "Tween 80") muestra un efecto preventivo de la turbidez solamente con una adición de 0,01% en peso y es especialmente preferente.

Para la concentración del tensoactivo a utilizar, de acuerdo con la presente invención, se puede indicar usualmente como ejemplo una concentración favorablemente de 0,001% como mínimo en peso, preferentemente de 0,01% como mínimo en peso, pero no más de 1% en peso, preferentemente no más de 0,1% en peso.

El preparado de trombomodulina en solución acuosa, de acuerdo con la presente invención, puede contener, además de los componentes constituyentes indicados en lo anterior, otros aditivos incluyendo agentes isotónicos (tales como cloruro sódico, etc.) y conservantes (tales como ésteres del ácido p-oxibenzoico, etc.) como terceros componentes.

No existe limitación especial en cuanto a la forma práctica de incorporación de los ingredientes aditivos en el preparado de trombomodulina en solución acuosa, tal como se ha indicado anteriormente, y se puede utilizar un procedimiento, en el que se añaden directamente a la solución acuosa que contiene la trombomodulina o pueden ser disueltos previamente en agua, en el agua para inyección o en una solución tampón adecuada, y la solución resultante es añadida a la solución de trombomodulina.

En una realización preferente para la preparación de la trombomodulina en solución acuosa, por ejemplo, una jeringa, ampolla o vial son llenadas con una solución de trombomodulina en agua, en agua para inyección o en una solución tampón adecuada a una concentración de 0,05 mg o más, preferentemente 0,1 mg o más, especialmente preferente 1 mg o más, por 1 ml. Si bien el límite superior de contenido de trombomodulina no está restringido de manera específica, puede ser indicada como ejemplo una concentración de trombomodulina como, por ejemplo, no superior a 15 mg, preferentemente no superior a 10 mg, especialmente preferente no superior a 6 mg por 1 ml. Una cantidad, por ejemplo, de 0,3-10 ml de una solución acuosa que contiene la trombomodulina a la concentración indicada anteriormente y otros ingredientes aditivos se utiliza para el llenado del contenedor anteriormente mencionado, de forma aséptica, por una técnica convencional, de manera que se puede obtener un producto farmacéutico de la preparación para inyección acuosa de la trombomodulina. Para esterilizar el contenedor, se puede utilizar, por ejemplo, una práctica ordinaria de calentamiento en seco, autoclave y esterilización por rayos \gamma. Se puede utilizar por ejemplo, una situación de temperatura mayor de 250ºC durante más de 30 minutos para calentamiento en seco, a una temperatura superior a 121ºC durante más de 20 minutos para autoclave e irradiación de rayos \gamma con una dosis de 20-60 kGy (kilograys). Para la esterilización se utiliza, usualmente, calentamiento en seco para ampollas y viales realizadas en vidrio, y la acción de autoclave es utilizada de forma usual para el tapón de goma del vial. Para esterilizar la jeringa se utiliza, usualmente, esterilización por rayos \gamma , si bien también se puede utilizar autoclave. La solución acuosa de trombomodulina a llenar en el contenedor se hace pasar, preferentemente, en general, a través de un filtro de esterilización con una dimensión de poros de 0,22 ó 0,2 micras. El preparado para inyección acuosa de trombomodulina, según la presente invención, es preparada al llenar de forma aséptica un contenedor esterilizado con la solución acuosa filtrada asépticamente de trombomodulina. También es preferible que el preparado de inyección acuosa obtenido de este modo de trombomodulina sea envasado mediante una hoja o caja de cartón.

El preparado de inyección acuosa de trombomodulina, de acuerdo con la presente invención, puede encontrarse presente de modo preferente como preparado de jeringa con llenado previo, tal como se ha indicado anteriormente, si bien se puede almacenar en una ampolla o vial. En el caso de un preparado en ampolla, es preferible utilizar una ampolla que haya sido sometida a un tratamiento de azufre. Una ampolla con tratamiento de azufre se obtiene por contacto de la ampolla de vidrio con gas SO_{2} o, de manera favorable, pulverizando una solución de sulfato amónico en agua sobre la pared interior del contenedor en forma de ampolla y sometiendo al contenedor pulverizado de este modo a un tratamiento de calentamiento. Usualmente, se puede utilizar como ejemplo un método de pulverización de una solución de 1-10% de sulfato amónico con un tratamiento de calentamiento subsiguiente a la temperatura de 630-700ºC. En general, el contenedor en forma de ampolla sometido a este tratamiento es sometido previamente a otro tratamiento en, por ejemplo, una máquina de lavado de ampollas o similar, por ultrasonidos en estado húmedo con lavado subsiguiente con agua, seguido de esterilización mediante calor seco a una temperatura de 300-350ºC durante varios minutos, antes de su llenado con el preparado para inyección.

A continuación, se describirá el método de la segunda forma de realización de la presente invención, es decir, el método en el que el preparado de inyección acuosa de trombomodulina, que se caracteriza por haber sido preparado como solución acuosa con un valor de pH comprendido entre 5 y 7,0 y conteniendo una trombomodulina soluble en una cantidad efectiva y un componente tampón con una función tampón en una gama de pH comprendida entre 5 y 7,0, y que consiste en un preparado en jeringa con un llenado previo, llenado de forma aséptica en un recipiente en forma de jeringa, excluyendo cualquier espacio sustancial para gas en su interior, es almacenado/transportado en forma líquida durante un largo período de tiempo.

Las definiciones de la trombomodulina soluble, componente tampón y el preparado de inyección acuosa de trombomodulina son iguales a las descritas anteriormente.

Para la utilización del recipiente en forma de jeringa, de acuerdo con la presente invención, puede ser preferible la utilización de una jeringa de inyección de tipo comercial y, de manera general, un recipiente de jeringa para el prellenado de la misma con un diámetro interno aproximadamente de 8,6 mm, unos 6,3 mm o unos 4,6 mm, a título de ejemplo. Si bien se selecciona de acuerdo con la cantidad de carga de la solución acuosa de trombomodulina, la más preferente es una jeringa con un diámetro interno de unos 4,6 mm a efectos de la estabilidad contra las sacudidas, si bien el recipiente de jeringa con 6,3 mm de diámetro interno permite una aplicación suficiente. Para un recipiente de jeringa con diámetro interno de unos 8,6 mm es necesario mantener la proporción de espacio para gas en el recipiente cuando es cargado con el preparado acuoso como máximo al 50% en volumen. De este modo, el recipiente de jeringa con un diámetro interior de unos 8,6 mm, puede asegurar su estabilidad contra las sacudidas siempre que la proporción de espacio para gas en su interior, después de haber sido llenada con el preparado acuoso, se mantenga como máximo en 50% del volumen.

El preparado de inyección acuosa de trombomodulina, de acuerdo con la forma específica y diámetro interno del recipiente, puede no ser sometido sustancialmente a sacudidas debido a su tensión superficial. En el contexto de esta descripción, los términos "parte sujeta a sacudidas" significa una parte del recipiente en la que el preparado de inyección acuosa de trombomodulina presente en el recipiente se puede llevar a un movimiento con sacudidas sustanciales cuando el recipiente es objeto de sacudidas, a condición de una amplitud de 5 cm y una frecuencia de 180 revoluciones por minuto a una temperatura de 25ºC. "La proporción del espacio de gas" en el recipiente es el valor calculado al dividir la diferencia de volumen, calculada por restar el volumen del preparado de inyección acuosa de trombomodulina presente dentro de la parte sometida a sacudidas del volumen a la parte sometida a sacudidas, con respecto al volumen de la parte sometida a sacudidas del recipiente, expresado en porcentaje. La cantidad de preparado de inyección acuosa de trombomodulina presente en la parte sometida a sacudidas, a saber, la parte móvil del preparado de inyección acuosa en el recipiente se puede confirmar, por ejemplo, repitiendo un experimento para determinar y medir la cantidad de preparado acuoso del recipiente, que se ha desplazado hacia abajo en el mismo, después de mantener el recipiente lleno con el preparado para inyección de tipo acuoso de trombomodulina durante 5 segundos en este estado, tal que los ejes vertical y horizontal de los recipientes se mantienen fijos, después de haber sido sometido a sacudidas durante dos minutos en la situación anteriormente mencionada. En este caso, también es posible, al mismo tiempo, confirmar la parte sometida a sacudidas, de manera que su volumen puede ser determinado. En el caso de una jeringa de forma simple, la parte sometida a sacudidas consiste, desde luego, en el espacio confinado entre la jeringa y el tapón (y la caperuza). En el caso de la jeringa de aproximadamente 4,6 mm de diámetro interno, no tienen lugar sacudidas sustanciales y no es necesario tener en cuenta la proporción de espacio de gas.

Usualmente, el recipiente de jeringa sellado por una caperuza es llenado con el preparado de inyección acuosa de trombomodulina de manera ordinaria, y a continuación es dotado de un tapón. Para montar el tapón en el recipiente en forma de jeringa, se puede utilizar una técnica, por ejemplo, de vacío, utilizando un tubo de ventilación (o manguito).

Cuando el recipiente en forma de jeringa es cerrado de forma estanca por montaje del tapón en vacío, la proporción de espacio de gas se puede ajustar de manera relativamente fácil a un valor, por ejemplo, no superior a 15% en volumen. Por lo tanto, se comprenderá por los términos "excluir cualquier espacio sustancial de gas", que se indican de acuerdo con la presente invención, como una realización preferente que, de manera típica, tiene la proporción de espacio de gas no superior a 15% en volumen. También es preferible que la proporción de espacio de gas no sea superior a 10% en volumen, mucho más que no sea superior a 5% en volumen. Con un recipiente en forma de jeringa para una jeringa llenada de forma previa, adaptada para inyección subcutánea o para inyección intramuscular (teniendo ordinariamente la capacidad de varios ml, preferentemente no superior a 2 ml, más preferentemente no superior a 1 ml, especialmente preferente no superior a 0,5 ml) con un diámetro interno mínimo de 8,6 mm, se puede obtener fácilmente un preparado en jeringa prellenada que muestra una estabilidad contra sacudidas muy elevada, siempre que la proporción de espacio de gas permanezca por debajo del valor anteriormente indicado.

Además del recipiente en forma de jeringa anteriormente explicado, se pueden utilizar también viales y ampollas para el recipiente cuando se tiene en cuenta la incorporación de un tensoactivo. Los viales y ampollas ordinarios tienen un diámetro interno relativamente grande y, por lo tanto, es relativamente difícil para ellos el disminuir y ajustar la proporción de espacio de gas. Por lo tanto, la utilización de viales y ampollas se puede evitar, preferentemente, cuando la proporción de espacio de gas se debe ajustar de manera precisa.

El preparado de inyección acuosa de trombomodulina preparado, tal como se ha indicado anteriormente, muestra una gran estabilidad a largo plazo y, por lo tanto, puede conseguir la conservación mínima de un 80% de su actividad original durante un período de 12 meses, preferentemente 18 meses, a 5ºC. En algunos casos, puede permitir almacenamiento/transporte durante un largo período de tiempo que supere incluso dos años, preferentemente hasta tres años, siempre que se satisfagan otras condiciones determinadas.

El preparado de inyección acuosa de trombomodulina, de acuerdo con la presente invención, no sufrirá turbidez incluso en condiciones de sacudidas con una amplitud de 5 cm, a una frecuencia de 180 revoluciones por minuto a 25ºC durante un período de un mes. Por lo tanto, el preparado de inyección acuosa de trombomodulina, de acuerdo con la presente invención, muestra suficiente estabilidad, tal y como se ha indicado anteriormente, y puede ser almacenado/transportado en forma de líquido durante un largo período de tiempo.

Las condiciones de almacenamiento/transporte que se encontrarán en un preparado de inyección acuosa de trombomodulina, según la presente invención, pueden incluir una temperatura superior a la que provoca su congelación, pero no superior a la temperatura ambiente y, según un ejemplo concreto, de 0ºC a 20ºC, preferentemente unos 5ºC. La duración permisible puede cubrir, por lo tanto, 12 meses, preferentemente 18 meses y, más preferentemente unos dos años.

El preparado de inyección acuosa de trombomodulina, de acuerdo con la presente invención, suministra las formas de administración de inyecciones subcutánea e intramuscular. Por lo tanto, el cuarto aspecto de la presente invención consiste en un método para aplicar el preparado de jeringa rellenada de trombomodulina para la administración al paciente por vía de inyección subcutánea o intramuscular.

El quinto aspecto de la presente invención consiste en un preparado de inyección acuosa duradera de trombomodulina, conteniendo, como ingrediente activo, una trombomodulina soluble a administrar al paciente por inyección subcutánea o intramuscular con una frecuencia de administración de una vez cada dos a cinco días.

Dado que la trombomodulina existe en la superficie de las células endoteliales celulares y el lugar de acción de la misma está limitado dentro del vaso sanguíneo, se ha aceptado que la administración de trombomodulina por inyección intravenosa puede producir un efecto directo y es la más preferible. Por ejemplo, la Patente japonesa Kokai Sho 64-6219 da a conocer un ejemplo de inyección intravenosa gota a gota.

No obstante, es necesario desarrollar un preparado medicamentoso que no se ha descubierto de manera convencional y que pueda permitir una elección adecuada de acuerdo con el estado del paciente y con carácter práctico.

En los informes y publicaciones conocidos hasta el momento, no siempre se ha dejado claro que la trombomodulina sea administrada a un paciente intencionadamente por una ruta distinta a la inyección intravenosa. Por lo tanto, los inventores de la presente invención han hecho investigaciones y han descubierto, por primera vez, que una concentración de trombomodulina en la sangre puede ser aumentada cuando la trombomodulina soluble constituida por la secuencia de aminoácidos compuesta por los residuos de aminoácidos del lugar nº 19 al lugar nº 516 del listado de secuencia SEQ ID NO: 1 (trombomodulina soluble obtenida por transfectado del segmento de DNA que codifica la secuencia de aminoácidos del listado de secuencia SEQ ID NO: 1 a una célula hospedante) se administra a un paciente por inyección subcutánea y que, en particular, esta concentración de trombomodulina en la sangre es conservada durante un período de tiempo notablemente más largo en comparación con la trombomodulina soluble constituida por la secuencia de aminoácidos compuesta por los residuos del lugar nº 367 al lugar nº 480 del listado de secuencia SEQ ID NO: 1.

Por lo tanto, se consigue, de acuerdo con la presente invención, un prepapado medicamentoso preferente, estable, de trombomodulina.

También puede ser favorable que se incorpore al preparado medicamentoso duradero que se ha indicado una sustancia anestésica local. También es preferible un contenido adicional de un conservante.

Entre los ejemplos preferentes del agente anestésico local se incluye el clorhidrato de procaína y el alcohol bencílico. La cantidad de administración del agente anestésico local puede ser, por ejemplo, de 0,5-10%, preferentemente de 1-5%, basándose en el peso total del preparado de inyección.

Es permisible, en caso necesario, que el preparado de inyección contenga aminoácidos, sales, carbohidratos, tensoactivos, albúmina, gelatina y otros, tal como se da la conocer en las Patentes japonesas Kokai Sho 64-6219 A y Hei 6-321805 A. La adición de un conservante es también favorable, para lo cual los ejemplos preferentes incluyen ésteres de ácido paraoxibenzoico, tal como metil paraoxibenzoato, etil paraoxibenzoato y mezclas de ésteres de ácido paraoxibenzoico. La cantidad de conservante puede encontrarse habitualmente, por ejemplo, en una gama de 0,01 a 1,0%, preferentemente de 0,1 a 0,3%, basado en el peso del preparado de inyección.

Para la trombomodulina soluble a utilizar en el preparado medicamentoso estable, de acuerdo con la presente invención, se puede incorporar cualquier trombomodulina soluble sin restricción especial, siendo especialmente preferente una trombomodulina soluble constituida con la secuencia de aminoácidos compuesta por los residuos de aminoácidos desde el lugar nº 19 al lugar nº 516 del listado de secuencia SEQ ID NO: 1, una trombomodulina soluble constituida por la secuencia de aminoácidos compuesta por los residuos de aminoácidos desde el lugar nº 19 al lugar nº 516 del listado de secuencia SEQ ID NO: 2, una trombomodulina soluble obtenida por transfectado del segmento de DNA que codifica para la secuencia de aminoácidos del listado de secuencias SEQ ID NO: 1 a una célula hospedante, y una trombomodulina soluble obtenida por transfectado del segmento de DNA que codifica para la secuencia de aminoácidos del listado de secuencia SEQ ID NO: 2 a una célula hospedante.

La estabilidad del preparado medicamentoso, de acuerdo con la presente invención, puede ser indicada de manera favorable como ejemplo por el hecho de que la media vida de la concentración en la sangre (T_{1/2}) es como mínimo de 16 horas y que el tiempo de retención mínimo (MRT) en el plasma es como mínimo de 36 horas.

Es preferible que el preparado medicamentoso estable, de acuerdo con la presente invención, se dispone en forma de preparado de inyección acuosa. Si bien el preparado medicamentoso estable, de acuerdo con la presente invención, puede ser distribuido en forma de producto liofilizado que se tiene que disolver en agua en su administración, es más conveniente su utilización en forma de preparado en jeringa de llenado previo, preparado por llenado de un recipiente en forma de jeringa con el preparado de inyección acuosa de trombomodulina, tal como se ha descrito en lo anterior, de forma aséptica, en forma de medicamento subcutáneo o inyección intramuscular.

La forma de proceder prácticamente para la incorporación de aditivos en la preparación del preparado de larga duración, de acuerdo con la presente invención, no está específicamente restringido. Así, por ejemplo, los aditivos pueden ser mezclados en una solución acuosa de trombomodulina o son disueltos de forma preliminar en agua, en agua para inyección o en una solución tampón adecuada, y las soluciones resultantes son reunidas a continuación en una proporción adecuada, antes de preparar la inyección acuosa. Por ejemplo, una solución acuosa que contiene 0,05-15 mg, preferentemente 0,1-6 mg, de la trombomodulina soluble junto con los aditivos antes mencionados por 1 ml de agua, agua para una inyección o solución tampón adecuada, es cargada, por ejemplo, en un recipiente en forma de jeringa o en un vial u, ocasionalmente, una ampolla en una cantidad, por ejemplo, de 0,5-10 ml, y el preparado formulado de esta manera es utilizado como tal para la preparación de la inyección acuosa de trombomodulina o, en el caso de vial y ampolla, el preparado formulado puede ser sometido además a liofilización. Habitualmente, el preparado medicamentoso de larga duración obtenido de esta manera puede contener una trombomodulina soluble en una cantidad, por ejemplo, de 0,01 a 100 mg.

La frecuencia de administración del preparado de inyección acuosa de trombomodulina, de acuerdo con la presente invención, puede ser, tal como es práctica convencional, 1 a 3 administraciones por día, si bien es posible seleccionar una frecuencia de administración, por ejemplo, de 2-5 días. Especialmente, en el caso de inyección subcutánea o intramuscular, es preferible una administración con una frecuencia, por ejemplo, de una vez cada 2-5 días, debido a su carácter duradero. Para la dosificación de una administración, si bien es permisible administrar la dosis máxima permisible por inyección intravenosa gota a gota, habitualmente una dosis para una administración única, como máximo de 1 mg de la trombomodulina soluble por kg de peso corporal, se indica como ejemplo de administración de inyección única en un vaso sanguíneo. Para la dosis mínima, se puede poner como ejemplo habitualmente una cantidad mínima de 0,001 mg, preferentemente, como mínimo, 0,005 mg por 1 kg de peso corporal. El límite superior de dosis para una inyección subcutánea o intramuscular única está determinado por una cantidad soluble máxima del ingrediente activo en una cantidad de inyección del líquido portador. Una dosis típica adaptada para inyección subcutánea o intramuscular es, en general, de varios mililitros, preferentemente un máximo de 2 ml, más preferentemente, un máximo de 1 ml, y de manera especialmente preferente un máximo de 0,5 ml. Por lo tanto, una dosis expresada por el peso de la trombomodulina soluble para una sola administración por inyección subcutánea o intramuscular pueda ser, por ejemplo, 20 mg o menos, mientras que la cantidad mínima efectiva para una sola administración puede ser, por ejemplo, de 0,001 mg por kg de peso corporal, preferentemente un mínimo de 0,005 mg por kg de peso corporal, tal como se ha indicado anteriormente.

La preparación de larga duración de trombomodulina, según la presente invención, puede mostrar su duración por administración no solamente por vía subcutánea, sino también por vía intramuscular, de manera que resulta preferente la inyección subcutánea.

Es posible, de acuerdo con la presente invención, extender de forma notable la duración en la que se mantiene la concentración de trombomodulina en la sangre, lo cual resulta en una posible reducción de la frecuencia de administración, de manera que se consigue un preparado medicamentoso de trombomodulina, efectivo con una cantidad menor en comparación con la de un preparado convencional para inyección intravenosa. Este preparado medicamentoso puede reducir los dolores del paciente en la inyección y puede permitir inyección ocasional por el propio paciente, contribuyendo de esta forma a la comodidad terapéutica del paciente de forma considerable.

El examen de la toxicidad aguda del preparado de inyección acuosa de trombomodulina soluble, de acuerdo con la presente invención, ha demostrado que no se ha observado caso mortal alguno en la administración a grupos de cada 5 ratas macho + hembra SD por inyección con una dosis de 180 mg/kg como peso de dosis de trombomodulina. Tampoco se apreció caso mortal alguno por la administración por inyección subcutánea a la misma dosis de 180 mg/kg.

Breve descripción del dibujo

La figura 1 muestra la variación temporal de la concentración de trombomodulina soluble en el plasma, después de la administración de la trombomodulina soluble a ratas. En el gráfico, IV indica inyección intravenosa y SC indica inyección subcutánea.

Texto de la tabla de listados de secuencias

Otras informaciones en el listado de secuencias SEQ ID NO:1 se refieren a secuencias parciales de aminoácidos de trombomodulina humana.

Otras informaciones del listado de secuencias SEQ ID NO:2 se refieren a secuencias parciales de aminoácidos de una trombomodulina humana.

Otras informaciones en el listado de secuencias SEQ ID NO:3 se refieren a secuencias parciales base de un gen de trombomodulina humana.

Otras informaciones en el listado de secuencias SEQ ID NO:4 se refieren a secuencias base parciales de un gen de trombomodulina humana.

Otras informaciones del listado de secuencia SEQ ID NO:5 se refieren al DNA sintético para mutación.

Ejemplo

A continuación, se describirá la presente invención de manera concreta en base a Ejemplos y Ejemplos Comparativos, debiéndose observar que no queda restringida a los mismos.

Ejemplo de Referencia 1

Las trombomodulinas solubles a utilizar en los Ejemplos se obtienen de acuerdo con el método de Yamamoto y otros (método que se da a conocer en el Ejemplo 10 de la memoria de la Patente japonesa Kokai Sho 64-6219). Por lo tanto, el DNA del listado de secuencia SEQ ID NO: 3 fue integrado en una célula de ovario de hámster chino (CHO), para preparar una célula transformada y, por cultivo de esta célula transformada, se produjeron trombomodulinas solubles.

Ejemplo de Referencia 2

Purificación primaria mediante una resina de intercambio aniónico fuertemente básica

11 litros del sobrenadante del cultivo obtenido en el Ejemplo de Referencia 1, que habían sido congelados a menos 20ºC, fueron descongelados y filtrados a través de un filtro de membrana con un tamaño de poros de 0,2 \mum (MILLIPACK 20, producto de la firma Millipore).

El sobrenadante de cultivo filtrado fue cargado en una columna de Q-Sepharosa (suministrada por la firma Pharmacia, con un diámetro de 90 mm y una altura de 6,5 cm) que había sido equilibrada con una solución tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) conteniendo 150 mM NaCl. A continuación, la columna fue lavada con tampón acetato 20 mM con 180 mM NaCl y, a continuación, se lavó adicionalmente con una solución tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) conteniendo 180 mM NaCl, seguido de elución con solución tampón 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) conteniendo 300 mM NaCl, después de lo cual la fracción eluida de la elevación del pico de absorbancia de 280 nm hasta una elución de 0,5 volúmenes de columna se recogió como producto purificado primario.

Ejemplo de Referencia 3

Purificación principal por columna de afinidad (columna de trombina)

400 ml de la fracción eluida obtenida en el Ejemplo de Referencia 2 fueron dializados contra una solución tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) conteniendo 100 mM NaCl y cloruro cálcico 0,5 mM. Después de la diálisis, la solución dializada de este modo fue cargada en una columna DIP-trombina Agarosa (06-148-1035, suministrada por la firma PAESE LOREI, con un diámetro de 50 mm y una altura de 6 cm) equilibrada con solución tampón 20 mM Tris (pH 7,4) conteniendo 100 mM NaCl y 0,5 mM CaCl_{2}.

La elución fue empezada con una solución tampón 20 mM Tris (pH 7,4) conteniendo 1,0 M NaCl y 0,5 mM CaCl_{2}, después de lavado con solución tampón 20 nM Tris (pH 7,4) conteniendo 200 mM NaCl y 0,5 mM CaCl_{2} de manera que la fracción eluida de la elevación del pico de absorbancia de 280 nm hasta la bajada del mismo fue recogida como producto purificado principal.

Ejemplo de Referencia 4

Purificación principal por columna de afinidad (anticuerpo B)

La columna de afinidad fue preparada del modo siguiente: El anticuerpo, monoclonal anti-trombomodulina B fue obtenido por purificación del sobrenadante cultivo resultado del cultivo de un hibridoma que produce este anticuerpo o por purificación de la hidropesía abdominal resultante del cultivo de un hibridoma en el peritoneo de un animal histocompatible, tal como un ratón simple, por medio de aislamiento y purificación, tal como separación por sal, cromatografía por intercambio iónico o utilización de columna de proteína A. Después de ello, el anticuerpo monoclonal B antitrombomodulina purificado de este modo fue disuelto en solución tampón 0,1 M NaHCO_{3} (pH 8,3) conteniendo 0,5 M NaCl y la solución fue llevada a contacto con Sepharosa 4B (52-1153-00-AI, producto de Pharmacia) activada por CNBr para provocar que el anticuerpo monoclonal antitrombomodulina B se acoplara con la Sepharosa 4B para constituir un anticuerpo (anticuerpo B) monoclonal anti-trombomodulina acoplado a Sepharosa 4B, de acuerdo con los procedimientos del manual de Pharmacia (Affinity Chromatography Principles & Methods). Este anticuerpo anti-trombomodulina (anticuerpo B) acoplada Sepharosa 4B fue utilizado para el llenado de una columna para preparar una columna de anticuerpo monoclonal (anticuerpo B).

400 ml de la fracción eluida obtenida en el Ejemplo de Referencia 2 fueron cargados en la columna de anticuerpo monoclonal (anticuerpo B) (con un diámetro de 50 mm y una altura de 6 cm) equilibrada de forma preliminar con una solución tampón de fosfato 20 mM (pH 7,3) conteniendo 1,0 M NaCl. A continuación, se hizo pasar por la columna tampón fosfato 20 mM (pH 7,3) conteniendo 1,0 M NaCl, seguido de lavado con solución tampón de acetato 100 mM (pH 5,0), después de lo cual se inició elución utilizando solución tampón 100 mM glicina-HCl (pH 3,0) conteniendo 0,3 M NaCl, de manera que se recogió como producto principal purificado la fracción eluida de la elevación del pico de absorbancia de 280 nm hasta su bajada.

Ejemplo de Referencia 5

Purificación de alta pureza con columna de intercambio iónico fuertemente ácida (1) Purificación del eluido de la columna de trombina (fracción no adsorbida SP)

200 ml del eluido obtenido en el Ejemplo de Referencia 3 fueron diluidos con solución tampón de 100 mM glicina-HCl (pH 3,5) y el pH de la solución diluido de este modo fue ajustado 3,5 utilizando solución tampón (pH 2,0) de 1,0 M glicina-HCl. Este eluido diluido y ajustado en pH fue cargado en la columna de SP-Sepharosa (de la firma Pharmacia, con un diámetro de 26 mm y una altura de 3 cm) que fue equilibrada preliminarmente con solución tampón 100 mM glicina-HCl (con una conductividad específica de 31 ms/cm, pH 3,5) conteniendo 300 mM NaCl. El lavado fue iniciado utilizando una solución tampón de 100 mM glicina-Hcl (igual a la indicada anteriormente) teniendo 300 mM NaCl, y la fracción eluida de la elevación del pico de absorbencia de 280 nm hasta su bajada fue recogida y neutralizada inmediatamente con solución de tampón fosfato 500 mM (pH 7,3) hasta un pH de 7,0, que fue utilizado para el producto de alta pureza.

(2) Purificación del eluido de la columna de anticuerpo monoclonal (fracción adsorbida no SP)

180 ml del eluido obtenido en el Ejemplo de Referencia 4 fueron tratados con solución tampón 1,0 M glicina-HCl (pH 2,0) para ajustar su pH a 3,5, y a continuación se cargó en una columna SP-Sepharosa (de la firma Pharmacia, con un diámetro de 26 mm y una altura de 3 cm) que fue equilibrada preliminarmente con una solución tampón de 100 mM de glicina-HCl (igual que la indicada anteriormente) conteniendo 300 mM NaCl. El lavado fue iniciado utilizando solución tampón 100 mM glicina-HCl (igual que en el caso anterior) conteniendo 300 mM NaCl, y la fracción eluida de la subida de pico de absorbancia 280 nm hasta la bajada del mismo fue recogida y neutralizada inmediatamente con solución tampón de fosfato 500 mM (pH 7,3) a un pH 7,0, que se utilizó como producto de alta pureza.

(3) Purificación de eluido de la columna de trombina (Fracción adsorbida SP)

200 ml del eluido obtenido en el Ejemplo de Referencia 3 fueron diluidos con solución tampón 100 mM glicina-HCl (pH 3,5) y el pH de la solución diluida de este modo fue ajustada a 3,5 utilizando solución tampón 1,0 M glicina-HCl (pH 2,0). Este eluido diluido y ajustado en pH fue cargado en una columna de SP-Sepharosa (de la firma Pharmacia, con un diámetro de 26 mm y una altura de 3 cm) que fue equilibrada preliminarmente con solución tampón 100 mM glicina-HCl (pH 3,5) conteniendo 100 mM NaCl. La columna fue lavada utilizando solución tampón 100 mM glicina-HCl (pH 3,5) conteniendo 100 mM NaCl y fue eluida con solución tampón 100 mM glicina-HCl (pH 3,5), de manera que la fracción eluida de la subida de 280 nm del pico de absorbancia a la bajada del mismo fue recogida y neutralizada inmediatamente con solución tampón de fosfato 500 mM (pH 7,3) a un pH de 7,0 que se utilizó como producto de alta pureza.

(4) Purificación de eluido de la columna de anticuerpo (Fracción adsorbida SP)

180 ml del eluido obtenido en el Ejemplo de Referencia 4 fueron diluidos con solución tampón 100 mM glicina-HCl (pH 3,5) y el pH de la solución diluida de este modo fue ajustado a 3,5 utilizando una solución tampón 1,0 M glicina-HCl (pH 2,0). Este eluido diluido y ajustado de pH fue pasado a una columna de SP-Sepharosa (de la firma Pharmacia, con un diámetro de 26 mm y una altura de 3 cm) que había sido equilibrada previamente con solución tampón 100 mM glicina-HCl (pH 3,5) conteniendo 100 mM NaCl. Esta columna fue lavada utilizando solución tampón 100 mM glicina-HCl (pH 3,5) conteniendo 100 mM NaCl y eluida utilizando solución tampón 100 mM glicina-HCl (pH 3,5) conteniendo 300 mM NaCl, después del cual la fracción eluida de la elevación del pico de absorbancia de 280 nm a la bajada del mismo fue recogida y neutralizada inmediatamente con solución tampón fosfato 500 mM (pH 7,3) a un pH de 7,0, que se utilizó como producto de alta pureza.

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Ejemplo de Referencia 6

Concentración del producto de alta pureza utilizando fibras huecas de polisulfonas

El producto de alta pureza obtenido en el Ejemplo de Referencia 5 fue concentrado utilizando fibras huecas de polisulfona (de la empresa Asahi Chemical Industry Co., Ltd.), cada una de las cuales tenía una longitud de 1 m y había sido tratada con una solución tampón de fosfato 20 mM (pH 7,3) conteniendo 50 mM NaCl para provocar su humectación, de manera que se obtuvieron correspondientes licores concentrados, cada uno de ellos en una cantidad de 5 ml.

Ejemplo de Referencia 7

Intercambio de la solución tampón del producto de alta pureza utilizando columna de filtración de gel

Cada uno de los lotes de 5 ml del producto de alta pureza concentrado, obtenidos en el Ejemplo de Referencia 6, fueron cargados cada uno de ellos en columnas Sephacryl S-300 (de la empresa Pharmacia, con un diámetro de 16 mm y una altura de 90 cm) que habían sido equilibradas previamente con solución tampón de fosfato 20 mM (pH 7,3) conteniendo 50 mM NaCl. Esta columna fue tratada por un revelado con tampón de fosfato sódico 20 mM (pH 7,3) conteniendo 50 mM, después de lo cual se llevó a cabo elución fraccionada. Cada una de las fracciones fue examinada en cuanto a actividad de trombomodulina para acelerar la activación de proteína C por trombina, de acuerdo con el método de determinación 1, después de lo cual las fracciones que mostraron esta actividad fueron recogidas, después de lo que se obtuvieron productos de alta pureza con la solución tampón de intercambio.

En los Ejemplos y Ejemplos Comparativos que se facilitan a continuación, cada uno de los productos de trombomodulina de alta pureza se purificaron en orden de secuencia de los Ejemplos de Referencia 2, 4, 5(2), 6 y 7. Para ajustar la concentración de la solución tampón y para utilizar un componente tampón distinto de la solución tampón de fosfato sódico, se intercambió el componente tampón dializando el producto de alta pureza obtenido, tal como se ha indicado anteriormente, contra cada una de las soluciones de tampón respectivas. Por añadidura adicional de una solución tampón de concentración adecuada, se ajustó la concentración de la trombomodulina.

El ajuste del pH fue efectuado añadiendo una cantidad adecuada de ácido clorhídrico diluido o solución de hidróxido sódico.

La trombomodulina obtenida se confirmó que era soluble en agua para inyección, como mínimo, a una concentración de 6 mg/ml. También se confirmó que el peso molecular de la misma era de 66.000\pm10.000 (estado no reducido) determinado por los procedimientos que se indican a continuación:

Determinación del peso molecular

Utilizando un gel de electroforesis de gradiente (un gel de gradiente de poliacrilamida SDS con la marca PAGEL, 5/20% de la firma ATTO; dimensiones del gel de 90 x 73 x 1,0 mm), se llevó a cabo análisis por electroforesis en estado no reducido a 25ºC a una corriente constante de 20 mA de 90 minutos, en el que se utilizó un estándar de peso molecular [un equipo para electroforesis de peso molecular bajo: producto de Pharmacia, conteniendo en un solo vial fosforilasa b (peso molecular = 94.0000), albúmina de suero bovino (peso molecular = 67.000), ovalbúmina (peso molecular = 43.000), carbonilanidrasa (peso molecular = 30.000), un inhibidor de tripsina (peso molecular = 20.100), \alpha-lactalbúmina (peso molecular = 14.400) y sacarosa] para determinar el peso molecular de la trombomodulina. La coloración se llevó a cabo utilizando azul brillante Coomassie.

Ejemplo de referencia 8

Una trombomodulina soluble constituida a base de la secuencia de aminoácidos de los residuos desde el lugar 367 al 480 de la secuencia del listado SEQ ID NO: 1 fue obtenida de la manera siguiente: un plásmido obtenido de acuerdo con los procedimientos indicados en el ejemplo 1-(1)-(b) de la Patente japonesa Kokai Hei 5-213998 A se transfectó a una célula por el método descrito en el ejemplo 1-(2) de la misma, seguido de purificación por los procedimientos indicados en su ejemplo 3-(3), después de lo cual se llevó a cabo intercambio de solución tampón a efectos de obtener un producto de alta pureza de la trombomodulina soluble.

La trombomodulina soluble obtenida de esta manera fue confirmada como soluble en agua para inyección, como mínimo, a una concentración de 6 mg/ml. Se confirmó, además, que su peso molecular era de 25.000\pm5.000 (estado no reducido) según determinación por los procedimientos indicados anteriormente.

Para ajustar la concentración de la solución tampón y para utilizar un componente tampón distinto de la solución tampón de fosfato sódico, se intercambió el componente tampón dializando el producto de alta pureza obtenido, tal como se ha indicado anteriormente, contra cada solución tampón correspondiente. Añadiendo adicionalmente una solución tampón de una concentración adecuada, se ajustó la concentración de la trombomodulina. El ajuste de pH fue realizado por adición de la cantidad adecuada de ácido clorhídrico diluido o solución de hidróxido sódico.

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Ejemplo de referencia 9

Una trombomodulina soluble constituida a base de la secuencia de aminoácidos de los residuos desde el lugar 19 al lugar 516 del listado de secuencia SEQ ID NO: 2 se obtuvo de la manera siguiente: se siguió la técnica descrita en Method in Enzymology, 100, 468 (1983), Academic Press ("Métodos de enzimología"), de manera que un segmento de DNA que tenía la secuencia base del listado de secuencia SEQ ID NO: 3 fue sometido a una mutación específica de lugar utilizando un DNA sintético para mutación que tenía la secuencia base del listado de secuencia SEQ ID NO: 5 en un DNA cuyos códigos de la secuencia de aminoácidos del listado de secuencias SEQ ID NO: 2, seguido por los procedimientos de los ejemplos de referencia 1 a 7, obteniendo la trombomodulina soluble anteriormente identificada.

La trombomodulina soluble obtenida de este modo fue confirmada como soluble en agua para inyección como mínimo en la concentración de 6 mg/ml. Se confirmó, además, que su peso molecular era de 66.000\pm10.000 (estado no reducido), según determinación por los procedimientos antes indicados.

Para ajustar la concentración de la solución de tampón y para utilizar un componente tampón distinto de la solución de tampón fosfato sódico, el componente tampón fue intercambiado dializando el producto de alta pureza obtenido anteriormente contra cada solución tampón respectiva. Añadiendo adicionalmente una solución tampón de una concentración adecuada, se ajustó la concentración de la trombomodulina. El ajuste de pH se realizó añadiendo una cantidad adecuada de ácido clorhídrico diluido o solución de hidróxido sódico.

Ejemplo 1

Se preparó una solución acuosa a efectos de ajustar la concentración de la trombomokulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución de tampón de fosfato sódico a 0,2 mM, a lo que se añadió NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Se prepararon ampollas de productos para inyección en solución acuosa conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml (con un diámetro interior de 12 mm) y cerrando de manera estanca la ampolla. La "proporción de espacio de gas" en la "parte sometida a sacudidas" para ese producto era aproximadamente 35% del volumen.

Ejemplo 2

Se preparó una solución acuosa a efectos de ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución de tampón de fosfato sódico a 0,2 mM, a la que se añadió NaCl y aceite de ricino polioxitilen-hidrogenado (con la Marca HCO-60), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,1%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas del producto preparado acuoso para inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa antes obtenida en ampollas de 2 ml de capacidad y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 3

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de acetato sódico a 20 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 4

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de acetato sódico a 20 mM, a lo que se añadieron NaCl y un aceite de ricino polioxietilen-hidrogenado (de Marca HCO-60), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,1%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 5

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de acetato sódico a 200 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 6

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de acetato sódico a 20 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 5,5. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 7

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de acetato sódico a 20 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 5,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 8

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de acetato sódico a 2 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 9

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de acetato sódico a 2 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 5,5. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 10

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de acetato sódico a 2 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 5,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 11

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de acetato sódico a 0,2 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 12

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de acetato sódico a 0,2 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 5,5. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 13

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de acetato sódico a 0,2 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 5,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 14

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de fosfato sódico a 200 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 15

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de fosfato sódico a 200 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 5,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 16

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de fosfato sódico a 20 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 17

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de fosfato sódico a 20 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 5,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 18

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de fosfato sódico a 2 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 19

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de fosfato sódico a 2 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 5,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 20

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución tampón de fosfato sódico y de la solución de tampón de acetato sódico a 20 mM y 20 mM, respectivamente, a lo que se añadió NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH fue ajustado a 7,0. Se prepararon ampollas del preparado para inyección acuosa conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa antes mencionada en ampollas de 2 ml de capacidad y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 21

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución tampón de fosfato sódico y de la solución de tampón de acetato sódico a 20 mM y 20 mM, respectivamente, a lo que se añadió NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH fue ajustado a 6,5. Se prepararon ampollas del preparado para inyección acuosa conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa antes mencionada en ampollas de 2 ml de capacidad y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 22

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución tampón de fosfato sódico y de la solución de tampón de acetato sódico a 20 mM y 20 mM, respectivamente, a lo que se añadió NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH fue ajustado a 6,0. Se prepararon ampollas del preparado para inyección acuosa conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa antes mencionada en ampollas de 2 ml de capacidad y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 23

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución tampón de fosfato sódico y de la solución de tampón de acetato sódico a 20 mM y 20 mM, respectivamente, a lo que se añadió NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH fue ajustado a 5,5. Se prepararon ampollas del preparado para inyección acuosa conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa antes mencionada en ampollas de 2 ml de capacidad y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 24

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución tampón de fosfato sódico y de la solución de tampón de acetato sódico a 20 mM y 20 mM, respectivamente, a lo que se añadió NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH fue ajustado a 5,0. Se prepararon ampollas del preparado para inyección acuosa conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa antes mencionada en ampollas de 2 ml de capacidad y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 25

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de malonato sódico a 20 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 26

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de succinato sódico a 20 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 27

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de glutarato sódico a 20 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 28

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de tartarato sódico a 20 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 29

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de fumarato sódico a 20 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 30

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de malato sódico a 20 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 31

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de propionato sódico a 20 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 32

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución de tampón de citrato sódico a 20 mM, a lo que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 33

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución tampón de fosfato sódico y de la solución de tampón de propionato sódico a 20 mM y 20 mM, respectivamente, a lo que se añadió NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH fue ajustado a 6,0. Se prepararon ampollas del preparado para inyección acuosa conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa antes mencionada en ampollas de 2 ml de capacidad y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 34

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución tampón de fosfato sódico y de la solución de tampón de glutarato sódico a 20 mM y 20 mM, respectivamente, a lo que se añadió NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH fue ajustado a 6,0. Se prepararon ampollas del preparado para inyección acuosa conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa antes mencionada en ampollas de 2 ml de capacidad y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

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Ejemplo 35

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución tampón de fosfato sódico y de la solución de tampón de succinato sódico a 20 mM y 20 mM, respectivamente, a lo que se añadió NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH fue ajustado a 6,0. Se prepararon ampollas del preparado para inyección acuosa conteniendo la trombomodulina soluble llenando cada 2 ml de la solución acuosa antes mencionada en ampollas de 2 ml de capacidad y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 36

Se preparó una solución acuosa a efectos de ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución tampón de fosfato sódico y de la solución tampón de tartarato sódico a 20 mM y 20 mM, respectivamente, a lo que se añadió NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones ajustaron a 150 mM y 0,01% respectivamente, después de lo cual su pH fue ajustado a 6,0. Se prepararon ampollas de preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas de 2 ml de capacidad y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 37

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución tampón de fosfato sódico y de solución tampón de fumarato sódico a 20 mM y 20 mM respectivamente, a las que se añadió NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01% respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Se prepararon ampollas del preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas de 2 ml de capacidad y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 38

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución tampón de fosfato sódico y de solución tampón de malato sódico a 20 mM y 20 mM, respectivamente, a las que se añadió NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Se prepararon ampollas del preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa obtenida en lo anterior en ampollas de 2 ml de capacidad y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 39

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de propionato sódico a 2 mM, a la que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80) de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,1% respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Se prepararon ampollas del preparado acuoso de inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa anteriormente obtenida en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 40

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución de tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadieron NaCl y aceite de recino polioxietilén-hidrogenado (HCO-60), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 1%, respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Se prepararon ampollas del preparado de inyección acuoso conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa anteriormente obtenida en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 41

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución de tampón de fosfato sódico a 2 mM a las que se añadieron NaCl y aceite de recino polioxietilén-hidrogenado (HCO-60), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,1%, respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Se prepararon ampollas del preparado de inyección acuoso conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa anteriormente obtenida en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 42

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución de tampón de fosfato sódico a 2 mM, a las que se añadieron NaCl y polioxietilén(160)polioxipropilén(30) glicol (marca comercial: Pluronic F68), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 1%, respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Se prepararon ampollas del preparado de inyección acuoso conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa anteriormente obtenida en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 43

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadieron NaCl y polioxietilén(160)polioxipropilén(30)glicol (Pluronic F68), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,1% respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Se prepararon ampollas del preparado de inyección acuoso conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa anteriormente obtenida en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 44

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 20 mM, a la que se añadió polisorbato 80 (Tween 80) de manera que su concentración se ajustó a 0,01%, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Se prepararon ampollas del preparado de inyección acuoso conteniendo la trombomodulina soluble, llenando cada 2 ml de la solución acuosa anteriormente obtenida en ampollas con una capacidad de 2 ml y sellando la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 45

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 5%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 46

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10% ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 47

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 15%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 48

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 25%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 49

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo estándar de 1 ml fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 8,6 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 5%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 50

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo estándar de 1 ml fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 8,6 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 51

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo estándar de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 8,6 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 15%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 52

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo estándar de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 8,6 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 25%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

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Ejemplo 53

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 0,5 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 54

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 0,5 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 15%, ajustando el grado de vacío a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 55

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 0,5 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 30%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 56

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 0,5 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 40%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 57

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 0,5 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo estándar de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 8,6 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 40%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

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Ejemplo 58

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 0,5 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo estándar de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 8,6 mm y dotada cada una de ellas en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 50%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 59

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 0,5 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de 0,5 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, con aguja) con un diámetro interno de 4,6 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 60

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 0,5 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de 0,5 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, con aguja) con un diámetro interno de 4,6 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 15%, ajustando el grado de vacío a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 61

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 0,3 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de 0,5 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, con aguja) con un diámetro interno de 4,6 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 15%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 62

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 0,3 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de 0,5 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, con aguja) con un diámetro interno de 4,6 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 35%, ajustando el grado de vacío a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

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Ejemplo 63

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 0,3 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de 0,5 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, con aguja) con un diámetro interno de 4,6 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 50%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 64

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 5,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 65

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 5,5. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 66

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,5. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 67

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 7,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

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Ejemplo 68

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 20 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 69

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 200 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 70

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de acetato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado de manera estanca por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 71

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de acetato sódico a 20 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado de manera estanca por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 72

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de acetato sódico a 200 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado de manera estanca por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

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Ejemplo 73

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 0,1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado de manera estanca por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 74

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 0,3 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado de manera estanca por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 75

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 3 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 6 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 76

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 6 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 12 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado de manera estanca por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 77

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 3 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 6 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 0,5 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado de manera estanca por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 15%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

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Ejemplo 78

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 6 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 12 mM, a la que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 0,5 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 15%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 79

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80) de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado de manera estanca por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 80

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 3 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 6 mM, a las que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada cada una de ellas en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 81

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 6 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 12 mM, a la que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 0,5 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado de manera estanca por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 15%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 82

Se preparó una solución acuosa para ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 6 mg/ml y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 12 mM, a la que se añadieron NaCl y aceite de recino-polioxietileno (Cremophor EL), de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Cada 0,5 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes de tipo jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo delantero de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado de manera estanca por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó a 15%, ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado en forma de jeringa con llenado previo, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 83

Se preparó una solución acuosa a efectos de ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del Ejemplo de Referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución de tampón fosfato sódico y de la solución tampón de acetato sódico a 20 mM y 20 mM, respectivamente, a las que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Cada 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo fue llenado en recipientes en forma de jeringa de vIdrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la firma Becton-Dickinson, sin aguja) teniendo cada una un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en su extremo frontal de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue sellado de manera estanca por montaje en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó al 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de preparar una jeringa pre-llenada para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 84

Se preparó una solución acuosa a efectos de ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución de tampón de fosfato sódico y de tampón de propionato sódico a 20 mM y a 20 mM, respectivamente, a las que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se llenó 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo en recipientes de cristal de tipo jeringa (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la empresa Becton-Dickinson, sin aguja), cada una de las cuales tenía un diámetro interno de 6,3 mm y dotada en el extremo frontal de una caperuza de goma (elastómero básico goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue cerrado de forma estanca por colocación en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West)en la jeringa de manera que la proporción de espacio de gas se ajustó 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de preparar una jeringa pre-llenada para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 85

Se preparó una solución acuosa a efectos de ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución de tampón de fosfato sódico y de tampón de glutarato sódico a 20 mM y a 20 mM, respectivamente, a las que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se llenó 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo en recipientes de cristal de tipo jeringa (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la empresa Becton-Dickinson, sin aguja), cada una de las cuales tenía un diámetro interno de 6,3 mm y dotada en el extremo frontal de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue cerrado de forma estanca por colocación en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera que la proporción de espacio de gas se ajustó 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de preparar una jeringa pre-llenada para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 86

Se preparó una solución acuosa a efectos de ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución de tampón de fosfato sódico y de tampón de succinato sódico a 20 mM y a 20 mM, respectivamente, a las que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de la cual se ajustó su pH a 6,0. Se llenó 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo en recipientes de cristal de tipo jeringa (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la empresa Becton-Dickinson, sin aguja), cada una de las cuales tenía un diámetro interno de 6,3 mm y dotada en el extremo frontal de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue cerrado de forma estanca por colocación en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West)en la jeringa de manera que la proporción de espacio de gas se ajustó 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de preparar una jeringa pre-llenada para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 87

Se preparó una solución acuosa a efectos de ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución de tampón de fosfato sódico y de tampón de tartarato sódico a 20 mM y a 20 mM, respectivamente, a las que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se llenó 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo en recipientes de cristal de tipo jeringa (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la empresa Becton-Dickinson, sin aguja), cada una de las cuales tenía un diámetro interno de 6,3 mm y dotada en el extremo frontal de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue cerrado de forma estanca por colocación en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera que la proporción de espacio de gas se ajustó 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de preparar una jeringa pre-llenada para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

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Ejemplo 88

Se preparó una solución acuosa a efectos de ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución de tampón de fosfato sódico y de tampón de fumarato sódico a 20 mM y a 20 mM, respectivamente, a las que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se llenó 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo en recipientes de cristal de tipo jeringa (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la empresa Becton-Dickinson, sin aguja), cada una de las cuales tenía un diámetro interno de 6,3 mm y dotada en el extremo frontal de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo fabricada por la firma West) y el recipiente fue cerrado de forma estanca por colocación en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera que la proporción de espacio de gas se ajustó 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de preparar una jeringa pre-llenada para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 89

Se preparó una solución acuosa a efectos de ajustar la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución de tampón de fosfato sódico y de tampón de malato sódico a 20 mM y a 20 mM, respectivamente, a las que se añadió NaCl de manera que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual se ajustó su pH a 6,0. Se llenó 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo en recipientes de cristal de tipo jeringa (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la empresa Becton-Dickinson, sin aguja), cada una de las cuales tenía un diámetro interno de 6,3 mm y dotada en el extremo frontal de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue cerrado de forma estanca por colocación en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera que la proporción de espacio de gas se ajustó 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de preparar una jeringa pre-llenada para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 90

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 9 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 20 mM, a la que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80) de forma que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Se prepararon ampollas del preparado acuoso para inyección conteniendo la trombomodulina soluble, llenando 2 ml de la solución acuosa obtenida en ampollas de 2 ml de capacidad y cerrando de forma estanca la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo 91

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 9 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de forma que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual se ajustó el pH a 6,0. Se llenó 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo en recipientes de cristal de tipo jeringa (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la empresa Becton-Dickinson, sin aguja), cada una de las cuales tenía un diámetro interno de 6,3 mm y dotada en el extremo frontal de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue cerrado de forma estanca por colocación en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera que la proporción de espacio de gas se ajustó 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de preparar una jeringa pre-llenada para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo 92

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 8 (compuesta por los residuos aminoácidos de los lugares 367 al 480 del listado de secuencia SEQ ID NO:1) en 1 mg/ml y la concentración del tampón de fosfato sódico a 20 mM, a la que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80) de manera que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, de manera que su pH fue ajustado a 6,0. Se prepararon ampollas de inyección acuosa conteniendo la trombomodulina soluble, llenando 2 ml de la solución acuosa obtenida en ampollas con una capacidad de 2 ml y cerrando la ampolla de forma estanca (proporción de espacio de gas=35%).

Ejemplo Comparativo 1

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 20 mM, a la que se añadió NaCl de forma que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 7,3. Se prepararon ampollas de solución acuosa conteniendo la trombomodulina soluble llenando 2 ml de la solución acuosa obtenida en ampollas de 2 ml de capacidad y cerrando de forma estanca la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

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Ejemplo Comparativo 2

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 20 mM, a la que se añadió NaCl de forma que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Se prepararon ampollas de solución acuosa conteniendo la trombomodulina soluble llenando 2 ml de la solución acuosa obtenida en ampollas de 2 ml de capacidad y cerrando de forma estanca la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo Comparativo 3

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 0,2 mM, a la que se añadió NaCl de forma que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Se prepararon ampollas de solución acuosa conteniendo la trombomodulina soluble llenando 2 ml de la solución acuosa obtenida en ampollas de 2 ml de capacidad y cerrando de forma estanca la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo Comparativo 4

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 20 mM, a la que se añadió NaCl de forma que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Se prepararon ampollas de solución acuosa conteniendo la trombomodulina soluble llenando 2 ml de la solución acuosa obtenida en ampollas de 2 ml de capacidad y cerrando de forma estanca la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo Comparativo 5

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 200 mM, a la que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80) de forma que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 7,3. Se prepararon ampollas del preparado acuoso para inyección conteniendo la trombomodulina soluble llenando 2 ml de la solución acuosa obtenida en ampollas de 2 ml de capacidad y cerrando de forma estanca la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo Comparativo 6

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 20 mM, a la que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80) de forma que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 7,3. Se prepararon ampollas del preparado acuoso para inyección conteniendo la trombomodulina soluble llenando 2 ml de la solución acuosa obtenida en ampollas de 2 ml de capacidad y cerrando de forma estanca la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo Comparativo 7

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadieron NaCl y polisorbato 80 (Tween 80) de forma que sus concentraciones se ajustaron a 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 7,3. Se prepararon ampollas del preparado acuoso para inyección conteniendo la trombomodulina soluble llenando 2 ml de la solución acuosa obtenida en ampollas de 2 ml de capacidad y cerrando de forma estanca la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo Comparativo 8

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y las concentraciones de la solución tampón de fosfato sódico y de tampón de acetato sódico a 20 mM y 20 mM, respectivamente, a las que se añadió NaCl y polisorbato 80 (Tween 80) de manera que sus concentraciones se ajustaron en 150 mM y 0,01%, respectivamente, después de lo cual su pH se ajustó a 7,3. Se prepararon ampollas para inyección acuosa conteniendo trombomodulina soluble preparadas por llenado de 2 ml de la solución acuosa antes mencionada en ampollas de 2 ml de capacidad y cerrando la ampolla de forma estanca (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo Comparativo 9

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de forma que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual se ajustó el pH a 7,3. Se prepararon ampollas de inyección acuosa conteniendo la trombomodulina soluble llenando 2 ml de la solución anteriormente mencionada en ampollas de 2 ml de capacidad y cerrando de forma estanca la ampolla. En este caso, la proporción de espacio de gas en la parte objeto de sacudida fue de 35%.

Ejemplo Comparativo 10

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de forma que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual se ajustó el pH a 7,3. Se llenó 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo en recipientes de cristal de tipo jeringa (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la empresa Becton-Dickinson, sin aguja), cada una de las cuales tenía un diámetro interno de 6,3 mm y dotada en el extremo frontal de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue cerrado de forma estanca por colocación en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera que la proporción de espacio de gas se ajustó 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de preparar una jeringa pre-llenada para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo Comparativo 11

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de forma que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual se ajustó el pH a 6,0. Se llenó 0,5 ml de la solución acuosa preparada de este modo en recipientes de cristal de tipo jeringa (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la empresa Becton-Dickinson, sin aguja), cada una de las cuales tenía un diámetro interno de 8,6 mm y dotada en el extremo frontal de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue cerrado de forma estanca por colocación en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera que la proporción de espacio de gas se ajustó 60%, ajustando el grado de vacío, a efectos de preparar una jeringa pre-llenada para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo Comparativo 12

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 2 mM, a la que se añadió NaCl de forma que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual se ajustó el pH a 6,0. Se llenó 0,5 ml de la solución acuosa preparada de este modo en recipientes de cristal de tipo jeringa (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la empresa Becton-Dickinson, sin aguja), cada una de las cuales tenía un diámetro interno de 8,6 mm y dotada en el extremo frontal de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue cerrado de forma estanca por colocación en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera que la proporción de espacio de gas se ajustó 70%, ajustando el grado de vacío, a efectos de preparar una jeringa pre-llenada para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo Comparativo 13

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 20 mM, a la que se añadió NaCl de forma que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual se ajustó el pH a 7,3. Se llenó 1 ml de la solución acuosa preparada de este modo en recipientes de cristal de tipo jeringa (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la empresa Becton-Dickinson, sin aguja), cada una de las cuales tenía un diámetro interno de 6,3 mm y dotada en el extremo frontal de una caperuza de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue cerrado de forma estanca por colocación en vacío de un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera que la proporción de espacio de gas se ajustó 10%, ajustando el grado de vacío, a efectos de preparar una jeringa pre-llenada para inyección conteniendo la trombomodulina soluble.

Ejemplo Comparativo 14

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 9 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 20 mM, a la que se añadió NaCl de forma que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Se prepararon ampollas de solución acuosa conteniendo la trombomodulina soluble llenando 2 ml de la solución acuosa obtenida en ampollas de 2 ml de capacidad y cerrando de forma estanca la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

Ejemplo Comparativo 15

Se preparó una solución acuosa ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 8 a 1 mg/ml y la concentración de solución tampón de fosfato sódico a 20 mM, a la que se añadió NaCl de forma que su concentración se ajustó a 150 mM, después de lo cual su pH se ajustó a 6,0. Se prepararon ampollas de solución acuosa conteniendo la trombomodulina soluble llenando 2 ml de la solución acuosa obtenida en ampollas de 2 ml de capacidad y cerrando de forma estanca la ampolla (proporción de espacio de gas = 35%).

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Ejemplo de Pruebas 1

Se determinó el porcentaje de mantenimiento de la actividad (a saber, actividad residual porcentual) para cada uno de los preparados para inyección acuosa de trombomodulina de los ejemplos 1 a 4 y de los ejemplos comparativos 1 a 4 para estimación de las estabilidades con respecto a la acción del calor de acuerdo con los procedimientos del método de Examen 1 que se indica más adelante. Los preparados que tienen valores de actividad residual mínima de 66% determinada por el método de examen 1, después de haber sido mantenidos a 50ºC durante 96 horas, se evalúan como "aprobados". De acuerdo con la predicción del gráfico de Arrhenius, los preparados que tienen actividad residual mínima de 66% se supone que tienen una vida en la que el preparado tiene una actividad residual mínima de 80% cuando se conserva a 5ºC, de 3 años. Por otra parte, se llevó a cabo la evaluación de la estabilidad con respecto a sacudidas de acuerdo con los procedimientos de método de examen 2 que se indica más adelante. El preparado que fue evaluado satisfactorio tanto para los métodos de examen 1 como 2 se evalúa de manera integral como "apropiado" mientras que otros son descartados como "no apropiados". Los resultados se resumen en la Tabla 1.

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Tal como se ha mostrado en la Tabla 1, todos los preparados tanto con solución tampón de fosfato sódico como solución tampón de acetato sódico tenían actividades residuales porcentuales superiores a 66% a 6,0 en la prueba de estabilidad con respecto al calor, mientras que el preparado del ejemplo comparativo 1 con pH 7,3 tenía un valor inferior a 66%. Cuando se encontraba presente un tensoactivo, a saber, Tween 80 ó HCO-60, se obtuvo un preparado acuoso para inyección que no se enturbiaba en la prueba de estabilidad a las sacudidas y que se evaluó integralmente como "apropiado".

Método de Examen 1

Prueba de estabilidad con respecto al calor (calentando a 50ºC durante 96 horas)

El preparado acuoso para inyección a comprobar fue sometido a tratamiento por calor a 50ºC durante 96 horas, después de lo cual se evaluó la actividad de su trombomodulina a efectos de evaluar la tasa de conservación de actividad (porcentaje de actividad residual) por comparación del valor de actividad observada del preparado de inyección en caliente tratado con el valor original del preparado almacenado en congelación sin someter a tratamiento térmico que se supuso de 100%.

La determinación de la actividad de la trombomodulina de un preparado acuoso se lleva a cabo observando la función del preparado para acelerar la activación de la proteína C por trombina (ensayo APC). De este modo, 5 \mul de una solución de muestra, que fue preparada de manera adecuada a partir de un preparado para inyección acuosa conteniendo trombomodulina soluble de forma que la trombomodulina estaba contenida en aquélla, por dilución adecuada, en una cantidad comprendida entre 0,35 a 1,4 ng, se añaden a 37,5 \mul de una solución tampón 50 mM Tris-HCl (pH = 8,5) conteniendo 100 mM NaCl, 3 mM cloruro cálcico, 0,1% de albúmina de suero bovino (suministrada por la firma Sigma) y 0,225 NIHU de trombina humana (suministrada por la firma Sigma) y la mezcla se deja en reposo durante 15 minutos a 37ºC añadiéndose a la misma 7,5 \mul de proteína bovina C de unos 300 \mug/ml (suministrada por la firma Life Technologies) y la mezcla resultante se deja en reposo durante otros 30 minutos a 37ºC, a efectos de activar la proteína C. A continuación, se añaden aproximadamente 7,5 \mul de una solución acuosa que contiene aproximadamente 100 \mul/ml de una heparina (suministrada por Wako Pure Chemical Ind., Ltd.) y aproximadamente 6 \mul/ml de Antitrombina III (de la firma Life Technologies) para terminar la reacción de la mezcla. A esta mezcla se añaden a continuación 500 \mul de una solución que contiene 100 \mug/ml de un sustrato sintético (Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA) y la mezcla resultante se mantiene en reposo durante 20 minutos a 37ºC. La reacción de cizalladura del sustrato se termina añadiendo 50 \mul de ácido acético. La mezcla de reacción es examinada observando la intensidad de fluorescencia con una longitud de onda de agitación de 380 nm y con una longitud de onda de emisión de 440 nm, utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia para determinar la cantidad de la proteína C activada existente, después de lo cual se calcula la actividad de la trombomodulina por comparación con un preparado de referencia con actividad de trombomodulina estándar.

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Método de Examen 2

Prueba de estabilidad contra sacudidas (con sacudidas de 180 desplazamientos alternativos por minuto)

Un preparado para inyección acuoso a comprobar es sometido a un tratamiento de sacudidas en un aparato de sacudidas a temperatura constante de 25ºC con una amplitud de 5 cm y un régimen alternativo de 180 vueltas por minuto durante 1 mes, a efectos de observar cambios en el aspecto antes y después del tratamiento por sacudidas. En caso necesario, se determinó la turbidez (absorbancia a 650 nm) y la actividad residual de la trombomodulina. La dirección del movimiento alternativo se ajusta de forma que sea paralelo al eje longitudinal del recipiente de prueba. Los procesos prácticos para la determinación de la actividad de la trombomodulina son iguales que el método de examen 1.

Ejemplo de Pruebas 2

Se llevaron a cabo pruebas por métodos de examen 1 y 2 para preparados de inyección acuosa de los ejemplos 3, 5 a 13 y ejemplo comparativo 1, para evaluaciones globales de los mismos de manera similar. Los resultados se resumen en la tabla 2.

24

\newpage

Tal como se muestra en la tabla 2 no hubo influencia debida a alteraciones de la concentración de solución tampón al variar la concentración de la solución de tampón de acetato sódico dentro de una gama de 0,2 a 200 mM y todos los preparados acuosos tenían actividad residual superior a 66% en la prueba de estabilidad al calor. En presencia de 0,01% de Tween 80, no se observó apariencia de turbidez en la prueba de estabilidad a las sacudidas y se obtuvieron preparaciones de inyección acuosas que mostraban la evaluación global "apropiada".

Ejemplo de Pruebas 3

Se llevaron a cabo pruebas por los métodos de examen 1 y 2 para los preparados de inyección acuosa de los ejemplos 14 a 19 y de los ejemplo comparativos 5 a 7, para determinar las evaluaciones globales para los mismos de manera similar. Los resultados se resumen en la tabla 3.

1

Tal como se muestra en la tabla 3, se recononoció influencia debido a la alteración de la concentración de la solución tampón a pH 7,3, al variar la concentración de solución tampón de fosfato sódico dentro de una amplia gama de 2 a 200 mM, pero todos los preparados acuosos tenían actividades residuales superiores a 66% en la prueba de estabilidad al calor, siempre que el pH de la preparación se encontrara en una gama de 5,0-6,0. En presencia de 0,01% de Tween 80, no se presentó turbidez en la prueba de estabilidad frente a sacudidas y se obtuvieron preparados acuosos por inyección que mostraban la evaluación global de "apropiados".

Ejemplo de Pruebas 4

Se llevaron a cabo pruebas por los métodos de examen 1 y 2 para los preparados acuosos para inyección de los ejemplos 20 a 24 y de los ejemplos comparativos 1 a 8, determinando de esta manera las evaluaciones globales para los mismos de manera similar. Los resultados se resumen en la tabla 4.

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TABLA 4

2

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Tal como se muestra en la tabla 4, todos los preparados acuosos para inyección, cuyos valores de pH se encuentran en una gama de 5,0-7,0, tenían actividades residuales superiores a 66% en la prueba de estabilidad térmica, cuando las concentraciones de componentes tampón, es decir, solución tampón de fosfato sódico y solución tampón de acetato sódico, se habían ajustado ambas a 20 mM y el pH del preparado acuoso variaba dentro de una gama de 5,0 a 7,3. Dentro de la gama de pH de 5,5-6,5, los preparados acuosos tenían actividades residuales superiores a 73% en la prueba de estabilidad térmica, que se supone que correspondían a una vida del preparado almacenado 5ºC, conservando como mínimo el 80% de su actividad original. En particular, las actividades residuales para los preparados con valores de pH de 5,5 y 6,0 eran superiores al 80%. Por otra parte, la actividad residual era inferior a 66% a pH 7,3 (ejemplos de referencia 1 y 8). En presencia de 0,01% de Tween 80, no apareció turbidez en la prueba de estabilidad a las sacudidas y los preparados acuosos para inyección mostraron una evaluación global "apropiado".

Ejemplo de Pruebas 5

Se llevaron a cabo pruebas por los métodos de examen 1 y 2 para los preparados de inyección acuosa de los ejemplos 25 a 32 y los ejemplos comparativos 1 y 2, para determinar de esta manera las evaluaciones globales para los mismos de manera similar. Los resultados se resumen en la tabla 5.

3

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Tal como se ha mostrado en la tabla 5, todas las actividades residuales fueron superiores a 66% cuando el pH se ajustó a 6,0, aunque la solución tampón se cambió a la de 20 mM, variando la sal de ácido carboxílico. En presencia de 0,01% de Tween 80, no apareció turbidez en la prueba de estabilidad a las sacudidas y los preparados de inyección de tipo acuoso mostraron, de manera general, la evaluación "apropiado".

Ejemplo de Pruebas 6

Se llevaron a cabo pruebas mediante los métodos de examen 1 y 2 para los preparados acuosos de inyección de los ejemplos 33 a 38 y de los ejemplos comparativos 1 y 2, para determinar las evaluaciones globales para los mismos de manera similar. Los resultados se resumen en la tabla 6.

4

Tal como se muestra en la tabla 6, todas las actividades residuales fueron superiores a 66% cuando el pH se ajustó a 6,0, aunque se añadiera un componente tampón con una sal de ácido carboxilico variable a la solución de tampón fosfato sódico. En presencia de 0,01% de Tween 80, no apareció turbidez en la prueba de estabilidad por sacudidas y se obtuvieron preparados acuosos para inyección que mostraban la evaluación global "apropiado".

Ejemplo de Pruebas 7

Se llevaron a cabo pruebas mediante los métodos de examen 1 y 2 para los preparados de inyección de tipo acuoso de los ejemplos 18, 39 a 43 y 44 y del ejemplo comparativo 9, para determinar de esta manera las evaluaciones globales para los mismos de manera similar. Los resultados se resumen en la tabla 7.

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(Tabla pasa a página siguiente)

5

Tal como se muestra en la tabla 7, el preparado acuoso sin tensoactivo (ejemplo comparativo 9) mostró turbidez en la prueba de estabilidad a las sacudidas al someter a sacudidas la muestra de pruebas con tensoactivo variable por su concentración, mientras que, en las muestras con tensoactivo, se impidió la aparición de turbidez. Se obtuvo un efecto suficiente con una concentración de 0,1%, para el tensoactivo con la marca Tween 80, y 0,1%, para los tensoactivos con las marcas HCO-60 y Pluronic F68. No se observó influencia del cloruro sódico.

Ejemplo de Pruebas 8

Se llevaron a cabo pruebas por métodos de examen 1 y 2 para los preparados acuosos para inyección de los ejemplos 45 a 63 y de los ejemplos comparativos 10 a 12, para determinar de esta manera las evaluaciones globales para los mismos de forma similar. El resultado se resume en la tabla 8.

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(Tabla pasa a página siguiente)

6

7

Tal como se muestra en la tabla 8, no apareció turbidez en la prueba de estabilidad a las sacudidas cuando la proporción de espacio de gas en la partes sometidas a sacudidas era inferior a 50% del volumen, mientras que, en las muestras de los ejemplos de referencia 11 y 12, en los que la proporción de espacio de gas es 60% volumen y 70% volumen, respectivamente, se observó la aparición de turbidez en las sacudidas. En el caso de ajustar el pH al valor 6,0, la actividad residual en la prueba de estabilidad térmica fue superior a 66% y se obtuvieron preparados para inyección acuosa que mostraban una evaluación global de "apropiado".

Ejemplo de Pruebas 9

Las pruebas llevadas a cabo por métodos de examen 1 y 2 para los preparados acuosos de inyección de los ejemplos 46 y 64 a 72 y del ejemplo comparativo 10, para determinar las evaluaciones globales para los mismos de manera similar. Los resultados se resumen en la tabla 9.

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(Tabla pasa a página siguiente)

8

Tal como se ha mostrado en la tabla 9, no hay influencia por la alteración de concentración de la solución tampón de fosfato sódico o la solución tampón de acetato sódico dentro de una amplia gama de 2-200 mM y todas las actividades residuales fueron superiores a 66% en la prueba de estabilidad al calor cuando el pH se ajustó dentro de una gama de 5,0-7,0. En el caso en que la proporción de espacio de gas se ajustó a 10%, no apareció turbidez en la prueba de estabilidad a las sacudidas y los preparados acuosos para inyección mostraron una evaluación global de "apropiado".

Ejemplo de Pruebas 10

Se llevaron a cabo pruebas por métodos de examen 1 y 2 para los preparados acuosos por inyección de los ejemplos 46, 73 a 82 y 90 a 92 y los ejemplos comparativos 13 a 15, para determinar de manera global las evaluaciones para los mismos de manera similar. Los resultados se resumen en la tabla 10.

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(Tabla pasa a página siguiente)

9

10

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Tal como se muestra en la tabla 10, no se apreció influencia en el cambio de la concentración de trombomodulina como mínimo en una gama de 0,1 mg/ml y 6 mg/ml y todas las actividades residuales fueron superiores a 66% cuando se ajustó el valor del pH a 6,0. Cuando la proporción de espacio de gas se ajustó a 10-15%, no apareció turbidez en la prueba de estabilidad a las sacudidas y los preparados acuosos por inyección obtenidos mostraron de modo global la evaluación "apropiado".

De acuerdo con el ejemplo comparativo 14, se confirmó que existe un problema en la estabilidad frente a las sacudidas también en la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 9. Por los resultados de los ejemplos 90 y 91, se confirmó que se obtenía también un preparado acuoso para inyección de trombomodulina soluble superior en la estabilidad térmica y en la estabilidad a las sacudidas de acuerdo con la presente invención utilizando la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 9.

En el ejemplo 92, en el que se utilizó la trombomodulina soluble del Ejemplo de referencia 8, se obtuvo una preparación acuosa para inyección superior en cuanto a estabilidad al calor y a estabilidd en agitación.

Ejemplo de Pruebas 11

Se llevaron a cabo pruebas por el método de examen 3 en cuanto a estabilidad acelerada que se indica a continuación, para los preparados acuosos para inyección de los ejemplos 1, 3 y 79 a 82, así como los ejemplos comparativos 6 y 13, en los que se determinó la actividad residual después del almacenamiento a 20ºC. Los resultados se resumen en la Tabla 11.

TABLA 11

11

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Tal como se muestra en la tabla 11, los preparados acuosos para inyección de los ejemplos 1, 3 y 79 a 82 eran estables, mientras que los de los ejemplos comparativos 6 y 13 mostraron disminución de la actividad residual a un 52,4% y 63,2%, respectivamente, después del almacenamiento a 20ºC durante 6 meses.

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Método de examen 3

Prueba de estabilidad acelerada (almacenamiento a 20ºC durante 6 meses)

El preparado acuoso para inyección a comprobar es almacenado a 20ºC durante 6 meses, después de lo cual se determina la actividad residual de trombomodulina. La determinación de la actividad de la trombomodulina se lleva a cabo de igual manera que en el método de examen 1.

Ejemplo de Pruebas 12

Se llevaron a cabo pruebas por el método de examen 4 en cuanto estabilidad a largo plazo, tal como se indica a continuación, para los preparados de inyección acuosa de los ejemplos 1 y 3, en los que la actividad residual de la trombomodulina fue determinada después de almacenamiento a 5ºC. La determinación de la actividad de la trombomodulina es llevada a cabo de la misma manera que en el método de examen 1. Los resultados se resumen en la Tabla 12.

TABLA 12

12

Los preparados acuosos de los ejemplos 1 y 3 no mostraron disminución en la actividad de trombomodulina después de almacenamiento a 5ºC durante 9 meses.

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Método de examen 4

Prueba de estabilidad a largo plazo (almacenamiento 5ºC durante 9 meses)

El preparado acuoso para inyección a comprobar es almacenado a 5ºC durante 9 meses, después de lo que se determina la actividad residual de trombomodulina. La determinación de la actividad de trombomodulina es llevada a cabo de igual manera que en el método de examen 1.

Ejemplo de Pruebas 13

Se administró una solución de pruebas o preparado de pruebas, que se indica a continuación, a ratas macho SD de 9-10 semanas de edad a través de la vena de la cola o ruta subcutánea en el dorso, y se llevó a cabo la recogida de sangre a un intervalo adecuado.

1) Soluciones de prueba para inyección intravenosa

Se prepararon soluciones de prueba para inyección intravenosa ajustando las concentraciones de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 en el producto de alta pureza del mismo a 10 \mug/ml, 50 \mug/ml y 250 \mug/ml, respectivamente, y la concentración de la solución tampón de fosfato sódico a 10 mM, y añadiendo a la misma NaCl a una concentración de 150 mM y polisorbato 80 (Twenn 80) a una concentración de 0,01%, después de lo que se ajustó el pH a 7,4. Estas soluciones de prueba fueron administradas cada una de ellas a la dosis indicada en la tabla 13.

2) Soluciones de prueba A para inyección subcutánea

Se prepararon soluciones de prueba ajustando las concentraciones de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 en el producto de alta pureza de las mismas a 10 \mug/ml, 50 \mug/ml y 250 \mug/ml, respectivamente, y la concentración del tampón de fosfato sódico a 10 mM, y añadiendo a la misma NaCl para concentración de 150 mM, polisorbato 80 (Tween 80) a una concentración de 0,01%, benzil alcohol de farmacopea a una concentración de 40 mg/ml y metil p-oxibenzoato a una concentración 0,3%, después de lo que se ajustó el pH 7,4 para obtener las soluciones de prueba A. Estas soluciones de pruebas de administraron, cada una de ellas, a las dosis indicadas en la tabla 13.

3) Soluciones de pruebas B para inyección subcutánea

Se prepararon soluciones de prueba ajustando las concetraciones de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 en su producto de alta pureza a 10 \mug/ml, 50 \mug/ml y 250 \mug/ml, respectivamente, y la concentración de la solución de tampón de fosfato sódico a 10 mM, y añadiendo a la misma NaCl a una concentración de 150 mM, polisorbato 80 (Tween 80) a una concentración de 0,01%, hidroclornidrato de procaína de farmacopea a una concentración de 40 mg/ml y metil p-oxibenzoato a una concentración de 0,3%, después de lo cual el pH se ajustó a 7,4 para obtener solución de prueba B.

4) Preparado de pruebas C para inyección subcutánea

Se preparó una solución de prueba por ajuste de concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 en el producto de alta pureza del mismo a 250 \mug/ml y la concentración de la solución de tampón de fosfato sódico a 2 mM y añadiendo a la misma NaCl a una concentración de 150 mM, después de lo cual el pH se ajustó a 6,0. Se llenó 1 ml de esta solución en cada uno de los recipientes en forma de jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la empresa Becton-Dickison, sin aguja), con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada, cada una de ellas, en el extremo delantero de una caperuza de goma (elastomero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue cerrado de forma estanca acoplando por vacío un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromubutilo fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó 10% ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado para una jeringa pre-llenada, para inyección, conteniendo la trombomodulina soluble. Acoplando a este preparado pre-llenado para inyección una varilla tipo pistón (pistón de 1 ml de largo de tipo jeringa realizado en polipropileno, suministrado por la empresa Becton-Dickison) y una aguja de inyección (26 G x ½, suministrada por la empresa Terumo), se obtuvo un preparado de prueba C listo para utilización para inyección subcutánea.

5) Preparado de prueba D para inyección subcutánea

Se preparó una solución de pruebas ajustando la concentración de la trombomodulina soluble del ejemplo de referencia 7 en el producto de alta pureza de la misma en 250 \mug/ml y la concentración de la solución de tampón fosfatos sódico a 2 mM, y añadiendo a la misma NaCl a una concentración de 150 mM y polisorbato 80 (Tween 80) a una concentración de 0,01%, en la que se ajusta el pH a 6,0. Se llenó 0,5 ml de esta solución en cada uno de los recipientes en forma de jeringa de vidrio (jeringa de tipo largo de 1 ml, fabricada por la empresa Becton-Dickison, sin aguja), con un diámetro interno de 6,3 mm y dotada cada una de ellas en el extremo delantero de una caperuza de goma (elastomero básico: goma de bromobutilo, fabricada por la firma West) y el recipiente fue cerrado de forma estanca acoplando por vacío un tapón de goma (elastómero básico: goma de bromubutilo, fabricada por la firma West) en la jeringa, de manera tal que la proporción de espacio de gas se ajustó 15% ajustando el grado de vacío, a efectos de conseguir un preparado para una jeringa pre-llenada, para inyección conteniendo la trombomodulina soluble. Acoplando a este preparado pre-llenado para inyección una varilla tipo pistón (pistón de 1 ml de largo de tipo jeringa realizado en propileno, suministrado por la empresa Becton-Dickison) y una aguja de inyección (26 G x ½, suministrada por la empresa Terumo), se obtuvo un preparado de prueba D listo para utilización para inyección subcutánea.

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(Tabla pasa a página siguiente)

13

La concentración de la trombomodulina soluble en la sangre se observó después de administración al determinar por ensayo inmunoabsorbente relacionado con las encimas (ELISA) en cada momento cuyo resultado se muestra en la figura 1. Para los procesos prácticos de la determinación de trombomodulina se utilizó una técnica conocida de ELISA, en el que R4B6 como anticuerpo de fase estacionaria y R4D1 como anticuerpo de etiquetado fueron acoplados (Patente Japonesa Kokai Hei 6-205692 A). Se indican en la tabla 14 algunos parámetros farmacocinéticos basados en el curso de variación de los valores de la concentración de trombomodulina en la sangre.

14

Tal como se muestra en la tabla 14, se descubrió que el tiempo de permanencia media (MRT) es superior para administración por ruta subcutánea que para administración por ruta intravenosa en todas las dosis. Además se confirmó también, tal como se aprecia en la figura 1, el tiempo de duración para mantener la concetración en la sangre es notablemente más largo para la administración subcutánea que para la administración intravenosa. Se confirmó que los valores T1/2 se pueden extender hasta 16 horas o más por administración subcutánea.

En los grupos administrados con la solución de pruebas de inyección B y con los preparados subcutáneos C y D, se obtuvieron casi los mismos resultados que en la solución de pruebas de inyección subcutánea A. Se confirmó, a partir de estos hechos, que se consigue la mejor función de mantener un nivel más efectivo de la concentración de trombomodulina en la sangre a efectos de terapia por administración subcutánea en comparación con la ruta de administración intravenosa como en práctica convencional. El valor de la disponibilidad biológica (BA) después de la administración subcutánea se observó que era mayor del 50% para todas las dosis, indicando una mejor capacidad de absorción.

Cuando se variaron los valores de pH de las soluciones de prueba para administración subcutánea en una gama de 3,0-7,4, no se observó diferencia especial en la concentración en la sangre. Al alterar la intensidad de iones de la solución de pruebas a administrar (variación de la concentración de NaCl en una gama de 0 a 4,8%), no se observó cambio especial en la concentración del agente efectivo en la sangre.

<110> ASAHI KASEI KOGYO KABUSHIKI KAISHA

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<120> Método para el mantenimiento de la calidad de un preparado acuoso de trombomodulina para inyección a lo largo de su almacenamiento/transporte.

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<130> 98947842.5

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<140> 98947842.5

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<141> 1998-10-13

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<150> JP9/281659

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<151> 1997-10-15

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<150> JP9/308523

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<151> 1977-11-11

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<160> 5

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<170> PatenIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 516

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: secuencias parciales de aminoácidos de una trombomodulina humana.

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<400> 1

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15

16

17

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<210> 2

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<211> 516

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<212> PRT

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<213>

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<220> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencias parciales de aminoácidos de una trombomodulina humana.

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<400> 2

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18

19

20

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<210> 3

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<211> 1548

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencias parciales de aminoácidos de una trombomodulina humana.

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<400> 3

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21

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<210> 4

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<211> 1548

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencias parciales de aminoácidos de una trombomodulina humana.

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<400> 4

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22

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<210> 5

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: DNA sintético para mutación.

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

aatgtggcgg gcaagggccg a

\hfill

21

Claims (22)

1. Utilización de una solución acuosa que tiene un valor de pH en una gama de 5 a 7,0 y que contiene una trombomodulina soluble en una cantidad efectiva y un componente o componentes tampón que muestran acción tampón en una gama de pH entre 5 y 7,0 en la que la solución acuosa de trombomodulina tiene una de las siguientes características a) o b) a saber:

a)

que contiene además un tensoactivo y ha sido llenada asépticamente en un contenedor, o bien

b)

que consiste en un preparado en jeringa pre-llenada de manera aséptica en un contenedor en forma de jeringa, excluyendo cualquier espacio de gas sustancial en su interior, para mantener la calidad de un preparado acuoso de trombomodulina para inyección en forma de líquido no congelado o no liofilizado a lo largo de su periodo de almacenamiento y transporte.

2. Utilización, según la reivindicación 1, en la que el preparado acuoso de trombomodulina para inyección se caracteriza porque ha sido preparado como solución acuosa que tiene un valor de pH comprendido entre 5 y 7,0 y que contiene (a) trombomodulina soluble en una cantidad efectiva, componente o componentes tampón que muestran una acción tampón en una gama de pH entre 5 y 7,0 y un tensoactivo siendo llenado en un contenedor asépticamente.

3. Utilización, según la reivindicación 1, en la que el preparado acuoso de trombomodulina para inyección se caracteriza porque es preparado como solución acuosa que tiene un valor de pH en una gama de 5 a 7,0 y que contiene una trombomodulina soluble en una cantidad efectiva y un componente o componentes tampón que muestran una acción tampón en una gama de pH entre 5 y 7,0 y que consiste en un preparado en jeringa pre-llenada de manera aséptica en un contenedor en forma de jeringa, excluyendo cualquier espacio de gas en su interior.

4. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el preparado acuoso de trombomodulina para inyección se caracteriza porque es preparado en solución acuosa que tiene un valor de pH en una gama de 5 a 7,0 y que contiene una trombomodulina soluble en una cantidad efectiva, componente o componentes tampón que muestran una acción tampón en una gama de pH entre 5 y 7,0 y un tensoactivo y que consiste en un preparado en jeringa pre-llenada de manera aséptica en un contenedor en forma de jeringa, excluyendo cualquier espacio de gas sustancial en su interior.

5. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la trombomodulina soluble es un péptido que se caracteriza porque tiene un peso molecular de 66.000 \pm 10.000, determinado por electroforesis de SDS-gel de poliacrilamida en estado no reducido, muestra una función de aceleración de la activación de la proteina C por trombina y es soluble en agua para inyección como mínimo en una concentración de 6 mg/ml.

6. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la trombomodulina soluble muestra la función de aceleración de la activación de proteína C por trombina y comprende una trombomodulina constituida por una secuencia de aminoácidos compuesta por los residuos de aminoácidos desde el lugar 19 al lugar 516 del listado de secuencia SEQ ID NO: 1.

7. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la trombomodulina soluble es cualquiera entre un grupo que consiste en el que está constituido por una secuencia de aminoácidos compuesta por los residuos de aminoácidos desde el lugar 19 al lugar 516 del listado de secuencia SEQ ID NO: 1, la constituida por la secuencia de aminoácidos compuesta de los residuos de aminoácidos desde el lugar 19 al lugar 516 del listado de secuencia SEQ ID NO: 2, la obtenida por transfectado del segmento de DNA que codifica la secuencia de aminoácidos indicada en el listado de secuencia SEQ ID NO: 1 a una célula huésped y que es obtenida por transfectado del segmento de DNA que codifica la secuencia de aminoácidos indicada en el listado de secuencia SEQ ID NO: 2 a una célula hospedante.

8. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el componente tampón consiste como mínimo en uno entre componentes tampón basados en fosfato y acetato.

9. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el valor de pH de la solución acuosa se encuentra en una gama de 5,5 a 6,5.

10. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 9, en la que el preparado en jeringa pre-llenada, que es llenado asépticamente en el contenedor en forma de jeringa para eliminar cualquier espacio de gas en su interior, se caracteriza porque la solución acuosa de trombomodulina ocupa el contenedor en forma de jeringa en una cantidad tal que el espacio residual de gas en su interior no supera 15% del volumen en términos de la proporción de espacio de gas.

11. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 10, en la que el diámetro interno del contenedor en forma de jeringa para el preparado pre-llenado en forma de jeringa es de 8,6 mm o menos.

12. Preparado acuoso de trombomodulina para inyección en forma líquida no congelada o no liofilizada, superior en estabilidad durante un largo periodo de establecimiento y con estabilidad contra sacudidas y adecuado para almacenamiento/transporte durante un largo periodo de tiempo, caracterizado porque el preparado acuoso de trombomodulina para inyección tiene un valor de pH en una gama de 5 a 7,0, contiene una trombomodulina soluble en una cantidad efectiva, componente o componentes tampón que muestran una acción tampón en una gama comprendida entre 5 y 7,0 y un tensoactivo, y es llenado en un contenedor asépticamente.

13. Preparado acuoso de trombomodulina para inyección en forma líquida no congelada o no liofilizada, superior en estabilidad durante un largo periodo de almacenamiento y con estabilidad contra sacudidas y adecuado para almacenamiento/transporte durante un largo periodo de tiempo, caracterizado porque el preparado acuoso de trombomodulina es un preparado pre-llenado en jeringa que tiene un valor de pH en una gama de 5 a 7,0, contiene una trombomodulina soluble en una cantidad efectiva y componente o componentes tampón que muestran acción tampón en una gama comprendida entre 5 y 7,0 y que es llenado en un contenedor en forma de jeringa asépticamente, a efectos de eliminar cualquier espacio sustancial de gas en su interior.

14. Preparado acuoso de trombomodulina para inyección en forma líquida no congelada y no liofilizada, superior en estabilidad durante un largo periodo de tiempo de almacenamiento y con estabilidad contra sacudidas y adecuado para almacenamiento/transporte durante un largo periodo de tiempo, caracterizado porque la preparación acuosa de trombomodulina para inyección es un preparado pre-llenado en jeringa que tiene un valor de pH en una gama de 5 a 7,0, contiene una trombomodulina soluble en una cantidad efectiva y componente o componentes tampón que muestran acción tampón en una gama comprendida de pH entre 5 y 7,0 y un tensoactivo, y que es llenado en un contenedor de jeringa asépticamente eliminando cualquier espacio sustancial de gas en su interior.

15. Preparado acuoso de trombomodulina para inyección, según la reivindicación 13 ó 14, en el que el preparado pre-llenado en jeringa está destinado a inyección subcutánea o para inyección intramuscular.

16. Preparado acuoso de trombomodulina para inyección, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que la trombomodulina soluble es cualquiera entre un grupo que consiste en el constituido por la secuencia de aminoácido compuesta por los residuos de aminoácidos desde el lugar 19 al 516 del listado de secuencia SEQ ID NO: 1, el constituido por la secuencia de aminoácidos compuesta por los residuos de aminoácidos desde el lugar 19 al 516 del listado de secuencias SEQ ID NO: 2, el obtenido por transfectado del segmento de DNA que codifica la secuencia de aminoácidos indicada en el listado de secuencia SEQ ID NO: 1 a una célula hospedante y el obtenido por transfectado del segmento de DNA que codifica la secuencia de aminoáciodos indicada en el listado de secuencias SEQ ID NO: 2 a una célula hospedante.

17. Preparado acuoso de trombomodulina para inyección, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que el pH de la solución tampón se encuentra en una gama de 5,5 a 6,5.

18. Preparado acuoso de trombomodulina para inyección, según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que el preparado pre-llenado en jeringa que es llenada asépticamente en un contenedor en forma de jeringa a efectos de eliminar cualquier espacio sustancial de gas en su interior, se caracteriza porque la solución acuosa de trombomodulina ocupa el recipiente en forma de jeringa en una cantidad tal que el espacio residual de gas en su interior no supera el 15% en volumen en términos de la proporción de espacio de gas.

19. Preparado acuoso de trombomodulina para inyección, según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en el que el que el diámetro interno del recipiente en forma de jeringa para el preparado pre-llenado de la jeringa es de 8,6 mm o inferior.

20. Utilización, según la reivindicación 1, que comprende el envasado de dicho contenedor lleno de la solución acuosa para almacenamiento/transporte en un elemento laminar o en una caja de cartón.

21. Preparado acuoso de trombomodulina para inyección, según la reivindicación 12, que comprende el envasado de dicho contenedor lleno de la solución acuosa para almacenamiento/transporte en un elemento laminar o en una caja de cartón.

22. Preparado acuoso de trombomodulina para inyección, según la reivindicación 12, que comprende el envasado aséptico de dicha solución acuosa en un contenedor en el que se mantiene dicha solución acuosa asépticamente en el contenedor durante su almacenamiento/transporte.