PT2720710E - Formulações liofilizadas de fgf-18 - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "FORMULAÇÕES LIOFILIZADAS DE FGF-18"
Campo de Invenção A invenção refere-se ao campo das formulaçõesfarmacêuticas. Mais particularmente, é dirigida aformulações secas por congelação da proteina do Fator deCrescimento de Fibroblastos 18 (FGF-18) e a métodos de produção de tais formulações. As formulações secas porcongelação de acordo com a invenção são estáveis ao armazenamento à temperatura ambiente durante um intervalode tempo apropriado.
Antecedentes da invenção 0 fator de Crescimento de Fibroblastos 18 (FGF-18) é um membro da família de proteínas do Fator de Crescimento deFibroblastos (FGF), intimamente relacionado com o FGF-8 e oFGF-17. Os membros da família de FGF caracterizam-se pordomínios de ligação a heparina. Um tal domínio de ligação aheparina putativo foi identificado para o FGF-18. Épostulado que a sinalização mediada por recetores é iniciada após ligação do ligando de FGF complexado comproteoglicanos de sulfato de heparina da superfíciecelular.
Foi demonstrado que o FGF-18 é um agente proliferativo paracondrócitos e osteoblastos (Ellsworth et al., 2002,
Osteoarthritis and Cartilage, 10: 308-320; Shimoaka et al.,2002, J. Bio. Chem. 277(9):7493-7500). O FGF-18 foiproposto para o tratamento de distúrbios da cartilagem taiscomo osteoartrite e lesão da cartilagem, quer seja sozinho (W02008/023063) ou em associação com ácido hialurónico(W02 004/032849) .
As composições farmacêuticas que compreendem um polipéptidode FGF são conhecidas na técnica. A WOOO/21548 e aWO02/17956 divulgam composições farmacêuticas quecompreendem um FGF recombinante em combinação com umveiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Osexemplos de veículos ou diluentes adequados para soluçõesinjetáveis incluem a água ou soluções fisiológicasisotónicas. A WO2008/121563 refere-se a formulações farmacêuticas quecompreendem um composto de FGF-21 preparado numa formainjetável de dosagem unitária em conjunto com um veículofarmaceuticamente aceitável. O veículo adequado pode ser,entre outros, um açúcar, um tampão e/ou um tensioativo. A WO92/01442 divulga uma composição liofilizada quecompreende um FGF, um agente de volume farmaceuticamenteaceitável e i) um sal de metal alcalino de celulose ou ii)uma combinação de éster de polioxietileno sorbitano deácido gordo com cisterna. Os componentes de i) e ii)permitem estabilizar a composição de FGF. A WOOl/39788 descreve composições farmacêuticas quecompreendem um composto de FGF-18 em conjunto com umacitotoxina, numa mistura com um veículo farmaceuticamenteaceitável, por exemplo soro fisiológico tamponado comfosfato. A W02008/023063 divulga formulações que compreendem umcomposto de FGF-18 em conjunto com pelo menos um veículofarmaceuticamente aceitável, excipientes ou semelhantes.Como um exemplo, divulga uma formulação para injeção que compreende FGF-18 em veículos tais como soro fisiológico,solução de dextrose, albumina sérica e solução de Ringer.
Quando se prepara uma composição farmacêutica quecompreende uma proteína bioativa, a referida composição temde ser formulada de tal como que a atividade da proteínaseja mantida durante um intervalo de tempo apropriado. Umaperda na atividade / estabilidade da proteína pode resultarde instabilidades químicas ou físicas da proteína,especialmente devido a desnaturação, agregação ou oxidação.Os produtos resultantes podem ser assim farmaceuticamenteinaceitáveis. Embora se conheça a utilização de excipiente(s) para aumentar a estabilidade de uma determinada proteína, os efeitos estabilizantes destesexcipientes é altamente dependente da natureza dos excipientes e da própria proteína bioativa. AsUS2003/113316, WO2007/076354, WO2008/121563 e W097/04801 divulgam meios gerais para a estabilização de proteínas.
Permanece uma necessidade de outras formulações quecontenham FGF-18 como um ingrediente ativo, em que as referidas formulações sejam estáveis durante um intervalode tempo apropriado e adequadas para utilização em injeção,preferencialmente para injeção intra-articular. Asreferidas formulações poderiam ser úteis para administraçãono tratamento de um distúrbio da cartilagem num doente, talcomo osteoartrite ou lesão da cartilagem.
Sumário da invenção É um objetivo da presente invenção proporcionar uma novaformulação que contém uma proteína FGF-18. Maisparticularmente, a referida formulação é uma formulaçãoseca por congelação (ou liofilizada) estável que contémFGF-18. A invenção também proporciona métodos de preparação da formulação seca por congelação de acordo com a presenteinvenção. A formulação seca por congelação aqui descritapode ser útil, após reconstituição, para administração notratamento de distúrbios da cartilagem.
Num primeiro aspeto, a invenção proporciona uma formulaçãoseca por congelação estável que compreende ou consiste emFGF-18, um tampão, um tensioativo de poloxâmero e um açúcarcomo estabilizante. 0 tampão é um tampão de fosfato, otensioativo de poloxâmero é poloxâmero 188, e oestabilizante é sacarose. 0 tampão mantém o pH compreendidoentre 7,0 e 7,5, e mais particularmente a, ou aaproximadamente, 7,2. Numa forma de realização ainda maispreferida, a concentração do tensioativo de poloxâmero éde, ou de aproximadamente, 0,1 a 0,4 mg/frasco.Preferencialmente, o FGF-18 é selecionado do grupo queconsiste em: 1) um polipéptido que compreende ou consistena forma madura do FGF-18 humano, correspondente àsequência que compreende ou consiste no residuo 28 (Glu) atéao residuo 207(Ala) de SEQ ID NO: 1, 2) um polipéptido quecompreende ou consiste numa forma truncada de FGF-18 humanoque compreende ou consiste no residuo 28 (Glu) até aoresiduo 196 (Lys) de SEQ ID NO:l e 3) um polipéptido quecompreende ou consiste na SEQ ID NO: 2. Maispreferencialmente, o FGF-18 é trFGF-18, como definido maisà frente.
Num segundo aspeto, a invenção proporciona um método defabrico de uma formulação seca por congelação estável deFGF-18, que compreende os passos de: 1) preparar uma mistura de FGF-18, em conjunto com umtampão, um tensioativo e um estabilizante, e 2) submeter a mistura a liofilização (secagem porcongelação), em que o tampão é um tampão de fosfato, o estabilizante ésacarose e o tensioativo é poloxâmero 188. Numa forma derealização preferida, o tampão mantém o pH a, ou aaproximadamente, 7,0 a 7,5, e mais particularmente a, ou aaproximadamente, 7,2. Preferencialmente, FGF-18 éselecionado do grupo que consiste em: 1) um polipéptido quecompreende ou consiste na forma madura do FGF-18 humano,correspondente à sequência que compreende ou consiste noresiduo 28(Glu) até ao residuo 207(Ala) de SEQ ID NO: 1, 2)um polipéptido que compreende ou consiste numa formatruncada de FGF-18 humano que compreende ou consiste noresiduo 28 (Glu) até ao residuo 196 (Lys) de SEQ ID NO:l e 3) um polipéptido que compreende ou consiste na SEQ IDNO:2. Mais preferencialmente, o FGF-18 é trFGF-18, comodefinido mais à frente.
Num terceiro aspeto, a invenção proporciona um artigo defabrico para uso farmacêutico ou veterinário, quecompreende: 1) um primeiro recipiente que compreende uma formulaçãoseca por congelação estável, em que a referida formulaçãoseca por congelação compreende FGF-18, um tampão, umtensioativo e um estabilizante, e 2) um segundo recipiente que compreende um solvente parareconstituição, em que o tampão é um tampão de fosfato, o estabilizante ésacarose, o tensioativo é poloxâmero 188 e o solvente parareconstituição é água ou um soro fisiológico (por exemplocloreto de sódio a 0,9% p/v para injeção) .
Preferencialmente, o FGF-18 selecionado do grupo queconsiste em: 1) um polipéptido que compreende ou consistena forma madura do FGF-18 humano, correspondente àsequência que compreende ou consiste no residuo 28(Glu) atéao residuo 207(Ala) de SEQ ID NO: 1, 2) um polipéptido quecompreende ou consiste numa forma truncada de FGF-18 humanoque compreende ou consiste no residuo 28 (Glu) até aoresiduo 196 (Lys) de SEQ ID NO:l e 3) um polipéptido quecompreende ou consiste na SEQ ID NO: 2. Maispreferencialmente, o FGF-18 é trFGF-18, como definido maisà frente.
Definições O termo "proteina FGF-18" ou "FGF-18", como aquiutilizado, pretende ser uma proteina que mantém pelo menosuma atividade biológica da proteina FGF-18 humana. O FGF-18pode ser nativo, na sua forma madura ou uma forma truncadado mesmo. As atividades biológicas da proteina FGF-18humana incluem, em especial, o aumento da atividadeosteoblástica (ver W098/16644) ou na formação de cartilagem(ver W02008/023063). O FGF-18 humano nativo, ou de tipo selvagem, é uma proteinaexpressa pelos condrócitos da cartilagem articular. O FGF-18 humano foi inicialmente designado por zFGF-5 e encontra-se totalmente descrito na W098/16644. A SEQ ID NO:lcorresponde à sequência de aminoácidos do FGF-18 humanonativo, com um péptido sinal que consiste nos residuos deaminoácidos 1 (Met) a 27 (Ala) . A forma madura do FGF-18humano corresponde à sequência de aminoácidos desde oresiduo 28 (Glu) até ao residuo 207 (Ala) de SEQ ID NO: 1(180 aminoácidos). O FGF-18 tem especificidade para o FGFR4e para as variantes de excisão-união "IIIc" de FGFR3 eFGFR2 (Ellsworth et al.r 2002, Osteoarthritis and
Cartilage, 10 : 308-320) . A forma madura de FGF-18 tern uma massa média de 21,04 kDa.
Na presente invenção, o FGF-18 pode ser produzido por ummétodo recombinante, tal como se ensina no pedido W02006/063362. Dependendo dos sistemas de expressão econdições, o FGF-18 na presente invenção é expresso numacélula hospedeira recombinante com uma Metionina inicial(residuo de Met) ou com uma sequência sinal para secreção.Quando expresso num hospedeiro procariótico, tal como em E.coli, o FGF-18 contém um residuo de Met adicional naextremidade N-terminal da sua sequência. Por exemplo, asequência de aminoácidos do FGF-18 humano, quando expressoem E.coli, começa com um residuo de Met na extremidade N-terminal (posição 1) seguido dos residuos 28 (Glu) até aoresiduo 207 (Ala) de SEQ ID NO: 1. O termo "forma truncada" de FGF-18, como aqui utilizado, refere-se a uma proteína que compreende ouconsiste nos resíduos 28 (Glu) a 196 (Lys) de SEQ ID NO: 1.
Preferencialmente, a forma truncada da proteína FGF-18 é opolipéptido designado "trFGF-18" (170 aminoácidos), o qualcomeça com um resíduo de Met (na extremidade N-terminal)seguido dos resíduos de aminoácidos 28 (Glu) -196 (Lys) doFGF-18 humano de tipo selvagem. A sequência de aminoácidosde trFGF-18 é mostrada na SEQ ID NO:2 (resíduos deaminoácidos 2 a 170 de SEQ ID NO:2 correspondem aosresíduos de aminoácidos 28 a 196 de SEQ ID NO:l). O trFGF-18 é uma forma truncada recombinante de FGF-18 humano,produzida em E.coli (ver W02006/063362). Foi demonstradoque o trFGF-18 apresenta atividades semelhantes às do FGF-18 humano maduro, por exemplo aumenta a proliferação decondrócitos e a deposição de cartilagem que conduz àreparação e reconstrução para uma variedade de tecidos cartilaginosos (ver W02008/023063) . 0 trFGF-18 tem uma massa média de 19,83 kDa. 0 termo "estabilidade", como aqui utilizado, refere-seà estabilidade fisica, quimica e conformacional do FGF-18nas formulações de acordo com a presente invenção(incluindo a manutenção da potência biológica). Ainstabilidade de uma formulação de proteina pode serprovocada por degradação quimica ou agregação das moléculasde proteina para formar polímeros de ordem superior,desglicosilação, modificação da glicosilação, oxidação ouqualquer outra modificação estrutural que reduz, pelomenos, uma atividade biológica de uma proteina FGF-18 dapresente invenção. 0 termo solução ou formulação "estável", como aquiutilizado, é uma solução ou formulação em que o grau dedegradação, modificação, agregação, perda de atividadebiológica e semelhantes, das proteínas ali contidas écontrolado de forma aceitável, e não aumentainaceitavelmente com o tempo. Preferencialmente, aformulação retém pelo menos mais de 80% da atividade deFGF-18 ao longo de um periodo de pelo menos 12 meses àtemperatura ambiente. A formulação estabilizada da presenteinvenção que compreende FGF-18 tem preferencialmente umperiodo de conservação de pelo menos cerca de 12 meses, 18meses, mais preferencialmente pelo menos 20 meses, aindamais preferencialmente cerca de 24 meses, quando armazenadaà temperatura ambiente. Os métodos para monitorizar aestabilidade da formulação de FGF-18 da presente invençãoestão disponíveis na técnica e incluem os métodos descritosnos exemplos aqui divulgados. O termo "tampão", como aqui utilizado, refere-se asoluções de compostos que são conhecidas como sendo seguras em formulações para uso farmacêutico ou veterinário e quetêm o efeito de manter ou controlar o pH da formulação nagama de pH desejado para a formulação. Os tampõesaceitáveis para controlar o pH a um pH moderadamente ácidoaté um pH moderadamente básico incluem, mas não se limitama, tampões de fosfato, acetato, citrato, arginina, TRIS ehistidina. "TRIS" refere-se a 2-amino-2-hidroximetil-l,3, -propanodiol, e a qualquer sal farmacologicamente aceitáveldo mesmo. De acordo com a presente invenção, os tampõespreferíveis são os tampões de fosfato. 0 termo "tensioativo", como aqui utilizado, refere-sea um composto solúvel que pode ser utilizado especialmentepara aumentar a solubilidade em água de substâncias oleosashidrófobas ou, de outro modo, aumentar a miscibilidade deduas substâncias com hidrofobicidades diferentes. Por estarazão, estes polímeros são comummente utilizados emaplicações industriais, cosméticas e farmacêuticas. Sãotambém utilizados como sistemas modelo para aplicações naadministração de fármacos, especialmente para modificar aabsorção do fármaco ou a sua administração aos tecidosalvos. Os tensioativos bem conhecidos incluem polissorbatos(derivados de polioxietileno; Tween) bem como poloxâmeros(isto é, copolímeros baseados em óxido de etileno e óxidode propileno, também conhecidos como Pluronics®). De acordocom a invenção, o tensioativo preferido é um tensioativo depoloxâmero e ainda mais preferencialmente é o poloxâmero188 (Pluronic® F68). 0 termo "agente estabilizante", "estabilizante" ou"agente isotonizante", como aqui utilizado, é um compostoque é fisiologicamente tolerado e confere umaestabilidade/tonicidade adequada a uma formulação. Previneespecialmente o fluxo líquido de água através das membranascelulares que estão em contacto com a formulação. Durante o processo de secagem por congelação (liofilização), oestabilizante é também eficaz como um crioprotetor. Oscompostos, tais como glicerina, são comummente utilizadospara esses fins. Outros agentes estabilizantes adequadosincluem, mas não se limitam a, aminoácidos ou proteínas(por exemplo glicina ou albumina), sais (por exemplocloreto de sódio), e açúcares (por exemplo dextrose,manitol, sacarose e lactose). De acordo com a presenteinvenção, o estabilizante preferido é um açúcar, ainda maispreferencialmente sacarose. 0 termo "frasco" ou "recipiente", como aqui utilizado,refere-se, em termos latos, a um reservatório adequado pararetenção da formulação de FGF-18 na forma liofilizada. Deforma semelhante, reterá o solvente para reconstituição. Osexemplos de um frasco que pode ser utilizado na presenteinvenção incluem seringas, ampolas, cartuchos ou outroreservatório adequado desse tipo para administração daformulação de FGF-18 ao doente através de injeção,preferencialmente através de injeção intra-articular.Alternativamente, o frasco que retém a formulação de FGF-18e aquele que retém o solvente para reconstituição podem serapresentados como os 2 compartimentos de um sistema dedupla câmara (por exemplo, seringa ou cartucho). Os frascosadequados para embalar produtos para administração intra-articular são bem conhecidos e reconhecidos na técnica. 0 termo "solvente ", como aqui utilizado, refere-se aum solvente liquido seja aquoso ou não aquoso. A seleção dosolvente depende especialmente da solubilidade do compostofarmacológico no referido solvente e do modo deadministração. 0 solvente aquoso pode consistirexclusivamente de água, ou pode consistir em água mais umou mais solventes miscíveis, e pode conter solutosdissolvidos tais como açúcares, tampões, sais ou outros excipientes. Os solventes não aquosos mais comummenteutilizados são os álcoois orgânicos de cadeia curta, taiscomo, metanol, etanol, propanol, cetonas de cadeia curta,tais como acetona, e poliálcoois, tais como glicerol. Deacordo com a presente invenção, o solvente preferido é umsolvente aquoso tal como água ou um solvente salino. 0 termo "distúrbio da cartilagem", como aquiutilizado, abrange distúrbios resultantes de danos devidosa lesão traumática ou condropatia. Os exemplos dedistúrbios da cartilagem que podem ser tratados pelaadministração da formulação de FGF-18 aqui descritaincluem, mas não se restringem a, artrite, tal comoosteoartrite ou artrite reumatoide e lesão da cartilagem. 0 termo "Osteoartrite" é utilizado para indicar aforma mais comum de artrite. Pode ser provocada peladegradação de cartilagem. Pedaços da cartilagem podemquebrar e causar dor e tumefação na articulação entre osossos. Ao longo do tempo a cartilagem pode desgastar-se porcompleto, e os ossos irão friccionar uns com os outros. Aosteoartrite pode afetar qualquer articulação, masgeralmente está relacionada com as mãos e as articulaçõesde sustentação de peso tais como as ancas, joelhos, pés ecoluna vertebral. Num exemplo preferido, a osteoartritepode ser osteoartrite do joelho ou osteoartrite da anca. 0especialista está totalmente consciente das classificaçõesde osteoartrite que são utilizadas na técnica, emparticular o sistema de avaliação OARSI (ver por exemploCusters et al., 2007) . A osteoartrite é um dos distúrbiosda cartilagem preferidos que podem ser tratadosadministrando as formulações de FGF-18 de acordo com apresente invenção. 0 termo "lesão da cartilagem" como aqui utilizado é umdistúrbio da cartilagem ou dano da cartilagem resultanteespecialmente de um traumatismo. As lesões da cartilagempodem ocorrer como consequência de destruição mecânicatraumática, especialmente depois de um acidente oucirurgia. É também considerada dentro desta definição alesão relacionada com o desporto ou o desgaste relacionadocom o desporto de tecidos da articulação.
Descrição detalhada da invenção 0 objeto principal da presente invenção é uma formulaçãoseca por congelação estável que compreende ou consiste numproteína FGF-18, um tampão, um tensioativo de poloxâmero eum açúcar como estabilizante. 0 tampão é um tampão defosfato, o tensioativo de poloxâmero é o poloxâmero 188 e oestabilizante é sacarose. Preferencialmente, a proteínaFGF-18 é selecionada do grupo que consiste em: 1) umpolipéptido que compreende ou consiste na forma madura doFGF-18 humano, correspondente à sequência que compreende ouconsiste no resíduo 28 (Glu) até ao resíduo 207(Ala) de SEQID NO: 1, 2) um polipéptido que compreende ou consiste numaforma truncada de FGF-18 humano que compreende ou consisteno resíduo 28 (Glu) até ao resíduo 196 (Lys) de SEQ ID NO:le 3) um polipéptido que compreende ou consiste na SEQ IDNO:2. Mais preferencialmente, o FGF-18 é o trFGF-18. A concentração de FGF-18 na presente invenção épreferencialmente de, ou de aproximadamente, 20 a 300 mcg/frasco, preferencialmente de, ou de aproximadamente, 20,30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou 300mcg/frasco, ainda mais preferencialmente de, ou deaproximadamente, 20, 30, 60, 100, 200 ou 300 mcg/frasco. OFGF-18 pode ser adicionado num excesso de 5%, a fim deprevenir perdas de proteína que possam ocorrer durante a formulação. Por exemplo, para uma concentração de FGF-18 de30 mcg/frasco, o composto pode ser adicionado numaquantidade de 31,5 mcg/frasco.
Preferencialmente, as formulações da invenção retêm pelomenos 80% da atividade biológica de FGF-18 na altura daliofilização e/ou embalagem ao longo de um período de pelomenos 12 meses (antes da primeira utilização). A atividadede FGF-18 pode ser medida como se descreve na secção de"Exemplos" que se segue.
Os tampões preferíveis de acordo com a presente invençãosão tampões de fosfato e mantêm o pH compreendido entre 7,0e 7,5, e ainda mais preferencialmente a, ou aaproximadamente, 7,2. A concentração de tampão na solução total épreferencialmente de, ou de aproximadamente, 5 a 500 mM.Numa forma de realização preferida, a concentração dotampão é de, ou de aproximadamente, 10 a 10 0 mM.Preferencialmente, a concentração do tampão é de, ou deaproximadamente, 10 mM. O estabilizante na presente invenção é preferencialmente umaçúcar. O açúcar preferido é a sacarose. Preferencialmente,a concentração do estabilizante é de, ou deaproximadamente, 0,5 a 250 mg/frasco, maispreferencialmente de, ou de aproximadamente, 1 a 100mg/frasco, mais particularmente de, ou de aproximadamente,15 a 60 mg/frasco, ainda muito preferencialmente de, ou deaproximadamente, 30 mg/frasco. O tensioativo de acordo com a presente invenção é umtensioativo de poloxâmero e, em particular, é o poloxâmero188 (isto é, Pluronic® F68) . Preferencialmente a concentração de tensioativo é de, ou de aproximadamente,0,01 a 10 mg/frasco, mais preferencialmente de, ou deaproximadamente, 0,05 a cerca de 5 mg/frasco, maisparticularmente de, ou de aproximadamente, 0,1 a cerca de 1mg/frasco, ainda muito preferencialmente de, ou deaproximadamente, 0,1, 0,2 ou 0,4 mg/frasco, e em particularde, ou de aproximadamente, 0,2 mg/frasco.
Numa forma de realização preferida, a formulação seca porcongelação estável na presente invenção compreende ouconsiste em FGF-18 a, ou a aproximadamente, 20, 30, 60,100, 200 ou 300 mcg/frasco, tampão de fosfato 10 mM a pH7,2, 30 mg/frasco de sacarose e 0,2 mg/frasco de poloxâmero188. Quando é incluido um excesso de 5%, a formulação secapor congelação de acordo com a presente invenção compreendeFGF-18 a, ou a aproximadamente, 21, 31,5, 63, 105, 210 ou315 mcg/frasco.
Numa outra forma de realização, a presente invenção édirigida a uma formulação seca por congelação estável guecompreende: 1) FGF-18:sacarose numa proporção de concentrações de, oude aproximadamente, 1:95000 até, ou até aproximadamente,1:6000, preferencialmente a, ou a aproximadamente, 1:92000,1:61000, 1:31000, 1:18450, 1:9200 ou 1:6100, 2) FGF-18:poloxâmero 188 numa proporção de concentraçõesde, ou de aproximadamente, 1:25 até, ou atéaproximadamente, 6:10, preferencialmente a, ou aaproximadamente, 1:25, 5:83, 5:42, 1:5, 2:5 ou 6:10. 3) FGF-18: tampão de fosfato a pH 7,2 numa proporção molarde, ou de aproximadamente, ou 1:10500 até, ou atéaproximadamente, 1:700, preferencialmente a, ou a aproximadamente, 1:10500, 1:7000, 1:3500, 1:2100, 1:1050 ou1:700, em que a proteína FGF-18 é preferencialmente selecionada dogrupo que consiste em: 1) um polipéptido que compreende ouconsiste nos resíduos de aminoácidos 28 (Glu)-207(Ala) deSEQ ID NO:l, 2) um polipéptido que compreende ou consistenos resíduos de aminoácidos 28(Glu)-196(Lys) de SEQ ID NO:lou 3) um polipéptido que compreende ou consiste na SEQ IDNO:2. Mais preferencialmente, a proteína FGF-18 compreendeou consiste nos resíduos de aminoácidos 28(Glu)-207(Ala) deSEQ ID NO:1.
Ainda noutra forma de realização, a presente invenção édirigida a uma formulação seca por congelação estável quecompreende: 1) FGF-18:sacarose numa proporção molar de, ou deaproximadamente, 1:90000 até, ou até aproximadamente,1:5000, preferencialmente a, ou a aproximadamente, 1:87000,1:58000, 1:29000, 1:17400, 1:8700 ou 1:5800, 2) FGF-18:poloxâmero 188 numa proporção molar de, ou deaproximadamente, ou 5:120 até, ou até aproximadamente, 5:8,preferencialmente a, ou a aproximadamente, 5:118, 5:79,10:79, 10:47, 5:12 ou 5:8, 3) FGF-18: tampão de fosfato a pH 7,2 numa proporção molarde, ou de aproximadamente, ou 1:10000 até, ou atéaproximadamente, 1:700, preferencialmente a, ou aaproximadamente, 1:10000, 1:6600, 1:3300, 1:2000, 1:1000 ou1:700, em que a proteína FGF-18 é preferencialmente selecionado dogrupo que consiste em: 1) um polipéptido que compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos 28(Glu)-207(Ala) deSEQ ID NO:l, 2) um polipéptido que compreende ou consistenos resíduos de aminoácidos 28(Glu)-196(Lys) de SEQ IDNO:l, ou 3) um polipéptido que compreende ou consiste naSEQ ID NO:2. Mais preferencialmente, a proteína FGF-18compreende ou consiste nos resíduos de aminoácidos 28 (Glu)-196(Lys) de SEQ ID NO:l. Ainda mais particularmente, aproteína FGF-18 compreende ou consiste na SEQ ID NO:2. Numaforma de realização particular, a proteína FGF-18 é otrFGF-18 A invenção proporciona ainda um método de fabrico dequalquer uma das formulações secas por congelação estáveisde FGF-18 descritas acima, em que o método compreende ospassos de: 1) preparar uma mistura de FGF-18 em conjunto com tampão defosfato, poloxâmero 188 e sacarose como um estabilizante, e 2) submeter a mistura a liofilização.
Os passos 1 e 2 são realizados utilizando procedimentosconvencionais. Como um exemplo, a fim de preparar umaformulação estável adequada, uma determinada quantidade deFGF-18, tal como trFGF-18, é misturada com tampão defosfato que mantém o pH a, ou a aproximadamente, 7,2,poloxâmero 188 e sacarose. Cada um destes compostos (istoé, FGF-18, o tampão, o tensioativo e o estabilizante) podeser utilizado de acordo com as concentrações, pH e/ouproporções descritas acima. A mistura resultante éliofilizada e, em seguida, distribuída para frascos. Asvariantes deste processo serão reconhecidas por umespecialista com conhecimentos médios na matéria. A invenção também proporciona um artigo de fabrico, parauso farmacêutico ou veterinário, que compreende: 1) um primeiro recipiente que compreende qualquer uma dasformulações secas por congelação estáveis descritas acima,em que a referida formulação compreende ou consiste em FGF-18, um tampão, um tensioativo de poloxâmero, um açúcar comoum estabilizante, como descrito acima, e 2) um segundo recipiente que compreende um solvente parareconstituição.
Como um exemplo, o primeiro recipiente compreende umaformulação seca por congelação estável que compreende ouconsiste numa determinada quantidade de FGF-18, tal comotrFGF-18, tampão de fosfato que mantém o pH a, ou aaproximadamente, 7,2, poloxâmero 188 e sacarose, e osegundo recipiente compreende soro fisiológico (cloreto desódio a 0,9% p/v para injeção) . Cada um destes compostos(isto é, FGF-18, o tampão, o tensioativo e o estabilizante)pode ser utilizado de acordo com as concentrações, pH e/ouproporções descritas acima. Preferencialmente, o recipienteque retém a formulação de FGF-18 e aquele que retém osolvente para reconstituição correspondem aos dois compartimentos de um sistema de dupla câmara (por exemplo,seringa ou cartucho). É também descrito um material de embalagem que proporcionainstruções para reconstituir a formulação seca por congelação de FGF-18 (primeiro recipiente) no solvente(segundo recipiente).
As formulações secas por congelação da invenção podem sermantidas durante pelo menos cerca de 12 meses a cerca de 24meses. Sob condições de conservação preferidas, antes da primeira utilização, as formulações são mantidas afastadasda luz forte (preferencialmente no escuro), à temperaturaambiente (a, ou a aproximadamente, 25 °C). A formulação seca por congelação estável da invenção tem deser reconstituída, preferencialmente sob condição estéril,com um solvente, tal como água ou um soro fisiológico (porexemplo cloreto de sódio a 0,9% p/v para injeção) antes dautilização, isto é, antes da injeção. Após reconstituição,o volume a ser injetado é preferencialmente desde 0,5 mL a5 mL, mais preferencialmente 0,5, 1 ou 2 mL. A formulaçãode FGF-18 deve ser administrada preferencialmente dentro deuma hora da reconstituição. A presente invenção proporciona formulações secas porcongelação estáveis de FGF-18, em particular parautilização única, adequadas para uso farmacêutico ouveterinário. A formulação seca por congelação estável que compreendeFGF-18, na presente invenção, pode ser utilizada, apósreconstituição, para administração para melhorar areparação da cartilagem ou para o tratamento de distúrbiosda cartilagem, tais como osteoartrite ou lesões dacartilagem.
Estas formulações secas por congelação estáveis, apósreconstituição, são adequadas para serem utilizadas eminjeção e sistemas de administração alternativos. Numaforma de realização particularmente preferida, asformulações da invenção são para injeção intra-articular.Elas podem ser administradas, após reconstituição, porinjeção direta no liquido sinovial da articulação oudiretamente no defeito. Numa forma de realização preferidada presente invenção, a administração intra-articular é efetuada numa articulação selecionada de articulação daanca, joelho, cotovelo, pulso, tornozelo, coluna vertebral,pé, dedo, dedo do pé, mão, ombro, costelas, omoplatas,coxas, canelas, calcanhares e ao longo de pontos ósseos dacoluna vertebral. Ainda noutra forma de realizaçãopreferida, a administração intra-articular é efetuada naarticulação da anca ou joelho.
As formulações de FGF-18 da presente invenção têmestabilidade melhorada e podem ser facilmente armazenadas àtemperatura ambiente (a, ou a aproximadamente, 25 °C) ou a2-8 °C (ver os exemplos que se seguem), preferencialmente àtemperatura ambiente. Na realidade, os inventoresconstataram que as formulações secas por congelação quecompreendem FGF-18 (por exemplo trFGF-18), tampão defosfato 10 mM a pH 7,2, 30 mg/frasco de sacarose e 0,2mg/frasco de poloxâmero 188 são estáveis ao longo do tempo,especialmente quando armazenadas à temperatura ambiente. Asreferidas formulações minimizam a perda de principio ativo,isto é, FGF-18. Constatou-se também que as referidasformulações são mais resistentes à oxidação e à formação deagregados de proteína.
Os seguintes exemplos são proporcionados para ilustrarainda mais a preparação das formulações e composições dainvenção. O âmbito da invenção não deve ser interpretadocomo consistindo meramente nos exemplos seguintes e é comodefinido nas reivindicações apensas.
Descrição da figura:
Figura 1: Mostra o efeito do tensioativo (poloxâmero 188)na recuperação de FGF-18 antes do processo de liofilização.Foram utilizadas pré-formulações que contêm 10 mg/mL (+ 5%de excesso) de FGF-18 em tampão de fosfato a pH 7,2, enquanto se variou a concentração de tensioativo (desde 0 a0,2 %) . O teor de proteína foi avaliado para cada uma daspré-formulações antes da filtração (BF) e após a filtração(T=0).
Descrição das sequências: SEQ ID NO.l: Sequência de aminoácidos do FGF-18 humano nativo. SEQ ID NO.2: Sequência de aminoácidos do FGF-18 truncado recombinante (trFGF-18).
Exemplos
Material O FGF-18 truncado recombinante (trFGF-18) dos presentesexemplos foi preparado por expressão em E.coli, de acordocom a técnica descrita no pedido W02006/063362. Nosexemplos seguintes, trFGF-18 e FGF-18 são utilizadosindistintamente.
Outras substâncias utilizadas nos exemplos são as seguintes:
Sacarose (1.07653, Merck; Massa molecular: 342,30 g/Mol)
Di-hidrogenofosfato de sódio mono-hidratado (1.06345,Merck)
Hidrogenofosfato dissódico di-hidratado (1.06586,
Merck)
Poloxâmero 188 (Lutrol F 68 DAC, USP/NF, Basf; Massamolecular: 8400 g/Mol) Água para preparação injetável,
Soro fisiológico (cloreto de sódio a 0,9% p/v parainj eção)
Anticorpo monoclonal anti-FGF-18 clone #F5A2, para oteor de proteina (Proporcionado por RBM) Células BAF3-FGFR3c (Washington University)
Meio seletivo à base de Roswell Park MemorialInstitute (RPMI) 1640 (Invitrogen) .
Sistema de ensaio de luminescência ATPlite em 1 passo(Perkin Elmer)
Heparina H3149 (Sigma)
Equipamento AMICON ULTRA-4 com corte a 10 000 (UFC 8012024,Amicon)
Biacore 2000 (Biacore)
Incubadora de C02 (Heraeus)
Coluna TSK2000SWxl, 7, 8 x 300 mm, 5 μ (TosoHaas,código 08540)
Pré-coluna TSKG2000 (Hichrom, código 8543)
Sistemas de HPLC (Waters)
Luminómetro (Perkin Elmer)
Filtros de membrana de 0,22 ym (Durapore de tipo GWVP,Millipore)
Software Stabileo (ver. 1.1; pacote de Microsoft®Excel Visual Basic®)
Software GraphPad (Prism)
Suportes em aço inoxidável de 22 mL e 220 mL decapacidade (Sartorius)
Coluna Zorbax 300SB-C18 (150X4,6cm)
Frascos de vidro DIN2R (3 mL) (Nuova OMPI)
Rolhas de borracha revestidas (S2F452, D777-1, B2-40,
West Pharmaceutical)
Rolhas de borracha (código 1779, cinzento W1816,Pharma-Gummi) Métodos
Diferentes ensaios nas formulações
Foram utilizados métodos padrão para: SE-HPLC, RP-HPLC,
Humidade residual,pH,
Osmolalidade (Tempo 0, apenas), SDS-PAGE/SS, e
Mapeamento de péptidos/UPLC (formas oxidadas).
Teor de proteína A quantificação da proteina, isto é, trFGF-18, nas diferentes formulações foi realizada por Biacore. Amostras(25 pL) contendo trFGF-18 foram testadas (apropriadamentediluidas na presença de 10 mg/mL de BSA) fazendo fluir, a 5pL/min a 25 °C, sobre a superfície de um sensor, previamente revestido com o anticorpo monoclonal anti-FGF-18 clone F5A2, seguido de 5 pL de Glicina 10 mM, pH 2,0como tampão de regeneração. O padrão de referência (IRSFGF-18 N.° 051230), que vai desde 125 até 2 000 ng/mL, foianalisado em cada sessão analítica. Os resultados foramrecolhidos como Unidade de Ressonância (RU) e o nivel deFGF-18 de cada amostra foi extrapolado a partir da curva decalibração ajustada utilizando o algoritmo quadrático comdados transformados em logaritmos.
Bioensaio A atividade biológica de FGF-18 é medida como atividade deproliferação por um bioensaio in vitro que utiliza linha de células BaF3 transfetadas de forma estável com o recetor 3cde FGF (FGFR3c) . As células BaF3 que expressam FGFR3cproliferam sob estímulos de FGF-18.
As células BaF3/FGFR3c são cultivadas em meio seletivo àbase de RPMI 1640 na presença de r-hIL-3 como fator decrescimento. A fim de testar especificamente o efeitoproliferativo do FGF-18, as células têm de ser privadas deIL-3. Assim sendo, as células são cultivadas a 37 °C, 5% deCO2 na ausência de r-hIL-3 durante 26 horas antes doensaio. O padrão e as amostras são sucessivamente diluídos 5 vezesem meio de ensaio na gama de concentração desde 0,002 U/mLaté 177,5 U/mL. As células BAF3/FGFR3c privadas de IL-3(20 000 células/poço) são incubadas a 37 °C, 5% de CO2 comFGF-18 na presença de 1 yg/mL de heparina e 10% de Soro deVitelo Recém-Nascido, e em seguida a proliferação celular éavaliada após 48 horas pelo ensaio de luminescência"ATPlite em 1 passo", um sistema de monitorização de ATPcom base em luciferase de Pirilampo. A potência da amostra é medida aplicando o modelo de dose-resposta de curva alargada. Com este modelo, a curva dose-resposta total do padrão e das amostras são ajustadas peloalgoritmo de curva dose-resposta sigmoide com declivevariável (4PL) indicando os valores de cps (isto é,contagens por segundo) contra o logaritmo das concentraçõesde FGF-18. Para cada curva, a EC50 é calculadaautomaticamente pelo software GraphPad. A potência daamostra é calculada com base na relação entre a EC50 dapreparação de referência e aquela da amostra desconhecida(razão de potência). A potência de FGF-18 é expressa comoU/mL.
Exemplo 1: Formulações secas por congelação de trFGF-18 A composição das formulações secas por congelação de FGF-18é proporcionada na Tabela 1 abaixo.
Tabela 1: Composição para formulações secas por congelação de FGF-18 (*)
As formulações secas por congelação foram fabricadas comose segue: a sacarose e o Poloxâmero 188 foram dissolvidosno tampão de fosfato. Em seguida, foi adicionada aquantidade necessária de substância farmacológica (trFGF-18), o pH verificado e a solução ajustada ao volume final.A solução foi em seguida filtrada através de uma membranade 0,22 ym (Durapore®) sob pressão de azoto, mantendo umataxa de filtração de cerca de 20 cc/cm2 ou de cerca de 50cc/cm2. A solução final foi em seguida manualmente introduzida, sobcondições estéreis em frascos de vidro (0,5 mL/frasco) eseca por congelação de acordo com o seguinte ciclo:
As formulações secas por congelação estão prontas paraserem reconstituídas, em qualquer momento, com um solvente,tal como água para preparação injetável ou um sorofisiológico.
Exemplo 2: Estudos de estabilidade preliminares dasformulações de FGF-18
Exemplo 2.1: Foram utilizadas condições de estabilidadeacelerada (a 2-8 °C, 25 °C e 40 °C) para identificar pré-formulações secas por congelação a serem adicionalmenteestudadas (dados não apresentados).
Foram preparadas várias formulações secas por congelaçãopreliminares, a fim de identificar as melhores formulaçõescandidatas. No quadro deste estudo preliminar, foramavaliados vários tampões, incluindo tampões de fosfato ehistidina. Foram também testadas várias concentrações desacarose e poloxâmero 188. As pré-formulações candidatasforam testadas quanto à pureza (por SE-HPLC e RP-HPLC),teor de proteína (por Biacore), atividade biológica (bioensaio in vitro), humidade residual, pH e osmolalidade.Foram também gerados dados de suporte da estabilidade porSDS-PAGE/SS (pureza) e por mapeamento de péptidos/UPLC(formas oxidadas).
Exemplo 2.2 (dados de estabilidade para as formulaçõespreliminares; dados não apresentados): Os dados deestabilidade recolhidos para as formulações secas porcongelação preliminares por SE-HPLC ao longo de 3-4 semanasde conservação indicam gue o tampão de fosfato a pH 7,2 épreferido, uma vez gue foi observado um nivel muito maisalto de pureza (isto é, maior % de monómero) em comparaçãocom o tampão de histidina a pH 6 (ver tabela 2) . Aguantidade de sacarose (15 mcg/frasco vs 30 mcg/frasco)desempenha também um papel na estabilização de FGF-18versus agregação, onde foram observadas recuperaçõesglobalmente maiores de monómero com 30 mcg/frasco desacarose (conservação a 25 °C e 5 °C) . Além disso, foiobservada uma maior recuperação de proteína após o passo defiltração (antes do processo de liofilização) à medida guese aumentava o tensioativo (isto é, poloxâmero 188), com osmelhores resultados a 0,2 mg/frasco (figura 1).
Com base nos resultados desta fase de pré-formulação, forampreparadas seis formulações secas por congelação parainvestigações posteriores (formulações 1-6 da Tabela 1;também referidas como formulações candidatas).
Exemplo 3: Estudos de estabilidade de formulações secas porcongelação de FGF-18
Foram recolhidos dados de estabilidade de duas semanas até24 meses nas formulações secas por congelação candidatas daTabela 1.
Exemplo 3.1 (pureza por SE-HPLC): Os resultados para aavaliação estatística realizada pelo Stabileo sobre osdados de estabilidade gerados por SE-HPLC estão resumidosna Tabela 3: não foi detetada qualquer perda significativade pureza (teor de monómero) para qualquer formulação secapor congelação candidata durante o armazenamento adiferentes temperaturas (até 6 meses a 40 °C e até 24 mesesa 25 °C).
Exemplo 3.2 (pureza por SDS-PAGE/SS): Os resultados geradospor SDS-PAGE confirmaram os níveis de pureza globalmentesuperiores a 99% para qualquer uma das formulações secaspor congelação durante o armazenamento a todas astemperaturas testadas (pelo menos 6 meses a 40 °C e até 18meses a 25 °C). Os resultados são proporcionados na Tabela4 .
Exemplo 3.3 (pureza por RP-HPLC): Os resultados para aavaliação estatística realizada pelo Stabileo sobre osdados de estabilidade gerados por RP-HPLC estão resumidosna Tabela 5: não foi detetada qualquer perda significativada pureza (% de pico principal) para qualquer formulaçãoseca por congelação candidata durante o armazenamento adiferentes temperaturas (até 6 meses a 40 °C e até 18 mesesa 25 °C) . Por conseguinte, a formulação FGF-18 de acordocom a presente invenção não resulta em qualquer perda depureza em comparação com o material de partida (puro) FGF-18. Refira-se que, como o material de partida (antes daformulação) não estava completamente puro (as impurezas nãoforam completamente resolvidas por RP-HPLC), o pico antesda formulação não estava a 100%, mas por exemplo a 77,5%para a FD-30 e 87,4% para a FD-300 e o pico a T=0 estava,por exemplo, a 76,8% para a FD-30 e 87,7% para a FD-300.
Exemplo 3.4 (ensaio do teor de proteína): Os resultados daconcentração de proteína medida por Bioacore estãoresumidos nas Tabelas 6 e 7. Não foi detetada qualquerperda principal por filtração através da membrana de0,22 ym, isto é, foi observada uma recuperação quasecompleta da proteína (ver coluna "AF" na Tabela 6) . Apósreconstituição do produto seco por congelação com 1 mL deWFI (ver coluna "TO" na Tabela 6), foi obtida uma menorrecuperação, a qual pode ser explicada pela adsorção daproteína ao frasco de vidro (após reconstituição, a soluçãoda proteína é, em seguida, exposta a uma superfície maior).
Do ponto de vista da estabilidade, não foi detetadaqualquer perda no teor de proteína por Biacore para todasas potências a todas as temperaturas testadas, como semostra na Tabela 7 (até 6 meses a 40 °C e até 24 meses a 25°C) .
Exemplo 3.5 (atividade biológica): Os resultados daatividade biológica (expressa em U/recipiente) para todosos candidatos secos por congelação durante o armazenamentosão proporcionados na Tabela 8. Por exemplo, a atividadebiológica observada para a potência mais alta (300mcg/frasco de trFGF-18) durante o armazenamento, tanto a25 °C como a 40 °C foi estável ao longo do tempo. Foiobservada mais variabilidade com a potência mais baixa FD-20. Uma vez que não foi detetada qualquer alteração naestabilidade do produto por qualquer um dos outros ensaios,esta diminuição observada para a FD-20 deve ser confirmadaapós 39, 52, 78 e 104 semanas de conservação a 25 °C.
Exemplo 3.6 (formas oxidadas): O nível de formas oxidadasdetetadas para todas as potências durante o armazenamento éresumido na Tabela 9: entre os resíduos de Met que poderiamsofrer oxidação, os resultados indicam que a Met 1 é mais suscetível a oxidação, para todas as potências e a qualqueruma das temperaturas avaliadas.
Exemplo 3.7 (humidade residual): Não ocorreu nenhum aumentosignificativo na humidade residual durante o armazenamentopara todas as potências; foram geralmente medidos valoresde humidade residual abaixo ou próximos de 1% ao longo detodo o estudo de estabilidade (ver Tabela 10) (até 6 mesesa 40 °C e até 24 meses a 25 °C).
Exemplo 3.8 (variação de pH) : Não foi observada qualquer variação de pH significativa durante o armazenamento aqualquer uma das temperaturas testadas, para todas aspotências (ver Tabela 11) (até 6 meses a 40 °C e até 24meses a 25 °C).
Exemplo 3.9 (variação da osmolalidade): Não foi observada qualquer variação significativa na osmolalidade durante oarmazenamento a qualquer uma das temperaturas testadas,para todas as potências (ver Tabela 12) (até 6 meses a40 °C e até 24 meses a 25 °C).
Tabelas
Tabela 2: Percentagem (%) de monómeros de FGF-18 em pré-formulações secas por congelação (10 mcg/frasco de FGF-18 e0,2 mg/frasco de F68) durante o armazenamento, analisada
por SE-HPLC
Tabela 3: Percentagem (%) de monómeros de FGF-18 nasformulações secas por congelação candidatas durante oarmazenamento, analisada por SE-HPLC.
Tabela 4: Pureza das formulações secas por congelação deFGF-18 candidatas durante o armazenamento, analisada por SDS-PAGE (em %).
Tabela 5. Pureza das formulações secas por congelação de FGF-18 candidatas, durante o armazenamento, analisada por RP-HPLC
f?>0 pico antes da formulação era de 87,4%,!'»0 pico antes da formulação era de 77,5%.
Tabela 6: Recuperação de FGF-18 após filtração/enchimento, analisada por Biacore.
1 <
I
Tabela 7: Recuperação de FGF-18 durante o armazenamento, com base no ensaio porBiacore {nas formulações secas por congelação candidatas)
Tabela 8: Atividade biológica de trFGF-18 nas formulações secas por congelação candidatas,durante o armazenamento, no Bioensaio (U/recipienie)
Tabeia 9: Formas oxidadas de FGF-8 nas formulações secas por congelação candidatas durante oarmazenamento {em %)
Tabela 10: Humidade residual nas formulações secas por congelação de FGF-18candidatas, durante o armazenamento (em %)
Tabela 11: Valores de pH das formulações secas por congelação de FGP-18 candidatas, durante oarmazenamento
Tabela 12: Osmofaiidade das formulações secas por congelação de FGF-18 candidatasdurante o armazenamento
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<210> 1<211> 207<212> PRT <213> Homo sapiens<22 0> <223> FGF-18 humano<4 0 0> 1
Met Tyr Ser Ala Pro Ser Ala Cys Thr Cys Leu Cys Leu His Phe Leu 1 5 10 15
Leu Leu Cys Phe Gin Vai Gin Vai Leu Vai Ala Glu Glu Asn Vai Asp 20 25 30
Phe Arg lie His Vai Glu Asn Gin Thr Arg Ala Arg Asp Asp Vai Ser35 40 45
Arg Lys Gin Leu Arg Leu Tyr Gin Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys50 55 60
His lie Gin Vai Leu Gly Arg Arg Ile Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly65 70 75 80
Asp Lys Tyr Ala Gin Leu Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gin85 90 95
Val Arg lie Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg100 105 110
Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Val115 120 125
Phe lie Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala130 135 140
Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg 145 150 155 160
Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gin Gin Asp Val His Phe Met Lys 165 17Q 175
Arg Tyr Pro Lys Gly Gin Pro Glu Leu Gin Lys Pro Phe Lys Tyr Thr180 185 190
Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg lie Arg Pro Thr His Pro Ala195 200 205 <210> 2<211> 170<212> PRT<213> Artificial <22 0> <223> FGF-18 truncado recombinante (trFGF-18) <400> 2
Met Glu Glu Asn Val Asp Phe Arg lie His Val Glu Asn Gin Thr Arg15 10 15
Ala Arg Asp Asp Val Ser Arg Lys Gin Leu Arg Leu Tyr Gin Leu Tyr 20 25 30
Ser Arg Thr Ser Gly Lys His lie Gin Val Leu Gly Arg Arg lie Ser35 40 45
Ala Arg Gly Glu Asp Gly Asp Lys Tyr Ala Gin Leu Leu Val Glu Thr50 55 60
Asp Thr Phe Gly Ser Gin Val Arg lie Lys Gly Lys Glu Thr Glu 3?he 65 70 75 80
Tyr Leu Cys Met Asn Arg Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly 85 90 95
Thr Ser Lys Glu Cys Val Phe He Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr100 105 110
Thr Ala Leu Met Ser Ala Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr 115 120 125
Lys Lys Gly Arg Pro Arg Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gin Gin130 135 140
Asp Val His Phe Met Lys Arg Tyr Pro Lys Gly Gin Pro Glu Leu Gin 145 150 155 160
Lys Pro Phe Lys Tyr Thr Thr Val Thr Lys165 170

Claims (12)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Formulação seca por congelação estável que compreendeFGF-18, um tampão de fosfato que mantém o pHcompreendido entre 7,0 e 7,5, poloxâmero 188 esacarose.
  2. 2. Formulação seca por congelação estável de acordo com areivindicação 1, em que o tampão de fosfato mantém opH a, ou a aproximadamente, 7,2.
  3. 3. Formulação seca por congelação estável de acordo comqualquer uma das reivindicações anteriores, em que aconcentração do tampão é de, ou de aproximadamente, 5a 100 mM.
  4. 4. Formulação seca por congelação estável de acordo comqualquer uma das reivindicações anteriores, em que aconcentração de poloxâmero 188 é de, ou deaproximadamente, 0,1 a 0,4 mg/frasco.
  5. 5. Formulação seca por congelação estável de acordo comqualquer uma das reivindicações anteriores, em que aconcentração de sacarose é de, ou de aproximadamente,10 a 60 mg/frasco.
  6. 6. Formulação seca por congelação estável de acordo comqualquer uma das reivindicações anteriores, em que aconcentração de FGF-18 é de, ou de aproximadamente, 20a 300 mcg/ frasco.
  7. 7. Formulação seca por congelação estável de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que aformulação compreende 20, 30, 60, 100, 200 ou 300 mcg/frasco de FGF-18, tampão de fosfato 10 mM quemantêm o pH a, ou a aproximadamente, 7,2, 30 mg/frascode sacarose e 0,2 mg/frasco de poloxâmero 188.
  8. 8. Formulação estável de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, em que a formulaçãocompreende ainda um excesso de 5% de FGF-18.
  9. 9. Formulação seca por congelação estável de acordo comqualquer uma das reivindicações anteriores, em que oFGF-18 é selecionado do grupo que consiste em: a. um polipéptido que compreende ou consiste nosresiduos de aminoácidos 28-207 de SEQ ID NO:l, b. um polipéptido que compreende ou consiste nosresiduos de aminoácidos 28-196 de SEQ ID NO:l, e c. um polipéptido que compreende ou consiste na SEQ IDNO: 2 .
  10. 10. Método de produção da formulação seca por congelação estável de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende os passosde: a. formar uma mistura de FGF-18 em conjunto com o tampão de fosfato, o poloxâmero 188 e a sacarose, e b. submeter a mistura a liofilização.
  11. 11. Artigo de fabrico que compreende um primeiro recipiente que compreende a formulação seca porcongelação estável de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 9 e um segundo recipiente que compreende um solvente para reconstituição.
  12. 12. Artigo de fabrico de acordo com a reivindicação11, em que o recipiente que compreende a formulaçãoseca por congelação estável e aquele que compreende umsolvente para reconstituição são os doiscompartimentos de um sistema de dupla câmara.
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