KR20140041600A

KR20140041600A - Fgf-18의 동결-건조된 제제

Info

Publication number: KR20140041600A
Application number: KR1020137034615A
Authority: KR
Inventors: 알레산드라 세레티; 알레산드라 델 리오
Original assignee: 아레스 트레이딩 에스.에이.
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2014-04-04
Also published as: CY1117933T1; PL2720710T3; AR086956A1; EA024937B1; DK2720710T3; HRP20160566T1; EA201490032A1; TWI527590B; MX338017B; BR112013032400B1; IL229977A; PT2720710E; CA2836667C; SI2720710T1; JP5981538B2; JP2014522807A; MX2013014894A; US20140121162A1; TW201302217A; SG195021A1

Abstract

본 발명은 약학적 제제의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 섬유아세포 성장인자 18 (Fibroblast Growth Factor 18 (FGF-18)) 단백질의 동결-건조된 제제 및 이러한 제제의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 동결-건조된 제제는 적당한 시간 동안 저장시 안정하다. 그들은 골관절염 또는 연골 상해와 같은 연골 장애의 치료를 위해 재구성 후 사용될 수 있다.

Description

FGF-18의 동결-건조된 제제{FREEZE-DRIED FORMULATIONS OF FGF-18}

본 발명은 약학적 제제의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 섬유아세포 성장인자 18 (Fibroblast Growth Factor 18 (FGF-18)) 단백질의 동결-건조된 제제 및 이러한 제제의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 동결-건조된 제제는 적당한 시간 동안 실온에서 저장시 안정하다.

섬유아세포 성장인자 18 (FGF-18)는 단백질의 섬유아세포 성장인자 (FGF) 패밀리의 구성원이며, FGF-8 및 FGF-17에 밀접하게 관련된다. FGF 패밀리의 구성원은 헤파린 결합 도메인을 특징으로 한다. 이러한 추정 헤파린-결합 도메인은 FGF-18에 대하여 확인되었다. 수용체-매개된 신호는 세포-표면 헤파린 설페이트 프로테오글리칸으로 복합된 FGF 리간드의 결합시 시작된다는 것이 상정되었다.

FGF-18는 연골세포 및 조골세포를 위한 증식제라는 것이 나타났다(Ellsworth et al., 2002, Osteoarthitis and Cartilage, 10: 308-320; Shimoaka et al., 2002, J. Bio. Chem. 277(9):7493-7500). FGF-18은 단독으로(WO2008/023063) 또는 히알루론산과 조합하여(WO2004/032849) 골관절염 및 연골 손상과 같은 연골 장애의 치료에 제안되었다.

FGF 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 그 기술분야에 알려져 있다. WO00/21548은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 조합하여 재조합 FGF를 포함하는 약학적 조성물을 개시한다. 주사가능한 용액을 위한 적절한 담체 또는 희석제의 예는 물 또는 등장성 식염수 용액을 포함한다.

WO2008/121563은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 단위 투여량 주사가능 형태로 제조된 FGF-21 화합물을 포함하는 약학적 제제에 관한 것이다. 적절한 담체는 특히 당, 완충제 및/또는 계면활성제일 수 있다.

WO92/01442는 FGF, 약학적으로 허용가능한 벌킹제, 및 i) 셀룰로오스의 알칼리 금속염 또는 ii) 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르와 시스테인의 조합을 포함하는 냉동건조된 조성물을 개시한다. i) 및 ii)의 성분들은 FGF 조성물이 안정화되도록 한다.

WO01/39788은 약학적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 포스페이트 완충 식염수와 혼합물에서, 사이토톡신과 함께 FGF-18 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 기재하고 있다.

WO2008/023063은 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 등과 함께 FGF-18 화합물을 포함하는 제제를 개시한다. 예로서, 식염수, 덱스트로스 용액, 세럼 알부민 및 링거 용액과 같은 비히클에 FGF-18을 포함하는 주사용 제제를 개시한다.

생리활성 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 제조할 때, 상기 조성물은 단백질의 활성이 적절한 시간 동안 유지되도록 제제화되어야 한다. 단백질의 활성/안정성의 손실은 변성, 응집 또는 산화에 현저히 기인하는 단백질의 화학적 또는 물리적 불안정성으로부터의 결과일 수 있다. 따라서 결과 산물은 약학적으로 허용가능하지 않을 수 있다. 부형제(들)의 사용이 해당 단백질의 안정성을 증가시키는 것으로 알려져 있더라도, 이들 부형제의 안정화 효과는 부형제 및 생리활성 단백질 자체의 성질에 크게 의존한다.

활성 성분으로서 FGF-18을 포함하며, 적절한 기간 동안 안정하고 주사, 바람직하게는 관절 내 주사에서의 사용에 적합한 다른 제제에 대한 요구가 존재한다. 상기 제제는 골관절염 또는 연골 손상과 같은 환자에서 연골 장애의 치료에서의 투여에 유용할 수 있다.

본 발명의 목적은 FGF-18 단백질을 함유하는 신규의 제제를 제공하는 것이다. 보다 구체적으로, 상기 제제는 FGF-18을 함유하는 안정한 동결-건조된 (또는 냉동건조된) 제제이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 동결-건조된 제제의 제조방법을 제공한다. 본원에 설명된 동결-건조된 제제는 재구성 후 연골 장애의 치료에서 투여를 위해서 유용할 수 있다.

제1 양태에서, 본 발명은 FGF-18, 완충제, 폴록사머 계면활성제 및 안정화제로서 당(sugar)을 포함하거나 이들로 이루어진 안정한 동결-건조된 제제를 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 완충제는 포스페이트 완충제이고, 폴록사머 계면활성제는 폴록사머 188이고, 안정화제는 수크로오스이다. 다른 바람직한 실시형태에서 완충제는 pH를 6 내지 8 또는 그 정도로 유지하고, 더욱 바람직하게는 7.2 또는 그 정도에서 유지한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 폴록사머 계면활성제의 농도는 0.1 내지 0.4 mg/vial 또는 그 정도이다. 바람직하게는, FGF-18은 1) SEQ ID NO: 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 207(Ala)를 포함하거나 이들로 이루어진 서열에 해당하는, 사람 FGF-18의 성숙 형태를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드, 2) SEQ ID NO:1의 잔기 28 (Glu) 내지 잔기 196 (Lys)를 포함하거나 이들로 이루어진 사람 FGF-18의 절단(truncatdd) 형태를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드, 및 3) SEQ ID NO:2를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 바람직하게는, FGF-18은 이하에 정의된 바와 같이 trFGF-18이다.

제2 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 FGF-18의 안정한 동결-건조된 제제의 제조방법을 제공한다:

1) 완충제, 계면활성제 및 안정화제와 함께 FGF-18의 혼합물을 형성하는 단계, 및

2) 상기 혼합물을 냉동건조(동결-건조)하는 단계,

여기서 상기 완충제는 포스페이트 완충제이고, 안정화제는 수크로오스와 같은 당이고, 계면활성제는 폴록사머 188과 같은 폴록사머 계면활성제이다. 바람직한 실시형태에서, 완충제는 pH를 6 내지 8 또는 그 정도로 유지하고, 보다 구체적으로는 7.2 또는 그 정도이다. 바람직하게는, FGF-18은 1) SEQ ID NO: 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 207(Ala)를 포함하거나 이들로 이루어진 서열에 해당하는, 사람 FGF-18의 성숙 형태를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드, 2) SEQ ID NO:1의 잔기 28 (Glu) 내지 잔기 196 (Lys)를 포함하거나 이들로 이루어진 사람 FGF-18의 절단 형태를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드, 및 3) SEQ ID NO:2를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 바람직하게는, FGF-18은 이하에 정의된 바와 같이 trFGF-18이다.

제3 양태에서, 본 발명은 이하를 포함하는 약학적 또는 수의학적 용도를 위한 제조품을 제공한다:

1) 안정한 동결-건조된 제제를 포함하는 제1 용기이며, 상기 동결-건조된 제제는 FGF-18, 완충제, 계면활성제 및 안정화제를 포함하는 제1 용기, 및

2) 재구성을 위한 용제를 포함하는 제2 용기,

여기서 상기 완충제는 포스페이트 완충제이고, 안정화제는 수크로오스와 같은 당이고, 계면활성제는 폴록사머 188과 같은 폴록사머 계면활성제이고, 재구성을 위한 용제는 물 또는 식염수 용액(주사용 0.9% w/v 염화나트륨)이다. 바람직하게는, FGF-18은 1) SEQ ID NO: 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 207(Ala)를 포함하거나 이들로 이루어진 서열에 해당하는, 사람 FGF-18의 성숙 형태를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드, 2) SEQ ID NO:1의 잔기 28 (Glu) 내지 잔기 196 (Lys)를 포함하거나 이들로 이루어진 사람 FGF-18의 절단 형태를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드, 및 3) SEQ ID NO:2를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 바람직하게는, FGF-18은 이하에 정의된 바와 같이 trFGF-18이다.

도 1: 냉동건조 프로세스 전에 FGF-18 회수에 대한 계면활성제 (폴록사머 188)의 효과를 나타낸다. 계면활성제의 농도를 변화시키면서 (0 내지 0.2 %), pH 7.2에서의 포스페이트 완충제에 10 mg/ml (+ 5% 오버레이지) FGF-18을 함유하는 예비-제제를 사용하였다. 단백질 성분은 여과 전 (BF) 및 여과 후에 (T=0) 예비-제제의 각각에 대하여 평가하였다.

정의

- 본원에 사용된 용어 "FGF-18 단백질" 또는 "FGF-18"은 사람 FGF-18 단백질의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 단백질인 것으로 의도된다. FGF-18은 그것의 성숙 형태로 천연이거나, 그것의 절단(truncated) 형태일 수 있다. 사람 FGF-18 단백질의 생물학적 활성은 조골세포 활성 (W098/16644 참조) 또는 연골 형성 (WO2008/023063 참조) 증가를 현저하게 포함한다.

천연, 또는 야생형 사람 FGF-18은 관절 연골의 연골세포로 발현되는 단백질이다. 사람 FGF-18은 첫째로 지정된 zFGF-5이고 W098/16644에 충분히 설명되어 있다. SEQ ID NO:1은 천연 사람 FGF-18의 아미노산 서열에 해당하고, 아미노산 잔기 1(Met) 내지 27(Ala)로 이루어진 신호 펩티드를 갖는다. 사람 FGF-18의 성숙 형태는 SEQ ID NO: 1 (180 아미노산)의 잔기 28(Glu)로부터 잔기 207(Ala)까지 아미노산 서열에 해당한다. FGF-18은 FGFR4에 대한 특이성을 갖고 "lllc"는 FGFR3 및 FGFR2의 변이체를 잇는다 (Ellsworth et al., 2002, Osteoarthritis and Cartilage, 10: 308-320). FGF-18의 성숙 형태는 21.04 kDa의 평균 질량을 갖는다.

본 발명에서 FGF-18는 출원 WO2006/063362에 의해 교시되는 바와 같이 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 발현 시스템 및 조건에 의존하여, 본 발명에서 FGF-18은 출발 메티오닌 (Met 잔기) 또는 분비에 대한 신호 서열을 갖는 재조합 호스트 셀에서 발현된다. E. coli와 같은 원핵 호스트에서 발현될 때, FGF-18은 그것의 서열의 N-말단에서 추가의 Met 잔기를 포함한다. 예를 들어, 사람 FGF-18의 아미노산 서열은 E.coli에서 발현시 N-term (포지션 1)에서 Met 잔기로 시작한 다음 SEQ ID NO: 1의 잔기 28 (Glu) 내지 잔기 207 (Ala)이다.

- 본원에 사용된 용어 FGF-18의 "절단 형태"는 SEQ ID NO: 1의 잔기 28(Glu) 내지 196(Lys)를 포함하거나 이들로 이루어진 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, FGF-18 단백질의 절단 형태는 폴리펩티드 지정된 "trFGF-18" (170 아미노산)이며, 이것은 (N-말단에서) Met 잔기로 시작한 다음 야생형 사람 FGF-18의 아미노산 잔기 28 (Glu) -196 (Lys)이다. trFGF-18의 아미노산 서열은 SEQ ID NO :2에 나타낸다 (SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 2 내지 170은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 28 내지 196에 해당한다). trFGF-18은 E.coli에서 생성된, 사람 FGF-18의 재조합 절단 형태이다 (WO2006/063362 참조). trFGF-18은 성숙 사람 FGF-18와 유사한 활성을 나타낸다는 것이 보여졌고, 예를 들어 이것은 연골세포 증식 및 연골 침착을 증가시켜서 다양한 연골질 조직에 대한 보수 및 재구성을 유도한다 (WO2008/023063 참조). trFGF-18은 19.83 kDa의 평균 질량을 갖는다.

- 본원에 사용된 용어 "안정성"은 본 발명에 따른 제제에서 FGF-18의 물리적, 화학적 및 형태적 안정성을 지칭한다 (그리고 생물학적 효능의 유지 포함). 단백질 제제의 불안정성은 단백질 분자의 화학적 열화 및 응집을 초래하여 본 발명의 FGF-18 단백질의 적어도 하나의 생물학적 활성을 감소시키는 더 높은 차수의 폴리머, 탈글리코실화, 글리코실화의 변형, 산화 또는 임의의 다름 구조적 변형을 형성한다.

- 본원에 사용된 용어 "안정한" 용액 또는 제제는 단백질의 열화, 변형, 응집, 생물학적 활성의 손실 등의 정도가 허용가능하게 조절되고, 시간에 따라 허용불가능하게 증가하지 않는 하나의 용액 또는 제제이다. 바람직하게는, 제제는 실온에서 적어도 12개월의 기간 넘게 FGF-18 활성의 적어도 80% 초과를 유지한다. FGF-18을 포함하는 본 발명의 안정화된 제제는 실온에서 저장시 바람직하게는 적어도 약 12개월, 18개월, 보다 바람직하게는 적어도 20개월, 더욱 바람직하게는 약 24개월의 저장 수명을 갖는다. 본 발명의 FGF-18 제제의 안정성의 모니터링 방법은 기술분야에서 이용가능하고, 본원에 개시된 실시예에 기재된 방법을 포함한다.

- 본원에 사용된 용어 "완충제"는 약학적 또는 수의학적 용도를 위한 제제에서 안전한 것으로 공지되어 있고 제제에 요망되는 pH 범위에서 제제의 pH를 유지하거나 조절하는 효과를 갖는 화합물의 용액을 지칭한다. 적정한 산성 pH 내지 적정한 염기성 pH로 pH를 조절하기 위한 허용가능한 완충제는 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 아르기닌, TRIS 및 히스티딘 완충제를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. "TRIS"는 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3,-프로판디올, 및 그것의 임의의 약물학적으로 허용가능한 염을 지칭한다. 본 발명에 따르면, 바람직한 완충제는 포스페이트 완충제이다.

- 본원에 사용된 용어 "계면활성제"는 소수성, 오일상 물질의 수용성을 현저히 증가시키거나, 그외 상이한 소수성을 갖는 두개의 물질의 혼화성을 증가시키는데 사용할 수 있는 가용성 화합물을 지칭한다. 이러한 이유로, 이들 폴리머는 산업상 용도, 화장품 및 의약품에 일반적으로 사용된다. 이들은 또한 현저하게 타겟 조직에 약물의 흡수 또는 그것의 전달을 변형시키기 위해서 약물 전달 용도를 위한 모델 시스템으로서 사용된다. 잘 알려진 계면활성제는 폴리소르베이트 (폴리옥시에틸렌 유도체; Tween) 및 폴록사머 (즉 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드에 기반한 코폴리머, Pluronics®로서 공지됨)를 포함한다. 본 발명에 따르면, 바람직한 계면활성제는 폴록사머 계면활성제이고, 보다 바람직하게는 폴록사머 188 (Pluronic® F68)이다.

- 본원에 사용된 용어 "안정화제", "안정제" 또는 "등장제"는 생리학적으로 용인되고 제제에 적절한 안정성/긴장성을 부여하는 화합물이다. 이것은 제제와 접촉하는 세포막을 가로질러 물의 총 흐름을 현저하게 방지한다. 동결-건조 (냉동 건조) 프로세스 동안, 안정제는 또한 냉동보호제로서 효과적이다. 글리세린과 같은 화합물은 이러한 목적으로 보통 사용된다. 다른 적절한 안정화제는 아미노산 또는 단백질 (예를 들어 글리신 또는 알부민), 염 (예를 들어 염화나트륨) 및 당 (예를 들어 덱스트로스, 만니톨, 수크로오스 및 락토스)를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따르면, 바람직한 안정화제는 당, 보다 바람직하게는 수크로스이다.

- 본원에 사용된 용어 "바이알" 또는 "용기"는 냉동건조된 형태로 FGF-18 제제를 보유하는데 적합한 저장소를 넓게 지칭한다. 유사하게는, 이것은 재구성을 위한 용제를 보유할 것이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 바이알의 예는 주사기, 앰플, 카트리지 또는 주사, 바람직하게는 관절 내 주사를 통해 환자에게 FGF-18 제제의 전달에 적합한 다른 저장소를 포함한다. 대안적으로, FGF-18 제제를 보유하는 바이알 및 재구성을 위한 용제를 보유하는 바이알이 듀얼-챔버 시스템(예를 들어 주사기 또는 카트리지)의 2 구획으로서 존재할 수 있다. 주사 투여를 위한 포장 제품에 적절한 바이알은 잘 알려져 있으며 기술분야에서 인지된다.

- 본원에 사용된 용어 "용제"는 수성 또는 비수성 액체 용제를 지칭한다. 용제의 선택은 상기 용제에 대한 약물 화합물의 용해도 및 투여 방식에 현저하게 의존한다. 수성 용제는 물 단독으로 이루어질 수 있거나, 또는 물 플러스 하나 이상의 혼화성 용제로 이루어질 수 있고, 당, 완충제, 염 또는 다른 부형제와 같은 용해된 용질을 함유할 수 있다. 보다 일반적으로 사용되는 비수성 용제는 메탄올, 에탄올, 프로판올과 같은 단쇄 유기 알콜, 아세톤과 같은 단쇄 케톤, 및 글리세롤과 같은 폴리 알콜이다. 본 발명에 따르면, 바람직한 용제는 물 또는 식염수 용제와 같은 수성 용제이다.

- 본원에 사용된 용어 "연골 장애"는 외상적 상해 또는 연골질환으로 인한 손상으로부터 유래한 장애를 포함한다. 본원에 기재된 FGF-18 제제의 투여에 의해 치료될 수 있는 연골 장애의 예는 골관절염 또는 류마티스 관절염과 같은 관절염, 및 연골 장해를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

- 용어 "골관절염"은 가장 일반적인 형태의 관절염을 의도하는데 사용된다. 이것은 연골의 파괴에 기인할 수 있다. 연골의 조각은 파괴되고 통증 및 뼈 사이의 관절에서 종창(swelling)을 유발할 수 있다. 시간이 지남에 따라 연골은 전체적으로 마모될 수 있고, 뼈가 함께 문질러질 것이다. 골관절염은 임의의 관절에 영향을 미칠 수 있지만 대개 손, 및 엉덩이, 무릎, 발 및 척추와 같은 체중-지지 관절에 영향을 미친다. 바람직한 예에서, 골관절염은 무릎 골관절염 또는 엉덩이 골관절염이다. 당업자는 기술분야, 특히 OARSI 평가 시스템에서 사용되는 골관절염 분류를 충분히 인지한다 (예를 들어 Custers et al., 2007 참조). 골관절염은 본 발명에 따른 FGF-18 제제를 투여하여 치료할 수 있는 바람직한 연골 장애 중 하나이다.

- 본원에 사용되는 용어 "연골 상해"는 현저하게 외상으로부터 기인하는 연골 장애 또는 연골 손상이다. 연골 상해는 외상적 기계적 파괴, 더욱 현저하게 사고 또는 수술의 결과로서 발생할 수 있다. 또한 이 용어 내에서 고려되는 것은 스포츠 관련 상해 또는 스포츠 관련 관절 조직의 마모이다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 주요 목적은 FGF-18 단백질, 완충제, 폴록사머 계면활성제 및 안정화제로서 당을 포함하거나 이들로 이루어진 안정한 동결-건조된 제제이다. 바람직한 실시형태에서, 완충제는 포스페이트 완충제이고, 폴록사머 계면활성제는 폴록사머 188이고, 안정화제는 수크로오스이다. 바람직하게는, FGF-18 단백질은 1) SEQ ID NO: 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 207(Ala)를 포함하거나 이들로 이루어진 서열에 해당하는, 사람 FGF-18의 성숙 형태를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드, 2) SEQ ID NO:1의 잔기 28 (Glu) 내지 잔기 196 (Lys)를 포함하거나 이들로 이루어진 사람 FGF-18의 절단 형태를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드, 및 3) SEQ ID NO:2를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 바람직하게는, FGF-18은 trFGF-18이다.

본 발명에서 FGF-18의 농도는 바람직하게는 20 내지 300 mcg/vial 또는 그 정도, 바람직하게는 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 300 mcg/vial 또는 그 정도, 더욱 바람직하게는 20, 30, 60, 100, 200 또는 300 mcg/vial 또는 그 정도이다. FGF-18은 제제화 동안 발생할 수 있는 단백질 손실을 방지하기 위해서 5% 과량으로 첨가할 수 있다. 예를 들어, 30 mcg/vial의 FGF-18 농도를 위해서, 화합물은 31.5 mcg/vial의 양으로 첨가될 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 제제는 냉동 건조 및/또는 포장시 적어도 12개월의 기간을 넘어서 (첫번째 사용 전에) FGF-18 생물학적 활성의 적어도 80%를 보유한다. FGF-18 활성은 하기 "실시예"에 기재된 바와 같이 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 바람직한 완충제는 포스페이트 완충제이고, 6 내지 8로 이루어진, 바람직하게는 7 내지 7.5로 이루어진, 보다 바람직하게는 7.2 또는 그 정도로 pH를 유지한다.

전체 용액에서 완충제 농도는 바람직하게는 5 내지 500 mM 또는 그 정도이다. 바람직한 실시형태에서, 완충제의 농도는 10 내지 100 mM 또는 그 정도이다. 바람직하게는, 완충제의 농도는 10 mM 또는 그 정도이다.

본 발명에서 안정화제는 바람직하게는 당이다. 바람직한 당은 수크로오스이다. 바람직하게는 안정화제의 농도는 0.5 내지 250 mg/vial 또는 그 정도, 보다 바람직하게는 1 내지 100 mg/vial 또는 그 정도, 더욱 구체적으로는 15 내지 60 mg/vial 또는 그 정도, 더욱 더 바람직하게는 30 mg/vial 또는 그 정도이다.

본 발명에 따른 계면활성제는 바람직하게는 폴록사머 계면활성제이고, 특히 폴록사머 188 (즉 Pluronic® F68)이다. 바람직하게는 계면활성제의 농도는 0.01 내지 10 mg/vial 또는 그 정도, 보다 바람직하게는 0.05 내지 5 mg/vial 또는 그 정도, 더욱 구체적으로는 0.1 내지 1 mg/vial 또는 그 정도, 더욱 더 바람직하게는 0.1, 0.2 또는 0.4 mg/vial 또는 그 정도, 특히 0.2 mg/vial 또는 그 정도이다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명에서 안정한 동결-건조된 제제는 FGF-18의 20, 30, 60, 100, 200 또는 300 mcg/vial 또는 그 정도, pH 7.2에서 10 mM 포스페이트 완충제, 30 mg/vial의 수크로오스 및 0.2 mg/vial의 폴록사머 188을 포함하거나 이들로 이루어진다. 5% 오버에이지가 포함되는 경우, 본 발명에 따른 동결-건조된 제제는 21, 31.5, 63, 105, 210 또는 315 mcg/vial 또는 그 정도로 FGF-18를 포함한다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 안정한 동결-건조된 제제에 관한 것이다:

1) 1:95000 내지 1:6000 또는 그 정도, 바람직하게는 1:92000, 1:61000, 1:31000, 1:18450, 1:9200, 또는 1:6100 또는 그 정도의 농도비의 FGF-18:수크로오스,

2) 1:25 내지 6:10 또는 그 정도, 바람직하게는 1:25, 5:83, 5:42, 1:5, 2:5, 또는 6:10 또는 그 정도의 농도비의 FGF-18:폴록사머 188,

3) 1:10500 내지 1:700 또는 그 정도, 바람직하게는 1:10500, 1:7000, 1:3500, 1:2100, 1:1050, 또는 1:700 또는 그 정도의 몰비의 FGF-18:pH 7.2에서 포스페이트 완충제,

여기서 FGF-18 단백질은 바람직하게는 1) SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 28(Glu) 내지 잔기 207(Ala)를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드, 2) SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 28 (Glu) 내지 잔기 196 (Lys)를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드, 및 3) SEQ ID NO:2를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 바람직하게는 FGF-18 단백질은 SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 28(Glu)-207(Ala)를 포함하거나 이들로 이루어진다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 안정한 동결-건조된 제제에 관한 것이다:

1) 1:90000 내지 1:5000 또는 그 정도, 바람직하게는 1:87000, 1:58000, 1:29000, 1:17400, 1:8700, 또는 1:5800 또는 그 정도의 몰비의 FGF-18:수크로오스,

2) 5:120 내지 5:8 또는 그 정도, 바람직하게는 5:118, 5:79, 10:79, 10:47, 5:12, 또는 5:8 또는 그 정도의 몰비의 FGF-18:폴록사머 188,

3) 1:10000 내지 1:700 또는 그 정도, 바람직하게는 1:10000, 1 :6600, 1:3300, 1:2000, 1:1000, 또는 1:700 또는 그 정도의 몰비의 FGF-18:pH 7.2에서 포스페이트 완충제,

여기서 FGF-18 단백질은 바람직하게는 1) SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 28(Glu) 내지 잔기 207(Ala)를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드, 2) SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 28 (Glu) 내지 잔기 196 (Lys)를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드, 및 3) SEQ ID NO:2를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 바람직하게는 FGF-18 단백질은 SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 28(Glu)-196(Lys)를 포함하거나 이들로 이루어진다. 보다 바람직하게는, FGF-18 단백질은 SEQ ID NO:2를 포함하거나 이루어지고, 특정 실시형태에서 FGF-18은 trFGF-18이다.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 상기 기재된 FGF-18의 안정한 동결-건조된 제제의 제조방법을 제공한다:

1) 완충제, 폴록사머 계면활성제 및 안정화제로서 당과 함께 FGF-18의 혼합물을 형성하는 단계, 및

2) 상기 혼합물을 냉동건조하는 단계.

단계 1 및 2는 종래의 방법을 사용하여 행한다. 예로서, 적합한 안정한 제제를 제조하기 위해서, 주어진 양의 FGF-18, 예컨대 trFGF-18을 pH를 7.2 또는 그 정도로 유지하는 포스페이트 완충제, 폴록사머 188 및 수크로오스와 혼합한다. 이들 각 화합물 (즉 FGF-18, 완충제, 계면활성제 및 안정화제)은 상기 기재된 농도, pH, 및/또는 비에 따라 사용할 수 있다. 얻어진 혼합물을 냉동 건조한 다음 바이알로 분배한다. 이 과정의 변형은 당업자에게 인지될 것이다.

본 발명은 또한 다음을 포함하는 약학적 또는 수의학적 용도를 위한 제조품을 제공한다:

1) 상기 기재된 안정한 동결-건조된 제제를 포함하는 제1 용기이고, 상기 제제는 FGF-18, 완충제, 폴록사머 계면활성제, 안정화제로서 당을 포함하거나 이들로 이루어진 제1 용기, 및

2) 재구성을 위한 용제를 포함하는 제2 용기.

예로서, 제1 용기는 주어진 양의 FGF-18, 예컨대 trFGF-18, pH를 7.2 또는 그 정도로 유지하는 포스페이트 완충제, 폴록사머 188 및 수크로오스를 포함하거나 이들로 이루어진 안정한 동결-건조된 제제를 포함하고, 제2 용기는 식염수 용액 (주사용 0.9% w/v 염화나트륨)을 포함한다. 이들 각 화합물 (즉 FGF-18, 완충제, 계면활성제 및 안정화제)은 상기 기재된 농도, pH 및/또는 비에 따라 사용할 수 있다. 바람직하게는 FGF-18 제제를 보유하는 용기 및 재구성을 위한 용제를 보유하는 용기는 듀얼-챔버 시스템 (예를 들어 주사기 또는 카트리지)의 2개 구획에 대응한다.

또한 용제 (제2 용기)에서 FGF-18의 동결-건조된 제제 (제1 용기)를 재구성하기 위한 설명서를 제공하는 포장 재료가 기재된다.

본 발명의 동결-건조된 제제는 적어도 약 12개월 내지 약 24개월 동안 유지될 수 있다. 바람직한 저장 조건하에서, 첫번째 사용 전에, 제제는 실온(25℃ 또는 그 정도)에서 불빛을 멀리하여 (바람직하게는 어둠에서) 유지된다.

본 발명의 안정한 동결-건조된 제제는 바람직하게는 멸균 조건하에서 물 또는 식염수 용액(예를 들어 주사용 0.9% w/v 염화나트륨)과 같은 용제로 사용 전에 즉 주사 전에 재구성될 필요가 있다. 재구성 후, 주사되는 부피는 바람직하게는 0.5 mL 내지 5 mL, 보다 바람직하게는 0.5, 1 또는 2 mL이다. FGF-18 제제는 바람직하게는 재구성의 1시간 내에 투여되어야 한다.

본 발명은 약학적 또는 수의학적 용도에 적합한 특히 단일 용도로 FGF-18의 안정한 동결-건조된 제제를 제공한다.

본 발명에서 FGF-18을 포함하는 안정한 동결-건조된 제제는 재구성 후 연골 보수 개선, 또는 골관절염 또는 연골 상해와 같은 연골 장애의 치료를 위한 투여를 위해 사용될 수 있다.

재구성 후 이들 안정한 동결-건조된 제제는 주사 및 대안적 전달 시스템에서 사용에 적합하다. 특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 제제는 관절 내 주사를 위한 것이다. 이들은 재구성 후 관절의 윤활액으로 직접 주사에 의해 또는 결함으로 직접 투여될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 관절 내 투여는 엉덩이, 무릎, 팔꿈치, 손목, 발목, 척추, 발, 손가락, 발가락, 손, 어깨, 늑골, 어깨뼈, 넓적다리, 정강이, 발뒤꿈치의 관절 및 척추의 뼈대 포인트를 따른 관절로부터 선택된 관절에서 행한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 관절 내 투여는 엉덩이 또는 무릎의 관절에서 행한다.

본 발명의 FGF-18 제제는 개선된 안정성을 가지며, 실온 (25℃ 또는 그 정도)에서 또는 2-8℃에서 (하기 실시예 참조), 바람직하게는 실온에서 용이하게 저장할 수 있다. 실제로, 발명자들은 FGF-18 (예를 들어 trFGF-18), pH 7.2에서 10 mM 포스페이트 완충제, 30 mg/vial의 수크로오스 및 0.2 mg/vial 폴록사머 188를 포함하는 동결-건조된 제제가 시간이 지남에 따라, 현저하게는 실온에서 저장시 안정하다는 것을 발견하였다. 상기 제제는 활성 원칙, 즉 FGF-18의 손실을 최소화한다. 또한 상기 제제는 산화 및 단백질 응집체의 형성에 더욱 내성이 있다는 것이 발견되었다.

하기 실시예는 본 발명의 제제 및 조성물의 제조를 더욱 설명한다. 본 발명의 범위는 단지 하기 실시예로 구성되는 것으로 이해되지 않는다.

서열의 설명

SEQ ID N0.1 : 천연 사람 FGF-18의 아미노산 서열.

SEQ ID NO.2: 재조합 절단된 FGF-18의 아미노산 서열 (trFGF-18).

실시예

재료

출원 WO2006/063362에 기재된 기술에 따라서 E.coli에서 발현에 의해 본 실시예의 재조합 절단 FGF-18 (trFGF-18)을 제조하였다. 하기 실시예에서, trFGF-18 및 FGF-18를 상호교환적으로 사용한다.

실시예에서 사용된 다른 물질은 하기와 같다:

- 수크로오스 (1.07653, Merck; 분자량: 342.30 g/Mol)

- 소듐 디히드로젠 포스페이트 모노히드레이트 (1.06345, Merck)

- 디히드레이트 디소듐 히드로젠 포스페이트 (1.06586, Merck)

- 폴록사머 188 (Lutrol F 68 DAC, USP/NF, Basf; 분자량: 8400 g/Mol)

- 주사용 물,

- 식염수 용액 (주사용 0.9% w/v 염화나트륨)

- 모노클론 항체 항-FGF-18 클론 #F5A2, 단백질 성분을 위해 (RBM에 의해 제공됨)

- BAF3-FGFR3c 세포 (Washington University)

- Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 기반한 선택 배지(Invitrogen).

- ATPIite 1 단계 발광 분석 시스템 (Perkin Elmer)

- 헤파린 H3149 (Sigma)

장치

- AMICON ULTRA-4 10,000 cutoff (UFC 8012024, Amicon)

- Biacore 2000 (Biacore)

- C02 인큐베이터 (Heraeus)

- Column TSK2000SWxl, 7.8 x 300 mm, 5 μ (TosoHaas, code 08540)

- Guard 컬럼 TSKG2000 (Hichrom, code 8543)

- HPLC 시스템 (Waters)

- 발광측정기 (Perkin Elmer)

- 멤브레인 필터 0.22 μm (Durapore type GWVP, Millipore)

- Stabileo 소프트웨어 (ver. 1.1; Microsoft® Excel Visual Basic®의 패키지)

- GraphPad 소프트웨어 (Prism)

- 스테인레스 스틸 홀더 22 mL 및 220 mL 용량 (Sartorius)

- Zorbax 300SB-C18 (150X4.6cm) 컬럼

- DIN2R (3 ml) 유리 바이알 (Nuova OMPI)

- 코팅된 고무 마개 (S2F452, D777-1, B2-40, West Pharmaceutical)

- 고무 마개 (code 1779, W1816 grey, Pharma-Gummi)

방법

제제에 대한 상이한 분석

표준 방법을 사용하였다:

- SE-HPLC,

- RP-HPLC,

- 잔여 수분,

- pH,

- 삼투압 (시간 0, 오직),

- SDS-PAGE/SS, 및

- 펩티드 매핑/UPLC (산화 형태).

단백질 성분

상이한 제제에서 단백질, 즉 trFGF-18의 정량화를 Biacore에 의해 행하였다. trFGF-18을 함유하는 샘플 (25μL)를 (적절하게는 10 mg/mL BSA의 존재하에 희석됨) 모노클론 항체 항-FGF-18 클론 F5A2으로 미리 코팅된, 센서 표면 위로, 25℃에서, 5μL/min에서 플로잉에 의해, 그 다음 재생 완충제로서 5μL의 10mM 글리신 pH 2.0에 의해 테스트하였다. 125 내지 2,000 ng/mL 범위인 표준 시료 (IRS FGF-18 No. 051230)를 각 분석 세션에서 수행하였다. 결과를 공명 유닛(RU)으로서 수집하고 각 샘플의 FGF-18 수준을 로그 변환 데이터로 이차 알고리즘을 사용하여 피팅된 표준 곡선으로부터 추론하였다.

바이오어세이

FGF-18의 생물학적 활성을 FGF 수용체 3c (FGFR3c)로 안정하게 트랜스펙션된 BaF3 셀라인을 사용하는 인비트로 바이오어세이에 의해 증식 활성으로서 측정한다. FGFR3c를 발현하는 BaF3 세포가 FGF-18 자극하에서 증식한다.

BaF3/FGFR3c 세포를 성장 인자로서 r-hIL-3의 존재에서 RPMI 1640 기반 선택적 배지에서 배양한다. FGF-18의 증식 효과를 구체적으로 테스트하기 위해서, 세포는 IL-3 제거할 필요가 있다. 그러므로, 세포를 어세이 전에 26시간 동안 r-hIL-3의 부재에서 37℃, 5% C0₂에서 배양한다.

표준 시료 및 샘플을 0.002 U/mL 내지 177.5 U/mL의 농도 범위에서 어세이 배지에 5-배 순차 희석한다. IL-3 제거된 BAF3/FGFR3c 세포 (20,000 cells/well)를 1 μg mL 헤파린 및 10% Newborn Calf Serum의 존재하에서 FGF-18와 함께 37°C, 5% C02에서 인큐베이션한 다음, 48 시간 후 "ATPlite 1 step" 발광 어세이, Firefly luciferase에 기반한 ATP 모니터리 시스템에 의해 세포 증식을 평가한다.

연장된 용량-반응 곡선 모델을 적용하여 샘플 효능을 측정한다. 이 모델과 함께, 가변 기울기 (4PL) 알고리즘 보고 cps (즉 카운터 퍼 세컨드) 값 대 FGF-18 농도의 로그로 에스자형 용량-반응 곡선에 의해 표준 시료 및 샘플의 전체 용량-반응 곡선을 피팅한다. 각 곡선에 대하여 EC₅₀는 GraphPad 소프트웨어에 의해 자동으로 산출된다. 샘플 효능은 표준 제조물의 EC₅₀과 미지의 샘플의 EC50 사이의 비(효능 비)에 기초하여 산출된다. FGF-18의 효능은 U/mL로 표현된다.

실시예 1: trFGF-18의 동결-건조된 제제

FGF-18 동결-건조된 제제의 조성을 하기 표 1에 제공한다.

동결-건조된 제제를 하기와 같이 제조하였다: 수크로오스 및 폴록사머 188 을 포스페이트 완충제에 용해하였다. 그 다음, 필요한 양의 약물 물질 (trFGF-18)을 첨가하고, pH를 확인하고, 용액을 최종 부피로 취하였다. 그 다음 용액을 질소 압력하에서 0.22 μm 멤브레인 (Durapore®)을 통해 여과하고, 여과 비를 약 20 cc/cm² 또는 약 50 cc/cm²로 유지하였다.

그 다음 최종 용액을 멸균 조건하에서 유리 바이알(0.5 mL/vial)에 수동으로 채우고, 하기 사이클에 따라 동결 건조하였다:

동결-건조된 제제는 주사용 물 또는 식염수 용액으로 임의의 시간에 재구성되도록 준비된다.

실시예 2: FGF-18 제제의 예비 안정성 연구

실시예 2.1: 더욱 연구될 동결-건조된 예비-제제를 확인하기 위해서 가속된 안정성 조건 (2-8℃, 25℃ 및 40℃에서)을 사용하였다(데이타는 나타내지 않음).

최적 후보 제제를 확인하기 위해서 다양한 예비의 동결-건조된 제제를 제조하였다. 이 예비 연구의 프레임에서, 포스페이트 및 히스티딘 완충제를 포함하여 다양한 완충제를 평가하였다. 다양한 농도의 수크로오스 및 폴록사머 188 또한 테스트하였다. 순도 (SE-HPLC 및 RP-HPLC에 의해), 단백질 성분 (Biacore에 의해), 생물학적 활성 (인-비트로 바이오어세이), 잔여 수분, pH 및 삼투압에 대하여 예비-후보 제제를 테스트하였다. SDS-PAGE/SS (순도) 및 펩티드 매핑/UPLC (산화 형태)에 의해 지지적 안정성 데이타 또한 발생되었다.

실시예 2.2 (예비 제제에 대한 안정성 데이타; 나타내지 않음): 3-4주 저장에 걸쳐서 SE-HPLC에 의해 예비-동결 건조 제제에 대하여 수집된 안정성 데이타는 pH 7.2에서 포스페이트 완충제가 바람직하다는 것을 나타내고, pH 6에서 히스티딘 완충제와 비교하여 매우 더 높은 순도 수준(즉, 더 높은 모노머 %)이 발견되었기 때문이다 (표 2 참조). 수크로오스의 양 (15 mcg/vial vs 30 mcg/vial)은 또한 응집에 대하여 FGF-18를 안정화하는 역할을 하고, 여기서 30 mcg/vial의 수크로오스로 대체적으로 더 높은 모노머 회수율이 관찰되었다 (25℃ 및 5℃에서 저장). 또한, 계면활성제 (즉 폴록사머 188)가 증가함에 따라, 여과 단계 후 (냉동건조 프로세스 전) 더 높은 단백질 회수율이 관찰되었고, 최적 결과는 0.2 mg/vial이었다 (도 1).

이 예비-제제 상으로부터의 결과를 기초로, 다음 조사를 위해 6개 동결-건조된 제제를 제조하였다 (표 1로부터 제제 1-6; 또한 후보 제제라고도 함).

실시예 3: FGF-18 동결-건조된 제제의 안정성 연구

표 1의 후보 동결-건조된 제제에 대하여 2주 내지 24개월 안정성 데이타를 수집하였다.

실시예 3.1 (SE-HPLC에 의한 순도): SE-HPLC에 의해 발생된 안정성 데이타에 대하여 Stabileo에 의해 행해진 통계적 평가에 대한 결과를 표 3에 요약한다: 상이한 온도(40℃에서 최대 6개월 및 25℃에서 최대 24개월)에서 저장시 임의의 동결-건조된 후보 제제에 대하여 현저한 순도 (모노머 성분) 손실이 검출되지 않았다.

실시예 3.2 (SDS-PAGE/SS에 의한 순도): SDS-PAGE에 의해 발생된 결과는 모든 테스트 온도(40℃에서 적어도 6개월 및 25℃에서 최대 18개월)에서 저장시 임의의 동결-건조된 제제에 대하여 대체적으로 99%를 초과하는 순도 수준을 확인하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.

실시예 3.3 (RP-HPLC에 의한 순도): RP-HPLC에 의해 발생된 안정성 데이타에 대하여 Stabileo에 의해 행해진 통계적 평가에 대한 결과를 표 5에 나타낸다: 상이한 온도(40℃에서 최대 6개월 및 25℃에서 최대 18개월)에서 저장시 임의의 동결 건조 후보 제제에 대하여 현저한 순도(% 메인 피크) 손실이 검출되지 않았다. 그러므로, 본 발명에 따른 FGF-18 제제화는 출발 물질 (순수한) FGF-18와 비교하여 어떤 순도 손실을 초래하지 않는다. 출발 물질이 (제제화 전) 완전히 순수하지 않았기 때문에 (RP-HPLC에 의해 불순물이 완전히 분해되지 않았음), 제제화전 피크는 100%에서가 아니었지만, 예를 들어 FD-30에 대하여 77.5% 및 FD-300에 대하여 87.4%이고, T=0에서의 피크는 예를 들어 FD-30에 대하여 76.8% 및 FD-300에 대하여 87.7%이었다는 것을 주지한다.

실시예 3.4 (단백질 성분 어세이): Bioacore에 의해 측정된 단백질 농도의 결과를 표 6 및 7에 요약한다. 0.22 μm 멤브레인을 통한 여과시 주요 손실이 검출되지 않았고, 즉 거의 모든 단백질 회수가 관찰되었다(표 6에서 "AF" 컬럼 참조). 1 mL WFI로 동결-건조된 산물의 재구성시 (표 6에서 "TO" 컬럼 참조), 더 낮은 회수율이 얻어졌고, 이것은 유리 바이알 상에 단백질의 흡착에 의해 설명할 수 있다 (재구성시, 그 다음 단백질 용액이 더 큰 표면에 노출됨).

안정성 관점으로부터, 표 7에 나타낸 바와 같이, 모든 테스트 온도에서 모든 강도에 대하여 Biacore에 의해 단백질 성분의 손실이 검출되지 않았다 (40℃에서 최대 6 개월 및 25℃에서 최대 24개월).

실시예 3.5 (생물학적 활성): 저장시 모든 동결-건조된 후보에 대하여 생물학적 활성의 결과 (U/용기로 표현함)를 표 8에 나타낸다. 예를 들어, 25℃ 및 40℃ 모두에서 저장시 더 높은 강도(300 mcg/vial의 trFGF-18)에 대하여 관찰된 생물학적 활성은 시간이 지남에 따라 안정하였다. 최저 강도 FD-20로 더 큰 가변성이 관찰되었다. 다른 테스트에 의해 산물 안정성 변화가 검출되지 않았으므로, 이 FD-20로 관찰된 감소는 25℃에서 39, 52, 78 및 104주 저장 후 확인되어야 한다.

실시예 3.6 (산화 형태): 저장시 모든 강도에 대하여 검출된 산화 형태의 수준을 표 9에 요약한다: 산화가 진행된 Met 잔기 중에서, 결과는 모든 강도 및 임의의 평가 온도에 대하여 Met 1이 산화에 보다 민감하다는 것을 나타낸다.

실시예 3.7 (잔여 수분): 모든 강도에 대하여 저장시 현저한 잔여 수분 증가가 발생하지 않았다; 안정성 연구를 통틀어 1% 아래의 또는 그 정도의 잔여 수분값이 대체적으로 측정되었다 (표 10 참조) (40℃에서 최대 6개월 및 25℃에서 최대 24개월).

실시예 3.8 (pH 변화): 모든 강도에 대하여 임의의 테스트 온도에서 저장시 현저한 pH 변화가 관찰되지 않았다 (표 11 참조) (40℃에서 최대 6개월 및 25℃에서 최대 24개월).

실시예 3.9 (삼투압 변화): 모든 강도에 대하여 임의의 테스트 온도에서 저장시 현저한 삼투압 변화가 관찰되지 않았다 (표 12 참조) (40℃에서 최대 6개월 및 25℃에서 최대 24개월).

Claims

FGF-18, 완충제, 폴록사머 계면활성제, 및 안정화제로서 당(sugar)을 포함하는 안정한 동결-건조된 제제.
제1항에 있어서, 상기 완충제는 포스페이트 완충제이고, 6 내지 8로 구성된 pH를 유지하는 안정한 동결-건조된 제제.
제2항에 있어서, 상기 포스페이트 완충제는 pH를 7.2 또는 그 정도로 유지하는 안정한 동결-건조된 제제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제의 농도는 5 내지 100 mM 또는 그 정도인 안정한 동결-건조된 제제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴록사머 계면활성제는 폴록사머 188인 안정한 동결-건조된 제제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴록사머 계면활성제의 농도는 0.1 내지 0.4 mg/vial 또는 그 정도인 안정한 동결-건조된 제제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정화제는 수크로오스인 안정한 동결-건조된 제제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정화제의 농도는 10 내지 60 mg/vial 또는 그 정도인 안정한 동결-건조된 제제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGF-18의 농도는 20 내지 300 mcg/vial 또는 그 정도인 안정한 동결-건조된 제제.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 20, 30, 60, 100, 200 또는 300 mcg/vial의 FGF-18, pH를 7.2 또는 그 정도로 유지하는 10 mM 포스페이트 완충제, 30 mg/vial의 수크로오스 및 0.2 mg/vial의 폴록사머 188를 포함하는 안정한 동결-건조된 제제.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 5% 오버에이지(overage)의 FGF-18를 더 포함하는 안정한 동결-건조된 제제.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGF-18는
a. SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 28-207를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드,
b. SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 28-196를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드, 및
c. SEQ ID NO:2를 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드
로 이루어진 군에서 선택된 안정한 동결-건조된 제제.
a. 완충제, 계면활성제 및 안정화제와 함께 FGF-18의 혼합물을 형성하는 단계, 및
b. 상기 혼합물을 냉동건조하는 단계
를 포함하는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 안정한 동결-건조된 제제의 제조방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 안정한 동결-건조된 제제를 포함하는 제1 용기 및 재구성을 위한 용제를 포함하는 제2 용기를 포함하는 제조품.
제14항에 있어서, 상기 안정한 동결-건조된 제제를 포함하는 용기 및 재구성을 위한 용제를 포함하는 용기는 듀얼-챔버 시스템의 2개 구획인 제조품.