KR101880905B1 - 안정한 수성 ｍｉａ／ｃｄ－ｒａｐ 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 5 mg/mL CD-RAP 단백질 및 하전된 아미노산을 포함하는 안정한 수성 제제에 관한 것으로, 상기 아미노산은 바람직하게는 약 6 내지 8 사이의 pH에서 유효전하(net charge)를 갖는다. 상기 제제의 성분은 반복되는 동결-융해 사이클 동안 안정성을 제공한다. 바람직한 측면에서, 제제는 치료 용도로 사용되고, 바람직하게는 염증성 질환, 특히 골관절염의 치료를 위해 사용된다. 또한, 본 발명의 제제를 포함한 키트를 제공한다.

Description

안정한 수성 ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ 제제 {Stable aqueous MIA/CD-RAP formulations}
본 발명은 적어도 5 mg/mL의 CD-RAP 단백질 및 하전된 아미노산을 포함하며, 상기 아미노산은 바람직하게는 약 6 내지 8의 pH에서 유효전하(net charge)를 갖는 안정한 수성 제제에 관한 것이다. 상기 제제의 성분은 바람직하게는 동결-융해(freeze-thaw) 사이클이 반복되는 동안 안정성을 제공한다. 바람직한 한 구체예에서, 상기 제제는 치료적 용도를 위한 것이고, 바람직하게는 염증성 장애, 특히 골 관절염의 치료를 위한 것이다. 또한, 본 발명의 제제를 포함하는 키트를 제공한다.
단백질은 제약 , 수의약품, 화장품 및 다른 소비재, 식품, 사료, 진단, 공업화학 및 오염제거 분야에서 광범위하게 적용되어 사용된다. 때로는 단백질 자체의 내재적 제약 또는 그들이 사용되는 환경 또는 매체에 의한 제약에 의해 이 같은 단백질의 사용이 제한된다. 이 같은 제약은 단백질의 낮은 안정성, 기능의 가변성 또는 고가의 비용에 기인한다. 생명공학의 유익성에 기인하여 치료적 적용을 위한 폭 넓고 다양한 단백질을 생산하는 것이 가능하다. 단백질 의약은 생산된 후에 대개 사용하기에 앞서 보관된다. 단백질은 일반적으로 "종래의" 의약에 비해 더 크고 복잡하기 때문에, 보관에 적합한 단백질 의약의 제제화 및 공정은 특히 어려울 수 있다. 단백질 의약의 제제 및 공정 디자인을 검토하기 위해 Carpenter et al. (1997), Pharm. Res. 14:969-975; Wang (2000), Int. J. Pharmaceutics 203:1 -60; 및 Tang and Pikal (2004), Pharm. Res. 21:191-200을 참고한다.
단백질 의약의 생산을 위한 제제 및 공정의 디자인에 있어서 여러 요인이 고려될 수 있다. 그 중 주요한 요인은 조성물의 제조, 동결(freezing), 건조, 보관, 운반, 재형성(reconstitution), 동결/융해 사이클 및 최종 사용자에 의한 재형성 후 보관을 포함할 수도 있는 제조, 운반 및 취급상의 어느 혹은 모든 단계에 있어서의 단백질의 안정성이다. 다른 가능한 고려사항은 제조, 처리 및 분배의 용이성 및 경제성; 환자에게 투여하기 위한 최종 제품의 구성; 및 재형성시 냉동건조된 제제(lyophilized formulation)의 가용성을 포함한 최종 사용자에 의한 사용의 용이성을 포함한다.
액상 제제는 특정 목적을 만족시킬 수도 있다. 액상 제제의 가능한 이점은 제조의 용이성 및 경제성과 최종 사용자의 편의성을 포함한다. 흔히, 장기간 보관할 때 폴리펩타이드는 용액 내에서 불안정하다(Manning et al (1989), Pham. Res. 6: 903-918). 이에 따라, 유통기한을 더 길게 허용하기 위하여 건조, 예컨대, 냉동건조를 포함하는 추가의 공정 단계가 개발되어 왔다. 냉동건조된 제제는 또한 특정 이점을 제공할 수도 있다. 냉동건조의 잠재적 이점은 운반 및 보관의 용이성, 경제성뿐만 아니라 향상된 단백질 안정성을 포함한다. 그러나, 냉동건조된 약제학적 조성물은 최종 수요자에게는 덜 편리할 수도 있다.
조성물의 기본 형태의 선택에 더하여(예를 들어, 냉동건조, 액상, 동결, 등), 단백질 제제의 최적화는 통상적으로 제제의 성분의 다양성 및 단백질 안정성을 최대화하기 위한 각각 성분의 농도와 연관된다. 이온 강도, pH, 온도, 동결/융해 사이클, 전단력, 동결, 건조, 교반 및 재형성을 포함한 다양한 요인이 단백질 안정성에 영향을 줄 수도 있다. 단백질 불안정성은 물리적 분해(예를 들어, 변성, 응집, 또는 침전) 또는 화학적 분해(예를 들어, 탈아미노화, 산화, 또는 가수분해)가 원인일 수도 있다. 제제 성분 및 농도의 최적화는 불안정한 요소를 극복하기 위해 오로지 실증적 연구 및/또는 합리적인 접근을 기초로 한다.
때때로, 수성 및 냉동건조된 제제를 포함하는, 폴리펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물의 장기간 보관에 있어서, 응집 및/또는 분해에 의해 활성 폴리펩타이드가 소실될 수 있다.
따라서, 폴리펩타이드의 안정성을 향상시키기 위한 통상적인 방법은 제제와 함께 성분 농도의 다양화 하거나 제제를 조정하기 위한 부형제를 첨가하는 것으로 해결하고 있다(미국 특허 제 5,580, 856 및 6,171,586 및 미국 특허 출원 제 2003/0202972, US　2003/0180287). 미국 특허 제 5,580,856호는 재수화 후 또는 재수화 동안 건조된 단백질을 안정화하기 위해 천연 고분자, 계면활성제, 황화 다당류, 단백질 및 버퍼와 같은 시약을 첨가한 프로토타입의 출원이다. 그러나, 많은 선택사항을 별론으로 하더라도, 미국 특허 제 5,580,856호는 어떤 단백질을 위해 재수화 안정화제가 첨가되어야 하는지는 개시하지 않는다. 따라서, 통상의 기술자가 많은 선택사항을 인지한다고 하더라도, 그/그녀는 미국 특허 제 5,580,856호에 개시된 많은 사항들 중에서 단백질에 가장 좋은 조건을 찾아 내야 할 것이다. 미국 특허 출원 제 2003/0202972호는 안정화제로 당, 트레할로오스, 또는 버퍼를 사용한 항-Her2 항체의 냉동건조된 안정한 제제를 기술한다. 그러나, 이들 안정화제는 항체에는 유용하나, 다른 단백질에도 그러하리라고 예측할 수 없다. 미국 특허 출원 제 2003/0180287호는 면역글로불린-유사 단백질, 즉, Fc 도메인을 함유하는 단백질의 안정한 용액을 기술하고 있다는 점에서 제　2003/0202972호와 유사하다. 안정화제는 소듐 포스페이트, 포타슘 포스페이트, 소듐 또는 포타슘 시트레이트, 말레 산, 암모늄 아세테이트, 트리스-버퍼, 아세테이트, 디에탄올아민, 히스티딘, 리신 또는 시스테인일 수도 있다. 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있는 화학적으로 구별되는 이들 안정화제 중에서, 리신이 적합한 것으로 밝혀졌다. 그러나, US　2003/0202972호 에서와 같이, 단백질을 함유한 Fc 도메인과 같은 특정 안정화제는 특정 단백질에만 적합하며 그 자체로 다른 단백질에 적용될 수 없다. 따라서, 첨가제의 사용은 특정 단백질로부터 다른 관련없는 단백질에까지 적용될 수 없다. 실제로, 첨가제의 사용은 보관성을 향상시키는 반면 불활성 폴리펩타이드의 원인이 될 수 있다. 게다가, 냉동건조의 경우, 재수화 단계가, 예를 들어, 응집 또는 변성에 의해 폴리펩타이드의 불활성화를 일으키는 상황을 야기할 수 있다(Hora et al.(1992), Pharm. Res., 9: 33-36; Liu et al. (1991), Biotechnol. Bioeng., 37: 177-184). 사실, 폴리펩타이드의 응집은 면역원성을 일으킬 수도 있기 때문에 바람직하지 않다(Cleland et al.(1993), Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier system, 10: 307-377; and Robbins et al. (1987), Diabetes, 36: 838-845).
제약품을 개발 및 제조하는 동안 생물학적 활성의 유지는 이용된 안정화 기술뿐만 아니라 고분자(macromolecule) 고유의 안정성에 따라 달라진다. 단백질 안정화 기술의 범위는 화학적 "안정화제"를 단백질의 수용액 또는 현탁액에 부가하는 것을 포함하여 존재한다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,297,344호는 선택된 아미노산의 첨가에 의한 응고인자 II 및 VIII, 안티트롬빈 III 및 플라스미노겐의 열에 대한 안정화에 대해 개시한다. 미국 특허 제 4,783,441호는 표면 활성 물질을 첨가하여 단백질을 안정화하는 방법에 대해 개시한다. 미국 특허 제 4,812,557호는 인간 혈청 알부민을 사용하여 인터루킨-2를 안정화하는 방법에 대해 개시한다. 물질을 동결 보호제(cryoprotectant)와 함께 혼합하고 매우 낮은 온도에서 보관하는 동결/융해 방법은 단백질을 안정화하기 위한 또 다른 방법이다. 그러나, 모든 단백질이 동결/융해 사이클에서 생존하지는 못할 것이다. 보통은 글리세롤의, 동결 보호제를 첨가한 저온 보관이 다른 선택일 수도 있다. 미국 특허 제 5,098,893호에 기술된 바와 같이, 유리질 형태로의 보관 또한 가능하다. 이 경우에, 단백질은 무정형 또는 유리질 상태의 수성 또는 수팽윤성 물질에 용해된다. 단백질을 안정화하기 위해 가장 넓게 쓰이는 방법은 동결 건조(freeze-drying) 또는 냉동건조이다. 수용액 중에서 충분한 단백질의 안정성을 얻지 못할 때, 냉동건조는 성공할 수 있는 가장 좋은 대체법이다. 냉동건조의 단점은 정교한 공정을 필요로 하고 시간이 많이 소요되며 고가라는 점이다. 게다가, 냉동건조가 신중하게 실행되지 않으면 대부분의 제조물은 동결 및 탈수 단계에 의해 적어도 부분적으로 변성된다. 그 결과, 빈번하게 단백질 분자 부분의 비가역적 응집이 일어나고 비경구 투여에서 허용되지 않는 제제의 렌더링(rendering)이 일어난다.
일반적으로, 단백질의 분해는 문헌에 잘 기술되어 있지만, 특히, CD-RAP 단백질/MIA (CD-RAP 단백질이라 칭함)의 보관 및 가용성은 기술된 바 없다. CD-RAP 단백질은 악성 흑색종 세포 및 연골세포로부터 분비되는 작은 가용성 단백질이다. 최근 증거는 SH3 도메인-유사 접힘을 채택하는 세포 외 단백질의 작은 군으로써 CD-RAP 단백질을 확인했다. 세포외 기질 단백질에서 CD-RAP 단백질 및 특정 에피토프 사이의 상호작용은 종양 세포 및 연골세포의 부착을 조절하는 것으로 생각된다(Moser et al. (2002), Mol Cell Biol. 5:1438-45). 한편, CD-RAP-연관 단백질은 US　2002/0103360 및 WO　2004/015078로부터 알려졌다. 그러나, 양 출원은 CD-RAP-연관 단백질의 안정한 제제에 관하여는 언급하고 있지 않다.
지금까지, WO　2008/040556로부터 CD-RAP 단백질의 리포좀-기반의 제제가 알려져 있다. 구체적으로, 재형성 후 CD-RAP 단백질을 함유하는 큰 다중 라멜라 소구체(multilamellar vesicles)를 포함하는 건조된 약제학적 조성물이 개시되어 있고, 이에 의해 목적한 활성 부위에서 CD-RAP 단백질이 긴 시간 동안 유지될 수 있도록 CD-RAP 단백질 운반을 지연시키기 위해, CD-RAP 단백질이 리포좀 내에 캡슐화(encapsulated) 및/또는 봉입(entrapped)된다.
CD-RAP 단백질의 한 기능은 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)의 주화성 인자(chemotactic factor)로써 역할을 한다는 것이다. CD-RAP 단백질이 마우스 또는 인간의 중간엽 줄기세포(HMSC)의 분화를 유도하는 능력은 없는 반면, 골 분화를 억제하는 동안 연골 형성(chondrogenic phenotype)에 도움을 주어, 중간엽 줄기세포가 분화하는 동안에 골형성 단백질(bone morphogenetic protein; BMP)-2 및 형질전환 성장인자(transforming growth factor; TGF)-beta 3의 작용에 영향을 준다. 더 나아가, CD-RAP 단백질은 BMP-2의 골세포 분화능을 억제하는 BMP-2 처리된 HMSC 배양액에서 오스테오폰틴 및 오스테오칼신 유전자의 발현을 하향 조절한다. 인간 일차 연골세포(human primary chondrocytes)의 경우, CD-RAP 단백질은 글리코스아미노글리칸의 양을 증가시키면서 세포외 기질 침착(extracellular matrix deposition)을 자극한다. 따라서, CD-RAP 단백질은 골분화 및 연골 유지에 있어 중요한 조절자라고 믿어진다. 또한, CD-RAP 단백질은 연골 수복을 위한 유망한 후보물질이라고 여겨진다. 따라서 보관하는 동안 오랜 기간에 걸쳐 안정한 충분히 많은 양의 CD-RAP 단백질을 포함하는 이용가능한 약제학적 제제를 갖는 것이 요망된다. 실제로, 높은 농도의 CD-RAP 단백질을 함유하는 안정한 제제는 환자에게 적은 양의 주사를 가능하게 하고 많은 양의 주사로 인한 통증과 같은 부작용을 감소시키고 각 투여용량의 증가를 자연스레 허용한다.
게다가, 안정성은 유지하면서 높은 농도의 단백질을 허용하는 시약 및 다수의 선택가능한 단백질 안정화제가 이용가능함은 당업계에 알려진 반면에, 본 발명에 이르기까지, 높은 농도의 CD-RAP 단백질을 포함하는 제제가 불안정할 수 있으며 따라서 개발이 필요하다는 사실은 당업계에 인식된 바 없다.
이런 이유로, 본 발명의 해결하고자 하는 과제는 위에서 언급한 요구들에 응하기 위한 것이다.
본 발명은 이러한 요구들에 대해 다루고 기술적 과제를 해결하기 위한 해결책으로써 CD-RAP 단백질의 투여가 유용한 장애를 가진 환자의 치료에 적용하기 위한 이들 제제의 용도 및 방법뿐만 아니라 제제에 관한 구체예를 제공한다. 이들 구체예는 본 명세서에서 특정되고 기술되며 실시예를 통해 설명되고 청구항에 반영된다.
본 명세서에서 사용된, 단수 형태의 용어 "하나의"는 다른 명백한 표시가 없는 한 복수의 형태를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 용어 "하나의 항체"는 하나 또는 그 이상의 다른 항체를 포함하고 "그 방법"은 본 명세서에서 기술된 방법을 대체 또는 수정할 수 있는, 통상의 기술자가 알고 있는 방법 및 그와 동등한 방법을 포함한다.
인용된 모든 문헌 및 특허는 본 명세서에 그 전체로서 참고로 포함되어 있다. 참고로 포함된 물질의 범위가 본 명세서와 불일치 혹은 모순된 경우, 본 명세서는 그와 같은 어떤 물질을 대체할 것이다. 다른 표시가 없으면, 요소의 연속에 앞서는 용어 "적어도"는 연속하는 모든 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 통상의 기술자는 본 명세서에 기술된 특정 구체예에 상당하는 많은 예가 있음을 일반적인 실험을 하여 인지하거나 알 수 있을 것이다. 그와 같은 동등한 부분까지 본 발명에 포함된다.
명세서 및 후에 기술할 청구항 전체에 있어서, 다른 요구가 없는 한, 용어 "포함하는"은 정해진 정수 또는 정수의 단계 또는 정수의 그룹 또는 그룹의 단계를 포함하나 다른 정수 또는 정수의 단계 또는 정수의 그룹 또는 그룹의 단계는 제외하는 것으로 이해될 것이다. 사용된 용어 "포함하는"은 "함유하는" 또는 "가지는"으로 대체될 수 있다.
사용된 용어 "이루어진"은 청구항 구성요소로 특정되지 않은 어떤 성분, 단계 또는 요소를 제외한다. 사용된 용어 "필수적으로 이루어진"은 청구항의 기본적이고 신규한 특징에 중요한 영향을 미치지 않는 단계 또는 물질을 제외하지 않는다. 각각의 경우에서 "포함하는", "필수적으로 이루어진" 및 "이루어진"은 서로 대체될 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 다수의 요소 사이의 접속사 "및/또는"은 각각의 요소 및 이들을 결합한 것을 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 두 요소가 "및/또는"으로 결합된 경우, 첫번째 선택은 두번째 요소를 제외한 첫번째 요소가 적용가능함을 나타낸다. 두번째 선택은 첫번째 요소를 제외한 두번째 요소가 적용가능함을 나타낸다. 세번째 선택은 첫번째 및 두번째 요소가 함께 적용가능함을 나타낸다. 이들 선택 중 어느 하나도 그 의미에 포함되고 따라서 본 명세서에서 사용된 용어 "및/또는"의 요구를 만족하는 것으로 이해된다. 하나 이상의 선택을 동시에 적용하는 것도 그 의미에 포함되고, 따라서 본 명세서에서 사용된 용어 "및/또는"의 요구를 만족하는 것으로 이해된다.
본 명세서 전체에 여러 문헌이 인용되었다. 여기서 인용된 각 인용문헌은(모든 특허, 특허출원, 과학 저널, 제조회사의 사양, 설명서 등을 포함하는), 앞 또는 뒤 어디든지, 본 명세서에 전체로서 참고로 포함되어있다. 여기의 어떤 것도 본 발명이 이전의 발명의 장점에 의한 개시를 앞설 권리가 있는 것은 아니라는 시인으로 해석되지 않는다.
본원 발명의 발명자들은 환자에게 투여할 때 적은 양의 주사를 가능하게 하여 많은 양의 주사에 기인한 통증과 같은 부작용을 감소시키기 위하여 높은 농도의 CD-RAP 단백질를 함유하는 안정한 제제를 제공하고자 하는 목적으로 높은 농도의 CD-RAP 단백질이 불안정할 수도 있고 또한 장기간 보관하는 동안 불안정할 수도 있다는 점을 인지했다.
그런 까닭에, 발명자들은 고농도의, 안정한 제제를 제공하고자 하는 목적으로 연구하는 동안 CD-RAP 단백질의 확실한 불안정성을 관찰했고, 따라서 이러한 의도치않은 관찰을 개선하는 것을 목적으로 했다. 따라서, 그들은 용액으로 존재하는 동안, 즉, 용해 단계에서, CD-RAP 단백질을 농축시키고자 했다. 그렇게 해서, 그들은 그들 중 어떤 것도 목적한 문제를 해결하기에 적합할 것이라는 어떤 예측 없이 이용가능한 다수의 선택 및 대안을 가졌다.
"용해 단계"는 CD-RAP 단백질, 바람직하게는 적어도 5 mg/mL의 CD-RAP 단백질이 용액 중에 있는 것, 즉, 제제의 수용액 중에(즉, 수상에) 직접 용해 및/또는 분산 되어있는 것을 의미한다. 바람직하게는, CD-RAP 단백질은 균일하게 용해 및/또는 분산된다. 균일하다는 것은 안정한 수성 제제 중에 용해 및/또는 분산된 CD-RAP 단백질의 양이 거의 균등하게, 바람직하게는 균등하게 분포되어 수용액의 부피("v") 중에(또는 통하여) CD-RAP 단백질의 양("n"은 몰질량 "m"은 질량인 경우)의 농도("c")가 거의 동일, 바람직하게는 동일함을, 즉 c=n/v 또는 c=m/v, 각각이 거의 상수, 바람직하게는 상수임을 의미한다. 제제 내에 농도구배가 없는 것이 바람직하다.
따라서, CD-RAP 단백질을 포함하는 본 발명의 안정한 수성 제제는 바람직하게는 CD-RAP 단백질이 직접 용해 및/또는 분산된 수용액으로 여겨질 수 있다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 안정한 수성 제제는 적어도 5 mg/mL의 CD-RAP 단백질 및 하전된 아미노산의 수용액으로 여겨질 수 있다. 이는 제제가 최소한의 하전된 아미노산과 함께 적어도 5 mg/mL의 CD-RAP 단백질이 용해 및/또는 분산된 수용액을 기본으로 함을 의미한다.
그렇지 않으면, 본 발명의 안정한 수성 제제는 수용액을 기본으로 한 적어도 농도(중량/부피) 5 mg/mL의 CD-RAP 단백질 및 하전된 아미노산을 포함하는 안정한 제제로 여겨질 수 있다.
"용액"은 하나 또는 둘 또는 그 이상의 물질/성분의 균일한 혼합물이다. 그러한 혼합물 내에 용질(본 발명에 있어서 CD-RAP 단백질, 바람직하게는 적어도 5 mg/mL의 CD-RAP 단백질)이 용매로 알려진 다른 물질(본 발명에 있어서 바람직하게는 수성 제제) 내에 용해 (위에서 설명한 바와 같이)된다.
앞서 언급한 바와 같이, 바람직하게는, CD-RAP 단백질은 수용액 중에 불균일하게 용해 및/또는 분산되지 않는다. 용어 "용해된 상태"는 또한 바람직하게는 CD-RAP 단백질이 본질적으로 유화되지 않고, 더욱 바람직하게는 수용액 중에 전혀 유화되지 않는 것을 포함한다.
또한, 용어 "용해된 상태"는 CD-RAP 단백질이 바람직하게는 본질적으로 예를 들어, 리포좀에서, 다중라멜라 리포좀 또는 그 유사물 내에, 캡슐화 및/또는 봉입되지 않거나(바람직하게 CD-RAP 단백질의 2%, 1%, 또는 0.5% 보다 적은 양이 캡슐화 및/또는 봉입), 더욱 바람직하게는 전혀 캡슐화 및/또는 봉입 되지 않는 것을 포함한다.
따라서, 바람직한 한 구체예에서, 본 발명은 본질적으로 리포좀이 없는(바람직하게는 2%, 1%, 또는 0.5% 미만의 리포좀을 포함하는), 바람직하게는 리포좀이 없는 적어도 5 mg/mL의 CD-RAP 단백질 및 하전된 아미노산을 포함하는 안정한 수성 제제를 포함한다.
보다 바람직한 관점에서, 본 발명은 CD-RAP 단백질이 본질적으로 리포좀에 함유되지 않은(바람직하게는 2, 1, 또는 0.5% 미만), 바람직하게는 전혀 함유되지 않은(캡슐화 및/또는 봉입), 적어도 5 mg/mL의 CD-RAP 단백질 및 하전된 아미노산을 포함하는 안정한 수성 제제를 포함한다.
실제로, 단백질이 불안정해지는 많은 경로가 존재한다. 예를 들어, 탈아미노화, 산화, 이황화 결합의 파괴 및 형성, 수화, 숙시닉이미드화(succinimidation), 비-이황화 가교(non-disulfide crosslinking), 탈글리코실화(deglycosylation) 또는 "효소적 갈변"(Maillard reaction)에 의해 야기된 화학적 불안정성 또는 이들 현상의 조합뿐만 아니라 응집에 의해 단백질 불안정성이 야기될 수 있다; 예를 들어, Wang et al. (1999), Int. J. Pharm. 185: 129-188) 및 도 1을 참고한다. 게다가, 온도, pH 값, 계면 흡착, 염, 금속 이온, 킬레이트화제, 전단력과 같은 물리적 힘, 변성제, 비-수성 용매, 단백질 농도, 단백질의 출처 및 순도, 단백질의 다형성 또는 압력과 같은 물리화학적 파라미터가 단백질의 안정성에 영향을 줄 수 있다.
그렇지만, 단백질 안정성에 영향을 줄 수 있는 많은 요인, 많은 방법이 단백질을 안정화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 내부적으로(아미노산의 변화에 의해) 또는 외부적으로 안정화될 수 있다. 외부적 안정화는 킬레이트화제, 금속이온, 환원제, 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜/폴리올, 혈청 알부민, 계면활성제, 당 및 폴리올, 지방산 및 포스포리피드, 아미노산, 버퍼 등에 의해 얻어질 수 있다; 예를 들어, Wang, Y 및 Hanson M (1988), J. Parental Sci. & Technology, 42, Supplement: 4-26; Wang et al. (1999), Int. J. Pharm. 185: 129-188, 및 도 2를 참고한다. 요약하면, 제제 내 CD-RAP 단백질의 안정화를 위해서, 통상의 기술자는 많은 이용가능한 선택 사항을 갖고 있었다.
본 발명의 경우, 발명자들은 응집을 보이는 CD-RAP 단백질을 관찰했다. 단백질 제제에 있어서, 많은 다른 요인이 단백질 응집을 일으킬 수 있다. 일반적인 정제 및 보관 과정은 단백질 응집의 원인이 되는 요소 및 조건에 단백질 제제를 노출시킬 수 있다. 예를 들어, 제제 내 단백질은 다음의 하나 또는 그 이상이 원인이 되어 응집될 수도 있다: 보관, 온도 상승에의 노출, 제제의 pH, 제제의 이온 강도, 및 특정 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트-20 및 폴르소르베이트-80) 및 유화제의 존재. 유사하게, 단백질은 전단력에 노출되었을 때, 용액 중에 냉동건조된 케이크의 재형성, 단백질 샘플의 여과-정제(filter-purifying), 시린지를 통한 단백질 용액의 동결-융해, 셰이킹, 또는 운반의 경우와 같이, 응집될 수도 있다. 응집은 또한 용액 중의 폴리펩타이드 분자간 상호작용 및 보관 용기(vial) 내의 액체-공기 인터페이스의 결과로 일어난다. 운반하는 동안의 흔들림에 의해 인터페이스가 압축 또는 확장되는 동안 공기-액체 및 고체-액체 인터페이스에 부착된 폴리펩타이드의 배좌가 변한다. 이 같은 흔들림은 제제의 단백질이 응집하여 궁극적으로 다른 흡착 단백질과 함께 침전하는 원인이 된다.
제제의 빛에의 노출 또한 단백질 응집을 일으킨다. 본 발명은 따라서 단백질의 응집을 줄이고 CD-RAP 단백질을 높은 농도로 함유할 수 있는 제제를 제공한다. 이론에 기초함이 없이, 위에서 언급한 응집 메커니즘의 하나 또는 그 이상을 조절하여 단백질 응집의 감소가 획득된다. 그 결과, 예를 들어, 향상된 제품 안정성, 및 제조 공정 및 보관 조건에서 더 큰 유연성을 얻게 된다.
구체적으로, 본 발명자들은 많은 실험된 시약으로부터 약 6 내지 약 8의 pH 범위에서 유효전하(net charge)를 갖는 아미노산이, 특히 가용성을 조정하고/하거나 단백질 응집을 억제하여 고농도의 CD-RAP 단백질을 안정화하는데 유용함을 발견했다. 아미노산은 바람직하게는 L-아미노산을 의미한다. D-아미노산은 덜 바람직하다. 바람직하게는 아미노산은 L-히스티딘, L-아르기닌, L-글루탐산 또는 그의 염이다; 바람직하게는 상기 염은 클로라이드, 포스페이트, 아세테이트 또는 설페이트이다.
따라서, 본 발명은, 적어도 부분적으로는, 적어도 5 mg/mL의 CD-RAP 단백질 및 하전된 아미노산 또는 그의 염, 바람직하게는 염은 클로라이드, 포스페이트, 아세테이트 또는 설페이트이고, 더욱 바람직하게는 버퍼, 이당류, 벌크화제(벌크화제), 및 임의 부가의 계면활성제를 포함하는 제제가 장기간 보관 및/또는 하나 또는 그 이상의 동결/융해 사이클 동안 충분히 안정하게 된다는 발견에 기초한다. 본 발명의 제제는 보통의 완충된 제제에 비해서 많은 이점을 갖는다. 한 관점에서, 제제는 높은 농도의, 예를 들어, 30 mg/mL 또는 그 이상의, CD-RAP 단백질을 포함한다. 놀랍게도, 단백질의 높은 농도에도 불구하고, 제제는 응집이 최소화되고 높은 농도의 단백질 제제가 가질 것으로 예상되는 유해한 영향 없이 다양한 방법 및 형태, 예를 들어 동결로 보관가능하다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 제제는 예를 들어, 용액 중의 단백질을 안정화하기 위해 종래 제제에 사용되는 계면활성제 및 완충 시스템과 같은 부형제를 필요로 하지 않는다. 게다가, 본 명세서에서 기술된 제제는 단백질 안정화에 필요한 부가물의 부재로 인한 면역원성을 감소시키기 때문에 보통의 제제보다 바람직하다.
따라서, 본 발명은 적어도 5 mg/mL, 바람직하게는 적어도 7.5 mg/mL, 더욱 바람직하게는 적어도 10 mg/mL, 더욱 바람직하게는 적어도 15 mg/mL, 특히 바람직하게는 적어도 20 mg/mL, 더욱 특히 바람직하게는 적어도 25 mg/mL, 더욱 특히 바람직하게는 적어도 30 mg/mL의 농도의 CD-RAP 폴리펩타이드 또는, CD-RAP 단백질의 네 개의 시스테인 골격을 가지며 본 명세서에 기술된 SEQ ID No. 1의 12 내지 107 번째 아미노산과 적어도 63% 이상의 서열 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 그의 생물학적 활성 유사체 및 하전된 아미노산 또는 그의 염, 바람직하게는 클로라이드, 포스페이트, 아세테이트 또는 설페이트의 놀라울 만큼 장기간 보관을 가능하게 하는 액상 제제, 바람직하게는 안정한 액상 제제에 관한 것이다. 이 제제는, 제제 내에 CD-RAP 폴리펩타이드가 매우 농축되어 많은 용량의 주사에 기인한 통증과 같은 부작용을 감소시킴으로써, 환자가 사용하기에 더욱 편리하기 때문에 유용하다. 더욱이, 제제를 관절내 주사로 낮은 유체 동압(dynamic fluid pressure)하에 환자에게 투여함으로써 연골 형성이 증강된다.
본 발명의 제제(본 명세서에서 "조성물"이라고도 함)는 바람직하게는 액체의, 냉동된, 냉동건조된, 동결 건조된, 분무 건조된 및 재구성된 제제와 같이 다양한 물리적 상태로 있을 수도 있으며 액체 및 냉동건조된 상태가 선호된다. 바람직하게는, 제제는 6.0 및 그 이상의 pH를 가지며, 더욱 바람직하게는 5.5 내지 9.0의 범위를 갖고, 더욱 바람직하게는 6.0 내지 8.0의 범위의 pH를 가지며, 더욱 바람직하게는 6.5 내지 7.6의 범위를 갖고, 가장 바람직하게는 7.0 내지 7.5의 범위를 가진다.
본 명세서에서 기술된 용어 "액상 제제"는 실온에서 분리되려는 경향 없이 구성성분 분자 간의 자유이동이 특징인 액체로 된 조성물을 의미한다. 액상 제제는 수성 및 비-수성 액체를 포함하며 수성 제제가 선호된다. 액상 제제는 용매가 물인 제제이다. 제제 내 CD-RAP 폴리펩타이드의 용해는 균일하거나 불균일할 수도 있고, 앞서 기술한 바와 같이 균일한 것이 바람직하다.
어떤 적합한 비-수성 액체로 본 발명의 제제에 안정성을 제공해주는 것이 사용될 수도 있다. 비-수성 액체는 친수성 액체가 바람직하다. 적합한 비-수성 액체의 예는: 글리세롤; 디메틸 설폭사이드(DMSO); 폴리디메틸실록세인(PMS); 에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 200, PEG 300, 및 PEG 400과 같은 에틸렌 글리콜; 및 디프로필렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜("PPG") 425 및 PPG 725와 같은 프로필렌 글리콜을 포함한다.
본 명세서에서 기술된 용어 "혼합된 수성/비수성 액상 제제"는 물 및 추가의 액체 조성물을 함유하는 액상 제제를 말한다.
본 명세서에서 기술된 용어 "제제(formulation)"는 바람직하게는 액체 상태의 CD-RAP 폴리펩타이드 (즉, 활성 약제/물질) 및 다른 화학적 물질 및/또는 의약품에 필요한 첨가제의 혼합물을 말한다. 본 발명의 제제는 약제학적 제제를 포함한다. 용어 "약제학적 제제"는 효과적인 활성성분의 생물학적 활성이 허용되는 형태로, 따라서, 치료목적으로 환자에게 투여될 수도 있는 제제를 말한다.
제제의 제조는 약제학적 조성물과 같은 최종 의약품을 생산하기 위해서 활성 약제를 포함하는 다른 화학 물질들을 결합하는 과정을 포함한다. 본 발명의 제제의 활성 약제는 CD-RAP 폴리펩타이드이다. 용어 "폴리펩타이드" 는 "단백질"과 상호 교환적으로 사용될 수도 있고, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및 융합 단백질을 포함한다. 단백질은 재조합 또는 합성에 의해 만들어질 수도 있다.
몇몇 구체예에서, 제제화된 CD-RAP 단백질은 본질적으로 순수하고/하거나 본질적으로 균일(즉, 대체로 오염된 단백질이 없는, 등)하다. 용어 "본질적으로 순수한" 단백질은 단백질 분율의 중량이 적어도 약 80%, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 더욱 바람직하게는 97%, 또는 가장 바람직하게는 98%인 조성물을 의미한다. 용어 "본질적으로 균일한" 단백질은 용액 중의 다양한 안정화제 및 물의 질량을 제외한 단백질 분율의 중량이 적어도 약 99%인 조성물을 의미한다.
본 발명 제제의 CD-RAP 폴리펩타이드는 공지(EP-B1 710 248 또는 EP-B1 1 146 897 참고)되고/되거나 본 명세서에서 기술된다. 본 발명의 제제에 쓰인 CD-RAP(Cartilage derived retinoic acid sensitive protein; 연골 유래 레티노산 민감성 단백질) 폴리펩타이드는 Bosserhoff et al. (2004), Gene Expr. Patterns. 4: 473-479; Bosserhoff 및 Buettner (2003), Biomaterials 24: 3229-3234; Bosserhoff et al. (1997), Dev. Dyn. 208: 516-525; WO 00/12762; WO　2004/015078; EP-B1 710 248; US　2002/0103360; 또는 EP-B1 1 146 897에 개시된 분비 단백질의 류에 속하는 것으로 MI (melanoma inhibitory 활성; 흑색종 억제활성, OTOR (fibrocyte derived 단백질;섬유세포 유래 단백질, FDP, MIA- like;MIA-유사, MIAL) 및 TANGO 130으로도 명명되는 CD-RAP 폴리펩타이드이다. 본 발명의 제제에 쓰인 CD-RAP 단백질은 바람직하게는 재조합된 인간 CD-RAP 단백질 (rh CD-RAP 단백질)이다.
본 발명의 제제의 CD-RAP 폴리펩타이드는 a) CD-RAP 단백질 (SEQ ID No. 1)의 성숙한 서열 및 기능적 절편(functional fragments) 또는 그의 변이체를 포함하거나 가지는 폴리펩타이드, b) CD-RAP 단백질의 시스테인 골격을 가지고 SEQ ID No. 1의 12 내지 107번째 아미노산과 적어도 63%, 더욱 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드, 또는 c) 본 명세서에서 정의된 1 내지 3의 일반 서열 (SEQ ID NOs. 2, 3 및 4)을 갖는 폴리펩타이드임이 바람직하다. CD-RAP 단백질의 변이체는 WO　2004/015078에 개시된 것으로, SEQ ID NO: 4 또는 그의 성숙한 형태를 갖는 단백질이거나 US　2002/0103360에 개시된 것으로, SEQ ID NO.14의 서열을 갖는 단백질이다.
본 명세서에서 확인된 CD-RAP 단백질에 관한 "아미노산 서열 상동성 퍼센트(%)"는 필요하다면, 최대 퍼센트로 일치하는 서열을 얻고 서열 일치부분으로서 어떤 보존적 치환(conservative substitutions)도 고려하지 않기 위해 갭(gap)을 포함하고 서열을 정렬한 후의, CD-RAP 단백질 서열의 아미노산 잔기와 일치하는 후보서열의 아미노산 잔기 퍼센트로 정의된다. 아미노산 서열의 일치 정도(%)를 결정하기 위한 정렬은 예를 들어, BLAST, ALIGN, 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공중이 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용한, 업계에서 알려진 기술범위 내의 여러 가지 방식으로 가능하다. 그러한 업계의 기술은 비교되는 서열의 총 길이에 대하여 최대한 정렬하기 위해 필요한 어떤 알고리즘을 포함한, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터로 결정할 수 있다.
CD-RAP 단백질로써 동일한 생물학적 기능을 가지는 기능적 절편은 바람직하게는 SEQ ID No. 1로 나타낸 서열의 적어도 20, 특히 적어도 40, 바람직하게는 적어도 50, 가장 바람직하게는 80개의 연속적인(contiguous) 아미노산을 갖는다. 바람직하게는, 기능적 절편은 SEQ ID No 1의 1 내지 50, 1 내지 70, 1 내지 80, 20 내지 80, 20 내지 107번째 위치의 아미노산을 포함한다.
성숙한(Mature) CD-RAP 단백질 서열 (SEQ ID NO. 1):
GPMPKLADRKLCADQECSHPISMAVALQDYMAPDCRFLTIHRGQVVYVFSKLKGRGRLFWGGSVQGDYYGDLAARLGYFPSSIVREDQTLKPGKVDVKTD KWDFYCQ
일반(Generic) 서열 1 (SEQ ID NO. 2):
C X4 C X17 C X12 V X 11-13 W X7 -18 F X4 V X21 C X
일반(Generic) 서열 2 (SEQ ID NO. 3)
K X C X D X E C X11 D X3 P D C X12 V X2 K L X7 -9 W X G S X5-13 G Y F P X3
V X18 D F X C X
일반(Generic) 서열 3 (SEQ ID NO. 4):
K X C X D X2 C X8 X2 D X3 P D C R F X5 G X V X5 K L X7 W X G S V X12 G Y F P X22 D F X C Q
각각 독립하여 나타낸 상기 "X"는 어떤 아미노산 및 소문자로 쓰여진 어떤 아미노산의 수를 나타내는 숫자를 의미한다. 바람직하게는, "X"는 각각 자연히 존재하는 아미노산 및 특히, A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V를 나타낸다. "X"는 또한 란티오닌, 2-아미노이소부티르산, 디하이드로알라닌, 오르니틴, 시트룰린, 베타-알라닌 또는 노르류신과 같은 비표준 아미노산을 나타낼 수도 있다. 물론, 업계에서 흔하게 알려진, 번역 후 개조(post-translational modification) 또한 예상된다. 따라서, 본 발명의 CD-RAP 폴리펩타이드는 번역 후 개조될 수도 있다.
본 발명의 제제에 쓰인 CD-RAP 단백질은 온전한(intact) 또는 절단된(truncated) 게놈 DNA 또는 cDNA, 또는 원핵 또는 진행 숙주 세포에서 합성된 DNA로부터 발현될 수 있다. 단백질은 배양 배지 또는 내포체(inclusion bodies) 로부터 분리되고/되거나 생물학적 활성 조성물을 형성하기 위해 재접힘될 수 있다. 재조합 CD-RAP 단백질의 정제를 위한 예시적 프로토콜로 EP-B1 710 248 및 Lougheed et al. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 98: 5515-5520를 참고한다. 그와 같이 분리된 단백질의 활성(예를 들어, 연골형성)을 어떻게 테스트하는지 자세한 설명은 Tscheudschilsuren et al. (2005), Exp. Cell Res. 1-10; 또는 Stoll et al. (2003), Sci. 12: 510-519)에 기술되어있다. 연골 유도를 위한 생물검정은 EP-B1 1 146 897의 실시예 2 내지 5 에 기술되어있다. 다른 생물검정은 인프라 및 실시예 7 및 8에 기술되어있다.
폴리펩타이드를 생산하기 위한 세포의 유전공학 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, Ausubel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)를 참고한다. 이 같은 방법은 살아있는 숙주세포에 폴리펩타이드를 코딩하고 발현되도록 하는 핵산을 도입하는 것을 포함한다. 이들 숙주세포는 박테리아 세포, 진균 세포, 또는, 바람직하게는, 배양하여 성장한 동물 세포일 수 있다. 박테리아 숙주세포는 대장균을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 대장균의 예로: HB101, DH5a, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539, 및 이종 DNA를 절단하지 못하는 어떤 대장균도 포함한다. 사용될 수 있는 진균 숙주세포는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 사용될 수 있는 동물 세포주의 적은 예는 CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, 및 WI38이다. 업계에서 공지된 방법(예를 들어, 형질전환, 바이러스 감염 및/또는 선택) 을 이용하여 새로운 동물 세포주가 구축될 수 있다. 임의적으로, 폴리펩타이드가 숙주세포에 의해 배지로 분비될 수 있다.
이온-교환 컬럼의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSET 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(폴리아스파르틱산 컬럼과 같은), 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 알루미늄 설페이트 침전과 같은, 폴리펩타이드 정제를 위한 기술은 필요에 따라 활용될 수 있다. 본 발명의 제제에 쓰인 CD-RAP 단백질은 EP-B1 1 697 523의 실시예에 기술된 바와 같이 발현되고 정제될 수도 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 제제 내 CD-RAP 단백질의 농도는 적어도 5 mg/mL, 바람직하게는 적어도 7.5 mg/mL, 더욱 바람직하게는 적어도 10 mg/mL, 더욱 바람직하게는 적어도 15 mg/mL, 특히 바람직하게는 적어도 20 mg/mL,특히 더욱 바람직하게는 적어도 25 mg/mL, 특히 더욱 바람직하게는 적어도 30 mg/mL이다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 제제 내 CD-RAP 폴리펩타이드의 농도는 약 5 mg/mL부터 약 10 mg/mL까지, 약 10 mg/mL부터 약 20 mg/mL까지, 약 15 mg/mL 부터 약 25 mg/mL까지, 약 20 mg/mL부터 약 30 mg/mL까지, 또는 약 5mg/mL부터 약 30 mg/mL까지의 범위로부터 선택된다.
바람직한 한 구체예에서, CD-RAP 단백질 제제, 특히 본 발명의 안정한 수성 제제는 리포좀 및/또는 매트릭스 물질을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 CD-RAP 단백질 제제는 히알루론산, 알지네이트, 콜라겐, 헤파린, 피브린, 피브리노겐, 탈회골(demineralized bone), 폴리락틱-코-글리콜라이드(polylactic-co-글리콜ide) 및/또는 폴리락틱-코-글리콜라이드 유도체 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 리포좀 및/또는 매트릭스 물질을 포함하지 않는다.
더욱 바람직한 한 구체예에서, 350-420 mM 농도의 아르기닌/H3PO4 중에, CD-RAP 단백질은 1.0 mg/mL, 1.5 mg/mL, 2.0 mg/mL, 2.5 mg/mL, 3.0 mg/mL, 3.5 mg/mL, 4.0 mg/mL을 포함하는 1-4 mg/mL의 농도로 포함되지 않는다. 더욱 바람직하게는, pH 7.5에서 350 mM 또는 420 mM의 아르기닌/H3PO4 중에, CD-RAP 단백질은 1.15 mg/mL 또는 3 mg/mL의 농도로 포함되지 않는다 .
본 명세서에서 기술된 용어 "약"은 기술된 제제의 CD-RAP 단백질의 농도에 있어서 주어진 값의 5%, 10%, 15% 또는 20% 까지 편차가 있을 수 있다고 이해된다. 예를 들어, 제제가 약 5 mg/mL의 CD-RAP 폴리펩타이드를 가진다면, 이는 3 내지 7 mg/mL, 더욱 바람직하게는 4 내지 6 mg/mL의 CD-RAP 폴리펩타이드를 가지는 것으로 이해된다. 따라서, 본 명세서에 기술된 "X 내지 Y"로 정의된 농도 간격은 "X 및 Y의 사이"와 동일하다. 시간 간격은 구체적으로 상한 및 하한을 포함한다. 예를 들어, "5 mg/mL 내지 10 mg/mL" 또는 "5 mg/mL 내지 10 mg/mL의 사이"는 5, 6, 7, 8, 9, 및/또는 10 mg/mL을 포함함을 의미한다.
"안정한" 제제는 제제 내에 함유된 단백질이, 바람직하게는 색 및/또는 선명도를 육안으로 검사하거나 자외선 산란(UV light scattering) 또는 크기배제 크로마토그래피에 의해 측정한 것으로서, 보관에 있어서 본질적으로 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 보유하고/하거나 대조군과 비교해서 실질적으로 침전 및/또는 변성되는 경향을 보이지 않는 제제이다. 단백질의 안정성 측정을 위한 업계의 다양한 분석기법이 이용 가능하며, 예를 들어, Peptide 및 Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)에서 검토된다.
바람직하게는, 본 발명의 제제와 관련된 용어 "안정한"은 제제의 CD-RAP 폴리펩타이드가, 보관의 개시 및/또는 동결 융해하는 동안 또는 동결 융해 후의 CD-RAP 폴리펩타이드의 활성과 비교하여, 보관하는 동안에 생물학적 활성의 15%, 또는 바람직하게는 10%, 또는 더욱 바람직하게는 5%, 및 가장 바람직하게는 3% 이상 손실하지 않는 것을 의미한다. CD-RAP 단백질 생물학적 활성은, 예를 들어, EP-B1 1 146 897의 실시예 2 내지 5에 기술된 연골 유도를 위한 생물검정에 의해 측정된다. 다른 생물검정은 Stoll et al., (2006), Biol. Chem., Vol. 387, pp. 1601-1606 또는 실시예 7 및 8에 기술된 침윤실험(invasion assay)이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "보관하는 동안"은 제조된 제제가 바로 사용되지 않는 것, 정확히는, 제조 후 보관하기 위해, 나중에 액체 형태 또는 다른 형태로의 재형성을 위한 것으로서 액체 형태, 냉동된 상태, 또는 건조된 형태로 포장된 것을 의미한다.
"반복되는 동결 융해 사이클"은 본 발명의 제제가 하나 또는 그 이상의 동결-융해 사이클, 예를 들어, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상의 동결-융해 사이클을 거치는 것을 포함한다. 그러나, 본 명세서에서 기술되고 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제제는 반복되는 동결-융해 사이클 동안 안정한 형태로 남아있다. 따라서, CD-RAP 폴리펩타이드는 바람직하게 반복되는(하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상) 동결-융해 사이클 동안 안정하다. 동결-융해 사이클은, 바람직하게는, 5℃ 내지 -25℃, 1.0℃/분의 냉각 및 가열 속도, 각 사이클 사이에 15분의 등온 과정을 갖는다. 이론에 구애됨이 없이, 본 발명의 맥락에서 적용되는 동결-융해 사이클은 많은 양의 용해된 단백질을 동결하는 동안 일어날 수도 있는 동결 압박(freezing stress)을 시뮬레이션한다. 따라서, 본 발명의 제제는 동결-융해 사이클 동안 용액 내에서 CD-RAP 단백질을 안정하게 유지할 수 있기 때문에, 본 발명의 제제는 우수하고 이로운 성질을 갖는다.
보관하는 동안, 예를 들어, 상승된 온도에의 노출 때문에 응집이 형성될 수도 있다. "상승된 온도" 는 CD-RAP 폴리펩타이드를 포함하는 본 발명의 제제가 일반적으로 보관되는 온도보다 높은 온도를 의미한다. 일반적으로 보관온도는 약 4℃ 및 10℃ 사이, 바람직하게는 약 4℃ 및 8℃ 사이, 더욱 바람직하게는 약 4℃ 및 6℃ 사이, 더욱 바람직하게는 약 4℃ 이다. 제제의 응집의 또 다른 원인은 재제의 pH, 제제의 이온 강도, 특정 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트-20 및 폴리소르베이트-80), 유화제(emulsifying agents)의 존재 및/또는 폴리펩타이드의 본질적인 응집 경향성 때문이다. 이론에 구애됨이 없이, CD-RAP 폴리펩타이드의 응집 형성은 하나 또는 그 이상의 앞서 언급한 원인에 기인할 수 있다고 추측되고 활성의 소실이 응집을 일으킬 수도 있다.
따라서, CD-RAP 폴리펩타이드는 보관하는 동안 및/또는 동결-융해하는 동안 또는 동결-융해 후에 실질적으로 응집을 형성하지 않는 한(예를 들어, 앞서 언급한 하나 또는 그 이상의 원인에 의하여) 안정할 것이라고 예상된다. 따라서, 보관 개시 시점의 CD-RAP 폴리펩타이드 양과 비교하여, 바람직하게는 CD-RAP 폴리펩타이드의 10% 이하 , 더욱 바람직하게는 8% 이하, 더욱 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 3% 이하, 특히 바람직하게는 1% 이하가 응집을 형성할 것이라 예상된다.
이에 대체하여, 다이머(dimers) 또는 올리고머를 형성하지 않는 한 CD-RAP 폴리펩타이드는 안정할 것이라고 예상된다. 달리 표현하면, CD-RAP 단백질의 안정성은 용액 내의 모노머 함량(%)에 따라서 분해(예를 들어, 분열)되고/되거나 응집된 단백질의 낮은 퍼센트로 측정될 수 있다. 예를 들어, CD-RAP 단백질을 포함하는 본 발명의 제제는 CD-RAP 단백질 모노머의 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 92%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 특히 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 99%를 포함할 수도 있다.
"응집"은 용해되어 남아있거나 용액 밖으로 침전되어 불용성 응집을 형성할 수도 있는 공유결합 되거나 비공유결합된 다이머 또는 올리고머 (즉, 고분자량 물질)를 형성시키는 단백질 분자간 물리적 상호작용을 의미한다. "응집"은 또한 분해되거나/되고 분열된 CD-RAP 단백질을 포함한다. 제제 내의 응집 정도는 제제에 본 명세서에서 기술된 하전된 아미노산을 추가하기 이전에, 실질적으로 동시에, 또는 이후에 측정될 수도 있다. 한 구체예에서, 응집 정도는 제제에 본 명세서에서 기술된 하전된 아미노산을 추가한 후, 적어도 약 하루 및 약 12주에 한번 측정된다. 다른 구체예에서, 응집의 정도는 제제에 본 명세서에서 기술된 하전된 아미노산을 추가한 후, 적어도 약 1 개월 및 36 개월마다 측정된다.
위에서 언급한 바와 같이, 단백질을 포함하는 제제 내 응집의 존재 및 정도를 측정하기 위한 다수의 다른 분석 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 네이티브 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(native polyacylamide gel electrophoresis; PAGE), 도데실 황산 나트륨-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE), 모세관 젤 전기영동(capillary gel electrophoresis; CGE), 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography; SEC), 분석용 초원심분리(analytical ultracentrifugation; AUC), 필드 플로우 프랙셔네이션(field flow fractionation; FFF), 광산란 검출기(light scattering detection), 침강속도(sedimentation velocity), UV 분광기, 시차주사열량계, 탁도측정법(turbidimetry), 네펠로법(nephelometry), 현미경 관찰, 크기 배제 크로마토그래피-고성능액체크로마토그래피(SEC-HPLC), 역상-고성능액체크로마토그래피(RP-HPLC), 전기분무 이온 탄뎀 질량분석법(electrospray ionization tandem mass spectroscopy; ESI-MS), 및 탄뎀 RP-HPLC/ESI-MS, 플로우 필드-플로우 프랙셔네이션 기술 및 정적 및/또는 동적 광산란법을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 방법들은 단독으로 또는 결합하여 사용될 수도 있다. 바람직하게는, CD-RAP 단백질과 같은 단백질을 포함하는 제제 내의 응집의 존재 및 정도를 측정하기 위한 분석방법은, 바람직하게는, 크기배제크로마토그래피-고성능액체크로마토그래피(SEC-HPLC), 플로우 필드-플로우 프랙셔네이션, 및 정적 및/또는 동적 광산란법이다.
단백질을 포함하는 제제의 흔한 문제점은 시간, 열, 전단력에 따른 응집의 비가역적 축적이다. 일반적으로, 응집이 침전되면 큰 입자를 형성하여 검출이 용이하다. 그러나, 종종 큰 입자로 침전되는 전구체가 되는 작은 비-공유 결합의 가용성 응집은 검출 및 정량하기가 더 어렵다. 따라서, 단백질 제제 내의 단백질 응집을 검출 및 정량하기 위한 방법은 평가할 응집의 종류에 기초할 필요가 있다.
상기 방법 중에서, 단백질 제제 내의 가용성의, 공유결합성 응집의 존재 및/또는 양을 측정하기 위하여 제안되는 방법은 SEC/광산란법, SDS-PAGE, CGE, RP-HPLC/ESI-MS, FFF 및 AUC 이다. 단백질 제제 내의 가용성의, 비-공유결합성 응집의 존재 및/또는 양을 측정하기 위하여 제안되는 방법은 SEC, PAGE, SDS-PAGE, CGE, FFF, AUC, 및 동적 광산란법이다. 단백질 제제 내의 불용성의, 비-공유결합성 응집의 존재 및/또는 양을 측정하기 위하여 제안되는 방법은 UV 분광기, 탁도 측정법, 네펠로법, 현미경 관찰, AUC 및 동적 광산란법이다.
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명의 다른 구체예는 본 발명에 따라 제제화된 폴리펩타이드를 보관하기 전에, 즉, 시간이 0 일 때의 활성을 시험하는 단계, 약 37℃ 및 42℃ 사이에서 보관, 바람직하게는 약 37℃에서 적어도 한 달 동안 보관하고 폴리펩타이드의 안정성을 측정하는 단계 및 시간이 0 일 때부터 한 달까지의 시간별 안정성을 비교하는 단계를 포함하는 본 발명의 제제 내 CD-RAP 폴리펩타이드 안정성의 가속 안정성 시험법을 제공한다. 이 정보는 처음에는 좋은 안정성을 나타내나 장기간 보관을 위해서는 좋지않은 배치 또는 로트를 일찍 제거하는데 유용하다.
나아가, 본 발명의 제제는 액체 또는 동결된 상태로, 바람직하게는 액체 상태로, 보관하는 동안 CD-RAP 단백질이 안정할 정도로 장기간 보관의 개선을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 용어, "장기간" 보관은 제제가 적어도 1개월, 2개월, 3개월 또는 그 이상, 6개월 또는 그 이상, 및 바람직하게는 1년 또는 그 이상 보관 가능함을 의미하는 것으로 이해된다. 장기간 보관은 또한 약제학적 조성물이 2-8℃에서 액체로 또는 동결된 상태, 예를 들어, -20℃ 또는 그 이하로 보관됨을 의미하는 것으로 이해된다. 그럼으로써 제제는 본 명세서에서 기술된 만큼의 생물학적 활성을 잃지 않고/않거나, 본 명세서에서 기술된 만큼의 응집을 형성하지 않고/않거나 본 명세서에서 기술된 만큼의 모노머를 포함한다. 이러한 특성에 대한 시험이 본 명세서에 기술되어 있다. 또한 제제가 1회 이상 동결 및 융해될 수 있음을 실시예를 통해 보여준다.
본 발명의 한 구체예에서, 제제 내의 CD-RAP 단백질은 액체상태로 적어도 1 개월, 2 개월, 3 개월; 적어도 4 개월, 적어도 5 개월; 적어도 6 개월; 적어도 12 개월 동안 안정하다. 상기 시간 간격의 중간 범위, 예를 들어, 9 개월 등, 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 게다가, 상한 및/또는 하한으로서 언급된 상기의 어느 수치의 조합한 수치 범위도 포함된다. 바람직하게, 제제는 실온(약 20℃ ) 또는 30℃에서 적어도 1 개월 동안 안정하고/안정하거나 약 2-8℃에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개월, 또는 그 이상 동안 안정하고, 또는 바람직하게는 약 2-8℃에서 적어도 2 년 동안 안정하다. 나아가, 제제는 바람직하게는 본 명세서에서 "동결/융해 사이클"에 해당하는 다음의 동결 (예를 들어, -80℃에서) 및 융해에 안정하다.
예상 밖으로, 고농도의 CD-RAP 단백질을 안정화하고자 본 발명자들은, 약 6 및 8 사이의 pH 범위에서 유효전하를 갖는 아미노산이 고농도의 CD-RAP 단백질 제제의 제조를 허용하고 제제 내의 CD-RAP 폴리펩타이드의 응집을 감소시키는 역할을 함으로써 본 명세서에서 기술된 안정한 제제를 얻을 수 있음을 알았다.
따라서, 바람직한 관점에서, 본 발명의 안정한 제제에 포함된 하전된 아미노산은 약 6 및 8 사이의 pH 범위에서 유효전하를 갖는다.
용어 "유효전하"는 아미노산 또는 단백질의 아미노산의 성질에 따라 달라지는 아미노산 또는 단백질 표면의 양전하 및 음전하가 0이 아닌 것을 의미한다. 유효전하는 폴리펩타이드의 1차 서열 내의 아미노산의 위치, pH 및 하전된 아미노산의 수 및 종류에 따라 달라진다. 특정 pH에서 양전하 및 음전하는 균형을 이루어 유효전하는 0일 것이다. 이 pH를 단백질이 가장 낮은 가용성을 보이는 등전점이라 부른다.
더욱 바람직하게는, 아미노산 또는 하전된 아미노산은 글라이신, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 히스티딘, 글루타메이트, 아르기닌 또는 그의 염이 특히 바람직하다. 한 구체예에서, 앞서 언급한 아미노산의 결합 또는 그의 염이 본 발명의 제제에 적용된다.
본 발명의 한 구체예에서, 아미노산은 바람직하게는 6.0 또는 그 이상의 pH에서 CD-RAP 단백질의 용해도를 증가시키는 능력이 있는 아르기닌, 리신 또는 히스티딘의 유사체이다. 이러한 유사체는 아르기닌, 리신 또는 히스티딘을 포함한 다이펩타이드 및 트리펩타이드를 포함하나, 이제 제한되는 것은 아니다.
다른 구체예에서, 아미노산 염은 아르기닌 클로라이드(바람직하게는 pH 6.0 내지 8.0의 용액, 더욱 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.5의 용액, 가장 바람직하게는 pH 6.0 또는 pH 7.4의 용액), 아르기닌 포스페이트(바람직하게는 pH 6.0 내지 8.0의 용액, 더욱 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.5의 용액, 가장 바람직하게는 pH 6.0 또는 pH 7.4의 용액), 히스티딘 포스페이트(바람직하게는 pH 6.0 내지 8.0의 용액, 더욱 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.5의 용액, 가장 바람직하게는 pH 6.0 또는 pH 7.4의 용액), 히스티딘 클로라이드(바람직하게는 pH 6.0 내지 8.0의 용액, 더욱 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.5의 용액, 가장 바람직하게는 pH 6.0 또는 pH 7.4의 용액), 포타슘 및 소듐 글루타메이트(바람직하게는 pH 6.0 내지 8.0의 용액, 더욱 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.5의 용액, 가장 바람직하게는 pH 6.0 또는 pH 7.4의 용액)이다. 본 발명에 적용되는 아미노산 및 그의 염은 업계에 잘 알려져 있고 공지된 방법으로 제조되고 상업적 공급업체로부터 구할 수 있다.
제제 내의 하전된 아미노산, 그의 염 또는 글라이신, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산과 같은 명시된 아미노산 및 그의 염의 농도는 바람직하게는 약 0.5% (w/v) 내지 약 8% (w/v), 1% (w/v) 내지 약 8% (w/v), 1% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 1.5% (w/v) 내지 약 5% (w/v), 2. % (w/v) 내지 약 5% (w/v), 0.5% (w/v) 내지 약 3% (w/v), 더욱 바람직하게는 약 1.0% (w/v) 내지 약 3% (w/v), 더욱 바람직하게는 약 1.5% (w/v) 내지 약 3% (w/v), 더욱 바람직하게는 2.0% (w/v) 내지 약 3% (w/v), 및 특히 바람직하게는 약 2.5% (w/v)이다. 하전된 아미노산은 상업적 공급업체로부터 구할 수 있다.
본 발명의 제제는 명세서에 기술된 CD-RAP 폴리펩타이드에 더하여, 약 6 및 8의 pH에서 유효전하를 갖는 아미노산을 결합하여 예를 들어, 수용액으로 제조될 수 있다.
또한, 필요에 따라, 버퍼, 장성 조절제(tonicity modifier) 및/또는 안정화제 및 임의적으로 추가의 부형제가 부가될 수 있다. 당업자는 제제 내에 포함될 다양한 성분의 조합이 적절한 순서로 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 버퍼가 처음, 중간 또는 마지막에 추가될 수 있고 장성 조절제 또한 처음, 중간 또는 마지막에 추가될 수 있다. 당업자는 이들 화학물질의 일부는 특정 조합에 있어서 양립할 수 없고 따라서, 관련된 혼합물에서 유사한 성질을 갖는 양립 가능한 다른 화학물질로 쉽게 대체할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 제제에 포함된 아미노산 및 포함될 수도 있는 버퍼, 장성 조절제, 안정화제, 부형제와 같은 추가의 성분은 반복되는 동결/융해 사이클 (바람직하게는 5번의 동결/융해 사이클 (5℃ 내지 -25℃, 1.0℃/분의 냉각 및 가열 속도, 각 사이클 사이에 15분의 등온 과정)).
본 발명의 바람직한 관점에서, 제제는 버퍼를 포함한다. 명세서에서 기술된 용어 "버퍼"는 목적한 범위 내의 pH를 유지시키는 물질을 포함한다. 버퍼는 약산 및 그의 짝염기 또는 약염기 및 그의 짝산의 혼합물을 포함하는 수용액이다. 버퍼는 적은 양의 강산 또는 강염기가 첨가되었을 때 용액의 pH를 거의 변화시키지 않는 성질이 있다. 버퍼 용액은 거의 변함없는 값의 pH를 유지시키기 위한 수단으로 화학분야에 있어서 다양하게 사용된다. 버퍼 용액은 특정 pH 범위를 유지하기 위해 사용된다. 일반적으로, 본 발명의 제제에 버퍼가 적용되면 바람직하게는 CD-RAP 단백질이 안정화된다.
"아미노산 버퍼"는, 예를 들어, 아르기닌 및 그의 짝염을 포함한다. 아미노산 버퍼의 예로 아르기닌/아르기닌 클로라이드, 아르기닌/아르기닌 포스페이트 히스티딘/히스티딘 클로라이드, 히스티딘/히스티딘 포스페이트/ 글루탐산/소듐 또는 포타슘 글루타메이트가 있다. 이러한 예들은 본 발명에 적용된다.
본 명세서에 기술된 제제의 바람직한 pH는 약 4 내지 약 10, 약 5 내지 약 9, 바람직하게는, 약 6 내지 약 8의 범위에서 선택될 수도 있다. 따라서, 바람직하게는 용액의 pH를 6.0 내지 8.0의 범위로 유지할 수 있는 버퍼가 사용된다. 명세서의 pH 수치/범위에서 기술된 용어 "약"은 바람직하게는 명시된 값의 +/- 25%의 범위를 가지는 수의 값을 의미한다. 약제학적 조성물의 pH가 생리학적 레벨이거나 그 근처일 때, 투여에 따른 환자의 편안함이 최대화된다.
일반적으로, 버퍼 및/또는 아미노산의 종류 및 그의 농도는 제제의 오스몰농도가 280 - 320 mosmol/㎏ 범위에서 정해진다. 특히, pH의 범위가 약 5.8 내지 8.4, 바람직하게는 약 6.2 내지 7.4, 더욱 바람직하게는 5.8 내지 8.4, 가장 바람직하게는 6.2 내지 7.4의 범위인 것이 바람직하나, pH는 제제 내의 폴리펩타이드의 안정성 및 가용성을 최대화하기 위한 필요로서 생리학적 범위 밖의 범위이나 바람직하게는 환자가 견딜 수 있을 범위 내에서 조정될 수 있다고 이해되어야 한다.
본 명세서에 기술된 제제에 사용될 수도 있는 버퍼에는, 제한 없이, 히스티딘, 숙시네이트, 글루코네이트, 시트레이트, 트리스(트로메타몰), 비스-트리스, MOPS, ACES, TES, HEPES, EPPS, 에틸렌디아민, 인산, 말레산/ 포스페이트, 시트레이트, 2-모르폴리노에탄술폰산(MES), 소듐 포스페이트, 소듐 아세테이트 및 디에탄올아민이 포함된다.
바람직한 버퍼는 포스페이트 버퍼, 트리스 버퍼, 아르기닌, 히스티딘 및 글루타메이트 버퍼와 같은, 그러나 이에 제한되지는 않는, 아미노산 버퍼이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 제제에 다음의 버퍼가 적용된다: 아르기닌 포스페이트 (바람직하게는 6.0 내지 8.0의 pH, 더욱 바람직하게는 6.5 및 7.5 사이의 pH, 가장 바람직하게는 6.0 또는 7.4의 pH를 갖는), 히스티딘 포스페이트 (바람직하게는 6.0 내지 8.0 사이의 pH, 더욱 바람직하게는 6.5 및 7.5 사이의 pH, 가장 바람직하게는 6.0 또는 7.4의 pH를 갖는), 히스티딘 클로라이드 (바람직하게는 6.0 내지 8.0의 pH, 더욱 바람직하게는 6.5 및 7.5 사이의 pH, 가장 바람직하게는 6.0 또는 7.4의 pH를 갖는). 본 발명에 적용되는 버퍼는 업계에 잘 알려져 있고 공지된 방법에 의해 제조되며 상업적 공급업체로부터 구할 수 있다.
본 발명의 조성물 내의 아미노산, 그의 염, 글라이신, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산 및 그의 염, 트리스 버퍼, 히스티딘 버퍼, 아르기닌 포스페이트 버퍼 및 포스페이트 버퍼와 같은, 그러나 이에 제한되지는 않는 버퍼의 농도는 다음의 범위로부터 선택될 수도 있다: 약 1 내지 약 500 mM, 약 1 내지 약 450 mM, 약 1 내지 약 400 mM, 약 1 내지 약 350 mM, 약 1 내지 약 300 mM, 약 1 내지 약 250 mM, 약 1 내지 약 200 mM, 약 1 내지 약 150 mM, 약 1 내지 약 100 mM, 약 1 내지 약 50 mM, 약 1 내지 약 40 mM, 약 1 내지 약 30 mM, 약 1 내지 약 20 mM, 약 1 내지 약 10 mM, 약 10 내지 약 500 mM, 10 내지 약 450 mM, 10 내지 약 400 mM, 10 내지 약 350 mM, 10 내지 약 300 mM, 10 내지 약 250 mM, 10 내지 약 200 mM, 10 내지 약 150 mM, 약 30 내지 약 500 mM, 30 내지 약 450 mM, 30 내지 약 400 mM, 30 내지 약 350 mM, 30 내지 약 300 mM, 30 내지 약 250 mM, 30 내지 약 200 mM, 또는 30 내지 약 150 mM.
트리스 버퍼의 가장 바람직한 농도는 30 내지 100 mM, 히스티딘 버퍼의 바람직한 농도는 45 내지 60 mM 또는 250 내지 350 mM, 가장 바람직하게는 50 mM 내지 300 mM, 포스페이트 버퍼의 바람직한 농도는 45 내지 60 mM, 아르기닌 버퍼의 바람직한 농도는 250 내지 380 mM 및 글루타메이트 버퍼의 바람직한 농도는 250 내지 360 mM, 가장 바람직하게는 280 내지 360 mM이다.
발명의 바람직한 관점에서, 제제는 장성 조절제를 포함한다. 명세서에서 기술된 용어, "장성 조절제"는 액상 제제의 삼투압을 조정하기 위해 사용될 수 있는 화합물을 의미한다. 적합한 장성 조절제는 글리세린, 락토오스, 만니톨, 덱스트로오즈, 소듐 클로라이드, 마그네슘 설페이트, 마그네슘 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 소듐 설페이트, 소르비톨, 트레할로오스, 수크로오스, 라피노오스, 말토오스 및 업계에 알려진 다른 물질을 포함한다. 한 구체예에서, 액상 제제의 삼투압은 혈액 또는 혈장의 삼투압과 비슷하다. 장성 조절제는 조성물에 삼투압을 부여한다. 인간 혈청의 삼투압은 약 250-350 mOsM/kg이다. 단백질의 안정성을 유지하고 환자의 불편을 최소화하기 위해서, 제제는 등장성, 즉, 인간 혈청 또는 윤활액과 거의 동등한 삽투압을 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 조성물의 삼투압은 바람직하게는 180 내지 420 mOsM/kg, 더욱 바람직하게는 280 내지 320 mOsM/kg이다. 이 범위 내에서 가장 바람직한 삼투압은, 즉, 등장성이다. 용어 "등장성"은 제제가 인간 혈액과 실질적으로 같은 삼투압을 갖는 것을 의미한다. 등장성 제제는 일반적으로 약 270-328 mOsM의 삼투압을 갖는다. 약간 저장성의 삼투압은 250-269 이고 약간 고장성의 삼투압은 328-350 mOsm이다. 삼투압은 예를 들어, 증기압 또는 아이스-프리징 타입 오스모메터를 이용하여 측정될 수 있다.
다만, 통상의 기술자는 요구되는 특정 조건에 의해 조성물의 삼투압이 높거나 낮을 수 있음을 이해할 것이다. 다양한 장성 조절제가 업계에 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 2003/0180287의 [0047] 참조).
염(예를 들어, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드 및 소듐 시트레이트), 버퍼, 이당류(예를 들어, 수크로오스, 글루코오스 및 만니톨), 벌크화제, 및 계면 활성제를 포함하나 이에 제한되지 않는 제제의 다른 성분도 조성물의 삼투압에 기여할 수 있다.
제제 내의 장성 조절제의 농도는 바람직하게는 1 mM ~ 1000 mM 사이이며, 더욱 바람직하게는 약 10 mM ~ 약 200 mM 사이이다.
본 발명의 제제에 적용된 바람직한 장성 조절제는 포타슘 클로라이드 또는 소듐 클로라이드이며, 농도는 바람직하게는 150 mM 미만, 100 mM 미만, 80 mM 미만, 50 mM 미만, 10 ~ 50 mM, 40 ~ 90 mM, 40 ~ 120 mM, 50 ~ 120 mM, 50 ~ 150 mM, 80 ~ 150 mM, 80 ~ 120 mM, 40 ~ 45 mM, 80 ~ 90 mM, 100 ~ 150 mM, 100 ~ 120 mM, 42.5 mM, 89.5 mM, 116.5 mM 또는 150 mM 이다.
한 구체예에서, 제제는 소듐 클로라이드 (NaCl)를 더 포함한다.
다른 구체예에서, 제제는 1-200 mM, 또는 50 mM 미만, 40 mM 미만,　35 mM 미만, 30 mM 미만, 25 mM 미만, 20 mM 미만, 15 mM 미만, 10 mM 미만, 또는 5 mM 미만의 NaCl로 구성된다.
특정 조건하에서, NaCl은 냉동건조를 어렵게 하거나, 재형성된 냉동건조물(lyophilate)을 혼탁(opalescence)하게 할 수 있다.
따라서, 덜 바람직한 실시예에서는, 제제는 NaCl로 구성되지 않는다.
게다가 CD-RAP 단백질, 명세서에서 기술된 제제는 또한 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 안정화제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
따라서, 바람직한 관점에서, 제제는 안정화제를 포함한다. 용어 "안정화제" 는 특정 CD-RAP 단백질 제제의 안정성을 개선 시키거나 향상시키는 물질을 의미한다. 안정화제는 이당류, 당알코올, 금속 킬레이터 또는 금속 킬레이터의 조합, 라디칼 제거제이거나 이들의 결합일 수도 있다.
바람직하게는, 안정화제로 이용되는 이당류는 비환원당, 예를 들어, 수크로오스, 트레할로오스 또는 만노오스일 수도 있다.　
한 구체예에서, 조성물의 이당류의 농도는 다음과 같은 범위에서 선택된다: 0.5~5%, 0.5~4%, 0.5~3%, 0.5~2.5%, 0.5~2%, 0.5~1.5%, 0.5~1 %, 1~1.5%, 1.5~2%, 2~2.5%, 2.5~3%, 3~4%, 4~5% 또는 5% 이상 (w/v)　
한 구체예에서, 조성물의 이당류의 농도는 약 0.5~5 %이며, 예를 들어 약 0.5~2.0%(w/v)이다. 본 발명의 제제에 적용된 바람직한 안정화제는 바람직하게는 5.0%의 수크로오스 또는 바람직하게는 5.0% (w/v)의 만니톨이다.
안정화제는, 또한, 글리콜, 글리세롤, 에리스리톨, 트레이톨, 아라비톨, 자일리톨, 리비톨, 만니톨, 소르비톨, 둘시톨, 이디톨, 이소말트, 말티톨, 락티톨 또는 폴리글리시톨과 같은 당알코올일 수도 있다.
또다른 안정화제는 금속 킬레이터 또는 금속 킬레이터의 조합 일 수도 있다. 한 구체예에서, 금속 킬레이터 는 DTPA, EGTA 및 DEF 이다. 한 구체예에서, 단백질 제제 내의 DTPA 또는 EGTA 의 농도는 약 1 μM ~ 약 10 mM, 약 1 μM ~ 약 5 mM, 약 10 μM ~ 약 10 mM, 50 μM ~ 약 5 mM, 또는 약 75 μM ~ 약 2.5 mM 이다. 한 구체예에서, 단백질 제제 내의 DEF의 농도는 약 1 μM ~ 약 10 mM, 약 1 μM ~ 약 5 mM, 약 10 μM ~ 약 1 mM, 또는 약 20 μM ~ 약 250 μM이다.
안정화제는 유리 라디칼 제거제 일 수 있으며, 특히 산소 라디칼 제거제일 수 있다. 한 구체예에서, 유리 라디칼 제거제는 만니톨 또는 히스티딘이다. 한 구체예에서, 단백질 제제 내의 만니톨의 농도는 약 0.01% ~ 약 5%, 약 0.1% ~ 약 5%, 약 0.5% ~ 약 5%, 또는 약 1% ~ 약 5% 이다.
다른 구체예에서, 제제의 단백질의 응집을 감소시키는 물질은 금속 킬레이터의 조합 및 유리 라디칼 제거제이다. 한 구체예에서, 제제의 단백질이나 단백질의 응집를 감소시키는 물질은 시트레이트이다. 한 구체예에서, 단백직 제제 내의 시트레이트의 농도는 약 0.5 mM ~ 약 50 mM, 약 0.5 mM ~ 약 25 mM, 약 1 mM ~ 약 35 mM, 약 5 mM ~ 약 25 mM, 또는 약 5 mM ~ 약 10 mM 이다.
바람직한 실시예에서, 명세서에 기술된 제제는 부형제를 포함한다. 바람직하게는 부형제는 동결보호제(cryoprotectant), 동결건조 보호제(lyoprotectant), 계면활성제, 벌크화제, 항산화제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 물질이다.
부형제는 또한 화학적 첨가제로서, 바람직하게는 용액(건조 또는 동결된 형태) 내의 CD-RAP 폴리펩타이드를 안정화하는, 공-용질(co-solutes), 또는 공-용매(co-solvents)이며 본 발명의 제제에 첨가될 수 있다. 바람직하게는 부형제는 CD-RAP 단백질의 안정화에 기여하지만, 제제의 다른 물리적, 화학적, 및 생물학적 특성에 기여할 수 있다. 부형제는 업계에 알려져 있으며, 알려진 방법으로 제조될 수 있고, 상업적 공급업체로부터 구할 수 있다.
부형제의 예들은 수크로오스, 락토오스, 글리세롤, 자일리톨, 소르비톨, 만니톨, 말토오스, 이노시톨, 트레할로오스, 글루코오스와 같은 당/폴리올; 혈청 알부민 (소 혈청 알부민 (BSA), 인간 SA 또는 재조합 HA), 덱스트란, PVA, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 (HPMC), 폴리에틸렌이민, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 하이드록시에틸셀룰로오스 (HEC), 하이드록시에틸 전분 (HES)과 같은 폴리머; 다가알코올, (예를 들어, PEG, 에틸렌 글리콜 및 글리세롤) 디메틸설폭사이드 (DMSO) 및 디메틸포름아미드 (DMF)와 같은 비수성 용매; 프롤린, L-세린, 소듐 글루탐산, 알라닌, 글라이신, 리신 하이드로클로라이드, 사르코신 및 감마-아미노부티르산과 같은 아미노산; Tween-80, Tween-20, SDS, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 코폴리머와 같은 계면활성제; 포타슘 포스페이트, 소듐 아세테이트, 암모늄 설페이트, 마그네슘 설페이트, 소듐 설페이트, 트리메틸아민 N-옥사이드, 베타인, 금속 이온 (예를 들어, 아연, 구리, 칼슘, 망간 및 마그네슘), CHAPS, 모노라우레이트, 2-O-베타-만노글리세레이트 또는 상기의 어떠한 물질의 조합과 같은 다양한 부형제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 한 구체예에서, 제제 내의 계면활성제의 농도는 중량당 0.001 ~ 5.0%, 0.001 ~ 2.5%, 0.001 ~ 1%, 0.001 ~ 0.5%, 0.001 ~ 0.2%, 0.001 ~ 0.1%, 0.001 ~ 0.05%, 0.001 ~ 0.01%, 또는 0.001 ~ 0.005% 이다.
"동결보호제"는 생산, 동결, 보관, 처리, 유통, 재형성, 또는 사용하는 동안 동결된 단백질에 안정성을 제공해 주는 물질을 포함한다. 특정 관점에서, "동결보호제"는 동결 과정에 의해 유도된 압박으로부터 단백질을 보호하는 물질을 포함한다. 동결보호제는 동결건조보호 효과를 가질 수도 있다. 동결보호제의 제한없는 예는 수크로오스, 글루코오스, 트레할로오스, 만니톨, 만노오스, 및 락토오스와 같은 당; 덱스트란, 하이드록시에틸 전분 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머; 폴리소르베이트 (예를 들어, PS-20 또는 PS-80)와 같은 계면활성제; 및 글라이신, 아르기닌, 류신 및 세린과 같은 아미노산을 포함한다. 일반적으로 생물 시스템에서 낮은 독성을 나타내는 동결보호제가 사용된다. 제제에 포함되는 경우, 동결보호제는 최종농도의 약 1% 및 약 10% (w/v)사이, 바람직하게는 최종농도의 0.5 내지 8% (w/v), 0.5 내지 6% (w/v),0.5 내지 8% (w/v), 0.5 내지 5% (w/v), 1 내지 8% (w/v), 1 내지 6% (w/v), 1 내지 8% (w/v), 1 내지 5% (w/v), 1.5 내지 8% (w/v), 1.5 내지 6% (w/v), 1.5 내지 8% (w/v), 1.5 내지 5% (w/v), 2 내지 8% (w/v), 2 내지 6% (w/v), 2 내지 8% (w/v), 2 내지 5.5% (w/v)로 부가된다.
명세서에 기술된 이당류는 동결건조 보호제 또는 동결보호제로서 역할을 할 수도 있다. "동결건조 보호제"는 냉동건조 및 그 후 보관에 있어서 단백질의 화학적 또는 물리적 불안정성을 억제하거나 감소시키는 물질을 포함한다. 한 관점에서, 동결건조 보호제는 건조되는 과정 동안 조성물로부터 물이 제거됨으로써 나타나는 단백질의 화학적 또는 물리적 불안정성을 억제하거나 감소시킨다. 다른 관점에서, 동결건조 보호제는 수소결합을 통하여 단백질이 적절한 입체구조를 유지할 수 있게 도움으로써 단백질을 안정화한다.
따라서, 한 관점에서, 명세서에 기술된 이당류는 동결되는 동안 CD-RAP 단백질의 안정화에 도움을 줄 수도 있다. 동결하는 동안의 보호 작용은 이당류의 완전한 농도에 따라 달라질 수도 있어(Carpenter et al., Pharm. Res. (1997), 14:969-975), 안정성을 최대화하기 위해 5% 초과의 농도가 필요할 수도 있다.
한 관점에서, 이당류는 건조되는 동안 CD-RAP 단백질을 안정화한다. 건조되는 동안의 보호는 이당류 및 단백질 사이의 최종 질량비에 따라 달라질 수도 있다(Carpenter et al., Pharmaceutical Research 14:969-975 (1997)). 따라서, 몇몇 구체예에서, 이당류의 농도는 이당류와 단백질의 목적한 질량비, 일반적으로 적어도 1:1인,를 얻을 수 있도록 선택된다. 몇몇 구체예에서, 이당류:단백질의 질량비가 약 5:1인 경우에 안정성은 최적화된다. 다른 구체예에서, 이당류:단백질의 질량비는 10:1 , 20:1 , 30:1 , 40:1 , 50:1 , 100:1 , 200:1 , 300:1 , 400:1 , 500:1 , 600:1 , 700:1 , 800:1 , 900:1 , 1000:1, 또는 1000:1 이상이다.
한 구체예에서, 동결건조 보호제가 명세서에 기술된 제제에 부가된다. 용어 "동결건조 보호제"는 동결-건조 또는 탈수과정(1차 및 2차 동결-건조 사이클)동안 무정형 유리 매트릭스를 제공함에 의해서, 그리고 건조 과정 동안 제거되는 물분자와 교체하여 수소 결합으로 단백질과 결합함에 의해서 단백질에 안정성을 제공하는 물질을 포함한다. 이는 냉동건조 사이클 동안 단백질 분해를 최소화하고 단백질의 입체구조를 유지하는데 도움을 주며 장기간 보관시 안정성을 향상시킨다. 동결건조 보호제는 전-냉동건조된 제제에, 동결건조 보호제의 동결건조 보호 가능한 양만큼 존재하에 CD-RAP 단백질이 냉동건조 된 다음에, 단백질은 실질적으로 그의 물리적 화학적 안정성 및 냉동건조 과 보관에 따른 온전한 상태를 유지함을 의미하는 "동결건조 보호 가능한 양"으로 부가된다.
동결건조 보호제의 제한 없는 예는 수크로오스 또는 트레할로오스와 같은 당; 모노소듐 글루타메이트, 글라이신 또는 히스티딘과 같은 아미노산; 베타인과 같은 메틸아민; 마그네슘 설페이트와 같은 리오트로픽 염; 트리하이드릭 또는 그 이상의 당 알코올, 예를 들어, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 및 만니톨과 같은 폴리올; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉스; 및 이들의 조합을 포함한다. 제제에 부가되는 동결건조 보호제의 양은 단백질 제제가 냉동건조 될 때 허용되지 않는 단백질의 분해/응집을 일으키지 않는 일반적인 양이다. 동결건조 보호제가 당 (수크로오스 또는 트레할로오스와 같은) 이고 단백질은 항체인 경우, 단백질 제제 내의 동결건조 보호제의 양의 제한 없는 예는 약 10 mM 내지 약 400 mM, 바람직하게는 약 30 mM 내지 약 300 mM, 가장 바람직하게는 약 50 mM 내지 약 100 mM이다. 한 구체예에서, 제제에 계면활성제가 포함될 수도 있다.
다른 바람직한 부형제는 계면활성제이다. 용어 "계면활성제"는 일반적으로 공기/용액 계면-유도 압박 및 용액/표면 유도-압박으로부터 CD-RAP 단백질을 보호하는 물질을 포함한다. 예를 들어, 계면활성제는 응집으로부터 단백질을 보호할 수도 있다.
계면활성제의 예는 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20)와 같은 비-이온성 계면활성제; 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188); 트리톤, 소듐 도데실 설페이트 (SDS); 소듐 라우럴 설페이트; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-설포베타인, 미리스틸-설포베타인, 리놀레일-설포베타인, 스테아릴-설포베타인, 라우릴-사르코신, 미리스틸-사르코신, 리놀레일- 사르코신, 스테아릴-사르코신, 리놀레일-베타인, 미리스틸- 베타인, 세틸-베타인, 라우로아미도프로필-베타인, 코카미도프로필-베타인, 리놀레아미도프로필-베타인, 미리스트아미도프로필-베타인, 팔미도프로필-베타인, 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들어, 라우로아미도프로필), 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-,또는 이소스테아르아미도프로필- 디메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 Monaquat series (Mona Industries, Inc., Paterson, NJ.), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 코폴리머 (예를 들어, 플루로닉, PF68)을 포함하나 이제 제한되는 것은 아니다. 부가되는 계면활성제의 양은 예를 들어, 고분자량(HMW) 물질 또는 저분자량 (LMW) 물질의 퍼센트를 측정하기 위한 SEC-HPLC를 이용하여 평가된 재형성된 단백질의 응집을 허용가능한 정도로 유지하고 명세서에 기술된 단백질 제제의 냉동건조물의 재형성 후에 입자형성을 최소화할 수 있는 양이다. 예를 들어, 계면활성제는 제제(액체, 또는 냉동건조물의 재형성 전의) 내에 약 0.001 내지 약 0.5%, 예를 들어, 약 0.05 내지 약 0.3%로 존재할 수 있다. 본 발명의 제제에 적용되는 바람직한 계면활성제는 폴리소르베이트 20 또는 80이다.
또 다른 바람직한 부형제는 벌크화제일 수도 있다. 즉, 발명의 한 관점에서, 본 발명의 제제는 벌크 제제로 제조되는 것이 고려되고 그러한 경우 약제학적 조성물의 성분은 투여에 필요한 양보다 많은 양이 되도록 조정되고 투여되기 전에 적절하게 희석된다.
명세서에 기술된 용어 "벌크화제"는 약제학적 제품과 직접적인 상호작용 없이 동결 건조된 제품의 구조를 제공하는 물질을 포함한다. 게다가 약제학적으로 우수한 케이크를 제공하기 위해, 벌크화제는 또한 붕괴온도(collapse temperature)의 수정, 동결-융해 보호의 제공 및 장기간 보관에 있어서 단백질 안정성의 향상과 관련하여 유용한 퀄리티를 제공한다. 벌크화제의 제한 없는 예는 만니톨, 글라이신, 락토오스, 및 수크로오스를 포함한다. 벌크화제는 결정질(글라이신, 만니톨 또는 소듐 클로라이드) 또는 무정형(덱스트란, 하이드록시에틸 전분)일 수도 있고 일반적으로 단백질 제제 내에서 0.5% 내지 10%의 양으로 사용된다.
바람직하게는, 본 발명의 제제에 적용된 벌크화제는 심미적으로 허용되고 균일하거나 기계적으로 강한 케이크 형성을 촉진한다. 벌크화제는 또한 바람직하게는 개방 기공 구조(open pore structure)의 형성 및 쉽고 빠른 재형성을 촉진한다. 벌크화제는 또한 바람직하게는 케이크의 붕괴, 공융(eutectic melting) 또는 잔여수분의 보유를 감소시키거나 억제한다. 다른 관점에서, 벌크화제는 바람직하게는 압박(예를 들어, 물리적 및 화학적 압박)에 대하여 CD-RAP 단백질의 보호 및 단백질 활성의 유지를 돕는다.
한 구체예에서, 조성물 내의 벌크화제의 농도는 다음의 범위로부터 선택된다: 1 내지 10%, 1 내지 8%, 1 내지 5%, 2 내지 8%, 2 내지 6%, 2,5 내지 6%, 0.5 내지 1%, 1 내지 1.5%, 1.5 내지 2%, 2 내지 2.5%, 2.5 내지 3%, 3 내지 3.5%, 3.5 내지 4%, 4 내지 4.5%, 4.5 내지 5%, 5% 이상, 0.5 내지 5%, 0.5 내지 4%, 0.5 내지 3%, 0.5 내지 2.5%, 0.5 내지 2%, 0.5 내지 1.5%, 또는 0.5 내지 1%. 한 구체예에서, 조성물 내의 벌크화제의 농도는 0.5 내지 5%, 예를 들어 0.5 내지 3%, 더욱 정확하게는 1.8 내지 2% 이다.
다른 바람직한 부형제는 항산화제일 수도 있다. 명세서에 기술된 용어 "항산화제"는 다른 분자의 산화를 늦추거나 억제할 수 있는 분자이다. 산화는 전자가 기질로부터 산화제로 이동하는 화학적 반응이다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위해, 생리학적으로 허용되는 항산화제가 바람직하다. 그러한 항산화제는, 환원제, 아스코르브산 (비타민 C), 리포산, 멜라토닌, 요산, 카로틴, 레티놀, 토코페롤 및 토코트리에놀, 예를 들어, 알파-토코페롤(비타민 E), 유비퀴논 (코엔자임 Q) 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
몇몇 구체예에서, 제제는 임의적으로 보존제를 함유할 수도 있다. "보존제"는 박테리아 활성을 줄이기 위해 본 발명의 제제에 부가될 수 있는 화합물이다. 보존제의 첨가는, 예를 들어, 다회-사용(다회-투여)제제의 생산을 가능하게 한다. 가능한 보존제의 예는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤잘코늄 클로라이드 (알킬기의 긴 사슬 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 다른 유형의 보존제는 페놀, 부틸 및 벤질 알코올과 같은 방향족 알코올, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥사놀, 3-펜타놀, 및 m-크레솔과 같은 알킬 파라벤을 포함한다. 여기서 가장 바람직한 보존제는 벤질 알코올이다.
실시예(실시예 3 및 4 참조)는 시험된 제제(6.0의 pH에서, 50 mM 포타슘 포스페이트/5% 수크로오스 및 150 mM 글라이신의 CD-RAP 단백질을 제외하고)에서 동결융해 사이클이 단백질의 안정성에 영향이 없음을 나타낸다(도 6, 7, 10 및 11). 후자의 경우 세번째 동결/융해 사이클 후에 CD-RAP 단백질 농도의 유의한 감소를 볼 수 있다. 그러나, 모든 다른 제제에서 용액은 모든 동결 사이클 후에 맑았다. UV/Vis에 의한 rhCD-RAP 단백질의 정량으로부터의 결과와 조합하여, 문제를 해결하고 고농도의 rhCD-RAP 단백질에 적합한 조건을 얻었다.
따라서, 더욱 바람직한 제제는 액상의, 바람직하게는 수성의, 적어도 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 mg/mL의 CD-RAP 단백질 및 포타슘 또는 소듐 포스페이트, 트리스, 히스티딘, 아르기닌 및 글루타메이트 버퍼로 이루어진 그룹으로부터 선택된 버퍼 및 아스파테이트, 글루타메이트 (바람직하게는 글루타메이트 포스페이트), 아르기닌 (바람직하게는 아르기닌 포스페이트 또는 아르기닌 클로라이드), 히스티딘 (바람직하게는 히스티딘 클로라이드또는 히스티딘 포스페이트),리신 및 글라이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 제제이다.
글루타메이트, 아스파테이트, 아르기닌, 히스티딘, 리신 및 글라이신은 바람직하게는 제제 내에 2.5% (w/v)의 양으로 존재한다. 바람직하게는, 버퍼 및 아미노산은 5회 동결/융해 사이클 (5 ℃ 내지 -25 ℃, 1.0 /분의 냉각 및 가열 속도, 각 사이클 사이에 15분의 등온 과정)동안 CD-RAP 단백질의 안정화를 제공할 수 있도록 선택된다.
따라서, 따라서, 더욱 바람직한 제제는 액상의, 바람직하게는 수성의, 적어도 30 mg/mL CD-RAP 단백질 및 50 mM 트리스 클로라이드 및 2.5% 글루타메이트; 50mM 히스티딘 및 2.5% (w/v) 글라이신, 2.5% (w/v), 글루타메이트(w/v) 또는 2.5% 리신 (w/v); 300 mM 히스티딘 클로라이드 pH 6.0; 50, 100, 200 또는 300 mM 히스티딘 포스페이트 pH 6.0; 350 mM 아르기닌 클로라이드 pH 6.0; 350 mM 아르기닌 포스페이트 pH 6.0; 350 mM 아르기닌 포스페이트 pH 7.4;또는 300 mM 포타슘 글루타메이트 pH 6.0을 포함하는 제제이다. 이 제제는 임의적으로 명세서에 기술된 안정화제, 장성 조절제 및/또는 부형제를 포함할 수도 있다.
조성물의 특정 성분은 업계에서 알려진 대체물로 교환될 수 있음이 이해되어야 한다. 그러나, 통상의 기술자는 또한 특정 성분의 포함은 다른 성분, 농도 또는 제제의 제조방법을 사용하지 못하게 하므로, 이런 이유로, 제한 없이 화학적 호환성, pH, 삼투압, 및 안정성이 포함됨을 이해할 것이다.
명세서에 기술한 바와 같이, 본 출원은 제제에 하전된 아미노산의 부가함으로써 제제에 고농도로 함유된 CD-RAP 단백질의 응집을 감소시킬 수 있다는 발견에 관한 것이다. 제제 내에서 고농도의 CD-RAP 단백질이 응집되는 원인과 관계없이, 명세서에 기술된 하전된 아미노산 또는 하전된 아미노산의 조합의 부가는 제제 내의 CD-RAP 단백질의 응집을 감소시킨다. 한 구체예에서, 하전된 아미노산의 부가는, 예를 들어, 보관, 상승된 온도에의 노출, 빛에의 노출, 전단력에의 노출, 계면활성제의 존재, pH 및 이온상태, 및 이들의 조합에 의한 제제 내의 응집을 감소시킨다.
본 발명자들에 의해 발견된 이러한 수단은 CD-RAP 단백질 제제, 특히 액상 제제에서의 응집을 감소시키기 위해 사용될 수도 있다. 감소된 응집이 따라서 바람직하게는 액상 제제에서 관찰된다. 나중에 사용하기 위하여 액상 제제를 직접 보관할 때, 동결된 상태로 보관하고 사용하기 전에 융해될 때, 또는 사용하기 전에 액체 형태 또는 다른 형태로 재형성하기 위하여 냉동건조, 열풍 건조(air-dried), 또는 분무 건조 형태와 같이 건조된 형태로 제조된 경우에도 응집의 감소가 관찰될 것이라 추측된다.
따라서, 여기서 기술된 제제는 업계에서 알려진 어느 방법에 의해서도 보관될 것이라고 예상된다. 제한 없는 예로 동결, 냉동건조, 및 분무 건조 제제를 포함한다.
어떤 경우에는, 단백질 제제는 보관을 위해 동결된다. 따라서, 동결-융해 사이클 상태를 포함한 그와 같은 상태에서 제제가 상대적으로 안정할 것이 요구된다. 제제의 안정성을 측정하기 위한 하나의 방법은 샘플 제제를 적어도 2회, 예를 들어, 3회 내지 10회의 동결 및 융해 (예를 들어, 실온에서 빠르게 융해 또는 얼음에서 천천히 융해)과정을 받게 하고, 동결-융해 사이클 후에 축적된 저분자량 (LMW) 물질 및/또는 고분자량(HMW) 물질을 측정 및 동결-융해 사이클 전의 샘플에 존재하는 저분자량 물질 또는 고분자량 물질과 비교하는 것이다. LMW 또는 HMW 물질의 증가는 제제의 부분으로서 단백질의 안정성이 감소됨을 나타낸다. LMW 및 HMW 물질의 존재를 측정하기위해 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)가 사용될 수 있다.
어떤 경우에는, 단백질 제제는 액체 상태로 보관될 수도 있다. 따라서, 명세서에 기술된 바와 같이, 다양한 온도를 포함한 상태에서 액상 제제가 안정할 것이 목적된다. 예를 들어, 제제의 안정성을 측정하기 위한 하나의 방법은 가혹한 온도(2-8, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 및 50 ℃)에서 샘플 제제를 보관하고 시간에 따라 축적되는 HMW 및/또는 LMW 물질의 양을 모니터하는 것이다. 시간에 따라 축적되는 HMW 및/또는 LMW 물질의 양이 적을수록, 제제를 보관하기에 더 좋은 조건이다. 추가적으로, 단백질의 전하 프로파일(charge profile)은 양이온 교환-고성능 액체 크로마토그래피(CEX-HPLC)에 의해 모니터할 수 있다. 그 대신에, 제제는 냉동건조 후에 보관될 수 있다.
용어 "냉동건조" 또는 "동결건조"는 냉동건조와 같은 건조 과정을 거친 적어도 수분의 90% 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98%가 제거된 물질의 상태를 포함한다. 따라서, 명세서에 기술된 용어 "냉동건조"는, 진공 환경에서 건조된 물질이 먼저 동결된 다음 승화에 의해 얼음 또는 동결된 용매가 제거되는 과정을 의미한다. 보관에 있어서 냉동건조된 제품의 안정성을 향상시키기 위해 부형제(예를 들어, 동결건조보호제)가 냉동건조될 제제에 포함될 수도 있다. 명세서에 기술된 용어 "재형성된 제제"는 냉동건조된 단백질 제제를 희석액(diluent)에 용해하여 단백질이 희석액에 분산되도록 제조된 제제를 말한다.
명세서에 사용된 용어 "희석액"은 약제학적으로 허용되고(인간에게 투여하기에 안전하고 무독성인) 냉동건조 후에 재형성된 제제와 같은 액상 제제의 제조에 유용한 물질이다. 희석액의 제한없는 예는 멸균수, 정균수(bacteriostatic water for 주사; BWFI), pH 버퍼용액 (예를 들어, 포스페이트- 버퍼 식염수), 멸균 식염수 용액, 링거액, 덱스트로오즈 용액, 또는 염 및/또는 버퍼의 수용액을 포함한다.
냉동건조 후에 제제의 단백질 성분의 안정성에 대해 제제를 시험하는 것은 제제의 안정성을 측정하는 데에 유용하다. 그 방법은 샘플 제제가 동결 대신 냉동건조된 것을 제외하고, 앞서 동결에 대해 기술한, 희석액을 사용하여 재형성되고, 재형성된 제제가 LMW 물질 및/또는 HMW 물질의 존재를 위해 실험되었다는 것과 유사하다. 냉동건조 되지않은 샘플 제제와 비교하여 냉동건조된 샘플의 LMW 또는 HMW 물질의 증가는 냉동건조된 샘플의 안정성이 감소하였음을 나타낸다.
어떤 경우에, 제제는 분무-건조되고나서 보관된다. 분무 건조를 위해서, 액상 제제는 드라이 가스 스트림의 존재하에 에어로졸화 된다. 제제의 액적(droplets)으로부터 가스 스트림으로 물이 제거되어 약제의 건조된 입자가 된다. (i) 분무 건조 탈수하는 동안 단백질의 보호, (ii) 분무 건조 후 보관하는 동안 단백질의 보호, 및/또는 iii) 분무주입에 적합한 용액 특성의 제공을 위해 제제에 부형제가 포함될 수도 있다. 그 방법은 샘플 제제가 동결 대신 분무 건조된 것을 제외하고, 앞서 동결에 대해 기술한, 희석액을 사용하여 재형성되고, 재형성된 제제가 LMW 물질 및/또는 HMW 물질의 존재를 위해 실험되었다는 것과 유사하다. 분무 건조되지않은 샘플 제제와 비교하여 분무 건조된 샘플의 LMW 또는 HMW 물질의 증가는 분무 건조된 샘플의 안정성이 감소하였음을 나타낸다.
냉동건조된 제제는 일반적으로 사용을 위해서 냉동건조된 제제를 용해하기 위한 수용액의 부가에 의해 재형성된다. 냉동건조된 제제의 재형성을 위해 다양한 종류의 수용액이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 물을 사용하여 냉동건조된 제제가 재형성된다. 냉동건조된 제제는 바람직하게는 물(예를 들어, USP WFI, 또는 주사용 증류수(water for 주사; WFI)) 또는 정균수(예를 들어, 0.9% 벤질 알코올을 함유한 USP WFI)를 필수적으로 함유하고 있는 용액으로 재형성된다. 그러나, 버퍼 및/또는 부형제 및/또는 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 용액 또한 사용될 수 있다.
동결 건조 또는 냉동건조된 제제는 일반적으로 용액, 서스펜션, 에멀젼 등과 같은 액체로부터 제조된다. 따라서, 동결 건조 또는 냉동건조 하에 있는 액체는 바람직하게는 최종의 재형성된 액상 제제에 목적된 모든 성분을 포함한다. 그 결과로서, 재형성될 때, 동결 건조 또는 냉동건조된 제제는 재형성에 따라 목적한 액상 제제가 될 것이다.
발명의 다른 관점에서, 제제는 치료를 위해 사용될 것이다. 따라서, 본 발명은 명세서에 기술된 제제를 포함하는 약제학적 조성물(또는 의약)을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명은 명세서에 기술된 제제의 치료상의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 CD-RAP 폴리펩타이드로 유익하게 치료가능한 질병 또는 장애을 가진 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 여기서 기술된 제제는 CD-RAP 단백질로 예방 및/또는 치료가능한 질병의 예방 및/또는 치료에 적용된다.
용어 "대상체"는 살아있는 유기체를 포함한다. 대상체의 예는 포유동물, 예를 들어, 인간, 개, 소, 말, 돼지, 양, 거위, 고양이, 마우스, 토끼, 랫트, 및 인간 이외의 형질전환 동물을 포함한다. 한 구체예에서, 대상체는 인간이다.
용어 "유효량" 또는 "유효 투여량"은 목적한 효과를 얻기에 충분하거나 적어도 부분적으로 목적한 효과를 달성할 수 있는 양으로 정의된다. 용어 "치료상의 유효량"은 질병을 앓고 있는 환자를 치료하기에 충분하거나 적어도 부분적으로 질병 및 합병증을 막을 수 있는 양을 말한다. 유효량은 감염의 정도 및 대상체의 면역 시스템의 일반적인 상태에 따라 달라진다. 용어 "환자"는 예방 또는 치료를 받는 인간 및 다른 포유동물을 포함한다.
제제의 적절한 투여량, 또는 치료학적 유효량은 치료받을 상태, 질병의 상태, 이전의 치료 및 환자의 병력 및 치료제에 대한 반응에 따라 달라진다. 적절한 투여량은 담당의사의 판단에 따라 조정될 수 있어 환자에게 한번 또는 연속 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 필요에 따라 단독 또는 다른 약물과 조합하여 투여될 수 있다.
볼 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여, 즉, 피하, 근육 내, 정맥 내, 관절 내 및/또는 활액 내 투여에 특히 유용하다. 비경구 투여는 볼루스 주사(bolus 주사) 또는 지속적 주입(continuous infusion)에 의해 할 수 있다.
한 구체예에서, 주사는 국소 또는 비-전신적 주사, 바람직하게는 활액(synovia), 활액 공간, 활액(synovial fluid),또는 윤활관절, 연골하부분, 뼈연골 결함, 관절 내 공간 바람직하게는 무릎, 어깨, 엉덩이, 엄지손가락, 턱관절 또는 후관절, 섬유륜, 수핵, 수핵공간, 디스크 내(intradiscally) 또는 디스크 관통(transdically) 주사이다. 더욱 바람직하게는, 주사는 무릎, 어깨, 엉덩이, 엄지손가락, 턱관절 또는 후관절에의 관절 내 주사이다. 더욱 바람직하게는, 관절 내 주사는 후관절 또는 턱관절의 활액(synovial fluid)에의 관절 내 주사이다. 더욱 바람직한 주사는 활액하 공간 또는 부분(area)으로의 주사 또는 연골 또는 뼈연골 결함으로의 주사이다. 또한 멤브레인으로 결함을 막기 전 또는 후에 연골 또는 뼈연골 결함으로의 주사가 포함된다. 멤브레인은 골막 또는 콜라겐 멤브레인일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 구체예에서, 멤브레인은 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 III, 돼지 또는 랫트의 콜라겐 타입 I 또는 타입 III, 히알루론산 또는 그의 유도체를 포함하는 멤브레인이다. 제제를 주사하기 전에 결함을 막는 것의 이점은 내지 제제의 희석을 줄이거나 제제의 활성 성분의 국소 농도를 증가시킨다는 것이다. 멤브레인은 또한 세포의 부착을 위한 생체접착제로서 작용한다. 단백질 제제가 냉동건조되면, 냉동건조된 물질은 먼저 투여에 앞서 적절한 액체로 재형성된다. 냉동건조된 물질은 예를 들어, 정균 주사용수(BWFI), 생리식염수, 포스페이트 버퍼 식염수(PBS), 수용액, 또는 냉동건조 되기 전과 동일한 단백질 제제로 재형성될 수도 있다.
주사하기 위한 약제학적 조성물은 추가된 보존제와 함께 단위 제형(unit dosage form), 예를 들어, 앰플 또는 다회용 컨테이너(multi-dose containers)로 존재할 수도 있다. 게다가, 최근 다수의 약물전달법이 개발되어왔고 본 발명의 약제학적 조성물은 이들 새로운 방법, 예를 들어, Inject-ease, Genject, Genen과 같은 펜 주사기, 및 BioJector와 같은 바늘 없는 장치를 사용하여 투여하기에 적합하다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 아직 발견되지 않는 투여 방법에도 적용될 수 있다. Langer, 1990, Science, 249: 1527-1533를 참고한다.
약제학적 조성물은 또한 데포 제제(depot preparation)로 제제화될 수 있다. 이와 같은 장기간 작용성 제제는 이식(예를 들어 피하, 인대 또는 힘줄, 활액하 또는 근육 내에), 활액하 주사 또는 근육 내 주사에 의해 투여될 수도 있다. 따라서, 예를 들어, 제제는 적합한 고분자성 또는 소수성 물질(예를 들어 허용가능한 오일 내의 에멀젼), 이온 교환 수지, 또는 난용성 염과 같은 난용성 유도체로 수정될 수도 있다.
약제학적 조성물은 반응성 조성물을 제공하기 위해 투여되는 종래의 다양한 데포 제제일 수도 있다. 여기에는, 예를 들어, 용액 또는 서스펜션, 슬러리, 겔, 크림, 밤, 에멀젼, 로션, 파우더, 스프레이, 거품 제제, 페이스트, 연고, 샐브(salves), 밤(balms) 및 드랍(drops) 과 같은 고형, 반고형 및 액상 투여형태를 포함한다.
약제학적 조성물은 목적에 따라, 활성 성분을 함유한 하나 또는 그 이상의 단위 제제를 포함할 수도 있는 바이알, 팩 또는 디스펜서 장치에 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 디스펜서 장치는 주사를 위한 액상 제제의 한 회 투여랑을 가진 시린지를 포함할 수 있다. 시린지는 투여를 위한 설명서가 동봉될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 추가의 약제학적으로 허용가능한 성분을 포함할 수도 있다. 다른 약제학적으로 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 기술된 제제의 목적한 특성에 부정적인 영향을 미치지 않는 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제가 본 발명의 단백질 제제에 포함될 수도 있다. 명세서에 기술된 것으로서 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 약제학적 투여와 호환가능한 어느 및 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항박테리아 및 항균제, 등장성 및 흡수 지연제를 의미한다. 약제학적 활성 성분을 위한 이와 같은 물질의 사용은 업계에 잘 알려져 있다. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 적용 농도 및 투여량에서 수용자에게 무독성이고: 추가의 버퍼; 보존제; 공-용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; EDTA와 같은 킬레이트화제; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 폴리에스테르와 같은 생분해성 폴리머; 소듐, 폴리하이드릭 당 알코올과 같은 염 형성 카운터 이온; 알라닌, 글라이신, 아스파라긴, 2-페닐알라닌, 및 트레오닌과 같은 아미노산; 락티톨, 스타키오스, 만노오스, 소르보오스, 자일로오스, 리보오스, 리비톨, 미오이노시토오스, 미오이노시톨, 갈락토오스, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클리톨 (예를 들어, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜과 같은 당 또는 당 알코올; 글루타치온, 티옥트산, 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, [알파]-모노티오글리세롤, 및 소듐티오설페이트와 같은 황 함유 환원제; 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 다른 이뮤노글로불린과 같은 저분자량 단백질; 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머를 포함한다.
여기에 기술된 제제는 필요로 하는 환자에 있어서 질병 또는 장애을 치료 및/또는 예방하는 약제학적 조성물로서 유용하다. 용어 "치료"는 치료학적 처치 및 예방 수단 모두를 말한다. 치료는 제제를 치료, 치유, 완화, 경감, 변동, 개선, 향상을 목적으로 하거나 질병, 질병의 증상 또는 질병에 대한 소질에 영향을 주기 위해 신체, 분리된 조직 또는 질병/장애, 질병/장애의 증상 또는 질병/장애에 대한 소질을 가진 환자의 세포에 적용 또는 투여하는 것을 포함한다.
"치료를 필요로 하는" 자는 질병을 예방하고자 하는 자 및 이미 장애에 걸린 자를 포함한다. 용어 "장애"는 여기에 기술된 단백질 제제로 치료되는 어떤 상태이다. 여기에는 만성 및 급성 장애 또는 문제의 장애에 포유동물을 취약하게 하는 이러한 병적 상태를 포함하는 질병을 포함한다. 치료될 장애의 제한 없는 예는 퇴행성 질환, 뼈 및/또는 연골 및/또는 관절 연골 결함, 면역 질환, 관절염 (골관절염, 류마티스성 관절염을 포함하나 이에 제한되지 않는다)과 같은 관절(joint), 뼈 또는 연골 조직의 만성 염증 및 퇴행성 디스크 질환과 같은 척추 장애를 포함한다. 한 구체예에서, 척추 장애는 특발성 요통, 요추간판탈출, 디스크 내장증(internal disc disruption) 또는 균열 디스크(fissured discs), 신경근변증, 척추관 협착증, 추간판탈출증-유도 좌골신경통, 좌골신경통, 특발성 척추 측만증 또는 척수병증이다.
용어 "퇴행성 질환"은 뼈 구조의 관여 유무에 따른 연골 퇴행 또는 파괴와 같은 손상된 연골 구조를 가져오는 질병 또는 결함을 의미한다. 바람직하게는, 퇴행성 질환은 퇴행성 연골 질환이다. 여기에는 턱관절 장애 (TMDs), 비구순 장애(acetabular labrum disorders), 관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 소아 만성 관절염, 리조멜릭 가관절염(rhizomelic pseudoarthritis), 류마티스성 다발 관절염, 퇴행성 디스크 질환, 연골 또는 뼈연골 결함, 중심 연골 결함, 중심 뼈 연골 결함, 가벼운 연골 결함, 박리성 뼈연골염, 전-두께(full-thickness) 연골 결함, 부분-두께(partial-thickness) 연골 결함, 연골연화증, 무릎 관절 주변의 힘줄 및 인대와 관련된 외상, 측면 또는 중심 메니스커스의 외상, 메니스커스 티어스(meniscus tears), 앞쪽의 중대한 인대 손상, 활막성 골연골종증, 척추염, 강직성 척추염, 활막염, 융모결절성 활막염을 포함한다.
용어 "연골 결함"은 연골 질환, 예를 들어, 외상 또는 퇴행에 의한 연골의 변형을 포함한 비정상적인 연골을 의미한다.
용어 "관절 연골"은 관절 내 뼈 부분의 표면을 덮고 있고 뼈가 움직일 수 있도록 두 개의 뼈 사이에 쿠션으로 작용한다. 정상의 건강한 관절 연골은 히알린 연골로 기술된다. 관절 연골은 프로테오글리칸, 뚜렷한 어그리칸(predominantly aggrecan), 콜라겐 타입 II 섬유, 다른 단백질 및 물이 풍부한 세포 내 물질의 매트릭스에 박혀있는 특별한 세포(연골세포)로 이루어진다. 매트릭스는 박혀있는 연골세포에 의해 생산되고 유지된다. 연골 조직은 신경이 통하지 않고 혈관이 없으며 기저조직에 의해 영양분을 공급받는다.
CD-RAP 단백질에 더하여, 본 발명의 약제학적 조성물은 추가의 치료학적 또는 생리학적 활성 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 골관절염과 같은 특정 진단의 치료에 유용한, 예를 들어, 관절 연골 또는 활액 성분과 관련된 하나 또는 그 이상의 억제제와 같은 치료상의 인자는 항-메탈로프로테이나제, 사이클린 화합물, 사이토카인 길항제, 코르티코스테로이드, TNF 억제제, IL-억제제, ㅎ하항-혈관생성 물질, 아그레카나제 억제제, p38 키나아제 억제제, 세포사멸 억제제, 히알루로니다제 억제제 및 단백질 가수분해 효소 억제제일 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 인플릭시맙, 이타너셉트, 아달리물랍(adalimulab), 네렐리몬맙(nerelimonmab), 리너셉트(lenercerpt) 등 또는 이들의 조합을 포함하는 염증을 조절하는 인자 또한 조성물의 부분일 수 있다. 약제학적 리포조말 조성물은 히알루론산 또는 염, 에스테르, 분자내 에스테르(inner ester), 및 황화 유도체를 포함하는, 바람직하게는 히알루론산의 부분 에스테르인, 그의 유도체와 같은 세포 외 매트릭스 성분을 포함할 수도 있다고 예상된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 제제를 함유하는 키트(또는 제조물) 또는 컨테이너에 관한 것이다. 제제는 바람직하게는 이미 액체상태일 수도 있다. 그러나, 이에 대체하여,바람직하게는 냉동건조된 상태일 수도 있다. 또한, 동결, 냉동건조, 동결 건조 또는 분무 건조 상태일 수도 있다. 따라서, 제제가 액체가 아닌 경우, 기술자에 의해 (액체) 수성 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. 예를 들어, 제제는 냉동건조 되고 나서 재형성되어야 한다. 따라서, 키트는 동결, 냉동건조, 동결 건조 또는 분무 건조된 제제의 재형성을 위한 수단 및/또는 제제 또는 약제학적 조성물의 투여를 위한 수단을 각각 더 포함할 수도 있다. 키트는 또한 사용을 위해 설명서가 동반될 수 있다.
따라서, 여기서 기술된 제제를 함유하는 제조물 및 그의 사용을 위한 설명이 제공된다. 제조물은 제제를 함유하기에 적합한 컨테이너를 포함한다. 적합한 컨테이너는 병, 바이알(예를 들어, 듀얼 챔버 바이알), 시린지(예를 들어, 싱글 또는 듀얼 챔버 시린지), 테스트 튜브, 네뷸라이저, 흡입기(예를 들어, 정량 흡입기 또는 건조 분말 흡입기), 또는 데포를 제한 없이 포함한다. 컨테이너는 유리, 금속 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리올레핀)과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 컨테이너는 제제를 담고 재형성 및/또는 사용을 위한 설명과 관련된 라벨로 표시한다. 라벨은 또한 제제의 용도 또는 피하 투여를 목적함을 표시할 수 있다. 제제를 담는 컨테이너는 반복 투여(예를 들어, 1-6회 투여)가 가능한 수회-사용 바이알일 수도 있다. 제조물은 또한 적합한 희석액(예를 들어, WFI, 0.9% NaCl, BWFI, 포스페이트 버퍼 식염수)을 포함하는 두 번째 컨테이너를 포함할 수도 있다. 제조물이 냉동건조된 단백질 제제를 포함할 때, 냉동건조된 제제와 희석액의 혼합은 일반적으로 적어도 20 mg/mL의 재형성된 제제 내의 최종 단백질 농도를 제공할 것이다. 제조물은 또한 다른 버퍼, 희석액, 필터, 바늘, 시린지, 및 사용을 위한 설명이 동봉된 포장 등을 포함하는 상업적 및 사용자 관점에서 목적한 다른 물질을 더 포함할 수도 있다.
발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 수성 제제를 함유한 제조물 및 사용을 위한 설명이 제공된다. 제조물은 컨테이너를 포함한다. 적합한 컨테이너는 병, 바이알(예를 들어, 듀얼 챔버 바이알), 시린지(예를 들어, 싱글 또는 듀얼 챔버 시린지), 시린지를 함유한 자기주사 펜, 및 테스트 튜브를 포함한다. 컨테이너는 유리, 플라스틱 또는 폴리카보네이트와 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 컨테이너는 수성 제제를 담고 사용을 위한 설명과 관련된 라벨로 표시한다. 라벨은 또한 제제의 용도 또는 피하 투여를 목적함을 표시할 수 있다. 제제를 담는 컨테이너는 수성 제제의 반복 투여(예를 들어, 2-6회 투여)가 가능한 수회-사용 바이알일 수도 있다. 제조물은 또한 다른 버퍼, 희석액, 필터, 바늘, 시린지, 및 사용을 위한 설명이 동봉된 포장 등을 포함하는 상업적 및 사용자 관점에서 목적한 다른 물질을 더 포함할 수도 있다.
또한 발명에 포함되는 장치는 본 발명의 제제를 전달하기 위해 사용될 수도 있다. 이와 같은 장치의 예는 시린지, 펜, 임플란트, 바늘 없는 주사 장치, 흡입 장치 및 패치를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 도면 및 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명된다. 도면 및 실시예는 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 이에 의해 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1: 단백질 안정성에 영향을 주는 요인.
도 2: 단백질을 안정화하기 위한 모범적인 방법.
도 3: 포타슘 포스페이트 내의 rhCD-RAP 단백질의 연속 농도.
도 4: 트리스 클로라이드내의 rhCD-RAP 단백질의 연속 농도.
도 5: 히스티딘 클로라이드내의 rhCD-RAP 단백질의 연속 농도.
도 6: 다른 버퍼 시스템에서 고농도의 rhCD-RAP 단백질의 안정성.
도 7: 다른 버퍼 시스템에서 고농도의 rhCD-RAP 단백질의 안정성.
도 8: 다른 pH 값에서의 글라이신 및 rhCD-RAP 단백질의 유효전하.
도 9: 150 mM 글라이신 내에서 pH가 rhCD-RAP 단백질의 안정성에 미치는 영향.
도 10: 히스티딘 포스페이트의 몰농도가 rhCD-RAP 단백질의 가용성에 미치는 영향.
도 11: 히스티딘 포스페이트가 (포타슘 클로라이드로 등장 삼투압으로 조정한) rhCD-RAP 단백질의 가용성에 미치는 영향.
도 3-11의 경우, 막대 그래프의 범례에 더해진 숫자는 그래프에서 보여주는 각 "블럭" (왼쪽에서 오른쪽으로)과 관련된다. 예를 들어, "0"은 가장 왼쪽의 막대, "1"은 "0" 다음의 막대와 관련된다.
다음의 실시예는 발명을 설명한다.
환자에게 투여량을 줄이고, 많은 투여량으로 인한 통증과 같은 부작용을 줄이는 고농도의 CD-RAP을 함유한 안정한 제제를 목적으로 한 발명자의 심사숙고에 기초하여, 다양한 제제가 CD-RAP 단백질 안정화에 미치는 영향을 시험하였다. 이들 제제의 일부를 아래의 실시예에서 보여준다. 그러나, 여기에 언급된 것으로서, 발명자의 목적에 따른 시작으로, 각 단백질은 다른 성질을 가지고 있으므로, 한 성분이 적절함을 보여주는 하나의 예로부터 그것이 적절하다고 결론지을 수 없기 때문에 목적에 맞는 제제에 적절한 성분을 실험에 의해 찾는 것이 중요하다.
실시예 1: rhCD-RAP 단백질에 대한 다양한 버퍼 시스템의 분석
rhCD-RAP 단백질은 36 버퍼 시스템 (50 mM 포타슘 클로라이드, 50 mM 히스티딘 클로라이드 또는 50 mM 트리스 클로라이드, 각 pH 6.0, 각 버퍼는 0.1% Tween 20®과 함께 또는 없이, 수크로오스, 만니톨, 글라이신, 리신 및 글루탐산으로부터 선택된 안정화제 중 하나를 더하거나 더하지 않은)으로 투석되었다. 그 다음, 투석여과에 의해 rhCD-RAP 단백질이 30 mg/mL이 되도록 농축하는 동안 샘플은 UV/Vis에 의해 분석되었다.
안정한 제제는 동결-융해 사이클에 의해 압박된다. 각 사이클 후에, 샘플은 원심분리되고 rhCD-RAP 단백질은 UV/Vis에 의해 정량된다.
투석
2.0 ml 의 rhCD-RAP 단백질 벌크소재(bulk material) (pH 7.4, 350mM 아르기닌/포스페이트 내의)를 6-8 kDa 분자량 차단(cut-off) 튜브를 사용하여 4℃에서 24 시간 동안, 적당한 교반 하에, 500mL의 버퍼로 투석하였다. 16시간 투석한 후, 버퍼를 500mL의 새 버퍼로 교환했다. 결과물인 단백질 용액을 더 분석하기 위해 2-8℃에 보관했다.
UV-VIS
투석된 rhCD-RAP 단백질을 13.000 rcf로 5분 동안 원심분리한 후, UV/Vis에 의해 샘플 내 단백질 양이 측정되었다. 상응하는 샘플 버퍼가 블랭크 제거를 위해 제공되었다. 단백질농도[mg/ml]를 계산하기 위해 280 nm에서의 흡광도 및 280 nm [1.649 mL/(mg*cm)] 에서의 rhCD-RAP 단백질의 특정 흡수율이 이용되었다.
rhCD-RAP 단백질-농도의 증가
투석된 rhCD-RAP 단백질을 2 mL 원심성 농축기로 옮겼다. 연속 원심분리 단계(4000 rcf, 4℃ )후에, rhCD-RAP 단백질 용액의 부피가 감소했다. 남아있는 rhCD-RAP 단백질 용액의 부피를 측정하고 UV/Vis에 의해 rhCD-RAP 단백질 농도를 정량했다.
열안정성 (동결/융해 사이클)
rhCD-RAP 단백질의 열안정성이 냉동 냉장고를 이용하여 5 내지 -25℃로 동결/융해 사이클을 5회 적용하여 평가되었다. 각 사이클 사이에 15분의 등온 단계를 두고 냉각 및 가열속도는 1.0℃/분이다. 분석될 때까지 단백질 용액은 4-8 ℃에서 보관된다.
30 mg/mL의 농도의 rhCD-RAP 단백질 300 ㎕ 이 1.5 mL PP 바이알로 이동되고 앞서 기술한 바와 같은 동결-융해 단계에 의해 압박되었다.
실시예 2: 다른 버퍼 시스템에서 rhCD-RAP 단백질의 안정성
실시예 1의 모든 버퍼 시스템의 안정성 효과를 측정했다.
포타슘 포스페이트 버퍼 시스템
최종 중량 1 kg, 버퍼 농도 50 mM가 되도록, 다음의 물질이 WFI에 용해되었다. KOH 및 HCl을 각각 첨가하여 pH를 6.0으로 조정했다.
a) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 6,8 g 포타슘 포스페이트, 12.4 g KCl
b) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 6.8 g 포타슘 포스페이트, 50 g 수크로오스, 4.9 g KCl
c) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 6.8 g 포타슘 포스페이트, 50 g 만니톨
d) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 6.8 g 포타슘 포스페이트, 25 g 글라이신
e) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 6.8 g 포타슘 포스페이트, 25 g 글루탐산
f) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 6.8 g 포타슘 포스페이트, 25 g 리신
g) 61.0 g 아르기닌, 인산으로 pH 7.4로 조정(대조군)
필요에 따라, 포타슘 클로라이드로 300 - 400 mOsm/kg의 등장성이 조정되었다. 각 버퍼의 삼투압(osmolality)을 표 1에 나타내었다.
포타슘 포스페이트 버퍼의 삼투압
제제 삼투압[mOsm/kg]
50 mM 포타슘 포스페이트 345
50 mM 포타슘 포스페이트 + 5% (w/v) 수크로오스 340
50 mM 포타슘 포스페이트 + 5% (w/v)만니톨 376
50 mM 포타슘 포스페이트 + 2.5% (w/v) 글라이신 371
50 mM 포타슘 포스페이트 + 2.5% (w/v) 글루탐산 354
50 mM 포타슘 포스페이트 + 2.5% (w/v) 리신 302
rhCD-RAP 단백질은 표 1에 나열된 버퍼시스템에 기초하여 포타슘 포스페이트에 대하여 투석되고 여과 장치 내 원심분리에 의해 농축되었다. 버퍼의 연속적인 감소를 확인한 후에, 유지된 단백질 용액의 부피가 측정되고 UV/Vis에 의해rhCD-RAP 단백질 농도가 정량되었다. 도 3은 10, 20 및 30 mg/mL으로 농축한 후, 5 mg/mL CD-RAP 단백질 용액의 투석 전후의 CD-RAP 단백질 농도의 결과를 보여준다. 아르기닌/포스페이트 버퍼가 대조군으로 사용되었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 아르기닌/포스페이트 버퍼 시스템 내의 제제가 모든 농도 단계에서 최적의 용해도를 나타내었다. 가장 고농도의 단계에서도, 측정된 단백질의 양은 rhCD-RAP 단백질의 이론상 가능한 양에 도달했다. 따라서, 아르기닌/포스페이트 내에서 rhCD-RAP 단백질에 대한 단백질의 손실이 없기 때문에 이 버퍼가 가장 바람직하게 용해된 용액 중의 하나이다.
아르기닌/포스페이트에 반하여, 포타슘 포스페이트 버퍼는 충분히 용해시키기 위해 추가의 보충제가 필요했다. 50 mM의 포타슘 포스페이트 (등장성에 도달하기 위해 이온성 보충제로서 포타슘 클로라이드를 포함한)는 rhCD-RAP 단백질의 10 mg/mL의 농도까지만 좋은 가용성을 나타내었기 때문에, 30 mg/mL 또는 그 이상 농도의 rhCD-RAP 단백질을 용해시키기 위해 추가의 보충제가 필요했다. 다양한 안정화제 중에서 오직 수크로오스만이 30 mg/mL에서도, rhCD-RAP 단백질의 탁월한 용해도를 이끌어내었다. 다른 것들은 다른 농도 단계에서 부분적으로 눈에 보이는 침전된 단백질의 응집효과를 나타내었다.
트리스 버퍼 시스템
용해도 증가제로서 Tween 80® 유무에 따른, 수크로오스, 만니톨, 글라이신, 글루탐산 및 리신과 같은 안정화제로 변화된 트리스 클로라이드가 최종 중량 1 kg, 버퍼 농도 50 mM가 되도록, WFI에 용해되었다. HCl을 각각 첨가하여 pH를 6.0으로 조정했다.
a) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 6.05 g 트리스 염기, 9.7 g NaCl
b) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 6.05 g 트리스 염기, 50 g 수크로오스, 3.9 g NaCl
c) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 6.05 g 트리스 염기, 50 g 만니톨
d) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 6.05 g 트리스 염기, 25 g 글라이신
e) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 6.05 g 트리스 염기, 25 g 글루탐산
f) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 6.05 g 트리스 염기, 25 g 리신
필요에 따라, 포타슘 클로라이드로 300 - 400 mOsm/kg의 등장성이 조정되었다. 각 버퍼의 삼투압(osmolality)을 표 2에 나타내었다.
트리스 버퍼의 삼투압
제제 삼투압 [mOsm/kg]
50 mM 트리스 342
50 mM 트리스 + 5% 수크로오스 344
50 mM 트리스 + 5% 만니톨 378
50 mM 트리스 + 2.5% 글라이신 370
50 mM 트리스 + 2.5% 글루탐산 350
50 mM 트리스 + 2.5% 리신 309
포타슘 포스페이트 버퍼에 대하여 위에서 기술한 바와 같이, rhCD-RAP 단백질은 30 mg/mL이 될 때까지 투석 및 농축되었다. 350 mM 아르기닌 포스페이트 버퍼가 대조군으로 사용되었다.
포타슘 포스페이트에 기초한 버퍼 제제에 비하여, 2.5% 글루탐산을 함유한 50 mM 트리스 클로라이드를 제외한 모든 트리스 클로라이드 버퍼는 5 mg/mL 이상의 CD-RAP 단백질 농도에서 낮은 용해도를 나타내었다.
히스티딘 버퍼 시스템
용해도 증가제로서 Tween 80® 유무에 따른, 수크로오스, 만니톨, 글라이신, 글루탐산 및 리신과 같은 안정화제로 변화된 히스티딘 클로라이드 (50 mM, pH 6.0)가 다른 두 버퍼 시스템에 대하여 기술한 바와 같은 방법으로, 다음에 따라 분석되었다.
최종 중량 1 kg, 버퍼 농도 50 mM가 되도록, WFI에 용해되었다. HCl을 각각 첨가하여 pH를 6.0으로 조정했다.
a) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 7.76 g L-히스티딘 클로라이드, 12.4 g KCl
b) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 7.76 g L-히스티딘 클로라이드, 50 g 수크로오스, 4.9 g KCl
c) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 7.76 g L-히스티딘 클로라이드, 50 g 만니톨
d) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 7.76 g L-히스티딘 클로라이드, 25 g 글라이신
e) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 7.76 g L-히스티딘 클로라이드, 25 g 글루탐산
f) 1.0 g의 Tween 80® 유무에 따른 7.76 g L-히스티딘 클로라이드, 25 g 리신
삼투압은 필요에 따라 조정되었다. 최종 삼투압은 표3에 나타내었다.
히스티딘 클로라이드 버퍼의 삼투압
버퍼 제제 삼투압 [mOsm/kg]
50mM 히스티딘 348
50mM 히스티딘 + 5% 수크로오스 349
50mM 히스티딘 + 5% 만니톨 371
50mM 히스티딘 + 2.5% 글라이신 375
50mM 히스티딘 + 2.5% 글루탐산 355
50mM 히스티딘 + 2.5% 리신 307
버퍼 시스템 내에서 rhCD-RAP 단백질이 투석되고 30 mg/mL ( 4.1.1 와 비교)의 농도로 농축되었다.
포타슘 포스페이트 및 트리스에 기초한 버퍼 제제와 비교하여 히스티딘 클로라이드에 기초한 버퍼는 아르기닌 포스페이트 버퍼에 더하여 rhCD-RAP 단백질의 가장 좋은 용해도를 나타내었다.
5 mg/mL의 rhCD-RAP 단백질 농도에서 응집된 50 mM 히스티딘 +/- Tween 80®을 제외하고, 모든 다른 버퍼는 6.0 및 중성 범위의 pH, 등장성 버퍼 내에서 30 mg/mL의 매우 좋은 용해도를 나타내었다. 다시 말해, 분석할 때, 버퍼 시스템 내에서 Tween 80®의 사용은 rhCD-RAP 단백질의 용해도에 영향을 미치지않았다.
결론
단백질의 농도가 30 mg/mL까지 응집되지 않은 CD-RAP 단백질의 가장 좋은 결과를 나타낸 경우는 다음과 같다: a) 5% 수크로오스를 함유한 50 mM 포타슘 포스페이트, b) 50 mM 트리스 클로라이드, 2.5% 글루탐산, c) 50 mM 히스티딘, 2.5% 글라이신, d) 50 mM 히스티딘, 2.5% 글루탐산, e) 50 mM 히스티딘, 2.5% 리신, f) 5% 만니톨을 함유한 히스티딘 및 g) 350 mM 아르기닌 포스페이트.
목적한 농도를 5 mg/mL로 떨어뜨리면 거의 모든 시험된 제제에 대하여 단백질을 안정화할 수 있는 반면에 30 mg/mL로 증가시키면 제거해야할 장애물이 생긴다.
실시예 3: 동결 융해 사이클에 의한 다른 버퍼 시스템에서 rhCD-RAP 단백질의 열안정성 평가
실시예 1은 7 가지 버퍼 제제의 rhCD-RAP 단백질을 6.0의 pH에서 30 mg/mL 농도까지 농축할 수 있는 능력에 대해 평가했다. 이들 제제는 스트레스 상황, 즉, 동결/융해 사이클에서 rhCD-RAP 단백질의 안정성이 유지되는지 시험 되었다.
rhCD-RAP 단백질은 버퍼 시스템 (a) 5% 수크로오스를 함유한 50 mM 포타슘 포스페이트, b) 50 mM 트리스 클로라이드, 2.5% 글루탐산, c) 50 mM 히스티딘, 2.5% 글라이신, d) 50 mM 히스티딘, 2.5% 글루탐산, e) 50 mM 히스티딘, 2.5% 리신, f) 5% 만니톨을 함유한 히스티딘, g) 350 mM 아르기닌 포스페이트 내에서 투석되고 그 후 여과 장치 내 원심분리에 의해 rhCD-RAP 단백질의 농도가 ~ 30 mg/mL가 되도록 농축되었다. 300 ㎕가 1.5 mL PP 바이알로 이동되었다. 제제는 5회의 동결/융해 사이클에 의해 압박되고, 응집된 rhCD-RAP 단백질은 그 후 원심분리에 의해 제거되고 UV/Vis에 의해 용해된 상태의 rhCD-RAP 단백질이 정량되었다.
rhCD-RAP 단백질은 모든 실험된 버퍼 시스템에서 성공적으로 30 mg/mL 농도 근처로 농축되었다.
도 6은 50 mM 포타슘 포스페이트/5% 수크로오스 내의 rhCD-RAP 단백질을 제외한 모든 제제에서 동결 융해 사이클의 단백질 농도에 대한 부정적 영향이 없음을 나타낸다. 오직 50 mM 포타슘 포스페이트/5% 수크로오스에서 3회 동결/융해 과정 후에 rhCD-RAP 단백질의 상당한 감소 및 일시적으로 분산제와 같이 현탁함을 볼 수 있었다. 다른 모든 제제에서, UV/Vis에 의한 rhCD-RAP 단백질 정량의 결과와 결합하여 고농도에서 rhCD-RAP 단백질의 가용성 및 안정성 문제를 해결한 모든 동결/융해 사이클 후에 용액은 맑았다.
놀랍게도 오직 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 버퍼 시스템이 동결 및 융해 사이클링 후에 rhCD-RAP 단백질의 열안정성을 야기했다.
실시예 4: 다른 아미노산의 rhCD-RAP 단백질 (30 mg/mL)에 대한 안정성 효과
실시예 2 및 3은 아미노산을 함유한 버퍼 용액 내에서 rhCD-RAP 단백질이 30 mg/mL 농도로 우수한 가용성을 나타내었기 때문에 다음의 실시예에서 이 특별한 아미노산의 효과가 실험되었다.
글라이신과 같은 중성 아미노산, 글루탐산과 같은 산성 아미노산 및 히스티딘 및 아르기닌과 같은 염기성 아미노산의 rhCD-RAP 단백질에 대한 안정화 효과가 실험되었다.
모든 벌크 용액은 어떤 염 또는 다른 부형제의 부가 없이, 6.0의 pH에서 등장성으로 만들어졌다; pH는 염산 및 인산으로 조정되었다. 추가로 350 mM 아르기닌 포스페이트는 6.0의 pH 및 7.4의 pH에서 실험되었다.
다른 버퍼에서 동결 융해 사이클에 의해 압박된 rhCD-RAP 단백질
제제 삼투압 [mOsm/kg]
300mM L-히스티딘-클로라이드 pH 6 330
300mM L-히스티딘-포스페이트 pH 6 303
350mM 아르기닌-클로라이드 pH 6 302
350 mM 아르기닌-포스페이트 pH 6 310
350 mM 아르기닌-포스페이트 pH 7.4 300
300mM 포타슘-글루타메이트 pH 6 337
150mM 글라이신 pH 6 326
rhCD-RAP 단백질은 버퍼 시스템 (표 4에 나열된)에서 투석된 후 여과 장치 내 원심분리에 의해 ~ 30 mg/ mL의 농도까지 농축된다. 300 ㎕가 1.5 mL PP 바이알로 이동된다.
표 4에 나열된 제제는 앞서 기술한 실시예에 따라 5회의 동결/융해 사이클에 의해 압박된다. 응집된 rhCD-RAP 단백질이 원심분리에 의해 제거되고 UV/Vis에 의해 남아있는 가용성의 rhCD-RAP 단백질이 정량된다.
도 7은 하나를 제외하고 시험된 모든 버퍼 시스템의 우수한 안정화 효과 및 동결/융해 사이클에서 rhCD-RAP 단백질의 가용성을 보여준다: 150mM 글라이신에 투석된 rhCD-RAP 단백질은 투석 과정 동안 양적으로 응집했다. 따라서 6.0의 pH에서 비-하전된 아미노산으로서 유일하게 분석된 글라이신은 rhCD-RAP 단백질 벌크 버퍼의 제조를 위한 아미노산의 사용에 있어서 하전된 아미노산이 중요한 기술적 재산임을 나타낸다. 그러나, 포스페이트 및 클로라이드 버퍼는 동일한 양상을 나타낸다.
실시예 5: 글라이신 내에서 rhCD-RAP 단백질의 용해도에 대한 pH의 영향
실시예 4는 6.0의 pH, 등장 글라이신 용액에서 rhCD-RAP 단백질의 낮은 용해도가 중성거동 때문임을 지적한다. 발명자들은 글라이신은 여전히 비하전 되었으나 rhCD-RAP 단백질이 pH 변화 및 CD-RAP 단백질 각각의 높은 유효전하에 의해 높은 유효전하를 포함하는 경우에 CD-RAP 단백질의 가용성이 중요함을 밝혔다.
도 8은 다른 pH 에서 pKs 값에 의한 글라이신 및 rhCD-RAP 단백질의 유효전하를 설명한다. 실험에서, rhCD-RAP 단백질은 4.0, 6.0 및 8.0의 pH에서, 150 mM 글라이신에 대하여 투석되었다. pH 값은 인산 및 소듐 하이드록사이드 각각으로 조정되었다. rhCD-RAP 단백질은 응집에 대해 강한 저항을 보이는 pH 6 및 8의 버퍼로 투석되었다. 이 용액은 뿌옇지 않은 맑은 외관을 보이는 글라이신 (pH 4)과 달리 우유와 같은 외관을 가졌다.
rhCD-RAP 단백질은 30 mg/ mL (pH 4.0)로 농축된 다음 5회 동결/융해 사이클에 의해 압박되었다. 그 후 응집된 rhCD-RAP 단백질은 원심분리에 의해 제거되고 UV/Vis에 의해b남아있는 가용성 rhCD-RAP 단백질이 정량되었다. 6.0 및 8.0의 pH에서 rhCD-RAP 단백질 용액은 농축 과정 동안 필터 차단(filter blocking)의 결과로서 낮은 농도에서 직접적으로 압박된다.
도 9는 산성 조건, 예를 들어, 4.0의 pH에서, 단백질의 유효전하의 상승에 기인한 rhCD-RAP 단백질의 자가-안정화를 보여준다. 글라이신은 4.0의 pH에서 하전되지 않지만, rhCD-RAP 단백질의 충분한 용해도를 획득하는 것이 가능했다.
6 - 8의 pH 에서, CD-RAP 단백질을 포함하는 제제는 낮은 pH, 예를 들어, 4.0의pH에서 안정화하는 부형제로서 반드시 하전된 아미노산을 포함해야 하는 반면, rhCD-RAP 단백질은 하전된 아미노산의 부가 없이 스스로 안정화할 수 있다.
실시예 6: rhCD-RAP 단백질의 안정화에 있어서 히스티딘의 영향
앞선 실험에서는 6.0의 pH와 같은 거의 중성의 pH에서 30 mg/ mL에 달하는 고농도의 rhCD-RAP 단백질 안정화를 위한 강력한 도구로서 하전된 아미노산을 설명했다. 버퍼의 범위를 확정하기 위해, 실시예 6은 가장 적합한 예로 히스티딘에 대한 CD-RAP 단백질을 위한 버퍼 요소의 농도의 의존성을 보여준다. 따라서, 아래의 표 5에 나타낸 바와 같이, rhCD-RAP 단백질은 0 mM 내지 300 mM의 히스티딘 농도에서 히스티딘 포스페이트로 투석되었다. 추가로, 이들 제제는 충분한 양의 포타슘 클로라이드의 부가로 인하여 생리학적 삼투압으로 조정되었다.
L-히스티딘 버퍼의 다른 농도, 등장성 조건을 위해 포타슘 클로라이드로 조정되기전의 삼투압
히스티딘 [mM] 포타슘 클로라이드 [mM] 삼투압 [mOsmol/kg]
0 0 2
0 150 295
50 0 67
50 116,5 298
100 0 121
100 89,5 302
200 0 215
200 42,5 302
300 0 299
rhCD-RAP 단백질은 30 mg/mL(pH 6.0)의 농도로 농축된 다음 5회 동결/융해 사이클에 의해 압박되었다. 그 후, 응집된 rhCD-RAP 단백질이 원심분리에 의해 제거되고 UV/Vis에 의해 남아있는 가용성 rhCD-RAP 단백질이 정량되었다.
도 10은 6.0의 pH, 히스티딘 포스페이트에서 rhCD-RAP 단백질의 용해도는 히스티딘의 농도에 절대적으로 의존함을 설명한다. 6.0의 pH에서 0mM의 히스티딘은 rhCD-RAP 단백질을 안정화하지 못하고, 고농도에서 히스티딘의 몰농도 증가에 따라 용해도를 상당히 증가시킨다. 반복되는 동결/융해-실험은 200 mmol/l의 농도 및 그 이상으로 L-히스티딘을 포함하는 버퍼가 30 mg/mL 농도에서 더욱 안정한 rhCD-RAP 단백질 용액을 제공함을 보여준다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 포타슘 클로라이드의 부가는 히스티딘 포스페이트 내의 rhCD-RAP 단백질의 용해도에 영향을 주지않는다. 따라서, 고농도의 rhCD-RAP 단백질의 용해도 및 안정성에 부정적 영향 없이, 포타슘 클로라이드로 약제학적 CD-RAP 단백질 제제를 등장성 삼투압으로 조정할 수 있다.
실시예 7: GDF-5-유도 ALP 활성의 억제
96-웰 플레이트에서 웰 당 30,000 세포의 밀도로 MCHT 세포를 심고 배지(10 % FCS로 완성된 글루타민 함유 알파-MEM)에서 하룻밤 동안 배양했다. 다음날, rhGDF-5 및 rhCD-RAP 단백질과 함께 각 웰의 배지를 160 ㎕ 의 특정 자극 배지로 교체함에 의해 자극이 시작되었다. 모든 표준 및 샘플은 네 개씩 만들어졌다. 표준 곡선(standard curve)을 얻기 위해, 다음의 rhGDF-5의 농도(완전 배지에서 1200　ng/ml, 400　ng/ml, 133.2　ng/ml, 44.5　ng/ml, 14.8　ng/ml rhGDF-5)로 rhGDF-5의 연속 희석이 준비되었다. rhCD-RAP 단백질-매개 ALP 활성의 억제를 분석하기 위해, 세포는 400 ng/ml 농도의 rhGDF-5 및 1 내지 10 μM 농도의 rhCD-RAP 단백질로 공-자극(co-stimulated)되었다. 세포는 2 mL Nonidet P40 내의 0.2 g MgCl2 x 6H2O를 부가하고 인큐베이터에서 16시간 배양하는 것에 의해 용해되기 전에 자극 배지 내에서 3일 동안 배양되었다. 용해물의 50 ㎕는 새로운 96-웰-플레이트로 이동되고 50 ㎕의 기질 버퍼(디에탄올아민 버퍼내의 0.222 g PNPP, Pierce)가 부가되고 37 ℃에서 45분 동안 배양되었다. 그 후 0.5 M NaOH를 부가함에 의해 반응이 종결되었다. 플레이트 판독기로 405 nm에서 흡광도가 측정되었다. 배경 ALP 활성이 비처치된 세포에서 측정되고 모든 표준 및 샘플에서 배경 ALP 활성을 뺐다. 모든 샘플에서 ALP 활성을 계산하기 위해 표준 곡선이 사용되었다.
실시예 8: 연골세포(chondrocyte)의 CD-RAP 단백질 자극 및 qRT-PCR 분석
연골세포는 무릎인공관절수술(total 무릎 replacement) 환자 유래의 인간 관절 연골로부터 분리되었다. 연골은 뼈에서 잘라 작은 조각이 되었다. 연골 조각은 37 ℃, 1시간 동안 1 % 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 내의 1% 프로나제로 소화되었다. 실온에서 5분 동안 200 x g으로 원심분리한 후, 연골 조각은 PBS로 한번 세척되었다. 37 ℃에서, 하룻밤 동안 배지 (10 % FCS 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신로 완전화된 DMEM/F12)내의 0.07 % 콜라게네아제 A(콜라겐ase A)로 소화되었다. 다음날 세포 현탁액은 100, 70 및 40 ㎛ 세포 스트레이너(cell strainers)를 통하여 연속하여 여과되었다. 세포는 배지에서 스핀다운, 재현탁되고 웰 당 250,000 세포의 밀도로 6-웰-플레이트에 심어졌다. 세포는 합일될 때까지 37 ℃, 5　% CO2 및 습도 90　% 조건에서 배양되었다(약 1 주). 배지는 격일로 교체했다.
CD-RAP 단백질로 자극하기 위하여, 세포는 무혈청배지에서 하룻밤 동안 두었다. CD-RAP (0.5 - 5 ㎛) 단백질이 무혈청 DMEM/F12에 부가되고 세포는 24시간동안 배양되었다. 그 후, 세포는 용해되고 제조업체의 설명서에 따라 RNeasy Mini Kit 로 RNA가 추출되었다. QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen)로 cDNA를 제조하기 위해 1 ㎍ RNA가 사용되었다. 표준 조건에서 4 ㎕의 희석된 cDNA (diluted 1:5) , 10 ㎕ QuantiFast SYBR Green PCR Mix (Qiagen), 4 ㎕ 뉴클레아제 비함유 물(nuclease-free water) 및 2 ㎕ 프라이머-믹스(primer-mix)로 Light cycler 50회 하여 RT-PCR이 수행되었다. 다음의 프라이머가 사용되었다: 18SrRNA (Qiagen, QuantiTect Primer Assay QT00199367, MMP13forward GGGTTCCTGATGTGGGTGAATA (SEQ ID No. 5), MMP13reverse GCCATCGTGAAGTCTGGTA (SEQ ID No. 6). 결과는 하우스키퍼 18S rRNA에 대해 정규화되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Scil Technology GmbH <120> Stable MIA/CD-RAP formulation <130> SCI13586PCT <150> EP10161160.6 <151> 2010/04/27 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Pro Met Pro Lys Leu Ala Asp Arg Lys Leu Cys Ala Asp Gln Glu 1 5 10 15 Cys Ser His Pro Ile Ser Met Ala Val Ala Leu Gln Asp Tyr Met Ala 20 25 30 Pro Asp Cys Arg Phe Leu Thr Ile His Arg Gly Gln Val Val Tyr Val 35 40 45 Phe Ser Lys Leu Lys Gly Arg Gly Arg Leu Phe Trp Gly Gly Ser Val 50 55 60 Gln Gly Asp Tyr Tyr Gly Asp Leu Ala Ala Arg Leu Gly Tyr Phe Pro 65 70 75 80 Ser Ser Ile Val Arg Glu Asp Gln Thr Leu Lys Pro Gly Lys Val Asp 85 90 95 Val Lys Thr Asp Lys Trp Asp Phe Tyr Cys Gln 100 105 <210> 2 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> generic human CD-RAP sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(23) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (25)..(36) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (38)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, wherein the number of any naturally occurring amino acid may vary from 11-13 <220> <221> misc_feature <222> (52)..(69) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, wherein the number of any naturally occurring amino acid may vary from 7-18 <220> <221> misc_feature <222> (71)..(74) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (76)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (98)..(98) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Cys Xaa <210> 3 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> generic human CD-RAP sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (21)..(23) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(38) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (40)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (44)..(52) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, wherein the number of any naturally occurring amino acid may vary from 7-9 <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (57)..(69) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, wherein the number of any naturally occurring amino acid may vary from 5-13 <220> <221> misc_feature <222> (74)..(76) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (78)..(95) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (98)..(98) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (100)..(100) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 3 Lys Xaa Cys Xaa Asp Xaa Glu Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Pro Asp Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Lys Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Tyr Phe Pro Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp 85 90 95 Phe Xaa Cys Xaa 100 <210> 4 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> generic human CD-RAP sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (21)..(23) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (29)..(33) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (37)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (44)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (56)..(67) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (72)..(93) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (96)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 4 Lys Xaa Cys Xaa Asp Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Ala Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Pro Asp Cys Arg Phe Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Gly Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Trp Xaa Gly Ser Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Gly Tyr Phe Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Phe Xaa 85 90 95 Cys Gln <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer sequence for human MMP-13 gene <400> 5 gggttcctga tgtgggtgaa ta 22 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer sequence for human MMP-13 gene <400> 6 gccatcgtga agtctggta 19 1

Claims (16)

10 mg/mL 내지 30 mg/mL의 CD-RAP 단백질 및
(ⅰ) 50 mM 트리스 클로라이드 및 2.5% (w/v) 글루타메이트;
(ⅱ) 50 mM 히스티딘 및 2.5% (w/v) 글라이신, 2.5% (w/v) 글루타메이트 (w/v) 또는 2.5% 리신 (w/v);
(ⅲ) pH 6.0의 300 mM 히스티딘 클로라이드;
(ⅳ) pH 6.0의 50, 100, 200 또는 300 mM 히스티딘 포스페이트;
(ⅴ) pH 6.0의 350 mM 아르기닌 클로라이드;
(ⅵ) pH 6.0의 350 mM 아르기닌 포스페이트;
(ⅶ) pH 7.4의 350 mM 아르기닌 포스페이트; 또는
(ⅷ) pH 6.0의 300 mM 포타슘 글루타메이트
를 포함하는 제제로서, 상기 CD-RAP 단백질이 제제 안에 직접 용해되어 있는 안정한 수성 제제.
제1항에 있어서, 상기 아미노산은 6 내지 8의 pH에서 유효전하(net charge)를 갖는 것인 수성 제제.
제1항에 있어서, 장성 조절제(tonicity modifier)를 포함하는 수성 제제.
제1항에 있어서, 안정화제(stabilizer)를 포함하는 수성 제제.
제1항에 있어서, 부형제(excipient)를 더 포함하는 수성 제제.
제1항에 있어서, 상기 제제는 6 내지 8의 pH를 갖는 것인 수성 제제.
제1항에 있어서, 동결 건조(freeze dried), 냉동건조(lyophilized) 또는 분무 건조(spray-dried)된 것인 수성 제제.
제1항에 있어서, 상기 제제의 성분은 동결-융해(freeze-thaw) 사이클이 반복되는 동안 안정성을 제공해 주는 것인 수성 제제.
제1항에 있어서, 상기 제제는 치료적 용도를 위한 것인 수성 제제.
제1항에 있어서, 상기 제제는 염증성 장애의 치료를 위한 것인 수성 제제.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 제제를 포함하는 키트.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 제제를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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