BR112012027361A2 - formulação mia/cd-rap estável. - Google Patents

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Abstract

"FORMULAÇÃO MIA/CD-RAP ESTÁVEL". - A presente invenção refere-se a formulações aquosas estáveis que compreendem pelo menos 5 mg / mL de CD-RAP e um aminoácido carregado, o aminoácido, de preferência tendo uma carga líquida a um pH entre cerca de 6 e 8. Os ingredientes da formulação de preferência proveem estabilidade durante repetidos ciclos de congelamento-descongelamento. Em um aspecto preferido, a formulação é para uso em terapia, de preferência, para uso no tratamento de distúrbios inflamatórios, preferivelmente osteoartrite. Além disso, um kit que inclui a formulação da invenção é provido.

Description

ia TEME ins uam o mona veio: 1/65 25/10/2012 15240 H6RI | : Uno ? BR 11 2012 027361 2. 2 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULA- º ÇÃO MIA/CD-RAP ESTÁVEL". ' A presente invenção refere-se a formulações aquosas estáveis que compreendem pelo menos 5 mg / mL de CD-RAP e um aminoácido car- regado, o referido aminoácido, de preferência tendo uma carga líquida a um pH entre cerca de 6 e 8. Os ingredientes da formulação de preferência pro- veem estabilidade durante repetidos ciclos de congelamento- descongelamento. Em um aspecto preferido, a formulação é para uso em terapia, de preferência, para uso no tratamento de distúrbios inflamatórios, preferivelmente osteoartrite. Além disso, um kit que inclui a formulação da à invenção é provido, * As proteínas são usadasem uma ampla gama de aplicações nas * áreas de produtos farmacêuticos, veterinários, cosméticos e outros produtos : de consumo, alimentos, rações, diagnósticos, química industrial e descon- taminação. Por vezes, estes usos têm sido límitados por restrições inerentes nas próprias proteínas ou impostas pelo ambiente ou meio em que são utili- zados. Tais restrições podem resultar em fraca estabilidade das proteínas, a variabilidade de desempenho ou custo elevado. Devido ao advento da bio- tecnologia é possível produzir uma grande variedade de proteínas para apli- cações terapêuticas. Após à sua produção, medicamentos proteicos são ge- ralmente armazenados antes de seu uso. Devido ao fato de que as proteínas são geralmente maiores e mais complexas do que os produtos farmacêuti- cos "tradicionais", formulação e processamento de fármacos de proteína que são adequados para o armazenamento podem ser particularmente difíceis. —Pararevisões de formulação farmacêutica de proteinas e projeto de proces- sos, vide Carpenter e outros (1997), Pharm. Res. 14:969-975; Wang (2000), Int. J. Pharmaceutics 203:1 -60, e Tang e Pikal (2004), Pharm. Res. 21:191-
200. Vários fatores podem ser considerados na concepção de formu- laçõese processos para a produção de proteínas farmacêuticas. De maior preocupação é a estabilidade da proteína através de um ou todos as etapas | de fabricação, transporte, e etapas de manuseamento, que podem incluir a :
D—D——M ii ss — . inõasu|-»ia"-ÔÂÔaaaaa aa ua úÚÚÓÚPA O , é“óú“C OM Pec) P . brmA oo» bbbmbiéobbiibibibiiiÉú“»e“»mmêÉÂZP“m mi 2/65 CG preparação da composição, congelamento, secagem, armazenamento, ex- * pedição, reconstituição, ciclos de congelamento / descongelamento, e arma- | . zenamento para pós-reconstituição, pelo usuário final. Outras considerações que podem incluir a facilidade e economia de fabricação, manuseamento e distribuição; composição do produto final, para administração ao doente, e a facilidade de uso, pelo usuário final, incluindo a solubilidade da formulação liofilizada após reconstituição. Formulações líquidas podem satisfazer determinados objetivos. Possíveis vantagens de formulações líquidas incluem a facilidade e econo- mia de fabricação e comodidade para o usuário final. Frequentemente, é quando armazenados por longos períodos, polipeptídeos são instáveis em sá solução (Manning e outros (1989), Pham. Res. 6: 903-918). Por conseguinte, = as etapas adicionais de processamento têm sido desenvolvidas para permitir : uma vida útil mais longa incluindo a secagem, por exemplo, liofilização. As formulações liofiizadas podem também prover certas vantagens. Benefícios potenciais da liofilização incluem a estabilidade melhorada da proteína, bem como a facilidade e economia de transporte e armazenamento. No entanto, as composições farmacêuticas liofiizadas podem ser menos convenientes para o usuário final. Além da escolha da forma básica da composição (por exemplo, liofilizada, líquida, congelada, etc.), a otimização de uma formulação de pro- teina envolve tipicamente variar os componentes da formulação e as suas respectivas concentrações, para maximizar a estabilidade da proteína, Uma variedade de fatores pode afetar a estabilidade da proteina, incluindo a força iônica, pH, temperatura, ciclos de congelamento / descongelamento, forças de cisalhamento, congelamento, secagem, agitação e reconstituição. Instabi- lidade da proteína pode ser causada pela degradação física (por exemplo, desnaturação, agregação ou precipitação) ou degradação química (por e- xemplo, desamidação, oxidação ou hidrólise). Otimização dos componentes | da formulação e concentrações é somente baseada em estudos empíricos e/ou abordagens racionais para superar as fontes de instabilidade. Por vezes, no armazenamento de longo prazo das composições
E a a o A'r"M* nAo”9n2, 012 25 %%“""oO"). 2 ôº”Óô- > PPooii:a=€% |) -sPÔÉSIAà A.-ELâA|FERb) Jr iso" ç=SÉ A o=ê!i = o-7” 2" Ui oo" 3/65 o farmacêuticas contendo os polipeptídeos, incluindo formulações aquosas e | : liofilizadas, polipeptídeos ativos podem ser perdidos devido à agregação . e/ou degradação.
Assim, as práticas típicas para melhorar a estabilidade do poli- peptídeo podem ser reguladas por variação da concentração de elementos com a formulação, ou adicionando excipientes para modificar a formulação (Patentes US Nos 5.580.856 e 6.171.586 e Pedidos de Patente US Nos US 2003/0202972, US 2003/0180287). US 5.580.856 é um protótipo de aplica- ção de agentes que podem ser adicionados para estabilizar a proteína seca durante ou depois da reidratação, tais como polímeros naturais, tensoativos, É polissacarídeos sulfatados, proteínas e tampões. No entanto, além de muitas - opções, a Patente US 5.580.856 não ensina que a estabilizador de reidrata- t ção deve ser adicionado para o qual a proteína. Assim, enquanto o bom lei- : tor é informado daquelas muitas opções, ele teria de descobrir para sua pro- teina as melhores condições entre as muitas opções descritas por US
5.580.856. O pedido de patente US 2003/0202972 descreve uma formulação liofilizada estável de um anticorpo anti-Her2, em que o estabilizador é um açúcar, trealose, ou um tampão. No entanto, enquanto estes estabilizadores podem ser úteis para um anticorpo, eles não podem ser extrapolados para outras proteínas. O pedido de patente US 2003/0180287 é semelhante ao US 2003/0202972, em que se descreve igualmente uma solução estável de uma proteina do tipo imunoglobulina, isto é, uma proteína contendo um do- mínio Fc. O estabilizador pode ser fosfato de sódio, fosfato de potássio, ci- trato de de sódio ou potássio, ácido maleico, acetato de amônio, tampão de tris, acetato, dietaolamina, histidina, lisina ou cisteína. Entre estes estabiliza- dores quimicamente distintos, que podem ser escolhidas pelo leitor especia- lista, lisina resultou ser adequada. No entanto, como com US 2003/020297?2, o estabilizador específico é apenas adequado para uma proteína específica, aqui uma proteína contendo domínios Fc, e não pode por si só ser extrapo- lado para uma outra proteina. Por conseguinte, a uso dos aditivos não po- | : dem ser extrapolados de uma proteína específica para uma outra proteina não relacionada. Na verdade, o uso de aditivos — enquanto melhorando o |
O.“ S4OSCY9———— eps a Ni Ao!WCQÉ ) = . 2“ "Oo “= ““ o íô 99 “ mt: []Õ e "-<0ettº“ o . ./”=" “6 o” -=ê. Po 0" A. N a j/ B ." 4/65 "o. armazenamento - pode ainda resultar em polipeptídeos inativos. Além disso, ? no caso da liofiização, a etapa de re-hidratação pode introduzir condições ? que resultam na inativação do polipeptídeo, por exemplo, agregação ou des- naturação (Hora e outros (1992), Pharm. Res., 9: 33-36; Liu E outros (1991), Biotechnol Bioeng, 37: 177-184). Na verdade, a agregação de polipeptídeos é indesejável uma vez que pode resultar em imunogenicidade (Cleland e outros (1993), Crit Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 10: 307-377, e Robbins e outros (1987), Diabetes, 36: 838-845). A manutenção da atividade biológica durante o desenvolvimento efabricação de produtos farmacêuticos depende da estabilidade inerente da ê macromolécula, bem como as técnicas de estabilização utilizadas. Uma va- * riedade de técnicas de estabilização de proteinas existe, incluindo a adição : de "estabilizadores" químicos à solução ou suspensão aquosa da proteína. Por exemplo, a patente norte-americana 4.297.344 descreve a estabilização de fatores de coagulação || e VIII, antitrombina II! e plasminogênio contra o calor adicionando aminoácidos selecionados. Patente norte-americana
4.783.441 descreve um método para a estabilização de proteínas, por adi- ção de substâncias tensoativos. Patente norte-americana 4.812.557 descre- ve um método para a estabilização da interleucina-2, utilizando albumina de soro humano. Métodos de congelamento / descongelamento em que a pre- paração é misturada com um crioprotetor e armazenada a temperaturas mui- to baixas, é uma outra opção para estabilizar a proteina, No entanto, nem | todas as proteinas irão sobreviver a um ciclo de congelamento / desconge- lamento. Armazenamento a frio, com aditivo crioprotetor, normalmente glice- rolémaisuma opção. Armazenamento na forma de vidro, tal como descrito na patente norte-americana 5.098.893, também pode ser feito. Neste caso, as proteínas são dissolvidas em substâncias solúveis em água ou incháveis | em água que se encontram em estado amorfo ou vítreo. O método mais am- plamente utilizado para a estabilização de proteínas é a secagem por conge- lamento ou liofilização. Sempre que a estabilidade da proteina suficiente não puder ser aicançada em solução aquosa, a liofiização provê uma alternativa viável. Uma desvantagem de liofilização é que ela requer processamento
NS sofisticado, é demorado e oneroso. Além disso, se a liofiização não é reali- ? zada com cuidado, a maioria das preparações é pelo menos parcialmente desnaturada pelas etapas de congelamento e desidratação da técnica. O resultado é frequentemente agregação irreversível de uma parte das molé- S culasde proteína, tornando a formulação inaceitável para administração pa- renteral.
Falando de forma geral, a degradação de proteínas tem sido bem descrita na literatura, mas o armazenamento e solubilidade, em particu- lar, de CD-RAP/MIA (adiante referido como CD-RAP), não foi descrito. CD- | 10 RAP é uma proteína pequena, solúvel secretada a partir de células de mela- sc noma maligno e a partir de condrócitos. Evidências recentes identificaram * CD-RAP como o protótipo de uma pequena família de proteínas extracelula- * res adotando uma duplicação tipo domínio de SH3. Pensa-se que a intera- ' ção entre o CD-RAP e os epitopos específicos em proteínas na matriz extra- celular regula a fixação das células tumorais e condrócitos (Moser e outros (2002), Mol. Cell Biol. 5:143845). Enquanto isso, proteínas relacionadas a CD-RAP são conhecidos a partir de US 2002/0103360 e WO 2004/015078. No entanto, ambas as aplicações são silenciosas sobre formulações está- veis de proteínas relacionadas a CD-RAP, até agora, uma formulação base- ada em |lipossomas de CD-RAP é conhecida a partir do WO 2008/0405586. Especificamente, uma composição farmacêutica compreendendo CD-RAP contendo grandes vesículas multilamelares após reconstituição é divulgada, por meio da qual a proteina CD-RAP é encapsulada e/ou capturada em li- possomas para a entrega de CD-RAP sustentada de tal modo que ela pode permanecer por um longo período de tempo, no local de ação desejada. Uma função de CD-RAP é que ela atua como um fator quimio- táctico sobre as células estaminais mesenquimais. Enquanto, CD-RAP não é capaz de induzir a diferenciação de células estaminais mesenquimais de murino ou humano (HMSC), ela influencia a ação da proteina morfogenética óssea(BMP)-2 e o fator de crescimento transformante (TGF)-beta 3 durante a diferenciação da célula estaminal mesenquimal, apoiando o fenótipo con- drogênico enquanto inibe diferenciação osteogênica. Além disso, o CD-RAP qi ; 5s“º”. Pmsa n92Aº29”9à " ) VA A 1 og d "sP=a€5 am “ “ ) sT»=P si . = o 0 . eº ]a s ii AÇ ) “AÊ... A*->Epa az" CM nv e SAS MXM.P* AS MOS O NOS 6/85 | t "q down-regula a expressão de genes de osteopontina e osteocalcina em cultu- º ras HMSC tratadas com BMP-2 inibindo o potencial osteogênico de BMP-2. ' No caso dos humanos, os condrócitos primários de CD-RAP estimulam a deposição de matriz extracelular, aumentando o teor de glicosaminoglicano.
Portanto, acredita-se que o CD-RAP é um regulador importante durante a | diferenciação condrogênica e manutenção da cartilagem.
Por conseguinte, acredita-se que CD-RAP seja um candidato promissor para a reparação da | cartilagem.
Por conseguinte, seria desejável ter as formulações farmacêuti- cas disponíveis compreendendo CD-RAP em uma quantidade suficiente- mente elevada, que é estável durante um período de tempo prolongado, du- 2 rante o armazenamento.
De fato, as formulações estáveis com concentra- * ções elevadas de CD-RAP permitiriam injeções de volume mais baixos aos r pacientes, o que reduz os efeitos colaterais, como a dor devido à injeção de : um volume elevado e permite naturalmente o aumento de cada dose.
Além disso, enquanto foi conhecido na técnica que um grande número de opções de agentes estabilizadores de proteinas, bem como a- gentes que permitem uma alta concentração de uma proteína sendo mantida estável estava disponível até a presente invenção, não foi reconhecido na técnica que uma formulação que compreende uma proteina CD-RAP em | concentrações elevadas poderia ser instável e, portanto, necessitando de | melhoria. | Assim, o problema técnico da presente invenção é o de satisfa- | zer as necessidades acima descritas.
A presente invenção responde a estas necessidades e provê, assim, como uma solução para o problema técnico das modalidades referen- tes a formulações, bem como métodos e usos, aplicar estas formulações no tratamento de indivíduos que sofrem destas doenças que se beneficiariam com a administração de CD-RAP.
Estas modalidades são caracterizadas e descritas aqui, ilustradas nos Exemplos, e refletidas nas reivindicações.
Deve-se notar que, como aqui utilizadas, as formas singulares "alo", e "um/uma" incluem referências plurais a menos que o contexto indi- que claramente o contrário.
Assim, por exemplo, a referência a "um anticor-
7/65 | : ES po" inclui um ou mais de tais anticorpos diferentes e a referência a "método" : inclui referência a etapas equivalentes e métodos conhecidos dos versados na técnica que podem ser modificados ou substituídos pelos métodos aqui descritos.
Todas as publicações e patentes citadas nesta divulgação são incorporadas por referência na sua totalidade. Na medida em que o material incorporado por referência contradiz ou é inconsistente com a presente es- | pecificação, a especificação irá substituir qualquer material desse tipo. Salvo indicação em contrário, o termo "pelo menos", precedendo um conjunto de elementos deve ser entendido para se referir a todos os elementos da série.
2 Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar o | : uso de não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das . * modalidades específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes des- | tinam-se a ser abrangidos pela presente invenção.
Ao longo desta especificação e das reivindicações que se se- guem, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreen- der", e variações tais como "compreende" e "compreendendo", será entendi- da como implicando na inclusão de um inteiro declarado ou etapa ou grupo de inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou etapa ou grupo de inteiro ou etapa. Quando aqui utilizado o termo "compreende" pode ser substituído pelo termo "contendo", ou, por vezes, quando aqui utili zado com o termo "tendo", Quando usado aqui "consistindo em" exclui qualquer elemento, etapa, ou ingrediente não especificado no elemento da reivindicação. Quan- do aqui utilizado, "consistindo essencialmente em" não exclui materiais ou etapas que não afetam materialmente as características básicas e novas da reivindicação. Em cada caso aqui qualquer dos termos "compreendendo", "consistindo essencialmente em" e "consistindo em" podem ser substituídos por qualquer um dos outros dois termos.
Tal como aqui utilizado, o termo conjuntivo "e/ou" entre os vários elementos recítados é entendido como englobando tanto o individual quanto as opções de combinados. Por exemplo, quando dois elementos são conju-
* gados por "e/ou", a primeira opção refere-se à aplicabilidade do primeiro e- : lemento sem o segundo.
Uma segunda opção refere-se à aplicabilidade do ] segundo elemento sem o primeiro.
Uma terceira opção refere-se à aplicabili- | dade dos primeiro e segundo elementos em conjunto.
Qualquer uma destas opçõesé compreendida como caindo dentro do significado e, portanto, satis- faz a exigência do termo "e/ou" como aqui é usado.
Aplicabilidade simultã- nea de mais do que uma das opções é também entendida como caindo den- tro do significado e, portanto, satisfaz a exigência do termo "e/ou" como aqui ! é usado. j Vários documentos são citados ao longo do texto desta especifi- | + cação.
Cada um dos documentos aqui citados (incluindo todas as patentes, | : pedidos de patentes, publicações científicas, especificações do fabricante, * instruções, etc.), quer supra ou infra, são aqui incorporados por referência na ' sua totalidade.
Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem o direito de antedatar tal divulgação em virtude da in- venção anterior. | Os inventores da presente invenção com o objetivo de prover uma formulação que tem uma elevada quantidade de CD-RAP, a fim de permitir que o menor volume seja injetado em indivíduos que dela necessita, demodo a reduzir os efeitos colaterais, como a dor devido a injeção de um volume elevado reconhecido que a proteina CD-RAP pode ser instável a concentrações elevadas e também pode ser instável durante um período prolongado de armazenamento.
Assim sendo, os inventores têm observado uma certa instabili- dade de proteinas CD-RAP durante seus estudos com o objetivo de prover uma formulação altamente concentrada, estável e, portanto, destinada a me- lhorar esta observação indesejada.
Por conseguinte, eles reivindicam um CD-RAP concentrado, mantendo-o em solução, ou seja, em uma fase dis- solvida.
Ao fazê-lo, eles têm uma grande variedade de opções e alternativas disponíveis, sem, no entanto, qualquer indicação de que qualquer uma delas | seria adequada para resolver o problema objetivo. "Fase dissolvida" significa que a proteina CD-RAP, de preferên- RES |
. cia em uma concentração de, pelo menos, 5 mg / ml! de CD-RAP, está em solução, isto é, a (dis) solvida e/ou dispersa diretamente na solução aquosa ( , isto é, na fase aquosa) da formulação.
De preferência, a proteína CD-RAP é homogeneamente (dis) solvida e/ou dispersa.
Homogeneamente significa quea quantidade de proteina CD-RAP que é (dis) solvida e/ou dispersa na formulação aquosa estável é quase uniformemente, de preferência unifor- memente distribuída na formulação aquosa, de modo que à concentração ("c") da quantidade de proteina CD-RAP ("n", no caso de massa molar ou "m", no caso de massa) é quase idêntica, de preferência, idêntica em (ou toda) volume ("v") da solução aquosa, isto é, c = nv ou c = m/v, respectiva- : mente, é quase constante, preferivelmente constante.
Preferivelmente não existe nenhum gradiente de concentração dentro da formulação. : Assim, a formulação aquosa estável da presente invenção que compreende uma proteina CD-RAP pode preferivelmente ser considerada como uma solução aquosa, em que um CD-RAP é diretamente dissolvida efou dispersa na mesma.
Mais preferencialmente, a formulação aquosa estável da presen- te invenção pode ser considerada como uma solução aquosa, pelo menos, 5 mg / ml de proteina CD-RAP e um aminoácido carregado.
Isto significa que a formulação baseia-se em uma solução aquosa, em que, pelo menos, 5 mg / mi de proteina CD-RAP é dissolvida e/ou dispersa em conjunto com, pelo menos, o aminoácido carregado.
Em alternativa, a formulação aquosa estável da presente inven- ção pode ser considerada como mais preferivelmente uma formulação está- velcom base em uma solução aquosa, a formulação compreendendo pelo menos uma concentração (peso / volume) de 5 mg / ml de proteina CD-RAP e um aminoácido carregado.
A "solução" é uma mistura homogênea de uma ou duas ou mais substâncias / componentes.
Em tal mistura, um soluto (na presente inven- ção, uma proteina CD-RAP, de preferência, pelo menos, 5 mg / ml de prote- ina CD-RAP) é dissolvida (como descrito acima), em outra substância (na presente invenção, de preferência, uma formulação aquosa), também co-
= nhecida como solvente. : Tendo em consideração o acima exposto, a proteina CD-RAP é : de preferência não heterogeneamente dissolvida e/ou dispersa na solução aquosa. O termo “estado dissolvido" também inclui que a proteína CD-RAP é, de preferência, essencialmente, não emulsionada, ou, mais preferivelmen- te, não emulsionada no todo na solução aquosa.
Além disso, o "estado dissolvido" incluí que a proteina CD-RAP é de preferência essencialmente não encapsulada e/ou capturada (de prefe- rência menos de 2%, 1%, ou 0,5% da proteína CD-RAP pode ser encapsu- lada e/ou retida), ou mais de preferência, não encapsulada e/ou retida de «: todo, por exemplo, em lipossomas, lipossomas multilamelares ou similares. ? Assim, em um aspecto preferido, a presente invenção compre- 7 ende uma solução aquosa estável essencialmente livre de lipossomas (de : preferência menos de 2%, 1%, ou 0,5% de lipossomas), de preferência livre de lipossomas, à formulação compreendendo pelo menos 5 mg / ml de pro- teina CD-RAP e um aminoácido carregado.
Em um aspecto alternativo mais preferida, a presente invenção abrange uma formulação aquosa estável compreendendo pelo menos 5 mg / | ml de proteina CD-RAP e um aminoácido carregado, em que a proteína CD- RAP é essencialmente não contida (de preferência inferior a 2, 1, ou 0,5%), de preferência, não contida (encapsulada e/ou retida) em lipossomas.
De fato, existem muitas formas de uma proteína poder ser instá- vel. Por exemplo, a instabilidade da proteina pode ser causada por agrega- ção da proteina, mas também pela instabilidade química devido à desamina- ção, oxidação, ruptura e formulação de ligação de dissulfeto, hidrólise, suc- cinimidação, reticulação sem dissulfito, desglicosilação ou "escurecimento enzimático” (reação de Maillard), ou qualquer combinação destes fenôme- nos, vide, por exemplo, Wang e outros (1999), Int. J. Pharm. 185: 129-188) e ' na Figura 1. Além disso, os parâmetros físico-químicos, tais como a tempe- ratura, valor de pH, adsorção de superfície, sais, íons metálicos, agentes quelantes, forças físicas, tais como forças de cisalhamento, desnaturantes de proteínas, solventes não aquosos, concentração de proteína, fonte e pu-
reza da proteína, morfismo ou pressão de proteína podem influenciar a esta- bilidade da proteína.
Ainda, que muitos fatores que podem influenciar a estabilidade da proteina, que muitas medidas poderiam ser tomadas para estabilizar uma proteina. Por exemplo, uma proteina pode ser interna (alterando aminoáci- dos) ou externamente estabilizada. Estabilização externa pode ser alcança- da por agentes quelantes, íons de metal, agentes redutores, polímeros, poli- etileno glicóis / polióis, albumina de soro, tensoativos, açúcares e polióis, ácidos graxos e fosfolipídeos, aminoácidos, tampões, etc., vide, por exem- plo, Wang, Y e Hanson M (1988), J. Parental Sci. & Technology, 42, Sup- plement: 4-26; Wang e outros (1999), Int. J. Pharm. 185: 129-188, e a Figura
2. Em suma, para a estabilização de uma proteína CD-RAP em uma formu- lação, o versado teria muitas opções disponíveis. No caso presente, os inventores observaram que a proteína CD- RAP mostrou agregação. Muitos fatores diferentes podem causar a agrega- ção de uma proteina de uma formulação de proteína. Procedimentos típicos de purificação e armazenamento podem expor formulações proteicas a con- dições e componentes que fazem com que a proteína se agregue. Por e- xemplo, as proteínas de uma formulação de proteina podem se agregar co- —moresultado de qualquer um ou mais dos seguintes procedimentos: a expo- sição de armazenamento a temperaturas elevadas, o pH da formulação, a força iônica da formulação, e a presença de certos agentes tensoativos (por exemplo, polissorbato 20 e polissorbato 80) e agentes emulsificantes. Simi- larmente, as proteínas podem se agregar quando expostas a tensão de cisa- —lhamento, tal como, reconstituindo um bolo liofilizado de proteína em solu- ção, por purificação por filtragem de uma amostra de proteína, gelo-degelo, agitação, ou transferindo uma solução de proteína através de uma seringa. À agregação pode também ocorrer como resultado de interações entre as mo- léculas de polipeptíideo em solução e nas interfaces líquido-ar dentro de frascos de armazenamento. Alterações conformacionais podem ocorrer em polipeptídeos adsorvidos às interfaces ar-líquido e sólido-líquido durante a compressão ou extensão das interfaces resultantes de agitação durante o
O A 12/65 A transporte.
Tal pode provocar agitação da proteína de uma formulação para agregar e precipitar, em última análise com outras proteínas adsorvidas. ' Além disso, a exposição de uma formulação de proteína à luz pode fazer com que a proteína se agregue.
A presente invenção provê, as- sim, formulações que permitem altas concentrações de CD-RAP e que redu- zem a agregação de proteínas.
Sem ser limitado pela teoria a redução da agregação de proteinas é alcançada controlando um ou mais dos mecanis- mos acima mencionados de agregação.
Isto pode resultar em, por exemplo, a estabilidade melhorada do produto e uma maior flexibilidade no processo de fabricação e das condições de armazenamento. “ Especificamente, os presentes inventores descobriram que a ç partir de muitos agentes testados, aminoácidos que transportam uma carga : ? líquida a um pH entre cerca de 6 e cerca de 8 são úteis para estabilizar a | proteina CD-RAP, a uma concentração elevada, inter alia, mediando a solu- ! bilidade da proteína e/ou inibindo a agregação de proteínas, Quando referido | aqui, um aminoácido é, de preferência concebido para ser um L-aminoácido. | Menos preferido é um D-aminoácido.
De preferência, o aminoácido é a L- histidina, L-arginina, ácido L-glutâmico ou um seu sal, de preferência o sal é Í um cloreto, fosfato, acetato ou sulfato. ! Assim, a invenção é baseada, pelo menos em parte, na desco- | berta de que as formulações que compreendem, pelo menos, 5 mg / mL de | CD-RAP e um aminoácido carregado ou um seu sal, de preferência o sal é Í um cloreto, fosfato, acetato ou sulfato, mais preferivelmente, em adição, um tampão, um dissacarídeo, um agente de volume e, opcionalmente, um ten- —soativosão tornados suficientemente estáveis para armazenamento a longo prazo elou uma ou mais formulação de ciclos de congelamento / desconge- lamento.
A presente invenção tem muitas vantagens sobre formulações tamponadas padrão.
Em um aspecto, a formulação compreende elevadas concentrações de proteina CD-RAP, por exemplo, 30 mg / mL ou mais.
Sur- preendentemente, apesar da elevada concentração de proteina, a formula- ção tem agregação mínima e pode ser armazenada através de vários méto- dos e formas, por exemplo, congelamento sem efeitos nocivos que podem NS e a A A AA o ser esperados com formulações de proteína.
Em algumas modalidades menos preferidas, as formulações da ] presente invenção não necessitam de excipientes, tais como, por exemplo, agentes tensoativos e sistemas de tampão, que são utilizados em formula- ções tradicionais para estabilizar proteínas em solução.
Além disso, as for- mulações aqui descritas são preferidas sobre as formulações padrão, porque elas têm diminuído a imunogenicidade devido à falta de agentes adicionais necessários para a estabilização da proteína.
Assim, a presente invenção é direcionada para uma formulação líquida, de preferência uma formulação líquida estável que, surpreendente- * mente, permite a armazenamento a longo prazo de polipeptídeo CD-RAP ou ? análogo biologicamente ativo do mesmo possuindo uma sequência de ami- | 7 noácidos que compartilha sequência pelo menos 63% de homologia com os : quatro esqueletos de cisteina de CD-RAP, os aminoácidos 12 a 107 de SEQ 1DNo. 1, como aqui descrito abaixo, a uma concentração de, pelo menos, 5 mg / mL, preferencialmente pelo menos 7,5 mg / mL, mais preferivelmente pelo menos 10 mg / mL, ainda mais preferivelmente pelo menos 15 mg / ml, particularmente preferido de pelo menos 20 mg / mL, mais particularmente preferido de pelo menos 25 mg / mL, ainda mais particularmente preferido de | pelomenos 30 mg/mL e um aminoácido carregado ou sal destes, de prefe- rência um cloreto, fosfato, acetato ou sulfato.
Esta formulação é útil, em par- | te, porque é mais conveniente utilizar para o paciente, como o polipeptídeo CD-RAP desta formulação é altamente concentrado, de modo a reduzir os efeitos colaterais, como a dor devido à injeção de um volume elevado.
Além disso, a aplicação da formulação a um doente, sob baixa pressão de fluido dinâmico, com injeção intra-articular aumenta condrogênese.
A formulação da presente invenção (por vezes também referida aqui como "composição de matéria" ou "composição”) pode ser de preferên- cia estar em vários estados físicos tais como líquido, congelado, liofilizado, seco por congelamento, formulações secas por pulverização e reconstituí- das, com líquido e liofilizadas sendo preferidas.
Preferencialmente, a formu- lação tem um pH de 6,0 e mais, ainda mais preferencialmente entre 5,5 e o 9,0, mais preferencialmente, a formulação tem um pH entre 6,0 e 8,0, ainda mais preferivelmente entre 6,5 e 7,6, mais preferivelmente entre 7,0 e 7,5. ' "Formulação líquida", como aqui utilizada refere-se a uma com- posição de matéria que se encontra no estado líquido, caracterizado por um movimento livre das moléculas constituintes entre si, mas sem a tendência a se separar à temperatura ambiente. As formulações líquidas incluem líquidos aquosos e não aquosos, com as formulações aquosas de preferência. Uma formulação aquosa é uma formulação em que o solvente é a água. A disso- lução de polipeptíideo CD-RAP na formulação pode ser homogênea ou hete- rogênea, com homogênea sendo preferida como descrito acima.
z O líquido não aquoso adequado pode ser empregado, desde * que proporcione estabilidade à formulação da presente invenção. De prefe- . 7 rência, o liquido não aquoso é um líquido hidrófilo. Exemplos ilustrativos de líquidos não-aquosos adequados incluem: glicerol; sulfóxido de dimetila (DMSO); polidimetilsiloxano (PMS), etileno-glicóis, tais como etileno glicol, dietileno glicol, trietileno glicol, polietileno glicol ("PEG") 200, PEG 300, e PEG 400, e propileno-glicóis, tais como o dipropileno glicol, tripropileno gli- col, polipropileno glicol ("PPG") 425 e PPG 725. "Formulação líquida aquosa / não aquosa misturada”, conforme aqui utilizado refere-se a uma formulação líquida que contém uma mistura de água e uma composição líquida adicional. Quando utilizada aqui uma "formulação" é uma mistura de subs- tâncias químicas de polipeptídeo CD-RAP (isto é, fármaco / substância ativo) e substâncias químicas adicionais e/ou aditivos necessários para um produto medicinal que está de preferência em estado líquido. A formulação da pre- sente invenção inclui uma formulação farmacêutica. Uma "formulação far- macêutica" refere-se a formulações que são de tal maneira a permitir a ativi- dade biológica dos ingredientes ativos para serem eficazes, e, portanto, po- dem ser administradas a um indivíduo para uso terapêutica como aqui des- crito. A preparação da formulação inclui o processo em que as dife- rentes substâncias químicas, incluindo o fármaco ativo, são combinadas pa-
SS CSCCSSSSSSSSSSSSS 15/65 to ra produzir um produto medicinal final tal como uma composição farmacêuti- ca.
O fármaco ativo da formulação da presente invenção é um polipeptídeo ' de CD-RAP.
O termo "polipeptídeo" pode ser aqui utilizado de forma inter- cambiável com o termo "proteína" e, como aqui utilizado, compreende um — peptídeo, um polipeptídeo, uma proteína, e uma proteína de fusão.
As prote- inas podem ser produzidas por métodos recombinantes ou sintéticos.
Em certas modalidades, a proteina CD-RAP a ser formulada, essencialmente pura e/ou essencialmente homogênea (isto é, substancial- mente livre de proteínas contaminantes, etc.). O termo proteína "essencial- mente pura" significa uma composição compreendendo pelo menos cerca de " 80%, de preferência 90% em peso da fração de proteina, de preferência pelo ? menos cerca de 95% em peso da fração de proteina, mais preferivelmente . 7 97% em peso da fração de proteina ou mais preferivelmente 98% em peso i da fração de proteína.
O termo "essencialmente homogênea" significa uma composição de proteina que compreende pelo menos cerca de 99% em pe- so da fração de proteínas, com exceção da massa de vários estabilizantes e água em solução.
O polipeptídeo de CD-RAP da formulação da presente invenção é conhecido na técnica (vide EP-B1-710248 ou EP-B1-1146897) e/ou aqui | descrito.
O polipeptideo CD-RAP (proteina sensível a ácido retinoico deriva- da de cartilagem) aplicado nas formulações da invenção é o Polipeptídeo CD-RAP, também chamado MIA (atividade inibidora de melanoma), OTOR | (proteína derivada de fibrócito, FDP, tipo MIA, MIAL) e TANGO 130, que per- | tence a uma classe de proteinas segregadas, tal como descrito em Bosse- rhoffe outros (2004), Gene Expr.
Patterns. 4: 473-479; Bosserhoff e Buettner (2003), Biomaterials 24: 3229-3234; Bosserhoff e outros (1997), Dev.
Dyn. 208: 516-525, WO 00/12762, WO 2004/015078, EP-B1 710 248, US 2002/0103360, ou EP-B1-1 146897). A proteína CD-RAP aplicada na formu- lação da presente invenção é, de preferência, uma proteína recombinante —CD-RAP humana (rh CD-RAP). É também preferido que o polipeptideo CD-RAP da formulação da presente invenção seja um polipeptídeo que compreende ou que possui a
O ————————— —" "SS pop e ee ii PA A€É!Í A] AÁÂÓÚÚU A “Fl,2.., 2 . 000 2 e : :c.: " =€. : . 2 “Ci .”P "> A? | 16/65 o sequência madura de CD-RAP (SEQ ID No. 1) e fragmentos funcionais ou : variantes da mesma, b) um polipeptídeo tendo pelo menos 63%, mais prefe- rivelmente 70%, ainda mais preferencialmente 80%, ainda mais preferenci- almente 90%, mais preferivelmente 95% de homologia de sequência de a- —minoácidos com os quatro esqueletos de cisteina de CD-RAP, os aminoáci- dos 12 a 107 de SEQ ID No. 1, ou c) um polipeptídeo possuindo qualquer uma das sequências genéricas 1 a 3 aqui definidas (SEQ ID Nos 2, 3 e 4). Uma variante de CD-RAP é a proteína que possui a SEQ ID NO: 4 ou uma forma madura da mesma, tal como descrito no documento WO 2004/015078 oua proteína que possui a SEQ ID NO.14 ou uma forma madura da mesma, é conforme descrito em US 2002/01033860. , "Percentagem (%) de homologia de sequência de aminoácidos" . * em relação a sequências CD-RAP identificadas no presente documento de- fine-se como a percentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de CD-RAP, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para atingir a máxima percentagem de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da per- centagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser conseguido de várias formas que estão dentro da perícia na técnica, por exemplo, utili- zando programas de computador disponíveis publicamente tais como os programas BLAST, ALIGN ou software Megalign (DNASTAR). Os versados na técnica podem determinar os parâmetros adequados para medir o ali- —nhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conseguir o ali- nhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências a ser comparadas. Fragmentos funcionais com a mesma função biológica, como CD-RAP têm de preferência um comprimento de pelo menos 20, em particu- lar, pelo menos 40 e mais preferivelmente pelo menos 50, mais preferenci- almente 80 aminoácidos contíguos da sequência mostrada em SEQ ID No.
1. De preferência, os fragmentos funcionais compreendem os aminoácidos E SS A o o *., da posição 1 a 50, 1 a 70, 1 a 80, 20 a 80, 20 a 107 da SEQ ID No 1. Sequência CD-RAP madura (SEQ ID No.1): ' GPMPKLADRKLCADQECSHPISMAVALQDYMAPDCRFLTIHRGQVVYVFS | KLKGRGRLFWGGSVQGDYYGDLAARLGYFPSSIVREDOTLKPGKVDVKTD |
KWDFYCQ Sequência Genérica 1 (SEQ ID No. 2): CX4CX17 CXI12VX 11-13 WX7-18FX4 VX21 CX Sequência Genérica 2 (SEQ ID No. 3) ! KXCXDXEC X11 D X3 PDC X12 VX2 KL X7-9 WXGSX5-13GYFPX3 |
VXIBDFXCX á Sequência Genérica 3 (SEQ ID No 4): , KXCXDX2CXBAXZDXSX5PDCRFGXVXSKLX7WXGSV | 2 X12GYFPX22DFXCQ | | em que "X" em cada ocorrência, independentemente representa qualquer aminoácido e o número em minúsculo indica o número de qualquer aminoá- cido. De preferência, "X", independentemente, representa um aminoácido de ocorrência natural e, em particular, A, R N, D,C, Q, E, GH L LK, M,F,P, S, T, W, Y ou V "X" pode também representar um aminoácido não padrão l tais como a lantionina, ácido 2-aminoisobutírico, desidroalanina, ornitina, citrtuliha, beta alanina ou norleucina. Naturalmente, modificações pós- traducionais vulgarmente conhecidas na técnica são também previstas. As- sim, um polipeptideo CD-RAP da presente invenção pode ser modificado | após a tradução. A proteína CD-RAP aplicada na formulação da presente inven- Í l 25 ção pode ser expressa a partir de DNA ou cDNA genômico intato ou trunca- | do ou a partir de DNAs sintéticos em células hospedeiras procarióticas ou | eucarióticas. As proteinas podem ser isoladas a partir dos meios de cultura ou de corpos de inclusão e/ou reduplicadas para formar composições ativas | biológicas. Vide, por exemplo, EP-B1i 710 248 e Lougheed e outros (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 98: 5515-5520 para protocolos exemplares para purificação de proteínas recombinantes de CD-RAP. A descrição detalhada de como testar a atividade (por exemplo, condrogênese) de tais proteinas | ii AA ÂIiirr rr"""""""9º"o . " ” $i | ' 18/65 o isoladas é descrita em Tscheudschilsuren e outros (2005), Exp.
Cell Res. 1- : 10; ou Stoll e outros (2003), Protein Sci. 12: 510-519). Um bioensaio para a ' indução de cartilagem é descrito no exemplo 2 a 5, em EP-B1-1 146 897. Bioensaios suplementares são descritos infra e no Exemplo 7 e 8. Os métodos de engenharia genética de células para a produção de polipeptídeos são bem conhecidos na técnica.
Vide, por exemplo, Ausub- el e outros, Eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York). Tais métodos incluem a introdução de ácidos nucleicos que codificam e permitem a expressão do polipeptídeo em células hospedeiras vivas.
Estas células hospedeiras podem ser células bacterianas, células de fungos, ou, z de preferência, células animais em cultura.
As células hospedeiras bacteria- ? nas incluem, mas não estão limitadas a, células de Escherichia coli.
Exem- : ? plos de cepas de E. coli adequadas incluem: HB101, DH5a, GM2929, JM109, KW251, NM538, NMS5389 e qualquer cepa de E. coli que não consiga clivaro DNA estrangeiro.
As células hospedeiras de fungos que podem ser utilizadas incluem, mas não estão limitadas a, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, e células de Aspergillus.
Alguns exemplos de linhagens de células de origem animal que podem ser utilizados são CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, e WIS8. Novas linhagens de células de origem animal podem ser estabelecidas utilizando métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica (por exemplo, por transformação, infecção viral, e/ou seleção). Opcionalmente, o polipeptídeo pode ser secretado pelas célu- las hospedeiras para o meio.
As técnicas para a purificação de polipeptídeo, tais como fracio- | 25 namentoem uma coluna de permuta iônica, precipitação com etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SE- PHAROSET, cromatografia sobre uma resina aniônica ou de permuta de cátions (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS- PAGE, e precipitação com sulfato de amônio pode ser utilizado, dependendo da necessidade.
A proteina CD-RAP aplicada na formulação da presente : invenção pode ser expressa e purificada como descrito nos exemplos da EP- : B1-1 697 523.
A 5“ £A— PA É.” “º “AO... rr 5 AA aPj]l|ó F-rÓrIii]a-ninm AA -NAAANAA A | 19/65 oa Em algumas modalidades, a concentração de uma proteína CD- : RAP em uma formulação da presente invenção é de pelo menos 5 mg / mL, ' preferencialmente pelo menos 7,5 mg / mL, mais preferencialmente pelo menos 10 mg / mL, ainda mais preferencialmente menos pelo menos 15 mg ml, particularmente preferido de pelo menos 20 mg / mL, mais particular- mente preferido de pelo menos 25 mg / mL, ainda mais particularmente pre- ferido de pelo menos 30 mg / mL.
Em algumas modalidades, a concentração de polipeptídeo CD- RAP em uma formulação da presente invenção é escolhida entre os seguin- tes intervalos: de cerca de Smg/mL de cerca de 10 mg / mL, a partir de cerca à de 10 mg / mL a cerca de 20 mg / mL, a partir de cerca de 15 mg / mL a cer- | * ca de 25 mg / mL, a partir de cerca de 20 mg / mL a cerca de 30 mg / mL, ou é ? desde cerca de 5mg/mL de cerca de 30 mg / mL. ' Em um aspecto preferido, a formulação de CD-RAP, em particu- lar, a formulação aquosa estável da presente invenção não inclui lipossomas e/ou material de matriz, Preferencialmente, a formulação de CD-RAP da in- venção não compreende lipossomas e/ou material! de matriz selecionado do grupo do ácido hialurônico, alginato, colagênio, heparina, fibrina, fibrinigeno, ' osso desmineralizado, poliláctico-coglicolideo e/ou derivados de poliláctico- —coglideo ou suas combinações.
Mais preferencialmente, a formulação de CD-RAP não contém uma bicamada lipídica.
Em um aspecto preferido adicional a proteina CD-RAP não é compreendida, a uma concentração de 14 mg / mL, incluindo, 1,0 mg / mL, 1,5 mg / mL, 2,0 mg / mL, 2,5 mg / mL, 3,0 mg / mL, 3,5 mg / mL, 4,0 mg / mlLem uma arginina/H;PO,, de preferência a uma concentração de 350-420 mM, Mais preferivelmente, a proteína CD-RAP não é compreendida, a uma concentração de 1,15 mg / ml. ou 3 mg / mL em 350 mM de um ou 420 mM pH 7,5 arginina/H3PO,. Quando utilizado aqui, o termo "cerca de" é entendido para signi- ficar que pode haver variação na concentração de uma proteina CD-RAP da formulação descrita, que pode ser de 5%, 10%, 15%, ou até, e incluindo 20% do valor determinado.
Por exemplo, se uma formulação tem cerca de 5
So mg / mL de polipeptídeo CD-RAP, isto é entendido para significar que uma i formulação pode ter entre 3 a 7 mg / mL, mais preferivelmente entre 4 e 6 Í mg / mL. Assim, como usado no presente documento, um intervalo de con- centração que é definido como "X para Y" equipara com um intervalo que é — definido como "entre X e Y". Ambos os intervalos de tempo incluem especifi- camente o limite superior, e também o limite inferior. Isto significa que, por exemplo, um intervalo de "mg/ml e 10 mg / mL" ou entre "5 mg / ml a 10 mg / mL" inclui uma concentração de 5, 6, 7, 8, 9 e/ou 10 mg / mL. Uma formulação "estável" é uma em que a proteína nela man- têm essencialmente a sua estabilidade física e/ou estabilidade química e/ou | ã atividade biológica após armazenamento e/ou substancialmente mostra » quaisquer sinais de agregação, precipitação e/ou desnaturação da compara- : ? ção com uma amostra de controle, de preferência, após exame visual da cor l | e/ou a clareza, ou conforme medido por dispersão de luz UV ou por croma- tografia de exclusão de tamanho. Várias outras técnicas analíticas para me- dição da estabilidade de proteinas estão disponíveis na técnica e são revis- | tas em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery | Rev. 10: 29-90 (1993), por exemplo. De preferência, o termo "estável", em relação à formulação da presente invenção, é entendido para significar que o polipeptideo CD-RAP da formulação não perde mais do que 15%, ou mais preferencialmente 10%, ou mesmo mais preferencialmente 5 %, e mais preferencialmente de 3% da sua atividade biológica durante o armazenamento em relação à atividade do polipeptideo de CD-RAP no início do armazenamento e/ou durante ou após congelamento-descongelamento. Atividade biológica de CD-RAP pode, por exemplo, ser determinada pelo bioensaio para a indução de cartilagem é descrito no exemplo 2 a 5, em EP-B1-1 146 897. Outros bioensaios são o ensaio de invasão descrito em Stoll e outros, (2006), Biol. Chem., Vol. 387, pp1601-1606,ouno Exemplo?7e8ê8.
"Durante o armazenamento", tal como aqui utilizado, significa uma formulação que, uma vez preparada, não é imediatamente utilizada, em | | |
: : vez disso, após a sua preparação, é embalada para armazenamento, ou em uma forma líquida, no estado congelado, ou em uma forma seca para poste- Í rior reconstituição em uma forma líquida ou de outra forma. "Repetidos ciclos de congelamento-descongelamento" inclui que aformulação da presente invenção é submetida a um ou mais ciclos de con- gelamento e descongelamento, por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco ou mais ciclos de congelamento-descongelamento.
No entanto, como é aqui descrito e mostrado nos exemplos, a formulação da presente invenção man- | tém-se estável sob repetidos ciclos de descongelamento livre.
Assim, o poli- | 10 peptídeo de CD-RAP é de preferência estável sob repetida (um, dois, três, | é de preferência quatro, cinco ou mais) ciclos de congelamento e desconge- : : lamento, de preferência, o ciclo de congelamento-descongelamento é a se- ! : 2 . guinte: 5 ºC a -25 “C, arrefecimento e de aquecimento de 1,0 “C / min com | um etapa isotérmico de 15 minutos entre cada ciclo.
Sem estar limitado pela ' teoria, o ciclo de congelamento-descongelamento, que é de preferência apli- | cado no contexto da invenção simula o stress do frio que pode ocorrer du- rante o congelamento de grandes quantidades de proteína dissolvida.
Por | conseguinte, uma vez que a formulação da presente invenção revelou-se capaz de manter CD-RAP estável em solução durante o ciclo de congela- mento-descongelamento, a formulação da invenção é superior e tem propri- edades vantajosas.
Os agregados podem ser formados durante o armazenamento, por exemplo, devido à exposição a temperaturas elevadas.
Por "temperatura elevada" significa qualquer temperatura acima da temperatura à qual a for- —mulação da presente invenção que compreende um polipeptideo de CD- RAP é normalmente armazenada.
A temperatura de armazenamento normal situa-se entre cerca de 4 ºC e 10 ºC, de preferência entre cerca de 4 ºCe8 ºC, mais preferivelmente entre cerca de 4 ºC e 6 ºC, ainda mais preferivel- mente à uma temperatura de cerca de 4 ºC.
Outras causas para a formação de agregados pode ser o pH da formulação, a força iônica da formulação, a presença de certos agentes tensoativos (por exemplo, polissorbato 20 e po- lissorbato 80), agentes emulsionantes e/ou por causa de um polipeptídeo | [ÇÇÕISSSS SSSSNÕSS SS ES SS SS SS O OS as a A AAA A A A A
7 que tem uma tendência inerente para formar tais agregados. Sem estar limi- tado pela teoria, supõe-se que a formação de agregados de Polipeptídeos : CD-RAP pode ser causada por uma ou mais das causas acima menciona- das e pode levar a uma perda de atividade.
Em consequência, é previsto que um polipeptídeo CD-RAP é de preferência estável, na medida em que ele não substancialmente forme a- gregados (por exemplo, devido a uma ou mais das causas acima mencíiona- das), durante o armazenamento e/ou durante ou após congelamento- | descongelamento . Deste modo, é de preferência previsto que não mais do que 10% de um Polipeptideo CD-RAP, mais preferencialmente não superior a 8%, ainda mais preferivelmente, não mais do que 5%, ainda mais prefe- rencialmente não mais do que 3%, especialmente de preferência não mais ' do que 1% em relação à quantidade do polipeptideo de CD-RAP, no início de agregados formas de armazenamento. Em alternativa, prevê-se que um polipeptídeo CD-RAP é de pre- ferência estável, na medida em que não se formam dímeros ou oligêômeros. Dito de outra forma, a estabilidade de uma proteína CD-RAP pode ser de- terminada de acordo com a percentagem de monômero de proteína na solu- ção, com uma baixa percentagem de degradação (por exemplo, fragmenta- do) e/ou proteína agregada. Por exemplo, uma formulação da invenção compreendendo uma proteína CD-RAP pode incluir pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 92%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, ainda mesmo mais preferencialmente pelo menos 97%, particularmen- te de preferência pelo menos 98%, mais preferivelmente 99% de monômero daproteina CD-RAP, Por "agregado" significa uma interação física entre as moléculas de proteína que resulta na formação de dimeros covalentes ou não covalen- tes ou oligômeros (ou seja, entidades de alto peso molecular), que podem permanecer solúveis, ou formam agregados insolúveis que precipitam a par- tirda solução. Um "agregado" também inclui proteina CD RAP degradada e/ou fragmentada. O nível de agregação de proteinas na formulação pode ser medido antes, substancialmente durante o mesmo tempo que, ou após,
: õ a adição de um aminoácido carregado, como aqui descrito para a formula- | ção. Em certas modalidades, o nível de agregação é medido pelo menos ' uma vez entre cerca de 1 dia e cerca de 12 semanas após a adição de um aminoácido carregado, como aqui descrito para a formulação. Em outras modalidades, o nívelde agregação é medido pelo menos uma vez entre cer- ca de 1 mês e 36 meses após a adição de um aminoácido carregado, como | aqui descrito para a formulação. | Tal como aqui mencionado acima, um número de diferentes mé- todos de análise pode ser utilizado para detectar a presença e os níveis de | agregados em uma formulação que compreende uma proteína. Estes inclu- | + em, mas não estão limitados a, por exemplo, eletroforese em gel nativo de | ? poliacrilamida (PAGE), eletroforese em gel de dodecilsulfato de poliacrilami- ! | : * da (SDS-PAGE), eletroforese em gel capilar (CGE), cromatografia de exclu- | | são de tamanho (SEC), ultracentrifugação analítica (AUC), fracionamento do | 15 fluxodecampo(FFF), detecção de dispersão de luz, velocidade de sedimen- ! tação, espectroscopia de UV, calorimietria exploratória diferencial, turbidime- ! tria, nefelometria, microscopia, cromatografia de exclusão de tamanho, cro- matografia líquida de alta performance (SEC-HPLC), cromatografia liquida de fase reversa de alta cromatografia (RP-HPLC), espectrometria de massa de ionização por eletropulverização (ESI-MS), e RP-HPLC/ESI-MS em tan- dem técnica de fracionamento de fluxo de campo de fluxo e dispersão dinâ- mica de luz estática e/ou dinâmica. Estes métodos podem ser usados quer sozinhos, quer em combinação. De preferência, os métodos de análise para detectar a presença e os níveis de agregados em uma formulação compre- —endendo uma proteina, de preferência de CD-RAP, são de cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia líquida de alta performance (SEC- HPLO) e técnica de fracionamento de fluxo de campo estático e/ou disper- são dinâmica de luz.
Um problema comum com uma formulação que compreende uma proteina é o acúmulo de agregados irreversíveis com o tempo, o stress térmico, ou cisalhamento. Tipicamente, quando agregados se precipitam eles formam as partículas grandes que são fáceis de detectar. Agregados
". : z solúveis menores, não covalentes, no entanto, que muitas vezes são precur- | sores para precipitar as partículas grandes, são mais difíceis de detectar e | ' quantificar.
Assim, os métodos para detectar e quantificar a agregação de | proteinas em uma formulação de proteína precisam de ser baseados no tipo | 5 de agregado a ser avaliado.
Entre os métodos acima, os métodos sugeridos para determinar a presença e/ou a quantidade de agregados solúveis, covalentes em uma formulação de proteína são: SEC / dispersão de luz, SDS-PAGE, CGE, RP- HPLC/ESIH-MS, FFF e AUC: Os métodos sugeridos para determinar a pre- sença e/ou quantidade de agregados solúveis, não covalentes em uma for- + mulação de proteína são: SEC, PAGE, SDS-PAGE, CGE, FFF, AUC, e dis- É - i persão de luz dinâmica.
Os métodos propostos para determinar a presença | ê e/ou a quantidade de agregados insolúveis em água, não covalentes em i uma formulação de proteina são; espectroscopia de UV, turbidimetria, nefe- lometria, microscopia, AUC, e dispersão de luz dinâmica.
Tendo em conta o acima exposto, é outra modalidade da pre- sente invenção prover um método para o teste de estabilidade acelerada da estabilidade de um polipeptideo CD-RAP em uma formulação da invenção compreendendo as etapas de testar a atividade do polipeptídeo de acordo coma formulação da invenção, antes de armazenamento, ou seja, o tempo zero, o armazenamento da composição em cerca de entre 37 “*C e 42 ºC, de preferência a cerca de 37 ºC durante pelo menos um mês, e medindo a es- tabilidade do polipeptídeo, e comparando a estabilidade do tempo zero com o ponto de tempo de um mês.
Esta informação é útil para a eliminação inicial das bateladas ou lotes que parecem ter uma boa estabilidade, inicialmente, no entanto, não tão bem conservados por períodos mais longos.
Além disso, a formulação da invenção preferivelmente provê ar- mazenamento melhorado a longo prazo de modo que a proteina CD-RAP é estável ao longo do curso de armazenamento quer no estado líquido ou “30 congelado, de preferência na forma líquida, Tal como aqui utilizada, a frase armazenamento "a longo termo", é entendido para significar que a formula- ção pode ser armazenada durante pelo menos um mês, dois ou três meses j so * ou mais, seis meses ou mais, e de preferência por um ano ou mais. Arma- zenamento a longo prazo é também entendido que a composição farmacêu- | ' tica é armazenada como um líquido a 2 a 8 ºC ou é congelado, por exemplo, à temperatura de -20 ºC ou menos, desse modo a formulação de preferência | 5 não perde a sua atividade biológica, na medida em como aqui descrita e/ou que não formam agregados, na medida tal como aqui descrito e/ou compre- | ende monômeros na medida conforme aqui descrito. Testes para estas pro- | priedades são descritos aqui em algum lugar. Deve também ser contempla- | do e demonstrado nos exemplos que a formulação pode ser congelada e ' 10 descongelada mais do que uma vez. a Em um aspecto da invenção, a proteina CD-RAP nas formula- * ções é estável na forma líquida durante pelo menos 1 mês, 2 meses, 3 me- : =? ses, pelo menos 4 meses, pelo menos, 5 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 12 meses. Intervalos intermediários aos períodos de tempo acima citados também se destinam a ser parte da presente invenção, por exemplo, 9 meses, e assim por diante. Além disso, os intervalos de valores, utilizando uma combinação de qualquer um dos valores acima citados como limites superiores e/ou inferiores destinam-se a ser incluídos. De preferência, a for- mulação é estável à temperatura ambiente (cerca de 20 “C) ou a 30 “ºC du- | 20 rante pelo menos 1 mês e/ou estável a cerca de 2-8 ºC durante pelo menos 1,2,3,4,5,6 ,7,8, 9, 10, 11 ou 12 meses, ou mais, de preferência estável | a cerca de 2-8 ºC durante pelo menos 2 anos. Além disso, a formulação é preferivelmente estável seguinte a congelamento (a, por exemplo, -80 ºC) e | descongelamento da formulação, aqui também referido como um "ciclo de congelamento /descongelamento”", De forma inesperada, os inventores da presente invenção visan- do a estabilizar a proteina CD-RAP com uma concentração elevada, desco- briram que um aminoácido que tem uma carga líquida a um pH entre cerca de 6 e 8, permite a preparação de formulações CD-RAP e atua para reduzir a agregação de polipeptideos CD-RAP em tal formulação durante longos períodos, permitindo assim uma formulação estável, como aqui descrito.
Assim, em um aspecto preferido, o aminoácido carregado com-
posto pela formulação estável da presente invenção tem uma carga líquida a um pH entre cerca de 6 e 8.
O termo "carga líquida" significa que as cargas posítivas e nega- tivas na superfície do aminoácido ou proteina, que dependem da natureza do aminoácido ou os aminoácidos da proteína não é zero. A carga líquida depende do número e identidades dos aminoácidos carregados, e em pH, bem como sobre a posição do aminoácido dentro da sequência primária de um polipeptídeo. A um pH específico, as cargas positivas e negativas serão equilibradas e a carga líquida será zero. Este pH é chamado de ponto isoelé- trico onde a proteina tem a sua menor solubilidade. x Mais preferencialmente, o aminoácido ou aminoácido carregado é selecionado a partir do grupo que consiste em glicina, arginina, lisina, his- tidina, ácido aspártico, ácido glutâmico e seus sais. Glutamato, histidina, ar- ginina ou um seu sal é particularmente preferido. Em algumas modalidades, as combinações de aminoácidos acima mencionados ou os seus sais, são aplicadas na formulação da presente invenção.
Em outras modalidades, o aminoácido é um análogo de arginina, lisina ou histidina, que retém a capacidade de aumentar a solubilidade de CD-RAP de preferência a um pH de 6,0 ou superior. Tais análogos incluem, sem limitação, dipeptídeos e tripeptídeos contendo arginina, lisina ou histidi- na.
Em outras modalidades preferidas, o sal de aminoácido é o clo- reto de arginina (de preferência, em uma solução de pH entre 6,0 a 8,0, mais preferencialmente entre pH 6,5 e 7,5, mais preferivelmente a um pH de 6,0 ou7A), fosfato de arginina (de preferência, em uma solução entre pH 6,0 a * 8,0, mais preferivelmente entre PH 6,5 e 7,5, mais preferivelmente à um pH de 6,0 ou 7,4), fosfato de histidina (de preferência em uma solução de pH entre 6,0 a 8,0, mais preferencialmente entre pH 6,5 e 7,5, mais preferivel- mente a um pH de 6,0 ou 7,4 ), cloreto de histidina (de preferência em uma solução de pH entre 6,0-8,0, mais preferencialmente entre pH 6,5 e 7,5, mais preferivelmente a um pH de 6,0 ou 7,4), glutamato de potássio e de sódio (de preferência, em uma solução de pH entre 6,0 a 8,0, mais preferencial-
: : mente entre pH 6,5 e 7,5, mais preferencialmente a pH 6,0 ou pH 7,4). Os aminoácidos e sais dos mesmos aplicados na invenção são bem conhecidos " na técnica e são fabricados por métodos conhecidos e disponíveis de forne- cedores comerciais.
A concentração do aminoácido carregado, ou seu sal de qual- quer aminoácido especificado tal como a glicina, arginina, lisina, histidina, | ácido aspártico, ácido glutâmico e os seus sais, em que a formulação é pre- ferencialmente entre cerca de 0,5% (p/v) a cerca de 8% (pív), 1% (p/v) até cerca de 8% (p/v), 1% (p/v) até cerca de 5% (p/v), 1,5% (p/v ) a cerca de 5% (py), 2. % (P/v) até cerca de 5% (p/v), 0,5% (p/v) até cerca de 3% (p/v), a mais preferencialmente de cerca de 1,0% (p/v) até cerca de 3% (p/v), mais ? preferencialmente ainda cerca de 1,5% (p/v) até cerca de 3% (p/v), ainda - É mais preferencialmente de 2,0% (p/v) até cerca de 3% (p/v), e especialmente de preferência de cerca de 2,5 % (p/v). Os aminoácidos carregados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais.
A formulação da invenção é preparada através da combinação de, em adição a um polipeptídeo CD-RAP tal como aqui descrito, um amino- ácido que tem uma carga líquida a um pH entre cerca de 6 e 8, por exemplo, em uma solução aquosa.
Além disso, um tampão, um modificador de tonicidade e/ou um estabilizador e, opcionalmente, um excipiente adicional pode ser adicionado como necessário. As pessoas que têm conhecimentos comuns da matéria compreenderão que a combinação de vários componentes a ser incluídos na formulação pode ser feita em qualquer ordem apropriada. Por exemplo, o tampão pode ser adicionado em primeiro lugar, no meio ou por último e o modificador de tonicidade pode também ser adicionado primeiro, no meio ou por último. Deve também ser entendido por um versado comum na técnica que alguns destes produtos químicos podem ser incompativeis em certas combinações, e, consequentemente, podem ser facilmente substituídos com diferentes produtos químicos que têm propriedades similares, mas são com- patíveis na mistura relevante.
Em uma modalidade preferida da invenção, o composto de ami-
: > noácidos na formulação da presente invenção, bem como qualquer um dos outros ingredientes, tais como um tampão, modificador de tonicidade, estabi- : lizador, excipiente, que pode ser composto na formulação é escolhido de tal forma para proporcionar estabilidade à proteina CD-RAP sobre repetidos ciclos de congelamento / descongelamento (de preferência mais de 5 de ci- clos congelamento / descongelamento (5 ºC a -25 ºC, taxa de arrefecimento e de aquecimento de 1,0 ºC / min com uma etapa isotérmica de 15 minutos entre cada ciclo). Em um aspecto preferido da invenção, a formulação compreen- de um tampão.
O "tampão", tal como aqui utilizado, inclui aqueles agentes à que mantêm o pH em um intervalo desejado.
Tampão é uma solução aquosa $ constituída por uma mistura de um ácido fraco e a sua base conjugada ou . t uma base fraca e o seu ácido conjugado.
Ele tem a propriedade de que o pH da solução muda muito pouco, quando uma pequena quantidade de um áci- do forte ou uma base forte é adicionado.
Soluções de tampão são usadas como um meio de manter o pH a um valor quase constante em uma ampla variedade de aplicações químicas.
Soluções de tampão são utilizadas para manter um determinado nível na escala de pH.
Em geral, um tampão, quan- do aplicado na formulação da invenção, de preferência estabiliza uma prote- ínaCD-RAP. , "Tampões" de aminoácidos, quando utilizados na presente in- venção incluem, por exemplo, a base de aminoácido, por exemplo, arginina e o seu sal de conjugado.
Exemplos de tampões de aminoácidos são argini- na / arginina, cloreto de arginina / arginina fosfato de cloreto de histidina / histidina, histidina / histidina fosfato / ácido glutâmico / glutamato de sódio ou de potássio.
Estes exemplos são de preferência aplicados na presente in- venção.
O pH preferido de uma formulação como descrito aqui pode ser escolhido entre os seguintes intervalos: de cerca de 4 a cerca de 10, a partir decercade5a cerca de 9, de preferência, de cerca de 6 a cerca de 8. Con- sequentemente, um tampão que pode manter uma solução a um pH de 6,0 a 8,0 é de preferência usado.
O termo "cerca de", quando utilizado no contexto
: , do valor de pH / intervalo de preferência, um valor numérico com um interva- lo de + / - 25% em torno do valor referido. Quando o pH da composição far- ' macêutica é definido em ou perto de níveis fisiológicos, o conforto do pacien- te quando da administração é maximizado.
Em geral, a natureza de um tampão e/ou o aminoácido e a sua concentração é tal que a osmolalidade da formulação é entre 280-320 mos- mol / kg. Em particular, é preferível que o pH esteja dentro de um intervalo de pH cerca de 5,8 a 8,4, com cerca de 6,2 a 7,4 sendo preferido, mais pre- | ferivelmente o pH é entre pH 5,8 a 8,4, mais preferivelmente entre 6,2 a 7,4, no entanto, deve ser compreendido que o pH pode ser ajustado conforme 5 necessário para maximizar a estabilidade e solubilidade do polipeptídeo em : uma formulação particular e, como tal, um pH fora dos intervalos fisiológicos, : $ de preferência ainda tolerável para o paciente, está dentro do âmbito da in- venção.
Exemplos não limitativos de tampões que podem ser utilizados em uma formulação descrita na presente invenção incluem, histidina, succi- nato, gluconato, citrato, tris (trometamo!), Bis-Tris, MOPS, ACES, TES, HE- PES, EPPS, etilenodiamina, fosfórico ácido, ácido maleico / fosfato, citrato, ácido 2-morfolinoetanossulfônico (MES), fosfato de sódio, acetato de sódio e dietanolamina.
Tampões preferidos são os tampões de fosfato, tampões de Tris, tampões de aminoácidos, tais como, mas não limitados a arginina, histidina e tampão de glutamato. Mais preferencialmente, os tampões que se seguem são aplicados na formulação da presente invenção: Fosfato de arginina (de preferência entre pH 6,0 e 8,0, mais preferivelmente entre pH 6,5 e 7,5, mais preferivelmente a um pH de 6,0 ou 7,4), fosfato de histidina (de preferência entre pH 6,0 a 8,0, mais preferivelmente entre pH 6,5 e 7,5, mais preferivel mente a um pH de 6,0 ou 7,4), cloreto de histidina (de preferência entre pH 6,0 e 8,0, mais preferivelmente entre pl 6,5 e 7,5, mais preferivelmente a umpHde6,00ou?74) Os tampões utilizados na presente invenção são bem conhecidos na técnica e são fabricados por métodos conhecidos e disponí- veis a partir de fornecedores comerciais.
: ! : r A concentração de um aminoácido, um seu sal, glicina, arginina, | lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico e os seus sais, um tampão, ' tal como, mas não limitado a tampão de Tris, tampão de histidina, tampão de fosfato de arginina e tampão de fosfato nas composições da presente inven- ção podem ser escolhidos de entre os seguintes intervalos: de cerca de 1 a cerca de 500 mM, de cerca de 1 a cerca de 450 mM, de cerca de 1 a cerca de 400 mM, de cerca de 1 a cerca de 350 mM, de cerca de 1 a cerca de 300 MM, de cerca de 1 a cerca de 250 mM, de cerca de 1 a cerca de 200 mM, de cerca de 1 a cerca de 150 mM, de cerca de 1 a cerca de 100 mM, de cerca de1acercade 50 mM, desde cerca de 1 até cerca 40 mM, a partir de cerca ” de 1 a cerca de 30 mM, desde cerca de 1 a cerca de 20 mM, desde cerca de : 1 a cerca de 10 mM, desde cerca de 10 a cerca de 500 mM, 10 mM a cerca . Í de 450, 10 a cerca de 400 mM, cerca de 10 a 350 mM, 10 mM a cerca de 300, 10 a cerca de 250 mM, 10 mM a cerca de 200, 10 a cerca de 150 mM, de cerca de 30 a cerca de 500 mM, 30 mM a cerca de 450, 30 a cerca de 400 mM, cerca de 30 a 350 mM, 30 mM a cerca de 300, 30 a cerca de 250 MM, de 30 a cerca de 200 mM, ou cerca de 30 a 150 mM.
Para um tampão de Tris a concentração mais preferida é de 30 a 100 mM, para um tampão de histidina a concentração preferida é de 45 a 60 mM ou250a350 mm, mais preferencialmente 50 mM a 300 MM, para um tampão de fosfato a concentração preferida é de 45 a 60 mM, para um tam- pão de arginina a concentração preferida é de 250 a 380 mm e de um tam- pão de glutamato a concentração preferida é de 250 a 360 mm, mais preferi- velmente 280 a 360 mM.
Em um aspecto preferido da invenção, a formulação compreen- de um modificador de tonicidade. Como usado aqui, o "modificador da toni- cidade" é entendido para significar um composto ou compostos que podem ser utilizados para ajustar a tonicidade de uma formulação líquida. Modifica- dores de tonicidade adequados incluem glicerina, lactose, manitol, dextrose, — cloreto de sódio, sulfato de magnésio, cloreto de magnésio, cloreto de po- tássio, sulfato de sódio, sorbitol, trealose, sacarose, rafinose, maltose e ou- tros conhecidos daqueles versados na técnica ou comuns na prática. Em
: * uma modalidade, a tonicidade da formulação líquida se aproxima da tonici- | dade do sangue ou plasma. Um modificador de tonicidade contribui para a ' ' osmolaridade da composição. A osmolalidade de soro humano é de cerca de 250-350 mOsm / kg. Para manter a estabilidade da proteina e a minimizar o — desconforto do paciente, é geralmente preferível que a formulação seja, iso- tônica, isto é com a osmolalidade aproximadamente igual, com soro ou fluido sinovial humano. Deste modo, a osmolalidade da composição é, de prefe- rência 180 a 420 mOsm / kg, mais preferencialmente 280 a 320 mOsm / kg.
Dentro desta faixa está a pressão osmótica mais desejada, isto é, a isotoni- cidade O termo "isotônica" significa que a formulação de interesse tem es- = sencialmente a mesma pressão osmótica que o sangue humano. As formu- - lações isotônicas terão geralmente uma pressão osmótica de cerca de 270 a . : 328 mOsm. Pressão osmótica ligeiramente hipotônica é 250 a 269 e pressão osmótica ligeiramente hipertônica é 328 a 350 mOsm. A pressão osmótica pode ser medida, por exemplo, utilizando uma pressão de vapor ou osmô- metro do tipo gelo congelado.
No entanto, um versado na técnica compreenderá que a osmola- lidade da composição pode ser maior ou menor do que as condições especí- ficas requerem. Uma grande variedade de modificadores de tonicidade é conhecida na técnica (vide, por exemplo, parágrafo [0047] do Pedido de Pa- tente US 2003/0180287). Outros componentes da formulação, incluindo, mas não se limitando a, sais (por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de po- tássio e citrato de sódio), tampões dissacarídeos (por exemplo, glicose, sa- carose e manitol), agentes de volume, e tensoativos, podem igualmente con- tribuir para a osmolaridade da composição. A concentração do modificador de tonicidade na formulação é de preferência entre cerca de 1 mM até 1000 mm, mais preferivelmente cerca de 10 mM a cerca de 200 mM. Um modifi- cador de tonicidade preferido aplicado na formulação da presente invenção é o cloreto de potássio ou cloreto de sódio, de preferência a uma concentração inferior a 150 mM, inferior a 100 mM, inferior a 80 mM, inferior a 50 MM, a uma concentração de 10 a 50 mM, 40 a 90 mM, 40 a 120 mM, 50 a 120 mM, 50 a 150 mM, 80 a 150 mM, 80 a 120 mM, de 40 a 45 mM, de 80 a 90 mM,
- : - 100 a 150 mM, 100-120 mM, 42,5 mM, 89,5 mM, 116,5 mM ou 150 mM.
Em algumas modalidades, a formulação compreende adicional- Ú mente cloreto de sódio (NaCl). Em modalidades particulares, a formulação compreende 1 a 200 mM, ou inferior a 50 mM, inferior a 40 mM, inferior a 35 mM, inferior a30 mM, inferior a 25 mM, inferior a 20 MM, inferior a 15 mM, inferior a 10 MM, ou inferior a 5 mM de NaCl.
Sob certas condições, NaCl! pode causar uma dificuldade durante a liofilização ou levar ao aparecimento de opalescência na liofilizado reconstituído.
Por conseguinte, em uma moda- lidade menos preferida, a formulação não contém NaCl.
Além da proteína CD-RAP, uma formulação tal como aqui des- a crita pode também conter outras substâncias.
Estas substâncias incluem, * mas não estão limitadas a, agentes estabilizantes (estabilizadores). - ? Assim, em um aspecto preferido, a formulação compreende um estabilizador.
O termo "agente de estabilização” refere-se a um agente que melhora ou aumenta a estabilidade da formulação, em particular, da proteína CD-RAP.
Um agente estabilizante pode ser um dissacarídeo, um álcool! de açúcar, um quelante de metal ou uma combinação de agentes quelantes de metal, um captador de radícais ou suas combinações.
De preferência, o dissacarídeo, quando utilizado como agente estabilizante pode ser um açúcar não redutor, como por exemplo, sacarose, trealose ou manose.
Em certas modalidades, a concentração de dissacari- deo na composição é escolhida a partir dos seguintes intervalos: de 0,5 a 5%, de 0,5 a 4%, de 0,5 a 3%, de 0,5 a 2,5%, de 0,5 a 2%, de 0,5 a 1,5%, de 0,5 a 1%, de 1 a 1,5%, de 1,5 a 2%, de 2 a 2,5%, de 2,5 a 3%, 3-4%, 4-5%, oumaisdo que 5% (p/v). Em concretizações particulares, a concentração de dissacarideo na composição é de cerca de 0,5 a 5%, por exemplo cerca de 0,5 a 2,0% (pív). Um estabilizador preferido aplicado na formulação da pre- sente invenção é a sacarose, de preferência a 5,0% ou manitol, de preferên- cia a 5,0% (p/v). O agente de estabilização pode também ser um álcool de açúcar tais como glicerol, glicol, o eritritol, o treitol, arabitol, xilitol, ribitol, manitol, sorbitol, dulcitol, iditol, isomaite, matltitol, lactitol ou poliglicitol.
: 33/65 Um outro estabilizador pode ser um agente quelante de metal ou uma combinação de agentes quelantes de metal.
Em modalidades específi- cas, os agentes quelantes de metal são DTPA, EGTA e DEF.
Em algumas modalidades, a concentração de DTPA ou EGTA na formulação de proteinas édecercade1uM até cerca de 10 MM, desde cerca de 1 uM até cerca de 5 MM, a partir de cerca de 10 yM a cerca de 10 mM, 50 pM a cerca de 5 mM, ou a partir de cerca de 75 UM a cerca de 2,5 mM.
Em algumas modalidades, “ —a concentração de DEF na formulação de proteínas é de cerca de 1 uM até cerca de 10 mM, desde cerca de 1 uM até cerca de 5 mM, a partir de cerca de10uMacercade 1 mM, ou desde cerca de 20 yM até cerca de 250 uM.
O estabilizador também pode ser um eliminador de radicais |li- vres, especialmente um eliminador de radicais de oxigênio.
Em modalidades específicas, o captador de radicais livres é o manitol ou a histidina.
Em al- gumas modalidades, a concentração de manitol na formulação de proteinas é de cerca de 0,01% a cerca de 5%, a partir de cerca de 0,1% a cerca de 5%, a partir de cerca de 0,5% a cerca de 5%, ou de cerca de 1% a cerca de 5%. Em outras modalidades, o agente que reduz a agregação da proteína da formulação é uma combinação de um quelante de metal e de um sequestrante de radical livre.
Em algumas modalidades, o agente que reduz a agregação de uma proteína ou proteinas, em uma formulação é o citrato.
Em certas modalidades, a concentração de citrato na formulação de proteí- nas é de cerca de 0,5 mM a cerca de 50 mM, desde cerca de 0,5 mM a cer- ca de 25 mM, desde cerca de 1 MM à cerca de 35 mM, desde cerca de 5 mMacercade25mM, ou de cerca de 5 mM a cerca de 10 mM.
Em uma modalidade preferida, a formulação aqui descrita com- preende um excipiente.
Preferivelmente, o excipiente é selecionado a partir i do grupo consistindo em um crioprotetor, um lioprotetor, um tensoativo, um agente espessante, um antioxidante, e suas combinações.
Excipientes, também referidos como os aditivos químicos, cos- solutos ou cossolventes, de preferência, que estabilizam o polipeptídeo RAP- CD enquanto em solução (também em formas secas ou congeladas)
também podem ser adicionados a uma formulação da presente invenção. De preferência, os excipientes contribuem para a estabilidade da proteína CD- RAP, mas deve ser entendido que os excipientes podem contribuir de outra forma para a indústria química, física e propriedades biológicas da formula- ção. Excipientes são bem conhecidos na técnica e são fabricados por co- nhecido métodos e disponíveis a partir de fornecedores comerciais.
Exemplos de excipientes incluem, mas não se limitam a açúca- res / polióis, tais como: sacarose, lactose, glicerol, xilitol, sorbitol, manitol, glicose, maitose, inositol, trealose,, polímeros, tais como: soro de albumina (albumina de soro bovino (BSA), SA humano ou HA recombinante), dextra- no, PVA, hidroxipropil metilcelulose (HPMC), polietilenoímina, gelatina, poli- . vinilpirrolidona (PVP), hidroxietilcelulose (HEC), hidroxietilamido (HES), sol- S ventes não aquosos, tais como: os álcoois polifuncionais, (por exemplo, PEG, etileno glicol e glicerol), dimetilsulfóxido (DMSO) e dimetilformamida (DMF); aminoácidos, tais como: prolina, L-serina de sódio, ácido glutâmico, alanina, glicina, hidrocloreto de lisina, sarcosina e ácido gama-aminobutírico, tensoativos, tais como : Tween-80, Tween-20, SDS, polissorbato, copolimero de polioxietileno, e excipientes variados tais como: fosfato de potássio, ace- tato de sódio, sulfato de amônio, sulfato de magnésio, sulfato de sódio, N- óxido de trimetilamina, betaína, íons de metal (por exemplo, zinco, cobre, cálcio, manganês, e magnésio), CHAPS, monolaurato, 2-O-beta- mannoglicerato ou qualquer combinação dos anteriores. Em certas modali- dades, a concentração de agente tensoativo na formulação é de 0,001 a 5,0%, de 0,001 a 2,5%, de 0,001 a 1%, de 0,001 a 0,5%, de 0,001 a 0,2%, - de 0,001 a 0,1%, de 0,001 a 0,05%, de 0,001 a 0,01%, ou de 0,001 a 0,005% em peso.
"Crioprotetores" incluem substâncias que dão estabilidade à pro- teina congelada durante produção, congelamento, armazenamento, manu- seamento, distribuição, reconstituição ou uso. Em um aspecto particular, “crioprotetores" incluem substâncias que protegem a proteína dos estresses induzido pelo processo de congelamento. Crioprotetores podem ter efeitos lioprotetor. Exemplos não limitantes de crioprotetores incluem açúcares, tais ue Spos“t “NPºununo "Pi: =SSAK)U22"""".€|!LÔIA . “X372 2" !:/ =!;“%”ê”iÂmdmm 7 20" A ubs)Évjc ââA 0” iu | O" . " -“ é. /LÉÓêÔUÉÔ»)Ss ô ' IS. o) Pos. É! o oeoPoS :ÉúôÔ)s > aa a 36/65 dade é otimizada para um dissacarídeo: razão de massa de proteína de cer- ca de 5:1. Em outras modalidades, o dissacarideo com relação à quantidade de proteína é de 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, 600:1, 700:1, 800:1, 900:1, 1000:1 ou superior a 1000:1.
Em uma modalidade, um lioprotetor é adicionado a uma formu- i lação aqui descrita. O termo "lioprotetor" como aqui usado, inclui os agentes que proporcionam estabilidade à proteína durante o processo de secagem por congelamento ou desidratação (ciclos de secagem por congelamento primários e secundários), através do fornecimento de uma matriz vítrea a- morfae ligando-se com a proteina através de ligação de hidrogênio, substi- tuindo as moléculas de água, que são removidas durante o processo de se- cagem. Isto ajuda a manter a conformação da proteína, minimizar a degra- dação da proteína, durante o ciclo de liofilização, e melhorar a estabilidade do produto a longo prazo. O lioprotetor é adicionado à formulação de pré- liofilizada em uma "quantidade de lioproteção" o que significa que, após a liofiização da proteina CD-RAP, na presença da quantidade lioproteção do lioprotetor, a proteina mantém essencialmente a sua estabilidade física e química e integridade após a liofilização e armazenamento.
Exemplos não limitativos de lioprotetores incluem açúcares, tais como sacarose ou trealose, um aminoácido, tais como o glutamato monos- sódico, glicina ou histidina; uma metilamina, tais como a betaína, um sal lio- trópico, tal como sulfato de magnésio, um poliol, tais como tri-hidricos ou álcoois de açúcar mais elevados, por exemplo, arabitol, xilitol, sorbitol e ma- nitol; polietilenoglico!; plurônicos, e suas combinações. A quantidade de lio- protetor adicionada a uma formulação é geralmente uma quantidade que não conduz a uma quantidade inaceitável de degradação / agregação da proteina quando a proteína está formulação liofilizada. Sempre que o liopro- tetor for um açúcar (tal como sacarose ou trealose) e a proteina for um anti- corpo, exemplos não limitativos de concentrações de lioprotetor na formula- ção da proteina são de cerca de 10 mM a cerca de 400 mM, e de preferên- cia de cerca de 30 mM a cerca de 300 mM, e mais preferencialmente desde cerca de 50 mM a cerca de 100 mM. Em certas modalidades, um tensoativo o 37/65 o - pode ser incluído na formulação. i : | Um outro excipiente preferido é um agente tensoativo. O termo CU "tensoativos" geralmente inclui os agentes que protegem a proteína CD-RAP de ar / estresse induzido por interface de solução / estresse induzido por su- perfície. Por exemplo, agentes tensoativos podem proteger a proteína de agregação. Exemplos de agentes tensoativos incluem, sem limitação, tenso- ativos não iônicos, tais como polissorbatos (por exemplo, polissorbato 80 ou polissorbato 20), poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188); Triton, dode- cilsulfato de sódio (SDS), suífato de sódio de louro; octil glicosídeo de sódio; | a lauril-sulfobetaína, — miristil-sulfobetaína, — linoleil-sulfobetaína, — estearil- | F sulfobetaína, lauril-sarcosina, miristil-sarcosina, linoleil-sarcosina, estearil- | 7 sarcosina, linoleil-betaína, betaína, miristil-betaína, cetil-betaína, lauroami- ' dopropil betaína, cocoamidopropil-betaína, linoleamidopropil- betaína, miris- tamidopropil- betaína, palmidopropil- betaína, isostearamidopropil- betaína (por exemplo, lauroamidopropila), miristarnidopropila, palmidopropila, ou i- sostearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil de sódio , -ou metil ofeil-taurato de sódio; e a série Monaquat (Mona Industries, Inc., Paterson, NJ.), polietil glicol, polipropil glicol, e copolímeros de etileno e propiteno glicol (por exem- plo, Pluronics, PF68). A quantidade de tensoativo adicionada é tal que ela mantém a agregação da proteína reconstítuída a um nível aceitável tal como ensaiado utilizando, por exemplo, SEC-HPLC para determinar a percenta- gem de espécies de alto peso molecular (HMW) ou espécies de baixo peso molecular (LMW), e minimizar a formação de partículas, após reconstituição deumliofiizado de uma formulação de proteína aqui descrita, Por exemplo, o tensoativo pode estar presente em uma formulação (líquida, ou antes da reconstituição de um liofilizado) em uma quantidade de cerca de 0,001 a cerca de 0,5%, por exemplo, desde cerca de 0,05 a cerca de 0,3%. Um ten- soativo preferido aplicado na formulação da invenção é o polissorbato 20 ou
80. Um excipiente adicional preferido pode, através de um agente de volume. Ou seja, em um aspecto da presente invenção, contempla-se que a
SO SS A
O — e W W |"... m. — , o a”oA A )p). ..s= .. 2 38/65 * formulação da invenção é preparada em uma formulação de volume e, como , | tal, os componentes da composição farmacêutica são ajustados de modo a CG que seja mais elevado do que seria necessário para a administração e ade- quadamente diluídos antes da administração.
O termo "agente de volume" tal como é aqui usado, inclui os a- gentes que proveem a estrutura do produto liofilizado sem interagir direta- mente com o produto farmacêutico.
Além de prover um bolo farmaceutica- mente elegante, agentes de volume também podem conferir qualidades úteis no que diz respeito à alteração da temperatura de colapso, provendo prote- ção de congelamento-descongelamento, e aumentando a estabilidade da & proteina durante armazenamento a longo prazo.
Exemplos não limitativos de : agentes de volume incluem manitol, glicina, lactose e sacarose.
Agentes de é ? volume podem ser cristalinos (tais como glicina, manitol ou cloreto de sódio) ou amorfos (tais como dextrano, amido de hidroxietila) e são geralmente uti- lizados em formulações de proteinas em uma quantidade compreendida en- tre 0,5% e 10%. De preferência, o agente de volume aplicado na formulação da presente invenção promove a formação de um bolo que é esteticamente a- ceitável, uniforme, ou mecanicamente forte.
Agentes de volume, de prefe- —rênciatambém promovem a formação de uma estrutura de poros abertos e a facilidade e velocidade de reconstituição.
Agentes de volume, de preferência também reduzem ou previnem o colapso do bolo, fusão eutética, ou a reten- ção de umidade residual.
Em outro aspecto, agentes de volume, de prefe- rência ajudam a proteger a proteína CD-RAP contra tensões (por exemplo, astensões físicas e químicas) e ajudam a manter a atividade da proteina.
Em certas modalidades, a concentração do agente de volume da composição é escolhida a partir dos seguintes intervalos: de 1a 10%, 1a 8%, 1 a 5%, 2 a 8%, 2 a 6 %, de 2,5 a 68%, de 0,5 a 1%, de 1 a 1,5%, de 1,5 a 2%, de 2 a 2,5%, de 2,5 a 3%, de 3 a 3,5%, 3,5 a 4 %, de 4 a 4,5%, de 4,5 a5S5%, maisdo que 5%, de 0,5 a 5%, de 0,5 a 4%, de 0,5 a 3%, de 05a | 2,5%, de 0,5 a 2%, a partir de 0,5 a 1,5%, ou de 0,5 a 1%. Em certas moda- lidades, a concentração de agente espessante na composição é de 0,5 a ss———————m—-—-—-—-—-—---—-—-n.—-.-. -==—n————m—m—m—É2-m
' 5%, por exemplo, 0,5 a 3%, ainda mais precisamente, 1,8 a 2%. Um outro excipiente preferido pode ser um antioxidante. Como : aqui utilizado, um "antioxidante" é uma molécula capaz de retardar ou pre- venir a oxidação de outras moléculas. A oxidação é uma reação química que transfere elétrons de uma substância para um agente oxidante. Para uso nos métodos da presente invenção, os antioxidantes fisiologicamente aceitáveis são de interesse. Tais antioxidantes incluem, sem limitação, agentes reduto- res, ácido ascórbico (vitamina C), ácido lipoico, melatonina, ácido úrico, ca- rotenos, retinóis, tocoferóis e os tocotrienóis, por exemplo a-tocoferol (vita- mina£E),aubiquinona (coenzima OQ), e similares.
Em algumas modalidades, a formulação pode conter opcional- mente um conservante. Um "conservante" é um composto que pode ser adi- cionado às formulações neste documento para reduzir a atividade bacteria- na. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (dose-múltipla). Exemplos de conservantes poten- ciais incluem cloreto de octadecildimetilbenzilamônio, cloreto de hexametô- . nio, cloreto de benzalcônio (uma mistura de cloretos de alquilbenzildimetila- mônio em que os grupos alquila são compostos de cadeia longa), e cloreto de benzetônio. Outros tipos de conservantes incluem álcoois aromáticos, tais como fenol, álcool benzílico e butílico, aquil parabenos tais como metila ou propilparabeno, catecol, resorcinol, cicloexanol, 3-pentanol, e m-cresol. O conservante aqui mais preferido é o álcool benzílico.
Os exemplos anexos (vide Exemplos 3 e 4) demonstram (vide também a Figura 6, 7, 10 e 11) que os ciclos de congelamento e desconge- lamento das formulações testadas (exceto para CD-RAP em 50 mM de fos- fato de potássio / 5% de sacarose e 150 mM de glicina pH 6,0) não tiveram nenhum efeito sobre a estabilidade da proteína. No último caso, uma diminu- ição significativa na concentração de CD-RAP após o terceiro ciclo de con- gelamento / descongelamento pode ser vista. No entanto, em todas as ou- tras formulações a solução estava limpida após cada ciclo de congelamento. Em combinação com os resultados de quantificação de rhCD-RAP por UV / Vis isto resolve o problema da presente invenção, e os resultados em condi-
mm | | | | 40/85 ê ções adequadas para rhCD-RAP em concentrações elevadas. i Por conseguinte, em modalidades mais preferidas uma formula- ' ção da presente invenção é um líquido, de preferência aquoso, formulação que compreende, pelo menos, 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 mg / mL de CD-RAP e umtampão selecionado a partir do grupo consistindo em fosfato de sódio ou de potássio, TRIS, histidina, tampão de arginina e glutamato e um aminoáci- do selecionado a partir do grupo consistindo em aspartato, glutamato (prefe- rencialmente glutamato de fosfato), a arginina (de preferência fosfato de ar- ginina ou cloreto de arginina), histidina (de preferência cloreto de histidina ou fosfato de histidina), lisina e glicina. & O glutamato, aspartato, arginina, histidina, lisina e glicina são, . preferivelmente, presentes na formulação em uma quantidade de 2,5% (p/v). : ? De preferência, o tampão e o aminoácido são escolhidos de modo que eles proveem estabilidade à proteína CD-RAP em 5 ciclos de congelamento / descongelamento (5 ºC a -25 ºC, taxa de arrefecimento e aquecimento de 1,0 ºC / min com uma etapa isotérmica de 15 min entre cada ciclo). Assim, em particular, modalidades preferidas de uma formulação da presente invenção é um líquido, de preferência aquoso, formulação que compreende, pelo menos, 30 mg / mL de CD-RAP e 50 mM de cloreto de TRISe2,5% de glutamato; 50 mM de histidina e 2,5% (pív) de glicina, 2,5% (p/v), glutamato (p/v) ou 2,5% de lisina (p/v), 300 mM de cloreto de histidina pH 6,0, 50, 100, 200 ou 300 mM de fosfato de histidina pH 6,0, 350 mM de cloreto de arginina pH 6,0, 350 mM de fosfato de arginina pH 6,0, 350 mM de fosfato de arginina, pH 7,4, ou 300 mM de glutamato de potássio, pH 6,0. Essas formulações podem compreender, opcionalmente, um estabilizador, modificador de tonicidade e/ou um excipiente tal como aqui descrito.
Deve ser entendido que certos componentes da composição po- dem ser trocados com as alternativas conhecidas na técnica.
No entanto, um versado na técnica compreenderá também que a inclusão de determinados componentes irá impedir o uso de outros componentes, concentrações, ou métodos de preparação da formulação, por razões que incluem, mas não estão limitadas a, produtos químicos, tonicidade pH, compatibilidade, e esta- ' | |
A A oi Í Úº“ºÚÔÊi 22. ss ».W N RZzÔ o O€OÊ 41/65 à bilidade Tal como mencionado neste documento, este pedido refere-se ' geralmente à descoberta de que a adição de um aminoácido carregado de uma formulação pode reduzir a agregação de proteina CD-RAP em concen- trações elevadas em uma formulação. Independente do que faz com que uma proteína CD-RAP a uma concentração elevada de uma formulação se agregue, a adição de um aminoácido carregado, ou uma combinação dos ' aminoácidos carregados como aqui descrito reduz a agregação da proteína | CD-RAP na formulação. Em certas modalidades, a adição de um aminoácido carregado reduz a agregação em uma formulação causada, por exemplo, " pela exposição de armazenamento, a exposição a temperaturas elevadas, 3 exposição à luz, tensão de cisalhamento, presença de agentes tensoativos, : | pH e condições iônicas, bem como quaisquer combinações dos mesmos. Esta medida encontrada pelos presentes inventores podem ser utilizadas para diminuir a agregação de proteínas CD-RAP formuladas, em especial na forma líquida. A agregação é reduzida, assim, de preferência, observada em uma formulação líquida. Assume-se que uma redução da a- gregação também pode ser observada quando armazenada diretamente na forma líquida para uso mais tarde, armazenada no estado congelado e des- | congelado antes de seu uso, ou preparada de uma forma seca, tal como um liofilizado, seco ao ar, forma seca por pulverização, para reconstituição pos- terior em forma líquida ou qualquer outra forma antes do uso. | Assim, prevê-se que a formulação aqui descrita pode ser arma- | zenada por qualquer método conhecido para um versado na técnica. Exem- | plosnãolimitativos incluem o congelamento, liofilização, secagem por pulve- rização e formulação. Em alguns casos, as formulações proteicas são congeladas para armazenamento. Por conseguinte, é desejável que a formulação seja relati- vamente estável em condições tais, incluindo ciclos de congelamento- —descongelamento. Um método para determinar a adequação de uma formu- lação é sujeitar uma amostra de formulação de pelo menos dois, por exem- plo, de três a dez ciclos de congelamento e de descongelamento (por exem-
EA
E OSSSS 42/65 & Í . plo, por descongelamento rápido à temperatura ambiente ou em gelo degelo lento), a determinação da quantidade de espécies de baixo peso molecular : (LMW) e/ou espécies de alto peso molecular (HMW) que se acumulam após os ciclos de congelamento-descongelamento e comparando-as com a quan- tidade de espécies de LMW ou espécies HMW presentes na amostra antes do procedimento de congelamento-descongelamento.
Um aumento nas es- pécies LMW ou HMW indica estabilidade diminuída de uma proteina arma- | zenada como parte da formulação.
Cromatografia líquida de exclusão de ' tamanho de elevado desempenho (SEC-HPLC) pode ser usada para deter- | minara presença de espécies de LMW e HMW. 2 Em alguns casos, as formulações de proteína podem ser arma- ' zenadas como um líquido.
Deste modo, tal como aqui descrito, é desejável : : que a formulação líquida seja estável sob essas condições, incluindo as vá- rias temperaturas.
Por exemplo, um método para determinar a adequação de uma formulação é o de armazenar à formulação de amostra a várias temperaturas (como 2-8, 15, 20, 25, 30, 35, 40, e 50 ºC) e o controle da quantidade de espécies HMW e/ou LMW que se acumulam ao longo do tempo.
Quanto menor for a quantidade de espécies HMW e/ou LMW que se acumulam ao longo do tempo, melhor é a condição de armazenamento para aformulação.
Além disso, o perfil de carga da proteína pode ser monitoriza- do por cromatografia líquida de permuta catiônica de alta performance (CEX- HPLC). Alternativamente, as formulações podem ser armazenadas depois da liofilização. | O termo "liofilizado" ou "seco por congelamento" inclui um esta- dode uma substância que foi submetida a um procedimento de secagem tal como liofilização, onde pelo menos 90%, de preferência 95%, mais preferi- velmente 98% de umidade foi removida.
Por conseguinte, a "liofilização”, tal como aqui utilizada, refere-se a um processo pelo qual o material a ser seco é primeiro congelado, seguido por remoção do solvente de gelo ou congela- do por sublimação em ambiente de vácuo.
Um excipiente (por exemplo, lio- protetor) pode ser incluído em formulações que são para ser liofilizadas, de modo a melhorar a estabilidade do produto liofiizado durante o armazena-
3 mento. A "formulação reconstituída", tal como aqui utilizado, refere-se a uma formulação que foi preparada através da dissolução de uma formulação de ' proteina liofiizada em um diluente tal que a proteina é dispersa no diluente. O termo "diluente" tal como aqui utilizado, é uma substância que é farmaceuticamente aceitável (segura e não tóxica para a administração à um ser humano), e é útil para a preparação de uma formulação líquida, tal como uma formulação reconstituída após liofilização. Exemplos não limitati- vos de diluentes incluem água estéril, água bacteriostática para injeção (BWF]I), uma solução de pH tamponado (por exemplo, tampão de fosfato | 10 salino), solução salina estéril, solução de Ringer, solução de dextrose, ou . soluções aquosas de sais e/ou tampões. Í Testar uma formulação para a estabilidade do componente de + ? proteína da formulação após a liofilização é útil para determinar a adequação de uma formulação. O método é semelhante ao descrito acima para o con- gelamento, anão ser que a formulação de amostra seja liofilizada em vez de congelada, reconstituída com um diluente, e a formulação reconstituída seja testada para a presença de espécies de espécies de LMW e/ou HMW. Um aumento de espécies LMW ou HMW na amostra liofiizada em comparação com uma formulação correspondente amostra que não foi liofilizada indica diminuição da estabilidade na amostra liofilizada.
Em alguns casos, a formulação é seca por pulverização e, em seguida, armazenada. Para a secagem por pulverização, uma formulação em aerossol líquido é, na presença de um fluxo de gás, seca. A água é re- movida das gotas de formulação para o fluxo de gás, o que resulta em parti- culassecas da formulação de fármaco. Excipientes, podem ser incluídos na formulação, para (i) proteger a proteina durante a desidratação de secagem por pulverização, (ii) proteger a proteina durante o armazenamento após a secagem por pulverização, e/ou iii) dar as propriedades de solução adequa- das para a dispersão em aerossol. O método é semelhante ao descrito aci- ma parao congelamento, a não ser que a formulação da amostra seja seca | por pulverização em vez de congelada, reconstituída com um diluente, e a formulação reconstituída seja testada para a presença de espécies de LMW í ' elou espécies de HMW. Um aumento de espécies LMW ou HMW na amos- . tra seca por pulverização comparada com uma formulação de amostra cor- ' respondente que não foi liofilizada indica diminuição da estabilidade da a- mostra seca por pulverização. As formulações liofilizadas são geralmente reconstituídas para uso, por adição de uma solução aquosa para dissolver a formulação liofiliza- da. Uma grande variedade de soluções aquosas pode ser usada para re- constituir uma formulação liofilizada. De preferência, as formulações liofiliza- das são reconstituídas com água. As formulações liofilizadas são preferenci- almente reconstituídas com uma solução que consiste essencialmente em a água (por exemplo, USP WFI, ou água para injeção (WFI)), ou água bacteri- ' ostática (por exemplo, USP WFI com 0,9% de álcool benzílico). No entanto, . : as soluções que compreendem tampões e/ou excipientes e/ou um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis podem também ser utilizadas. As formulações secas por congelamento ou liofilizadas são ge- ralmente preparadas a partir de líquidos, isto é, a partir de soluções, suspen- sões, emulsões, e similares. Assim, o líquido que está sendo submetido à liofiização ou seco por liofilização compreende, preferivelmente, todos os componentes desejados na formulação reconstituída líquida final. Como re- —sultado, quando reconstituída, a formulação seca por congelamento ou liofili- zada irá processar uma formulação líquida desejada após a reconstituição. Em outro aspecto da invenção, a formulação é prevista para uso em terapia. Assim, a invenção prevê uma composição farmacêutica (ou me- | dicamento), que compreende a formulação aqui descrita. | | 25 Em ainda outra modalidade, a invenção provê um método de tra- | tar um indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade tera- peuticamente eficaz da formulação descrita aqui, em que o indivíduo tem uma doença ou distúrbio que pode ser beneficamente tratado com um poli- peptídeo de CD-RAP. De preferência, a formulação aqui descrita é aplicada na profila- xia e/ou tratamento de uma doença que pode ser prevenida e/ou tratada com CD-RAP.
AA e co O termo "indivíduo" destina-se a incluir organismos vivos. Exem- plos de indivíduos incluem os mamiíferos, por exemplo, seres humanos, ' cães, vacas, cavalos, porcos, ovelhas, cabras, gatos, camundongos, coe- lhos, ratos e transgênicos não humanos em animais. Em modalidades prefe- ridasda invenção, o indivíduo é um ser humano.
O termo "dose eficaz" ou "dosagem eficaz" definido como uma quantidade suficiente para se atingir ou pelo menos parcialmente, se obter o efeito desejado. O termo "dose terapeuticamente eficaz" é definido como uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos parcialmente parar a doençae as suas complicações em um paciente que já sofre da doença. As 2 quantidades eficazes para este uso dependerão da gravidade da infecção e ? do estado geral do sistema imunológico do indivíduo. O termo "paciente" 2 inclui humanos e outros indivíduos mamíferos que recebem tratamento, quer profilático ou terapêutico.
A dosagem apropriada, ou a quantidade terapeuticamente eficaz da formulação irá depender da condição a ser tratada, da gravidade da con- dição, terapia anterior, história clínica do paciente e resposta ao agente tera- pêutico. A dose adequada pode ser ajustada de acordo com o julgamento do médico assistente tal que pode ser administrada ao paciente uma vez ou ao longo de uma série de administrações. A composição farmacêutica pode ser administrada como um agente terapêutico único ou em combinação com terapias adicionais conforme necessário.
As composições farmacêuticas da presente invenção são parti- cularmente úteis para administração parentérica, isto é, por via subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-articular e/ou intra-sinovial. A administração parentérica pode ser por injeção de bolus ou infusão contínua.
Em uma modalidade preferida, a injeção é uma injeção local ou não sistêmica, de preferência, no fluido sinovial, espaço sinovial, ou área sinovial, junta subcondral, defeito osteocondral, espaço intra-articular, de preferência do joelho, dos ombros, quadril, polegar conjunta, temporomandi- | bular ou faceta comum, anel fibroso, núcleo pulposo, espaço pulposo do nú- cleo, intradiscalmente ou transdicalmente. Mais preferencialmente, a admi- ;
í ' nistração é uma injeção intra-articular, de preferência dentro do joelho, arti- culação do ombro, anca, polegar conjunta, temporomandibular ou faceta. : Ainda de preferência, a injeção intra-articular é uma injeção intra-articular no fluido sinovial da articulação ou faceta da articulação temporomandibular. | 5 Uma injeção adicional preferida é uma injeção no espaço subsinovial ou á- rea ou uma injeção no defeito condral ou osteocondral, Também englobada é uma injeção no defeito condral ou osteocondral, antes ou depois do fe- | chamento do defeito com uma membrana. A membrana pode ser, mas não está limitada a, um periósteo ou uma membrana de colágeno. Em uma outra modalidade preferida, a membrana é uma membrana composta de colágeno 2 do tipo |, o colágeno do tipo Ill, colágeno de porcino ou rato tipo | ou II, ácido bi hialurônico ou um seu derivado. Uma vantagem do fechamento do defeito . : antes da injeção da formulação é a de reduzir a diluição da formulação ou a aumentar a concentração local de ingrediente ativo da formulação. A mem- brana atua como agente adicional bioadesivo para a fixação das células. Se | a formulação de proteína foi liofilizada, o material liofilizado é reconstituído primeiro em um líquido adequado antes da administração. O material liofili- zado pode ser reconstituído em água, por exemplo, bacteriostática para inje- ção (BWFI), soro fisiológico, soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), uma solução aquosa, ou a mesma formulação da proteína tinha sido antes da liofilização.
As composições farmacêuticas para injeção podem ser apresen- tadas em forma de unidade de dosagem, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multidose, com um conservante adicionado. Além disso, uma sériede abordagens de entrega de fármacos mais recentes tem sido desen- volvida e as composições farmacêuticas da presente invenção são adequa- das para administração através destes métodos novos, por exemplo, fácil | Injetação, Genject, canetas injetoras como Genen e dispositivos sem agu- Ilhas, como MediJector e BioJector. A presente composição farmacêutica — pode também ser adaptada para métodos de administração a serem ainda descobertos. Vide também Langer, 1990, Science, 249: 1527-1533. A composição farmacêutica pode também ser formulada como
OCO daddddsscce em ea aeee meneno ,.1 S9S .A%fSSM"SSSS ST âêliei mp MIiºsPfs ÔÔÔÂÔÔ"* Ô AM OO S PII A O A OO rm TA TO | 47/65 , t uma preparação de depósito. Tais formulações de ação prolongada podem | ser administradas por implantação (por exemplo, subcutaneamente, no liga- ' mento ou tendão, subsinovial ou intramuscular), por injeção subsinovial ou | por injeção intramuscular. Assim, por exemplo, as formulações podem ser modificadas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos (por exemplo, como | uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de permuta iônica, ou como derivados fracamente solúveis, por exemplo, como um sal fracamente solú- | vel. As composições farmacêuticas podem também estar em uma variedade | de formas de depósito convencionais utilizadas para a administração para fornecer composições reativas. Estes incluem, por exemplo, formas de do- | s sagem sólidas, semi-sólidas e líquidas, tais como soluções liquidas ou sus- l : pensões, pastas, géis, cremes, bálsamos, emuisões, loções, pós, sprays, | é ? espumas, pastas, unguentos, pomadas, bálsamos e gotas.
As composições farmacêuticas podem, se desejado, ser apre- sentadas em um frasco, embalagem, ou dispensador que pode conter uma ou mais formas de unidades de dosagem contendo o ingrediente ativo. Em uma modalidade o dispositivo dispensador pode compreender uma seringa com uma dose única da formulação líquida pronta para a injeção. A seringa pode ser acompanhada por instruções para administração.
A composição farmacêutica pode ainda compreender outros componentes farmaceuticamente aceitáveis. Outros veículos farmaceutica- mente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes, tais como os descritos em Remington 's Pharmaceutical Sciences 16 *? edição, Osol, A. Ed.. (1980) também podem ser incluídos em uma formulação de proteínas aqui descrita, desde que não afete adversamente as características desejadas da formula- ' ção. Conforme aqui utilizado, "veículo farmaceuticamente aceitável" significa qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores da absor- | ção, compatíveis com administração farmacêutica. O uso de tais meios e | agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Veículos aceitáveis, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas e inclu-
CCC NA 48/65 í 7 em: agentes tamponantes adicionais; conservantes; co-solventes; antioxi- dantes, incluindo ácido ascórbico e metionina, agentes quelantes tais como i EDTA; complexos metálicos (por exemplo, complexos proteicos de Zn), po- limeros biodegradáveis, tais como os poliésteres formadores de sal; contra- jons,tais como sódio, álcoois de açúcar poli-hídricos, aminoácidos, tais co- mo alanina, glicina, asparagina, 2-fenilalanina, e treonina; açúcares ou álco- ois de açúcar, tais como lactitol, estaquiose, manose, sorbose, xilose, ribose, ribitol, mioinisitose, mioinisitol, galactose, galactitol, glicerol, ciclitóis (por e- xemplo, inositol), polietileno-glicol; agentes redutores contendo enxofre, tais como a glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, [alfa]- a monotioglicerol, e tio sulfato de sódio; proteinas de baixo peso molecular, $ tais como albumina do soro humano, albumina de soro bovino, gelatina, ou é : outras imunoglobulinas, e polímeros hidrófilos, tais como a polivinilpirrolido- na.
As formulações aqui descritas são úteis como composições far- macêuticas para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio em um paciente com necessidade do mesmo.
O termo "tratamento" refere- se tanto a tratamento terapêutico quanto a medidas profiláticas ou preventi- vas.
O tratamento inclui a aplicação ou a administração da formulação ao organismo, um tecido isolado, ou células de um paciente que sofre de uma doença / distúrbio, um sintoma de uma doença / distúrbio, ou uma predispo- sição para uma doença / distúrbio, com a finalidade de curar, curar, aliviar, aliviar, alterar, corrigir, melhorar, aliviar, ou afetar a doença, sintoma da do- ença, ou a predisposição para a doença.
Aqueles "com necessidade de tratamento" incluem aqueles já com o distúrbio, bem como aqueles nos quais o distúrbio deve ser preveni- do.
O termo “distúrbio” é qualquer condição que se beneficiaria do tratamen- to com a formulação de proteína aqui descrita.
Isto inclui doenças crônicas e agudas ou doenças incluindo as condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão.
Exemplos não limitantes de distúrbios a serem tratados na presente invenção incluem doenças degenerativas, ós- seas e/ou de cartilagem e/ou defeitos de cartilagem articular, uma doença
=|” 7 imunológica inflamação crônica, de preferência de um tecido ósseo, articular 2? ou cartilagem, tais como artrite (incluindo, mas não limitado a osteoartrite, Ú artrite reumatoide) e um distúrbio da coluna vertebral, tais como a doença degenerativa dos discos.
Em uma modalidade preferida da doença vertebral éadornas costas idiopática baixa, hérnia de disco, ruptura interna do disco ou discos fissurados, radiculopatia, estenose espinal, núcleo pulposo hernia- ' do induzido por ciática, dor ciática, escoliose idiopática ou mielopatia. | O termo "doenças degenerativas" significa doenças ou defeitos com estrutura de cartilagem danificada, como a degeneração da cartilagem 19 ou destruição, com ou sem o envolvimento das estruturas ósseas.
De prefe- s rência, as doenças degenerativas são doenças degenerativas da cartilagem. í e.” Estas incluem disfunção da articulação temporomandibular (DTM), distúrbios ” É do labrum acetabular, artrite, artrose, artrite reumatoide, artrite psoriática, artrite juvenil crônica, pseudoarthritis rizomélica, poliartrite reumatoide, do- ença degenerativa do disco, defeitos condrais ou osteocondrais, defeito con- dral focal, defeito osteocondral focal, superficiais defeitos condrais, osteo- condrite dissecante, defeitos de espessura total condrais, defeitos de espes- sura parcial condrais, condromalácia, traumas associados com os tendões e ! ligamentos em torno da articulação do joelho, trauma do menisco lateral e medial, água do menisco, lesão do ligamento cruzado anterior fundamental, osteocondromatose sinovial, espondilite, espondilite anquilosante, sinovite, sinovite viltonodulat.
O termo "defeito de cartilagem" refere-se a qualquer anormali- dade da cartilagem incluindo as doenças da cartilagem, alteração da cartila- gem causada, por exemplo, por trauma ou processos degenerativos.
O ter- mo "cartilagem articular" abrange a superfície da porção de ossos nas articu- lações e funciona como uma almofada entre dois ossos para permitir o mo- | vimento das articulações.
Cartilagem articular normal saudável é descrita como a cartilagem hialina.
A cartilagem articular é constituída por células especializadas (condrócitos) incorporadas dentro de uma matriz de material intracelular rica em proteoglicanos, predominantemente de agrecana, fibrilas de colágeno de tipo Il, outras proteínas e água.
A matriz é produzida e man- SS AS SAS A A a a O O ônônmnmi PP PPP“ qQRÚQkoe,EÚPP”PN"!? ?QaQ?Õ?<?Ó
A * tida pelos condrócitos embebidos dentro. Tecido de cartilagem não é inerva- do e vascularizado e é nutrido pelo tecido subjacente.
Í Além da proteína CD-RAP, a composição farmacêutica da pre- sente invenção podem compreender agentes terapêuticos adicionais ou bio- logicamente ativos. Por exemplo, os fatores de terapêuticos úteis no trata- mento de uma determinada indicação, por exemplo de osteoartrite, tais co- mo um ou mais inibidores que estão envolvidos na destruição da cartilagem articular ou componentes sinoviais não se limitam a antimetaloproteinase, compostos ciclina, antagonistas de citocina, corticosteroides, inibidores de TNF, IL-inibidores, substâncias antiangiogênicas, inibidores da agrecanase, + inibidores de quinase p38, inibidores de apoptose, inibidores de hialuronida- e” se e inibidores de enzimas proteolíticas podem estar presentes. Fatores que .
- v 7“ controlam inflamação incluindo infliximab, etanercerpt, adalimulab, nereli- monmab, lenercerpt e similares, ou suas combinações também podem fazer parte da composição. Prevê-se igualmente que a composição farmacêutica de lipossomas pode incluir os componentes da matriz extracelular, tais como o ácido hialurônico ou um seu derivado, incluindo os seus sais, ésteres, és- teres e seus derivados sulfatados interior, de preferência, éster parcial de ácido hialurônico.
Em outra modalidade, a presente invenção é direcionada a um kit (ou artigo de fabricação) ou recipiente, que contém uma formulação da presente invenção. A formulação pode, de preferência já estar em um estado líquido. No entanto, em alternativa, pode estar de preferência em estado liofi- lizado. Também pode estar em um estado congelado, liofilizado, seco por congelamento, ou seco por pulverização. Por conseguinte, se a formulação estiver no estado diferente do líquido, ela pode ser preparada pelo praticante como composição farmacêutica aquosa (líquida). Por exemplo, a formulação pode ser liofilizada e, então, tem que ser reconstituída. Deste modo, o kit pode ainda compreender meios para a reconstituição de uma formulação congelada, liofiizada seca por congelamento ou seca por pulverização e/ou meios para a diluição da formulação e/ou meios para a administração da formulação ou composição farmacêutica, respectivamente. O kit também a Ê 7 pode ser acompanhado por instruções para uso.
Assim, um artigo de fabricação é provido o qual contém uma ] formulação aqui descrita e de preferência fornece instruções para o seu uso. | . O artigo de fabricação compreende um recipiente adequado para conter a | formulação.
Recipientes adequados incluem, sem limitação, garrafas, fras- cos (por exemplo, frascos de dupla câmara), seringas (por exemplo, serin- gas de câmara única ou dupla), tubos de ensaio, nebulizadores, inaladores (por exemplo, inaladores de dose calibrada ou inaladores de pó seco), ou depósitos.
O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de mate- ' riais, tais como metal, vidro ou plástico (por exemplo, policarbonato, poliesti- % reno, polipropileno, poliolefina). O recipiente contém a formulação e o rótulo ? sobre, ou associado com, o recipiente pode indicar instruções para reconsti- se É tuição e/ou uso.
O rótulo pode ainda indicar que a formulação é útil ou desti- nada a administração por via subcutânea.
O recipiente que contém a formu- lação pode ser um frasco multiuso, que permite administrações repetidas (por exemplo, 1-6 administrações) da formulação.
O artigo de fabricação po- de compreender ainda um segundo recipiente compreendendo um diluente adequado (por exemplo, WFI, NaCl a 0,9%, BWFI, solução salina tampona- da com fosfato). Quando o artigo de fabricação compreende uma versão de uma formulação liofiizada de proteínas, a mistura de um diluente com a for- mulação liofilizada irá prover uma concentração final de proteína na formula- ção reconstituída geralmente de pelo menos 20 mg / mL.
O artigo de fabri- cação pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista co- mercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para uso.
Em outra modalidade da invenção, um artigo de fabricação é provido o qual contém a formulação aquosa da presente invenção, e fornece instruções para o seu uso.
O artigo de fabricação compreende um recipiente.
Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos (por exem- plo, frascos de dupla câmara), seringas (tais como seringas de dupla câma- ra), caneta autoinjector contendo uma seringa, e tubos de ensaio.
O recipi- ente pode ser formado a partir de uma variedade de materiais tais como vi- A nr
: F dro, plástico ou policarbonato. O recipiente contém a formulação aquosa e o rótulo sobre, ou associado com, o recipiente pode indicar as instruções de ] uso. Por exemplo, o rótulo pode indicar que à formulação é útil ou destinada a administração por via subcutânea. O recipiente que contém a formulação pode ser um frasco multiuso, que permite a administrações repetidas (por exemplo, 2 a 6 administrações) da formulação aquosa. O artigo de fabrica- ção pode compreender ainda um segundo recipiente. O artigo de fabricação pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulascom instruções para uso.
a Também estão incluídos na presente invenção são os dispositi- o vos que podem ser utilizados para fornecer a formulação da presente inven- w ? ção. Exemplos de tais dispositivos incluem, mas não estão limitados a, uma seringa, uma caneta, um implante, um dispositivo de injeção sem agulha, um dispositivo de inalação, e um adesivo.
A invenção é ainda ilustrada pelas figuras e exemplos que são meramente ilustrativos e não são construídos como uma limitação do âmbito da presente invenção.
As figuras mostram: Figura 1: fatores que influenciam a estabilidade da proteina Figura 2: exemplos de medidas que podem ser tomadas para estabilizar uma proteína Figura 3: concentração sucessiva de rhCD-RAP em fosfato de potássio.
Figura 4: concentração sucessiva de rhCD-RAP em cloreto de
TRIS Figura 5: concentração sucessiva de rhnCD-RAP em cloreto de histidina Figura 6: estabilidade de rhCD-RAP em elevada concentração | emsistemas de tampão diferentes Figura 7: estabilidade de rhCD-RAP em elevada concentração em sistemas de tampão diferentes
| | 53/65 f ã 7 Figura 8: carga líquida de glicina e rhnCD-RAP em diferentes va- lores de pH Figura 9: influência do pH na solubilidade do rhnCD-RAP em 150 mM de glicina Figura 10: influência da molaridade de fosfato de histidina na so- lubilidade de rhnCD-RAP Figura 11: influência de fosfato de histidina (ajustado para osmo- laridade isotônica com cloreto de potássio) em solubilidade de rhCD-RAP Favor, notar que nas Figuras 3 a 11, a numeração adicionada à legenda do gráfico de barra pertence às barras de cada "bloco" mostrado no à gráfico (da esquerda para a direita). Por exemplo, "0" pertence à barra ex- ES terna esquerda, "1" pertence a barra ao lado da barra indicada com "O", etc. z ? Os Exemplos seguintes ilustram a invenção. ' Com base na análise dos inventores reivindicando formulações estáveis de altas concentrações de CD-RAP de modo a permitir a injeção de volumes menores nos pacientes, que reduz os efeitos colaterais, como a dor devido a injeção de grandes volumes, várias formulações foram testadas no seu efeito sobre a estabilização de proteina CD-RAP.
Algumas destas for- mulações são exemplarmente demonstradas nos exemplos a seguir abaixo. . No entanto, tal como mencionado no presente documento, quando se inici- ando com os inventores reivindicando, é uma questão de trabalho empírico para encontrar os ingredientes apropriados de uma formulação que satisfaça o objetivo, uma vez que cada proteina tem propriedades diferentes e, assim, não se pode concluir a partir de um exemplo quais ingredientes são os ade- quados.
Exemplo 1: Vários sistemas de tampão foram analisados para rhnCD-RAP rhCD-RAP foi dialisado contra 36 sistemas de tampão (50 mM de cloreto de potássio, 50 mM de cloreto de histidina ou 50 mM de cloreto de TRIS, pH 6,0, cada um, cada tampão com ou sem a adição de um dos se- guintes estabilizadores selecionados de entre sacarose, manitol, glicina, lisi- | na e ácido glutâmico, com ou sem 0,1% de Tween & 20. Durante o processo de concentração subsequente por meio de diálise até 30 mg / mL de rhCD co RAP amostras por filtração foram analisadas por espectroscopia UV / Vis. , Formulações estáveis estavam estressadas por ciclos de conge- | lamento e descongelamento.
Depois de cada ciclo, as amostras foram centri- fugadas e rhCD-RAP foi quantificada por espectroscopia UV / Vis.
Diálise 2,0 ml! de materia! de volume rhCD-RAP (em 350 mM de Argini- na / fosfato pH 7,4) foi dialisado contra 500 ml de tampão desejado, a 4 ºC durante 24 h sob agitação moderada por meio de um tubo de corte de 6-8 kDa de peso molecular.
Depois de 16 horas o tampão de diálise foi substitu- ido com 500 mL de tampão fresco.
As soluções de proteina resultantes fo- 4 ram armazenadas a 2-8 ºC para análise posterior.
O uvvs z : O conteúdo de proteina em amostras foi determinado por UV / Vis, após a centrifugação do rhCD-RAP dialisado por 5 minutos a 13.000 ref.
Os buffers de amostras correspondentes serviram para subtração em bran- co.
Para o cálculo da concentração de proteína [mg / m!l, a absorvância a 280 nm e a absorvência específica de rhnCD-RAP a 280 nm [1,649 mL / (mg * cem)] foram utilizados.
Aumento da concentração rhCD-RAP- | 20 rhCD-RAP dialisado foi transferido para um concentrador de centrífuga de 2 mL. ' Depois das etapas de centrifugação subsequentes (4000 rcf, 4ºC), o volume de solução de rhnCD-RAP diminuiu.
O volume dá solução de rhnCD-RAP remanescente foi determinado e concentração de rhCD-RAP foi | determinada por UV / Vis. | Estabilidade térmica (ciclos de congelamento / descongelamento) | A estabilidade térmica de rhnCD-RAP foi avaliada por aplicação de cinco ciclos de congelamento / descongelamento a partir de 5 ºC a tem- peratura de -25 ºC, utilizando um congelador.
Taxas de arrefecimento e a- —quecimento foram de 1,0 ºC min / com uma etapa isotérmica de 15 minutos entre cada ciclo.
As soluções de proteína foram armazenadas a 4 ºC -8"C até à análise.
co 300 ul de rhCD-RAP numa concentração de 30 mg / ml foram . transferidos para frascos de PP 1,5 mL e estressados por etapas de conge- lamento-descongelamento definidas como descrito acima.
Exemplo 2: Estabilidade de rhCD-RAP em sistemas de tampão diferentes Os efeitos de estabilização de todos os sistemas de tampão do Exemplo 1 foram determinados.
Sistemas tampão de fosfato de potássio As seguintes substâncias foram dissolvidas em WFi a um peso final de 1 Kg dando uma concentração de tampão de 50 mM.
O pH foi ajus- tadoparapH6,0 pela adição de KOH e de HCI, respectivamente. á a) 6,8 g de fosfato de potássio, 12,4 g de KCl, com e sem 1,0 g | ? Tween & 80 : : b) 6,8 g de fosfato de potássio, 50 g de sacarose, 4,9 g de KCl, com e sem 1,0 g Tween & 80 | c) 6,8 g de fosfato de potássio, 50 g de manitol, sem e com 1,0 g | de Tween & 80 | d) 6,8 g de fosfato de potássio, 25 g de glicina, com e sem 1,09 Tween & 80 e) 6,8 g de fosfato de potássio, 25 g de ácido glutâmico, com e sem1,0gTweenO& 80 PN 6,8 g de fosfato de potássio, 25 g de lisina, com e sem 1,0 g Tween O 80 9) 61,0 g arginina, pH 7,4 ajustado com ácido fosfórico (controle) Isotonicidade de 300 - 400 mOsm / kg foi ajustada com cloreto de potássio, se for necessário.
À osmolalidade de cada tampão é mostrada na Tabela 1. Tabela 1: Osmolaridade de tam) fosfato de potássio Formulação Osmolalidade [mMOsm / kg] 50 mM de fosfato de potássio + 5% de sa- 340 carose (p/v) 50 mM de fosfato de potássio + 5% (p/v) BB Manitol A ss rr
—————— ) P a une Nua SA| VB» r“º ºi"íP%5éN ;"aº“Àéé sl .=ãaãA AO) u CO“ .m PAi 2 II“ “À Z3ô.Aºêúélcio! 56/65 is Formulação Osmolalidade [mMOsm / kg] " Glicina ' 50 mM de fosfato de potássio + 2,5% (p/v) 354 j de Lisina rhCD-RAP foi então dialisada contra sistemas de tampão de fos- fato de potássio baseados como listados na Tabela 1 e concentrada por cen- trifugação em unidades de filtração. Após redução sucessiva definida de tampão o volume constante da solução de proteína foi determinado e con- t 5 centração de rhCD-RAP foi determinada por UV / Vis. A Figura 3 mostra a ? concentração resultante de CD-RAP, antes e depois de uma diálise de 5 mg v : / mL de solução de CD-RAP, bem como após a concentração de 10, 20 e 30 mg / mL. O tampão de arginina / fosfato serviu como controle.
Como mostrado na Figura 3, a formulação do sistema de tampão de arginina / fosfato mostrou solubilidade ideal em todas as etapas de con- centração. Mesmo na fase de concentração mais elevada o conteúdo de proteina medido alcançou o teor teórico de rhnCD-RAP. Assim, uma vez que não houve perda de proteína na arginina / fosfato para rhnCD-RAP este tam- pão é uma das soluções de solubilização mais preferidas. Em contraste com arginina / fosfato o uso de fosfato de potássio como tampão de formulação necessitou alguns suplementos adicionais para alcançar solubilidade sufici- ente. Como 50 mM de fosfato de potássio (que compreende o cloreto de po- tássio como suplemento iônico para alcançar estado isotônico) mostrou boa solubilidade apenas até 10 mg / mL de rhCD-RAP, houve uma necessidade | da adiçãode suplementos para alcançar solubilidade a concentrações de até a 30 mg / mL de rhnCD-RAP e superior. A partir da grande variedade de es- tabilizadores apenas sacarose conduz a uma excelente solubilidade de rhnCD-RAP, mesmo a uma concentração de 30 mg / mL. Outros efeitos de agregação mostrados com proteina precipitada parcialmente visível em eta- pasde concentração diferentes, Sistemas de Tampão Tris i é Cloreto de TRIS em variação com estabilizantes tais como saca- rose, manitol, glicina, ácido glutâmico e lisina, com ou sem Tween80 & como melhorador de solubilidade foi dissolvido em WFI a um peso final de 1 kg, | dando uma concentração de tampão de 50 mM.
O pH foi ajustado para pH 6,0 usando HC! adicional, respectivamente. a) 6,05 g de base Tris, 9,7 g de NaCl, com e sem 1,0 g Tween O 80 b) 6,05 g de base Tris, 50 g de sacarose, 3,9 g de NaCl, com e sem 1,0 g Tween & 80 c) 6,05 g de base Tris, 50 g de manitol, sem e com 1,0 g de % Tween & 80 ? d) 6,05 g de base Tris, 25 g de glicina, com e sem 1,0 g Tween 2 0 €&8BO €) 6,05 g de base Tris, 25 g de ácido glutâmico, com e sem 1,09 Tween8&80 f) 6,05 g de base Tris, 25 g de lisina, com e sem 1,0 g Tween O 80 Isotonicidade de 300 - 400 mOsm / kg foi ajustada com cloreto de potássio, se necessário.
A osmolalidade de cada tampão é mostrada na Tabela2. Tabela 2: Osmolaridade de tampões TRIS — Formulação Osmolaridade [mMOsm / kg] 50 mM TRIS 342 50 MM TRIS + 5% de sacarose 344 50 MM TRIS + 5% Manitol 50 MM TRIS + 2,5% de ácido glutâmico 350 " MhCD-RAP foi dialisada e concentrada até 30 mg / mL como descrito para o tampão de fosfato de potássio acima. 350mM de tampão de fosfato de arginina serviu como um controle para a solubilidade ideal.
Com- parado a formulações de tampão baseadas em fosfato de potássio todos os | tampões de cloreto de TRIS, exceto 50 mM de cloreto de TRIS com 2,5% de
7 * —àácidoglutânico mostraram baixa solubilidade acima de 5 mg / mLCD RAP. ; .., Sistemasde tampão de histidina Ss Cloreto de histidina (50 mM, pH 6,0) na variação com estabili- zantes tais como sacarose, maniftol, glicina, ácido glutâmico e lisina, com ou sem Tween80 & como melhorador de solubilidade, foi analisado como se segue utilizando o mesmo método tal como descrito acima para os outros dois sistemas de tampão. a) 7,76 g de cloreto de L-histidina, 12,4 g de KCI, com e sem 1,0 g Tween & 80 b) 7,76 g de cloreto de L-histidina, 50 g de sacarose, 4,9 g de “ KCl, com sem 1,0 g Tween & 80 é i c) 7,76 g de cloreto de L-histidina, 50 g de manitol, sem e com a” 1,0 g de Tween & 80 É d) 7,76 g de cloreto de L-histidina, 25 g de glicina, com e sem 1,09 Tween O 80 e) 7,76 g de cloreto de L-histidina, 25 g de ácido glutâmico, com e sem 1,0 g Tween & 80 f) 7,76 g de cloreto de L-histidina, 25 g de lisina, com e sem 1,0 g Tween & 80 A osmolalidade foi ajustada sempre que necessário.
À osmolali- ! dade final é mostrada na Tabela 3. Tabela 3: Osmolaridade de tampões de cloreto de histidina Histidina 5S0mM Histidina 50 mM, + 5% de sacarose | Histidina 50 MM + 5% de manitol Histidina 50 mM, + 2,5% de glicina = 375 | mico I'hCD-RAP foi dialisada em sistemas de tampão e concentrada para 30 mg / mL (comparar 4.1.1). Em comparação com ambas formulações de tampão baseadas
: * em fosfato de potássio e TRIS tampões baseados em cloreto de histidina geraram os melhores resultados de solubilidade de rhCD-RAP além do fos- ' fato de arginina de tampão presente. Com a exceção de que 50 mM de histidina + / - Tween80 & a- gregados acima de concentrações de 5 mg / mL de rhCD-RAP, todos os ou- tros tampões mostraram uma solubilidade muito boa de até 30 mg / mL em tampão isotônico dentro de um pH de 6,0 e cerca de um pH neutro. Mais | uma vez, não houve qualquer efeito sobre a solubilidade de rhnCD-RAP pelo uso de Tween80 & nos sistemas de tampão quando analisados. Conclusão e Os melhores resultados de CD-RAP provendo uma elevada con-
4. centração de proteína de até 30 mg / mL sem agregação foram os seguintes: z ; a) 50 mM de fosfato de potássio com sacarose a 5%, b) 50 mM de cloreto de Tris, 2,5% de ácido glutâmico, c) 50 mM de histidina, 2,5% de glicina, d) 50 mM de histidina, 2,5% de ácido glutâmico, e) 50 mM de histidina, 2,5% de lisina, f) histidina com manitol a 5% e g) 350 mM de fosfato de arginina. Soltar a concentração desejada a 5 mg / mL para quase todas as formulações testadas permitiu a estabilidade da proteina enquanto que aumentar a concentração de 30 mg / mL permitiu que a barreira fosse limpa. Exemplo 3: Avaliação da estabilidade térmica de rhCD-RAP em sistemas de tampão diferentes por ciclos de congelamento / descongelamento Exemplo 1, 7 formulações de tampão foram avaliadas para a sua capacidade para concentrar rhCD-RAP até 30 mg / mL a pH 6,0. Essas for- mulações foram testadas para manter estabilidade de RAP-rhnCD em situa- çõesde estresseisto é, ciclos de congelamento / descongelamento. rhCD-RAP foi dialisada em sistemas de tampão (a) 50 mM de fosfato de potássio com sacarose a 5%, b) 50 mM de cloreto de Tris, 2,5% de ácido glutâmico, c) 50 mM de histidina, 2,5% de glicina, d) 50 mM de his- tidina, 2,5% de ácido glutâmico, e) 50 mM de histidina, 2,5% de lisina, f) his- tidina com manito! a 5%, g) 350 mM de fosfato de arginina e subsequente- mente concentrada por centrifugação em unidades de filtração para concen- trações de — 30 mg / mL de rhCD-RAP, 300 ul foram transferidos para fras-
RP OÔA5M im "Pce8 ' | ' 60/65 e. cos PP de 1,5 mL.
As formulações foram estressadas por 5 ciclos de conge- : lamento / descongelamento, rhCD-RAP agregado foi removido por centrifu- | gação e depois o restante de rhCD-RAP solúvel foi quantificado por espec- troscopia UV / Vis. rhCD-RAP foi concentrada com sucesso para cerca de 30 mg / ml em todos os sistemas de tampão testados.
A Figura 6 não mostra nenhum efeito negativo sobre a concen- tração de proteína por ciclos de congelamento e descongelamento em todas as formulações, exceto rhCD-RAP em 50 mM de fosfato de potássio / 5% de sacarose.
Só quando em 50 mM de fosfato de potássio / 5% de sacarose r poderia uma diminuição significativa de rhCD-RAP ser observada após o ê, terceiro processo de congelamento / descongelamento e temporariamente É ; um leite turvo como dispersão foi visível.
Em todas as outras formulações a solução estava límpida após cada ciclo de congelamento / descongelamen- to, o que, em combinação com os resultados da quantificação de RAP-rhCD por UV / Vis resolveu o problema da solubilidade e estabilidade de RAP- rhCD em altas concentrações.
Surpreendentemente apenas sistemas de tampão que compre- enderam pelo menos um aminoácido resultaram em estabilidade térmica de —rhCD-RAP após ciclos de congelamento e descongelamento.
Exemplo 4: Efeito de estabilização de diferentes aminoácidos em rhCD-RAP (30 mg / ml) Uma vez que o Exemplo 2 e 3 mostraram solubilidade de rhCD- RAP excelente em concentrações de 30 mg / mL em soluções de tampão | 25 contendo os aminoácidos este efeito de aminoácido especial foi examinado no Exemplo seguinte.
Aminoácidos básicos tais como arginina e histídina, bem como aminoácidos neutros tais como glicina e aminoácido ácidos tais | como o ácido glutâmico foram testados no seu efeito estabilizador sobre rhCD-RAP.
Todas as soluções de volume são concebidas isotônicas a pH | 6,0,sema adição de quaisquer sais ou outros excipientes; pH foi ajustado com ambos os ácidos clorídrico e ácido fosfórico.
Adicionalmente 350 mM de fosfato de arginina foi testado a pH 6,0 e pH 7,4.
fp: BS--º,.)1IiEr”ÉÊ“)“TESS OE) p2) r”!A “ITEOQ.!1 o aáàáá“““ iO .) =. o Pn go er ..). 61/65 E. Tabela 4: rhCD-RAP estressado por ciclos de congelamento e descongela- . — mentoemtampões diferentes 300mM de cloreto de L-histidina pH 6 o 330 350 mM de cloreto de arginina pH 6 302 300 mM de glutamato de potássio pH 6 rhCD-RAP foi dialisada em sistemas de tampão (listados na Ta- '. . bela4),efoisubsequentemente concentrada por centrifugação em unidades , 5 de filtração para uma concentração de -— 30 mg / mL de rhnCD-RAP. 300 ul - foram transferidos para frascos PP de 1,5 mL.
As formulações listadas na Tabela 4 foram estressadas por 5 de congelamento / descongelamento de acordo com os Exemplos acima. rhCD- RAP agregado foi removido por centrifugação e depois o restante de rhCD- RAP solúvel foi quantificado por espectroscopia UV / Vis.
A Figura 7 mostra o efeito de estabilização excelente de todos os sistemas de tampão testados e solubilidade de rhCD-RAP em ciclos de congelamento / descongelamento, exceto um: rhCD-RAP dializou em 150 mM de glicina agregado quantitativamente durante a etapa de diálise. Assim, aglicina, a pH ácido 6.0 como o único aminoácido não carregado analisado indica que a carga do aminoácido é uma propriedade técnica importante no uso de aminoácidos para a preparação de tampões de massa de rhCD-RAP. No entanto, tanto o tampão de fosfato quanto o de cloreto foram realizados da mesma maneira.
Exemplo 5: Efeito de pH diferente sobre a solubilidade de rhnCD-RAP em gli- cina Exemplo 4 apontou para uma fraca solubilidade de RAP-rhCD em soluções isotônicas de glícina a pH 6.0 devido ao seu comportamento neutro. Os inventores, em seguida, determinaram a consequência da solubi- lidadede CD-RAP se glicina é ainda descarregado, mas rhCD-RAP compre-
| 62/65 ” ão * enderuma carga líquida mais elevada devido a uma alteração no pH e uma ss. maiorcarga líquida de CD-RAP respectivamente.
= : A Figura 8 ilustra a carga líquida de glicina e rhnCD-RAP em dife- rentes valores de pH devido aos seus valores de pKs. Nesta experiência rhcD-RAP foi dialisada contra 150 mM de glicina a pH 4,0, pH 6,0 e pH 8,0.
Os valores de pH foram ajustados com ácido fosfórico e hidróxido de sódio, respectivamente. rhCD-RAP dialisada em um tampão de pH 6 e pH 8 mos- trou uma forte tendência para a agregação. Estas soluções tinham a aparên- cia de leite, em contraste com a glicina (pH 4), onde a solução estava ainda mostrando um aparência não leitosa clara.
* vç rhCD-RAP foi concentrada para 30 mg / mL (pH 4,0) e posteri- É , 2 ormente foi salientada por 5 ciclos de congelamento / descongelamento ci- =P ' clos. rhCD-RAP agradado foi removido por centrifugação e depois o restante de rhCD-RAP solúvel foi quantificado por espectroscopia UV / Vis. Soluções derhCD-RAP a pH 6,0 e pH 8,0 foram diretamente estressadas em concen- trações mais baixas, como resultado do bloqueio do filtro durante o processo de concentração.
A Figura 9 mostra o efeito de rhnCD-RAP autoestabilizadora sob condições ácidas, por exemplo, em pH 4,0, devido à elevação da carga lí- quidada proteina. Embora a glicina seja descarregada, a pH 4,0, foi possível obter uma solubilidade suficiente de rhCD-RAP.
Considerando que, no intervalo de pH entre pH 6-8 formulações compreendendo CD-RAP devem ser constituídas por aminoácidos carrega- dos como um excipiente estabilizante, a um pH mais baixo por exemplo, rhCD-RAP a pH 4,0 é capaz de estabilizar a si mesma sem a adição de ami- noácidos carregados. Exemplo 6: Efeito de histidina na estabilização de rhCD-RAP Os experimentos anteriores demonstraram aminoácidos carre- gados como uma ferramenta poderosa para estabilização de rhCD-RAP para concentrações elevadas de até 30 mg / mL a cerca de pH neutro, tais como pH 6,0. Para determinar a faixa dos tampões identificados Este exemplo | mostra a dependência da concentração do componente de tampão para a jp Aê MM 63/65 ê 3 7” —CD-RAP para ser melhor adequadamente exemplificado por histidina.
Por- A tanto, rhCD-RAP foi dialisada para fosfato de histidina no intervalo de O mM = a 300 mM de histidina, como mostrado na Tabela 5 abaixo.
Adicionalmente, estas formulações foram ajustadas para osmolalidade fisiológica através da adiçãodeuma quantidade suficiente de cloreto de potássio.
Tabela 5: Concentrações diferentes de tampões de L-histidina, osmolaridade antes do ajuste com cloreto de potássio a condições isotônicas Histidina Im] [e o 2 o as ER Ta 7 ia Lia TO ATO LB [AA 218 200 FR a | rhCD-RAP foi concentrado a 30 mg / mL (pH 6,0) e, subsequen- temente, estressado por 5 ciclos de congelamento / descongelamento. | 10 rhCD-RAP agregado foi removido por centrifugação e depois o restante de rhnCD-RAP solúvel foi quantificado por espectroscopia UV / Vis. | A Figura 10 demonstra que a solubilidade de RAP-rhCD em fos- fato de histidina a 6.0 pH foi estritamente dependente da concentração de | histidina.
Considerando que OmM de histidina a pH 6,0 não conseguiu esta- —bilizarrhCD-RAP, concentrações mais elevadas levaram a solubilidade signi- ficativamente melhorada em relação ao aumento da molaridade de histidina.
Estes experimentos de congelamento / descongelamento repetido demons- traram que tampões compreendendo L-histidina em concentrações de 200 | mmol / | e mais proveram soluções rhCD-RAP estáveis a 30 mg / mL. : | Como visto na Figura 11, a adição de cloreto de potássio não in- fluenciou a solubilidade do RAP-rhnCD em fosfato de histidina.
Por conse- guinte, um ajuste da pressão osmótica isotônica de uma formulação CD- RAP farmacêutica com cloreto de potássio pode ser usado sem um impacto
CF + negativo sobre a solubilidade e estabilidade de rhCD-RAP em altas concen- trações.
Células MCHT foram semeadas em uma densidade de 30.000 células por poço em placas de 96 poços e foram crescidas durante a noite em meio de cultura (alfa-MEM contendo glutamina completada com 10% de ! FCS). No dia seguinte, a estimulação com rhnGDF-5 e rhCD-RAP foi iniciada através da alteração no meio de cultura de cada poço a 160 ul do meio de estimulação em particular.
Todos os padrões e as amostras foram feitas em quadruplets.
Uma série de diluições de rhnGDF-5 com as seguintes concen- z trações de rhnGDF-5 (1200 ng / ml, 400 ng / ml, 133,2 ng / ml, 44,5 ng / ml, 3 14,8 ng / ml! rhGDF-5 em meio de cultura completo) foi preparado para atin- E E gir uma curva padrão.
Para a análise da inibição de atividade ALP mediada por rhCD-RAP as células foram co-estimuladas com 400 ng / ml! de rhnGDF-5 ede1a10uMderhCD-RAP.
As células foram cultivadas no meio de esti- mulação, durante três dias antes de serem lisadas por adição de 0,2 g de MgClI2 x 68H20 em 2 ml de Nonidet P40 e incubando durante 16 horas em uma incubadora. 50 ul do lisado foi transferido para uma nova placa de 96 poços e 50 ul de tampão de substrato (0,222 g de PNPP em tampão de die- tanolamina, Pierce) foram adicionados e incubados durante 45 min a 37 ºC.
Em seguida a reação foi parada por adição de 0,5 M de NaOH.
A absorvân- cia foi medida a 405 nm em um leitor de placas.
Atividade de ALP de fundo foi medida em células não tratadas e foi subtraída de todos os padrões e amostras.
A curva padrão foi utilizada para calcular a atividade de ALP em todasas amostras.
Exemplo 8: Estimulação de CD-RAP de condrócitos e análise com gRT-PCR Os condrócitos foram isolados a partir de cartilagem articular humana derivada de doentes submetidos à substituição total do joelho.
A cartilagem foi cortada do osso e em pedaços pequenos.
Os pedaços de car- tilagem foram digeridos com Pronase a 1%, em DMEM/F12 contendo 1% de penicilina / estreptomicina a 37 ºC durante 1 h.
Após centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente, os pedaços de cartilagem foram la-
o = * —vados uma vez com PBS.
Eles foram digeridos em 0,07% de colagenase À no meio de cultura (DMEM/F12 completado com 10% de FCS e 1% de peni- Ú cilina / estreptomicina), a 37 ºC durante a noite.
No dia seguinte, a suspen- são celular foi filtrada, sucessivamente, através de 100, 70 e 40 uM de filtros | decélulas.
As células foram centrifugadas, ressuspensas em meio de cultura | e semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 250.000 células por poço.
As células foram cultivadas a 37 “C, 5% de CO, e 90% de umidade até atingirem a confluência (aproximadamente 1 semana). O meio foi troca- do a cada dois dias.
Para a estimulação com CD-RAP, as células foram jejuadas em % meio sem soro durante a noite.
CD-RAP (0,5-5 UM) foi adicionado em ; DMEMY/F12 isento de soro e as células foram cultivadas durante 24 h, Sub- w * sequentemente, as células foram lisadas e o RNA foi extraído com o Kit Mini RNeasy de acordo com as instruções do fabricante. 1 ug de RNA foi utiliza- do para preparar CDONA com o Kit de Transcrição Reversa QuantiTect (Qia- gen). RT-PCR foi realizada com 4 ul de cDNA diluído (1:5 diluído), 10 ul QuantiFast SYBR Green PCR Mix (Qiagen), 4 ul de água livre de nuclease e 2 ul de mistura de iniciadores, 50 ciclos em um termociclador de luz sob condições padrão.
Os iniciadores utilizados foram: 18SrRNA (Qiagen, Quan- tTect Assay Primer QTO00199367, MMP13forwward GGGTTCCT- GATGTGGGTGAATA (SEQ ID No. 5), MMPi3reverse GCCATCGTGA- AGTCTGGTA (SEQ ID No. 6) Os resultados foram normalizados para o rR- NA 18S empregada. | — i.e NSÉÉÊÔÚlÓ/l1Nn1háq 1 q!Édq%ô 061 (lf( àtétnIMm;níI6tMmíÓ+> M1qà&a :S<;<4ÔZ690 U00H mn 1q/.t //< I///mnmmMmm1n1mmm1nmmn1M1

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES
1. Formulação aquosa estável, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 5 mg / mL de CD-RAP e um aminoácido carregado, em que a proteina CD-RAP é diretamente dissolvida no mesmo.
2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido aminoácido tem uma carga líquida com um pH entre cerca de 6 e 8.
3. Formulação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zada pelo fato de que compreende um tampão.
4. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende um modificador de tonici- dade.
5. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende um estabilizador.
6. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a5, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um excipiente.
7. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que tem um pH entre cerca de 6 e 8.
8. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o aminoácido carregado é selecionado a partir do grupo compreendendo arginina, histidina, lisina e ácido glutâmico.
9. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que pode ser liofilizada, seca por congela- mento ou seca por pulverização.
+ 10. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizada pelo fato de que os ingredientes da formulação fornecem estabilidade durante repetidos ciclos de congelamento- descongelamento.
11. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções1al10, caracterizada pelo fato de que é usada em terapia.
12. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, caracterizada pelo fato de que é usada no tratamento de distúr-
bios inflamatórios, preferivelmente osteoartrite.
13. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 30 mg / mL de CD-RAP, o tampão é selecionado a partir do grupo compreendendo fosfato de potássio, cloreto de TRIS, histidina, arginina e glutamato, e o ami- noácido é selecionado a partir do grupo compreendendo aspartato, glutama- to (preferencialmente fosfato de glutamato), arginina (preferencialmente fos- fato de arginina ou cloreto de arginina), histidina (preferencialmente cloreto de histidina ou fosfato de histidina), lisina e glicina.
14. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 30 mg / mL de CD-RAP e (1) 50 MM cloreto de TRIS e 2,5%de glutamato; (ii) 50 mM de histidina e 2,5% (p/v) de glicina, 2,5% (p/v) de glu- tamato(p/v) ou 2,5% de lisina (p/v); (iii) 300 mM de cloreto de histidina pH 6,0; (iv) 50, 100, 200 ou 300 mM de fosfato de histidina pH 6,0; (v) 350 mM de cloreto de arginina pH 6,0; (vi) 350 mM de fosfato de arginina pH 6,0; (vii) 350 mM de fosfato de arginina pH 7,4; ou (viii) 300 mM de glutamato de potássio pH 6,0.
15. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a formula- ção, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
16. Uso de CD-RAP e um aminoácido carregado, caracterizado pelofatode ser na preparação de uma formulação aquosa estável para uso em terapia e/ou para tratar distúrbios inflamatórios.
17. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concretiza- ções ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inicialmente revelada no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresentados.
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