JP6078129B2 - 安定ｍｉａ／ｃｄ−ｒａｐ製剤 - Google Patents

Description

本発明は、少なくとも５mg/mLのCD-RAPと、荷電アミノ酸とを備え、前記アミノ酸は、好ましくはｐＨ６から８までにおいて正味電荷を有する安定水性製剤に関する。前記製剤の成分は、好ましくは繰り返しの凍結融解サイクルに対する安定性を付与する。好ましい態様において、前記製剤は、治療に用いるためのものであり、炎症性疾患、好ましくは骨関節炎の治療に用いるためのものである。さらに、本発明の製剤を備えたキットが提供される。

タンパク質は、医薬、獣医学製品、化粧品及び他の消費者製品、食品、飼料、診断学、工業化学並びに汚染除去の分野における広い適用範囲で用いられる。時々、そのような用途は、タンパク質自体の固有の制約により制限される、又はそれらが用いられる環境又は培地により限定される。そのような制約は、タンパク質の乏しい安定性、特性の変動又は高いコストを生じるかもしれない。バイオテクノロジーの出現の結果、治療適用のための種々のタンパク質の生成が可能となる。それらの生成の後、タンパク質医薬は、それらの使用の前に、通常は保存される。タンパク質は、一般に、「従来の」医薬よりも大きく、より複雑であるため、保存に適当なタンパク質医薬の調合及び加工は、特に必要とされ得る。タンパク質医薬製剤及びプロセス設計のレビューには、Carpenter等. (1997),Pharm.Res. 14: 969-975;Wang (2000), Int. J. Pharmaceutics 203: 1 -60;並びにTang及びPikal (2004), Pharm. Res. 21: 191-200.が参照される。

いくつかの因子は、タンパク質医薬製品のための製剤設計及びプロセス設計と考えられ得る。第１の関心は、製造、輸送及び操作ステップのいくつか又は全てのステップの安定性であり、それは、組成物の調製、凍結、乾燥、保存、輸送、再構成、凍結融解サイクル、及びエンドユーザによる再構成後の保存を含み得る。他の潜在的に考慮される事項は、患者に投与するための最終製品の組成物の製造、輸送及び流通の容易性及び経済性、並びに、再構成における凍結乾燥製剤の可溶性を含むエンドユーザの使用における容易性を含む。

液剤は、特定の目的を満たし得る。液剤の考えられる利点は、製造における容易性及び経済性、並びにエンドユーザのための利便性を含む。長期間の保存の際に、度々、ポリペプチドは溶液中で不安定となる(Manning等(1989),Pham. Res. 6: 903-918)。従って、より長い保存期間を許容するために、乾燥、例えば凍結乾燥等の追加の加工ステップが開発されてきた。凍結乾燥製剤も、特定の利点を有する。凍結乾燥の潜在的な利点は、タンパク質の安定性の改善、並びに輸送及び保存の容易性及び経済性を含む。しかしながら、凍結乾燥された医薬組成物は、エンドユーザのための利便性はより小さいかもしれない。

組成物の基本型（例えば、凍結乾燥型、液体型及び凍結型等）の選択に加えて、タンパク質製剤の最適化は、一般に、タンパク質の安定性を最大にするために、製剤の組成及びそれらそれぞれの濃度を変えることを含む。イオン強度、ｐＨ、温度、凍結融解サイクル、せん断力、凍結、乾燥、撹拌及び再構成を含む多様な因子が、タンパク質の安定性に影響し得る。タンパク質の不安定性は、物理的劣化（例えば、変性、凝集若しくは沈殿）又は化学的劣化（例えば、アミド分解、酸化若しくは加水分解）により引き起こされ得る。製剤の組成及び濃度の最適化は、単に実験による研究及び／又は不安定性の原因を解決するための合理的なアプローチに基づく。

液体及び凍結製剤を含む、ポリペプチドを含む医薬組成物の長期保存において、時々、活性ポリペプチドが凝集及び／又は分解のため失われ得る。

従って、ポリペプチドの安定性を改善するために一般的に行われることは、製剤に用いられる要素の濃度を変えること、又は製剤の改変のために賦形剤を加えることによる処理がなされ得る(米国特許5,580,856及び6,171,586、並びに米国特許出願 US 2003/0202972及びUS 2003/0180287)。米国特許5,580,856は、再水和の際又は後に乾燥されたタンパク質を安定にするために加えられる天然ポリマー、界面活性剤、硫酸化多糖、タンパク質及び緩衝剤等の物質の基本型の適用である。しかしながら、多くの見解の他に、米国特許5,580,856は、再水和安定剤がそのタンパク質に加えられるべきことを教示していない。従って、熟練した読者が多くの見解に気付かされる一方、彼又は彼女は、彼の／彼女のタンパク質のために米国特許5,580,856に記載された多くの見解のうち最も良い条件を見つけ出さなければならない。米国特許出願US 2003/0202972には、抗Ｈｅｒ２抗体の安定な凍結乾燥製剤について記載されており、その安定剤は、糖、トレハロース又は緩衝剤である。これらの安定剤は抗体には有益となり得るが、それらが他のタンパク質に適用できるとは推定できない。米国特許出願US 2003/0180287は、米国特許出願US 2003/0202972と類似しており、それには、イムノグロブリン様タンパク質、すなわちＦｃドメインを含むタンパク質の安定溶液が記載されている。安定剤には、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム若しくはカリウム、マレイン酸、酢酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ緩衝剤、酢酸、ジエタノールアミン、ヒスチジン、リジン、又はシステインが用いられ得る。熟練した特赦により選択され得るこれらの化学的に性質が異なる安定剤のうち、リジンが適当であるとわかった。しかしながら、US 2003/0202972と同じく、特定の安定剤は、特定のタンパク質、その特許出願ではＦｃドメインを含むタンパク質に適するだけであり、他のタンパク質に適用できるとは推定できない。従って、添加剤の使用が、特定のタンパク質から他の関連が無いタンパク質にまで適用できると推定できない。実際に、添加剤を使用が、良好な条件の保存状態であっても、非活性ポリペプチドを生じ得る。さらに、凍結乾燥の場合、再水和ステップが、例えば凝集又は変性によりポリペプチドの非活性化を引き起こす状態にし得る(Hora等. (1992),Pharm. Res., 9: 33-36; Liu 等. (1991), Biotechnol. Bioeng., 37: 177-184)。実際に、ポリペプチドの凝集は、免疫原性を引き起こし得るので望ましくない。(Cleland等. (1993), Crit. Rev.TherapeuticDrug Carrier Systems, 10: 307-377;及びRobbins等. (1987), Diabetes, 36: 838-845)。

医薬製品の開発及び製造の際における生物活性の維持は、高分子の固有の安定性、及び用いられた安定化技術に依存する。タンパク質の安定化技術の範囲は、タンパク質の水溶液又は懸濁液に化学的「安定剤」を添加することを含む。例えば、米国特許4,297,344には、選択されたアミノ酸を添加することにより、熱に対する凝固因子II及びVIII、抗トロンビンIII及びプラスミノゲンを安定化することが開示されている。米国特許4,783,441には、表面活性物質を添加することにより、タンパク質を安定化する方法が開示されている。米国特許4,812,557には、ヒト血清アルブミンを用いてインターロイキン２を安定化する方法が開示されている。凍結融解法において、製剤が凍結保護剤と混合される、及び非常に低温で保存されることがタンパク質を安定化する他の選択肢である。しかしながら、全てのタンパク質が凍結融解サイクルにおいて活性が残存するとは限らない。通常はグリセロールである凍結保護添加剤を用いた低温保存は、さらなる選択肢である。米国特許5,098,893に記載されたようなガラス形態での保存も行われ得る。この場合、タンパク質は、アモルファス状態又はガラス状態である水溶性、又は水を含んで膨張する性質を有する物質に溶かされる。タンパク質の安定化のために最も広く用いられている方法は、凍結乾燥（freeze-drying又はlyophilisation）である。十分なタンパク質の安定性が水溶液中で示されないときはいつでも、凍結乾燥が最も実行可能な代替案となる。凍結乾燥の１つの不利な点は、洗練された加工が必要であり、時間が掛かり、コストも掛かる。さらに、凍結乾燥が慎重に行われない場合、ほとんどの製剤は、その技術における凍結及び脱水ステップにより少なくとも部分的に変性する。その結果、度々、タンパク質分子の一部が不可逆的に凝集し、非経口投与に適しない製剤が生じる。

一般に、タンパク質の分解は、文献によく記載されてきたが、特にCD-RAP/MIA（さらに言うとCD-RAP）の保存性及び可溶性は記載されていない。CD-RAPは、悪性メラノーマ細胞、及び軟骨細胞から分泌された小分子で可溶性のタンパク質である。近年の証拠は、ＳＨ３ドメイン様の折り畳みの形をとる細胞外タンパク質のスモールファミリーのプロトタイプとしてCD-RAPを同定している。CD-RAPと細胞外マトリクスタンパク質における特定のエピトープとの間の相互作用は、腫瘍細胞と軟骨細胞との付着を制御すると考えられている(Moser 等. (2002),Mol Cell Biol. 5:1438-45)。一方、CD-RAP関連タンパク質は、US 2002/0103360及びWO 2004/015078から周知である。しかしながら、両方の出願では、CD-RAP関連タンパク質の安定製剤について言及されていない。これまで、CD-RAPのリポソームに基づいた製剤がWO 2008/040556から周知である。特に、再構成後のCD-RAPを含む大きいマルチラメラベシクルを備えた乾燥医薬組成物が開示されており、そのCD-RAPタンパク質は、所望の部位で長期間の活性を維持できるために、維持されたCD-RAPの輸送を目的としてリポソームに被包される、及び／又は封入される。CD-RAPの１つの機能は、間葉系幹細胞における走化性因子として作用することである。CD-RAPは、マウス又はヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）の分化を誘導できない一方、間葉系幹細胞の分化の際に骨形成タンパク質（ＢＭＰ）２及び形質転換成長因子（ＴＧＦ）β３の作用を促進し、造骨性の分化を阻害する一方で軟骨形成のフェノタイプを支持する。さらに、CD-RAPは、ＢＭＰ２の骨形成の潜在力を阻害して、ＢＭＰ２処理されたＨＭＳＣ培養物におけるオステオポンチン及びオステオカルシンの遺伝子発現をダウンレギュレートする。ヒト初代軟骨細胞の場合、CD-RAPは、グリコサミノグリカン量を増大して、細胞外マトリクス堆積を刺激する。従って、CD-RAPは、軟骨形成のための分化及び軟骨の維持の際に、重要な制御因子となると信じられている。従って、CD-RAPは、軟骨の修復のための有望な因子の候補となると信じられている。従って、長期間の保存に対して安定な十分な量のCD-RAPを備えている入手可能な医薬組成物を得ることが望まれる。実際に、高濃度のCD-RAPを有する安定な製剤は、患者により少ない量を注入することが可能となり、多量の注入による痛み等の副作用を低減し、各用量の増大を当然に許容する。

さらに、本発明に至るまで、タンパク質を安定化する薬剤、及び安定性を維持すると共に高濃度のタンパク質を許容する薬剤の多くの選択肢が得られることは、本技術分野において周知であった一方で、高濃度でCD-RAPタンパク質を備えた製剤が不安定となり得ること、また、このため、改良が必要であることが認知されていなかった。

従って、本発明の技術的課題は、上述のニーズに応じることである。

本発明は、これらのニーズに取り組み、技術的問題の解決法として、製剤、並びに、CD-RAPの投与が有効である病気に苦しめられている患者の治療に、これらの製剤を適用する方法及び用途に関して実施形態を提供する。これらの実施形態は、本明細書において特徴付けられ、説明され、実施例で例証され、特許請求の範囲に示されている。

本明細書において用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうでないことが示されていなければ、複数のものを含むものとすることを留意しなければならない。従って、例えば「抗体（an antibody）」という場合、１つ又はそれ以上のそのような種々の抗体を含み、「方法（the method）」という場合、本明細書に記載された方法から改変又は置換され得る当業者に周知の同等のステップ及び方法を含む。

この開示において引用された全ての刊行物及び特許は、それらの全体が参照として組み込まれる。参照として組み込まれた資料が否定する又は本明細書に反する範囲で、本明細書がそのような資料に取って代わる。明記が無い限り、一連の要素の前の「少なくとも」の用語は、一連の要素の全てをいうと理解される。当業者は、本明細書に記載された発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識し、ルーチンの試験を用いて確認できるだろう。そのような同等物は、本発明に含まれると意図される。

本明細書及び以下の特許請求の範囲の始めから終りまで、文脈から他の意味が要求されている場合を除き、「含む（comprise）」、並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」等の変化形は、述べられた整数若しくはステップ、又は複数の整数若しくは複数のステップの群を含むが、他の整数若しくはステップ、又は複数の整数若しくは複数のステップの群を除かないことを意味すると理解されるだろう。本明細書で用いられる「含む（comprising）」の用語は、「含む（containing）」、又は、時々「有する（having）」と置換され得る。

ここで、「からなる（consisting of）」が用いられている場合は、特許請求の範囲の要素に規定されていない要素、ステップ又は成分を除く。ここで、「実質的に〜からなる（consisting essentially of）」が用いられている場合は、特許請求の範囲の基本及び新規の特徴に全く影響を与えない材料又はステップは除かない。本明細書において、いかなる場合においても、「含む（comprising）」、「実質的に〜からなる（consistingessentially of）」及び「からなる（consisting of）」のいずれも、他の２つの用語のいずれかと置換し得る。

本明細書で用いられるように、記載された複数の要素の間における結合的用語である「及び／又は（and/or）」は、個々の及び結合された選択肢の両方を含むように理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は（and/or）」により結合されている場合、第１の選択肢は、第２でなく第１の要素の適用を意味する。第２の選択肢は、第１でなく第２の要素の適用を意味する。第３の選択肢は、第１の要素と第２の要素の両方の適用を意味する。これらの選択肢のいずれか１つが意味に属すると理解され、従って、本明細書で用いられる「及び／又は（and/or）」の用語の要件を満たす。１つより多い選択肢の同時の適用も、意味に属すると理解され、従って、本明細書で用いられる「及び／又は（and/or）」の用語の要件を満たす。

いくつかの文献は、本明細書の本文の至るところで引用される。本明細書で引用された文献（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書及び説明書等を含む）のそれぞれは、本明細書の前後を問わず、それらの全体を参照として本明細書に組み込まれる。先行発明による当該開示に先行する権限は本発明にはないと認めるように、本明細書中のいかなる内容も解釈されない。

多量の注入による痛み等の副作用を低減するためにそれらを必要とする患者に注入される際に、より少ない量にすることが可能となるために多量のCD-RAPを有する製剤を提供するという目的を有する本発明者らは、CD-RAPタンパク質が高濃度では不安定となり、また、長期間の保存に対しても不安定となり得ることに気付いた。

そのため、本発明者等は、高い濃度で安定な製剤を提供することを目的とする、従って望まれない観察結果を改良することを目的とする彼らの研究の間、CD-RAPの特定の不安定性を観察した。従って、彼らは、溶液、すなわち溶解段階で維持する一方、CD-RAPを濃縮することを目的とした。そうすることで、多くの選択肢及び得られる代替案のいずれかが対象の問題を解決するのに適当であるだろうということの示唆がなくても、彼らは、多くの選択肢及び得られる代替案を有した。

「溶解段階」は、好ましくは少なくともCD-RAPの濃度が5 mg/mlのCD-RAPタンパク質溶液であり、すなわち、CD-RAPタンパク質が製剤の水溶液（すなわち水相）に直接に溶解された及び／又は分散されていることを意味する。好ましくは、CD-RAPタンパク質は、均一に溶解及び／又は分散されている。均一とは、CD-RAPタンパク質の濃度の量（「ｃ」）（モル質量の場合は「ｎ」又は質量の場合は「ｍ」）が、水溶液の体積（「ｖ」）とほぼ同一、好ましくは同一であり、すなわち、c=n/v又はc=m/vのそれぞれは、ほぼ一定であり、好ましくは一定であるように、安定な水性製剤に溶解及び／又は分散されたCD-RAPタンパク質がほぼ均等に、好ましくは均等に、水性製剤に分布されていることを意味する。好ましくは、製剤中に濃度勾配がない。

従って、CD-RAPタンパク質を含む本発明の安定水性製剤は、好ましくは水溶液としてみなされ、CD-RAPはその中に直接に溶解及び／又は分散されている。

より好ましくは、本発明の安定水性製剤は、5 mg/mlのCD-RAPタンパク質及び荷電アミノ酸を有する水溶液としてみなされ得る。これは、その製剤が水溶液に基づいており、少なくとも5 mg/mlのCD-RAPタンパク質が少なくとも荷電アミノ酸と共に溶解及び／又は分散されていることを意味する。

あるいは、本発明の安定水性製剤は、より好ましくは、水溶液に基づく安定な製剤であり、その製剤は少なくとも5mg/mlの濃度（重量／体積）のCD-RAPタンパク質及び荷電アミノ酸を含むことを意味する。

「溶液」は、１つ、２つ又はそれ以上の物質／成分の均一な混合液である。そのような混合液において、溶質（本発明においてはCD-RAPタンパク質であり、好ましくは少なくとも5 mg/mlのCD-RAPタンパク質である）は、溶媒として知られる他の物質（本発明においては好ましくは水性製剤である）に溶解されている。

上記のことから、CD-RAPタンパク質は、好ましくは、水溶液に不均一に溶解及び／又は分散している。「溶解状態」の用語はCD-RAPタンパク質が好ましくは実質的に乳化されていない、又はより好ましくは水溶液中で全く乳化されていないことを含む。

また、「溶解状態」の用語は、CD-RAPタンパク質は、好ましくは実質的に、例えばリポソーム又はマルチラメラリポソーム等に被包及び／又は封入されていない（好ましくは２％未満、１％未満又は０．５％未満のCD-RAPタンパク質が被包及び／又は封入されている）、又はより好ましくは、全く被包及び／又は封入されていない。

従って、好ましい態様において、本発明は、実質的にリポソームフリー（好ましくは２％未満、１％未満又は０．５％未満のリポソームを含む）、好ましくはリポソームフリーであり、少なくとも5 mg/mlのCD-RAPタンパク質及び荷電アミノ酸を備えた安定水性製剤を含む。

代替のより好ましい態様において、本発明は、少なくとも5mg/mlのCD-RAPタンパク質及び荷電アミノ酸を備えた安定水性製剤を含み、CD-RAPタンパク質は、リポソームに実質的に含まれない（好ましくは２％未満、１％未満又は０．５％未満）、好ましくは含まれない（被包されていない及び／又は封入されていない）。

実際に、タンパク質が不安定になり得る多くの方法がある。例えば、タンパク質の不安定性はタンパク質の凝集により、また、脱アミノ化、酸化、ジスルフィド結合の切断及び形成、加水分解、スクシンイミド化、非ジスルフィド架橋、脱グルコシル若しくは「酵素的褐変」（メイラード反応）又はこれらの現象の組み合わせにより引き起こされ得る。例えば、Wang 等. (1999), Int. J. Pharm. 185:129-188)及び図１を参照できる。さらに、温度等の物理化学のパラメータ、ｐＨ値、表面吸着、塩、金属イオン、キレート剤、せん断力等の物理的な力、タンパク質変性、非水性溶媒、タンパク質濃度、タンパク質の起源及び純度、タンパク質の、タンパク質モルフィズム又は圧力は、タンパク質の安定性に影響し得る。

そのタンパク質の安定性に影響し得る多くの因子だが、その多くの基準がタンパク質を安定にするために取られ得る。例えば、タンパク質は（荷電アミノ酸により）内部的に又は外部的に安定化され得る。外部的安定化は、キレート剤、金属イオン、還元剤、ポリマー、ポリエチレングリコール／ポリオール、血清アルブミン、界面活性剤、糖及びポリオール、脂肪酸及びリン脂質、アミノ酸、並びに緩衝剤等により達成され得る。例えば、Wang, Y 及びHanson M (1988), J. ParentalSci.& Technology, 42, Supplement: 4-26; Wang等.(1999),Int. J. Pharm. 185: 129-188, 並びに図２を参照できる。要するに、製剤におけるCD-RAPタンパク質を安定化するために、熟練した人は、多くの得られる選択肢を有するだろう。

本件において、発明者等は、CD-RAPタンパク質が凝集を示したことを観察した。多くの種々の因子がタンパク質製剤におけるタンパク質の凝集を引き起こし得る。通常の精製及び保存方法は、タンパク質の凝集を引き起こす条件及び成分にタンパク質製剤を曝露し得る。例えば、タンパク質製剤におけるタンパク質は、以下の１つ又はそれ以上のうちのいずれかの結果として凝集し得る。それは、保存、高温への曝露、製剤のｐＨ、製剤のイオン強度、並びに特定の界面活性剤（例えばポリソルベート２０及びポリソルベート８０）及び乳化剤の存在である。同様に、タンパク質は、溶液での凍結乾燥されたタンパク質ケーキの再構成、タンパク質サンプルの濾過精製、凍結融解、振とう、又はシリンジを介したタンパク質溶液の移送等のせん断応力に曝露される際に凝集し得る。凝集は、保存瓶中の溶液及び液体−気体界面におけるポリペプチド分子同士の相互作用の結果としても起こり得る。立体構造の変化は、輸送のときの揺動で生じる界面の圧縮又は拡張の際、気体−液体及び個体−液体界面に吸着されたポリペプチドにおいて起こり得る。そのような揺動
は、製剤のタンパク質が他の吸着されたタンパク質と共に凝集し、沈殿することで起こり得る。

さらに、タンパク質製剤の光への曝露がタンパク質の凝集を引き起こし得る。従って、本発明は、CD-RAPを高濃度にでき、タンパク質の凝集を低減する製剤を提供する。理論に縛られることなく、タンパク質の凝集の低減は、１つ又はそれ以上の上述の凝集メカニズムを制御することにより達成される。これは、例えば、製品の安定性の改善及び製造プロセス及び保存条件におけるより大きな柔軟性を生じ得る。

特に、本発明者らは、多くの試験された薬剤のうち、ｐＨが約６から８までにおいて正味電荷を帯びているアミノ酸が、特に、タンパク質溶解性を媒介する及び／又はタンパク質の凝集を阻害することにより高濃度におけるCD-RAPタンパク質を安定化するのに有益であることがわかった。本明細書で述べられたアミノ酸は、好ましくはＬ−アミノ酸であることを意味する。Ｄ−アミノ酸はあまり好ましくない。好ましくは、アミノ酸は、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン酸又はそれらの塩であり、好ましくは、その塩は塩化物、リン酸塩、酢酸塩又は硫酸塩である。

従って、本発明は、少なくとも部分的に、少なくとも5 mg/mlのCD-RAP及び荷電アミノ酸又はその塩、好ましくは、その塩は塩化物、リン酸塩、酢酸塩又は硫酸塩であり、より好ましくは、さらに緩衝剤、二糖類、増量剤及び選択的に界面活性剤を備えた製剤は、長期の保存及び／又は１回又はそれ以上の凍結融解サイクルに対して十分な安定性が与えられることの発見に基づく。本発明の製剤は、標準の緩衝化された製剤に対して多くの利点を有する。一態様において、製剤は、高濃度の、例えば30 mg/ml又はそれ以上のCD-RAPタンパク質を含む。驚いたことに、高濃度のタンパク質にもかかわらず、その製剤はわずかの凝集を生じ、種々の方法及び形態を用いて、例えば凍結により、高濃度のタンパク質製剤で予測される悪影響が無く保存され得る。

あまり好ましくない実施形態において、本発明の製剤は、例えば界面活性剤及び緩衝剤系等の賦形剤を必要とせず、それは、溶液中のタンパク質を安定化するために従来の製剤に用いられている。さらに、本明細書において記載された製剤は、タンパク質の安定化のために必要とされる添加剤を欠いているため、免疫原性が低減されるので標準の製剤よりも好ましい。

従って、本発明は、液体製剤、好ましくは、少なくとも5 mg/mlの濃度、好ましくは少なくとも7.5mg/mlの濃度、より好ましくは少なくとも10mg/mlの濃度、さらにより好ましくは少なくとも15mg/mlの濃度、特に好ましくは少なくとも20mg/mlの濃度、特により好ましくは少なくとも25mg/mlの濃度、さらに特により好ましくは少なくとも30mg/mlの濃度のCD-RAPポリペプチド又は以下に記載された配列番号１の１２〜１０７のアミノ酸のCD-RAPの４つのシステイン骨格と少なくとも６３％の配列相同性があるアミノ酸配列を有するCD-RAPポリペプチドの生物学的活性アナログ、及び荷電アミノ酸又はその塩、好ましくは塩化物、リン酸塩、酢酸塩若しくは硫酸塩の長期間の保存を可能とする安定液体製剤に関する。多量の注入による痛み等の副作用を低減するために、この製剤のCD-RAPポリペプチドが高濃度に濃縮されて、患者に用いるのにより便利であるため、部分的に、この製剤は有益である。さらに、関節内注射を用いて、動的流体の低いレベルの圧力での患者への製剤の適用は、軟骨形成を増強する。

本発明の製剤（時々、本明細書において「組成物」又は「成分」ともいう）は、液体、凍結状態、凍結乾燥体（lyophilized）、凍結乾燥体（freeze-dried）、スプレードライ体、及び好ましくは液体と凍結乾燥体とを用いた再構成製剤等の種々の物理的状態に好ましくはなり得る。好ましくは、その製剤は、ｐＨ６．０以上、さらに好ましくは、ｐＨ５．５〜９．０であり、より好ましくは、ｐＨ６．０〜８．０、さらにより好ましくはｐＨ６．５〜７．６、最も好ましくはｐＨ７．０〜７．５である。

本明細書で用いられる「液体製剤」は、それらのうちの構成分子の自由運動により特徴付けられるが室温で分離する傾向がない液体として知られる組成物をいう。液体製剤は、水性及び非水性液体を含み、好ましくは水性製剤である。水性製剤は、溶媒が水である製剤である。製剤中でのCD-RAPポリペプチドの溶解は、均一又は不均一であるが、上述のように好ましくは均一である。

適当な非水性液体は、本発明の製剤に安定性を提供する限り用いられ得る。好ましくは、非水性液体は親水性液体である。適当な非水性液体の実例は、グリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＭＳ）、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２００，ＰＥＧ３００及びＰＥＧ４００等のエチレングリコール類、並びにジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）４２５及びＰＰＧ７２５等のプロピレングリコール類を含む。

本明細書で用いられる「混合された水性／非水性液体製剤」は、水及び追加の液体成分の混合物を含む液体製剤をいう。

本明細書で用いられる「製剤」は、CD-RAPポリペプチド（すなわち、活性薬剤／物質）とさらなる化学物質及び／又は好ましくは液体状態である医薬製品に必要な添加物の混合物である。本発明の製剤は、医薬製剤を含む。「医薬製剤」の用語は、活性成分の生物活性を有効にするような形態の製剤をいい、従って、本明細書に記載されるように治療用途で患者に投与され得る。

製剤の調製は、活性薬物を含む種々の化学物質が医薬成分等の最終医薬製品を製造するために組み合わされるプロセスを含む。本発明の製剤の活性薬物は、CD-RAPポリペプチドである。「ポリペプチド」の用語は、「タンパク質」と互換的に用いられ得る。また、それは、本明細書で用いられるように、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び融合タンパク質を含む。タンパク質は、組み換え法又は合成法により作製され得る。

特定の実施形態において、製剤化されるためのCD-RAPタンパク質は、実質的に純粋及び／又は実質的に均一である（すなわち、実質的に混在タンパク質等が含まれない）。「実質的に純粋な」タンパク質の用語は、タンパク質分画の少なくとも約８０重量％、好ましくは９０重量％、好ましくはタンパク質分画の少なくとも約９５重量％、より好ましくはタンパク質分画の少なくとも約９７重量％、又は最も好ましくはタンパク質分画の９８重量％を含む成分を意味する。「実質的に均一な」タンパク質の用語は、溶液中の種々の安定剤及び水の質量を除いて、タンパク質分画の少なくとも約９９重量％を含む成分を意味する。

本発明の製剤のCD-RAPポリペプチドは、本技術分野（欧州特許EP-B1 710 248又はEP-B11146 897を参照）において周知である及び／又は本明細書に記載されている。本発明の製剤に適用されるCD-RAP（軟骨由来レチノイン酸感受性タンパク質）ポリペプチドは、CD-RAPポリペプチドであり、ＭＩＡ（メラノーマ阻害活性）ＯＴＯＲ（繊維細胞由来タンパク質、ＦＤＰ、ＭＩＡ様、ＭＩＡＬ）、並びにBosserhoff等.(2004), Gene Expr. Patterns. 4:473-479; Bosserhoff及びBuettner (2003), Biomaterials 24:3229-3234; Bosserhoff等. (1997), Dev. Dyn. 208: 516-525;WO 00/12762; WO 2004/015078; EP-B1710 248; US 2002/0103360; 又は EP-B1 1 146 897)に記載されるような分泌タンパク質のクラスに属するＴＡＮＧＯ１３０とも呼ばれる。本発明の製剤に適用されるCD-RAPタンパク質は、好ましくは、組換え型ヒトCD-RAPタンパク質（rh CD-RAP）である。

本発明の製剤のCD-RAPポリペプチドは、CD-RAPの成熟配列（配列番号１）及び機能的断片又はその変異体を備える又は有するポリペプチド、ｂ）配列番号１の１２〜１０７番のアミノ酸であるCD-RAPの４つのシステイン骨格と少なくとも６３％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の相同性のあるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はｃ）本明細書で定義されたジェネリック配列１〜３（配列番号２、３及び４）のいずれかを有するポリペプチドであることが好ましい。CD-RAPの変異体は、WO 2004/015078に記載された配列番号４若しくはその成熟型を有するタンパク質、又はUS 2002/0103360に記載された配列番号１４若しくはその成熟型を有するタンパク質である。

本明細書において同定されたCD-RAP配列に関して「パーセント（％）アミノ酸配列の相同性」とは、配列の同一性の一部として保存的な置換を考えることなく、最大限の同一の割合を達成するために、もし必要であれば、配列のアライメント及びギャップの導入後の、候補配列におけるCD-RAP配列のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列の同一性の割合を決定するためのアライメントは、当業者の技術範囲内である種々の方法で、例えばBLAST、ALIGN又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェア等の公に入手可能なソフトウェアを用いて達成され得る。当業者は、比較される配列の全長に対する最大限のアライメントを達成するのに必要なアルゴリズムを含むアライメント測定のために適当なパラメータを決定できる。

CD-RAPと同一の生物学機能を有する機能的断片は、好ましくは、少なくとも２０の、特に少なくとも４０の、より好ましくは少なくとも５０の、最も好ましくは８０の連続した配列番号１に示す配列のアミノ酸を有する。好ましくは、その機能的断片は、配列番号１の１〜５０、１〜７０、１〜８０、２０〜８０又は２０〜１０７番目のアミノ酸を含む。

成熟CD-RAP配列（配列番号１）：
GPMPKLADRKLCADQECSHPISMAVALQDYMAPDCRFLTIHRGQVVYVFSKLKGRGRLFWGGSVQGDYYGDLAARLGYFPSSIVREDQTLKPGKVDVKTDKWDFYCQ
ジェネリック配列１（配列番号２）
C X₄ C X₁₇ C X₁₂ V X _11-13W X_7-18 F X₄V X₂₁ C X
ジェネリック配列２（配列番号３）
K X C XD X E CX₁₁ D X₃ P D C X₁₂ V X₂ K LX_7-9W X G S X_5-13 G Y F P X₃
V X₁₈DF X C X
ジェネリック配列３（配列番号４）
K X C XD X₂C X₈ A X₂ D X₃ P D C R F X₅G X V X₅K L X₇ W X G S V X₁₂ G Y F P X₂₂
D F X CQ
それぞれ独立して現れる「X」は、アミノ酸のいずれかを表し、下付きの数字は、アミノ酸の数を示す。好ましくは、「X」は、自然発生のアミノ酸、特にA、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y又はVを表す。「X」は、ランチオニン、２−アミノイソブチル酸、デヒドロアラニン、オルニチン、シトルリン、ベータアラニン又はノルロイシン等の非標準のアミノ酸をも意味し得る。当然に、本技術分野において一般に知られている翻訳後の修飾は予想される。従って、本発明のCD-RAPポリペプチドは、翻訳後に修飾され得る。ソブチル酸、デヒドロアラニン、オルニチン、シトルリン、ベータアラニン又はノルロイシン等の非標準のアミノ酸をも意味し得る。当然に、本技術分野において一般に知られている本発明の製剤におけるアライメントされたCD-RAPタンパク質は、原核又は真核宿主細胞における未変化又は切断されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡから発現され得る。タンパク質は、培養培地又は封入小体から単離され得る、及び／又は生物活性成分を生成するために再び折り畳まれ得る。CD-RAPの組換えタンパク質の精製のプロトコールの例としては、例えばEP-B1710248及びLougheed等. (2001), Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A98: 5515-5520を参照できる。そのように単離されたタンパク質の活性（例えば軟骨形成）を試験する方法の詳細な説明は、Tscheudschilsuren等. (2005), Exp. Cell Res.1-10; 又はStoll等.(2003), ProteinSci. 12: 510-519に記載されている。軟骨誘導のためのバイオ試験は、EP-B11 146 897の実施例２〜５に記載されている。さらに、バイオ試験は、以下に記載され、また、実施例７及び８に記載されている。

ポリペプチドを生成するための一般的な細胞工学の方法は、本技術分野において周知である。例えば、Ausubel等編集. (1990), Current Protocols inMolecularBiology (Wiley, New York)を参照できる。そのような方法は、ポリペプチドの発現がコードされ、発現を可能とする核酸を生きた宿主細胞に導入することを含む。それらの宿主細胞は、培養液中で増殖する細菌細胞、真菌細胞、又は好ましくは、動物細胞である。細菌宿主細胞は、以下のものに限られないが、Escherichiacoli細胞を含む。適当なE.coli株の例は、HB101、DH5a、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539及び外来ＤＮＡを切断できないE.coli株のいずれかを含む。用いられ得る真菌細胞は、以下のものに限られないが、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris及びAspergillus細胞である。用いられ得る動物細胞株の数個の例は、CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3、及びWI38である。新規の動物細胞株は、当業者に周知の方法（例えば、形質転換、ウィルス感染及び／又はセレクション）を用いて樹立され得る。任意に、ポリペプチドは、宿主細胞により培地中に分泌され得る。

イオン交換カラムの分画法、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ、シリカを用いたクロマトグラフィー、へパリンSEPHAROSETを用いたクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）を用いたクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法等のポリペプチドを精製するための技術は、必要に応じて利用され得る。本発明の製剤に適用されるCD-RAPタンパク質は、EP-B1 1 697 523の実施例に記載されているように、発現及び精製され得る。

いくつかの実施形態において、本発明に製剤中のCD-RAPタンパク質の濃度は、少なくとも5 mg/mLであり、好ましくは少なくとも7.5 mg/mLであり、より好ましくは少なくとも10 mg/mLであり、さらにより好ましくは少なくとも15 mg/mLであり、特に好ましくは少なくとも20 mg/mLであり、特により好ましくは少なくとも25 mg/mLであり、さらに特により好ましくは少なくとも30 mg/mLである。

いくつかの実施形態において、本発明の製剤中のCD-RAPポリペプチドの濃度は、以下の範囲から選択される。その範囲は、約5 mg/mLから約10 mg/mL、約10 mg/mLから約20 mg/mL、約15 mg/mLから約25 mg/mL、約20 mg/mLから約30 mg/mL又は約5 mg/mLから約30 mg/mLである。

好ましい態様において、CD-RAP製剤、特に本発明の安定水性製剤は、リポソーム及び／又はマトリックス材料を含まない。好ましくは、本発明のCD-RAP製剤は、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、コラーゲン、へパリン、フィブリン、フィブリニゲン、脱灰骨、ポリ乳酸コグリコイド誘導体、又はそれらの組み合わせの群から選択されるリポソーム及び／又はマトリックス材料を含まない。より好ましくは、CD-RAP製剤は、脂質二重層を含まない。

さらに好ましい態様において、CD-RAPタンパク質は、好ましくは350-420 mMの濃度のアルギニン／Ｈ_３ＰＯ_４中に、1.0 mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5 mg/mL、3.0 mg/mL、3.5 mg/mL、4.0mg/mLを含む1-4 mg/mLの濃度で含まれない。より好ましくは、CD-RAPタンパク質は、350 mM又は420 mMのアルギニン／Ｈ_３ＰＯ_４ｐＨ７．５中に1.15 mg/mL 又は3
mg/mLの濃度で含まれない。

本明細書で用いられる「約」の用語は、所定の値の５％、１０％、１５％又は２０％に至るまで及び２０％となり得る記載された製剤のCD-RAPタンパク質の濃度の変化が起こり得ることを意味すると理解される。例えば、約5mg/mLCD-RAPタンパク質を有する製剤である場合、製剤が3〜7mg/mL、より好ましくは4〜6mg/mLのCD-RAPタンパク質を有することを意味すると理解される。従って、本明細書で用いられように、「Ｘ〜Ｙ」と規定された濃度の間隔は、「ＸとＹとの間」と規定された間隔と同一視される。両方の間隔は、特に、上限及び下限の両方を含む。これは、例えば「5 mg/mL〜10 mg/mL」の間隔又は「5 mg/mL〜10 mg/mL」の間は、5、6、7、8、9、及び／又は10 mg/mLの濃度を含むことを意味する。

「安定」な製剤は、それらの中のタンパク質がその保存における物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物学的安定性を本質的に維持する、及び／又は好ましくは色及び／又は透明性の外観検査、ＵＶ光散乱又はサイズ排除クロマトグラフィーにより測定されることによってコントロールサンプルと比較して実質的に凝集、沈殿及び／又は変性が見られないものの１つである。タンパク質の安定性を測定するための種々の更なる分析技術は、本技術分野において入手可能であり、例えばPeptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed.,MarcelDekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)及びJones,A.Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)に概説されている。

好ましくは、本発明の製剤に関して「安定」の用語は、その製剤のCD-RAPポリペプチドが、保存の開始及び／又は凍結融解の間若しくはその後におけるCD-RAPポリペプチドの活性と比較して、保存の間に生物学的活性の１５％、より好ましくは１０％、さらにより好ましくは５％、また、最もより好ましくは３％より多く失わないことを意味すると理解される。CD-RAPの生物学的活性は、例えば、EP-B1 1 146 897の実施例２〜５に記載されている軟骨誘導のためのバイオ試験により測定され得る。他のバイオ試験は、Stoll 等., (2006), Biol. Chem., Vol. 387の1601〜1606頁又は実施例７及び８に記載されている浸潤試験である。

本明細書で用いられる「保存の間」とは、一度調製された製剤がすぐに用いられない、むしろ、その調製後、液体型、凍結状態、又は液体又は他の形態の中に再構成される乾燥型のいずれかでの保存のために包装されていることを意味する。

「繰り返しの凍結融解サイクル」は、本発明の製剤が１回又はそれ以上の凍結融解サイクル、例えば１回、２回、３回、４回、５回又はそれ以上の凍結融解サイクルを受けることを含む。しかしながら、本明細書に記載されるように、また実施例に示されるように、本発明の製剤は、繰り返しの凍結融解サイクルに対する安定性を維持する。従って、CD-RAPポリペプチドは、繰り返し（１回、２回、３回、好ましくは４回、５回又はそれ以上）の凍結融解サイクルに対して好ましくは安定であり、好ましくは凍結融解サイクルが、以下のように、各サイクルの間に１５分の等温ステップと1.0 ℃/minの冷却及び加熱速度で、５℃〜−２５℃で行われる。理論に縛られることなく、本発明の上で好適に適用される凍結融解は、多量の溶解されたタンパク質の凍結の際に生じ得る凍結ストレスをシミュレートする。従って、凍結融解サイクルの間における溶液中のCD-RAPの安定性を維持できるように本発明の製剤は作られているため、本発明の製剤は優れており、有利な特性を有している。

凝集は、例えば高温に曝露されることに起因して、保存の間に形成され得る。「高温」とは、CD-RAPポリペプチドを含む本発明の製剤が正常に保存される温度よりも高い温度を意味する。

正常な保存温度は、約４℃と１０℃との間であり、好ましくは約４℃と８℃との間であり、より好ましくは約４℃と６℃との間であり、さらにより好ましくは約４℃である。さらに、凝集の形成の原因は、製剤のｐＨ、製剤のイオン強度、特定の界面活性剤（例えばポリソルベート２０及びポリソルベート８０）及び乳化剤の存在であり、及び／又は、ポリペプチドが凝集等の形成する本来の傾向を有することによる。理論に縛られることなく、CD-RAPポリペプチドの凝集形成は、１つ又はそれ以上の前述の原因により引き起こされ得ると考えられ、また、活性の欠損を引き起こし得ると考えられる。

従って、CD-RAPポリペプチドは、保存の間及び／又は凍結融解の間若しくはその後に、（例えば１つ又はそれ以上の前述の原因により）凝集が実質的に形成されない程度又は範囲で好適に安定であることが予想される。従って、保存の開始時におけるCD-RAPポリペプチドの量と比較して、多くて１０％、より好ましくは多くて８％、さらにより好ましくは多くて５％、さらにより好ましくは多くて３％、特に好ましくは多くて１％のCD-RAPポリペプチドが凝集を形成すると好ましくは予想される。

その代わりに、CD-RAPポリペプチドは、ダイマー又はオリゴマーを形成しない範囲又は程度に好適に安定であることが予想される。言い換えれば、CD-RAPタンパク質の安定性は、分解（例えば断片化）された及び／又は凝集された低い割合のタンパク質を有する溶液中のモノマータンパク質の割合に従って決定され得る。例えば、CD-RAPタンパク質を含む本発明の製剤は、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、特に好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは９９％のモノマーCD-RAPタンパク質を含み得る。

「凝集」とは、可溶性を維持し得る又は溶液から沈殿する不溶解性の凝集物を形成する共有結合性又は非共有結合性のダイマー又はオリゴマー（すなわち、高い分子量を有する物質）の形成を引き起こすタンパク質分子同士の間の物理的な相互作用を意味する。また、「凝集」は、分解された及び／又は断片化されたCD-RAPタンパク質を含む。製剤におけるタンパク質の凝集のレベルは、本明細書において記載されているように製剤に荷電アミノ酸を追加する前に、実質的に同時に、又は後に測定され得る。特定の実施形態において、凝集のレベルは、本明細書において記載されるように製剤に荷電アミノ酸を追加した後に約１日から約１２週間の間に少なくとも１回測定される。他の実施形態において、凝集のレベルは、本明細書において記載されるように製剤に荷電アミノ酸を追加した後に約１カ月から３６カ月の間に少なくとも１回測定される。

上述のような多くの分析方法は、タンパク質を含む製剤における凝集の存在及びレベルを検出するために用いられ得る。これらは、以下のものに限られないが、例えば未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、キャピラリ−ゲル電気泳動（ＣＧＥ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、超遠心分析法（ＡＵＣ）、フィールドフロー分別法（ＦＦＦ）、光散乱検出法、沈降速度法、ＵＶ分光法、示差走査熱量測定法、比濁法、ネフェロ法、顕微鏡観察法、サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、逆相−高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、エレクトロスプレイイオン化タンデム質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）及びタンデムＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ）、フローフィールドフロー分別技術、並びに静的及び／又は動的光分散検出法を含む。

タンパク質を含む製剤における共通の問題は、時間、熱又はせん断応力による凝集の不可逆的促進である。一般に、凝集物が沈殿する際、それらは検出するのが容易な大きな粒子を形成する。より小さいほど、非共有結合性の可溶性凝集体は、大きい粒子を沈殿する前兆と度々なるが、検出する及び定量化することがより困難である。従って、タンパク質製剤におけるタンパク質凝集を検出及び定量化する方法は、評価される凝集の種類に基づいて必要となる。

上述の方法のうち、タンパク質製剤における可溶性の共有結合性凝集体の存在及び／又は量を測定するために提案される方法は、ＳＥＣ／光散乱検出法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＧＥ、ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ、ＦＦＦ及びＡＵＣである。タンパク質製剤における可溶性の非共有結合性凝集体の存在及び／又は量を測定するために提案される方法は、ＳＥＣ、ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＧＥ、ＦＦＦ、ＡＵＣ及び動的光分散検出法である。タンパク質製剤における不溶性の非共有結合性凝集体の存在及び／又は量を測定するために提案される方法は、ＵＶ分光法、比濁法、ネフェロ法、顕微鏡観察法、ＡＵＣ、及び動的光分散検出法である。

上記のことから、本発明の他の実施形態では、保存の前に本発明に従って製剤化されたCD-RAPポリペプチドの活性を試験するステップ、すなわち、少なくとも１カ月間、約３７℃と４２℃との間、好ましくは約３７℃でその成分を保存し、その時をゼロ時間とし、そのポリペプチドの安定性を測定し、ゼロ時間から１カ月時点までの安定性を比較するステップを備えた本発明の製剤におけるそのポリペプチドの安定性の加速安定試験の方法を提供する。その情報は、最初に良好な安定性を有するが、長期間の保存が良好にされないことを示すバッチ又はロットの早い排除を助ける。

さらに、本発明の製剤は、CD-RAPタンパク質が液体又は凍結状態のいずれか、好ましくは液体状態での保存中に安定であるように、改善された長期間の保存を提供する。本明細書で用いられる「長期間」の保存の用語は、製剤が少なくとも１カ月、２又は３カ月又はそれ以上、６か月又はそれ以上、また、好ましくは１年又はそれ以上保存され得ることを意味すると理解される。また、長期間の保存は、医薬組成物が２〜８℃の液体又は例えば−２０℃若しくはそれ以下の凍結状態のいずれかで保存され、それにより、製剤が本明細書に記載されるような程度に生物活性を好適に失わない、及び／又は本明細書に記載されるような程度凝集を形成しない、及び／又は本明細書に記載されるような程度にモノマーを備えていることを意味すると理解される。これらの特性のための試験は、本明細書の他の部分にも記載されている。また、製剤が１回よりも多く凍結及び融解され得ることは実施例で熟慮され、証明されている。

本発明の一態様において、製剤におけるCD-RAPタンパク質は、少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、少なくとも４カ月、少なくとも５カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月の間、液体状態で安定である。上述の期間の間の範囲、例えば９カ月等もまた、この発明の一部であることが意図される。さらに、上述の上限及び／又は下限値のいずれかの組み合わせを用いる値の範囲が含まれると意図される。好ましくは、製剤は、室温、若しくは３０℃で少なくとも１カ月間、安定であり、及び／又は約２〜８℃で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２カ月間、安定であり、又はより好ましくは約２〜８℃で少なくとも２年間、安定である。さらに、製剤は、本明細書で「凍結融解サイクル」といわれる製剤を凍結し（例えば−８０℃）、融解した後に安定であることが好ましい。

意外なことに、高濃度におけるCD-RAPタンパク質の安定化を目的としている本発明の発明者らは、ｐＨが約６と８との間で正味電荷を有するアミノ酸が、高濃度に濃縮されたCD-RAP製剤の調製を可能とし、長期間置いた製剤でのCD-RAPポリペプチドの凝集を低減する役割を果たし、それにより本明細書に記載されるように安定な製剤を可能とすることを発見した。

従って、好ましい態様において、本発明の安定な製剤に含まれた荷電アミノ酸は、ｐＨ
が約６と８との間で正味電荷を有する。

「正味電荷」の用語は、アミノ酸の性質又はタンパク質における複数のアミノ酸に依存するアミノ酸又はタンパク質の表面における正及び負の電荷がゼロでないことを意味する。正味電荷は、荷電アミノ酸の数及び同一性、ｐＨ、並びにポリペプチドの主配列内のアミノ酸の位置に依存する。特定のｐＨにおける正及び負の電荷は、バランスがとられ、その正味電荷はゼロとなるだろう。このｐＨは、タンパク質が最も低い可溶性を有する等電点と呼ばれる。

さらに好ましくは、アミノ酸又は荷電アミノ酸は、グリシン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びそれらの塩からなる群から選択される。ヒスチジン、グルタミン酸、アルギニン又はそれらの塩が特に好ましい。いくつかの実施形態において、上述のアミノ酸又はそれらの塩の組み合わせは、本発明の製剤に適用される。

更なる実施形態において、アミノ酸は、好ましくはｐＨ６．０又はそれ以上でCD-RAPの可溶性を増強する能力を保持するアルギニン、リジン又はヒスチジンのアナログである。そのようなアナログは、制限なしに、アルギニン、リジン又はヒスチジンを含むジペプチド及びトリペプチドを含む。

さらに好ましい実施形態において、アミノ酸塩は、（好ましくはｐＨ６．０〜８．０、より好ましくはｐＨ６.５〜７．５、最も好ましくはｐＨ６．０〜７．４の溶液中における）アルギニン塩化物、（好ましくはｐＨ６．０〜８．０、より好ましくはｐＨ６.５〜７．５、最も好ましくはｐＨ６．０〜７．４の溶液中における）アルギニンリン酸塩、（好ましくはｐＨ６．０〜８．０、より好ましくはｐＨ６.５〜７．５、最も好ましくはｐＨ６．０〜７．４の溶液中における）ヒスチジンリン酸塩、（好ましくはｐＨ６．０〜８．０、より好ましくはｐＨ６.５〜７．５、最も好ましくはｐＨ６．０〜７．４の溶液中における）ヒスチジン塩化物、（好ましくはｐＨ６．０〜８．０、より好ましくはｐＨ６.５〜７．５、最も好ましくはｐＨ６．０〜７．４の溶液中における）グルタミン酸カリウム及びナトリウムである。本発明に適用されるアミノ酸及びそれらの塩は、本技術分野において周知であり、周知の方法により製造される、及び営利的製造業者から入手可能である。

製剤中における荷電アミノ酸、それらの塩、又はグリシン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びそれらの塩等の特定のアミノ酸の濃度は、好ましくは約０．５％(w/v)〜約８％(w/v)、１％(w/v)〜約８％(w/v)、１％(w/v)〜約５％(w/v)、１．５％(w/v)〜５％(w/v)、２％(w/v)〜約５％(w/v)、０．５％(w/v)〜約３％(w/v)、より好ましくは約１．０％(w/v)〜約３％(w/v)、さらにより好ましくは約１．５％(w/v)〜約３％(w/v)、さらに好ましくは２．０％(w/v)〜約３％(w/v)、及び特に好ましくは約２．５％(w/v)である。荷電アミノ酸は、営利的製造業者から入手可能である。

本発明の製剤は、本明細書に記載されているようなCD-RAPポリペプチドに加えて、例えば水溶液中においてｐＨが約６と８との間で正味電荷を有するアミノ酸を組み合わせることにより調製される。

さらに、緩衝剤、浸透圧修飾剤及び／又は安定剤、並びに任意の追加的賦形剤は、必要に応じて加えられ得る。当業者は、製剤に含まれる種々の成分の組み合わせが適切な順序で行われ得ることを理解するだろう。例えば、緩衝剤は最初、中間又は最後に添加され得る。また、浸透圧修飾剤も最初、中間又は最後に添加され得る。これらの化学物質のいくつかは、特定の組み合わせにおいて不適合となり得るので、類似の特性を有するが関連する混合物に適合可能である異なる化学物質と容易に置換されることも、当業者に理解される。

本発明の好ましい実施形態において、本発明の製剤に含まれるアミノ酸、及びその製剤に含まれ得る緩衝剤、浸透圧修飾剤、安定剤、賦形剤等の更なる成分のいずれか１つは、（各サイクルの間に１５分の等温ステップと1.0 ℃/minの冷却及び加熱速度で、５℃〜−２５℃にする）繰り返しの凍結融解サイクル（好ましくは５回の凍結融解サイクル）に対してCD-RAPタンパク質に安定性を与えるように選択される。

本発明の好ましい態様において、製剤は緩衝剤を含む。本明細書において用いられる「緩衝剤」は、所望の範囲でｐＨを維持する作用剤を含む。緩衝剤は、弱酸及びその共役塩基、又は弱塩基及びその共役酸の混合液からなる水溶液である。それは、少量の強酸又は塩基が加えられた際に水溶液のｐＨがほとんど変化しない特性を有する。緩衝液は、多種多様な化学的適用において、ｐＨをほぼ一定値に維持する手段として用いられる。緩衝液は、ｐＨを特定のレベルで維持するために用いられる。一般に、本発明の製剤に適用される緩衝剤は、好ましくは、CD-RAPタンパク質を安定化する。

本明細書で用いられる「アミノ酸緩衝剤」は、例えばアルギニン及びその結合された塩であるアミノ酸を含む。アミノ酸緩衝剤の例は、アルギニン／アルギニン塩化物、アルギニン／アルギニンリン酸塩、ヒスチジン／ヒスチジン塩化物、ヒスチジン／ヒスチジンリン酸塩／グルタミン酸／グルタミン酸ナトリウム又はカリウムである。これらの例は、本発明に好ましくは適用される。

本明細書に記載されるような製剤の好ましいｐＨは、以下の範囲から選択され得る。その範囲は、約４から約１０まで、約５から約９まで、好ましくは約６から約８までである。従って、溶液をｐＨ６．０から８．０に維持できる緩衝剤は、好適に用いられる。ｐＨの値／範囲に関して用いられる「約」の用語は、好ましくは、前述の値の＋／−２５％の範囲を有する数値を意味する。医薬組成物のｐＨが生理学的レベルで又はその付近で設定される場合、投与を受ける患者の安楽が最大となる。

一般に、緩衝剤及び／又はアミノ酸の性質並びにその濃度は、製剤の重量モル浸透圧濃度が２８０〜３２０mosmol/kgとなるように設定する。特に、ｐＨが約５．８から８．４、好ましくは約６．２から７．４、より好ましくはｐＨが約５．８から８．４、最も好ましくは６．２から７．４であるが、ｐＨは特定の製剤におけるポリペプチドの安定性及び可溶性を最大にするために必要に応じて調製され得る。患者に好ましくは許容可能であるが生理学的範囲外のｐＨは、本発明の範囲内である。

本明細書に記載される製剤に用いられ得る緩衝剤の非限定的な例は、ヒスチジン、コハク酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、Tris（トロメタモール）、BIS-Tris、MOPS、ACES、TES、HEPES、EPPS、エチレンジアミン、リン酸、マレイン酸／リン酸塩、クエン酸塩、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及びジエタノールアミンを含む。

好ましい緩衝剤は、リン酸緩衝剤、Tris緩衝剤、以下のものに限らないがアルギニン、ヒスチジン及びグルタミン酸緩衝剤等のアミノ酸緩衝剤である。より好ましくは、以下の緩衝剤が本発明の製剤に適用される。それは、アルギニンリン酸塩（好ましくはｐＨ６．０から８．０まで、より好ましくはｐＨ６．５と７．５との間、最も好ましくはｐＨ６．０又は７．４）、ヒスチジンリン酸塩（好ましくはｐＨ６．０から８．０まで、より好ましくはｐＨ６．５と７．５との間、最も好ましくはｐＨ６．０又は７．４）、ヒスチジン塩化物（好ましくはｐＨ６．０から８．０まで、より好ましくはｐＨ６．５と７．５との間、最も好ましくはｐＨ６．０又は７．４）である。本発明に適用される緩衝剤は、本技術分野において周知であり、周知の方法により製造され、営利的製造業者から入手される。

本発明の成分中のアミノ酸、それらの塩、グリシン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びそれらの塩、以下のものに限られないがTris緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、アルギニンリン酸塩緩衝剤、及びリン酸緩衝剤緩衝剤等の緩衝剤の濃度は、以下の範囲から選択され得る。その範囲は、約１〜約５００ｍＭ、約１〜約４５０ｍＭ、約１〜約４００ｍＭ、約１〜約３５０ｍＭ、約１〜約３００ｍＭ、約１〜約２５０ｍＭ、約１〜約２００ｍＭ、約１〜約１５０ｍＭ、約１〜約１００ｍＭ、約１〜約５０ｍＭ、約１〜約４０ｍＭ、約１〜約３０ｍＭ、約１〜約２０ｍＭ、約１〜約１０ｍＭ、約１０〜約５００ｍＭ、約１０〜約４５０ｍＭ、約１０〜約４００ｍＭ、約１０〜約３５０ｍＭ、約１０〜約３００ｍＭ、約１０〜約２５０ｍＭ、約１０〜約２００ｍＭ、約１０〜約１５０ｍＭ、約３０〜約５００ｍＭ、約３０〜約４５０ｍＭ、約３０〜約４００ｍＭ、約３０〜約３５０ｍＭ、約３０〜約３００ｍＭ、約３０〜約２５０ｍＭ、約３０〜約２００ｍＭ又は約３０〜約１５０ｍＭである。

Tris緩衝剤の最も好ましい濃度は３０〜１００ｍＭであり、ヒスチジン緩衝剤の好ましい濃度は４５〜６０ｍＭ又は２５０〜３５０ｍＭであり、最も好ましくは５０〜３００ｍＭであり、リン酸緩衝剤の好ましい濃度は４５〜６０ｍＭであり、アルギニン緩衝剤の好ましい濃度は、２５０〜３８０ｍＭであり、グルタミン酸緩衝剤の好ましい濃度は２５０〜３６０ｍＭであり、最も好ましくは２８０〜３６０ｍＭである。

本発明の好ましい態様において、製剤は浸透圧修飾剤を含む。本発明で用いられる「浸透圧修飾剤」の用語は、液体製剤の浸透圧を調整するために用いられ得る単数の化合物又は複数の化合物を意味することが意図される。適当な浸透圧修飾剤は、グリセリン、ラクトース、マンニトール、デキストロース、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラフィノース、マルトース、及び当業者に知られる他の物質を含む。一実施形態において、液体製剤の浸透圧は、血液又は血漿の浸透圧に近い。浸透圧修飾剤は、成分のモル浸透圧濃度に寄与する。ヒト血清のモル浸透圧濃度は、約２５０〜３５０mOsM/kgである。タンパク質の安定性を維持し、患者の不快感を最低限にするために、製剤は等張である、すなわちヒト血清又は関節液とほぼ同一のモル浸透圧濃度を有することが一般に好ましい。従って、成分のモル浸透圧濃度は、好ましくは１８０〜４２０mOsM/kg、より好ましくは２８０〜３２０mOsM/kgである。この範囲内は、最も望ましいモル浸透圧濃度である、すなわち等張である。「等張」の用語は、関心のある製剤がヒトの血液と本質的に同一の浸透圧を有することを意味する。等張の製剤は、一般に、約２７０〜３２８mOsMの浸透圧を有するだろう。わずかに低張な浸透圧は、２５０〜２６９mOsMであり、わずかに高張な浸透圧は３２８〜３５０mOsMである。浸透圧は、例えば蒸気圧型又は製氷型浸透圧計を用いて測定され得る。

しかしながら、当業者は、成分の浸透圧は特定の状態が必要とするように、より高い又はより低いことを理解するだろう。種々の浸透圧修飾剤は、本技術分野に周知である（例えば米国特許出願2003/0180287の段落[0047]を参照）。以下のものに限られないが、塩（例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム及びクエン酸ナトリウム）、緩衝剤、二糖類（例えばスクロース、グルコース及びマンニトール）、増量剤並びに界面活性剤を含む製剤の他の成分は、成分のモル浸透圧濃度に寄与し得る。製剤中の浸透圧修飾剤の濃度は、好ましくは約１ｍＭ〜１０００ｍＭであり、より好ましくは約１０ｍＭ〜約２００ｍＭである。本発明の製剤に適用される好ましい浸透圧修飾剤は、塩化カリウム又は塩化ナトリウムであり、好ましくは、１５０ｍＭ未満、１００ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、１０〜５０ｍＭ、４０〜９０ｍＭ、４０〜１２０ｍＭ、５０〜１２０ｍＭ、５０〜１５０ｍＭ、８０〜１５０ｍＭ、８０〜１２０ｍＭ、４０〜４５ｍＭ、８０〜９０ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、１００〜１２０ｍＭ、４２．５ｍＭ、８９．５ｍＭ、１１６．５ｍＭ又は１５０ｍＭの濃度である。

いくつかの実施形態において、製剤は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）をさらに含む。特定の実施形態において、製剤は、１〜２００ｍＭ、又は５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３５ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２５ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、１０ｍＭ未満若しくは５ｍＭ未満のＮａＣｌを含む。特定の条件下で、ＮａＣｌは、凍結乾燥を困難とし得る、又は再構成された凍結乾燥物中に乳白色の濁りを発生させ得る。従って、あまり好ましくない実施形態において、製剤はＮａＣｌを含まない。CD-RAPタンパク質に加えて、本明細書に記載された製剤は、他の物質をも含み得る。これらの物質は、以下のものに限られないが、安定剤を含む。

従って、好ましい態様において、製剤は安定剤を含む。「安定剤」の用語は、製剤、特にCD-RAPタンパク質の安定性を改善又は増強する薬剤をいう。安定剤は、二糖類、糖アルコール、金属キレート若しくは金属キレートの組み合わせ、フリーラジカル捕捉剤、又はそれらの組み合わせであってもよい。

好ましくは、安定剤として用いられる場合の二糖類は、例えばスクロース、トレハロース又はマンノースといった非還元糖であってもよい。特定の実施形態において、成分中の二糖類の濃度は、以下の範囲から選択される。その範囲は、０．５〜５％、０．５〜４％、０．５〜３％、０．５〜２．５％、０．５〜２％、０．５〜１．５％、０．５〜１％、１〜１．５％、１．５〜２％、２〜２．５％、２．５〜３％、３〜４％、４〜５％、又は５％(w/v)よりも大きい。特定の実施形態において、成分中の二糖類の濃度は、約０．５〜５％であり、例えば約０．５〜２．０％(w/v)である。本発明の製剤に適用される好ましい安定剤は、好ましくは５・０％のスクロース、又は好ましくは５．０％(w/v)のマンニトールである。

安定剤は、グリコール、グリセロール、エリスリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、マンニトール、ソルビトール、ダルシトール、イジトール、イソマルト、マルチトール、ラクチトール又はポリグリシトール等の糖アルコールであってもよい。

他の安定剤は、金属キレート剤又は金属キレート剤の組み合わせであってもよい。特定の実施形態において、金属キレート剤は、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ及びＤＥＦである。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のＤＴＰＡ又はＥＧＴＡの濃度は、約１μＭから約１０ｍＭまで、約１μＭから約５ｍＭまで、約１０μＭから約１０ｍＭまで、約５０μＭから約５ｍＭまで、又は約７５μＭから約２．５ｍＭまでである。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤中のＤＥＦの濃度は、約１μＭから約１０ｍＭまで、約１μＭから約５ｍＭまで、約１０μＭから約１ｍＭまで、又は約２０μＭから約２５０μＭまでである。

安定剤は、特に酸素ラジカルの捕捉剤であるフリーラジカル捕捉剤であってもよい。特定の実施形態において、フリーラジカル捕捉剤は、マンニトール又はヒスチジンである。いくつかの実施形態において、タンパク製剤中のマンニトールの濃度は、約０．０１％から約５％まで、約０．１％から約５％まで、約０．５％から約５％まで、又は約１％から約５％までである。

他の実施形態において、本発明の製剤のタンパク質の凝集を低減する薬剤は、金属キレート剤及びフリーラジカル捕捉剤の組み合わせである。いくつかの実施形態において、製剤中のタンパク質又はタンパク質群の凝集を低減する薬剤はキレートである。特定の実施形態において、タンパク質製剤中のキレートの濃度は、約０．５ｍＭから約５０ｍＭまで、約０．５ｍＭから約２５ｍＭまで、約１ｍＭから約３５ｍＭまで、約５ｍＭから約２５ｍＭまで、又は約５ｍＭから約１０ｍＭまでである。

好ましい実施形態において、本明細書に記載された製剤は、賦形剤を含む。好ましい賦形剤は、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、界面活性剤、増量剤、抗酸化剤及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

溶液中（乾燥体中又は凍結型の）CD-RAPポリペプチドを好ましくは安定化する化学添加剤、共溶質又は共溶媒ともいわれる賦形剤は、本発明の製剤に添加され得る。好ましくは、賦形剤はCD-RAPタンパク質の安定性に寄与するが、賦形剤は、他に本発明の製剤の物理的、化学的及び生物的特性に寄与し得ると理解される。賦形剤は、本技術分野に周知であり、周知の方法により製造され、営利的製造業者から入手できる。

賦形剤の例は、以下のものに限られないが、スクロース、ラクトース、グリセロール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルトース、イノシトール、トレハロース、グルコース等の糖／ポリオール、血清アルブミン（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒトＳＡ若しくは組み換え型ＨＡ）、デキストラン、ＰＶＡ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンイミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）等のポリマー、多価アルコール（例えばＰＥＧ、エチレングリコール及びグリセロール）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の非水性溶媒、プロリン、Ｌ−セリン、グルタミン酸ナトリウム、グリシン、リジン塩酸塩、サルコシン及びガンマアミノブチル酸等のアミノ酸、Tween-80、Tween-20、ＳＤＳ、ポリソルベート、ポリオキシエチレンコポリマー等の界面活性剤、並びにリン酸カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、トリメチルアミンＮ−オキシド、ベタイン、金属イオン（例えば亜鉛、銅、カルシウム、マンガン及びマグネシウム）、ＣＨＡＰＳ、モノラウレート、２−Ｏ−β−マンノグリセレート等の賦形剤、又は上記のいずれかの組み合わせを含む。特定の実施形態において、本発明の製剤中の界面活性剤の濃度は、重量当たり０．００１から５．０％まで、０．００１から２．５％まで、０．００１から１％まで、０．００１から０．５％まで、０．００１から０．２％まで、０．００１から０．１％まで、０．００１から０．０５％まで、０．００１から０．０１％まで、又は０．００１から０．００５％までである。

「凍結保護剤」は、産生、凍結、保存、操作、流通、再構成又は使用の際における凍結タンパク質に安定性を与える物質を含む。特定の態様において、「凍結保護剤」は、凍結プロセスにより引き起こされるストレスからタンパク質を保護する物質を含む。凍結保護剤は、凍結乾燥保護剤の効果を有し得る。凍結保護剤の非限定的な例は、スクロース、グルコース、トレハロース、マンニトール、マンノース及びラクトース等の糖、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ及びポリエチレングリコール等のポリマー、ポリソルベート（例えばPS-20又はPS-80）等の界面活性剤、並びにグリシン、アルギニン、ロイシン及びセリン等のアミノ酸を含む。生体系において低い浸透圧を示す凍結保護剤が一般に用いられる。凍結保護剤が製剤に含まれる場合、約１％と約１０％(w/v)との間の最終濃度、好ましくは０．５〜８％(w/v)、０．５〜６％(w/v)、０．５〜８％(w/v)、０．５〜５％(w/v)、１〜８％(w/v)、１〜６％(w/v)、１〜８％(w/v)、１〜５％(w/v)、１．５〜８％(w/v)、１．５〜６％(w/v)、１．５〜８％(w/v)、１．５〜５％(w/v)、２〜８％(w/v)、２〜６％(w/v)、２〜８％(w/v)、２〜５．５％(w/v)の最終濃度で添加される。

本明細書に記載されている二糖類は、凍結乾燥保護剤又は凍結保護剤として作用し得る。「凍結乾燥保護剤」は、凍結乾燥及びその後の保存におけるタンパク質の化学的又は物理的不安定性を除く又は低減する物質を含む。一態様において、凍結乾燥保護剤は、乾燥プロセスの際に成分から水が除去されるので、タンパク質における化学的又は物理的不安定性を除く又は低減する。更なる態様において、凍結乾燥保護剤は、水素結合を介してタンパク質の適当な構造を維持することを助けることによりタンパク質を安定にする。

従って、一態様において、本明細書に記載された二糖類は、凍結の際にCD-RAPタンパク質を安定化するのに役立ち得る。凍結の際の保護作用が二糖類の絶対濃度に依存し得るので(Carpenter等., Pharm. Res. (1997),14:969-975)、５％より大きい濃度は、最大の安定性に必要となり得る。

一実施形態において、二糖類は、乾燥の際にCD-RAPタンパク質を安定化する。乾燥の際の保護作用は、二糖類とタンパク質との間の最終質量比に依存し得る（Carpenter等., PharmaceuticalResearch14:969-975 (1997)）。従って、いくつかの実施形態において、二糖類の濃度は、二糖類とタンパク質との望ましい質量比、一般には少なくとも１：１を達成するように選択される。いくつかの実施形態において、安定性は、二糖類：タンパク質が約５：１の質量比で最適化されている。他の実施形態において、二糖類：タンパク質の質量比が、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１又は１０００：１よりも高い。

一実施形態において、凍結乾燥保護剤は、本明細書に記載された製剤に添加される。本明細書に用いられる「凍結乾燥保護剤」の用語は、アモルファスのガラス材を提供することにより、及び乾燥プロセスの際に除去される水分子から置換した水素結合を介してタンパク質と結合することにより、凍結乾燥又は脱水プロセス（第１及び第２の凍結乾燥サイクル）の際にタンパク質に安定性を与える薬剤を含む。これは、タンパク質の構造を維持し、凍結乾燥サイクルの際のタンパク質の分解を最低限にし、長期の安定性を改善することを助ける。凍結乾燥保護量の凍結乾燥保護剤の存在下でCD-RAPの凍結乾燥の後において、タンパク質が凍結乾燥及び保存におけるその物理的及び化学的安定性及び保存性を本質的に維持することを意味する「凍結乾燥保護量」で凍結乾燥保護剤は、前凍結乾燥された製剤に添加される。

凍結乾燥保護剤の非限定的な例は、スクロース又はトレハロース等の糖、グルタミン酸ナトリウム、グリシン又はヒスチジン等のアミノ酸、ベタイン等のメチルアミン、硫酸マグネシウム等の離液性塩、例えばアラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールといった３価の又はより高い糖アルコール等のポリオール、ポリエチレングリコール、プルロニック、並びにそれらの組み合わせを含む。製剤に加えられる凍結乾燥保護剤の量は、一般に、タンパク質製剤が凍結乾燥されたときに、非許容的な量のタンパク質の分解／凝集を引き起こさない量である。凍結乾燥保護剤が（スクロース又はトレハロース等の）糖であり、タンパク質が抗体の場合、タンパク質製剤中の凍結乾燥保護剤の濃度の非限定的な例は、約１０ｍＭから約４００ｍＭまで、好ましくは約３０ｍＭから約３００ｍＭまで、最も好ましくは約５０ｍＭから約１００ｍＭまでである。特定の実施形態において、界面活性剤は本発明に係る製剤に含まれ得る。

他の好ましい賦形剤は界面活性剤である。「界面活性剤」の用語は、一般に、空気／溶液の界面で生じるストレス、及び溶液／表面で生じるストレスからCD-RAPタンパク質を保護する薬剤を含む。例えば、界面活性剤は凝集からタンパク質を保護する。

界面活性剤の例は、非限定的に、ポリソルベート（例えばポリソルベート８０又はポリ
ソルベート２０）等の非イオン性界面活性剤、ポロキサマー（例えばポロキサマ−１８８）、Triton、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、ステアリルスルホベタイン、ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、ステアリルサルコシン、リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、セチルベタイン、ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノレアミドプロピルメライン、ミリストアミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、イソステアラミドプロピルベタイン（例えばラウロアミドプロピル）、ミリスタニドプロピル−、パルミドプロピル−若しくはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン、メチルココイルタウリンナトリウム若しくはメチルオフェイルタウリンジナトリウム、並びにMonaquat シリーズ(Mona Industries, Inc., Paterson,NJ.)、ポリエチレングリコール、ポリプロピルグリコール、及びエチレンとプロピレングリコールとのコポリマー（例えばプルロニック、ＰＦ６８）を含む。加えられる界面活性剤の量は、高分子量（ＨＭＷ）の種又は低分子量（ＬＭＷ）の種の割合を測定するために、例えばSEC-HPLCを用いて試験される再構成されたタンパク質の凝集を許容可能なレベルに維持し、本明細書に記載されているタンパク質製剤の凍結乾燥物の再構成後の微粒子の形成を最小となるように決める。例えば、界面活性剤は、製剤中に、約０．００１から約０．５％まで、例えば約０．０５から約０．３％までで存在し得る。本発明の製剤に適用されるのに好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０又は８０である。

さらに、好ましい賦形剤は、増量剤であってもよい。すなわち、本発明の一態様において、本発明の製剤はバルク製剤で調製されると考えられ、医薬組成物の成分は、投与に必要とされるよりも多くなるように調製され、投与前に適当に希釈される。

本明細書で用いられる「増量剤」の用語は、医薬製品と直接に相互作用せずに凍結乾燥製品の構造を与える薬剤を含む。医薬的にエレガントなケーキを提供するのに加えて、増量剤は、崩壊温度を変化させること、凍結融解に対する保護性を与えること、及び長期の保存に対するタンパク質の安定性を増強することに関して有益な品質をも与え得る。増量剤の非限定的な例は、マンニトール、グリシン、ラクトース及びスクロースである。増量剤は、（グリシン、マンニトール又は塩化ナトリウム等の）結晶であってもよく、一般に、タンパク質製剤中に０．５％から１０％までで用いられる。

好ましくは、本発明の製剤に適用される増量材は、審美的に許容されるケーキの形成、均一性又は力学的強度を向上する。好ましくは、増量剤は、孔を含む構造の形成、並びに再構成の容易性及び速度をも向上する。また好ましくは、増量剤は、ケーキの崩壊、共晶の溶融又は残留水分の保持を抑制又は防止する。他の態様において、好ましくは、増量剤は、ストレス（例えば物理的及び化学的ストレス）に対するCD-RAPの保護を助け、タンパク質活性を維持することを助ける。特定の実施形態において、本発明の成分中の増量剤の濃度は、以下の範囲から選択される。その範囲は、１から１０％まで、１から８％まで、１から５％まで、２から８％まで、２から６％まで、２．５から６％まで、０．５から１％まで、１。５から２％まで、２から２．５％まで、２．５から３％まで、３から３．５％まで、３．５から４％まで、４から４．５％まで、４．５から５％まで、５％よりも大きい、０．５から５％まで、０．５から４％まで、０．５から３％まで、０．５から２．５％まで、０．５から２％まで、０．５から１．５％まで、０．５から１％までである。特定の実施形態において、本発明の成分中の増量剤の濃度は、０．５から５％まで、例えば０．５から３％まで、より適切には１．８から２％までである。

他の好ましい賦形剤は、抗酸化剤であってもよい。本明細書において用いられる「抗酸化剤」は、他の分子の酸化を遅延する又は防ぐことが可能な分子である。酸化は、物質から酸化剤に電子を移す化学的反応である。本発明の方法に用いるために、生理学的に許容
可能な抗酸化剤は興味深い。そのような抗酸化剤は、非限定的に、還元剤、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、リポ酸、メラトニン、尿酸、カロテン、レチノール、例えばα−トコフェロール（ビタミンＥ）であるトコフェロール及びトコトリエノール、並びにユビキノン（声ん財務Ｑ）等を含む。

いくつかの実施形態において、本発明の製剤は、任意に防腐剤を含んでもよい。「防腐剤」は、細菌活性を抑制するために本発明の製剤に添加され得る化合物である。防腐剤の添加は、例えば、多用途（複数回投与）製剤の作製を促進する。潜在的な防腐剤の例は、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物、ヘキサメトニウム塩化物、ベンズアルコニウム塩化物（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルアルキルベンジルジメチルアンモニウム塩化物の混合物）、及びベンズエトニウム塩化物を含む。防腐剤の他の型は、フェノール、ブチル及びベンジルアルコール等の芳香族アルコール、メチル又はプロピルパラベン等のパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールを含む。本明細書において最も好ましい防腐剤は、ベンジルアルコールである。

付け加えられた実施例（実施例３及び４を参照）は、試験製剤（５０ｍＭリン酸カリウム／５％スクロース及び１５０ｍＭグリシンｐＨ６．０中のCD-RAPを除く）における凍結融解サイクルがタンパク質の安定性に影響が無かったことを証明する（図６、７、１０及び１１を参照）。後者の場合、３回の凍結融解サイクルの後にCD-RAPの濃度の顕著な低減が見られた。しかしながら、他の全ての製剤において、溶液は各凍結サイクルの後、澄んでいた。UV/VisによるrhCD-RAPの定量化からの結果の組み合わせで、これは、本発明の問題を解決し、高濃度のrhCD-RAPを適当な状態にする。

従って、より好ましい実施形態において、本発明の製剤は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５又は３０mg/mLのCD-RAPと、リン酸カリウム又はナトリウム、Tris、ヒスチジン、アルギニン及びグルタミン酸の緩衝剤からなる群から選択される緩衝剤と、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩（好ましくはグルタミン酸リン酸塩）、アルギニン（好ましくはアルギニンリン酸塩又はアルギニン塩化物）、リジン及びグリシンからなる群から選択されるアミノ酸とを含む液体製剤であり、好ましくは水性製剤である。

グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、アルギニン、ヒスチジン、リジン及びグリシンは、好ましくは、２．５％(w/v)の量で製剤に含まれる。好ましくは、緩衝剤及びアミノ酸は、それらが５回の凍結融解サイクル（５℃から−２５℃であり、凍結及び加熱速度が１．０℃／ｍｉｎであり、各サイクルの間に、１５分の等温ステップを有する）に対してCD-RAPタンパク質に安定性を与えるように選択される。

従って、特に好ましい実施形態において、本発明の製剤は、少なくとも３０mg/mLのCD-RAPと、５０ｍＭのTris塩化物と、２．５％のグルタミン酸塩と、５０ｍＭのヒスチジンと、２．５％(w/v)のグリシン、２．５％(w/v)のグルタミン酸塩又は２．５％(w/v)のリジンと、３００ｍＭのヒスチジン塩化物 ｐＨ６．０、５０、１００、２００若しくは３００ｍＭのヒスチジンリン酸塩ｐＨ６．０、３５０ｍＭのアルギニン塩化物ｐＨ６．０、３５０ｍＭのアルギニンリン酸塩 ｐＨ６．０、３５０ｍＭのアルギニンリン酸塩 ｐＨ７．４又は３００ｍＭのグルタミン酸カリウムｐＨ６．０とを含む液体製剤、好ましくは水性製剤である。これらの製剤は、任意に、安定剤、浸透圧修飾剤、及び／又は本明細書に記載されているような賦形剤を含み得る。

本発明に係る組成物の特定の成分は、本技術分野に周知の代替物に置き換え得ることが理解される。しかしながら、当業者は、特定の成分の含有が、以下のものに限られないが、化学的適合性、ｐＨ、浸透圧及び安定性を含む理由で、他の化合物、濃度又は製剤の調製方法の使用を妨げることを理解するだろう。

上述のように、本願は、概して、製剤に荷電アミノ酸を添加することが、製剤中における高濃度のCD-RAPタンパク質の凝集を低減し得るという発見に関する。製剤中における高濃度のCD-RAPタンパク質は凝集を引き起こすにもかかわらず、本明細書に記載されている荷電アミノ酸又は複数の荷電アミノ酸の組み合わせの添加は、製剤中のCD-RAPタンパク質の凝集を低減する。特定の実施形態において、荷電アミノ酸の添加が、例えば保存、高温への曝露、光への曝露、せん断応力、界面活性剤の存在、ｐＨ及びイオン条件、並びにそれらの組み合わせにより引き起こされる製剤中での凝集を低減する。

本発明により見出されたこの方法は、特に液体型で製剤化されたCD-RAPタンパク質の凝集の低減のために用いられ得る。従って、低減された凝集は、液体製剤で好適に認められる。低減された凝集は、後で用いるために液体型で直接に保存された際に、凍結状態で保存されて使用前に融解された際に、又は凍結乾燥（lyophilized）、用いる前に液体型若しくは他の型に後で再構成するために凍結乾燥（air-dried）若しくはスプレードライ等で乾燥型に調製された際に、認められ得ると思われる。

従って、本明細書に記載されている製剤は、当業者に周知の方法により保存され得ることが予想される。非限定的な例は、凍結製剤、凍結乾燥製剤及びスプレードライ製剤を含む。

いくつかの場合、タンパク質製剤は、保存のために凍結される。従って、その製剤は凍結融解サイクルを含むそのような条件に対して比較的安定であることが望ましい。製剤の適合性を測定する１つの方法は、少なくとも２回、例えば３回から１０回の凍結融解サイクル（例えば室温での急速な融解又は氷上でのゆっくりとした融解）をサンプル製剤に受けさせ、凍結融解サイクル後に低分子量（ＬＭＷ）の種及び／又は高分子量（ＨＭＷ）の種の量を測定し、凍結融解工程の前にサンプルに存在するＬＭＷの種又はＨＭＷの種の量とそれを比較することである。ＬＭＷ又はＨＭＷの種における増大は、製剤の一部として保存されるタンパク質の低減した安定性を示す。サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SEC-HPLC）は、ＬＭＷ及びＨＭＷの種の存在を判定するために用いられ得る。

いくつかの場合、タンパク質製剤は、液体として保存され得る。従って、本明細書に記載されているように、種々の温度を含む条件に対して液体製剤が安定であることが望ましい。例えば、製剤の適合性を測定する１つの方法は、いくつかの温度（２〜８、１５、２０、２５、３０、３５、４０及び５０℃等）でサンプル製剤を保存し、時間と共に蓄積するＨＭＷ及び／又はＬＭＶの種の量を測定することである。時間と共に蓄積するＨＭＷ及び／又はＬＭＷの種の量が少ないほど、製剤の保存条件は良好である。従って、タンパク質の電荷のプロファイルは、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（CEX-HPLC）により測定され得る。従って、製剤は凍結乾燥の後に保存され得る。

「凍結乾燥型（lyophilized）」又は「凍結乾燥型（freeze-dried）」は、凍結乾燥等の乾燥工程を受けて、少なくとも９０％、好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の水分が除去された物質の状態を含む。従って、本明細書で用いられる「凍結乾燥」という用語は、第１の凍結の後の真空環境における昇華による氷又は凍結溶媒の除去によって、材料が乾燥されるプロセスをいう。賦形剤（例えば凍結乾燥保護剤）は、保存に対して凍結乾燥製品の安定性を増強するために凍結乾燥される製剤中に含まれ得る。本明細書で用いられる「再構成製剤」の用語は、タンパク質が希釈液に分散されるように希釈液に凍結乾燥型タンパク質製剤を溶解することにより調製された製剤をいう。

本明細書で用いられる「希釈液」の用語は、医薬的に許容可能（ヒトへの投与が安全で且つ無毒）であり、凍結乾燥後に再構成された製剤のような液体製剤の調製に有益である物質をいう。希釈液の非限定的な例は、無菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝食塩水）、無菌生理食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液、又は塩及び／若しくは緩衝剤の水溶液を含む。

凍結乾燥後の製剤のタンパク質成分の安定性のための製剤試験は、製剤の適合性を測定するのに有益である。その方法は、サンプル製剤が凍結の代わりに凍結乾燥されて希釈液を用いた再構成され、再構成製剤がＬＭＷの種及び／又はＨＭＷの種のために試験される以外は凍結する上記の試験方法と同様である。対応する凍結乾燥されていないサンプル製剤と比較される凍結乾燥サンプル中のＬＭＷ又はＨＭＷの増大は、凍結乾燥サンプルの低減した安定性を示す。

いくつかの場合、製剤はスプレードライされて保存される。スプレードライのために、液体製剤は、ドライガス流の存在下でエアロゾル化される。水は製剤の溶滴からガス流の中に移され、その薬物製剤の乾燥粒子が生じる。賦形剤は、(i)スプレードライによる脱水の際にタンパク質を保護する、(ii)スプレードライ後の保存の際にタンパク質を保護する、及び／又は(iii)エアロゾル化に適する溶液特性を与えるために、製剤に含まれ得る。その方法は、サンプル製剤が凍結の代わりにスプレードライされて希釈液を用いた再構成され、再構成製剤がＬＭＷの種及び／又はＨＭＷの種の存在のために試験される以外は凍結する上記の試験方法と同様である。対応する凍結乾燥されていないサンプル製剤と比較されるスプレードライされたサンプル中のＬＭＷ又はＨＭＷの増大は、スプレードライされたサンプルの低減した安定性を示す。

凍結乾燥製剤は、凍結乾燥製剤を溶解するための水溶液の添加により用いられるために、一般に再構成される。種々の水溶液は、凍結乾燥製剤を再構成するために用いられ得る。好ましくは、凍結乾燥製剤は、水を用いて再構成される。凍結乾燥製剤は、実質的に水（例えばＵＳＰＷＦＩ又は注射用水（ＷＦＩ））又は静菌水（例えば０．９％ベンジルアルコールを含むＵＳＰ ＷＦＩ）からなる溶液を用いて再構成されることが好ましい。しかしながら、緩衝剤及び／又は賦形剤及び／又は１つ若しくはそれ以上の医薬的に許容可能なキャリアを含む溶液も用いられ得る。

凍結乾燥（Freeze-dried）又は凍結乾燥（lyophilized）製剤は、液体、すなわち溶液、懸濁液及びエマルジョン等から一般に調製される。従って、凍結乾燥（Freeze-dried）又は凍結乾燥（lyophilized）を受けた液体は、最終再構成液体製剤に望まれる全ての成分を含むことが好ましい。結果として、再構成された際に、凍結乾燥（Freeze-dried）又は凍結乾燥（lyophilized）製剤は、再構成で望ましい液体製剤になるだろう。

本発明の他の態様において、製剤は、治療に用いられることが予想される。従って、本発明は、本明細書に記載されている製剤を含む医薬組成物（又は薬剤）を予想する。

さらに他の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている製剤の治療的有効量を投与することを含む患者の治療方法を提供し、その患者は、CD-RAPポリペプチドを用いて有利に治療され得る疾病又は障害を有する。

好ましくは、本明細書に記載されている製剤は、CD-RAPを用いて防ぐ及び／又は治療され得る疾病の予防及び／又は治療に適用される。

「患者」という用語は、生きている生物を含むことを意図している。患者の例は、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、及び非ヒトであるトランスジェニック動物を含む。本発明の好ましい実施形態において、患者はヒトである。

「有効用量」又は「有効投与量」の用語は、所望の効果を十分に達成する量、又は少なくとも部分的に達成する量として定義される。「治療的有効量」の用語は、病気に既に罹っている患者において、その病気及びその合併症を十分に治療する又は少なくとも部分的に抑止する量として定義されている。この用途の有効量は、感染の重症度及び患者自身の免疫系の状態に依存するだろう。「患者」の用語は、予防的又は治療的処置のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物を含む。

製剤の適当な投与量又は治療的有効量は、治療される状態、状態の重症度、先の治療、並びに患者の病歴及び治療剤に対する反応に依存するだろう。適切な用量は、患者に一度又は連続の投与され得るために、主治医の判断に従って調整され得る。医薬組成物は、単一の療法として又は必要に応じて追加の療法とを組み合わせて投与され得る。

本発明の医薬組成物は、非経口投与、すなわち皮下、筋肉内、静脈内、関節内及び／又は関節滑液嚢内の投与に特に有益である。非経口投与は、大量注射又は連続注入により行われ得る。

好ましい実施形態において、注射は、局所又は非全身注射であり、好ましくは、滑膜、滑膜のスペース、滑液若しくは滑膜関節、肋軟骨下領域、肋軟骨欠損、好ましくは膝、肩、尻、親指、顎関節若しくは椎間関節の関節内スペース、線維輪、髄核、髄核のスペース、椎間板内又はトランスディカリィ（transdically）に行う。より好ましくは、注射は、好ましくは、膝、肩、尻、親指、顎関節又は椎間関節への関節内注射である。さらに好ましくは、関節内注射は、椎間関節又は顎関節の滑液の中への関節内注射である。さらに好ましい注射は、滑膜下質若しくは領域への注射、又は軟骨若しくは肋軟骨欠損への注射である。また、膜を用いたその欠損の閉鎖前若しくは後の軟骨又は肋軟骨欠損への注射も含まれる。その膜は、以下のものに限られないが、骨膜又はコラーゲン膜であってもよい。他の好ましい実施形態において、膜は、コラーゲンタイプI、コラーゲンタイプIII、ブタ若しくはラットのコラーゲンタイプI若しくはタイプIII、ヒアルロン酸、又はそれらの誘導体を含む膜である。製剤の注射前の欠損の閉鎖の利点は、製剤の希釈を低減する、又は製剤の活性成分の局所的な濃度を増大することである。膜は、細胞の付着のための生体付着材として作用する。タンパク質製剤が凍結乾燥されている場合、凍結乾燥材料は、投与前に適当な液体で第１の再構成がなされる。凍結乾燥材料は、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水溶液、又は凍結乾燥前のタンパク質を有する同一の製剤で再構成され得る。

注射用の医薬組成物は、例えばアンプル内又は多回投与用容器内に、防腐剤が添加されて単位剤形で存在し得る。さらに、近年では多くのドラッグデリバリーアプローチが発達し、本発明の医薬組成物はこれらの新規の方法、例えばInject-ease、Genject、Genen等
のインジェクションペン、並びにMediJector及びBioJector等の針を有さない器具を用いた投与に適する。その医薬組成物は、まだ発見されていない投与方法にも適用され得る。Langer, 1990, Science, 249: 1527-1533を参照できる。

医薬組成物は、 デポ製剤として製剤化され得る。長期間作用する製剤は、移植（例えば、皮下、靭帯若しくは腱中、滑膜下又は筋肉内）、滑膜下注射又は筋肉内注射により投与され得る。従って、例えばその製剤は、適当なポリマー材料、疎水性材料（例えば許容可能な油中のエマルジョン）、イオン交換樹脂、又は、例えば溶けにくい塩のような溶けにくい誘導体を用いて修飾され得る。医薬組成物は、反応性の成分を与えるための投与のために用いられる従来の種々のデポフォームとなり得る。これらは、例えば溶液、懸濁液、スラリー、ゲル、クリーム、バルム、エマルジョン、ローション、パウダー、スプレー、泡、ペースト、軟膏（ointments）、軟膏（salves）、バルム及び滴剤等の固体、半固体及び液体剤形を含む。

望まれるならば、医薬組成物は、活性成分を含む１つ又はそれ以上の単位剤形を含み得るバイアル、パック又はディスペンサー装置に入れられ得る。一実施形態において、ディスペンサー装置は、注射のために準備された単一用量の液体製剤を有する注射器を含み得る。注射器は、投与のための説明書が添付され得る。

医薬組成物は、追加の医薬的に許容可能な成分をさらに含み得る。他の医薬的に許容可能で、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)に記載されているようなキャリア、賦形剤又は安定剤は、製剤の望ましい特性に不利な影響を与えないならば、本明細書に記載されているタンパク質製剤に含まれ得る。本明細書で用いられる「医薬的に許容可能なキャリア」は、医薬投与に適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤を意味する。医薬的活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、本技術分野において周知である。許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度で患者に無毒であり、追加の緩衝剤、防腐剤、共溶媒、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）、ポリエステル等の生分解可能ポリマー、ナトリウム、多価糖アルコール等の塩形成対イオン、アルギニン、グリシン、アスパラギン、２−フェニルアラニン、及びトレオニン等のアミノ酸、ラクチトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオイニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えばイノシトール）、ポリエチレングリコール等の糖又は糖アルコール、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、αモノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム等の還元剤を含む硫黄、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は他のイムノグロブリン等の低分子量タンパク質、並びにポリビニルピロリドン等の親水性ポリマーを含む。

本明細書に記載されている製剤は、必要とする患者の病気又は障害の治療及び／又は予防における医薬組成物として有益である。「治療」の用語は、治療的療法、及び予防又は防止方法の療法をいう。治療は、病気、病気の症状又は病気の傾向を治す、癒す、緩和する、軽減する、変更する、矯正する、寛回する、改善する又はそれに作用する目的で、病気／障害、病気／障害の症状、又は病気／障害の傾向を有する患者の身体、単離された組織、又は細胞に製剤を適用又は投与することを含む。

「治療を必要としている」それらは、既に障害を有するもの、及び障害を防止するためのものを含む。「障害」の用語は、本明細書に記載されているタンパク質製剤を用いた治療から利益を受けるであろう状態である。これは、問題の障害に哺乳動物が罹りやすい病態を含む慢性及び急性の障害又は病気を含む。本明細書で治療されるための障害の非限定的な例は、変性疾患、骨及び／又は軟骨及び／又は関節軟骨欠損、関節炎（骨関節炎、リウマチ性関節炎等を含む）等の関節、骨又は軟骨組織の慢性的な炎症といった免疫疾患、並びに変性椎間板疾患等の脊椎障害を含む。好ましい実施形態において、脊椎障害は、特発性の腰痛、椎間板ヘルニア、椎間板裂傷若しくは亀裂、神経根疾患、脊椎管狭窄症、髄核ヘルニア誘導性坐骨神経痛、坐骨神経痛、特発性側彎又は脊髄症である。

「変性疾患」の用語は、骨構造に関する又は関与しない軟骨変性又は破壊等の軟骨構造の欠陥を有する病気又は欠損を意味する。好ましくは、変性疾患は、変性軟骨疾患である。これらは、顎関節障害（ＴＭＤｓ）、関節唇障害、関節炎、骨関節炎、リウマチ関節炎、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチ、根性型偽関節症、リウマチ性多発関節炎、変性椎間板疾患、軟骨又は骨軟骨欠損、限局性軟骨欠損、限局性骨軟骨欠損、表面軟骨欠損、離断性骨軟骨炎、全層軟骨欠損、部分軟骨欠損、軟骨軟化、膝関節内及び周辺の腱及び靭帯に関する損傷、外側又は内側半月板の損傷、半月板断裂、靱帯損傷、滑液膜骨軟骨種症、脊椎炎、強直性脊椎炎、滑膜炎、絨毛結節性滑膜炎を含む。

「軟骨欠損」の用語は、軟骨疾患、及び例えば損傷又は変性プロセスにより引き起こされる軟骨の変化を含む軟骨異常をいう。「関節軟骨」は、関節内の骨の一部の表面を覆い、関節内の移動が可能な２つの骨の間のクッションとして機能する。正常で健康な関節軟骨は、ガラス軟骨として説明される。軟骨関節は、プロテオグリカン、主にアグリカン、コラーゲンタイプII細繊維、他のタンパク質及び水が多い細胞内マトリクス材料の中に組み込まれた特殊な細胞（軟骨細胞）からなる。マトリクスは、内部に組み込まれた軟骨細胞により産生及び維持される。軟骨組織は、神経分布及び血管形成されず、基礎となる組織により栄養を受ける。

CD-RAPタンパク質の他に、本発明の医薬組成物は、さらに治療学的又は生物学的活性薬剤を含み得る。例えば、抗メタロプロテアーゼ、サイクリン化合物、サイトカインアンタゴニスト、コルチコステロイド、ＴＮＦ阻害剤、ＩＬ阻害剤、抗血管形成物質、アグリカナーゼ阻害剤、ｐ３８キナーゼ阻害剤、アポトーシス阻害剤、ヒアルロニダーゼ阻害剤、及びタンパク質分解酵素阻害剤に限られない、関節軟骨又は滑膜成分の破壊に関わる１つ又はそれ以上の阻害剤等の例えば骨関節炎の特定の兆候の治療に有用な治療因子を含み得る。インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムラブ、ネレリモンマブ及びレネルセプト等、又はそれらの組み合わせを含む炎症を制御する因子は、組成物の一部であってもよい。医薬的リポソーム成分は、ヒアルロン酸、又は塩、エステル、インナーエステル、及び硫酸誘導体、好ましくはヒアルロン酸の部分エステルを含むそれらの誘導体等の細胞外マトリクス成分を含み得ることも考えられる。

他の実施形態において、本発明は、キット（若しくは製品）又はコンテナに関し、それらは本発明の製剤を含む。その製剤は、既に液体状態であることが好ましい。しかしながら、その代わりに、既に凍結乾燥状態であってもよい。また、凍結状態、凍結乾燥（lyophilized）状態、凍結乾燥（freeze-dried）状態又はスプレードライ状態であってもよい。従って、その製剤が液体以外の状態である場合、（液体）水性医薬組成物として専門家により調整され得る。例えば、その製剤が凍結乾燥されていれば、後に再構成されなければならないだろう。従って、そのキットは、さらに、凍結、凍結乾燥（lyophilized）、凍結乾燥（freeze-dried）若しくはスプレードライ製剤を再構成する手段、及び／又はその製剤を希釈する手段、及び／又はその製剤若しくは医薬組成物を投与する手段をそれぞれ含み得る。そのキットには、使用説明書が添付され得る。

従って、製品は、本明細書に記載されている製剤を含み、好ましくは使用説明書が添付されて提供される。その製品は、製剤を含むのに適当なコンテナを含む。適当なコンテナは、以下のものに制限されることなく、ボトル、バイアル（例えばデュアルチャンババイアル）、注射器（例えばシングル若しくはデュアルチャンバ注射器）、試験管、噴霧器、吸入器（例えば定量吸入器若しくは乾燥粉末吸入器）又はデポ−を含む。そのコンテナは、ガラス、金属又はプラスチック（例えばポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン）等の種々の材料から形成され得る。そのコンテナは製剤を収容し、コンテナに貼られた又は付けられたラベルは、再構成及び／又は使用のための注意事項を示し得る。そのラベルは、さらに、製剤が皮下投与に有益であること又は皮下投与用であることを示し得る。その製剤を含むコンテナは、多用途バイアルであってもよく、それは製剤の連続投与（例えば１〜６回の投与）を可能とする。その製品は、さらに、適当な希釈剤（例えば、ＷＦＩ、０．９％ＮａＣｌ、ＢＷＦＩ、リン酸緩衝生理食塩水）を含む第２のコンテナを備えている。製品がタンパク質製剤の凍結乾燥型を含む場合、凍結乾燥製剤と希釈剤との混合は、通常、最終タンパク質濃度が少なくとも２０mg/mLの再構成製剤を提供するだろう。その製品は、さらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、注射器、使用説明書を含む添付文書を含む商業上及び使用者の観点から望まれる他のものを含み得る。

本発明の他の実施形態において、製品は、本発明の水性製剤を含み、その使用のための説明書を添付して提供される。その製品は、コンテナを含む。適当なコンテナは、例えばボトル、バイアル（例えばデュアルチャンババイアル）、注射器（例えばシングル若しくはデュアルチャンバ注射器）、注射器を含む自動注射ペン、及び試験管を含む。そのコンテナは、ガラス、プラスチック、又はポリカーボネート等の種々の材料から形成され得る。そのコンテナは、水性製剤を収容し、コンテナに貼られた又は付けられたラベルは、使用のための注意事項を示し得る。例えば、そのラベルは、製剤が皮下投与に有益であること又は皮下投与用であることを示し得る。その製剤を含むコンテナは、多用途バイアルであってもよく、それは水性製剤の連続投与（例えば２〜６回の投与）を可能とする。その製品は、さらに、第２のコンテナを含んでもよい。その製品は、さらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、注射器、使用説明書を含む添付文書を含む商業上及び使用者の観点から望まれる他のものを含み得る。

本発明には、本発明の製剤を輸送するために用いられ得る装置も含まれる。そのような装置の例は、以下のものに限られないが、注射器、ペン、インプラント、無針注射装置、吸入装置及びパッチを含む。

以下の事項は、本発明に含まれるものである。
１．少なくとも５mg/mLのCD-RAPと、荷電アミノ酸とを備え、前記CD-RAPタンパク質が直接に溶解されている安定水性製剤。
２．前記１．の製剤において、前記アミノ酸は、ｐＨ６から８までにおいて正味電荷を有する製剤。
３．前記１．又は２．の製剤において、緩衝剤をさらに備えている製剤。
４．前記１．〜３．のいずれかの製剤において、浸透圧修飾剤をさらに備えている製剤。
５．前記１．〜４．のいずれかの製剤において、安定剤をさらに備えている製剤。
６．前記１．〜５．のいずれかの製剤において、賦形剤をさらに備えている製剤。
７．前記１．〜６．のいずれかの製剤において、ｐＨ６から８までである製剤。
８．前記１．の製剤において、 前記荷電アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、リジン及びグルタミン酸からなる群から選択される製剤。
９．前記１．〜８．のいずれかの製剤において、凍結乾燥（freeze dried, lyophilized）又はスプレードライされ得る製剤。
１０．前記１．〜９．のいずれかの製剤において、前記製剤の成分により繰り返しの凍結融解サイクルに対する安定性が付与されている製剤。
１１．前記１．〜１０．のいずれかの製剤において、治療に用いるための製剤。
１２．前記１．〜１１．のいずれかの製剤において、炎症性疾患、好ましくは骨関節炎の治療に用いるための製剤。
１３．前記１．〜１２．のいずれかの製剤を備えているキット。
１４．前記１．〜１３．のいずれかの製剤において、少なくとも30 mg/mL のCD-RAPを備え、前記緩衝剤は、リン酸カリウム、Tris塩化物、ヒスチジン、アルギニン及びグルタミン酸塩からなる群から選択され、前記アミノ酸は、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩（好ましくはグルタメートリン酸塩）、アルギニン（好ましくはアルギニンリン酸塩又はアルギニン塩化物）、ヒスチジン（好ましくはヒスチジン塩化物又はヒスチジンリン酸塩）、リジン及びグリシンからなる群から選択される製剤。
１５．前記１．〜１４．のいずれかの製剤において、少なくとも30 mg/mL のCD-RAPと、
(i)50mMのTris塩化物及び2.5%のグルタミン酸塩；
(ii)50 mMのヒスチジン及び2.5% (w/v)のグリシン、2.5%(w/v)のグルタミン酸塩若しくは2.5% (w/v)のリジンと；
(iii)300mMのヒスチジン塩化物pH 6.0；
(iv)50 mM、100 mM、200 mM若しくは300mMのヒスチジンリン酸塩pH 6.0；
(v)350mMのアルギニン塩化物pH 6.0;
(vi)350 mMのアルギニンリン酸塩pH 6.0;
(vii)350mMのアルギニンリン酸塩pH 7.4;又は
(viii)300mMのグルタミン酸カリウムpH 6.0とを備えている製剤。

本発明は、単なる説明のためのものであって本発明の範囲を制限しない図面及び実施例により、さらに説明される。

タンパク質の安定性に影響する要因を示す。 タンパク質を安定にするために採られ得る代表的な手段を示す。 リン酸カリウム中のrhCD-RAPの連続的な濃度を示す。 Tris塩化物中のrhCD-RAPの連続的な濃度を示す。 ヒスチジン塩化物中のrhCD-RAPの連続的な濃度を示す。 種々の緩衝剤系中の高濃度のrhCD-RAPの安定性を示す。 種々の緩衝剤系中の高濃度のrhCD-RAPの安定性を示す。 種々のｐＨ値におけるグリシン及びrhCD-RAPの正味電荷を示す。 １５０ｍＭグリシン中のrhCD-RAPの可溶性におけるｐＨの影響を示す。 rhCD-RAPの可溶性におけるヒスチジンリン酸塩のモル濃度の影響を示す。 rhCD-RAPの可溶性における（塩化カリウムで等張のモル浸透圧濃度に調整された）ヒスチジンリン酸塩の影響を示す。

なお、図３〜図１１において、棒グラフの凡例に加えられた番号は、グラフに示された各「ブロック」のバーに関する（左から右）。例えば、「０」は左の外側のバーに関し、「１」は「０」で示されたバーの隣のバーに関する等である。

以下の実施例は、本発明を説明する。

高用量の注射により引き起こされる痛み等の副作用を低減するように、患者に低用量の注射を可能とするために、高濃度のCD-RAPの安定製剤を目標とする発明者等の検討に基づいて、種々の製剤がCD-RAPタンパク質の安定化における影響について試験された。それらの製剤のいくつかは、以下の実施例に代表的に示される。しかしながら、本明細書で述べられるように、発明者等の目的を用いて始める場合、それぞれのタンパク質が異なる特性
を有するので、どの成分が適するものであるという一例から結論は出せないため、その目的に合う製剤の適当な成分を見出すための実験を行う必要がある。
（実施例）
実施例１：rhCD-RAPのための種々の緩衝剤系の分析
rhCD-RAPは、３６の緩衝剤系に対して透析された（緩衝剤は５０ｍＭ塩化カリウム、５０ｍＭヒスチジン塩化物又は５０ｍＭTris塩化物、それぞれｐＨ６．０で、各緩衝剤は、０．１％ Tween20を含む又は含まないスクロース、マンニトール、グリシン、リジン及びグルタミン酸から選択される安定剤を含む又は含まない）。濾過により３０mg/mLにまでrhCD-RAPを透析する物質濃縮するプロセスの間、サンプルは、ＵＶ／Ｖｉｓにより分析された。安定製剤は、凍結融解サイクルによりストレスが与えられた。各サイクルの後、サンプルに遠心法を行い、rhCD-RAPはＵＶ／Ｖｉｓにより定量化された。

透析
２．０ｍｌのrhCD-RAPバルク材料（３５０ｍＭアルギニン／リン酸塩 ｐＨ７．４）は、６〜８ｋＤａの分子量のカットオフチューブを用いて、適度に撹拌しながら４℃で２４時間、５００ｍＬの所望の緩衝剤に対して透析された。１６時間後、透析緩衝剤は、５００ｍＬの新鮮な緩衝剤に交換された。その結果生じたタンパク質溶液は、更なる分析のために２〜８℃で保存された。

ＵＶ−Ｖｉｓ
サンプル中のタンパク質量は、１３０００ｒｃｆで５分間、透析されたrhCD-RAPに対して遠心法を行った後に、ＵＶ／Ｖｉｓにより測定された。対応するサンプル緩衝剤は、ブランクの減算のために測定された。タンパク質濃度[mg/ml]の算出のために、２８０ｎｍにおける吸光度及び２８０ｎｍにおけるrhCD-RAPの特定の吸収率[1.649 mL/(mg*cm)]が用いられた。

rhCD-RAPの濃度の増大
透析されたrhCD-RAPは、２ｍＬの遠心濃縮機に移された。遠心ステップ（4000rcf, 4℃）の後、rhCD-RAP溶液の容量を減らした。残存するrhCD-RAP溶液の容量を測定し、rhCD-RAP濃度をＵＶ／Ｖｉｓにより定量化した。

熱安定性（凍結融解サイクル）
rhCD-RAPの熱安定性を、超低温フリーザーを用いて５℃から−２５℃の５回の凍結融解サイクルを行って評価した。冷却及び加熱速度は、１．０℃/minであり、各サイクルの間には１５分の等温ステップを行った。そのタンパク質溶液を、分析まで４℃〜８℃で保存した。濃度が３０mg/mLの３００μｌrhCD-RAPを１．５ｍＬＰＰバイアルの中に移し、上述のように規定された凍結融解ステップによりストレスを与えた。

実施例２：種々の緩衝剤系中のrhCD-RAPの安定性
実施例１の全ての緩衝剤系の安定化効果を測定した。

リン酸カリウム緩衝剤系
以下の物質を最終質量が１ｋｇとなり、緩衝剤濃度が５０ｍＭになるようにＷＦＩに溶解した。ｐＨは、ＫＯＨ及びＨＣｌをそれぞれ加えることによりｐＨ６.０に調整した。
ａ）６．８ｇのリン酸カリウム、１２．４ｇのＫＣｌを含み、１．０ｇのTween80を含まない
ｂ）６．８ｇのリン酸カリウム、５０ｇのスクロース、４．９ｇのＫＣｌを含み、１．０ｇのTween80を含まない
ｃ）６．８ｇのリン酸カリウム、５０ｇのマンニトール、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
ｄ）６．８ｇのリン酸カリウム、２５ｇのグリシン、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
ｅ）６．８ｇのリン酸カリウム、２５ｇのグルタミン酸、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
ｆ）６．８ｇのリン酸カリウム、２５ｇのリジン、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
ｇ）６１．０ｇのアルギニン、リン酸でｐＨ７．４に調整（コントロール）
必要であれば、塩化カリウムにより３００〜４００mOsm/kgの等張性を調整した。各緩衝剤のモル浸透圧濃度を表１に示す。
表１：リン酸カリウム緩衝剤のモル浸透圧濃度

rhCD-RAPを表１に示された緩衝剤系に基づくリン酸カリウムに対して透析し、濾過ユニットでの遠心法により濃縮した。

規定された緩衝剤の連続的な低減の後、維持された容量のタンパク質溶液を測定し、rhCD-RAP濃度をＵＶ／Ｖｉｓにより定量化した。図３は、５mg/mLのCD-RAP溶液の透析の前及び後、並びに１０、２０及び３０mg/mLに濃縮した後の、CD-RAPの濃度を示す。アルギニン／リン酸緩衝剤をコントロールとした。

図３に示すように、アルギニン／リン酸塩緩衝剤系中の製剤は、全ての濃縮ステップにおいて最適な可溶性を示した。最も高い濃縮ステップでさえ、測定されたタンパク質量は、rhCD-RAPの理論上の量に達した。従って、rhCD-RAPのためのアルギニン／リン酸塩中に同量のタンパク質があるため、この緩衝剤は、最も好ましい可溶化溶液の１つである。アルギニン／リン酸塩と対照的に、製剤の緩衝剤としてのリン酸カリウムの使用は、十分な可溶性に達するための特別な添加物を必要とした。５０ｍＭのリン酸カリウム（等張状態に達するためにイオン性添加物として塩化カリウムを含む）が、１０mg/mLのrhCD-RAPまでは良好な可溶性を示したので、３０mg/mLのrhCD-RAP及びそれ以上のレベルの濃度における可溶性に達するために添加物の追加の必要がある。広い範囲の安定剤から、スクロースのみが３０mg/mLの濃度においてさえもrhCD-RAPの優れた可溶性を引き起こす。他は、種々の濃縮ステップにおける部分的に目に見える沈殿したタンパク質が生じた凝集現象を示した。

Tris緩衝剤系
可溶性増強剤としてのTween80を含める又は含めないで、スクロース、マンニトール、グリシン、グルタミン酸及びリジン等の種々の安定剤とTris塩化物をＷＦＩに溶解し、最終重量を１ｋｇにし、緩衝剤濃度を５０ｍＭとした。それぞれ、追加のＨＣｌを用いることにより、ｐＨ６．０に調整した。
ａ）６．０５ｇのTris base、９．７ｇのＮａＣｌを含み、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
ｂ）６．０５ｇのTris base、５０ｇのスクロース、３．９ｇのＮａＣｌを含み、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
ｃ）６．０５ｇのTris base、５０ｇのマンニトールを含み、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
ｄ）６．０５ｇのTris base、２５ｇのグリシンを含み、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
ｅ）６．０５ｇのTris base、２５ｇのグルタミン酸を含み、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
ｆ）６．０５ｇのTris base、２５ｇのリジンを含み、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
必要であれば、塩化カリウムにより３００〜４００mOsm/kgの等張性を調整した。各緩衝剤のモル浸透圧濃度を表２に示す。
表２：Tris緩衝剤のモル浸透圧濃度

rhCD-RAPを上記のリン酸カリウム緩衝剤の場合において記載したように、透析し３０mg/mLにまで濃縮した。最適な可溶性のためのコントロールとして３５０ｍＭアルギニンリン酸塩緩衝剤を用いた。

リン酸カリウム緩衝剤の場合と比較して、２．５％グルタミン酸を含む５０ｍＭ Tris塩化物を除くすべてのTris塩化物緩衝剤は、５mg/mL以上のCD-RAPで乏しい可溶性を示した。

ヒスチジン緩衝剤系
可溶性増強剤としてのTween80を含める又は含めないで、スクロース、マンニトール、グリシン、グルタミン酸及びリジン等の種々の安定剤とヒスチジン塩化物（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）を他の２つの緩衝剤系における上記と同様の方法を用いて分析した。
ａ）７．７６ｇのＬ−ヒスチジン塩化物、１２．４ｇのＫＣｌを含み、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
ｂ）７．７６ｇのＬ−ヒスチジン塩化物、５０ｇのスクロース、４．９ｇのＫＣｌを含み、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
ｃ）７．７６ｇのＬ−ヒスチジン塩化物、５０ｇのマンニトールを含み、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
ｄ）７．７６ｇのＬ−ヒスチジン塩化物、２５ｇのグリシンを含み、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
ｅ）７．７６ｇのＬ−ヒスチジン塩化物、２５ｇのグルタミン酸を含み、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
ｆ）７．７６ｇのＬ−ヒスチジン塩化物、２５ｇのリジンを含み、１．０ｇのTween80を含む及び含まない
必要であれば、等張性を調整した。最終モル浸透圧濃度を表３に示す。
表３：ヒスチジン塩化物緩衝剤のモル浸透圧濃度

rhCD-RAPを上記緩衝剤系において透析し、３０mg/mLにまで濃縮した（4.1.1を比較）。

リン酸カリウム及びTris緩衝剤の両方と比較し、ヒスチジン塩化物緩衝剤では、アルギニンリン酸塩と並んで、rhCD-RAPの最も良好な可溶性を生じさせた。

５mg/mL以上のrhCD-RAPが凝集した５０ｍＭヒスチジン＋／−Tween80を除いて、他の全ての緩衝剤は、ｐＨ６．０及び中性ｐＨ周辺の等張緩衝剤で３０mg/mLまで非常に良好な可溶性を示した。また、分析した緩衝剤系でTween80の使用によるrhCD-RAPの可溶性に対する影響はなかった。
結論
凝集することなく３０mg/mLまで高濃度のタンパク質を提供するCD-RAPの最も良好な結果は、以下の通りであった。それは、ａ）５％スクロースを含む５０ｍＭリン酸カリウム、ｂ）２．５％グルタミン酸を含む５０ｍＭTris塩化物、ｃ）２．５％グリシンを含む５０ｍＭヒスチジン、ｄ）２．５％グルタミン酸を含む５０ｍＭヒスチジン，ｅ）２．５％リジンを含む５０ｍＭヒスチジン、ｆ）５％マンニトールを含むヒスチジン、及びｇ）３５０ｍＭアルギニンリン酸塩である。

ほとんど全ての実験された製剤において、所望の濃度を５mg/mLに下げると、タンパク質の安定性を得られたが、濃度を３０mg/mLに上げると、クリアされるためのハードルを得た。

実施例３：凍結融解サイクルによる種々の緩衝剤系中のrhCD-RAPの熱安定性の評価
実施例１では、ｐＨ６．０で３０mg/mLまでのrhCD-RAPのための７つの緩衝剤の形態を評価した。これらの緩衝剤形態は、ストレス状態、すなわち凍結融解サイクルにおけるrhCD-RAPの安定性の維持について試験された。

rhCD-RAPを、ａ）５％スクロースを含む５０ｍＭリン酸カリウム、ｂ）２．５％グルタミン酸を含む５０ｍＭ Tris塩化物、ｃ）２．５％グリシンを含む５０ｍＭヒスチジン、ｄ）２．５％グルタミン酸を含む５０ｍＭヒスチジン、ｅ）２．５％リジンを含む５０ｍＭヒスチジン、ｆ）５％マンニトールを含むヒスチジン、及びｇ）３５０ｍＭアルギニンリン酸塩の緩衝剤系で透析し、続いて、rhCD-RAPを〜３０mg/mLにまで濾過ユニットでの遠心法により濃縮した。３００μｌを１．５ｍＬのＰＰバイアルに移した。その製剤に５回の凍結融解サイクルによりストレスを与え、凝集したrhCD-RAPを遠心法を行った後に除去し、残った可溶性rhCD-RAPをＵＶ／Ｖｉｓにより定量化した。

rhCD-RAPを全ての試験される緩衝剤系中に３０mg/mL程度に首尾よく濃縮した。図６は、５０ｍＭリン酸カリウム／５％スクロース中のrhCD-RAPを除く全ての製剤において、凍結融解サイクルによりタンパク質濃度に負の影響はないことを示す。５０ｍＭリン酸カリウム／５％スクロースの場合のみ３回の凍結融解プロセスの後にrhCD-RAPの顕著な低減が認められ、一時的に濁った乳状体の分散が見られた。他の全ての製剤において、それぞれの凍結融解サイクルの後に溶液は清澄であり、ＵＶ／Ｖｉｓによる定量化の結果と組み合わせて、高濃度のrhCD-RAPの可溶性及び安定性の問題は解決した。

驚くことに、少なくとも１つのアミノ酸を含む緩衝剤系だけは、凍結融解サイクルの後にrhCD-RAPの熱安定性を示した。

実施例４：rhCD-RAP（30mg/mL）に対する種々のアミノ酸の安定化効果
実施例２及び３では、アミノ酸を含む緩衝液中の３０mg/mLのrhCD-RAPの優れた安定性を示したので、この特別なアミノ酸の効果を以下の実施例で試験した。ヒスチジン及びアルギニン等の塩基性アミノ酸、グリシン等の中性アミノ酸、及びグルタミン酸等の産生アミノ酸に対して、rhCD-RAPの安定化効果についての試験を行った。全てのバルク溶液を、塩又は他の賦形剤の添加なしにｐＨ６．０で等張に調製する。ｐＨを塩酸及びリン酸を用いて調整した。さらに、３５０ｍＭアルギニンリン酸塩をｐＨ６.０及びｐＨ７．４で試験した。
表４：種々の緩衝剤中で凍結融解サイクルによりストレスが与えられたrhCD-RAP

rhCD-RAPを（表４に示す）緩衝剤系で透析し、続いて、rhCD-RAPを〜３０mg/mLの濃度に濾過ユニットでの遠心法により濃縮した。３００μｌを１．５ｍＬのＰＰバイアルに移した。表４に示した製剤に対して、上記の実施例に従って、５回の凍結融解サイクルによりストレスを与えた。遠心法を行った後に凝集したrhCD-RAPを除去し、残った可溶性rhCD-RAPをＵＶ／Ｖｉｓにより定量化した。

図７は、１つの除いて、全ての緩衝剤系の優れた安定化効果、及び凍結融解サイクルでのrhCD-RAPの可溶性を示す。１５０ｍＭグリシンで透析されたrhCD-RAPは、透析ステップの際に量的に凝集した。従って分析された唯一の非荷電アミノ酸であるｐＨ６.０のグリシンは、rhCD-RAPバルク緩衝剤の調製のためのアミノ酸の使用において、アミノ酸の電荷が重要な技術的性質であることを示す。しかしながら、リン酸緩衝剤及び塩化物緩衝剤の両方は、同様であった。

実施例５：グリシン中のrhCD-RAPの可溶性における種々のｐＨの影響
中性の性質のため、ｐＨ６.０の等張グリシン溶液中のrhCD-RAPの乏しい可溶性を実施例４では示した。そこで、本発明者等は、グリシンが非荷電であるがｐＨの変化に起因するより高い正味電荷及びCD-RAPそれぞれのより高い正味電荷をrhCD-RAPが備える場合のCD-RAPの可溶性の結果を測定した。

図８は、ｐＫｓ値による、種々のｐＨ値でのグリシン及びrhCD-RAPの両方の正味電荷を示す。この試験において、rhCD-RAPをｐＨ４．０、ｐＨ６．０及びｐＨ８．０における１５０ｍＭのグリシンに対して透析した。リン酸及び水酸化ナトリウムのそれぞれを用いて、ｐＨ値を調整した。ｐＨ６及びｐＨ８の緩衝剤の中で透析されたrhCD-RAPは、凝集の強い傾向を示した。これらの溶液は、非乳状の清澄な外観を示すグリシン（ｐＨ４）溶液と対照的に、乳状の外観を有した。

rhCD-RAPを３０mg/mL（ｐＨ４．０）に濃縮し、続いて、５回の凍結融解サイクルによりストレスを与えた。その後、遠心法により凝集したrhCD-RAPを除去し、残存した可溶性rhCD-RAPをＵＶ／Ｖｉｓにより定量化した。遠心工程の際にフィルタが塞がる結果として、ｐＨ６．０及びｐＨ８．０のrhCD-RAP溶液により低い濃度で直接にストレスを与えた。

図９は、酸性条件下、例えばｐＨ４.０でのタンパク質の正味電荷が生じることに起因する自己安定したrhCD-RAPの影響を示す。グリシンはｐＨ４．０において非荷電であるが、rhCD-RAPの十分な可溶性を達成できる。

ｐＨ６〜８の範囲において、CD-RAPを有する製剤は、安定化させる賦形剤として荷電アミノ酸を含まなければならないが、より低いｐＨ、例えばｐＨ４.０において、rhCD-RAPは、荷電アミノ酸を加えなくともそれ自体を安定化できる。

実施例６：安定化rhCD-RAPにおけるヒスチジンの影響
上記の実施形態で」は、荷電アミノ酸が、ｐＨ６．０等のほぼ中性ｐＨにおいて３０mg/mLに達する高濃度のrhCD-RAPの安定化のための優れたツールであることを証明した。同定された緩衝剤の範囲を決定するために、この実施例では、最も適当な例のヒスチジンで、CD-RAPに対する緩衝剤成分の濃度の依存性を示す。従って、以下の表５に示すように０ｍＭから３００ｍＭまでの範囲のヒスチジンを含むヒスチジンリン酸塩でrhCD-RAPを透析した。さらに、それらの製剤を、十分な量の塩化カリウムの添加により生理的モル浸透圧濃度に調整した。
表５：Ｌ−ヒスチジン緩衝剤の種々の濃度、塩化カリウムを用いて等張状態に調整する前のモル浸透圧濃度

rhCD-RAPを３０mg/mL（ｐＨ６．０）に濃縮し、続いて、５回の凍結融解サイクルによりストレスを与えた。遠心法を行った後に凝集したrhCD-RAPを除去し、残存した可溶性rhCD-RAPをＵＶ／Ｖｉｓにより定量化した。

図１０は、ｐＨ６.０のヒスチジンリン酸塩中のrhCD-RAPの可溶性がヒスチジンの濃度に厳密に依存したことを示す。ｐＨ６．０の０ｍＭヒスチジンは、rhCD-RAPを安定化しなかったが、より高い濃度では、ヒスチジンのモル濃度の増大に相関して、可溶性の顕著な改善を引き起こした。凍結融解実験を繰り返されたそれらは、２００mmol/l以上のＬ−ヒスチジンを含む緩衝剤が、安定な３０mg/mLのrhCD-RAP溶液を提供したことを示した。

図１１に示すように、塩化カリウムの添加は、ヒスチジンリン酸塩中のrhCD-RAPの可溶性に影響しなかった。従って、塩化カリウムを用いて、医薬的CD-RAP製剤を等張なモル浸透圧濃度に調整することは、高濃度のrhCD-RAPの可溶性及び安定性に負の影響を与えることなく用いられ得る。

実施例７：ＧＤＦ−５誘導性ＡＬＰ活性の阻害
ＭＣＨＴ細胞を９６ｗｅｌｌプレートに３００００cellｓ/wellの濃度で播き、培養培地（１０％ＦＣＳ、グルタミンを含むα-ＭＥＭ）で一晩培養した。その次の日、rhGDF-5及びrhCD-RAPを用いた刺激を、各ウェルの培養培地を１６０μｌの特定の刺激培地に交換することにより開始した。全ての基準及びサンプルを４つずつ作製した。以下の濃度のrhGDF-5（1200 ng/ml、400ng/ml、133.2 ng/ml、44.5 ng/ml、14.8 ng/mlの完全培養培地中のrhGDF-5）の希釈系列を、検量線の作製のために調製した。rhCD-RAPを介するＡＬＰ活性の阻害の分析のために、細胞を４００ng/mlのrhGDF-5及び１〜１０μＭのrhCD-RAPを用いて同時刺激した。細胞を刺激培地で３日間培養した後、それらに０．２ｇのＭｇＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏを含む２ｍＬのノニデットＰ４０を加えて、インキュベータで１６時間インキュベートすることにより溶解した。５０μｌの溶解物を新しい９６ｗｅｌｌプレートに移し、５０μｌの基質緩衝液（０．２２２ｇのＰＮＰＰを含むジエタノールアミン緩衝液、Pierce社製）を加え、３７℃で４５分間インキュベートした。その後、０．５ＭのＮａＯＨを加えることにより反応を停止した。プレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度を測定した。バックグラウンドのＡＬＰ活性を未処理細胞で測定し、全ての基準及びサンプルから差し引いた。検量線を全てのサンプルにおけるＡＬＰ活性の算出に用いた。

実施例８：軟骨細胞のCD-RAP刺激及びqRT-PCRによる分析
軟骨を全膝置換の手術を受けている患者に由来するヒトの関節軟骨から単離した。軟骨を骨から切断し、小片に切り分けた。軟骨の小片を、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含み１％プロナーゼを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いて３７℃で１時間消化した。室温で５分間、２００×ｇで遠心法を行った後、軟骨小片をＰＢＳで１回洗浄した。それらを、０．０７％のコラゲナーゼＡを含む培養培地（１０％ＦＣＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）を用いて３７℃で一晩消化した。その次の日、その細胞懸濁液を、１００、７０及び４０μｍのセルストレーナに連続的に通して濾過した。その細胞を遠心沈殿し、培養培地に再建濁し、６ｗｅｌｌプレートに２５００００cells/wellの濃度で播いた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２、９０％の湿度で、それらがコンフルエントに達するまで培養した（約１週間）。培地を２日毎に交換した。CD-RAPを用いた刺激のために、細胞を無血清培地で一晩飢餓状態にした。CD-RAP（０．５〜５μＭ）を無血清培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２に添加し、細胞を２４時間培養した。続いて、細胞を溶解し、製造者の説明書に従って、RNeasy Mini Kitを用いてＲＮＡを溶出した。１μｇのＲＮＡをQuantiTectReverseTranscription Kit (Qiagen)を用いたｃＤＮＡの調製のために用いた。４μｌの希釈したｃＤＮＡ（１：５希釈）、１０μｌのQuantiFast SYBRGreen PCR Mix (Qiagen)、４μｌのヌクレアーゼを含まない水、及び２μｌのprimer-mixを用いて、標準条件でLight cyclerを使用した５０サイクルの RT-PCRを行った。以下のプライマーを用いた。それは、18SrRNA(Qiagen, QuantiTect Primer AssayQT00199367), MMP13forward GGGTTCCTGATGTGGGTGAATA (配列番号５), MMP13reverse GCCATCGTGA AGTCTGGTA (配列番号６)である。その結果物をハウスキーパー18SrRNAで正規化した。

Claims (11)

1. 少なくとも１０mg/mLのCD-RAPと、
   ２５０ｍＭ〜３８０ｍＭのアルギニン緩衝剤、２００ｍＭ〜３５０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、又は２５０ｍＭ〜３６０ｍＭのグルタミン酸緩衝剤とを備え、
   ｐＨ６から８までであり、前記CD-RAPタンパク質が直接に溶解されており、リポソームを含まない安定水性製剤。
2. 浸透圧修飾剤をさらに備えている請求項１に記載の製剤。
3. 安定剤をさらに備えている請求項１又は２に記載の製剤。
4. 賦形剤をさらに備えている請求項１〜３のいずれか１項に記載の製剤。
5. 凍結乾燥（freeze dried, lyophilized）又はスプレードライされる請求項１〜４のいずれか１項に記載の製剤。
6. 前記製剤の成分により繰り返しの凍結融解サイクルに対する安定性が付与されている請求項１〜５のいずれか１項に記載の製剤。
7. 少なくとも３０mg/mL のCD-RAPを備えている請求項１〜６のいずれか１項に記載の製剤。
8. 治療に用いるための請求項１〜７のいずれか１項に記載の製剤。
9. 炎症性疾患の治療に用いるための請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の製剤を備えているキット。
11. 少なくとも30 mg/mL のCD-RAPと、
    (i)300mMのヒスチジン塩化物pH6.0；
    (ii)300mMのヒスチジンリン酸塩pH 6.0；
    (iii)350mMのアルギニン塩化物pH6.0;
    (iv)350 mMのアルギニンリン酸塩pH6.0;
    (v)350mMのアルギニンリン酸塩pH7.4;又は
    (vi)300mMのグルタミン酸カリウムpH 6.0とを備えている請求項１〜９のいずれか１項に記載の製剤。