CN1184673A

CN1184673A - Fgf粗提多肽生长因子混合物及其提取工艺

Info

Publication number: CN1184673A
Application number: CN96114616A
Authority: CN
Inventors: 董玉兰
Original assignee: China Medical University
Current assignee: China Medical University
Priority date: 1996-12-13
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 1998-06-17

Abstract

FGF粗提多肽生长因子混合物及其提取工艺,混合物为粉白色粉末、无味,其特征是含有纤维母细胞生长因子(aFGF,bFGF)、表皮生长因子EGF,转化生长因子TGF－β;提取工艺是:把牛脑破碎、匀浆、搅拌、进低温离心机、收集上清液并加入硫酸链霉素,拌匀再次进离心机;收集上清液速冻、干燥、冷冻保存。FGF混合物是外用药,经对动物和部分临床试验证明,对所有外伤致组织缺损性损伤均有效,有显著的修复作用。适用于大面积的软组织损伤、烧伤、褥疮、慢性经久不愈的溃疡、放射性损伤、鼓膜穿孔、角膜溃疡、穿孔等。

Description

FGF粗提多肽生长因子混合物及其提取工艺

本发明涉及肽的分离CO7K1/14，关于分子生物学领域中的修复细胞及提取工艺。

创伤修复是医学中一个重要待深入研究的课题之一。近十年来随着分子生物学的不断发展，创伤修复的研究有了新的进展，突出表现在探讨各种生长因子在创伤修复中的作用。

九十年代以来，美国等发达国家投入大量经费对表皮生长因子EGF、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等在创伤修复中的作用进行了研究，并逐渐向临床应用过渡。但是至今仍未见有关临床应用的报导。

国内近几年中在少数军事医学院校开展了这方面的研究工作。主要是bFGF，EGF等生长因子对创伤愈合的实验研究，但均是对单一的一种生长因子的作用观察，并且是基因重组而获取的因子。

纤维母细胞生长因子(FGF，包括aFGF，bFGF)，是一种广谱的促有丝分裂剂，对源于中胚叶的细胞，如成纤维细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、成肌细胞、软骨细胞、成骨细胞均有促有丝分裂、增殖作用。FGF通过促进内皮细胞增生，新血管生成，成纤维细胞增生，胶原形成而促进肉芽组织和基质的形成。而创伤修复的基本过程是肉芽组织形成，基质形成与重塑(瘢痕形成)，所以FGF在创伤修复中将起重要作用。

以往的研究均系单一的一种纯化生长因子FGF，且系基因重组产物，而在生物体内创伤修复过程中是多种生长因子共同作用参与修复的结果，并且在组织损伤过程中FGF在损伤局部组织中的浓度很低，外源性加入FGF就显得更加重要。EGF促进上皮细胞、内皮细胞，成纤维细胞增生；TGF-β促进成纤维细胞增生、基质形成，因此研究FGF与其它生长因子协同作用就显得更加重要。而目前还未见有关FGF与多种生长因子共存参与损伤修复的研究报道。

本发明的目的是提供一种FGF粗提多肽生长因子混合物及其提取工艺。

FGF粗提多肽生长因子混合物为粉白色粉末，无味，其特征是含有纤维母细胞生长因子(aFGF，bFGF)、表皮生长因子(EGF)，转化生长因子(TGF-β)：选用新鲜牛脑为原料，提取工艺如下：

在4℃环境中操作，把牛脑去掉小脑、破碎、加NaCl、试PH值、匀浆；进磁力搅拌器中搅拌，进低温离心机，收集上清液并加入硫酸链霉素，搅拌均匀再次进离心机；收集上清液在液氮中速冻、冷冻干燥、低温保存。

ECGF是美国学者于1979年首先从牛下丘脑提职物中获取的，分子量为75000，具有明显促进内皮细胞(EC)增殖的作用。后来有文献证实ECGF即是FGF的一种，对热醋酸敏感，胰酶和还原剂可将其灭活。在培养中必须是有ECGF存在的条件下，EC才能在体外长期生长，并且由于肝素的存在而作用增强。单独肝素存在对EC不显示增生作用。本发明人在实验中证实FGF混合物用生理盐水稀释，200μg/ml，配肝素100μg/ml，对EC显示明显而稳定的增生作用。

目前国内外关于FGF生长促进剂的研究还处在动物试验阶段，作为商品也只有试剂。国际市场售阶15mg/85 而用本发明工艺提取该混合物不需通用的纯化手段、不需经过柱层析的分离、也不需基因重组的操阼，工艺简便，易于工业化生产，成本仅为进口价格的1/100。并且本发明的FGF混合物含有aFCF、bFGF、EGF和TGF-β₁，是多种生豆长因子混合物，更适用于临床创伤修复的应用，是目前创伤修复的理想制剂。

实施例：

本发明的FGF粗提多肽生长因子混合物为粉白色粉末，无味，其特征是含有纤维母细胞生长因子(aFGF，bFGF)、表皮生长因子(FGF)，转化生长因子(TGF-β)；提取所需设备包括磁力搅拌器、匀浆器、高速低温离心机、冷冻干燥机、抽滤灭菌器等，选用新鲜牛脑为原料，提取工艺如下：

在4℃环境中操作，把牛脑去掉小脑、破碎、加生理盐水、调试PH值、将物料送匀浆器内匀浆化；然后进磁力搅拌器中搅拌一定时间、进低温离心机中进行离心处理、收集上清液并加入硫酸链霉素，搅拌均匀再次进离心机，收集上清液，经0.2μ滤膜抽滤灭菌、在液氮中速冻、在-60℃下冷冻干燥、收取粉末；细胞培养检验：进行细菌、支原体、霉菌缺乏试验；装瓶检验：每15mgFGF混合物中含352mgSM(硫酸链霉素)、7.52mE NaCl，于20-30℃冷冻保存。-30℃中长期保存，有效期可达5年以上。

用本发明方法提取的FGF混合物是外用药，对所有外伤致组织缺损性损伤均有效。使用前如生理盐水配成工作液：200-300μg/ml在FGF粗提液中加100-150μg/ml肝素混合，抽滤灭菌，即可外用，涂于创面。经对动物和部分临床试验证明，它对各种创伤有显著的修复作用，如：大面积的软组织损伤、烧伤、褥疮、慢性经久不愈的溃疡、放射性损伤、鼓膜穿孔、角膜溃疡、穿孔等。

Claims

1、一种FGF粗提多肽生长因子混合物，为粉白色粉末，无味，其特征是含有纤维母细胞生长因子(aFGF，bFGF)、表皮生长因子EGF，转化生长因子TGF-β；使用前加生理盐水配成工作液：200-300μg/ml，并在FGF粗提液中加100-150μg/ml肝素，混合、抽滤灭菌、即可外用，涂于创面。

2、一种FGF粗提多肽生长因子混合物的提取工艺，采用设备包括磁力搅拌器、匀浆器、高速低温离心机、冷冻干燥机，在4℃环境下作业，选用新鲜牛脑为原料，其特征是提取工艺如下：把牛脑去掉小脑、破碎、加生理盐水、调PH值、匀浆后进磁力搅拌器中搅拌、进低温离心机离心、收集上清液并加入硫酸链霉素，搅拌均匀再次进离心机；收集上清液、抽滤灭菌，用0.2μ滤模、在液氮中速冻、在冷冻干燥机中干燥，-60℃、细胞培养检验：做细菌、支原体、霉菌缺乏试验；装瓶、于20-30℃中冷冻保存。

3、根据权利要求1和2所述的FGF粗提混多肽因子混合物及提取工艺，其特征是瓶装提取物的含量比例是：

每15mg FGF中含3.52mg硫酸链霉素SM和7.52mg NaCl。