CN104324053A

CN104324053A - 一种快速愈合犬创伤组织的犬干细胞分泌因子修复液

Info

Publication number: CN104324053A
Application number: CN201410506749.3A
Authority: CN
Inventors: 严玉霖; 汪登如; 曹景锋; 陈玲; 汪逸
Original assignee: Individual
Current assignee: Yan Yulin
Priority date: 2014-09-28
Filing date: 2014-09-28
Publication date: 2015-02-04
Anticipated expiration: 2034-09-28
Also published as: CN104324053B

Abstract

一种快速愈合犬创伤组织的犬干细胞分泌因子修复液，涉及生物技术领域，尤其是犬干细胞技术。本发明修复液中包含犬类干细胞活性成份提取液，该提取液是从犬骨髓基质干细胞中提取得到的，包括多种活性生长因子、胶原蛋白、活性多肽、微量元素、透明质酸等物质，可以快速促进细胞和组织生长、活化和再生，在治疗犬难愈性创面方面能发挥网络式的调节作用。本发明修复液可以快速有效地促进皮肤和手术创面的愈合，以及修复皮肤和眼部的溃疡，具有良好的科研和临床价值。

Description

一种快速愈合犬创伤组织的犬干细胞分泌因子修复液

技术领域

本发明涉及生物技术领域的犬干细胞技术, 尤其是快速促进犬创伤组织愈合的犬干细胞分泌因子修复液的制备方法及其临床应用。

背景技术

犬骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cells, BMSCs)是骨髓中具有自我更新和多向分化潜能的细胞群。具有来源广泛、采集方便、体外易于扩增、低免疫原性等特性，是目前再生医学、组织工程、基因治疗等方面比较理想的种子源细胞。犬BMSCs在特定的环境中可以定向分化，从而达到修复细胞和组织损伤的作用。有研究表明，除了干细胞本身的分化作用外，其旁分泌作用在修复过程中发挥了更大的作用。犬BMSCs能够分泌大量的细胞因子，其分泌因子在功能上主要可分为免疫调节、抗细胞凋亡、血管发生、支持干/祖细胞的增殖与分化、化学趋化、抗瘢痕六大类。它们通过自分泌或旁分泌的方式，改善机体局部微环境，促进内源性干细胞向伤口部位的迁移和分化，挽救濒临凋亡的细胞，从而达到修复创伤组织的目的。犬干细胞分泌因子包括干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素(IL)、抗炎因子、转化生长因子、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白、各种溶菌酶等20余种活性物质。

犬活泼好动，由于运动所导致的外伤屡见不鲜，同时手术创面、皮肤和眼部溃疡的修复也是临床中常见的问题，创伤和创面的愈合是一个错综复杂的生物学过程，该过程通过细胞因子的高度协调介导细胞与细胞间或细胞与基质间的相互作用来修复受损组织。细胞因子的协调不良或功能障碍均可导致创面愈合“失控”，在临床上表现为创面难愈。

目前犬创伤和溃疡的治疗原则首先是局部治疗服从全身治疗，其次创面的外科处理是局部治疗的前提和基础，如局部清创和抗感染等，最后采用某些措施和方法来促进难愈性创面愈合。传统的方法主要包括传统医药类、新型敷料类、基因工程药物(生长因子)类以及组织工程类。存在的主要问题是抗感染差、血管化延迟、制备技术复杂、生产周期长，价格昂贵以及组织工程皮肤存在生理缺陷等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种犬创伤、手术创面和皮肤溃疡能够快速愈合的修复液，该修复液可以快速有效地促进皮肤和手术创面的愈合，以及修复皮肤和眼部的溃疡。

本发明快速愈合犬创伤组织的修复液，其特征在于该修复液中包含犬类干细胞活性成份提取液，所述提取液是从犬骨髓基质干细胞中提取得到的。

所述的修复液中还含有0.5%-1%提取液质量的透明质酸。

所述的修复液中还含有0.3%-0.5%提取液质量的防腐剂丙酸钙。

所述的犬类干细胞活性成份提取液包括干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素(IL)、抗炎因子、转化生长因子、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白和溶菌酶。

所述的犬类干细胞活性成份提取液是通过以下的步骤制备而得的：

步骤1：从健康幼龄犬骨髓中体外分离培养大量的BMSCs；

步骤2：收集BMSCs培养上清液，超声破碎BMSCs并离心取上清；

步骤3：微孔径滤膜过滤，浓缩。

本发明利用犬干细胞增殖过程中能分泌诸如抗炎、血管发生、胞外基质重塑、纤维组织形成和表皮细胞再生等愈合相关因子，可大规模生产、活性高、使用安全相比于单一因子更适合体内环境，且不涉及干细胞使用中存在的争议，因此具有良好的科研和临床价值。

具体实施方式

实施例1：快速愈合犬创伤组织的修复液，该修复液中包含犬类干细胞活性成份提取液，透明质酸以及防腐剂丙酸钙。

所述的修复液具体提取步骤如下：

步骤 1，犬BMSCs的体外分离：常规麻醉幼犬，髂后上棘备皮、消毒、铺巾，用含1ml肝素钠的骨髓穿刺针分2-3点共抽取骨髓约10ml，混匀防凝，迅速转入50ml 消毒离心管，用等量DMEM/F12稀释混匀；取10支底部加入5ml 淋巴细胞分离液的离心管，加入的淋巴细胞分离液浓度为1.077 g/ml，上层分别贴壁流入等量骨髓稀释液，封口，控制温度4℃，离心机转速为2000 r/min，离心20 min去除上层脂肪细胞，吸取中间交界处白膜层细胞，然后用4℃的 10 ml DMEM/F12混匀洗涤界层细胞，再次离心20 min，转速2000 r/min，去除上清液，重复上述洗涤界层细胞步骤1次；用含15% FBS、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 链霉素的DMEM/F12培养基5ml重悬沉积物。

步骤2，台盼蓝染色测定细胞活力：取0.4g台盼蓝，加入100 ml的0.1 M PBS溶液中，配制成0.4%台盼蓝溶液，0.1M PBS溶液配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 3.488g，KH₂PO₄ 0.2g，加三蒸去离子水至1000 ml，调整PH值为7.4，0.22 μm滤膜过滤除菌。取0.4%台盼蓝溶液0.5 ml、DMEM/F12培养基0.3 ml 和细胞悬液0.2 ml 充分混匀，用血球计数板计数活细胞(未着色细胞) 和死细胞(着色细胞)，共计数500个细胞，计算细胞活力，细胞活力( %) = (细胞总数－着色细胞数) /细胞总数×100%。如台盼蓝染色细胞活力≥95%，则可进行下一步操作，否则重复步骤1（重复步骤 1、犬BMSCs的体外分离）。

步骤3，大量培养BMSCs：首次培养时用含15% FBS、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 链霉素(双抗)的DMEM/F12培养液调整细胞密度，以1×10⁶/ml细胞密度5 ml的培养液接种于25 cm²的一次性细胞培养瓶内，置于温度37℃，5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养3天后首次换液，去除红细胞、悬浮生长的骨髓造血干细胞及其它未贴壁的骨髓干细胞，以后每隔3天换液1次，即换新鲜的含有15% FBS、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 链霉素的DMEM/F12培养液，待细胞生长至70%～80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化2～3min，用含10%的FBS及双抗的DMEM/F12终止消化，反复吹打瓶壁细胞，制成单细胞悬液按1:3传代，倒置显微镜逐日观察，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时，重复上述操作，反复传代扩增，收集。

步骤4，干细胞活性成份的提取：犬BMSCs用胰蛋白酶消化计数10⁷个，PBS洗涤3次，溶于30 ml灭菌生理盐水中；超声破碎细胞，条件：超声10 s，间隔时间5 s，超声强度4，超声次数5次，使细胞内的蛋白及营养成分充分溶出；控制温度4℃，转速为10000 r/min，离心10 min，取上清液，去掉细胞碎片；用孔径为0.22 μm的滤膜过滤，使其无菌，测定蛋白浓度，调整浓度为200 μg/ml，4℃保存，标记为A液。待细胞长到最旺盛时，测培养基pH值为5.5-6.0，取上层培养液30 ml；因上层培养液含有大量酚红和其他成分，用50 k超滤膜过滤，使其体积浓缩至5 ml左右取出，加入5 ml灭菌生理盐水，定容至10 ml；用孔径为0.22 μm的滤膜过滤，使其无菌，测定蛋白浓度，定浓度为200 μg/ml，4℃保存，标记为B液。将上述30 ml的A液和10 ml的B液混合，得到干细胞活性提取液。

步骤5，干细胞分泌因子修复液的制备：以步骤4所得干细胞活性成份提取液40 ml为原料，按质量比为0.5%-1%的比例加入透明质酸，达到皮肤保湿和快速愈合伤口的目的；同时按质量比0.3%-0.5%的比例加入防腐剂丙酸钙，以延长保存时间和增加治愈效果。

将本发明制备的修复液进行应用，对创伤组织进行治疗，并与其他的常规治疗方法做相关的对比试验。

对比试验如下：

不同品种犬9只，年龄为3-5岁，随机分为三组，每组3只，第一组为治疗组，使用本发明的犬干细胞分泌因子修复液；第二组为常规治疗组，使用碘酒；第三组为对照组，使用生理盐水。

将9只犬用3%戊巴比妥钠静脉麻醉，背部皮肤去毛，消毒，用手术刀片制备直径为1 cm的圆形创面，深度为达皮肤全层，但不触及肌肉，每天分3次分别在创面上涂抹不同的药物，进行相应的治疗。在给予治疗的第 3，6，9，12，15，18，21天测量创面大小，进行愈合指标观察：在创后各时间点用消毒的透明薄膜贴于创口上，沿创缘划线，记录后用图像分析仪测定创面面积；动物致伤后立即测的面积为伤口原始面积。残留面积百分率=残留面积/原始面积×100%。

创面残留面积/原始面积的百分比代表创面愈合速度，治疗结果显示，犬干细胞分泌因子修复液可加快创面的愈合速度：在第6天与对照组比较差异显著，对照组创面在伤后18-21天基本愈合，而犬干细胞分泌因子修复液治疗组创面在伤后12-15天已全部愈合，提前了6-7天，并且愈合速度明显优于碘酒治疗组，结果列于表1中。

结果表明，利用本发明的犬干细胞分泌因子修复液可明显抑制创面的炎症反应，快速愈合犬创伤部位的皮肤组织，减少瘢痕组织的形成，具有良好的临床应用前景。

表1 伤后不同时间创面残留面积百分比 (%， + s)

实施例2：将实施例1制备得的修复液进行应用。

对昆明爱美森宠物医院临床接诊的不同品种年龄、各种类型和不同程度的软组织开放性创伤犬进行治疗，包括由互相撕咬争斗而引起的咬创和裂创，由锐利刀片或砍劈类物体造成切创或砍创，由钝性物打击形成的挫创，由车轮碾压或重物挤压而形成的压创，以及皮肤眼角膜溃疡等，治疗前临床症状表现为出血，疼痛，伤口感染引起化脓，有的表现为体温升高和白细胞数量增多等炎症反应。

对于严重创伤先进行抗休克治疗，镇痛，补液，同时进行清创，再用本发明的修复液进行治疗；对于有全身性炎症反应的患犬先用抗生素进行治疗，再清创和用修复液治疗；对于一般创伤则进行清创和用修复液进行治疗，修复液每天涂抹创面或创口组织部位3次。临床治疗结果表明，本发明的犬干细胞修复液可快速促进犬创伤组织的愈合，抑制炎症反应，减少瘢痕组织的形成，具有巨大的临床应用和推广价值。

Claims

1.一种快速愈合犬创伤组织的犬干细胞分泌因子修复液，其特征在于该修复液中包含犬类干细胞活性成份提取液，所述提取液是从犬骨髓基质干细胞中提取得到的。

2.如权利要求1所述的一种快速愈合犬创伤组织的犬干细胞分泌因子修复液，其特征在于所述的修复液中还含有0.5%-1%提取液质量的透明质酸。

3.如权利要求1所述的一种快速愈合犬创伤组织的犬干细胞分泌因子修复液，其特征在于所述的修复液中还含有0.3%-0.5%提取液质量的防腐剂丙酸钙。

4.如权利要求1所述的一种快速愈合犬创伤组织的犬干细胞分泌因子修复液，其特征在于所述的犬类干细胞活性成份提取液包括干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素(IL)、抗炎因子、转化生长因子、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白和溶菌酶。

5.如权利要求1所述的一种快速愈合犬创伤组织的犬干细胞分泌因子修复液，其特征在于所述的犬类干细胞活性成份提取液是通过以下的步骤制备而得的：

步骤1：从健康幼龄犬骨髓中体外分离培养大量的BMSCs；

步骤2：收集BMSCs培养上清液，超声破碎BMSCs并离心取上清；

步骤3：微孔径滤膜过滤，浓缩。