WO2020095592A1 - 医薬品組成物及び化粧品組成物 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a pharmaceutical composition and a cosmetic composition.
- Embryonic stem cells are stem cells established from early human or mouse embryos. ES cells have pluripotency capable of differentiating into all cells existing in the living body. Currently, human ES cells are available for cell transplantation therapy for many diseases such as Parkinson's disease, juvenile diabetes, and leukemia. However, there are obstacles to ES cell transplantation. In particular, transplantation of ES cells can elicit immune rejection reactions similar to those that occur following unsuccessful organ transplantation. In addition, there are many criticisms and dissent opinions from an ethical point of view regarding the use of ES cells established by destroying human embryos.
- iPS induced pluripotent stem cells
- An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition and a cosmetic composition that effectively utilize the medium of iPS cells.
- a pharmaceutical composition or a raw material for a pharmaceutical composition containing a supernatant of a medium used when reprogramming somatic cells containing a supernatant of a medium used when reprogramming somatic cells.
- an agent for preventing and improving the formation of any of skin spots, wrinkles and sagging which comprises the above-mentioned pharmaceutical composition or the raw material of the pharmaceutical composition.
- a cosmetic composition or a cosmetic composition raw material containing a supernatant of a medium used when reprogramming somatic cells a cosmetic composition or a cosmetic composition raw material containing a supernatant of a medium used when reprogramming somatic cells.
- an agent for preventing and improving the formation of any of skin spots, wrinkles, and sagging which comprises the above cosmetic composition or the cosmetic composition raw material.
- a collagen production promoter or a collagen production promoter raw material which comprises a supernatant of a medium used when reprogramming somatic cells.
- a hair-growing agent a hair-growing agent raw material, a hair-growing agent or a hair-growing agent raw material, which contains a supernatant of a medium used when reprogramming somatic cells.
- a dermal papilla cell activator or a dermal papilla cell activator raw material containing a supernatant of a medium used when reprogramming somatic cells is provided.
- a fibroblast growth factor family production promoter or a raw material for a fibroblast growth factor family production promoter which contains a supernatant of a medium used when reprogramming somatic cells.
- vascular endothelial cell growth factor production promoter or a vascular endothelial cell growth factor production promoter raw material, which contains a supernatant of a medium used for reprogramming somatic cells.
- a wound treatment agent or a raw material for a wound treatment agent which contains a supernatant of a medium used when reprogramming somatic cells.
- an epidermal cell growth promoting agent or a raw material for an epidermal cell growth promoting agent which contains a supernatant of a medium used when reprogramming somatic cells.
- a pharmaceutical composition or a raw material for a pharmaceutical composition which comprises an extract of stem cells.
- the stem cell extract may be a paste, or the stem cell extract may be freeze-dried.
- an agent for preventing and improving the formation of any of skin spots, wrinkles and sagging which comprises the above-mentioned pharmaceutical composition or the raw material of the pharmaceutical composition.
- a cosmetic composition or a cosmetic composition raw material containing an extract of stem cells there is provided a cosmetic composition or a cosmetic composition raw material containing an extract of stem cells.
- the stem cell extract may be a paste, or the stem cell extract may be freeze-dried.
- an agent for preventing and improving the formation of any of skin spots, wrinkles, and sagging which comprises the above cosmetic composition or the cosmetic composition raw material.
- a collagen production promoter or a collagen production promoter raw material containing an extract of stem cells there is provided a collagen production promoter or a collagen production promoter raw material containing an extract of stem cells.
- the stem cell extract may be a paste, or the stem cell extract may be freeze-dried.
- a hair growth agent a hair growth agent raw material, a hair growth agent or a hair growth agent raw material, which comprises an extract of stem cells.
- the stem cell extract may be a paste, or the stem cell extract may be freeze-dried.
- a dermal papilla cell activator or a dermal papilla cell activator raw material containing an extract of stem cells there is provided a dermal papilla cell activator or a dermal papilla cell activator raw material containing an extract of stem cells.
- the stem cell extract may be a paste, or the stem cell extract may be lyophilized.
- a fibroblast growth factor family production promoter or a raw material for a fibroblast growth factor family production promoter containing an extract of stem cells are provided.
- the stem cell extract may be a paste, or the stem cell extract may be freeze-dried.
- vascular endothelial cell growth factor production promoter or a vascular endothelial cell growth factor production promoter raw material containing an extract of a stem cell.
- the stem cell extract may be a paste, or the stem cell extract may be freeze-dried.
- a wound healing agent or a wound healing agent raw material containing an extract of stem cells there is provided a wound healing agent or a wound healing agent raw material containing an extract of stem cells.
- the extract of stem cells may be a paste, or the extract of stem cells may be freeze-dried.
- an epidermal cell growth promoting agent or an epidermal cell growth promoting agent raw material containing an extract of stem cells there is provided an epidermal cell growth promoting agent or an epidermal cell growth promoting agent raw material containing an extract of stem cells.
- the stem cell extract may be a paste, or the stem cell extract may be freeze-dried.
- a method for screening an ultraviolet substance is provided.
- a method for screening an anti-dry substance comprises culturing skin cells in each of a plurality of different solutions and selecting a solution having a high survival rate of skin cells.
- a method for screening an anti-dry substance comprises culturing skin cells in each of a plurality of different solutions, and selecting a solution in which tight junction damage of skin cells is small.
- At least one of occludin and claudin in tight junction may be analyzed.
- preparing skin cells differentiated from pluripotent stem cells prepared from somatic cells derived from aging disease patients or skin disease patients, applying oxidative stress to the skin cells, and oxidizing Provided is a method for screening an antioxidant stress substance, which comprises culturing stressed skin cells in each of a plurality of different solutions and selecting a solution having a high skin cell survival rate.
- preparing skin cells differentiated from pluripotent stem cells prepared from somatic cells derived from aging disease patients or skin disease patients, and culturing the skin cells in each of a plurality of different solutions And selecting a solution containing a large amount of a natural moisturizing factor derived from skin cells from a plurality of different solutions is provided.
- the natural moisturizing factor may be at least one of ceramide and filaggrin.
- an ultraviolet resistance inspection method including preparing skin cells differentiation-induced from pluripotent stem cells prepared from somatic cells derived from a subject, and inspecting skin cells for damage by ultraviolet rays An ultraviolet resistance inspection method is provided.
- preparing skin cells differentiated from pluripotent stem cells prepared from somatic cells derived from a subject, drying the skin cells, and examining the survival rate of the skin cells And a method for testing skin dryness resistance are provided.
- the present invention provides a method for testing skin dry resistance, which comprises:
- At least one of occludin and claudin in the tight junction may be analyzed in examining damage to the tight junction of skin cells.
- the present invention provides a method for testing skin oxidative stress resistance, including:
- preparing skin cells differentiated from pluripotent stem cells prepared from somatic cells derived from a subject culturing the skin cells, and the amount of the natural moisturizing factor derived from the skin cells And a method for examining the moisturizing ability of the skin.
- 5 is a graph showing the results of a hyaluronic acid production test using fibroblasts according to Example 2.
- 5 is a graph showing the results of a type I collagen production test using fibroblasts according to Example 4.
- 9 is a table showing the results of a type I collagen production test using fibroblasts according to Example 4.
- 9 is a graph showing the results of a hair papilla cell proliferation test according to Example 5.
- 9 is a table showing the results of a hair dermal papilla cell proliferation test according to Example 5.
- 9 is a graph showing the results of a VEGF production test using dermal papilla cells according to Example 6.
- 9 is a table showing the results of a VEGF production test using dermal papilla cells according to Example 6.
- 9 is a graph showing the results of an FGF-7 production test using dermal papilla cells according to Example 7.
- 9 is a table showing the results of FGF-7 production test using dermal papilla cells according to Example 7.
- 9 is a photograph showing the results of a fibroblast migration test according to Example 8.
- 9 is a photograph showing the results of a fibroblast migration test according to Example 8.
- 10 is a graph showing the results of a UV irradiation test on skin fibroblasts according to Example 10.
- 13 is a graph showing the results of a dryness stimulation test on skin fibroblasts according to Example 11.
- 13 is a graph showing the results of an oxidative stress test on skin fibroblasts according to Example 12.
- Example 13 is a graph showing the results of an oxidative stress test on skin fibroblasts according to Example 12. It is a microscope picture of the cell which concerns on a reference example. It is a microscope picture of the cell which concerns on a reference example. It is hiss and a graph which show the result of the flow cytometry of the cell which concerns on a reference example.
- Each of the pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition raw material, the cosmetic composition, and the cosmetic composition raw material according to the first embodiment is on the medium used when reprogramming somatic cells into pluripotent stem cells such as iPS cells. Including Qing.
- Each of the pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition raw material, the cosmetic composition, and the cosmetic composition raw material according to the first embodiment is on the medium used when reprogramming somatic cells into pluripotent stem cells such as iPS cells. It may include a freeze-dried product.
- Each of the pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition raw material, the cosmetic composition, and the cosmetic composition raw material according to the first embodiment is on the medium used when reprogramming somatic cells into pluripotent stem cells such as iPS cells.
- the liquid may be contained in a capsule such as a nanocapsule or an emulsion such as a nanoemulsion.
- IPS cells are induced by introducing reprogramming factors such as OCT3 / 4, KLF4, c-MYC, and SOX2 into somatic cells such as blood cells and differentiated cells such as fibroblasts. Inducing into iPS cells may be referred to as reprogramming, initialization, transformation, transdifferentiation (Transdifference or Lineage reprogramming), and cell fate change (Cell fate reprogramming).
- Pluripotent stem cells may be induced while being three-dimensionally cultured such as suspension culture. In the three-dimensional culture, a gel medium or a liquid medium may be used.
- the positive rate of any one of TRA1-60, OCT3 / 4, SSEA3, SSEA4, TRA1-81, and NANOG is 30% or more, 50% or more, preferably 80% or more.
- the gel medium may not contain feeder cells.
- human ES / iPS medium such as TeSR2 (STEMCELL Technologies) can be used.
- the medium is not limited to this, and various stem cell media can be used.
- Pluriton reprogramming medium (Stemgent), PluriSTEM (registered trademark), Stemfit AK02N, Stemfit AK03 (Ajinomoto), ESC-Sure (ESC-Sure). erum and feeder free medium for hESC / iPS (Applied StemCell), L7 (registered trademark) hPSC Culture System (LONZA), and Primate ES Cell Medium (ReproCELL) or the like may be utilized.
- the gel medium includes, for example, deacylated gellan gum in the above medium at a final concentration of 0.5% by weight to 0.001% by weight, 0.1% by weight to 0.005% by weight, or 0.05% by weight to 0% by weight. It is prepared by adding it so as to be 0.01% by weight.
- the gel medium includes gellan gum, hyaluronic acid, rhamsan gum, diutan gum, xanthan gum, carrageenan, fucoidan, pectin, pectic acid, pectinic acid, heparan sulfate, heparin, heparitin sulfate, keratosulfate, chondroitin sulfate, deltaman sulfate, rhamnan sulfate, and It may contain at least one polymer compound selected from the group consisting of salts thereof. Further, the gel medium may contain methyl cellulose. By including methyl cellulose, aggregation of cells is further suppressed.
- the gel medium may be poly (glycerol monomethacrylate) (PGMA), poly (2-hydroxypropylmethacrylate) (PHPMA), Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM), amineterminated, carboxylic acidterminated, maleimideterminated, N-hydroxysuccinimide (PNIPAM).
- PGMA poly (glycerol monomethacrylate)
- PPMA poly (2-hydroxypropylmethacrylate)
- PNIPAM Poly (N-isopropylacrylamide)
- each of the pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition raw material, the cosmetic composition, and the cosmetic composition raw material according to the first embodiment contains an extract of stem cells.
- the extract may be a liquid. That is, the extract may be an extract.
- Stem cells include pluripotent stem cells such as iPS cells, and embryonic stem cells (ES cells). Stem cells have, for example, a TRA1-60 or Oct3 / 4 positive rate of 30% or more, 50% or more, and preferably 80% or more.
- the medium contains b-FGF in an amount of 10 ng / ml or more, preferably 40 ng / ml or more.
- the stem cell extract may be a stem cell paste.
- the stem cell paste is obtained by grinding iPS cells.
- the stem cell extract may be a freeze-dried product.
- the stem cell extract may be in the form of powder.
- the stem cell extract may be a lysate of stem cells.
- the pharmaceutical composition according to the first embodiment may be a skin application composition.
- the pharmaceutical composition according to the first embodiment may be a skin disease therapeutic agent.
- diseases that can be treated with the therapeutic agent for skin diseases according to the first embodiment include acne vulgaris, psoriasis vulgaris, keloids, seborrheic dermatitis, contact dermatitis, atopic dermatitis, atopic dry skin.
- Inflammation dermatoporosis, actinic fibrosis, actinic keratoses, ptosis, alopecia areata, alopecia areata, hypotrichosis, chloasma, senile pigmented spots, eczema, freckles , Late bilateral Ota mother's plaque, seborrheic keratoses, skin diseases due to progeria, and herpes simplex.
- Examples of conditions that can be improved or eliminated by the cosmetic composition according to the first embodiment include spots, freckles, wrinkles, sagging, squeaks, reduced skin elasticity, dullness, sensitive skin, dry skin, and thin hair. Be done.
- the effect of the cosmetic composition according to the first embodiment is to condition the skin, condition the texture of the skin, keep the skin healthy, prevent rough skin, tighten the skin, moisturize the skin, moisture and oil content of the skin. Replenish, keep skin soft, protect skin, prevent dry skin, soften skin, give skin stick, give skin gloss, smooth skin, give skin stick, Examples include making spots less noticeable, suppressing wrinkles, and making the skin brighter.
- the scalp is kept healthy, hair growth, prevention of thinning hair, prevention of itch, prevention of hair loss, promotion of hair growth, promotion of hair growth, after illness or Examples include prevention of hair loss after childbirth and hair restoration.
- the pharmaceutical composition according to the first embodiment may be a wound treatment agent, an epidermal cell proliferation promoter, an epidermal turnover promoter, a hair growth agent, a hair growth agent, and an eyelash hypotrichosis drug.
- the pharmaceutical composition and the cosmetic composition according to the first embodiment include a collagen production promoter, hyaluronic acid production promoter, hair growth agent, fibroblast growth factor (FGF) family production promoter, and vascular endothelial cell growth factor ( It may be a VEGF) production promoter.
- hair growth During hair growth, the hair matrix cells of the hair root divide, and the cells generated from them divide into hair.
- hair growth has a cycle called a hair cycle, and repeats a growth phase, a catagen, and a resting phase.
- hair papilla cells influence the growth and differentiation of hair follicle epithelial stem cells and control the hair cycle.
- Activation of hair papilla cells and hair mother cells is said to contribute to the mechanism of hair growth.
- blood vessels are actively remodeled in hair follicles according to the hair cycle, but if there is a problem with angiogenesis at this time, the supply of nutrients and oxygen for hair formation becomes insufficient. Lack of blood flow from the hair follicle vascular network is said to be involved in the pathophysiology of male pattern baldness (AGA).
- VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
- AGA male pattern baldness
- VEGFB competes with and binds to VEGFR-1, which is a receptor on which VEGF acts.
- VEGFB has vascular endothelial cell proliferation and permeability enhancing activity, but its effect on hair follicles is unknown.
- the pharmaceutical composition and the cosmetic composition according to the first embodiment directly act on the papilla of the hair to increase the amount of FGF-7, which is a hair growth promoting factor, to be produced to promote hair growth, thereby increasing the growth period of the hair cycle.
- FGF-7 vascular endothelial growth factor
- the pharmaceutical composition and cosmetic composition according to the first embodiment are used as a hair growth agent or hair growth agent, other effects such as minoxidil, senburi, pantothenyl ethyl ether, tocopherol acetate, dipotassium glycyrrhizinate, and adenosine are used. It may contain components.
- wounds treatable with the wound treatment agent according to the first embodiment include burns, abrasions, lacerations, contusions, sutures, pressure sores, and skin defect wounds.
- the pharmaceutical composition and the cosmetic composition according to the first embodiment include an effective amount of the supernatant of the medium used when reprogramming somatic cells.
- the pharmaceutical composition and the cosmetic composition according to the first embodiment include an effective amount of the extract of stem cells.
- the effective amount means an amount capable of exerting an effect as a pharmaceutical composition or a cosmetic composition. The effective amount is appropriately set depending on the age of the patient, the target disease, the presence or absence of other successful ingredients, and the amount of other formulations.
- the pharmaceutical composition and cosmetic composition according to the first embodiment are pharmaceutically acceptable carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives. , And physiological saline and the like.
- excipients include lactose, starch, sorbitol, D-mannitol, and sucrose.
- disintegrants include carboxymethyl cellulose and calcium carbonate.
- buffering agents include phosphates, citrates, and acetates.
- emulsifying agents include gum arabic, sodium alginate, and tragacanth.
- suspending agents examples include glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, and sodium lauryl sulfate.
- soothing agents include benzyl alcohol, chlorobutanol, and sorbitol.
- stabilizers include propylene glycol and ascorbic acid.
- preservatives include phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, and methylparaben. Examples of preservatives include benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, and chlorobutanol.
- the pharmaceutical composition and cosmetic composition according to the first embodiment include water, alcohol, surfactants (cations, anions, nonions, amphoteric surfactants, etc.), moisturizers (glycerin, 1,3-butylene, etc.).
- Glycol propylene glycol, propanediol, pentanediol, polyquaternium, amino acid, urea, pyrrolidonecarboxylate, nucleic acids, monosaccharides, oligosaccharides, and their derivatives, thickeners (polysaccharides, polyacrylic acid) Salt, carboxyvinyl polymer, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, chitin, chitosan, alginic acid, carrageenan, xanthan gum, and methylcellulose, and their derivatives), wax, petrolatum, hydrocarbon saturated fatty acid, unsaturated fatty acid, and silicone oil, etc.
- Triglycerides such as glyceryl tri (capryl / caprate) and glyceryl trioctanoate, ester oils such as isopropyl stearate, natural oils and fats (olives oil, camellia oil, avocado oil, almond oil, cacao butter, evening primrose oil, grape seeds) Oil, macadamian nut oil, eucalyptus oil, rosehip oil, squalane, orange raffine oil, lanolin, ceramide, etc., preservatives (oxybenzoic acid derivative, dehydroacetate, photosensitizer, sorbic acid, phenoxyethanol, etc., and Derivatives, etc.), bactericides (sulfur, trichlorocarbanilide, salicylic acid, zinc pyrithione, hinokitiol, etc., and their derivatives), ultraviolet absorbers (para-aminobenzoic acid, methoxycinnamic acid, etc.,
- antioxidants tocopherol, BHA, BHT, astaxanthin, etc., and their derivatives
- chelating agents Edetic acid, hydroxyethanediphosphonic acid and the like, and derivatives thereof
- animal and plant extracts Ashitaba, Aloe, Ages, Ougon, Oataku, Seaweed, Karin, Chamomile, Licorice, Kiwi, Cucumber, Mulberry, Birch, Touki, (Garlic, button, hop, horse chestnut, lavender, rosemary, eucalyptus, milk, various peptides, placenta, royal jelly, euglena extract, hydrolyzed euglena extract, euglena oil, etc., and purified or fermented components thereof) , PH adjusters (inorganic acid, inorganic acid salt, organic acid, organic acid salt, etc., and derivatives thereof), vitamins (vitamin A, vitamin B, vitamin C, vitamin D, ubiquinone, and nicotine) Acid
- the components that can be added to the pharmaceutical composition and the cosmetic composition according to the first embodiment are not limited to those described above, and any component that can be used in the pharmaceutical composition and the cosmetic composition can be freely selected. is there.
- a base kaolin, bentonite, etc.
- a gelling agent polyacrylate, polyvinyl alcohol, etc.
- a sulfate, a hydrogen carbonate, a borate, a pigment, and a moisturizer are appropriately blended within a range to achieve the purpose, and a powder type Alternatively, it may be prepared as a liquid type.
- the pharmaceutical composition and the cosmetic composition according to the first embodiment can be produced by a method well known and commonly used in the relevant technical field.
- the screening method for an anti-ultraviolet substance according to the second embodiment is to prepare skin cells differentiated from iPS cells prepared from somatic cells derived from aging disease patients such as progeria patients and skin disease patients or skin disease patients. Irradiating the skin cells that have been optionally differentiated with ultraviolet light, culturing the skin cells that have been irradiated with ultraviolet light with each of a plurality of different solutions, and receiving a solution or ultraviolet light that causes less damage to the skin cells due to ultraviolet light. Selecting a solution with fast repair of skin cells.
- the patient is not limited to humans and includes non-human animals.
- progeria examples include Werner syndrome, xeroderma pigmentosum and Cockayne syndrome, but are not particularly limited.
- Somatic cells derived from progeria patients are, for example, fibroblasts, blood cells, epithelial cells, somatic stem cells, keratinocytes, dermal papilla cells, and dental pulp stem cells, but are not particularly limited.
- iPS cells are induced by introducing reprogramming factors such as OCT3 / 4, KLF4, c-MYC, and SOX2 into somatic cells derived from progeria patients.
- iPS cells are seeded in a low cell adhesion dish containing a culture solution containing no bFGF.
- the medium is replaced every 2 days, and the embryoid body (EB) formed after 8 days is seeded on the dish, the cells are allowed to adhere to the dish, and the cells are cultured in the 10% FBS medium.
- the cells become confluent, they are detached from the dish with trypsin and subcultured. Similarly, subculture is repeated for 1 month.
- a fibroblast marker such as CD13
- an iPS cell marker such as TRA 1-60.
- the skin cells for which differentiation is induced are, for example, skin fibroblasts, but are not particularly limited.
- Dermal cells which have been induced to differentiate, are irradiated with ultraviolet rays (UV) after being appropriately cultured.
- the intensity of ultraviolet light, the wavelength range, and the irradiation time are appropriately set according to the application, usage and dose of the anti-ultraviolet substance to be screened.
- the UV-irradiated skin cells are cultured in each of a plurality of different solutions each containing a different substance to be screened.
- the solution may be a medium.
- the substance to be screened in the solution, the culture time, etc. are appropriately set according to the application, usage, dose, etc. of the anti-ultraviolet substance to be screened.
- a solution that causes less damage to skin cells or a solution that repairs skin cells faster as a solution containing an anti-UV substance For example, analyze the skin cells cultured in each of a plurality of solutions, select one or a group of solutions used for the culture of less damaged skin cells, the solution used for the culture of more damaged skin cells Exclude one or a group of. Alternatively, skin cells cultured in each of a plurality of solutions are analyzed, and one or a group of solutions used for culturing skin cells that have been rapidly repaired is selected, and skin cells that have been slowly repaired or skin cells that have not been repaired are selected. Exclude one or a group of the solutions used for the culture.
- skin cells derived from iPS cells derived from somatic cells derived from aging disease patients or skin disease patients are the same as skin cells of healthy individuals. In comparison, it tends to have no resistance to UV irradiation. Therefore, an effective anti-ultraviolet substance can be screened by using skin cells derived from iPS cells derived from somatic cells derived from aging disease patients or skin disease patients such as progeria patients and skin disease patients. It is possible.
- the UV resistance test method for skin provides a skin cell differentiated from pluripotent stem cells prepared from somatic cells derived from a subject, irradiating the skin cell with UV light, and Inspecting skin cells for damage.
- the subject may be a patient with a disease or a healthy person.
- the somatic cells derived from the subject have already been obtained from the subject, and the method may not include the step of obtaining somatic cells from the subject. If the skin cells are greatly damaged by the ultraviolet rays, it may be determined that the skin cells of the subject do not have ultraviolet resistance. If the damage to the skin cells due to ultraviolet rays is small, it may be determined that the skin cells of the subject have ultraviolet resistance. According to the method, it is possible to inspect whether or not the skin cells of the subject have ultraviolet resistance, based on the inspection result of the damage to the skin cells by ultraviolet rays.
- the method for screening an anti-dry substance according to the fourth embodiment provides skin cells differentiated from iPS cells produced from somatic cells derived from aging disease patients such as progeria patients and skin disease patients, or skin disease patients. And drying the skin cells, culturing the dried skin cells with each of a plurality of different solutions, and selecting a solution having a high survival rate of the skin cells.
- Skin cells that have been induced to differentiate as in the second embodiment are appropriately cultured and then dried.
- the skin cells are dried, for example, the medium around the skin cells is removed.
- An air stream may be applied to the skin cells, or the skin cells may be dried using a desiccant or the like.
- the method for drying the skin cells and the drying time are appropriately set according to the application, usage and dose of the anti-dry substance to be screened.
- the dried skin cells are cultured in each of a plurality of different solutions each containing a different substance to be screened.
- the solution may be a medium.
- the substance to be screened in the solution, the culture time and the like are appropriately set according to the application, usage and dose of the anti-dry substance to be screened.
- measure the survival rate of skin cells cultured in each of the multiple solutions and select the solution with a high skin cell survival rate as the solution containing the anti-dry substance. For example, measuring the survival rate of skin cells cultured in each of a plurality of solutions, select one or a group of solutions used for the culture of skin cells with high survival rate, and culture the skin cells with low survival rate. Exclude one or a group of the solutions used in.
- a solution with less damage to the skin cell tight junction may be selected.
- at least one of occludin and claudin in the tight junction may be analyzed and a solution containing a large amount of at least one of occludin and claudin may be selected.
- the tight junction is damaged and the amount of occludin and claudin is reduced.
- skin cells derived from iPS cells derived from somatic cells derived from aging disease patients or skin disease patients are the same as skin cells of healthy individuals. In comparison, it tends to have no resistance to drying. Therefore, an effective anti-dry substance can be screened by using skin cells derived from iPS cells derived from somatic cells derived from patients with aging diseases such as patients with progeria and skin diseases or patients with skin diseases. It is possible.
- the method for testing the skin dry tolerance provides a skin cell differentiated from a pluripotent stem cell prepared from somatic cells derived from a subject, drying the skin cell, and Examining viability.
- the subject may be a patient with a disease or a healthy person.
- the somatic cells derived from the subject have already been obtained from the subject, and the method may not include the step of obtaining somatic cells from the subject. If the skin cell survival rate is high, it may be determined that the skin cells of the subject have drought tolerance. If the skin cell survival rate is low, it may be determined that the skin cells of the subject do not have drought tolerance. According to this method, it is possible to test whether or not the skin cells of the subject have drought tolerance based on the test result of the survival rate of skin cells.
- damage to tight junctions of skin cells may be examined.
- the skin cells of the subject may be resistant to drought, and when the damage of the tight junction is large, it may be determined that the skin cells of the subject are not drought resistant.
- the method for screening antioxidant stress substances according to the sixth embodiment prepares skin cells differentiated from iPS cells prepared from somatic cells derived from aging disease patients such as progeria patients and skin disease patients, or skin disease patients. And applying oxidative stress to the skin cells, culturing the oxidatively stressed skin cells in each of a plurality of different solutions, and selecting a solution having a high survival rate of the skin cells. ..
- the method of applying oxidative stress to skin cells is not particularly limited, but includes, for example, adding an oxidizing substance such as hydrogen peroxide to a medium in which skin cells are cultured.
- the method of applying oxidative stress to skin cells and the time of applying oxidative stress to skin cells are appropriately set according to the application, usage, dose, etc. of the antioxidant stress substance to be screened.
- the oxidatively stressed skin cells are cultured in each of a plurality of different solutions each containing a different substance to be screened after removing the substance that gives an oxidative stress.
- the solution may be a medium.
- the substance to be screened in the solution, the culture time and the like are appropriately set according to the use, usage and dose of the antioxidant stress substance to be screened.
- measure the survival rate of skin cells cultured in each of multiple solutions and select the solution with high survival rate of skin cells as the solution containing antioxidant stress substances. For example, measuring the survival rate of skin cells cultured in each of a plurality of solutions, select one or a group of solutions used for the culture of skin cells with high survival rate, and culture the skin cells with low survival rate. Exclude one or a group of the solutions used in.
- skin cells derived from iPS cells derived from somatic cells derived from aging disease patients or skin disease patients are the same as skin cells of healthy individuals. In comparison, it tends to have no resistance to oxidative stress. Therefore, by using skin cells derived from iPS cells derived from somatic cells derived from aging patients or skin disease patients such as progeria patients and skin disease patients, effective screening of antioxidant stress substances Is possible.
- the skin oxidative stress resistance test method according to the seventh embodiment provides skin cells differentiated from pluripotent stem cells prepared from somatic cells derived from a subject, and imparts oxidative stress to the skin cells, Examining skin cell viability.
- the subject may be a patient with a disease or a healthy person.
- the somatic cells derived from the subject have already been obtained from the subject, and the method may not include the step of obtaining somatic cells from the subject. If the damage to the skin cells due to oxidative stress is large, it may be determined that the skin cells of the subject do not have oxidative stress resistance. If the damage to the skin cells due to oxidative stress is small, it may be determined that the skin cells of the subject have oxidative stress resistance. According to this method, it is possible to test whether or not the skin cells of the subject have resistance to oxidative stress based on the test result of the damage to skin cells due to oxidative stress.
- a method for screening a moisturizing promoter provides skin cells differentiated from pluripotent stem cells prepared from somatic cells derived from aging disease patients such as progeria patients and skin disease patients or skin disease patients. And culturing the skin cells in each of a plurality of different solutions, and selecting from the plurality of different solutions a solution having a large amount of natural moisturizing factor derived from skin cells.
- the differentiation-induced skin cells are cultured in each of a plurality of different solutions containing different substances to be screened.
- the substance to be screened in the solution, the culture time and the like are appropriately set according to the use, usage and dose of the moisture retention promoting substance to be screened.
- Natural moisturizing factors include, but are not limited to, ceramide and filaggrin.
- a solution having a large amount of natural moisturizing factor is selected as a solution containing a moisturizing promoter. For example, measure the amount of natural moisturizing factor in each of a plurality of solutions, select one or a group of solutions with a high amount of natural moisturizing factor, and exclude one or a group of solutions with a low amount of natural moisturizing factor. ..
- an effective moisturizing promoter can be screened by using skin cells derived from iPS cells derived from somatic cells derived from aging disease patients or skin disease patients such as progeria patients and skin disease patients. It is possible.
- the method for examining the moisturizing ability of the skin includes preparing skin cells differentiated from pluripotent stem cells prepared from somatic cells derived from a subject, culturing the skin cells, and Testing the amount of natural moisturizing factor derived from.
- the subject may be a patient with a disease or a healthy person.
- the somatic cells derived from the subject have already been obtained from the subject, and the method may not include the step of obtaining somatic cells from the subject. If the amount of the natural moisturizing factor derived from skin cells is large, it may be determined that the skin cells of the subject have high moisturizing ability. If the amount of natural moisturizing factor derived from skin cells is small, it may be determined that the skin cells of the subject have low moisturizing ability. According to this method, it is possible to test whether or not the skin cells of the subject have moisturizing ability based on the test result of the amount of the natural moisturizing factor derived from skin cells.
- Example 1 Preparation of medium cultivated while reprogramming blood cells into iPS cells
- a hematopoietic cell culture medium was prepared by developing a growth factor in a serum-free and animal-derived component-free hematopoietic cell culture medium (Stemspan ACF, STEMCELL TECHNOLOGIES).
- 2 ⁇ 10 5 blood cells peripheral blood mononuclear cells
- a hematopoietic cell gel medium was added dropwise to each well to dissociate the blood cells in the hematopoietic cell gel medium.
- the 12-well dish was left to stand in a CO 2 incubator at 37 ° C., and the cells were subjected to suspension culture.
- hematopoietic cell gel medium was appropriately added to each well.
- the Sendai virus vector kit (CytoTune 2.0 Reprogramming Kit, registered trademark, Thermo Fisher) for producing iPS cells so that the virus titer is 1 to 20.
- a gel medium was added to each well to culture the cells.
- Gellan gum was added to the hES medium to a final concentration of 0.02% to prepare a stem cell gel medium. Two days after the infection, 2 mL of the stem cell gel medium was added to each well once every two days. 14 days after infection, it was confirmed that iPS cell mass was induced, and the gel medium supernatant was collected. The recovered gel medium supernatant was filtered and sterilized, and the gel medium supernatant that passed through the filter was used as the supernatant of the reprogramming medium according to Example 1.
- the human iPS cells maintained and cultured as described above were separated from the petri dish for adhesion culture using an ES cell dissociation solution (TrypLE Select, registered trademark, ThermoFisher), and divided into single cells. Then, gellan gum and 10 ⁇ mol / L ROCK inhibitor (Selleck) were added to the gelled medium for stem cells, and the human iPS cells were seeded, and the human iPS cells were suspension-cultured for 14 days. In the case of suspension culture for 14 days, the incubator was supplemented with the gelled medium for stem cells once every two days.
- the gelled stem cell culture medium in which human iPS cells were suspended was filtered with a mesh filter to remove cell clumps. Further, the filtered gelated stem cell medium was centrifuged at 1500 g for 5 minutes to precipitate the cells and gel, and the supernatant of the centrifuged stem cell medium was collected again, and then centrifuged at 3000 rpm for 3 minutes, and the stem cells after centrifugation were centrifuged. The culture medium supernatant was filtered through a 0.22 ⁇ m filter. The supernatant of the medium for stem cells after filtration was used as the supernatant of the medium in which the iPS cells according to Reference Example 1 were maintained and cultured.
- the iPS cells maintained in culture were positive for the undifferentiation markers NANOG, OCT3 / 4, and TRA 1-60.
- Example 2 Hyaluronic acid production test using fibroblasts
- As the growth medium A a DMEM medium containing 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin was prepared. Next, adult-derived normal human fibroblasts (KF-4109, Strain No. 01035, Kurabo) were suspended in growth medium A at a concentration of 5 ⁇ 10 3 cells / 0.1 mL / well, and then added to a 96-well plate. The cells were seeded on and cultured in a CO 2 incubator (5% CO 2 , 37 ° C.) for 1 day.
- a CO 2 incubator 5% CO 2 , 37 ° C.
- test medium A a DMEM medium containing 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin was prepared. Next, each of the supernatant solutions according to Example 1 and Reference Example 1 and the test medium A were mixed to obtain a supernatant-added medium A according to Example 1 and Reference Example 1 having a concentration of 10%. It was The growth medium A in some of the wells in which the fibroblasts were cultured was replaced with each of the supernatant-added medium A according to Example 1 and Reference Example 1. In addition, as a negative control, the growth medium A in some wells was replaced with DMEM medium (addition-free test medium A) to which FBS, penicillin-streptomycin, and the supernatant were not added.
- the fibroblasts were cultured for 3 days, the supernatant of the medium was collected, and the hyaluronic acid concentration in the supernatant of the medium was measured using DueSet Hyaluronan (Cat. No. DY3614, R & D Systems). did.
- DueSet Hyaluronan Cat. No. DY3614, R & D Systems.
- the results are shown in Figure 1.
- the fibroblasts cultured in the medium containing the supernatant of the reprogramming medium according to Example 1 were compared with the fibroblasts cultured in the medium containing the supernatant of the medium in which the iPS cells according to Reference Example 1 were maintained and cultured. Then, it was confirmed that more than double the amount of hyaluronic acid was produced.
- Example 3 Preparation of iPS cell extract
- iPS cells were cultivated on each of Matrigel coat and laminin coat using Teser 1, Teser 2, Stem Fit, Essential 8, Teser-E8, Nutri Stem.
- Teser 1 Teser 2
- Teser 2 Stem Fit
- Essential 8 Teser-E8 Nutri Stem.
- the iPS cells are 80% confluent, the iPS cells are detached from the incubator using Triple Select, the solution containing the detached iPS cells is centrifuged at 200 g for 5 minutes, and the iPS cells are placed in a 1.5 mL tube. Collected in.
- the cell mass of iPS cells was ground with a scouring tree (Pestle in G-Tube, Thermo Fisher), and the iPS cell extract containing the paste of the ground iPS cells was snap frozen with liquid nitrogen.
- a scouring tree Pestle in G-Tube, Thermo Fisher
- the iPS cell extract containing the paste of the ground iPS cells was snap frozen with liquid nitrogen.
- suspend the iPS cell extract in 5 mL of the culture medium, incubate overnight at 4 ° C., and then centrifuge the suspension for 10 minutes at 1500 g to remove cell debris. Removed from solution. Then, the solution was filtered with a filter, and the solution that passed through the filter was used as an iPS cell extract.
- Example 4 Type I collagen production test using fibroblasts
- a test medium A was prepared in the same manner as in Example 2.
- the iPS cell extract according to Example 3 and the test medium A are mixed to extract the iPS cells according to Example 3 having a concentration of 50.0 v / v% or 100.0 v / v%.
- the extract-containing medium A containing the liquid was obtained.
- the growth medium A in some of the wells in which the fibroblasts were cultured was replaced with the extract-added medium A.
- the growth medium A in some wells was replaced with DMEM medium (addition-free test medium A) to which FBS, penicillin-streptomycin, and iPS cell extract were not added.
- the fibroblasts were cultured for 3 days, and the supernatant of the medium was collected and stored at -80 ° C. Then, the supernatant of the medium was thawed, and the concentration of type I collagen in the supernatant of the medium was measured by human collagen type 1 ELISA kit (Cat. No. EC1-E105). The results are shown in FIGS. 2 and 3. It was confirmed that the fibroblasts cultured in the medium containing the iPS cell extract produced more collagen than the fibroblasts cultured in the medium containing no iPS cell extract. Was done.
- Example 5 Proliferative test of hair papilla cells
- a growth medium B a medium for exclusive use of dermal papilla cells (Cat. No. TMTPGM-250) to which exclusive additives (fetal bovine serum, insulin / transferrin / triiodothyronine mixed solution, bovine pituitary extract, cyproterone acetate) have been added , TOYOBO) was prepared.
- exclusive additives fetal bovine serum, insulin / transferrin / triiodothyronine mixed solution, bovine pituitary extract, cyproterone acetate
- the extract of iPS cells according to Example 3 was mixed with a medium for exclusive use of dermal papilla cells (additive-free test medium B) to which no additive was added, and the concentration was 50.0 v / v% or 100.0 v.
- An extract-containing medium B containing the extract of iPS cells according to Example 3 in an amount of / v% was obtained.
- the growth medium B of a part of the wells was replaced with a dermal papilla cell-dedicated medium (addition-free test medium B) to which the additive and the extract of iPS cells were not added.
- Hair papilla cells were cultured in the replaced medium for 3 days, and the viable cell count was measured by the WST-8 method. The results are shown in FIGS. 4 and 5.
- the additive-free test medium B containing the extract of iPS cells according to Example 3 was used, dermal papilla cells were predominant as compared with the case of using the additive-free test medium B containing no extract of iPS cells. It was confirmed that they proliferated. Therefore, it was suggested that the iPS cell extract has hair growth and hair growth effects such as treatment of thinning hair, prevention of hair loss, promotion of hair growth, and promotion of hair growth.
- Example 6 VEGF production test using dermal papilla cells
- normal human hair papilla cells were cultured in growth medium B for 1 day.
- the supernatant of the reprogramming medium according to Example 1 was added so that the concentration was 10.0 v / v% and 20.0 v / v%.
- the iPS cell extract according to Example 3 was added to the growth medium B in some wells so that the concentrations were 50.0 v / v% and 100.0 v / v%.
- the growth medium B of some wells was replaced with the non-addition test medium B.
- a growth medium B of a part of the wells adenosine-containing medium prepared by adding 100 ⁇ mol / L adenosine to the hair papilla cell-dedicated medium, and minoxidil prepared by adding 30 ⁇ mol / L minoxidil to the hair papilla cell-dedicated medium was used.
- Each of the supplemented media was replaced.
- the growth medium B in some wells was replaced with a DMSO-containing medium in which 0.1% DMSO was added to the hair papilla cell-dedicated medium.
- the dermal papilla cells were cultured for 3 days, and the supernatant of the medium was collected and stored at -80 ° C. Then, the supernatant of the medium was thawed, and the concentration of fibroblast growth factor 7 (FGF-7) in the supernatant of the medium was measured by FGF-7 Human ELISA kit (Cat. No. ab100519, Abcam). The results are shown in FIGS. 6 and 7. It was shown that the supernatant of the medium in which iPS cells were induced and cultured and the extract of iPS cells promote VEGF production of dermal papilla cells. This suggested that the supernatant of the medium in which iPS cells were induced and cultured and the extract of iPS cells were effective for hair growth, hair growth and hair growth.
- FGF-7 Human ELISA kit Cat. No. ab100519, Abcam
- Example 7 FGF-7 production test using dermal papilla cells
- normal human hair papilla cells were cultured in growth medium B for 1 day.
- the supernatant of the reprogramming medium according to Example 1 was added so that the concentration was 10.0 v / v% and 20.0 v / v%.
- the iPS cell extract according to Example 3 was added to the growth medium B in some wells so that the concentrations were 50.0 v / v% and 100.0 v / v%.
- the growth medium B of some wells was replaced with the non-addition test medium B.
- a growth medium B of a part of the wells adenosine-containing medium prepared by adding 100 ⁇ mol / L adenosine to the hair papilla cell-dedicated medium, and minoxidil prepared by adding 30 ⁇ mol / L minoxidil to the hair papilla cell-dedicated medium was used.
- Each of the supplemented media was replaced.
- the growth medium B in some wells was replaced with a DMSO-containing medium in which 0.1% DMSO was added to the hair papilla cell-dedicated medium.
- the dermal papilla cells were cultured for 3 days, and the supernatant of the medium was collected and stored at -80 ° C. Then, the supernatant of the medium was thawed, and the concentration of fibroblast growth factor 7 (FGF-7) in the supernatant of the medium was measured by FGF-7 Human ELISA kit (Cat. No. ab100519, Abcam). The results are shown in FIGS. 8 and 9. It was shown that the supernatant of the medium in which iPS cells were induced and cultured and the extract of iPS cells promoted the production of FGF-7 in hair papilla cells. This suggested that the supernatant of the medium in which iPS cells were induced and cultured and the extract of iPS cells were effective for hair growth, hair growth and hair growth.
- FGF-7 Human ELISA kit Cat. No. ab100519, Abcam
- Example 8 Migration test of fibroblasts
- the human fibroblasts were treated with 10 ⁇ g / mL mitomycin C (Cat. No. 20898-21, Nacalai tesque) for 2 hours to stop the cell division of the human fibroblasts.
- the human fibroblasts were cultured in a CO 2 incubator (5% CO 2 , 37 ° C) for 1 day.
- the medium in some plates was replaced with a medium containing 10% FBS medium to which the extract of iPS cells according to Example 3 was added so that the concentration was 10 v / v%. Further, the medium in a part of the plate was changed to a medium in which the supernatant of the reprogramming medium according to Example 1 was added to 10% FBS medium so that the concentration became 10.0 v / v% and 20.0 v / v%. Replaced.
- test medium B As a negative control, the growth medium B on some plates was replaced with an epidermal cell medium to which no growth additive was added (test medium B without addition).
- human fibroblasts were treated and migration test was performed. In the process of wound healing, human fibroblasts migrate toward the wound and the wound contracts. In this Example, it was analyzed using a plate reader whether or not human fibroblasts migrated to the area where human fibroblasts were not adhered to and blocked by a stopper before the migration test. Specifically, 23 hours after the medium was replaced, epidermal cells were stained with Hechest and observed.
- Example 9 Preparation of cells derived from progeria patients
- Werner syndrome patient-derived fibroblasts AG04110
- xeroderma pigmentosum patient-derived fibroblasts GM16684 and GM16687
- cocaine syndrome patient-derived fibroblasts GM010978
- Fibroblasts derived from these progeria patients were induced into iPS cells. Further, iPS cells were induced to differentiate into skin fibroblasts.
- Example 10 UV irradiation test of skin fibroblasts
- Test medium A a concentration of 2 ⁇ 10 5 cells / well.
- 6-well plate a CO 2 incubator (5% CO 2 , 37 ° C.) for 1 day.
- the cells irradiated with UV had a higher dead cell rate than the cells not irradiated with UV.
- skin fibroblasts derived from somatic cells of progeria patients had higher mortality due to UV irradiation than normal skin fibroblasts.
- the skin fibroblasts in the medium to which the supernatant of the medium when the iPS cells were maintained were added were the skin fibroblasts in the medium to which the supernatant of the medium when the iPS cells were maintained and cultured were not added. The survival rate was higher. Therefore, it was suggested that skin fibroblasts derived from somatic cells of progeria patients are sensitive to UV irradiation and suitable for screening for anti-UV substances.
- Example 11 Skin fibroblast dryness stimulation test
- the adult-derived normal human dermal fibroblasts and the dermal fibroblasts derived from the somatic cells of the progeria patients prepared in Example 9 were each cultured for 1 day using the test medium A. The next day, each well was dried for 40 seconds in the vent of the clean bench. Next, the test medium A in some of the wells was replaced with the supernatant-added medium A according to Reference Example 1. Moreover, the supernatant solution according to Example 1 and the test medium A were mixed at a volume ratio of 10.00: 90.00, and the concentration was 10.00 v / v% according to Example 1. Supernatant-added medium A was obtained.
- test medium A in some of the wells was replaced with the supernatant-added medium A according to Example 1.
- the next day all cells were detached from the wells with trypsin, the cells were stained with 7-aminoactinomycin D (7-AAD), and the dead cell rate was measured using a flow cytometer.
- skin fibroblasts derived from somatic cells of progeria patients had a higher mortality rate due to dryness stimulation.
- the skin fibroblasts in the medium to which the supernatant of the medium when the iPS cells were maintained were added were the skin fibroblasts in the medium to which the supernatant of the medium when the iPS cells were maintained and cultured were not added. The survival rate was higher.
- skin fibroblasts in the medium to which the supernatant of the medium when inducing culture of blood cells into iPS cells are added are the skin fibroblasts in the medium to which the supernatant of the medium when maintaining and culture iPS cells is added. Viability was higher than cells. Therefore, it was suggested that dermal fibroblasts derived from somatic cells of progeria patients are sensitive to dryness stimuli and are suitable for screening for anti-dryness stimulants.
- Example 12 Oxidative stress test of skin fibroblasts
- the adult-derived normal human dermal fibroblasts and the dermal fibroblasts derived from the somatic cells of the progeria patients prepared in Example 9 were each cultured for 1 day using the test medium A.
- hydrogen peroxide was added to the test medium A in each well so that the concentration was 0.03%.
- the medium in some of the wells was returned to the test medium A containing no hydrogen peroxide.
- the medium in a part of the wells was replaced with each of the supernatant-added medium A according to Example 1 and Reference Example 1.
- the medium in some of the wells was replaced with the medium containing the extract of iPS cells according to Example 3.
- all cells were detached from the wells with trypsin, the cells were stained with 7-aminoactinomycin D (7-AAD), and the dead cell rate was measured using a flow cytometer.
- FIG. 15 shows the dead cell rate of skin fibroblasts derived from somatic cells of xeroderma pigmentosum patients.
- a medium to which the supernatant of the medium when the iPS cells were maintained and cultured was added, a medium to which the supernatant of the medium when the blood cells were induced and cultured to the iPS cells was added, and an extract of the iPS cells.
- the skin fibroblasts in the medium supplemented with was more viable than the skin fibroblasts in the non-supplemented test medium A. Therefore, it was suggested that skin fibroblasts derived from somatic cells of xeroderma pigmentos are sensitive to oxidative stress and are suitable for screening antioxidant stress substances.
- Human iPS cells were cultured according to the examples described in JP-A-2016-128396. That is, using the same stem cell culture medium as in Example 1, human iPS cells were adherently maintained and cultured on feeder cells on a petri dish for adherent culture. Human iPS cells were passaged every week. At passage, human iPS cells were treated with a detachment solution containing 0.25% trypsin, 0.1 mg / mL collagenase IV, 1 mmol / L CaCl 2 , and 20% KSR.
- the human iPS cells cultured as described above were detached from the petri dish for adhesion culture using an ES cell dissociation solution (TrypLE Select, registered trademark, ThermoFisher).
- the peeled human iPS cells were suspended and cultured in non-gelled human iPS cells in a non-adhesion culture dish for 1 week.
- embryoid bodies EB
- the formed embryoid bodies were seeded on a petri dish for adherent culture, and grown for 1 week in DMEM containing 10% FBS and 1% anti-anti (registered trademark, antifungal agent).
- the cells were detached from the dish for adhesion culture using a 0.05% trypsin-EDTA solution, and the cells divided into single cells were seeded on a new dish for adhesion culture. Then, the cells were cultured for 1 week using DMEM containing 10% FBS as a medium.
- FIG. 16 (b) shows a photograph of cells observed without using excitation light.
- FIG. 17 (b) shows a photograph of cells observed using excitation light corresponding to the fluorescent reagent bound to the anti-OCT3 / 4 antibody.
- FIG. 17 (c) shows a photograph of cells observed using excitation light corresponding to the fluorescent reagent bound to the anti-NANOG antibody.
- No fluorescence was observed in FIGS. 17 (b) and 17 (c), confirming that the cells were OCT3 / 4 negative and NANOG negative.
- the cultured cells were negative for the undifferentiated markers NANOG, OCT3 / 4, and TRA 1-60. Therefore, it was confirmed that the cells did not maintain the undifferentiated state and were differentiated.
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Abstract
多能性幹細胞を誘導培養した培地の上清を含む、医薬品組成物又は医薬品組成物原料が提供される。
Description
本発明は、医薬品組成物及び化粧品組成物に関する。
胚性幹細胞(ES細胞)は、ヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞である。ES細胞は、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を有する。現在、ヒトES細胞は、パーキンソン病、若年性糖尿病、及び白血病等、多くの疾患に対する細胞移植療法に利用可能である。しかし、ES細胞の移植には障害もある。特に、ES細胞の移植は、不成功な臓器移植に続いて起こる拒絶反応と同様の免疫拒絶反応を惹起しうる。また、ヒト胚を破壊して樹立されるES細胞の利用に対しては、倫理的見地から批判や反対意見が多い。
このような背景の状況の下、京都大学の山中伸弥教授は、4種の遺伝子:OCT3/4、KLF4、c-MYC、及びSOX2を体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞(iPS細胞)を樹立することに成功した。これにより、山中教授は、2012年のノーベル生理学・医学賞を受賞した(例えば、特許文献1参照。)。iPS細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞である。したがって、iPS細胞は、細胞移植療法への利用が期待されている。一方、iPS細胞の培養に用いた培地を、医薬品組成物に再利用したとの報告がある(例えば、特許文献2参照。)。
しかし、本発明者らが検証したところ、特許文献2に記載の培養方法では、iPS細胞は分化してしまうため、実際にはiPS細胞ではなく分化した細胞を培養した培地が再利用されているものと考えられる。本発明は、iPS細胞の培地を有効活用した医薬品組成物及び化粧品組成物を提供することを目的の一つとする。
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、医薬品組成物又は医薬品組成物原料が提供される。
本発明の態様によれば、上記の医薬品組成物又は医薬品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤が提供される。
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、化粧品組成物又は化粧品組成物原料が提供される。
本発明の態様によれば、上記の化粧品組成物又は化粧品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤が提供される。
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、コラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料が提供される。
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、発毛剤、発毛剤原料、育毛剤又は育毛剤原料が提供される。
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料が提供される。
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料が提供される。
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料が提供される。
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、創傷治療剤又は創傷治療剤原料が提供される。
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料が提供される。
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、医薬品組成物又は医薬品組成物原料が提供される。
上記の医薬品組成物又は医薬品組成物原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。
本発明の態様によれば、上記の医薬品組成物又は医薬品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤が提供される。
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、化粧品組成物又は化粧品組成物原料が提供される。
上記の化粧品組成物又は化粧品組成物原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。
本発明の態様によれば、上記の化粧品組成物又は化粧品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤が提供される。
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、コラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料が提供される。
上記のコラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、発毛剤、発毛剤原料、育毛剤又は育毛剤原料が提供される。
上記の発毛剤、発毛剤原料、育毛剤又は育毛剤原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料が提供される。
上記の毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料が提供される。
上記の線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料が提供される。
上記の血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、創傷治療剤又は創傷治療剤原料が提供される。
上記の創傷治療剤又は創傷治療剤原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料が提供される。
上記の表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。
本発明の態様によれば、老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に紫外線を照射することと、紫外線を照射された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、紫外線による皮膚細胞のダメージが少ない培地又は紫外線を受けた皮膚細胞の修復が早い溶液を選択することと、を含む、抗紫外線物質のスクリーニング方法が提供される。
本発明の態様によれば、老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、乾燥された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、を含む、抗乾燥物質のスクリーニング方法が提供される。
本発明の態様によれば、老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、乾燥された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷が小さい溶液を選択することと、を含む、抗乾燥物質のスクリーニング方法が提供される。
上記の方法において、タイトジャンクションにおけるオクルディン及びクローディンの少なくとも一方を分析してもよい。
本発明の態様によれば、老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、酸化ストレスを与えられた皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、を含む、抗酸化ストレス物質のスクリーニング方法が提供される。
本発明の態様によれば、老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、複数の異なる溶液から皮膚細胞由来の天然保湿因子の量が多い溶液を選択することと、を含む、保湿促進物質のスクリーニング方法が提供される。
上記の方法において、天然保湿因子がセラミド及びフィラグリンの少なくも一方であってもよい。
本発明の態様によれば、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、紫外線による皮膚細胞のダメージを検査することと、を含む、皮膚の紫外線耐性検査方法が提供される。
本発明の態様によれば、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、皮膚細胞の生存率を検査することと、を含む、皮膚の乾燥耐性検査方法が提供される。
本発明の態様によれば、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷を検査することと、を含む、皮膚の乾燥耐性検査方法が提供される。
上記の方法において、皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷を検査することにおいて、タイトジャンクションにおけるオクルディン及びクローディンの少なくとも一方を分析してもよい。
本発明の態様によれば、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、皮膚細胞の生存率を検査することと、を含む、皮膚の酸化ストレス耐性検査方法が提供される。
本発明の態様によれば、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を培養することと、皮膚細胞由来の天然保湿因子の量を検査することと、を含む、皮膚の保湿能力の検査方法が提供される。
本発明によれば、iPS細胞の培地を有効活用した医薬品組成物及び化粧品組成物を提供可能である。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
(第1実施形態)
第1実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、体細胞をiPS細胞等の多能性幹細胞にリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む。第1実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、体細胞をiPS細胞等の多能性幹細胞にリプログラミングした際に使用した培地の上清の凍結乾燥物を含んでいてもよい。第1実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、体細胞をiPS細胞等の多能性幹細胞にリプログラミングした際に使用した培地の上清をナノカプセル等のカプセル又はナノエマルジョン等のエマルジョン中に含んでいてもよい。
第1実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、体細胞をiPS細胞等の多能性幹細胞にリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む。第1実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、体細胞をiPS細胞等の多能性幹細胞にリプログラミングした際に使用した培地の上清の凍結乾燥物を含んでいてもよい。第1実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、体細胞をiPS細胞等の多能性幹細胞にリプログラミングした際に使用した培地の上清をナノカプセル等のカプセル又はナノエマルジョン等のエマルジョン中に含んでいてもよい。
iPS細胞は、例えば血液細胞及び線維芽細胞等の分化細胞等の体細胞に、OCT3/4、KLF4、c-MYC、及びSOX2等の初期化因子を導入することにより誘導される。iPS細胞に誘導することを、リプログラミング、初期化、形質転換、分化転換(Transdifferentiation or Lineage reprogramming)、及び細胞の運命変更(Cell fate reprogramming)という場合がある。多能性幹細胞は、浮遊培養等の三次元培養されながら誘導されてもよい。三次元培養の際には、ゲル培地を用いてもよいし、液体培地を用いてもよい。多能性幹細胞は、例えば、TRA1-60、OCT3/4、SSEA3、SSEA4、TRA1-81、及びNANOGのいずれかの陽性率が、30%以上、50%以上、好ましくは80%以上である。ゲル培地は、フィーダー細胞を含まなくともよい。
誘導培養する際の培地としては、例えば、TeSR2(STEMCELL Technologies)等のヒトES/iPS培地を使用可能である。ただし、培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばPrimate ES Cell Medium、Reprostem、ReproFF、ReproFF2、ReproXF(Reprocell)、mTeSR1、TeSRE8、ReproTeSR(STEMCELL Technologies)、PluriSTEM(登録商標)Human ES/iPS Medium(Merck)、NutriStem (登録商標)XF/FF Culture Medium for Human iPS and ES Cells、Pluriton reprogramming medium(Stemgent)、PluriSTEM(登録商標)、Stemfit AK02N、Stemfit AK03(Ajinomoto)、ESC-Sure(登録商標)serum and feeder free medium for hESC/iPS(Applied StemCell)、L7(登録商標)hPSC Culture System (LONZA)、及びPrimate ES Cell Medium (ReproCELL)等を利用してもよい。
ゲル培地は、例えば、上記の培地に脱アシル化ジェランガムを終濃度が0.5重量%から0.001重量%、0.1重量%から0.005重量%、あるいは0.05重量%から0.01重量%となるよう添加することにより調製される。
ゲル培地は、ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも1種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA)、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。
あるいは、第1実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、幹細胞の抽出物を含む。抽出物は、液体であってもよい。すなわち、抽出物は、抽出液であってもよい。幹細胞は、iPS細胞のような多能性幹細胞、及び胚性幹細胞(ES細胞)を含む。幹細胞は、例えば、TRA1-60又は、Oct3/4の陽性率が、30%以上、50%以上、好ましくは80%以上である。幹細胞を未分化状態で維持培養する場合、培地はb-FGFを10ng/ml以上、好ましくは40ng/ml以上含む。医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、幹細胞の抽出物は、幹細胞のペーストであってもよい。幹細胞のペーストは、iPS細胞をすり潰すことにより得られる。幹細胞の抽出物は、凍結乾燥物であってもよい。また、幹細胞の抽出物は、粉体であってもよい。あるいは、幹細胞の抽出物は、幹細胞の溶解物であってもよい。
第1実施形態に係る医薬品組成物は、皮膚塗布組成物であってもよい。第1実施形態に係る医薬品組成物は、皮膚疾患治療剤であってもよい。第1実施形態に係る皮膚疾患治療剤で治療可能な疾患の例としては、尋常性ざ瘡、尋常性乾癬、ケロイド、脂漏性皮膚炎、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性乾燥皮膚炎、皮膚粗鬆症(dermatoporosis)、光線性弾性線維症、日光性角化症、眼瞼下垂症、円形脱毛症、頭髪脱毛症、睫毛貧毛症、肝斑、老人性色素班、汗疹、そばかす、遅発性両側性太田母班、脂漏性角化症、早老症による皮膚疾患、及び単純疱疹等が挙げられる。
第1実施形態に係る化粧品組成物で改善又は解消可能な状態の例としては、シミ、そばかす、しわ、たるみ、きしみ、肌のはりの低下、くすみ、敏感肌、乾燥肌、及び薄毛等が挙げられる。第1実施形態に係る化粧品組成物の効果としては、肌を整える、肌のキメを整える、皮膚をすこやかに保つ、肌荒れを防ぐ、肌をひきしめる、皮膚にうるおいを与える、皮膚の水分及び油分を補い保つ、皮膚の柔軟性を保つ、皮膚を保護する、皮膚の乾燥を防ぐ、肌を柔らげる、肌にはりを与える、肌にツヤを与える、肌を滑らかにする、肌にはり与える、シミを目立たなくさせる、しわを抑制する及び肌を明るくする等が挙げられる。さらに、第1実施形態に係る化粧品組成物の頭皮あるいは毛髪に関する効果としては、頭皮を健やかに保つ、育毛、薄毛の予防、かゆみの予防、脱毛の予防、毛生促進、発毛促進、病後又は産後の脱毛の予防、及び養毛等が挙げられる。
第1実施形態に係る医薬品組成物は、創傷治療剤、表皮細胞増殖促進剤、表皮ターンオーバー促進剤、発毛剤、育毛剤、及び睫毛貧毛症治療薬であってもよい。第1実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、発毛剤、線維芽細胞成長因子(FGF)ファミリー産生促進剤、及び血管内皮細胞増殖因子(VEGF)産生促進剤であってもよい。
毛髪の成長においては毛根の毛母細胞が分裂し、そこから生じた細胞が毛髪を構成していく。一方、毛髪の成長には毛周期と呼ばれる周期があり、成長期、退行期、及び休止期を繰り返す。毛乳頭細胞は増殖因子の産生と放出を通じて、毛包上皮幹細胞の増殖及び分化に影響を及ぼし、毛周期を制御している。毛乳頭細胞や毛母細胞の活性化が毛成長のメカニズムに寄与するといわれている。また、毛周期に応じて毛包では活発に血管のリモデリングが行われるが、このときの血管新生に問題があると、毛髪形成のための栄養や酸素の供給が不十分になる。毛包血管網からの血流の不足は男性型脱毛症(AGA)の病態に関与するといわれている。
毛乳頭細胞の遺伝子と発毛及び毛成長については、以下のようなことが知られている。すなわち、乳頭細胞が毛母細胞に対して分泌する増殖因子としては、FGF-7及びIGF-1等が知られている。これら遺伝子には毛包成長を維持する作用がある。血管内皮成長因子(VEGF)は毛乳頭細胞より分泌されて毛包血管の増生に関わり、またオートクラインに毛乳頭細胞を増殖させる効果があるが、成長期から退行期へ移行するにしたがい、発現量は減少する。VEGF遺伝子はAGA(男性型脱毛症)の毛組織で発現が低下している。VEGFBはVEGFが作用する受容体であるVEGFR-1に競合して結合する。VEGFBは血管内皮細胞の増殖や透過性亢進活性を持つが、毛包での効果は不明である。
第1実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、毛乳頭に直接作用し、発毛促進因子であるFGF-7の産生量を高めて発毛を促進することで毛周期の成長期を長くさせ、細く弱い毛から太くて強い毛に育てる効果、血管内皮成長因子(VEGF)を高め、毛乳頭細胞より分泌されて毛包血管の増生に関わり、またオートクラインに毛乳頭細胞を増殖させる効果がある。したがって、第1実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、毛乳頭細胞の活性化剤として使用可能である。
第1実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物が育毛剤又は発毛剤として用いられる場合、ミノキシジル、センブリ、パントテニルエチルエーテル、トコフェロール酢酸エステル、グリチルリチン酸二カリウム、及びアデノシン等の他の有効成分を含んでいてもよい。
第1実施形態に係る創傷治療剤で治療可能な創傷の例としては、熱傷、擦過創、裂傷、挫傷、縫合創、褥瘡、及び皮膚欠損創等が挙げられる。
第1実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を有効量含む。あるいは、第1実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、幹細胞の抽出物を有効量含む。ここで、有効量とは、医薬品組成物あるいは化粧品組成物として効用を発揮可能な量をいう。有効量は、患者の年齢、対象疾患、他の成功成分の有無、及び他の配合物の量に応じて、適宜設定される。
第1実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、製剤上許容される担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、及び生理食塩水等を含んでいてもよい。賦形剤の例としては、乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、及び白糖が挙げられる。崩壊剤の例としては、カルボキシメチルセルロース、及び炭酸カルシウムが挙げられる。緩衝剤の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び酢酸塩が挙げられる。乳化剤の例としては、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、及びトラガントが挙げられる。
懸濁剤の例としては、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。無痛化剤の例としては、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びソルビトールが挙げられる。安定剤の例としては、プロピレングリコール、及びアスコルビン酸が挙げられる。保存剤の例としては、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びメチルパラベンが挙げられる。防腐剤の例としては、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、及びクロロブタノールが挙げられる。
また、第1実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物には、水、アルコール、界面活性剤(カチオン、アニオン、ノニオン、及び両性界面活性剤等)、保湿剤(グリセリン、1,3-ブチレングリコール、プロピレングリコール、プロパンジオール、ペンタンジオール、ポリクオタニウム、アミノ酸、尿素、ピロリドンカルボン酸塩、核酸類、単糖類、及び少糖等、並びにそれらの誘導体等)、増粘剤(多糖類、ポリアクリル酸塩、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、キチン、キトサン、アルギン酸、カラギーナン、キサンタンガム、及びメチルセルロース等、並びにそれらの誘導体等)、ワックス、ワセリン、炭化水素飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、及びシリコン油等、並びにそれらの誘導体、トリ(カプリル・カプリン酸)グリセリル、及びトリオクタン酸グリセリル等のトリグリセライド類、ステアリン酸イソプロピル等のエステル油類、天然油脂類(オリブ油、椿油、アボガド油、アーモンド油、カカオ脂、月見草油、ブドウ種子油、マカデミアンナッツ油、ユーカリ油、ローズヒップ油、スクワラン、オレンジラフィー油、ラノリン、及びセラミド等)、防腐剤(オキシ安息香酸誘導体、デヒドロ酢酸塩、感光素、ソルビン酸、及びフェノキシエタノール等、並びにそれらの誘導体等)、殺菌剤(イオウ、トリクロカルバアニリド、サリチル酸、ジンクピリチオン、及びヒノキチオール等、並びにそれらの誘導体等)、紫外線吸収剤(パラアミノ安息香酸、及びメトキシケイ皮酸等、並びにそれらの誘導体等)、抗炎症剤(アラントイン、ビサボロール、ε-アミノカプロン酸、アセチルファネシルシスティン、及びグリチルリチン酸等、並びにそれらの誘導体等)、抗酸化剤(トコフェロール、BHA、BHT、及びアスタキサンチン等、並びにそれらの誘導体等)、キレート剤(エデト酸、及びヒドロキシエタンジホスホン酸等、並びにそれらの誘導体等)、動植物エキス(アシタバ、アロエ、エイジツ、オウゴン、オウバク、海藻、カリン、カミツレ、甘草、キウイ、キュウリ、クワ、シラカバ、トウキ、ニンニク、ボタン、ホップ、マロニエ、ラベンダー、ローズマリー、ユーカリ、ミルク、各種ペプタイド、プラセンタ、ローヤルゼリー、ユーグレナエキス、加水分解ユーグレナエキス、及びユーグレナ油等、並びにこれらの含有成分精製物又は発酵物等)、pH調整剤(無機酸、無機酸塩、有機酸、及び有機酸塩等、並びにそれらの誘導体等)、ビタミン類(ビタミンA類、ビタミンB類、ビタミンC、ビタミンD類、ユビキノン、及びニコチン酸アミド等、並びにそれらの誘導体等)、酵母、麹菌及び乳酸菌の発酵液、ガラクトミセス培養液、美白剤(トラネキサム酸、トラネキサム酸セチル塩酸塩、4-n-ブチルレゾルシノール、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、カンゾウフラボノイド、ナイアシンアミド、及びビタミンC誘導体等)、セラミド・セラミド誘導体、抗シワ剤(レチノール、及びレチナール、並びにそれらの誘導体、ニコチン酸アミド、及びオリゴぺプチド等、並びにそれらの誘導体等、好中球エラスターゼ阻害、並びにMMP-1及びMMP-2阻害作用のある天然及び合成成分等)、酸化チタン、タルク、マイカ、シリカ、酸化亜鉛、酸化鉄、シリコン、及びこれらを加工処理した粉体類等を、第1実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物の目的を達成する範囲内で配合することができる。
なお、第1実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物に添加可能な成分は、上記に限られるものではなく、医薬品組成物及び化粧品組成物に用い得る成分であれば自由に選択が可能である。第1実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物をハップ剤として用いる場合、上記成分に加えて、基剤(カオリン、及びベントナイト等)、ゲル化剤(ポリアクリル酸塩、及びポリビニルアルコール等)を目的を達成する範囲内で配合することができる。第1実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物を入浴剤として用いる場合、硫酸塩、炭酸水素塩、ホウ酸塩、色素、及び保湿剤を目的を達成する範囲内で適宜配合し、パウダータイプ、液剤タイプに調製してもよい。
第1実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、当該技術分野において周知慣用されている方法によって製造可能である。
(第2実施形態)
第2実施形態に係る抗紫外線物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製されたiPS細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、任意により分化誘導した皮膚細胞に紫外線を照射することと、紫外線を照射された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、紫外線による皮膚細胞のダメージが少ない溶液又は紫外線を受けた皮膚細胞の修復が早い溶液を選択することと、を含む。なお、患者はヒトに限定されず、非ヒト動物も含む。
第2実施形態に係る抗紫外線物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製されたiPS細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、任意により分化誘導した皮膚細胞に紫外線を照射することと、紫外線を照射された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、紫外線による皮膚細胞のダメージが少ない溶液又は紫外線を受けた皮膚細胞の修復が早い溶液を選択することと、を含む。なお、患者はヒトに限定されず、非ヒト動物も含む。
早老症の例としては、ウェルナー症候群、色素性乾皮症及びコケイン症候群が挙げられるが、特に限定されない。早老症患者由来の体細胞は、例えば線維芽細胞、血液細胞、上皮細胞、体性幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、及び歯髄幹細胞であるが、特に限定されない。iPS細胞は、早老症患者由来の体細胞に、OCT3/4、KLF4、c-MYC、及びSOX2等の初期化因子を導入することにより誘導される。iPS細胞から皮膚細胞を分化誘導する際には、例えば、bFGFを含まない培養液を入れた細胞低接着ディッシュにiPS細胞を播種する。その後、2日おきに培地を交換し、8日後に形成された胚様体(EB)をディッシュに播種し、細胞をディッシュに接着させ、10%FBS培地で細胞を培養する。細胞がコンフルエントになったところで、トリプシンで細胞をディッシュから剥がし、継代培養する。同様に継代培養を1か月繰り返す。その後、CD13等の線維芽細胞マーカーを用いて、細胞が線維芽細胞に分化したことを確認する。また、TRA 1-60等のiPS細胞マーカーを用いて、細胞に未分化のiPS細胞が残っていないかを確認してもよい。分化誘導される皮膚細胞は、例えば皮膚線維芽細胞であるが、特に限定されない。
分化誘導された皮膚細胞は、適宜培養された後、紫外線(UV)を照射される。紫外線の強さ、波長範囲、及び照射時間は、スクリーニングされる抗紫外線物質の用途、用法及び用量等に応じて適宜設定される。UVを照射された皮膚細胞は、スクリーニング対象となる異なる物質をそれぞれ含む複数の異なる溶液のそれぞれの中で培養される。溶液は、培地であってもよい。溶液中におけるスクリーニング対象物質及び培養時間等は、スクリーニングされる抗紫外線物質の用途、用法及び用量等に応じて適宜設定される。
その後、皮膚細胞のダメージが少ない溶液又は皮膚細胞の修復が早い溶液を、抗紫外線物質を含む溶液として選択する。例えば、複数の溶液のそれぞれで培養された皮膚細胞を分析し、ダメージが少ない皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを選択し、ダメージが多い皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを除外する。あるいは、複数の溶液のそれぞれで培養された皮膚細胞を分析し、早く修復した皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを選択し、遅く修復した皮膚細胞又は修復しなかった皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを除外する。
本発明者らの知見によれば、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から誘導されたiPS細胞から誘導された皮膚細胞は、健常者の皮膚細胞と比較して、UV照射に対する抵抗力がない傾向にある。したがって、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から誘導されたiPS細胞から誘導された皮膚細胞を用いることにより、効果的な抗紫外線物質をスクリーニングすることが可能である。
(第3実施形態)
第3実施形態に係る皮膚の紫外線耐性検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に紫外線を照射することと、紫外線による皮膚細胞のダメージを検査することと、を含む。
第3実施形態に係る皮膚の紫外線耐性検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に紫外線を照射することと、紫外線による皮膚細胞のダメージを検査することと、を含む。
被験者は疾患患者であってもよいし、健常者であってもよい。被験者由来の体細胞は、予め被験者から取得されており、当該方法は、被験者から体細胞を取得するステップを含まなくともよい。紫外線による皮膚細胞のダメージが大きければ、被験者の皮膚細胞が、紫外線耐性を有しないと判定してもよい。紫外線による皮膚細胞のダメージが小さければ、被験者の皮膚細胞が、紫外線耐性を有すると判定してもよい。当該方法によれば、紫外線による皮膚細胞のダメージの検査結果に基づいて、被験者の皮膚細胞が、紫外線耐性を有するか否かを検査することが可能である。
(第4実施形態)
第4実施形態に係る抗乾燥物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製されたiPS細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、乾燥された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、を含む。
第4実施形態に係る抗乾燥物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製されたiPS細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、乾燥された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、を含む。
第2実施形態と同様に分化誘導された皮膚細胞は、適宜培養された後、乾燥させられる。皮膚細胞を乾燥する際には、例えば、皮膚細胞周囲の培地を除去する。また、皮膚細胞に気流をあててもよいし、乾燥剤等を用いて皮膚細胞を乾燥させてもよい。皮膚細胞の乾燥方法及び乾燥時間は、スクリーニングされる抗乾燥物質の用途、用法及び用量等に応じて適宜設定される。乾燥させられた皮膚細胞は、スクリーニング対象となる異なる物質をそれぞれ含む複数の異なる溶液のそれぞれの中で培養される。溶液は培地であってもよい。溶液中におけるスクリーニング対象物質及び培養時間等は、スクリーニングされる抗乾燥物質の用途、用法及び用量等に応じて適宜設定される。
その後、複数の溶液のそれぞれで培養された皮膚細胞の生存率を測定し、皮膚細胞の生存率が高い溶液を、抗乾燥物質を含む溶液として選択する。例えば、複数の溶液のそれぞれで培養された皮膚細胞の生存率を測定し、生存率が高い皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを選択し、生存率が低い皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを除外する。
なお、皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択する代わりに、皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷が小さい溶液を選択してもよい。この場合、タイトジャンクションにおけるオクルディン及びクローディンの少なくとも一方を分析し、オクルディン及びクローディンの少なくとも一方の量が多い溶液を選択してもよい。一般に、皮膚細胞は、乾燥するとタイトジャンクションが損傷し、オクルディン及びクローディンの量が減少する。したがって、例えば、複数の溶液のそれぞれで培養された皮膚細胞のタイトジャンクションを分析し、タイトジャンクションの損傷が小さい皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを選択し、タイトジャンクションの損傷が大きい皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを除外する。
本発明者らの知見によれば、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から誘導されたiPS細胞から誘導された皮膚細胞は、健常者の皮膚細胞と比較して、乾燥に対する抵抗力がない傾向にある。したがって、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から誘導されたiPS細胞から誘導された皮膚細胞を用いることにより、効果的な抗乾燥物質をスクリーニングすることが可能である。
(第5実施形態)
第5実施形態に係る皮膚の乾燥耐性検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、皮膚細胞の生存率を検査することと、を含む。
第5実施形態に係る皮膚の乾燥耐性検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、皮膚細胞の生存率を検査することと、を含む。
被験者は疾患患者であってもよいし、健常者であってもよい。被験者由来の体細胞は、予め被験者から取得されており、当該方法は、被験者から体細胞を取得するステップを含まなくともよい。皮膚細胞の生存率が高ければ、被験者の皮膚細胞が乾燥耐性を有すると判定してもよい。皮膚細胞の生存率が低ければ、被験者の皮膚細胞が乾燥耐性を有しない判定してもよい。当該方法によれば、皮膚細胞の生存率の検査結果に基づいて、被験者の皮膚細胞が、乾燥耐性を有するか否かを検査することが可能である。
なお、皮膚細胞の生存率を検査する代わりに、皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷を検査してもよい。タイトジャンクションの損傷が小さい場合、被験者の皮膚細胞が、乾燥耐性を有し、タイトジャンクションの損傷が大きい場合、被験者の皮膚細胞が、乾燥耐性を有しないと判定してもよい。
(第6実施形態)
第6実施形態に係る抗酸化ストレス物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製されたiPS細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、酸化ストレスを与えられた皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、を含む。
第6実施形態に係る抗酸化ストレス物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製されたiPS細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、酸化ストレスを与えられた皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、を含む。
第2実施形態と同様に分化誘導された皮膚細胞は、適宜培養された後、酸化ストレスを与えられる。皮膚細胞に酸化ストレスを与える方法は、特に限定されないが、例えば、皮膚細胞を培養している培地に過酸化水素等の酸化物質を添加することを含む。皮膚細胞に酸化ストレスを与える方法及び皮膚細胞に酸化ストレスを与える時間は、スクリーニングされる抗酸化ストレス物質の用途、用法及び用量等に応じて適宜設定される。酸化ストレスを与えられた皮膚細胞は、例えば酸化ストレスを与える物質を除去した後、スクリーニング対象となる異なる物質をそれぞれ含む複数の異なる溶液のそれぞれの中で培養される。溶液は培地であってもよい。溶液中におけるスクリーニング対象物質及び培養時間等は、スクリーニングされる抗酸化ストレス物質の用途、用法及び用量等に応じて適宜設定される。
その後、複数の溶液のそれぞれで培養された皮膚細胞の生存率を測定し、皮膚細胞の生存率が高い溶液を、抗酸化ストレス物質を含む溶液として選択する。例えば、複数の溶液のそれぞれで培養された皮膚細胞の生存率を測定し、生存率が高い皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを選択し、生存率が低い皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを除外する。
本発明者らの知見によれば、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から誘導されたiPS細胞から誘導された皮膚細胞は、健常者の皮膚細胞と比較して、酸化ストレスに対する抵抗力がない傾向にある。したがって、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から誘導されたiPS細胞から誘導された皮膚細胞を用いることにより、効果的な抗酸化ストレス物質をスクリーニングすることが可能である。
(第7実施形態)
第7実施形態に係る皮膚の酸化ストレス耐性検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、皮膚細胞の生存率を検査することと、を含む。
第7実施形態に係る皮膚の酸化ストレス耐性検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、皮膚細胞の生存率を検査することと、を含む。
被験者は疾患患者であってもよいし、健常者であってもよい。被験者由来の体細胞は、予め被験者から取得されており、当該方法は、被験者から体細胞を取得するステップを含まなくともよい。酸化ストレスによる皮膚細胞のダメージが大きければ、被験者の皮膚細胞が、酸化ストレス耐性を有しないと判定してもよい。酸化ストレスによる皮膚細胞のダメージが小さければ、被験者の皮膚細胞が、酸化ストレス耐性を有すると判定してもよい。当該方法によれば、酸化ストレスによる皮膚細胞のダメージの検査結果に基づいて、被験者の皮膚細胞が、酸化ストレス耐性を有するか否かを検査することが可能である。
(第8実施形態)
第8実施形態に係る保湿促進物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、複数の異なる溶液から皮膚細胞由来の天然保湿因子の量が多い溶液を選択することと、を含む。
第8実施形態に係る保湿促進物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、複数の異なる溶液から皮膚細胞由来の天然保湿因子の量が多い溶液を選択することと、を含む。
第2実施形態と同様に分化誘導された皮膚細胞は、スクリーニング対象となる異なる物質をそれぞれ含む複数の異なる溶液のそれぞれの中で培養される。溶液中におけるスクリーニング対象物質及び培養時間等は、スクリーニングされる保湿促進物質の用途、用法及び用量等に応じて適宜設定される。
その後、複数の溶液のそれぞれにおける、皮膚細胞由来の天然保湿因子の量を測定する。天然保湿因子としては、特に限定されないが、セラミド及びフィラグリンが挙げられる。天然保湿因子の量が多い溶液を、保湿促進物質を含む溶液として選択する。例えば、複数の溶液のそれぞれで天然保湿因子の量を測定し、天然保湿因子の量が多い溶液の一つ又はグループを選択し、天然保湿因子の量が少ない溶液の一つ又はグループを除外する。
本発明者らの知見によれば、老化や皮膚疾患が進むと皮膚細胞における保湿促進物質の発現量が低下する傾向にある。したがって、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から誘導されたiPS細胞から誘導された皮膚細胞を用いることにより、効果的な保湿促進物質をスクリーニングすることが可能である。
(第9実施形態)
第9実施形態に係る皮膚の保湿能力の検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を培養することと、皮膚細胞由来の天然保湿因子の量を検査することと、を含む。
第9実施形態に係る皮膚の保湿能力の検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を培養することと、皮膚細胞由来の天然保湿因子の量を検査することと、を含む。
被験者は疾患患者であってもよいし、健常者であってもよい。被験者由来の体細胞は、予め被験者から取得されており、当該方法は、被験者から体細胞を取得するステップを含まなくともよい。皮膚細胞由来の天然保湿因子の量が大きければ、被験者の皮膚細胞が、保湿能力が高いと判定してもよい。皮膚細胞由来の天然保湿因子の量が小さければ、被験者の皮膚細胞が、保湿能力が低いと判定してもよい。当該方法によれば、皮膚細胞由来の天然保湿因子の量の検査結果に基づいて、被験者の皮膚細胞が、保湿能力を有するか否かを検査することが可能である。
(実施例1:血液細胞をiPS細胞にリプログラミングしながら培養した培地の調製)
無血清かつ動物由来成分フリーの造血系細胞培地(Stemspan ACF、STEMCELL TECHNOLOGIES)に成長因子を展開して、造血系細胞培地を調製した。12ウェルディッシュのそれぞれのウェルに、2×105個の血液細胞(末梢血単核球)を播種し、それぞれのウェルに造血系細胞ゲル培地を滴下して血液細胞を造血系細胞ゲル培地中に懸濁した。その後、12ウェルディッシュを37℃のCO2インキュベーター中に静置し、細胞を浮遊培養した。
無血清かつ動物由来成分フリーの造血系細胞培地(Stemspan ACF、STEMCELL TECHNOLOGIES)に成長因子を展開して、造血系細胞培地を調製した。12ウェルディッシュのそれぞれのウェルに、2×105個の血液細胞(末梢血単核球)を播種し、それぞれのウェルに造血系細胞ゲル培地を滴下して血液細胞を造血系細胞ゲル培地中に懸濁した。その後、12ウェルディッシュを37℃のCO2インキュベーター中に静置し、細胞を浮遊培養した。
細胞の培養を開始してから3日後、それぞれのウェルに造血系細胞ゲル培地を適宜追加した。細胞の培養を開始してから6日後、それぞれのウェルにおいて、ウイルスタイターが1から20になるよう、iPS細胞作製用センダイウイルスベクターキット(CytoTune 2.0 Reprogramming Kit、登録商標、Thermo Fisher)を培養液中に加えて遺伝子を導入するか、又はエピソーマルプラスミド(Thermo Fisher)をエレクトロポレーションして遺伝子を導入後、それぞれのウェルにゲル培地を加え、細胞を培養をした。
hES培地に終濃度が0.02%となるようゲランガムを添加し、幹細胞ゲル培地を調製した。感染2日後から、2日に1回、それぞれのウェルに2mLの幹細胞ゲル培地を加えた。感染14日後、iPS細胞塊が誘導されたことを確認し、ゲル培地上清を回収した。回収したゲル培地上清をフィルターでろ過して滅菌し、フィルターを通過したゲル培地上清を、実施例1に係るリプログラミング培地の上清とした。
(参考例1:iPS細胞を未分化状態を維持しながら培養した培地の調製)
mTeSR1(登録商標、STEMCELL Technologies)又はStemFit(登録商標、Ajinomoto)を用いて、Matrigel(登録商標、コーニング)又はLaminin511でコートした接着培養用シャーレ上で、ヒトiPS細胞を接着維持培養した。ヒトiPS細胞は、1週間ごとに継代した。継代の際には、ES細胞解離液(TrypLE Select、登録商標、ThermoFisher)で処理した。
mTeSR1(登録商標、STEMCELL Technologies)又はStemFit(登録商標、Ajinomoto)を用いて、Matrigel(登録商標、コーニング)又はLaminin511でコートした接着培養用シャーレ上で、ヒトiPS細胞を接着維持培養した。ヒトiPS細胞は、1週間ごとに継代した。継代の際には、ES細胞解離液(TrypLE Select、登録商標、ThermoFisher)で処理した。
上記の通り維持培養されたヒトiPS細胞を、ES細胞解離液(TrypLE Select、登録商標、ThermoFisher)を用いて、接着培養用シャーレから剥がし、シングルセルまで分割した。次に、ジェランガム及び10μmol/LのROCK阻害剤(Selleck)を添加してゲル化した幹細胞用培地にヒトiPS細胞を播種し、ヒトiPS細胞を14日間浮遊培養した。14日間浮遊培養する場合、2日に一度、ゲル化した幹細胞用培地を培養器に補充した。
その後、ヒトiPS細胞が懸濁しているゲル化幹細胞用培地をメッシュフィルターでろ過し、細胞塊を除去した。さらに、ろ過されたゲル化幹細胞用培地を1500gで5分遠心して細胞及びゲルを沈殿させ、遠心後の幹細胞用培地の上清を再度回収した後に3000回転で3分遠心し、遠心後の幹細胞用培地の上清を0.22μmのフィルターでろ過した。ろ過後の幹細胞用培地の上清を、参考例1に係るiPS細胞を維持培養した培地の上清とした。
また、維持培養されたiPS細胞は、未分化マーカーであるNANOG、OCT3/4、及びTRA 1-60が陽性であることを確認した。
(実施例2:線維芽細胞によるヒアルロン酸産生試験)
増殖培地Aとして、10%FBS及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン添加DMEM培地を用意した。次に、成人由来正常ヒト線維芽細胞(KF-4109、Strain No.01035、クラボウ)を、濃度が5×103細胞/0.1mL/ウェルとなるよう増殖培地Aで懸濁し、96ウェルプレートに播種して、CO2インキュベーター内(5%CO2、37℃)で1日間培養した。
増殖培地Aとして、10%FBS及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン添加DMEM培地を用意した。次に、成人由来正常ヒト線維芽細胞(KF-4109、Strain No.01035、クラボウ)を、濃度が5×103細胞/0.1mL/ウェルとなるよう増殖培地Aで懸濁し、96ウェルプレートに播種して、CO2インキュベーター内(5%CO2、37℃)で1日間培養した。
試験培地Aとして、10%FBS及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン添加DMEM培地を用意した。次に、実施例1及び参考例1に係る上清溶液のそれぞれと、試験培地Aと、を、混合し、濃度が10%の実施例1及び参考例1に係る上清添加培地Aを得た。線維芽細胞を培養している一部のウェル内の増殖培地Aを、実施例1及び参考例1に係る上清添加培地Aのそれぞれに置換した。また、陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Aを、FBS、ペニシリン-ストレプトマイシン、及び上清を添加していないDMEM培地(無添加試験培地A)に置換した。
培地を交換した後、3日間、線維芽細胞を培養し、培地の上清を回収し、培地の上清のヒアルロン酸濃度を、DueSet Hyaluronan(Cat.No.DY3614、R&D Systems)を用いて測定した。結果を図1に示す。実施例1に係るリプログラミング培地の上清を添加した培地で培養した線維芽細胞は、参考例1に係るiPS細胞を維持培養した培地の上清を添加した培地で培養した線維芽細胞と比較して、倍以上のヒアルロン酸を産生していることが確認された。
(実施例3:iPS細胞の抽出液の調製)
iPS細胞をマトリゲルコート及びラミニンコートのそれぞれの上で、Teser1、Teser2、Stem Fit、Essential8、Teser-E8、Nutri Stemのそれぞれを使用して培養をした。iPS細胞が80%コンフルエントになった段階で、トリプルセレクトを使ってiPS細胞を培養器から剥がし、剥がされたiPS細胞を含む溶液を5分間、200gで遠心して、iPS細胞を1.5mLのチューブに集めた。その後、すりこ木(Pestle in G-Tube、Thermo Fisher)でiPS細胞の細胞塊をすり潰し、すり潰されたiPS細胞のペーストを含むiPS細胞の抽出液を液体窒素で瞬間凍結した。iPS細胞の抽出液を使用するときは、5mLの培養液にiPS細胞の抽出液を懸濁し、一晩4℃でインキュベートし、翌日に懸濁液を10分間1500gで遠心して、細胞破砕片を溶液から除去した。その後、溶液をフィルターでろ過し、フィルターを通過した溶液を、iPS細胞の抽出液とした。
iPS細胞をマトリゲルコート及びラミニンコートのそれぞれの上で、Teser1、Teser2、Stem Fit、Essential8、Teser-E8、Nutri Stemのそれぞれを使用して培養をした。iPS細胞が80%コンフルエントになった段階で、トリプルセレクトを使ってiPS細胞を培養器から剥がし、剥がされたiPS細胞を含む溶液を5分間、200gで遠心して、iPS細胞を1.5mLのチューブに集めた。その後、すりこ木(Pestle in G-Tube、Thermo Fisher)でiPS細胞の細胞塊をすり潰し、すり潰されたiPS細胞のペーストを含むiPS細胞の抽出液を液体窒素で瞬間凍結した。iPS細胞の抽出液を使用するときは、5mLの培養液にiPS細胞の抽出液を懸濁し、一晩4℃でインキュベートし、翌日に懸濁液を10分間1500gで遠心して、細胞破砕片を溶液から除去した。その後、溶液をフィルターでろ過し、フィルターを通過した溶液を、iPS細胞の抽出液とした。
(実施例4:線維芽細胞によるI型コラーゲン産生試験)
実施例2と同様に成人由来正常ヒト線維芽細胞を増殖培地Aを用いて培養した。また、実施例2と同様に試験培地Aを用意した。次に、実施例3に係るiPS細胞の抽出液と、試験培地Aと、を、混合し、濃度が50.0v/v%又は100.0v/v%の実施例3に係るiPS細胞の抽出液を含む抽出液添加培地Aを得た。線維芽細胞を培養している一部のウェル内の増殖培地Aを、抽出液添加培地Aに置換した。また、陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Aを、FBS、ペニシリン-ストレプトマイシン、及びiPS細胞の抽出液を添加していないDMEM培地(無添加試験培地A)に置換した。
実施例2と同様に成人由来正常ヒト線維芽細胞を増殖培地Aを用いて培養した。また、実施例2と同様に試験培地Aを用意した。次に、実施例3に係るiPS細胞の抽出液と、試験培地Aと、を、混合し、濃度が50.0v/v%又は100.0v/v%の実施例3に係るiPS細胞の抽出液を含む抽出液添加培地Aを得た。線維芽細胞を培養している一部のウェル内の増殖培地Aを、抽出液添加培地Aに置換した。また、陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Aを、FBS、ペニシリン-ストレプトマイシン、及びiPS細胞の抽出液を添加していないDMEM培地(無添加試験培地A)に置換した。
培地を交換した後、3日間、線維芽細胞を培養し、培地の上清を回収し、-80℃で保存した。その後、培地の上清を解凍し、培地の上清のI型コラーゲンの濃度を、ヒトコラーゲンタイプ1 ELISA kit(Cat.No.EC1-E105)で測定した。結果を図2及び図3に示す。iPS細胞の抽出液を添加した培地で培養した線維芽細胞は、iPS細胞の抽出液を添加しなかった培地で培養した線維芽細胞と比較して、多くのコラーゲンを産生していることが確認された。
(実施例5:毛乳頭細胞の増殖性試験)
増殖培地Bとして、専用添加剤(牛胎児血清、インスリン・トランスフェリン・トリヨードサイロニン混液、牛下垂体抽出液、サイプロテロンアセテート)添加済みの毛乳頭細胞専用培地(Cat.No.TMTPGM-250、TOYOBO)を用意した。次に、正常ヒト毛乳頭細胞(Cat.No.CA60205a、Lot.No.2868、TOYOBO)を、濃度が1.2×104細胞/0.3mL/ウェルとなるよう増殖培地Bで懸濁し、typeIコラーゲンコート48ウェルプレートに播種して、CO2インキュベーター内(5%CO2、37℃)で1日間培養した。
増殖培地Bとして、専用添加剤(牛胎児血清、インスリン・トランスフェリン・トリヨードサイロニン混液、牛下垂体抽出液、サイプロテロンアセテート)添加済みの毛乳頭細胞専用培地(Cat.No.TMTPGM-250、TOYOBO)を用意した。次に、正常ヒト毛乳頭細胞(Cat.No.CA60205a、Lot.No.2868、TOYOBO)を、濃度が1.2×104細胞/0.3mL/ウェルとなるよう増殖培地Bで懸濁し、typeIコラーゲンコート48ウェルプレートに播種して、CO2インキュベーター内(5%CO2、37℃)で1日間培養した。
実施例3に係るiPS細胞の抽出液と、添加剤を添加していない毛乳頭細胞専用培地(無添加試験培地B)と、を、混合し、濃度が50.0v/v%又は100.0v/v%の実施例3に係るiPS細胞の抽出液を含む抽出液添加培地Bを得た。陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Bを、添加剤及びiPS細胞の抽出液を添加していない毛乳頭細胞専用培地(無添加試験培地B)に置換した。
置換された培地で、3日間、毛乳頭細胞を培養し、WST-8法で生細胞数測定を行った。結果を図4及び図5に示す。実施例3に係るiPS細胞の抽出液を含む無添加試験培地Bを用いた場合、iPS細胞の抽出液を含まない無添加試験培地Bを用いた場合と比較して、毛乳頭細胞が優位に増殖したことが確認された。したがって、iPS細胞の抽出液が、薄毛の治療、脱毛の予防、毛生促進、及び発毛促進等の育毛及び発毛効果を有することが示唆された。
(実施例6:毛乳頭細胞によるVEGF産生試験)
実施例5と同様に、増殖培地Bで正常ヒト毛乳頭細胞を1日間培養した。その後、一部のウェル内の増殖培地Bに、濃度が10.0v/v%及び20.0v/v%となるよう、実施例1に係るリプログラミング培地の上清を添加した。また、一部のウェル内の増殖培地Bに、濃度が50.0v/v%及び100.0v/v%となるよう、実施例3に係るiPS細胞の抽出液を添加した。
実施例5と同様に、増殖培地Bで正常ヒト毛乳頭細胞を1日間培養した。その後、一部のウェル内の増殖培地Bに、濃度が10.0v/v%及び20.0v/v%となるよう、実施例1に係るリプログラミング培地の上清を添加した。また、一部のウェル内の増殖培地Bに、濃度が50.0v/v%及び100.0v/v%となるよう、実施例3に係るiPS細胞の抽出液を添加した。
陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Bを、無添加試験培地Bに置換した。また、参考コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Bを、毛乳頭細胞専用培地に100μmol/Lのアデノシンを添加したアデノシン添加培地、及び毛乳頭細胞専用培地に30μmol/Lのミノキシジルを添加したミノキシジル添加培地のそれぞれに置換した。また、ミノキシジルのビヒクル・コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Bを、毛乳頭細胞専用培地に0.1%DMSOを添加したDMSO添加培地に置換した。
培地を交換した後、3日間、毛乳頭細胞を培養し、培地の上清を回収し、-80℃で保存した。その後、培地の上清を解凍し、培地の上清の線維芽細胞成長因子7(FGF-7)濃度を、FGF-7 Human ELISA kit(Cat.No.ab100519、Abcam)で測定した。結果を図6及び図7に示す。iPS細胞を誘導培養した培地の上清及びiPS細胞の抽出液が、毛乳頭細胞のVEGF産生を促進することが示された。これにより、iPS細胞を誘導培養した培地の上清及びiPS細胞の抽出液が、育毛、発毛及び増毛に有効であることが示唆された。
(実施例7:毛乳頭細胞によるFGF-7産生試験)
実施例5と同様に、増殖培地Bで正常ヒト毛乳頭細胞を1日間培養した。その後、一部のウェル内の増殖培地Bに、濃度が10.0v/v%及び20.0v/v%となるよう、実施例1に係るリプログラミング培地の上清を添加した。また、一部のウェル内の増殖培地Bに、濃度が50.0v/v%及び100.0v/v%となるよう、実施例3に係るiPS細胞の抽出液を添加した。
実施例5と同様に、増殖培地Bで正常ヒト毛乳頭細胞を1日間培養した。その後、一部のウェル内の増殖培地Bに、濃度が10.0v/v%及び20.0v/v%となるよう、実施例1に係るリプログラミング培地の上清を添加した。また、一部のウェル内の増殖培地Bに、濃度が50.0v/v%及び100.0v/v%となるよう、実施例3に係るiPS細胞の抽出液を添加した。
陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Bを、無添加試験培地Bに置換した。また、参考コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Bを、毛乳頭細胞専用培地に100μmol/Lのアデノシンを添加したアデノシン添加培地、及び毛乳頭細胞専用培地に30μmol/Lのミノキシジルを添加したミノキシジル添加培地のそれぞれに置換した。また、ミノキシジルのビヒクル・コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Bを、毛乳頭細胞専用培地に0.1%DMSOを添加したDMSO添加培地に置換した。
培地を交換した後、3日間、毛乳頭細胞を培養し、培地の上清を回収し、-80℃で保存した。その後、培地の上清を解凍し、培地の上清の線維芽細胞成長因子7(FGF-7)濃度を、FGF-7 Human ELISA kit(Cat.No.ab100519、Abcam)で測定した。結果を図8及び図9に示す。iPS細胞を誘導培養した培地の上清及びiPS細胞の抽出液が、毛乳頭細胞のFGF-7産生を促進することが示された。これにより、iPS細胞を誘導培養した培地の上清及びiPS細胞の抽出液が、育毛、発毛及び増毛に有効であることが示唆された。
(実施例8:線維芽細胞の遊走性試験)
成人由来正常ヒト線維芽細胞を濃度が1×105から2×105細胞/ウェルとなるよう10%FBS培地で懸濁をして遊走能を測定するキット(Radius Cell Migration Assay、登録商標)のプレートに播種した。次に、10μg/mLのマイトマイシンC(Cat.No.20898-21、Nacalai tesque)でヒト線維芽細胞を2時間処理し、ヒト線維芽細胞の細胞分裂を停止させた。その後、ヒト線維芽細胞を、CO2インキュベーター内(5%CO2、37℃)で1日間培養した。
成人由来正常ヒト線維芽細胞を濃度が1×105から2×105細胞/ウェルとなるよう10%FBS培地で懸濁をして遊走能を測定するキット(Radius Cell Migration Assay、登録商標)のプレートに播種した。次に、10μg/mLのマイトマイシンC(Cat.No.20898-21、Nacalai tesque)でヒト線維芽細胞を2時間処理し、ヒト線維芽細胞の細胞分裂を停止させた。その後、ヒト線維芽細胞を、CO2インキュベーター内(5%CO2、37℃)で1日間培養した。
一部のプレート内の培地を、10%FBS培地に濃度が10v/v%となるよう実施例3に係るiPS細胞の抽出液を添加した培地に置換した。また、一部のプレート内の培地を、10%FBS培地に濃度が10.0v/v%及び20.0v/v%となるよう実施例1に係るリプログラミング培地の上清を添加した培地に置換した。
一部のプレート上の増殖培地Bを、陰性コントロールとして、増殖添加剤を添加していない表皮細胞培地(無添加試験培地B)に置換した。
プロトコールに準じてヒト線維芽細胞を処理して、遊走試験を実施した。創傷治癒の過程では、傷に向かってヒト線維芽細胞が遊走して創傷が収縮する。本実施例においては、遊走試験前にストッパーで塞がれていてヒト線維芽細胞が接着していなかった部分にヒト線維芽細胞が遊走したか否かを、プレートリーダーを用いて分析した。具体的には、培地を置換してから23時間後、Hechestで表皮細胞を染色し、観察した。
結果を図10及び図11に示す。iPS細胞の抽出液及びiPS細胞を誘導培養した培地の上清が、ヒト線維芽細胞の遊走能を促進することが確認された。したがって、iPS細胞の抽出液及びiPS細胞を誘導培養した培地の上清が、創傷治癒に有効であることが示された。
(実施例9:早老症患者由来の細胞の用意)
ウェルナー症候群患者由来の線維芽細胞(AG04110)、色素性乾皮症患者由来の線維芽細胞(GM16684及びGM16687)、及びコケイン症候群患者由来の線維芽細胞(GM01098)をCoriell Institute for Medical Researchから購入した。これら早老症患者由来の線維芽細胞をiPS細胞に誘導した。さらにiPS細胞を、皮膚線維芽細胞に分化誘導した。
ウェルナー症候群患者由来の線維芽細胞(AG04110)、色素性乾皮症患者由来の線維芽細胞(GM16684及びGM16687)、及びコケイン症候群患者由来の線維芽細胞(GM01098)をCoriell Institute for Medical Researchから購入した。これら早老症患者由来の線維芽細胞をiPS細胞に誘導した。さらにiPS細胞を、皮膚線維芽細胞に分化誘導した。
(実施例10:皮膚線維芽細胞のUV照射試験)
成人由来正常ヒト皮膚線維芽細胞及び実施例9で用意した早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のそれぞれを、濃度が2×105細胞/ウェルとなるよう試験培地Aで懸濁し、6ウェルプレートに播種して、CO2インキュベーター内(5%CO2、37℃)で1日間培養した。
成人由来正常ヒト皮膚線維芽細胞及び実施例9で用意した早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のそれぞれを、濃度が2×105細胞/ウェルとなるよう試験培地Aで懸濁し、6ウェルプレートに播種して、CO2インキュベーター内(5%CO2、37℃)で1日間培養した。
翌日、UV照射機を使って302nmの紫外線を15分、ウェル内の皮膚線維芽細胞のそれぞれに照射した。次に、参考例1に係る上清溶液と、試験培地Aと、を、体積比で、10.00:90.00となるよう混合し、濃度が10.00v/v%の参考例1に係る上清添加培地Aを得た。一部のウェル内の試験培地Aを、参考例1に係る上清添加培地Aに置換した。翌日、全ての細胞をトリプシンでウェルから剥がし、細胞を7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)で染色した後、フローサイトメーターを用いて死細胞率を計測した。
その結果、図12に示すように、いずれの皮膚線維芽細胞においても、UVを照射された細胞は、UVを照射されなかった細胞と比較して、死細胞率が上昇した。また、正常皮膚線維芽細胞と比較して、早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のほうが、UV照射による死亡率が高かった。ただし、iPS細胞を維持培養した際の培地の上清を添加した培地中の皮膚線維芽細胞は、iPS細胞を維持培養した際の培地の上清を添加しなかった培地中の皮膚線維芽細胞より生存率が高かった。したがって、早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞は、UV照射に対して繊細であり、抗UV物質のスクリーニングに適していることが示唆された。
(実施例11:皮膚線維芽細胞の乾燥刺激試験)
実施例10と同様に、成人由来正常ヒト皮膚線維芽細胞及び実施例9で用意した早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のそれぞれを試験培地Aを用いて1日間培養した。翌日、クリーンベンチの通気口内で各ウェルを40秒乾燥をさせた。次に、一部のウェル内の試験培地Aを、参考例1に係る上清添加培地Aに置換した。また、実施例1に係る上清溶液と、試験培地Aと、を、体積比で、10.00:90.00となるよう混合し、濃度が10.00v/v%の実施例1に係る上清添加培地Aを得た。一部のウェル内の試験培地Aを、実施例1に係る上清添加培地Aに置換した。翌日、全ての細胞をトリプシンでウェルから剥がし、細胞を7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)で染色した後、フローサイトメーターを用いて死細胞率を計測した。
実施例10と同様に、成人由来正常ヒト皮膚線維芽細胞及び実施例9で用意した早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のそれぞれを試験培地Aを用いて1日間培養した。翌日、クリーンベンチの通気口内で各ウェルを40秒乾燥をさせた。次に、一部のウェル内の試験培地Aを、参考例1に係る上清添加培地Aに置換した。また、実施例1に係る上清溶液と、試験培地Aと、を、体積比で、10.00:90.00となるよう混合し、濃度が10.00v/v%の実施例1に係る上清添加培地Aを得た。一部のウェル内の試験培地Aを、実施例1に係る上清添加培地Aに置換した。翌日、全ての細胞をトリプシンでウェルから剥がし、細胞を7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)で染色した後、フローサイトメーターを用いて死細胞率を計測した。
その結果、図13に示すように、正常皮膚線維芽細胞と比較して、早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のほうが、乾燥刺激による死亡率が高かった。ただし、iPS細胞を維持培養した際の培地の上清を添加した培地中の皮膚線維芽細胞は、iPS細胞を維持培養した際の培地の上清を添加しなかった培地中の皮膚線維芽細胞より生存率が高かった。また、血液細胞をiPS細胞に誘導培養した際の培地の上清を添加した培地中の皮膚線維芽細胞は、iPS細胞を維持培養した際の培地の上清を添加した培地中の皮膚線維芽細胞より生存率が高かった。したがって、早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞は、乾燥刺激に対して繊細であり、抗乾燥刺激物質のスクリーニングに適していることが示唆された。
(実施例12:皮膚線維芽細胞の酸化ストレス試験)
実施例10と同様に、成人由来正常ヒト皮膚線維芽細胞及び実施例9で用意した早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のそれぞれを試験培地Aを用いて1日間培養した。翌日、それぞれのウェルの試験培地Aに、濃度が0.03%になるように過酸化水素を加えた。10分後、一部のウェル内の培地を過酸化水素を含まない試験培地Aに戻した。また、一部のウェル内の培地を実施例1及び参考例1に係る上清添加培地Aのそれぞれに置換した。さらに、一部のウェル内の培地を、実施例3に係るiPS細胞の抽出液を含む培地に置換した。翌日、全ての細胞をトリプシンでウェルから剥がし、細胞を7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)で染色した後、フローサイトメーターを用いて死細胞率を計測した。
実施例10と同様に、成人由来正常ヒト皮膚線維芽細胞及び実施例9で用意した早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のそれぞれを試験培地Aを用いて1日間培養した。翌日、それぞれのウェルの試験培地Aに、濃度が0.03%になるように過酸化水素を加えた。10分後、一部のウェル内の培地を過酸化水素を含まない試験培地Aに戻した。また、一部のウェル内の培地を実施例1及び参考例1に係る上清添加培地Aのそれぞれに置換した。さらに、一部のウェル内の培地を、実施例3に係るiPS細胞の抽出液を含む培地に置換した。翌日、全ての細胞をトリプシンでウェルから剥がし、細胞を7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)で染色した後、フローサイトメーターを用いて死細胞率を計測した。
その結果、図14及び図15に示すように、正常皮膚線維芽細胞と比較して、色素性乾皮症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のほうが、乾燥刺激による死亡率が高かった。図15は、色素性乾皮症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞の死細胞率を示す。図15に示すように、iPS細胞を維持培養した際の培地の上清を添加した培地、血液細胞をiPS細胞に誘導培養した際の培地の上清を添加した培地、及びiPS細胞の抽出液を添加した培地中の皮膚線維芽細胞は、無添加の試験培地A中の皮膚線維芽細胞より生存率が高かった。したがって、色素性乾皮症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞は、酸化ストレスに対して繊細であり、抗酸化ストレス物質のスクリーニングに適していることが示唆された。
(参考例)
特開2016-128396号公報に記載の実施例に準じてヒトiPS細胞を培養した。すなわち、実施例1と同じ幹細胞用培地を用いて、接着培養用シャーレ上のフィーダー細胞上で、ヒトiPS細胞を接着維持培養した。ヒトiPS細胞は、1週間ごとに継代した。継代の際には、ヒトiPS細胞を、0.25%トリプシン、0.1mg/mLのコラゲナーゼIV、1mmol/LのCaCl2、及び20%のKSRを含む剥離溶液で処理した。
特開2016-128396号公報に記載の実施例に準じてヒトiPS細胞を培養した。すなわち、実施例1と同じ幹細胞用培地を用いて、接着培養用シャーレ上のフィーダー細胞上で、ヒトiPS細胞を接着維持培養した。ヒトiPS細胞は、1週間ごとに継代した。継代の際には、ヒトiPS細胞を、0.25%トリプシン、0.1mg/mLのコラゲナーゼIV、1mmol/LのCaCl2、及び20%のKSRを含む剥離溶液で処理した。
上記の通り培養されたヒトiPS細胞を、ES細胞解離液(TrypLE Select、登録商標、ThermoFisher)を用いて、接着培養用シャーレから剥がした。剥がしたヒトiPS細胞を、非接着培養用シャーレに入れたゲル化していないヒトiPS細胞中で1週間浮遊培養した。この結果、胚様体(EB)が形成された。形成された胚様体を接着培養用シャーレ上に播種し、10%FBS及び1%アンチアンチ(登録商標、抗真菌剤)を含有するDMEM中で1週間成長(outgrowth)させた。
次に、細胞を0.05%トリプシン-EDTA溶液を用いて接着培養用シャーレから剥がし、シングルセルまで分割された細胞を新たな接着培養用シャーレに播種した。その後、培地として10%FBSを含有するDMEMを用い、細胞を一週間培養した。
細胞が70%から80%以上コンフルエントになったことを確認した後、細胞を観察した。本参考例で培養した細胞の写真を図16(a)に示す。通常、未分化のiPS細胞の形態は、図16(b)に示される写真のようになる。したがって、本参考例で培養した細胞は、未分化状態を維持していないことが形態的に観察された。また、本参考例に係る細胞を21日間培養した後、蛍光試薬で標識された抗OCT3/4抗体及び蛍光試薬で標識された抗NANOG抗体で細胞を処理した後、顕微鏡で細胞を観察した結果を図17に示す。図17(a)は、励起光を用いずに観察した細胞の写真を示す。図17(b)は、抗OCT3/4抗体に結合している蛍光試薬に対応する励起光を用いて観察した細胞の写真を示す。図17(c)は、抗NANOG抗体に結合している蛍光試薬に対応する励起光を用いて観察した細胞の写真を示す。図17(b)及び図17(c)において蛍光は観察されず、細胞がOCT3/4陰性及びNANOG陰性であることが確認された。さらに、細胞をフローサイトメーターで検査したところ、培養された細胞は、未分化マーカーであるNANOG、OCT3/4、及びTRA 1-60が陰性であることが確認された。よって、細胞は未分化状態を維持しておらず、分化していたことが確認された。
Claims (44)
- 体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、医薬品組成物又は医薬品組成物原料。
- 請求項1に記載の医薬品組成物又は医薬品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤。
- 体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、化粧品組成物又は化粧品組成物原料。
- 請求項3に記載の化粧品組成物又は化粧品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤。
- 体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、コラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料。
- 体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、発毛剤、発毛剤原料、育毛剤又は育毛剤原料。
- 体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料。
- 体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料。
- 体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料。
- 体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、創傷治療剤又は創傷治療剤原料。
- 体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料。
- 幹細胞の抽出物を含む、医薬品組成物又は医薬品組成物原料。
- 前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項12に記載の医薬品組成物又は医薬品組成物原料。
- 請求項12又は13に記載の医薬品組成物又は医薬品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤。
- 幹細胞の抽出物を含む、化粧品組成物又は化粧品組成物原料。
- 前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項15に記載の化粧品組成物又は化粧品組成物原料。
- 請求項15又は16に記載の化粧品組成物又は化粧品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤。
- 幹細胞の抽出物を含む、コラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料。
- 前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項18に記載のコラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料。
- 幹細胞の抽出物を含む、発毛剤、発毛剤原料、育毛剤又は育毛剤原料。
- 前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項20に記載の発毛剤、発毛剤原料、育毛剤又は育毛剤原料。
- 幹細胞の抽出物を含む、毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料。
- 前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項22に記載の毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料。
- 幹細胞の抽出物を含む、線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料。
- 前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項24に記載の線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料。
- 幹細胞の抽出物を含む、血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料。
- 前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項26に記載の血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料。
- 幹細胞の抽出物を含む、創傷治療剤又は創傷治療剤原料。
- 前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項28に記載の創傷治療剤又は創傷治療剤原料。
- 幹細胞の抽出物を含む、表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料。
- 前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項30に記載の表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料。
- 老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞に紫外線を照射することと、
前記紫外線を照射された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、
前記紫外線による前記皮膚細胞のダメージが少ない培地又は前記紫外線を受けた前記皮膚細胞の修復が早い溶液を選択することと、
を含む、抗紫外線物質のスクリーニング方法。 - 老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞を乾燥することと、
前記乾燥された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、
前記皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、
を含む、抗乾燥物質のスクリーニング方法。 - 老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞を乾燥することと、
前記乾燥された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、
前記皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷が小さい溶液を選択することと、
を含む、抗乾燥物質のスクリーニング方法。 - 前記タイトジャンクションにおけるオクルディン及びクローディンの少なくとも一方を分析する、請求項34に記載の方法。
- 老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、
前記酸化ストレスを与えられた皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、
前記皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、
を含む、抗酸化ストレス物質のスクリーニング方法。 - 老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、
前記複数の異なる溶液から前記皮膚細胞由来の天然保湿因子の量が多い溶液を選択することと、
を含む、保湿促進物質のスクリーニング方法。 - 前記天然保湿因子がセラミド及びフィラグリンの少なくも一方である、請求項37に記載の方法。
- 被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
紫外線による前記皮膚細胞のダメージを検査することと、
を含む、皮膚の紫外線耐性検査方法。 - 被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞を乾燥することと、
前記皮膚細胞の生存率を検査することと、
を含む、皮膚の乾燥耐性検査方法。 - 被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞を乾燥することと、
前記皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷を検査することと、
を含む、皮膚の乾燥耐性検査方法。 - 前記皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷を検査することにおいて、前記タイトジャンクションにおけるオクルディン及びクローディンの少なくとも一方を分析する、請求項41に記載の方法。
- 被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、
前記皮膚細胞の生存率を検査することと、
を含む、皮膚の酸化ストレス耐性検査方法。 - 被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞を培養することと、
前記皮膚細胞由来の天然保湿因子の量を検査することと、
を含む、皮膚の保湿能力の検査方法。
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Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20130109999A (ko) * | 2012-03-28 | 2013-10-08 | 고려대학교 산학협력단 | 신경줄기세포 배양액 또는 신경줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물 및 이의 제조방법 |
CN103784474A (zh) * | 2014-01-26 | 2014-05-14 | 广州赛莱拉生物科技有限公司 | 人脂肪间充质干细胞提取物及其冻干粉和应用 |
CN104324053A (zh) * | 2014-09-28 | 2015-02-04 | 严玉霖 | 一种快速愈合犬创伤组织的犬干细胞分泌因子修复液 |
CN104762260A (zh) * | 2015-04-23 | 2015-07-08 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途 |
JP2016516811A (ja) * | 2013-04-19 | 2016-06-09 | コリア ユニバーシティ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーションKorea University Research And Business Foundation | 神経幹細胞抽出物を含有する発毛促進または脱毛防止用組成物及びこれの製造方法 |
CN106109496A (zh) * | 2016-07-06 | 2016-11-16 | 广东科玮生物技术股份有限公司 | 人脐带间充质干细胞提取物冻干粉及制备方法 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110171185A1 (en) * | 1999-06-30 | 2011-07-14 | Klimanskaya Irina V | Genetically intact induced pluripotent cells or transdifferentiated cells and methods for the production thereof |
US20070087437A1 (en) | 2005-10-14 | 2007-04-19 | Jifan Hu | Methods for rejuvenating cells in vitro and in vivo |
EA014166B1 (ru) | 2005-12-13 | 2010-10-29 | Киото Юниверсити | Ядерный фактор перепрограммирования |
KR100964433B1 (ko) | 2008-11-07 | 2010-06-16 | (주)아모레퍼시픽 | 피부 기능 향상 물질의 스크리닝 방법 |
CA2952805C (en) * | 2009-06-05 | 2021-06-01 | Cellular Dynamics International, Inc. | Reprogramming t cells and hematopoietic cells |
US20130236428A1 (en) * | 2012-03-08 | 2013-09-12 | Vincent C. Giampapa | Reprogramming of Aged Adult Stem Cells |
JP2016128396A (ja) | 2015-01-09 | 2016-07-14 | 上田 実 | iPS細胞培養上清を含む医薬組成物およびその製造方法、化粧品およびその製造方法、抗加齢組成物、疾患発症抑制方法、疾患治療方法、組織異常治療方法ならびに美容方法 |
KR101779932B1 (ko) * | 2015-09-15 | 2017-09-21 | 주식회사 스템랩 | 나노그(Nanog)를 도입한 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 육모 촉진용 조성물의 제조방법 |
US11021688B2 (en) | 2015-10-21 | 2021-06-01 | Indiana University Research Annd Technology Corporation | Derivation of human skin organoids from pluripotent stem cells |
JP6624916B2 (ja) | 2015-12-11 | 2019-12-25 | 国立大学法人神戸大学 | 色素幹細胞の製造方法 |
CN110191714A (zh) | 2017-01-11 | 2019-08-30 | 思特科技公司 | 制备用于毛发生长的组合物的方法,该组合物包含从引入了nanog的羊水中胎儿衍生间充质干细胞获得的外泌体 |
CN107158165A (zh) | 2017-05-23 | 2017-09-15 | 广州润虹医药科技有限公司 | 包含ips细胞提取物的抗衰老组合物 |
-
2019
- 2019-10-04 JP JP2020556694A patent/JP7046421B2/ja active Active
- 2019-10-04 US US17/292,298 patent/US12036245B2/en active Active
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-
2022
- 2022-01-21 JP JP2022008191A patent/JP7111313B2/ja active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20130109999A (ko) * | 2012-03-28 | 2013-10-08 | 고려대학교 산학협력단 | 신경줄기세포 배양액 또는 신경줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물 및 이의 제조방법 |
JP2016516811A (ja) * | 2013-04-19 | 2016-06-09 | コリア ユニバーシティ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーションKorea University Research And Business Foundation | 神経幹細胞抽出物を含有する発毛促進または脱毛防止用組成物及びこれの製造方法 |
CN103784474A (zh) * | 2014-01-26 | 2014-05-14 | 广州赛莱拉生物科技有限公司 | 人脂肪间充质干细胞提取物及其冻干粉和应用 |
CN104324053A (zh) * | 2014-09-28 | 2015-02-04 | 严玉霖 | 一种快速愈合犬创伤组织的犬干细胞分泌因子修复液 |
CN104762260A (zh) * | 2015-04-23 | 2015-07-08 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途 |
CN106109496A (zh) * | 2016-07-06 | 2016-11-16 | 广东科玮生物技术股份有限公司 | 人脐带间充质干细胞提取物冻干粉及制备方法 |
Non-Patent Citations (10)
Title |
---|
IIZUKA, HAJIME ET AL: "Regulation of keratinocyte proliferation during wound healing.", SKIN RESEARCH, vol. 38, no. 1, 1996, pages 132 - 147 * |
IKEHARA, HAJIME: "Genetherapy and personalized medicine using disease-specific iPS cells", PEDIATRICS OF JAPAN, vol. 59, no. 12, 1 November 2018 (2018-11-01), pages 1777 - 1783 * |
ITOH, MASATOSHI: "Efficacy and safety of BU moisturizing cream on the dry skin in the patients with atopic dermatitis and xerosis,", HIFU NO KAGAKU, vol. 7, no. 4, 2008, pages 466 - 474 * |
KANG J. ET AL.: "Effects of reprogrammimg-conditioned medium on ultraviolet ray A-damaged human dermal fibroblasts", REPRODUCTION, FERTILITY AND DEVELOPMENT, vol. 29, no. 1, 2016, pages 208 199 * |
MATSUNAGA, KAYOKO: "Skin care for atopic dermatitis in children", JOURNAL OF PEDIATRIC DERMATOLOGY, vol. 23, no. 1, pages 3 - 10 * |
NISHIGORI, CHIKAKO: "Search for the pathogensisand therapy for xeroderma pigmentosum using XP-iPScells", REPORT OF COMMISSIONED BUSINESS 2014, 2015, pages 1 - 15 * |
TAKAHASHI, KENZO: "Molecular biology on development of hairs. For regeneration of lost hairs", MEDICAL PRACTICE, vol. 16, no. 10, 1999, pages 1688 - 1689 * |
TSUKAHARA H ET AL.: "Oxidative stress and altered antioxidant defenses in children with acute exacerbation of atopic dermatitis", LIFE SCIENCES, vol. 72, 2003, pages 2509 - 2516, XP055307485, DOI: 10.1016/S0024-3205(03)00145-0 * |
UYSAL P. ET AL.: "Association of oxidative stress and dynamic thiol-disulphide homeostasis with atopic dermatitis severity and chronicity in children: a prospective study", CLINICAL AND EXPERIMENTAL DERMATOLOGY, vol. 43, no. 2, March 2018 (2018-03-01), pages 124 - 130 * |
VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR PROSTAGLANDIN, vol. 31, 2003, pages 123 - 130 * |
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