CN107158165A - 包含ips细胞提取物的抗衰老组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种包含IPS细胞提取物的抗衰老组合物。本发明抗衰老组合物包含IPS细胞提取物，葡多酚和β‑胡萝卜素。本发明抗衰老组合物对果蝇的半数存活时间、平均寿命和最高寿命均有明显的延长作用。本发明抗衰老组合物能够显著增强D‑半乳糖致小鼠亚衰老模型SOD的含量、降低LPO和脂褐素的含量；本发明抗衰老组合物抗衰老作用显著且安全无毒。

Description

包含IPS细胞提取物的抗衰老组合物
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种包含IPS细胞提取物的抗衰老组合物。
背景技术
衰老是机体各组织、器官功能随年龄增长而发生的退行性变化，是机体各种生化反应的综合表现，是体内外许多因素(环境污染、精神紧张、遗传等)共同作用的结果。近半个多世纪以来，国际上已经提出一系列衰老学说，为揭开衰老机制及开发抗衰老药物奠定了基础。除上述具有代表性的自由基学说、现代前沿研究中的线粒体DNA损伤学说、衰老的端区学说外，还有交联学说、生物膜损伤学说、遗传程序学说、染色体突变学说、差错学说、免疫学说、内分泌学说等。这些学说从研究者所从事的不同学科角度出发，对衰老机制进行了较为深入的探索。目前正逐渐向更深层次的研究方向发展。与此同时我们也要清楚的认识到机体的衰老是一个复杂的过程，是由多种因素引起的一个复杂的生物学过程，与多种因素有关如组织再生性细胞减少、机体内自由基增加、机体中毒等，由多种机制参与发生，各方机制/因素综合作用，在直接造成机体神经、内分泌及免疫等各系统的功能损伤与退化的同时也使神经、内分泌、免疫网络的调节功能逐渐衰退，机体因而逐渐趋于衰老。而衰老过程中引发的各种老年病又会加速衰老的进程。
抗衰老药物是一类以提高生命效率(生存时间与生命活力的总和)为最终目的的药物，其从多系统、多层次和多阶段来发挥其调整功能，它能在遗传学上所界定的寿限内延迟衰老或提高生命质量。虽然目前有很多药物研究都证明能够延缓衰老，但抗衰老药物不可乱用。如长期服用多种维生素虽能降低一些疾病的危险性，但也可能对另一些疾病有负面影响；或者且长期大量服用抗衰老药物会致中毒及使机体产生药物依赖。
中国专利申请(CN105748518A)公开了一种包含脂肪干细胞提取物的抗衰老组合物，所述的抗衰老组合物由脂肪干细胞提取物和二甲双胍组成。但脂肪干细胞增殖分化能力远不及胚胎干细胞，而胚胎干细胞由于涉及伦理问题不能广泛应用。
诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，IPS)一是通过病毒介导或者其他的方式将多个多能性相关的基因导入体细胞后，将体细胞诱导而成的干细胞，它与胚胎干细胞类似具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的特性。IPS细胞的出现，在干细胞研究领域、表观遗传学研究领域以及生物医学研究领域都引起了强烈的反响，这不仅是因为它在基础研究方面的重要性，更是因为它为人们带来的光明的应用前景。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种包含IPS细胞提取物的抗衰老组合物。本发明抗衰老组合物效果明显且安全无毒。
本发明通过以下技术方案实现的：
一种包含IPS细胞提取物的抗衰老组合物，包含IPS细胞提取物，葡多酚和β-胡萝卜素。
优选地，所述IPS细胞提取物，葡多酚和β-胡萝卜素的质量配比为5:1～3:2～4。
优选地，所述IPS细胞提取物的制备方法为：
S1.饲养层细胞的准备：用2.5mL、0.5％明胶铺T75细胞培养瓶并覆盖全部底部，37℃培养箱放置45min后，加入37℃预孵育过10min的细胞完全培养基13mL，加入细胞浓度为1.5×105cells/mL，体积为15mL的CF-1小鼠胚胎成纤维细胞进行培养，饲养层细胞培养第二至三天，饲养层细胞生长密度达80-90％时可以接种诱导多能干细胞；
S2.诱导多能干细胞的培养：将培养获得的IPS细胞悬液，按体积比1:15～1:25接种到预铺有饲养层细胞的T75细胞培养瓶中于37℃的CO2培养箱中培养；
S3.细胞提取物提取：吸出T75细胞培养瓶中培养液，用PBS清洗2～3次，然后加2～3mL细胞裂解液溶解细胞，然后收集到离心管中，离心取上清；取上清液置于透析袋中，以4℃PBS溶液透析8小时；将透析袋内溶液冷冻干燥，保存在-80℃冰箱。
优选地，所述IPS细胞提取物的制备方法步骤S1中所用细胞完全培养基成分为：以DMEM/F12为基础培养基，还添加10％胎牛血清，4g/L大豆蛋白，3mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，7.5mg/L甘氨酰丙氨酸，0.5mg/L海藻糖和0.15mg/L葡多酚。
优选地，所述葡多酚提取方法为：将葡萄皮和葡萄籽在氮气流保护下进行破碎后，加入石油醚脱脂，真空抽干后，加入30mL65％乙醇在45℃恒温水浴锅中浸提2h，过滤，真空包装即得。
本发明抗衰老组合由IPS细胞提取物、葡多酚和β-胡萝卜素组成。IPS细胞提取中含有丰富的生物活性物质，如胶原蛋白、活性肽、生长因子、维生素、矿物质以及抗氧化活性酶等，这些物质均具有优异的抗衰老功能。IPS细胞具有与胚胎干细胞几乎完全相似的功能，因此IPS细胞提取物不仅丰富而且对人体抗原性小，易被人体吸收利用；同时IPS具有无限增殖的性能，并且本发明培养IPS细胞所用培养基中含有海藻糖和葡多酚，其能够保护细胞并能促进细胞增殖及抗氧化活性物质的分泌，这为IPS细胞有效提取物的大量活动提供了可能。
本发明技术人员发现在IPS细胞提取物中加入葡多酚和β-胡萝卜素能够有效保护细胞提取物成分，并且葡多酚具有抗氧化、抗自由基损伤、抗辐射及保护血管等生物活性，而β-胡萝卜除具有抗氧化活性功能外，还与葡多酚具有协同作用。因此，本发明抗衰老组合物中各成分相互有机地结合在一起，能够发挥优异的抗衰老功能。
所述抗衰老组合物可经配制用于口服给药的形式。
对于口服给药，所述抗衰老组合物可采取诸如片剂或胶囊的形式，所述片剂或胶囊通过常规方法用药学上可接受的赋型剂来制备，所述药学上可接受的赋型剂为例如粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。可通过本领域公知的方法对所述片剂进行包衣。
用于口服给药的液体制剂可采取例如溶液剂、糖浆剂或悬浮剂的形式，或者它们可按无水产物形式提供用于在使用前用水或其他适当的媒介物重溶。这样的液体制剂可通过常规方法用药学上可接受的添加剂制备，所述药学上可接受的添加剂为例如助悬剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂质)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。
所述制剂也可根据需要含有缓冲盐、矫味剂、着色剂和甜味剂。用于口服给药的制剂可经适当的配制，以提供活性化合物的控制释放。
与现有技术相比，本发明抗衰老组合物的抗衰老作用明显，试验发现该抗衰老组合物对果蝇的半数存活时间、平均寿命和最高寿命均有明显的延长作用。本发明抗衰老组合物能够显著增强D-半乳糖致小鼠亚衰老模型SOD的含量、降低LPO和脂褐素的含量，且安全无毒。
具体实施方式
下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
本发明IPS细胞购于上海斯丹塞(干细胞)生物技术有限公司，CAS号0210-003；海藻糖购于上海号雨工贸有限公司；Ⅳ型胶原酶，货号M-001。
实施例1一种包含IPS细胞提取物的抗衰老片剂
所述一种包含IPS细胞提取物的抗衰老片剂，由IPS细胞提取物，葡多酚和β-胡萝卜素按质量配比为5:2:3组成。
所述IPS细胞提取物的制备方法，分为以下步骤：
S1.饲养层细胞的准备：用2.5mL、0.5％明胶铺T75细胞培养瓶并覆盖全部底部，37℃培养箱放置45min后，加入37℃预孵育过10min的细胞完全培养基13mL，加入细胞浓度为1.5×105cells/mL，体积为15mL的CF-1小鼠胚胎成纤维细胞进行培养，饲养层细胞培养第二至三天，饲养层细胞生长密度达80-90％时可以接种诱导多能干细胞；
S2.诱导多能干细胞的培养：将培养获得的IPS细胞悬液，体积比1:20接种到预铺有饲养层细胞的T74细胞培养瓶中于37℃的CO2培养箱中培养；
S3.细胞提取物提取：吸出S3培养瓶中培养液，用PBS清洗2～3次，然后加2～3mL细胞裂解液溶解细胞，然后收集到离心管中，离心取上清；取上清液置于透析袋中，以4℃PBS溶液透析8小时；将透析袋内溶液冷冻干燥，保存在-80℃冰箱。
所述IPS细胞提取物的制备方法步骤S1中所用细胞完全培养基成分为：DMEM/F12基础培养基，10％胎牛血清，4g/L大豆蛋白，3mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，7.5mg/L甘氨酰丙氨酸，0.5mg/L海藻糖和0.15mg/L葡多酚。
所述葡多酚提取方法为：将葡萄皮和葡萄籽在氮气流保护下进行破碎后，加入石油醚脱脂，真空抽干后，加入30mL65％乙醇在45℃恒温水浴锅中浸提2h，过滤，真空包装即得。
将所述IPS细胞提取物、葡多酚和β-胡萝卜素按质量配比5:2:3混合均匀后，按常规方法配入适量医用敷料后制成片剂。
实施例2一种包含IPS细胞提取物的抗衰老口服液
所述一种包含IPS细胞提取物的抗衰老口服液，由IPS细胞提取物，葡多酚和β-胡萝卜素按质量配比为5:3:4组成。
所述IPS细胞提取物制备方法、葡多酚提取方法与实施例1类似。
将所述IPS细胞提取物，葡多酚和β-胡萝卜素按质量配比为5:3:4混合均匀后，按常规方法配入适量医用辅料后制成口服液。
实施例3一种包含IPS细胞提取物的抗衰老胶囊
所述一种包含IPS细胞提取物的抗衰老口胶囊，由IPS细胞提取物，葡多酚和β-胡萝卜素按质量配比为5:1:2组成。
所述IPS细胞提取物制备方法、葡多酚提取方法与实施例1类似。
将所述IPS细胞提取物，葡多酚和β-胡萝卜素按质量配比为5:1:2混合均匀，按常规方法配入适量医用辅料后制成胶囊。
对比例1一种包含IPS细胞提取物的抗衰老片剂
所述一种包含IPS细胞提取物的抗衰老片剂，由IPS细胞提取物，葡多酚和维生素E按质量配比为5:2:3组成。
所述IPS细胞提取物制备方法以及片剂制备方法与实施例1类似。
与实施例1的区别在于，将β-胡萝卜素替换为维生素E。
对比例2一种包含IPS细胞提取物的抗衰老片剂
所述一种包含IPS细胞提取物的抗衰老片剂，由IPS细胞提取物，葡多酚和β-胡萝卜素按质量配比为5:2:3组成。
所述IPS细胞提取物的制备方法步骤S1中所用细胞完全培养基成分为：DMEM/F12基础培养基，10％胎牛血清，4g/L大豆蛋白，3mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，7.5mg/L甘氨酰丙氨酸，0.5mg/L甘油和0.15mg/L葡多酚。
其它步骤均与实施例1类似。
与实施例1的区别在于，IPS细胞提取物的制备方法步骤S1中所用细胞完全培养基将海藻糖替换为甘油。
试验例1本发明抗衰老组合物对果蝇寿命的影响
将果蝇放入含有0.15％剂量的本发明实施例1-3及对比例1-2的抗衰老组合物五组培养管中饲养，并设置空白对照组，共分六组。每个剂量组果蝇200只，雌雄各半。每天早晚各观察一次，统计果蝇的死亡数目和生存数，直到全部死亡。比较各组寿命的长短，记录其半数死亡时间、最高寿命和平均寿命。
经过观察、记录，完成果蝇寿命计数后，对所得的实验数据进行统计学分析，如表1所示。由表1可知，与培养基中不加药组相比，加实施例1-3及对比例1-2组制备得到的抗衰老组合物后对果蝇的半数存活时间、平均寿命和最高寿命均有不同程度的延长作用，经统计学处理差异有显著性(P＜0.05～0.01)；实施例1-3组效果优于对比例1-2组，且实施例1组效果最为显著，由此可知本发明制备得到的组合物具备抗衰老活性。
表1不同抗衰老组合物对果蝇寿命的影响
注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。
试验例2对D-半乳糖致小鼠亚衰老模型的影响
选取体重18～22g昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分为7组，每组10只，即空白对照组、模型对照组、实施例1-3及对比例1-2组。模型组和各给药组小鼠每天颈部皮下注射5％D-半乳糖0.5mL/只，连续4周，空白对照组皮下注射等体积生理盐水。在注射D-半乳糖当日开始灌胃药，其中空白对照组、模型对照组分别灌入0.5mL蒸馏水，实施例1-3及对比例1-2组分别灌入对应制备得到的抗衰老组合物水溶液0.5mL，每天1次，持续5周。通过跳台法测定学习记忆情况，实验结果如表2所示。
表2各抗衰老组合物对D-半乳糖致小鼠记忆获得障碍的影响
注：与空白对照组比较##P<0.01，与模型对照组比较*P<0.05，**P<0.01。
由表2可知，用D-半乳糖造模5周后，小鼠活动减少，行为迟缓，皮毛蓬松，用跳台法测定其获得性记忆有明显障碍，触电潜伏期缩短，测试错误次数增加，应用本发明制备得到的抗衰老组合物口服治疗后，发现衰老小鼠的获得性记忆障碍有明显改善，触电潜伏期延长，测试错误次数减少，其中实施例1-3制备得到的抗衰老组合物效果均高于对比例1-2组，且实施例1组效果最佳。
测定血液超氧化物歧化酶(SOD)活性、血清脂质过氧化物(LPO)含量及脂褐素的含量，实验结果如表3所示。
表3各抗衰老组合物对D-半乳糖致小鼠亚衰老模型SOD、LPO、脂褐素的影响
注：与空白对照组比较##P<0.01，与模型对照组比较*P<0.05，**P<0.01。
由表3可知，用D-半乳糖造模5周后，小鼠血液SOD活性减弱，血清LPO含量增加，脑组织内老化代谢产物脂褐素的生成明显增加，表明用D-半乳糖成功制成动物衰老模型。应用本发明制备得到的抗衰老组合物口服治疗后，发现衰老小鼠的血液SOD活性增强，血清LPO含量下降，脑组织内老化代谢产物脂褐素的生成显著减少，其中实施例1-3制备得到的抗衰老组合物效果均高于对比例1-2组，且实施例1组效果最佳。
试验例3本发明抗衰老组合物毒理研究
取SPF级昆明小鼠30只，雌雄各半，体重18-22g，随机分成7组，分别为：对照组、实施例1-3及对比例1-2组。各组动物均空腹12小时，分别以允许的最大给药量灌胃给药。对照组给予蒸馏水0.4mL/10g体重，实施例1-3及对比例1-2采用各组制备得到的抗衰老组合物，给予1g生药/mL浓度的原药液(为最大浓度)0.4mL/10g体重，连续3次，每次间隔4小时。给药后对动物体重、精神状态、毛发、自主活动、摄食量、粪便、口鼻分泌物等一般状况进行观察，并记录动物的不良反应和死亡情况，连续观察7天。
结果表明，与对照组比较，实施例1-3及对比例1-2组小鼠灌胃给药后，大部分动物均出现活动减少，精神倦怠，除此以外，未见其他明显异常反应；2小时后，小鼠基本恢复正常，与对照组比较无明显异常。在2小时后的观察期间，小鼠精神状态良好、毛色光洁、活动自如、呼吸均匀、摄食量、粪便未见明显异常、口鼻内无异常分泌物，无动物死亡。在给药前、给药后第3天、给药后第5天和给药后第7天，分别对动物进行称重，各时间点动物体重均无明显组件差异。试验结束后，解剖小鼠，肉眼观察主要脏器颜色及形态学无改变，未见明显毒性。
实验研究表明，本发明抗衰老组合物对果蝇的半数存活时间、平均寿命和最高寿命均有明显的延长作用；本发明抗衰老组合物能够显著增强D-半乳糖致小鼠亚衰老模型SOD的含量、降低LPO和脂褐素的含量，且安全无毒。由此可知，本发明抗衰老组合物抗衰老效果显著。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (5)

1.一种包含IPS细胞提取物的抗衰老组合物，其特征在于，包含IPS细胞提取物，葡多酚和β-胡萝卜素。
2.根据权利要求1所述包含IPS细胞提取物的抗衰老组合物，其特征在于，所述IPS细胞提取物，葡多酚和β-胡萝卜素的质量配比为5:1～3:2～4。
3.根据权利要求1或2所述包含IPS细胞提取物的抗衰老组合物，其特征在于，所述IPS细胞提取物的制备方法为：
S1.饲养层细胞的准备：用2.5mL、0.5％明胶铺T75细胞培养瓶并覆盖全部底部，37℃培养箱放置45min后，加入37℃预孵育过10min的细胞完全培养基13mL，加入细胞浓度为1.5×105cells/mL，体积为15mL的CF-1小鼠胚胎成纤维细胞进行培养，饲养层细胞培养第二至三天，饲养层细胞生长密度达80-90％时可以接种诱导多能干细胞；
S2.诱导多能干细胞的培养：将培养获得的IPS细胞悬液，按体积比1:15～1:25接种到预铺有饲养层细胞的T75细胞培养瓶中于37℃的CO2培养箱中培养；
S3.细胞提取物提取：吸出T75细胞培养瓶中培养液，用PBS清洗2～3次，然后加2～3mL细胞裂解液溶解细胞，然后收集到离心管中，离心取上清；取上清液置于透析袋中，以4℃PBS溶液透析8小时；将透析袋内溶液冷冻干燥，保存在-80℃冰箱。
4.根据权利要求3所述包含IPS细胞提取物的抗衰老组合物，其特征在于，所述IPS细胞提取物的制备方法步骤S1中所用细胞完全培养基成分为以：DMEM/F12为基础培养基，还添加10％胎牛血清，4g/L大豆蛋白，3mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，7.5mg/L甘氨酰丙氨酸，0.5mg/L海藻糖和0.15mg/L葡多酚。
5.根据权利要求1或2所述包含IPS细胞提取物的抗衰老组合物，其特征在于，所述葡多酚提取方法为：将葡萄皮和葡萄籽在氮气流保护下进行破碎后，加入石油醚脱脂，真空抽干后，加入30mL 65％乙醇在45℃恒温水浴锅中浸提2h，过滤，真空包装即得。
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