CN110373382A - 一种ips细胞提取物的提取方法及利用ips细胞提取物逆转衰老的间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种逆转衰老的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：S1：将诱导多能干细胞的细胞提取物加入至间充质干细胞培养基，充分混匀，使细胞提取物的浓度达到100ug/ul；S2：取成人的牙源性间充质干细胞，将其添加至间充质干细胞必需培养基中培养至衰老代数，随后将其添加至间充质干细胞必需培养基中，进行培养；S3：待间充质干细胞达到80%融合度后进行传代，继续加ips细胞提取物培养3天，得到逆转衰老的间充质干细胞；本发明在衰老的间充质干细胞中加入诱导多能干细胞的细胞提取物，激活衰老间充质干细胞内相关胚胎干细胞基因表达，从而逆转间充质干细胞的衰老状态，使其回到年轻状态，从而保证了间充质干细胞的治疗效果。

Description

一种ips细胞提取物的提取方法及利用ips细胞提取物逆转衰 老的间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及干细胞治疗技术领域，特别是涉及一种ips细胞提取物的提取方法及利用ips细胞提取物逆转衰老的间充质干细胞的方法。

背景技术

随着干细胞基础研究的蓬勃发展和不断完善，基于干细胞的治疗手段正逐渐成为一种疾病治疗的新的有效方式。

目前基于干细胞的临床治疗细胞来源，有胚胎干细胞，基因重编程的诱导多能性干细胞，及来自成体组织的干细胞。虽然胚胎干细胞和诱导多能性干细胞（inducedpluripotent stem cells, iPS cells）均具有全能性，但胚胎干细胞的临床使用受到法律及伦理的限制，iPSCs在人体内的安全性及定向分化还有待于进一步评估与研究。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）作为成体干细胞的一种，不仅具有多向分化能力，而且来源十分广泛，可从骨髓、外周血、脐带、胎盘等多种成体组织及牙髓、牙周膜、牙龈等牙源性组织中获取。近年来，国内外关于MSC的研究已经从基本的生物学特性发展到临床治疗的应用。以mesenchymal stem cell作为关键词，截止到2019年4月7日，在ClinicalTrials.gov网站可以检索到945项登记注册的临床试验。其中利用自体MSCs进行临床治疗，可以避免异体MSCs及胚胎干细胞和诱导多能性干细胞带来的免疫排斥、疾病传染、致瘤的风险及道德伦理问题，因此在临床治疗中安全性更高，具有更好的应用价值。

但是MSCs扩增能力有限，对于临床治疗所需细胞量往往需要扩增代数较高，细胞趋于老化，治疗效果难以保证。因此，如何保持MSCs的年轻状态以及逆转衰老的MSCs至年轻状态以达到临床治疗所需MSCs的标准是目前基于干细胞临床研究亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的缺点，提供一种ips细胞提取物的提取方法及利用ips细胞提取物逆转衰老的间充质干细胞的方法。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案如下：

S1：将诱导多能干细胞接种在添加有培养基的第一培养板上，在显微镜下观察细胞的生长状态；

S2：当诱导多能干细胞克隆生长至80%融合度时，用磷酸盐缓冲液清洗诱导多能干细胞两次，然后添加传代试剂，随后将培养板放置在细胞培养箱中，进行孵育；

S3：在孵育7分钟后，取出培养板，吸出传代试剂，然后加入培养基清洗诱导多能干细胞两次，再添加2ml培养基，轻轻吹打后吸出细胞，分散至第二培养板中进行克隆；

S4：待细胞铺满培养板80%时，采用磷酸盐缓冲液冲洗细胞两次，并用胰酶消化细胞，反复吹打后加入离心机中，离心后取上清液置于-80℃中保存，隔夜后迅速取出，置于室温中融化，再取上清液置于-80℃中保存，隔夜后迅速取出，置于室温中融化，之后再一次取上清液置于-80℃中保存，隔夜后迅速取出，置于室温中融化，再加入离心机中，离心15min，取上清液，得到诱导多能干细胞的细胞提取物；

S5：将诱导多能干细胞的细胞提取物于-80℃保存，即用即取。

进一步地，S1中培养基为mTeSR1无血清、无需滋养层的培养基，贴壁基质是Corning Matrigel。

前所述的一种诱导多能干细胞的细胞提取物的提取方法，S2中传代试剂为Dispase分散酶。

前所述的一种诱导多能干细胞的细胞提取物的提取方法，S2中传代试剂的添加量为0.5ml/cm²。

前所述的一种诱导多能干细胞的细胞提取物的提取方法，S3中第一培养板与第二培养板的面积比例为1：6。

前所述的一种诱导多能干细胞的细胞提取物的提取方法，S4中离心机转速设置为12000转/分钟。

前所述的一种诱导多能干细胞的细胞提取物的提取方法，S3中诱导多能干细胞在第二培养板中的传代倍数为1：6。

一种逆转衰老的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1：将权利要求1提取的诱导多能干细胞的细胞提取物，从-80℃中取出，加入间充质干细胞培养基，充分混匀，使细胞提取物的浓度达到100ug/ul；

S2：取成人的牙源性间充质干细胞，将其添加至间充质干细胞必需培养基中培养至衰老代数，随后将其添加至S5得到的含100ug/ul细胞提取物的间充质干细胞必需培养基中，进行培养；

S3：待间充质干细胞达到80%融合度后进行传代，继续加ips细胞提取物培养3天，得到逆转衰老的间充质干细胞。

本发明的有益效果是：

（1）本发明利用胚胎干细胞提取物可以逆转终末分化的体细胞重编程为诱导多能干细胞的原理，在衰老的间充质干细胞中加入诱导多能干细胞的细胞提取物，激活衰老间充质干细胞内相关胚胎干细胞基因表达，从而逆转间充质干细胞的衰老状态，使其回到年轻状态，从而保证了间充质干细胞的治疗效果；

（2）本发明利用诱导多能干细胞的全能型，采用诱导多能干细胞的细胞提取物培养衰老的间充质干细胞使其逆转至年轻状态，诱导多能干细胞的细胞提取物没有致瘤性以及免疫排斥，有效避免了诱导多能干细胞的潜在致瘤性以及免疫排斥对临床广泛应用的限制；

（3）本发明采用Dispase分散酶作为诱导多能干细胞的传代试剂，Dispase分散酶来自细菌，不会带来支原体或任何动物病毒的污染，且Dispase分散酶的酶活性不受血清的限制；

（4）相较于传统的细胞裂解液裂解法，本发明采用反复冻融裂解法提取细胞提取物，可以为以后的临床转化与应用提供更加安全的保障。

附图说明

图1为对照组与实验组的细胞图。

具体实施方式

为使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施方式并结合附图，对本发明作出进一步详细的说明。

本实施例提供了一种利用细胞提取物培养衰老的MSCs逆转至年轻状态的方法，其中，细胞提取物的来源细胞为iPSCs，即诱导多能干细胞。

诱导多能干细胞（iPS cells）是将四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc）转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。即通过采用导入外源基因的方法使体细胞去分化为多能干细胞。经过近十二年的发展，iPSCs于再生医学领域的研究日趋广泛，在心血管疾病，皮肤创伤，靶向给药系统等领域的发展不断取得新的突破，已有ips细胞用于临床试验。但是iPSCs的潜在致瘤性以及免疫排斥限制了其临床的广发应用。因此我们利用iPSCs是全能细胞的特点，iPSCs的细胞提取物没有致瘤性以及免疫排斥，提取物逆转衰老的MSCs至年轻状态。

从PubMED MESH主题词的定义来看，细胞提取物是细胞的内容物，包括亚细胞结构物质，胞内分离物等。近年来， 国内外一些研究显示, 某些特殊细胞的提取物作用于不同类型细胞, 可发挥重编程效应并调控相关基因的表达。同时也是用于疾病诊断和蛋白质组学研究的重要生物分析物。iPSCs或ESC细胞提取物的研究内容较少且近十年主要集中在其对于成体细胞的重编程效应。2007年，TUI NERI团队证明了胚胎干细胞的细胞提取物可以重编小鼠成纤维细胞，使其表达Oct-4和Rex-1基因并进行碱性磷酸化作用。2009年，YAN-NING XU团队利用经过渗透作用处理的NIH3T3细胞与胚胎干细胞提取物共培养后发现，胚胎干细胞的细胞提取物可以在体外使成体细胞重编，从而使成体细胞在不经过DNA序列干扰的情况下减少其自身分化水平。2015年，Yoo-Wook Kwon等人报导小鼠iPSCs提取物对于成体细胞的重编更有效且安全，而Zscan4可能是致其重编效率增高的关键分子。另外，JingHu团队的研究发现，胚胎干细胞（EGCs）提取物可以消除印记基因并以一种更加安全有效的方式增强iPSCs的细胞功能。

本实施例给出了一种诱导多能干细胞的细胞提取物的提取方法，具体包括以下步骤：

S1：将诱导多能干细胞接种在添加有培养基的六孔培养板中的任一孔内，在显微镜下观察细胞的生长状态，其中，培养基为mTeSR1无血清、无需滋养层的培养基，贴壁基质是Corning Matrigel；

S2：当诱导多能干细胞克隆生长至80%融合度时，用磷酸盐缓冲液清洗诱导多能干细胞两次，然后添加1ml Dispase分散酶作为传代试剂，随后将培养板放置在细胞培养箱中，进行孵育；

S3：在孵育7分钟后，取出培养板，用吸管吸出传代试剂，然后加入培养基清洗诱导多能干细胞两次，之后添加2ml培养基，轻轻吹打后吸出细胞，并将其分散至另一六孔培养板上，且均匀分布在六个孔内，以1:6的比例进行细胞克隆；

S4：待细胞铺满培养板80%时，采用磷酸盐缓冲液冲洗细胞两次，并用胰酶消化细胞，反复吹打，然后加入离心机中，将离心机的转速调至12000r/min，离心后取上清液置于-80℃中保存，隔夜后迅速取出，置于室温中融化，再取上清液置于-80℃中保存，隔夜后迅速取出，置于室温中融化，之后再一次取上清液置于-80℃中保存，隔夜后迅速取出，置于室温中融化，然后再次加入离心机中，以12000转/分钟离心15min，取上清液，采用BCA法测定细胞提取物浓度是否大于100 ug/ul，若细胞提取物浓度大于100 ug/ul，则得到诱导多能干细胞的细胞提取物，若细胞提取物浓度小于100 ug/ul，则需要对上清液进行浓缩；

S5：将诱导多能干细胞的细胞提取物于-80℃保存，即用即取。

另外，诱导多能干细胞在培养过程中，当诱导多能干细胞克隆生长至80%融合度时可进行冻存，后续有需要时方便进行取用。选择合适的冻存液对于诱导多能干细胞的复苏率以及特征的保持都尤为重要。冻存试剂可采用Cryostor CS10(#07930)，Cryostor CS10(#07930)是USP级别经GMP生产的的无动物源成份的冻存液，含有10%的DMSO(二甲基亚枫)，不含内毒素。在冻存时，若以较大的细胞团冻存，诱导多能干细胞在解冻后的存活率将会提高，一般以50-200 µm的团块为宜。

本实施例还提供了一种逆转衰老的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1：将诱导多能干细胞的细胞提取物，加入间充质干细胞培养基，充分混匀，使细胞提取物的浓度达到100ug/ul；

S2：取成人的牙源性间充质干细胞，将其添加至间充质干细胞必需培养基中培养至衰老代数，随后将其添加至S5得到的含100ug/ul细胞提取物的间充质干细胞必需培养基中，进行培养；

S3：待间充质干细胞达到80%融合度后进行传代，继续加ips细胞提取物培养3天，得到逆转衰老的间充质干细胞。

提取两组成人的牙源性间充质干细胞，将其中一组添加至间充质干细胞必需培养基中培养至衰老代数，作为对照组；将另一组添加至间充质干细胞必需培养基中培养至衰老代数，然后添加含100ug/ul细胞提取物的间充质干细胞必需培养基，作为实验组；观察两组牙源性间充质干细胞的生理状态（包括细胞形态，增殖能力，成骨能力和细胞衰老程度）。

参见图1，阳性对照组为第5代间充质干细胞，阴性对照组为第19代衰老间充质干细胞，实验组是加ipsc提取物培养的第19代间充质干细胞，间充质干细胞传代至第19代显示衰老：与第5代细胞相比，细胞形态变大，衰老染色阳性，成骨能力低（钙结节）；而加了提取物的第19代细胞形态成短梭形，衰老染色阳性率很低，成骨能力大大增强（块状钙结节）。

由此可以看出，在衰老的间充质干细胞中加入诱导多能干细胞的细胞提取物，可激活衰老间充质干细胞内相关胚胎干细胞基因表达，从而逆转间充质干细胞的衰老状态，使其回到年轻状态，从而保证间充质干细胞的治疗效果。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式；凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种诱导多能干细胞的细胞提取物的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：将诱导多能干细胞接种在添加有培养基的第一培养板上，在显微镜下观察细胞的生长状态；

S2：当诱导多能干细胞克隆生长至80%融合度时，用磷酸盐缓冲液清洗诱导多能干细胞两次，然后添加传代试剂，随后将培养板放置在细胞培养箱中，进行孵育；

S3：在孵育7分钟后，取出培养板，吸出传代试剂，然后加入培养基清洗诱导多能干细胞两次，再添加2ml培养基，轻轻吹打后吸出细胞，分散至第二培养板中进行克隆；

S4：待细胞铺满培养板80%时，采用磷酸盐缓冲液冲洗细胞两次，并用胰酶消化细胞，反复吹打后加入离心机中，离心后取上清液置于-80℃中保存，隔夜后迅速取出，置于室温中融化，再取上清液置于-80℃中保存，隔夜后迅速取出，置于室温中融化，之后再一次取上清液置于-80℃中保存，隔夜后迅速取出，置于室温中融化，再加入离心机中，离心15min，取上清液，得到诱导多能干细胞的细胞提取物；

S5：将诱导多能干细胞的细胞提取物于-80℃保存，即用即取。

2.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞的细胞提取物的提取方法，其特征在于：所述S1中培养基为mTeSR1无血清、无需滋养层的培养基，贴壁基质是Corning Matrigel。

3.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞的细胞提取物的提取方法，其特征在于：所述S2中传代试剂为Dispase分散酶。

4. 根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞的细胞提取物的提取方法，其特征在于：所述S2中传代试剂的添加量为0.5ml/cm² 。

5. 根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞的细胞提取物的提取方法，其特征在于：所述第一培养板与第二培养板的培养面积比为 1：6。

6.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞的细胞提取物的提取方法，其特征在于：所述S4中离心机的转速设置为12000转/分钟。

7.根据权利要求1所述的一种诱导多能干细胞的细胞提取物的提取方法，其特征在于：所述S3中诱导多能干细胞在第二培养板中的传代倍数为1：6。

8.一种逆转衰老的间充质干细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：将权利要求1提取的诱导多能干细胞的细胞提取物，从-80℃中取出，加入间充质干细胞培养基，充分混匀，使细胞提取物的浓度达到100ug/ul；

S2：取成人的牙源性间充质干细胞，将其添加至间充质干细胞必需培养基中培养至衰老代数，随后将其添加至S5得到的含100ug/ul细胞提取物的间充质干细胞必需培养基中，进行培养；

S3：待间充质干细胞达到80%融合度后进行传代，继续加ips细胞提取物培养3天，得到逆转衰老的间充质干细胞。