CN105002133A - 人体脐带血干细胞提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人体脐带血干细胞提取物，按照下述步骤制取：取人体脐带血，加入细胞培养基，放入培养箱中，恒温恒湿持续传代培养；弃去培养基，分离得到人体脐带血干细胞原溶液；采用冻融法使细胞破碎至人体脐带血干细胞完全破碎，过滤，得到人体脐带血干细胞提取物原溶液。本发明提供的人体脐带血干细胞提取物含有多种生命活性物质，可活化皮肤细胞，激活人体自身的“自愈功能”，减少消除皱纹，延缓细胞衰老，淡化色斑暗疮，美白肌肤；各成分分子量小，仅为300道尔顿，能直接自主迅速渗透到皮肤深层，易被细胞吸收；提取人体同源细胞，对任何皮肤都无副作用，安全性高。

Description

人体脐带血干细胞提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种干细胞提取物，尤其涉及一种人体脐带血干细胞提取物及其制备方法和应用，还涉及一种活性成分包含人体脐带血干细胞提取物的抗皱祛斑美白护肤品。

背景技术

护肤在现代已经成为一门学问，人们受皮肤问题困扰不再盲目地去商店买各种化妆品来试，而是由皮肤科医生开出处方，提供针对性的护肤建议。随着人们对健康的追求日益高涨和皮肤医学的高速发展，带有更高安全性和有效性的医学护肤品已经成为不可阻挡的一股潮流。伴随更多的女性开始注重护肤品的质量和安全性，需要专业人员对皮肤及其附属器的结构和生理作用研究和认识更深入，对化妆品的研究更专业化，性能更具有针对性、可靠性和竞争力。

干细胞研究是当前生命科学研究中的一个热点，干细胞的应用为人类提供了一个全新的未来，为人类疾病的治疗打开了一个新的世界，使得人类不仅可以更好地研究自身发育进化的过程，也可以利用干细胞为人类疾病的研究及药物安全性评价提供新的方向。人们已经不仅仅是利用传统意义上的造血干细胞用于移植治疗，而是将会产生多种形式的干细胞治疗产品，包括以干细胞为最终治疗用产品，以干细胞与生物材料结合的治疗产品，或以干细胞分化为某一细胞类型的治疗产品等，如神经干细胞用于治疗神经萎缩性疾病，骨髓间充质干细胞用于治疗心肌损伤等。干细胞的产业化已经不再是一个理想，而是在不久的将来一定会拥有重大社会效益和经济效益的全球性产业，同时也预示着生物技术产业的一个商机。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人体脐带血干细胞提取物，将其应用于护肤品中，能有效修复皮肤，刺激细胞修复能力，帮助肌肤恢复天然修复功能；精准对抗多种岁月痕迹，显著延缓皮肤衰老速度；再现肌肤青春美态。

本法的第一个方面是提供一种人体脐带血干细胞提取物，按照下述步骤制取：

步骤1，取人体脐带血，加入细胞培养基，放入培养箱中，恒温恒湿持续传代培养；

步骤2，弃去培养基，分离得到人体脐带血干细胞原溶液；

步骤3，采用冻融法使细胞破碎至人体脐带血干细胞完全破碎，过滤，得到人体脐带血干细胞提取物原溶液。

优选地，还包括步骤4：将步骤3得到的人体脐带血干细胞提取物原溶液分装冻干，得到人体脐带血干细胞提取物冻干粉。

优选地，步骤3中冻融具体为：将人体脐带血干细胞原溶液冻结，然后在不高于8℃的温度下解冻，如此冻融，反复操作至细胞完全破碎。

优选地，步骤1中所述细胞培养基为含有胎牛血清的DMEM/F12培养基。

其中，步骤1中培养温度为36-38℃，湿度为90-98％。

优选地，步骤1中培养温度为37℃，湿度为95％。

优选地，步骤3中过滤采用孔径为0.22μm的过滤膜。

本发明的第二个方面是提供一种人体脐带血干细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：

1)取人体脐带血，加入细胞培养基，放入培养箱中，恒温恒湿持续传代培养；

2)弃去培养基，分离得到人体脐带血干细胞原溶液；

3)采用冻融法使细胞破碎至人体脐带血干细胞完全破碎，过滤，得到人体脐带血干细胞提取物原溶液。

优选地，还包括4)：将3)得到的人体脐带血干细胞提取物原溶液分装冻干，得到人体脐带血干细胞提取物冻干粉。

优选地，3)中冻融具体为：将人体脐带血干细胞原溶液冻结，然后在不高于8℃的温度下解冻，如此冻融，反复操作至人体脐带血干细胞完全破碎。

优选地，1)中所述细胞培养基为含有胎牛血清的DMEM/F12培养基。

优选地，3)中过滤采用孔径为0.22μm的过滤膜。

其中，1)中培养温度为36-38℃，湿度为90-98％。

优选地，1)中培养温度为37℃，湿度为95％。

本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的人体脐带血干细胞提取物在化妆品中的应用。

优选地，所述人体脐带血干细胞提取物为冻干粉。

本发明的第四个方面是提供一种抗皱祛斑美白护肤品，所述抗皱祛斑美白护肤品的活性成分包括且优选组成为本发明第一个方面所述的人体脐带血干细胞提取物。

优选地，所述人体脐带血干细胞提取物为冻干粉。

优选地，所述抗皱祛斑美白护肤品还包括溶媒，所述溶媒与所述人体脐带血干细胞提取物分开存储。

其中，所述溶媒可以为水。

本发明相对于现有技术具有如下有益效果：

(1)本发明提供的人体脐带血干细胞提取物含有多种生命活性物质，可活化皮肤细胞，激活人体自身的“自愈功能”，对衰老的细胞进行补充与调控，激活细胞功能，增加细胞数量，提高细胞活性，改善细胞质量，提高细胞膜物质运输功能和物质交换能力，防止和延缓细胞病变，恢复细胞的正常生理功能，促进真皮层细胞分泌合成胶原纤维、多糖、糖蛋白等功能分子，增强细胞新陈代谢，肌纤维排列整齐紧密，从而减少消除皱纹，延缓细胞衰老，淡化色斑暗疮，美白肌肤。

(2)本发明提供的人体脐带血干细胞提取物的各成分分子量小，仅为300道尔顿，能直接自主迅速渗透到皮肤深层，易被细胞吸收(正常情况下，人体皮肤细胞只能吸收分子量小于等于8000道尔顿的物质，而目前市场上销售的护肤品中所含天成分如透明质酸，SOD等，其分子量都在几万至几十万以上，因而无法被皮肤吸收)。

(3)本发明提供的人体脐带血干细胞提取物提取人体同源细胞，对任何皮肤都无副作用，安全性高。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。一、人体脐带血干细胞提取物冻干粉的制备

(1)从医院妇产科获得人体脐带血，加入含有10％(V/V)胎牛血清的DMEM/F12培养基(pH7.0)，放入培养箱中，恒温恒湿持续传代培养，培养温度为37℃，湿度为95％。

(2)弃去培养基，分离得到人体脐带血干细胞原溶液。

(3)将人体脐带血干细胞原溶液冻结，然后在不高于8℃的温度下解冻，如此冻融，反复操作至细胞完全破碎，采用孔径为0.22μm的过滤膜过滤，除去杂质，得到得到人体脐带血干细胞提取物原溶液。

(4)将人体脐带血干细胞提取物原溶液，按1ml/支分装冻干(冻干温度为-20～-35℃，真空度为50～200Pa，冻干时间为24～36小时)，即制得人体脐带血干细胞提取物冻干粉。

二、蛋白质电泳分析人体脐带血干细胞提取物冻干粉

配制12％Tricine-SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶。然后取按标示量配制好的人体脐带血干细胞提取物冻干粉水溶液20μl加入2×上样缓冲液，80℃加热40min。加入处理好的样品，每孔20μl，8mA电流稳流进行电泳约6h，结果显示，人体脐带血干细胞提取物冻干粉的分子量≤8000道尔顿。

三、体外抗衰老实验

取人皮肤成纤维母细胞(HDF细胞)，用含10％(V/V)FBS的DMEM/F12培养基配制HDF细胞悬液，得到4×10⁴cell/ml细胞悬液，分别注入3块96孔培养板内，每孔100μL，每处理组别设复孔4孔，置于含5％(V/V)CO2、37℃的恒温培养箱内培养24h。

试验分组：24h后弃原培养液，各组分别加入含1μg/ml(实验组1)、50μg/ml(实验组2)、100μg/ml(实验组3)胎盘干细胞提取物的1640培养液(已含15％(v/v)新生牛血清)100μL，设含15％新生牛血清的1640培养液100μL为培养基对照组，设不含有新生牛血清的1640培养液为空白对照组，放入37℃、5％CO₂培养箱中分别培养24h、72h、120h、168h。

各观察期终止时，加入20μL/孔的MTT液，继续培养6h，吸去原液，加入150μL/孔二甲基亚砜。震荡10min，在免疫酶标仪上以490nm波长测定吸光度。按下列公式计算细胞相对存活率(RGR)：

检测结果如表1所示。

表1人体脐带血干细胞提取物对HDF细胞相对存活率的影响

由表1可知，人体脐带血干细胞提取物对HDF细胞作用24～168小时，没有细胞毒性作用，反而具有促进HDF细胞增殖的作用，随着体脐带血干细胞提取物浓度的增高，其促细胞生长的作用越明显。胎盘干细胞提取物对HDF细胞生长的促进作用自接触24h后开始逐渐增强，至120h达到高峰，说明本发明提供的人体脐带血干细胞提取物。

四、对经过紫外照射后细胞的修复作用

用含10％(v/v)FBS的DMEM/F12培养基(青霉素200U/ml、链霉素200U/ml，pH7.2)培养人包皮成纤维细胞(HFF，ATCC)至融合度为80％左右时，换用含1％(v/v)FBS的1640培养基，每天在紫外线下照射2小时。阴性对照组用锡纸包住细胞培养瓶。细胞照射完四天后，观察发现细胞开始出现皱缩，开始有个别的细胞漂浮在培养基中。第五天，用含1％(v/v)FBS的1640培养基稀释各样品，人体脐带血干细胞提取物高剂量组终浓度为100μg/ml，低剂量终浓度为1μg/ml；阳性对照组(即紫外照射后不加提取物)加入含1％(v/v)FBS的1640培养基。继续培养24小时，观察细胞形态。结果表明，人体脐带血干细胞提取物对紫外照射造成的细胞损伤具有显著的修复作用。

五、黑色素生成抑制效果

使用小鼠恶性黑色素瘤细胞。使用含有胎牛血清10％的Eagle’s MEM培养基)，在CO₂培养箱(5％CO₂、37℃)内培养。将小鼠恶性黑色素瘤细胞制成细胞浓度3×10⁵个/ml的悬浮液，将该悬浮液1ml注入含有培养基9ml的100mm培养皿中。第二天替换为分别含有1μg/ml(实验组1)、50μg/ml(实验组2)、100μg/ml(实验组3)的人体脐带血干细胞提取物的培养基，培养4天。培养结束后，刮取细胞，各组的细胞数总计为5×10⁶个，进行离心。添加1mol/L NaOH500ml溶解后，测定其溶解液405nm处的吸光度。将无添加组作为100％，计算各组的黑素生成抑制率，结果如表2所示。

表2黑色素生成抑制结果

	抑制率(％)
		实验组1	38.2
实验组2	52.4
		实验组3	69.9

由表2可知，本发明能有效抑制黑色素生成，具有良好的美白效果。

六、外用试验

将本实施例提供的人体脐带血干细胞提取物冻干粉溶解在水中，对40-55岁的健康女性志愿者进行外用试验，在面部的一侧涂抹本实施例提供的人体脐带血干细胞提取物溶液，在另一侧涂抹比较品(市售抗皱产品)，每天涂抹2次，涂抹1周。测量角质层水分含量用CorneoMeter CM825C测定，皮肤水分蒸发量用TewaMeter TM210测定，皮肤粘弹性用弹性测量仪进行测定。弹性测量仪按照常规方法负压吸引2s，释放1s，重复3次，将第一次和第三次的皮肤拉伸(Uf值，最大振幅)以及粘性/弹性比率(Uv/Ue值)同连续使用前进行比较。而且使用硅胶淫魔采集外眼角的印模，测定皱纹的数目和长度，对连续使用前后的数值进行比较。并且通过不干胶胶带采集角质层的脱落程度，由专业人员的视感判定评价皮肤的纹理完整程度，和角质层脱落的均一程度，检测结果如表3所示。

表3外用试验结果

由表3，印模的分析结果表明本发明具有显著的抗皱作用，角质水分含量检测结果可看出本发明具有优异的保湿效果，皮肤水分蒸发量检测结果表明本发明具有显著的改善皮肤干燥效果，皮肤粘弹性检测结果表明本发明能有效增强皮肤弹性，皮肤纹理检测结果表明本发明具有显著的皮肤纹理的效果。

而且涂抹1周后，志愿者的皮肤都明显白皙，有色斑的志愿者的色斑明显淡化。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.人体脐带血干细胞提取物，按照下述步骤制取：

步骤1，取人体脐带血，加入细胞培养基，放入培养箱中，恒温恒湿持续传代培养；

步骤2，弃去培养基，分离得到人体脐带血干细胞原溶液；

步骤3，采用冻融法使细胞破碎至人体脐带血干细胞完全破碎，过滤，得到人体脐带血干细胞提取物原溶液。

2.根据权利要求1所述的人体脐带血干细胞提取物，其特征在于，还包括步骤4：将步骤3得到的人体脐带血干细胞提取物原溶液分装冻干，得到人体脐带血干细胞提取物冻干粉。

3.根据权利要求1所述的人体脐带血干细胞提取物，其特征在于，步骤3中冻融具体为：将人体脐带血干细胞原溶液冻结，然后在不高于8℃的温度下解冻，如此冻融，反复操作至细胞完全破碎。

4.根据权利要求1所述的人体脐带血干细胞提取物，其特征在于，步骤1中所述细胞培养基为含有胎牛血清的DMEM/F12培养基。

5.一种权利要求1所述的人体脐带血干细胞提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取人体脐带血，加入细胞培养基，放入培养箱中，恒温恒湿持续传代培养；

2)弃去培养基，分离得到人体脐带血干细胞原溶液；

3)采用冻融法使细胞破碎至人体脐带血干细胞完全破碎，过滤，得到人体脐带血干细胞提取物原溶液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括4)：将3)得到的人体脐带血干细胞提取物原溶液分装冻干，得到人体脐带血干细胞提取物冻干粉。

7.权利要求1所述的人体脐带血干细胞提取物在化妆品中的应用。

8.一种抗皱祛斑美白护肤品，其特征在于，所述抗皱祛斑美白护肤品的活性成分包括权利要求1所述的人体脐带血干细胞提取物。

9.根据权利要求8所述的抗皱祛斑美白护肤品，其特征在于，所述人体脐带血干细胞提取物为冻干粉。

10.根据权利要求9所述的抗皱祛斑美白护肤品，其特征在于，所述抗皱祛斑美白护肤品还包括溶媒，所述溶媒与所述人体脐带血干细胞提取物分开存储。