CN107550934A - 一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的皮肤修复剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的皮肤修复剂，所述的皮肤修复剂的制备方法包括：(1)培养脐带间充质干细胞，并利用超滤等技术制备提取物；(2)提取由芦根、蓝莲花、木槿花、甘草组成的中药的总黄酮；(3)将干细胞提取物和中药提取物混合。所述的皮肤修复剂可以喷涂、注射等方法作用于疤痕、妊娠纹等部位，通过促组织新生和杀伤成纤维细胞对疤痕、妊娠纹等进行治疗，且方法安全、高效、副作用小，制剂的生产工艺简单、成本低廉。

Description

一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的皮肤修复剂 及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的皮肤修复剂及其应用。

背景技术

疤痕是一种发生在动物表皮的自然现象，是一种创伤后修复时必然发生的病理性现象，会导致皮肤外观和结构发生改变。疤痕在创伤修复中具有一定的负面作用，不仅会导致皮肤外形的破坏，同时也可能造成功能性的影响。可以说，疤痕对于人体创伤后恢复具有心理和生理上的双重负面影响。但是，目前对于疤痕仍缺乏十分有效的治疗方法。常见的方法中，压力疗法作用有限且需要长期坚持，化学及放射疗法副作用明显，激光和手术疗法仅适用有限类型的疤痕。因此，目前对于疤痕的修复具有极高的市场需求。但疤痕如何减少，这要从疤痕的产生过程说起。

疤痕本质上是一种创口修复后期产生的非必要细胞堆积。在皮肤遭到创伤后，创口附近组织会大量分泌细胞因子，促进组织再生，并召集各类细胞覆盖创口。但当创口修复完毕后，新生的组织中沉积的多余细胞就会形成疤痕。其中，成纤维细胞在疤痕产生过程中扮演重要角色。一方面，这种常见细胞会第一时间赶到创口部位帮助修复，另一方面，这种细胞在修复完成后极难代谢，很容易产生堆积形成疤痕组织。由此可见，要治疗疤痕需要两方面的作用，一方面要加快组织修复，减少非必要细胞堆积时间，另一方面对成纤维细胞等非必要细胞进行抑制，减少创口部位的细胞堆积，从而消除疤痕。

干细胞是一类具有自我复制功能的多潜能细胞，间充质干细胞是其中被认为最具有医学价值的干细胞种类。这种细胞一方面具备干细胞自我复制分化的能力，另一方面富含各种类型的细胞因子，可以调节局部免疫水平，促进血管等机体组织新生，从而有效治疗各种组织损伤和自身免疫疾病。例如专利文献CN103037872A，公开日2013.04.10，公开了一种损伤部位治疗用组合物，其用于修复靶组织的损伤部位，该组合物含有通过培养干细胞而得到的干细胞培养上清，所述干细胞来源于间充质干细胞，还公开了一种中枢神经疾病的治疗方法，该方法包括将所述的损伤部位治疗用组合物作为中枢神经疾病治疗用组合物以治疗有效量对中枢神经疾病患者进行给药的步骤。

然而，与体内不同的是，在体表的治疗中，干细胞提取物不仅促进了创口的恢复，同时也加快了瘢痕的产生，这是因为干细胞提取物中的表皮生长因子对成纤维细胞的召集和增殖具有促进作用。因此，有必要引入别的添加剂抑制成纤维细胞。中药提取物在治疗皮肤病方面有相关的报道。例如专利文献CN102319272A，公开日2012.01.18，公开了银杏酚酸在制备治疗皮肤病的外用制剂中的用途。所述银杏酚酸包括银杏酸、银杏酚、银杏二酚等，可通过化学分离方法，从银杏的叶、果、外种皮、根茎等部位的提取物中得到，所述皮肤病为脓疱疮、毛囊炎、疱疹、疣、癣、湿疹、荨麻疹、皮肤瘙痒症、皮炎、螨虫病、疥疮、灰指甲、鸡眼、胼胝、银屑病等多种皮肤病。

但是目前未见间充质干细胞提取物联合中药提取物促进皮肤修复和减少疤痕形成的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种干细胞提取物。

本发明的再一的目的是，提供所述的干细胞提取物的用途。

本发明的另一的目的是，提供一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的皮肤修复剂。

本发明的第四个目的是，提供所述的皮肤修复剂的用途。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种干细胞提取物，所述的干细胞提取物的制备方法包括以下步骤：将华通氏块碎块用含胶原酶II的DMEM培养基消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基传代培养，再换用无血清DMEM培养基传代培养，2天传代一次，收集传代3-5代的细胞进行后续处理；用含EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗，再用无血清DMEM培养基重悬，超声波裂解破碎细胞，破碎产物离心后取上清；将上清用孔径为5000埃的滤器过滤。

优选地，所述的超声波裂解破碎细胞，其具体参数是100-150W，10-20S*15-25次，10-20S间隔。

优选地，所述的用孔径为5000埃的滤器过滤，具体是使用超滤管超滤提纯和浓缩，时间为25-40min，压力为0.25-0.35MPa。

优选地，所述的胶原酶II浓度为0.1-0.2％。

优选地，所述的使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基传代培养，其传代次数仅一代。

优选地，所述的EDTA浓度为0.04-0.06M。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

所述的干细胞提取物在制备促进皮肤修复或减少皮肤疤痕的药物中的应用。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的皮肤修复剂，所述的皮肤修复剂的制备方法包括以下步骤：

(1)干细胞提取物的制备：将华通氏块碎块用含胶原酶II的DMEM培养基消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基传代培养，再换用无血清DMEM培养基传代培养，2天传代一次，收集传代3-5代的细胞进行后续处理；用含EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗，再用无血清DMEM培养基重悬，超声波裂解破碎细胞，破碎产物离心后取上清；将上清用孔径为5000埃的滤器过滤；

(2)中药提取物的制备：按重量份称取充分干燥的物料：芦根15-25份、蓝莲花8-12份、木槿花6-8份、甘草1-3份，用75-85％乙醇浸泡50-70分钟，并用组织破碎器磨碎；用超声波破碎，功率500-700W，时间20-40分钟，10000-15000rpm离心10-20min，取上清，然后用乙醇定容；用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取4-6次；将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干，残留物用无水乙醇溶解；其总黄酮含量不小于20mg/L；

(3)皮肤修复剂的制备：将干细胞提取物和中药提取物混合。

优选地，步骤(1)中所述的超声波裂解破碎细胞，其具体参数是100-150W，10-20S*15-25次，10-20S间隔。

优选地，步骤(1)中所述的用孔径为5000埃的滤器过滤，具体是使用超滤管超滤提纯和浓缩，时间为25-40min，压力为0.25-0.35MPa。

优选地，步骤(2)中各物料的组成为：芦根20份、蓝莲花10份、木槿花8份、甘草2份。

优选地，步骤(3)中，所述的中药提取物和干细胞提取物的体积比为1:18-30。

优选地，步骤(1)中所述的胶原酶II浓度为0.1-0.2％。

优选地，步骤(1)中所述的使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基传代培养，其传代次数仅一代。

优选地，步骤(1)中所述的EDTA浓度为0.04-0.06M。

优选地，步骤(2)中，所述的用负压离心机进行浓缩，具体参数-20～-40mm Hg，40～50摄氏度。

更优选地，所述的皮肤修复剂的制备方法包括以下步骤：

步骤1：脐带间充质干细胞提取物的制备

1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1-3.375mm³大小后，放入无菌培养皿；用含0.1-0.2％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代3-5代的一瓶细胞进行后续处理；

2)用含0.04-0.06M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；

3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(100-150W，10-20S*15-25次，10-20S间隔)，将破碎产物用10000-15000rpm离心10-20分钟，取上清；

4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为25-40min，压力为0.25-0.35MPa；

5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；

6)将产物置于-80摄氏度长期保存；

步骤2：中药提取物的制备

1)准确称取已充分干燥的物料，包括芦根15-25g、蓝莲花8-12g、木槿花6-8g、甘草1-3g，用75-85％乙醇浸泡50-70分钟，并用组织破碎器磨碎；

2)用超声波破碎，功率500-700W，时间20-40分钟，10000-15000rpm离心10-20min，取上清，然后用乙醇定容；

3)用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取4-6次；

4)将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干(-20～-40mm Hg，40～50摄氏度)，残留物用无水乙醇溶解；

5)取1ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃；

步骤3：皮肤修复剂的制备

1)取1ml上述中药提取物与18-30ml脐带间充质干细胞提取物，加入无菌水混合；

2)将上述混合液用0.7μm滤器除菌过滤并封装，每支1.5ml。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

所述的皮肤修复剂在制备促进皮肤修复或减少皮肤疤痕的药物中的应用。

本文中，所述的蓝莲花中文名称：埃及蓝睡莲，拉丁名：Nymphaea coerulea。所述的治疗疤痕，可以是在创面形成过程中预防疤痕的形成，也可以对已形成的疤痕进行治疗，该种疤痕以成纤维细胞聚集为特点，因此不仅包括皮肤创伤引起的疤痕，还包括妊娠纹等。

应用本发明的皮肤修复剂治疗疤痕的方法为：

1)在患者疤痕表面用75％乙醇消毒；

2)在皮下浅表注射本发明的皮肤修复剂200μl～1ml(视疤痕面积而定)；

3)将剩余液体涂抹在疤痕表面；

4)用敷料包裹创口表面。

必要时，制造类似于激光治疗的浅表创口，促进疤痕部位血液供应，进一步削减疤痕部位的非必要细胞堆积。

本发明优点在于：

1、提出了治疗疤痕的新方案：一方面通过对脐带间充质干细胞分离提纯来获取富含多种细胞因子的细胞制剂，促进创口部位生长；另一方面，通过特殊的中药提取物抑制成纤维细胞的聚集，从而降低疤痕的产生。在此基础上，通过对既往疤痕组织实施可控式的损伤，从而加速疤痕部分聚集细胞的代谢，从而减缓甚至治愈疤痕。

2、细胞实验证实，本发明的皮肤修复剂可以有效抑制疤痕相关细胞，尤其是成纤维细胞的生长，而对于其他相关细胞，例如表皮干细胞、血管内皮细胞有良好的促进生长效果。

3、动物实验证实，本发明的皮肤修复剂可以有效促进皮肤组织的再生，尤其是血管再生，皮肤愈合速度加快，并且后期测量和HE染色实验显示几乎没有疤痕组织。而对愈伤组织的免疫荧光实验证实，治疗组的愈伤组织血管较为丰富，平均血管密度相比于模型组显著提高，且成纤维细胞较少。

4、用特殊方法对脐带间充质干细胞分离提纯，保证了提取物中含有大量具有关键作用的细胞因子。

5、采用特殊方法，对特殊原料组成的中药进行提取，获得了可有效抑制成纤维细胞等细胞聚集的提取物。

6、脐带间充质干细胞提取物和中药提取物的合用，具有协同促进皮肤修复、减少疤痕的效果。

7、对细胞无毒副作用，不仅有效，而且安全。

8、所有原料均简便易得，且生产高效，制备快速。

9、均可在制备完成后长期保存，制备产物可在封装后长期保存，保存时间经检测可达到16个月。因此其生产成本和周期均远远低于国外同类产品，从而提升干细胞治疗的临床应用。

综上，本发明为皮肤创伤修复过程中减少疤痕产生，或消除疤痕提供了有效的实施方法。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1本发明皮肤修复剂的制备(一)

步骤1：脐带间充质干细胞提取物的制备

1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm³大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代3代的一瓶细胞进行后续处理；

2)用含0.05M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；

3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(120W，15S*20次，15S间隔)，将破碎产物用12000rpm离心15分钟，取上清；

4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为35min，压力为0.3MPa；

5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；

6)将产物置于-80摄氏度长期保存。

步骤2：中药提取物的制备

1)准确称取已充分干燥的物料，包括芦根20g、蓝莲花10g、木槿花8g、甘草2g，用80％乙醇浸泡60分钟，并用组织破碎器磨碎；

2)用超声波破碎，功率600W，时间30分钟，12000rpm离心15min，取上清，然后用乙醇定容；

3)用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取5次；

4)将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干(-30mm Hg，45摄氏度)，残留物用无水乙醇溶解；

5)取1ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。

步骤3：皮肤修复剂的制备

1)取1ml上述中药提取物与24ml脐带间充质干细胞提取物，加入25ml无菌水混合；

2)将上述混合液用0.7μm滤器除菌过滤并封装，每支1.5ml。

实施例2本发明皮肤修复剂的细胞毒性实验

1、实验方法

1)原代培养脐带间充质干细胞；

2)将脐带间充质干细胞以2*10⁵个/ml铺入12孔板进行实验，贴壁培养至少24h；

3)加入本发明所述的皮肤修复剂(质量浓度分别为0％、0.5％、1％、2％、4％、10％和15％)，并加入细胞损伤剂博来霉素作为对照；

4)对细胞进行流式细胞检测，检测细胞凋亡、细胞活力(CCK8法)。

2、实验结果

对于间充质干细胞的CCK8实验证实，本发明的皮肤修复剂在4％浓度下的细胞毒性为4.2％，10％浓度下的细胞毒性为14.5％，表明其细胞毒性小，并选用4％质量浓度进行后续的细胞实验。

实施例3本发明皮肤修复剂抑制成纤维细胞生长、促进表皮干细胞和血管内皮细胞生长的细胞实验

1、实验方法

1)原代培养不同的细胞，包括成纤维细胞、表皮干细胞和血管内皮细胞；

2)将细胞以2*10⁵铺入12孔板进行实验，每种细胞4个孔，贴壁培养至少24h；

3)每种细胞分别加入本发明所述的皮肤修复剂(质量浓度4％)，并加入博来霉素(终浓度为2μg/ml)作为细胞损伤剂，具体加样方式为：

4)对所有细胞进行流式细胞检测，检测细胞凋亡、细胞活力(CCK8法)。

2、实验结果

各组细胞凋亡率结果见表1。从表1中结果可以看出：在4％皮肤修复剂存在的情况下，成纤维细胞出现13.8％的凋亡，相比于对照组的凋亡率差异均具有统计学意义(P<0.05)，而表皮干细胞和血管内皮细胞的凋亡率相比于对照则有所下降，细胞活力较好；博来霉素对所有细胞都产生了显著的杀伤作用，相比于对照组的凋亡率差异均具有统计学意义(P<0.05)；在4％皮肤修复剂和博来霉素同时存在的情况下，成纤维细胞的凋亡率相比于只有博来霉素存在的组别又显著提高，而表皮干细胞和血管内皮细胞组别的凋亡率却出现了显著的下降，与只有博来霉素存在的组别的凋亡率相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表1各组细胞凋亡率

实施例4本发明皮肤修复剂促进皮肤组织再生和减少疤痕的动物实验

1、实验方法

1)购买C57/BL6J小鼠20只，雄性，6周龄，放入无菌室饲养1周，随机分为5组，分别为对照组(5只)、干细胞提取物治疗组(5只)、中药提取物治疗组(5只)和皮肤修复剂治疗组(5只)；

2)将小鼠麻醉后，在右背部剃毛，并割去直径1cm的圆形皮肤，用无菌缝线固定创口以防止伤口收缩，用敷料覆盖创口；

3)皮肤修复剂治疗组往敷料底侧注射实施例1的皮肤修复剂，每次200μl，干细胞提取物治疗组往敷料底侧注射实施例1的干细胞提取物，每次200μl，中药提取物治疗组往敷料底侧注射实施例1的中药提取物，每次200μl，共3次。对照组注射安慰剂生理盐水，但剂量相同，每3天一次；

4)10天后取出敷料，观察新生皮肤，并计算创面愈合率，计算公式为：(1－未愈合创面面积/原创面面积)×100％；

5)再于第30天后观察小鼠创面愈合情况和疤痕形成情况，计算疤痕体积；

6)对新生皮肤取样进行免疫荧光实验，观察血管生成和成纤维细胞数量。

2、实验结果

给药后第10天各组小鼠创面愈合率见表2。结果表明，干细胞提取物治疗组和皮肤修复剂治疗组的伤口恢复均显著快于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，皮肤修复剂治疗组的伤口修复速度最快。从结果还可以分析得出，皮肤修复剂对皮肤创伤的修复速率显著高于干细胞提取物，将干细胞提取物和中药提取物组合使用可更好的发挥促修复作用。

表2给药后第10天各组小鼠创面愈合率

组别	创面愈合率(％)
		对照组	18.3±2.1
干细胞提取物治疗组	43.4±3.8*
		中药提取物治疗组	15.4±4.0
皮肤修复剂治疗组	63.3±5.7*

注：*P<0.05，vs对照组。

给药后第30天各组小鼠皮肤均已修复完整，疤痕体积统计结果见表3。结果表明，中药提取物治疗组和皮肤修复剂治疗组的疤痕体积均小于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，皮肤修复剂治疗组的疤痕最小。从结果还可以分析得出，皮肤修复剂减少疤痕的效果显著高于中药提取物单用，将干细胞提取物和中药提取物组合使用可更好的发挥抑制疤痕形成的作用。

表3给药后第30天各组大鼠疤痕体积

组别	疤痕体积(cm3)
		对照组	1.08±0.11
干细胞提取物治疗组	1.12±0.08*
		中药提取物治疗组	0.41±0.05*
皮肤修复剂治疗组	0.12±0.01*

注：*P<0.05，vs对照组。

对愈伤组织的免疫荧光实验证实，治疗组的愈伤组织血管较为丰富，成纤维细胞较少。光密度值定量分析表明，皮肤修复剂治疗组愈伤组织平均血管密度(MVD)比对照组高2.3倍，比干细胞提取物治疗组高1.1倍，比中药提取物治疗组高2.1倍。

实施例5影响本发明皮肤修复剂治疗效果的因素考察

本申请发明人结合经验，利用细胞实验对可能影响皮肤修复剂疗效的因素进行了初步考察。设置的组别包含以下四组：

实验组1：制备皮肤修复剂，方法同实施例1，不同之处在于，脐带间充质干细胞的提纯方法为：

1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm³大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代7代的一瓶细胞进行后续处理；

2)用含0.05M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；

3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(120W，15S*20次，15S间隔)，将破碎产物用12000rpm离心15分钟，取上清；

4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为35min、压力为0.3MPa；

5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；

6)将产物置于-80摄氏度长期保存。

实验组2：制备皮肤修复剂，方法同实施例1，不同之处在于，脐带间充质干细胞的提纯方法为：

1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm³大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代5代的一瓶细胞进行后续处理；

2)用含0.05M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；

3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(120W，15S*20次，15S间隔)，将破碎产物用12000rpm离心15分钟，取上清；

4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为35min、压力为0.3MPa；

5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；

6)将产物置于-80摄氏度长期保存。

实验组3：制备皮肤修复剂，方法同实施例1，不同之处在于，中药提取物的制备方法为：

1)准确称取已充分干燥的物料，包括芦根20g、蓝莲花10g、木槿花8g、甘草2g，用90％乙醇浸泡60分钟，并用组织破碎器磨碎；

2)用超声波破碎，功率600W，时间30分钟，12000rpm离心15min，取上清，然后用乙醇定容；

3)用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取5次；

4)将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干(-30mm Hg，45摄氏度)，残留物用无水乙醇溶解；

5)取1ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。

实验组4：制备皮肤修复剂，方法同实施例1，不同之处在于，中药提取物的制备方法为：

1)准确称取已充分干燥的物料，包括芦根20g、蓝莲花10g、木槿花8g、甘草2g，用80％乙醇浸泡60分钟，并用组织破碎器磨碎；

2)用超声波破碎，功率200W，时间90分钟，12000rpm离心15min，取上清，然后用乙醇定容；

3)用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取5次；

4)将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干(-30mm Hg，45摄氏度)，残留物用无水乙醇溶解；

5)取1ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。

然后按照实施例3细胞实验的方法检测各实验组制备的皮肤再生剂对成纤维细胞、表皮干细胞和血管内皮细胞生长的影响，结果见表3-6。分析结果可以看出：相比于实施例1制备的皮肤修复剂，实验组1制备的皮肤修复剂抑制表皮干细胞和血管内皮细胞凋亡的能力均出现了显著下降，促进成纤维细胞凋亡的能力有所下降，表明脐带间充质干细胞传代培养的代数对提取物中关键活性成分产生了较显著的影响；相比于实施例1制备的皮肤修复剂，实验组2制备的皮肤修复剂促进成纤维细胞凋亡的能力和抑制表皮干细胞和血管内皮细胞凋亡的能力均无明显下降，表明脐带间充质干细胞传至第5代其细胞中包含有大量能够抑制表皮干细胞和血管内皮细胞凋亡的活性物质；相比于实施例1制备的皮肤修复剂，实验组3和4制备的皮肤修复剂促进成纤维细胞凋亡的能力出现显著下降，抑制表皮干细胞和血管内皮细胞凋亡的能力略微下降，表明提取过程中乙醇浓度和超声破碎的功率和时间对提取物的物质组成、含量或活性有显著的影响。

表3实验组1细胞凋亡率

表4实验组2细胞凋亡率

表5实验组3细胞凋亡率

表6实验组4细胞凋亡率

实施例6本发明皮肤修复剂的制备(二)

步骤1：脐带间充质干细胞提取物的制备

1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成3.375mm³大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.2％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代4代的一瓶细胞进行后续处理；

2)用含0.06M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；

3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(100W，20S*25次，10S间隔)，将破碎产物用15000rpm离心10分钟，取上清；

4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为40min，压力为0.25MPa；

5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；

6)将产物置于-80摄氏度长期保存。

步骤2：中药提取物的制备

1)准确称取已充分干燥的物料，包括芦根15g、蓝莲花12g、木槿花6g、甘草3g，用85％乙醇浸泡50分钟，并用组织破碎器磨碎；

2)用超声波破碎，功率500W，时间40分钟，10000rpm离心20min，取上清，然后用乙醇定容；

3)用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取4次；

4)将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干(-40mm Hg，50摄氏度)，残留物用无水乙醇溶解；

5)取1ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。

步骤3：皮肤修复剂的制备

1)取1ml上述中药提取物与30ml脐带间充质干细胞提取物，加入无菌水混合；

2)将上述混合液用0.7μm滤器除菌过滤并封装，每支1.5ml。

实施例7本发明皮肤修复剂的制备(三)

步骤1：脐带间充质干细胞提取物的制备

1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm³大小后，放入无菌培养皿；用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代4代的一瓶细胞进行后续处理；

2)用含0.04M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；

3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(150W，10S*15次，20S间隔)，将破碎产物用10000rpm离心20分钟，取上清；

4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为25min，压力为0.35MPa；

5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；

6)将产物置于-80摄氏度长期保存。

步骤2：中药提取物的制备

1)准确称取已充分干燥的物料，包括芦根25g、蓝莲花8g、木槿花8g、甘草1g，用75％乙醇浸泡70分钟，并用组织破碎器磨碎；

2)用超声波破碎，功率700W，时间20分钟，15000rpm离心10min，取上清，然后用乙醇定容；

3)用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取6次；

4)将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干(-20mm Hg，40摄氏度)，残留物用无水乙醇溶解；

5)取1ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。

步骤3：皮肤修复剂的制备

1)取1ml上述中药提取物与18ml脐带间充质干细胞提取物，加入无菌水混合；

2)将上述混合液用0.7μm滤器除菌过滤并封装，每支1.5ml。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种干细胞提取物，其特征在于，所述的干细胞提取物的制备方法包括以下步骤：将华通氏块碎块用含胶原酶II的DMEM培养基消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基传代培养，再换用无血清DMEM培养基传代培养，2天传代一次，收集传代3-5代的细胞进行后续处理；用含EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗，再用无血清DMEM培养基重悬，超声波裂解破碎细胞，破碎产物离心后取上清；将上清用孔径为5000埃的滤器过滤。

2.根据权利要求1所述的干细胞提取物，其特征在于，所述的超声波裂解破碎细胞，其具体参数是100-150W，10-20S*15-25次，10-20S间隔。

3.根据权利要求1所述的干细胞提取物，其特征在于，所述的用孔径为5000埃的滤器过滤，具体是使用超滤管超滤提纯和浓缩，时间为25-40min，压力为0.25-0.35MPa。

4.权利要求1所述的干细胞提取物在制备促进皮肤修复或减少皮肤疤痕的药物中的应用。

5.一种利用干细胞提取物和中药提取物混合制备的皮肤修复剂，其特征在于，所述的皮肤修复剂其制备方法包括以下步骤：

(1)干细胞提取物的制备：将华通氏块碎块用含胶原酶II的DMEM培养基消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基传代培养，再换用无血清DMEM培养基传代培养，2天传代一次，收集传代3-5代的细胞进行后续处理；用含EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗，再用无血清DMEM培养基重悬，超声波裂解破碎细胞，破碎产物离心后取上清；将上清用孔径为5000埃的滤器过滤；

(2)中药提取物的制备：按重量份称取充分干燥的物料：芦根15-25份、蓝莲花8-12份、木槿花6-8份、甘草1-3份，用75-85％乙醇浸泡50-70分钟，并用组织破碎器磨碎；用超声波破碎，功率500-700W，时间20-40分钟，10000-15000rpm离心10-20min，取上清，然后用乙醇定容；用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取4-6次；将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干，残留物用无水乙醇溶解；其总黄酮含量不小于20mg/L；

(3)皮肤修复剂的制备：将干细胞提取物和中药提取物混合。

6.根据权利要求5所述的皮肤修复剂，其特征在于，步骤(1)中所述的超声波裂解破碎细胞，其具体参数是100-150W，10-20S*15-25次，10-20S间隔。

7.根据权利要求5所述的皮肤修复剂，其特征在于，步骤(1)中所述的用孔径为5000埃的滤器过滤，具体是使用超滤管超滤提纯和浓缩，时间为25-40min，压力为0.25-0.35MPa。

8.根据权利要求5所述的皮肤修复剂，其特征在于，步骤(2)中各物料的组成为：芦根20份、蓝莲花10份、木槿花8份、甘草2份。

9.根据权利要求5所述的皮肤修复剂，其特征在于，步骤(3)中，所述的中药提取物和干细胞提取物的体积比为1:18-30。

10.权利要求5所述的皮肤修复剂在制备促进皮肤修复或减少皮肤疤痕的药物中的应用。