CN107488627A - 一种治疗难治性皮肤破损的生物凝胶剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗难治性皮肤破损的生物凝胶剂及其应用。所述的生物凝胶剂是利用含有特殊干细胞培养添加剂的生物相容性可降解凝胶包裹脐带间充质干细胞制备得到的，所述的干细胞培养添加剂由脐带间充质干细胞、中药提取物和血清组成。本发明的生物凝胶剂可促进正常机体细胞增殖，降低缺氧、化疗等常见负面刺激对正常机体细胞的影响，延长细胞生长时间，促进细胞因子的分泌，有效治疗烫伤、烧伤等难治性皮肤损伤，且安全、高效、副作用小，生产简单、成本低廉。

Description

一种治疗难治性皮肤破损的生物凝胶剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种治疗难治性皮肤破损的生物凝胶剂及其应用。
背景技术
难治性皮肤破损并不是一种疾病，而是多种疾病或损伤导致的皮肤破损现象，表现为皮肤易反复破溃、部分皮肤功能丧失、易产生瘢痕等皮肤增生组织等。常见导致皮肤难治性破损的因素有烧烫伤、糖尿病、红斑狼疮、银屑病等。目前，对于这些问题尚无万全的解决方案，因为这种破损往往伴随有复杂的免疫紊乱和组织再生障碍，单一的治疗方案无法针对所有问题进行解决。但是，近年兴起的干细胞疗法有望解决所有组织再生和免疫调控两方面的问题。
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，间充质干细胞是其中被认为最具有医学价值的干细胞种类。这种细胞一方面具备干细胞自我复制分化的能力，另一方面富含各种类型的细胞因子，可以调节局部免疫水平，而且有效促进血管等机体组织新生，从而有效治疗各种组织损伤和自身免疫疾病。例如专利文献CN103037872A，公开日2013.04.10，公开了一种损伤部位治疗用组合物，其用于修复靶组织的损伤部位，该组合物含有通过培养干细胞而得到的干细胞培养上清，所述干细胞来源于间充质干细胞，还公开了一种中枢神经疾病的治疗方法，该方法包括将所述的损伤部位治疗用组合物作为中枢神经疾病治疗用组合物以治疗有效量对中枢神经疾病患者进行给药的步骤。
但是，目前对于干细胞治疗仍存在诸多问题，其中最主要的问题就在于体外培养的干细胞无法稳定地在患者体内长期生存。一般脐带间充质干细胞在移植受体内生存时间仅72小时，超过这个时间就会大量死亡，从而失去治疗价值。而对于皮肤治疗，干细胞治疗更是困难重重。因为皮肤表面缺乏保护，干细胞会迅速失水死亡。即便用敷料保持湿润，其定植生长的成功率也微乎其微。因此，如果要将干细胞应用于皮肤破损的治疗，在皮肤表面制造出一个符合生长的微环境是必要条件。
然而，目前未见能用于治疗难治性皮肤破损，且疗效、力学强度、安全性等各方面性能均十分优异的生物凝胶剂。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种中药提取物。
本发明的再一的目的是，提供一种干细胞培养添加剂。
本发明的另一的目的是，提供一种治疗难治性皮肤破损的生物凝胶剂。
本发明的第四个目的是，提供所述的生物凝胶剂的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种中药提取物，所述的中药提取物的制备方法包括以下步骤：按重量份称取充分干燥的物料：芦根15-25份、蓝莲花8-12份、木槿花6-8份、甘草1-3份，用75％-85％乙醇浸泡50-70分钟，并用组织破碎器磨碎；用超声波破碎，功率500-700W，时间20-40分钟，10000-15000rpm离心10-20min，取上清，然后用乙醇定容；用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取4-6次；将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干，残留物用无水乙醇溶解。
优选地，各物料的组成为：芦根20份、蓝莲花10份、木槿花8份、甘草2份。
优选地，所述的用负压离心机抽干，具体参数-20～-40mm Hg，40～50摄氏度。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种干细胞培养添加剂，所述的干细胞培养添加剂由干细胞提取物、中药提取物和血清组成，三者体积比为1:(18-30):(2-4)；所述的干细胞提取物的制备方法为：将华通氏块碎块用含胶原酶II的DMEM培养基消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基传代培养，再换用无血清DMEM培养基传代培养，2天传代一次，收集传代3-5代的细胞进行后续处理；用含EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗，再用无血清DMEM培养基重悬，超声波裂解破碎细胞，破碎产物离心后取上清；将上清用孔径为5000埃的滤器过滤；所述的中药提取物如上所述，且其总黄酮含量不小于20mg/L；所述的血清选自去蛋白胎牛血清、健康人血清和患者自体血清中的一种或几种。
优选地，所述的超声波裂解破碎细胞，其具体参数是100-150W，10-20S，15-25次，10-20S间隔。
优选地，所述的用孔径为5000埃的滤器过滤，具体是使用超滤管超滤提纯和浓缩，时间为25-40min，压力为0.25-0.35MPa。
优选地，所述的胶原酶II浓度为0.1％-0.2％。
优选地，所述的EDTA浓度为0.04-0.06M。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种治疗难治性皮肤破损的生物凝胶剂，所述的生物凝胶剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将分离的脐带间充质干细胞使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含4％-6％FBS和体积浓度8％-12％所述干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含体积浓度8％-12％所述干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即进行液氮保存或后续使用；
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为(1-5)*104个/ml；所述的凝固剂选自葡聚糖和壳聚糖配方、透明质酸和甲基纤维素配方以及改性聚乙二醇配方中的一种或几种；
所述的葡聚糖和壳聚糖配方包括：
凝固剂A：制备方法如下：明胶用磷酸盐缓冲液溶解，终浓度4％-6％，加入12-18ml乙二胺，调整pH至4.5-6.5，加入2-2.5g EDC，室温反应过夜，用PBS透析后冻干并液氮保存；
凝固剂B：主要成分为氧化葡聚糖和酸化壳聚糖，氧化葡聚糖制备方法如下：将葡萄糖制备成8％-12％水溶液，加入6-6.5g过氧碘酸钠，避光反应3.5-4.5小时后加入1.5-2.5ml乙二醇，用水透析66-78小时后冻干并液氮保存；酸化壳聚糖制备方法如下：将壳聚糖用1.8％-2.2％丙烯酸溶解，55-65摄氏度反应42-54小时后用丙酮沉淀提纯，产物用水溶解后加入0.4％-0.6％京尼平，避光反应20-28小时后超滤，冻干并液氮保存；上述两种成分按(18-22):1的比例混合即为凝固剂B；
所述的透明质酸和甲基纤维素配方包括：
凝固剂A：由II型胶原蛋白、透明质酸和矿物油组成，三者重量比为：(3-3.5):(6-7):1；
凝固剂B：制备方法如下：将甲基纤维素用pH＝11-13的氢氧化钠溶液溶解，调整浓度至3.5％-4.5％，55-65摄氏度反应3.5-4.5小时；
改性聚乙二醇配方包括：
凝固剂A：为含有细胞维持剂的三乙醇胺溶液，细胞维持剂包括10μg/LTernessin-C和细胞因子，所述的细胞因子包括10μg/L血管内皮生长因子、20μg/L成纤维细胞生长因子、5μg/L表皮生长因子和5μg/L干细胞生长因子，还包括三乙醇胺磷酸盐缓冲液，三乙醇胺浓度为0.49％，pH7.0；
凝固剂B：4臂-聚乙二醇-乙烯砜。
优选地，当所述的凝固剂为葡聚糖和壳聚糖配方时，步骤二具体为：将4.5-6ml细胞悬液中加入凝固剂A约180-220mg，充分溶解后加入凝固剂B约270-330mg，充分混匀。
优选地，当所述的凝固剂为透明质酸和甲基纤维素配方时，步骤二具体为：将4.5-6ml细胞悬液中加入凝固剂A约180-220mg，充分溶解后加入凝固剂B约1.10-1.15ml，充分混匀。
优选地，当所述的凝固剂为改性聚乙二醇配方时，步骤二具体为：取1.2-1.6ml凝固剂A与0.12-0.16g凝固剂B进行混合，混合充分后加入4.5-6ml细胞悬液，混匀。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
所述的生物凝胶剂在制备治疗难治性皮肤破损的药物中的应用。
作为本发明的一种具体实施方式，所述的难治性皮肤破损为烫伤、烧伤或糖尿病足，但不仅限于此。
本文中，所述的蓝莲花中文名称：埃及蓝睡莲，拉丁名：Nymphaea coerulea。
应用本发明的生物凝胶剂治疗难治性皮肤破损的方法为：将制备好的水溶剂注射到患处，促使其形成含细胞的生物凝胶。使生物凝胶对患处进行持续的治疗。
本发明优点在于：
1、提出了治疗难治性皮肤破损的新方法，制备了一种生物凝胶剂，该生物凝胶剂具备一定强度，携带各种水溶性成分，可以给干细胞提供一个稳定的生存环境。
2、本发明的生物凝胶剂兼具组织相容性，不仅不会造成组织的局部排异反应，而且可在干细胞生长到达界限后自动崩解吸收，不会对皮肤再生造成障碍。
3、细胞实验证实，本发明的生物凝胶剂可以有效促进正常机体细胞增殖，并降低缺氧、化疗等常见负面刺激对正常机体细胞的影响，有效延长干细胞的生长时间。
4、动物实验证实，本发明的生物凝胶剂可以有效治疗烫伤，显著促进血管新生，减少皮肤成纤维细胞的增殖。此外，发明人还通过动物实验证实了本发明的生物凝胶剂可有效治疗烧伤等皮肤破损。
5、采用特殊方法，对特殊原料组成的中药进行提取，获得了可有效抑制成纤维细胞等细胞聚集，且有效维持其他细胞生长，促进脐带间充质干细胞分泌细胞因子的提取物。
6、制备了特殊成分的干细胞培养添加剂，为脐带间充质干细胞在体表皮肤破损部位的生存提供了有利条件，从而持续释放细胞因子，以此大幅延长干细胞治疗的有效时间和治疗效果。
7、所有原料均简便易得，可在制成半成品后分装保存，因此可实现规模化生产，大幅降低治疗成本；全套制备流程仅耗时7日即可完成制备工艺，使用前仅需15分钟的简单操作就可完成治疗；其生产成本和周期均远远低于国外同类产品，从而能促进干细胞治疗的临床应用。
综上，本发明为烫伤、烧伤等难治性皮肤破损提供了有效的治疗方法。
附图说明
附图1是本发明生物凝胶剂的外观形态，为均匀不透明固态。
附图2是本发明生物凝胶剂中凝胶颗粒的电镜放大图。
附图3是实施例16的细胞实验中，固定在实施例7制备的生物凝胶剂内部的表皮干细胞生存示意图，培养时间为4天，绿色标记活细胞，红色为死细胞。
附图4是实施例16的细胞实验中，培养第4天时通过WesternBlot检测的实施例7制备的生物凝胶中干细胞因子的释放情况。
附图5是凝胶喷涂用喷枪，可将生物凝胶剂直接喷涂在患处。
附图6是喷涂在皮肤表面的生物凝胶剂。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1本发明中药提取物(一)
1)准确称取已充分干燥的物料，包括芦根20g、蓝莲花10g、木槿花8g、甘草2g，用80％乙醇浸泡60分钟，并用组织破碎器磨碎；
2)用超声波破碎，功率600W，时间30分钟，12000rpm离心15min，取上清，然后用乙醇定容；
3)用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取5次；
4)将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干(-30mm Hg，45摄氏度)，残留物用无水乙醇溶解；
5)取1ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。
实施例2本发明中药提取物(二)
1)准确称取已充分干燥的物料，包括芦根15g、蓝莲花12g、木槿花6g、甘草3g，用85％乙醇浸泡50分钟，并用组织破碎器磨碎；
2)用超声波破碎，功率500W，时间40分钟，10000rpm离心20min，取上清，然后用乙醇定容；
3)用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取4次；
4)将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干(-40mm Hg，50摄氏度)，残留物用无水乙醇溶解；
5)取1ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。
实施例3本发明中药提取物(三)
1)准确称取已充分干燥的物料，包括芦根25g、蓝莲花8g、木槿花8g、甘草1g，用75％乙醇浸泡70分钟，并用组织破碎器磨碎；
2)用超声波破碎，功率700W，时间20分钟，15000rpm离心10min，取上清，然后用乙醇定容；
3)用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取6次；
4)将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干(-20mm Hg，40摄氏度)，残留物用无水乙醇溶解；
5)取1ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。
实施例4本发明的干细胞培养添加剂(一)
包括干细胞提取物、中药提取物和血清，三者体积比为：所述的干细胞提取物、中药提取物和血清的比例为：1:24:3。
所述的干细胞提取物的制备方法为：
1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代3代的一瓶细胞进行后续处理；
2)用含0.05M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；
3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(120W，15S*20次，15S间隔)，将破碎产物用12000rpm离心15分钟，取上清；
4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为35min，压力为0.3MPa；
5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；
6)将产物置于-80摄氏度长期保存。
所述的中药提取物的制备方法如实施例1所述。
所述的血清选自去蛋白胎牛血清(购于Gibco)。
实施例5本发明的干细胞培养添加剂(二)
包括干细胞提取物、中药提取物和血清，三者体积比为：所述的干细胞提取物、中药提取物和血清的比例为：1:30:2。
所述的干细胞提取物的制备方法为：
1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成3.375mm3大小后，放入10cm无菌培养皿；用含0.2％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代4代的一瓶细胞进行后续处理；
2)用含0.06M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；
3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(100W，20S*25次，10S间隔)，将破碎产物用15000rpm离心10分钟，取上清；
4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为40min，压力为0.25MPa；
5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；
6)将产物置于-80摄氏度长期保存。
所述的中药提取物的制备方法如实施例2所述。
所述的血清选自去蛋白胎牛血清(购于Gibco)和健康人血清，二者体积比为1:1。
实施例6本发明的干细胞培养添加剂(三)
包括干细胞提取物、中药提取物和血清，三者体积比为：所述的干细胞提取物、中药提取物和血清的比例为：1:18:2。
所述的干细胞提取物的制备方法为：
1)将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入无菌培养皿；用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化；过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养，第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次；取传代4代的一瓶细胞进行后续处理；
2)用含0.04M EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗；
3)将细胞用无血清DMEM培养基重悬，并用超声波裂解破碎(150W，10S*15次，20S间隔)，将破碎产物用10000rpm离心20分钟，取上清；
4)将上清用美国Millipore的孔径5000埃的YM-50超滤管进行超滤提纯和浓缩，时间为25min，压力为0.35MPa；
5)用Elisa试剂盒对提纯产物中TGFB1进行定量，将提纯产物用无血清DMEM培养基稀释至TGFB1浓度为40mg/ml；
6)将产物置于-80摄氏度长期保存。
所述的中药提取物的制备方法如实施例3所述。
所述的血清选自去蛋白胎牛血清(购于Gibco)、健康人血清和患者自体血清，三者体积比为1:1:1。
实施例7本发明的生物凝胶剂(一)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为3*104个/ml。所述的凝固剂选自葡聚糖和壳聚糖配方：
凝固剂A：主要成分为胺化明胶，起环境稳定和促凝结作用，制备方法如下：明胶用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，终浓度5％，加入16ml乙二胺，调整pH至5.5，加入2.3g EDC(1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，室温反应过夜，用PBS透析48小时后冻干并液氮保存。
凝固剂B：主要成分为氧化葡聚糖和酸化壳聚糖，起支架作用。氧化葡聚糖制备方法如下：将葡萄糖制备成10％水溶液，加入6.34g过氧碘酸钠，避光反应4小时后加入2ml乙二醇，用水透析72小时后冻干并液氮保存。酸化壳聚糖制备方法如下：将壳聚糖用2％丙烯酸溶解，60摄氏度反应48小时后用丙酮沉淀提纯，产物用水溶解后加入0.5％京尼平，避光反应24小时后超滤，冻干并液氮保存。上述两种成分按20:1的比例混合即为凝固剂B。
使用方法：将5ml细胞悬液中加入凝固剂A约200mg，充分溶解后加入凝固剂B约300mg，反应液将在充分混匀后的10分钟左右凝结。
实施例8本发明的生物凝胶剂(二)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为2*104个/ml。所述的凝固剂选自透明质酸和甲基纤维素配方：
凝固剂A：主要成分为II型胶原蛋白、透明质酸和矿物油，用来保持细胞活性。具体由50mg II型胶原蛋白、100mg透明质酸和15mg环氧乙烷组成。
凝固剂B：主要成分为羟甲基纤维素，制备方法如下：将甲基纤维素用pH＝12的氢氧化钠溶液溶解，调整浓度至4％，60摄氏度反应4小时。
使用方法：将5ml细胞悬液中加入凝固剂A约200mg，充分溶解后加入凝固剂B约1.14ml，反应液将在充分混匀后的30分钟左右凝结。
实施例9本发明的生物凝胶剂(三)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例6所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例6所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为4*104个/ml。所述的凝固剂选自改性聚乙二醇配方：
凝固剂A：主要成分为含有细胞维持剂的三乙醇胺溶液，细胞维持剂包括Ternessin-C(10μg/L)和各种细胞因子，包括血管内皮生长因子(10μg/L)、成纤维细胞生长因子(20μg/L)、表皮生长因子(5μg/L)和干细胞生长因子(5μg/L)。此外包括三乙醇胺磷酸盐缓冲液(含三乙醇胺0.49％，pH7.0)。
凝固剂B：4臂-聚乙二醇-乙烯砜(4-Arms-PEG-VS)。
使用方法：取1.4ml凝固剂A与0.14g凝固剂B进行混合，混合充分后加入5ml细胞悬液，混匀后约10分钟左右凝结。
实施例10本发明的生物凝胶剂(四)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为1*104个/ml。所述的凝固剂选自葡聚糖和壳聚糖配方：
凝固剂A：制备方法如下：明胶用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，终浓度4％，加入18ml乙二胺，调整pH至4.5，加入2.5g EDC(1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，室温反应过夜，用PBS透析48小时后冻干并液氮保存。
凝固剂B：主要成分为氧化葡聚糖和酸化壳聚糖，氧化葡聚糖制备方法如下：将葡萄糖制备成8％水溶液，加入6.5g过氧碘酸钠，避光反应3.5小时后加入2.5ml乙二醇，用水透析66小时后冻干并液氮保存；酸化壳聚糖制备方法如下：将壳聚糖用2.2％丙烯酸溶解，55摄氏度反应54小时后用丙酮沉淀提纯，产物用水溶解后加入0.4％京尼平，避光反应28小时后超滤，冻干并液氮保存；上述两种成分按18:1的比例混合即为凝固剂B。
使用方法：将6ml细胞悬液中加入凝固剂A约180mg，充分溶解后加入凝固剂B约330mg，充分混匀。
实施例11本发明的生物凝胶剂(五)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为5*104个/ml。所述的凝固剂选自葡聚糖和壳聚糖配方：
凝固剂A：制备方法如下：明胶用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，终浓度6％，加入12ml乙二胺，调整pH至6.5，加入2g EDC(1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，室温反应过夜，用PBS透析48小时后冻干并液氮保存。
凝固剂B：主要成分为氧化葡聚糖和酸化壳聚糖，氧化葡聚糖制备方法如下：将葡萄糖制备成12％水溶液，加入6g过氧碘酸钠，避光反应4.5小时后加入1.5ml乙二醇，用水透析78小时后冻干并液氮保存；酸化壳聚糖制备方法如下：将壳聚糖用1.8％丙烯酸溶解，65摄氏度反应42小时后用丙酮沉淀提纯，产物用水溶解后加入0.6％京尼平，避光反应20小时后超滤，冻干并液氮保存；上述两种成分按22:1的比例混合即为凝固剂B。
使用方法：将4.5ml细胞悬液中加入凝固剂A约220mg，充分溶解后加入凝固剂B约270mg，充分混匀。
实施例12本发明的生物凝胶剂(六)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为1*104个/ml。所述的凝固剂选自透明质酸和甲基纤维素配方：
凝固剂A：由II型胶原蛋白、透明质酸和矿物油组成，三者重量比为：3:7:1。
凝固剂B：制备方法如下：将甲基纤维素用pH＝11的氢氧化钠溶液溶解，调整浓度至4.5％，55摄氏度反应4.5小时。
使用方法：取1.2ml凝固剂A与0.16g凝固剂B进行混合，混合充分后加入4.5ml细胞悬液，混匀。
实施例13本发明的生物凝胶剂(七)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为5*104个/ml。所述的凝固剂选自透明质酸和甲基纤维素配方：
凝固剂A：由II型胶原蛋白、透明质酸和矿物油组成，三者重量比为：3.5:6:1。
凝固剂B：制备方法如下：将甲基纤维素用pH＝13的氢氧化钠溶液溶解，调整浓度至3.5％，65摄氏度反应3.5小时。
使用方法：取1.6ml凝固剂A与0.12g凝固剂B进行混合，混合充分后加入6ml细胞悬液，混匀。
实施例14本发明的生物凝胶剂(八)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例6所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例6所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为5*104个/ml。所述的凝固剂选自改性聚乙二醇配方：
凝固剂A：为含有细胞维持剂的三乙醇胺溶液，细胞维持剂包括10μg/LTernessin-C和细胞因子，所述的细胞因子包括10μg/L血管内皮生长因子、20μg/L成纤维细胞生长因子、5μg/L表皮生长因子和5μg/L干细胞生长因子，还包括三乙醇胺磷酸盐缓冲液，三乙醇胺浓度为0.49％，pH7.0。
凝固剂B：4臂-聚乙二醇-乙烯砜。
使用方法：取1.2ml凝固剂A与0.16g凝固剂B进行混合，混合充分后加入4.5ml细胞悬液，混匀。
实施例15本发明的生物凝胶剂(九)
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例6所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例6所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为1*104个/ml。所述的凝固剂选自改性聚乙二醇配方：
凝固剂A：为含有细胞维持剂的三乙醇胺溶液，细胞维持剂包括10μg/LTernessin-C和细胞因子，所述的细胞因子包括10μg/L血管内皮生长因子、20μg/L成纤维细胞生长因子、5μg/L表皮生长因子和5μg/L干细胞生长因子，还包括三乙醇胺磷酸盐缓冲液，三乙醇胺浓度为0.49％，pH7.0。
凝固剂B：4臂-聚乙二醇-乙烯砜。
使用方法：取1.6ml凝固剂A与0.12g凝固剂B进行混合，混合充分后加入6ml细胞悬液，混匀。
实施例16本发明生物凝胶剂促进细胞增殖、提高细胞耐力和延长细胞生长期的细胞实验
1、实验方法
1)复苏培养小鼠皮肤成纤维细胞MC3T3-L1细胞、表皮干细胞和血管内皮细胞，并用含5％FBS的RPMI1640培养基进行传代培养。
2)用胰蛋白酶消化制备成单细胞悬液。
3)在实施例7、8或9的生物凝胶剂的制备过程中，分别加入上述单细胞悬液，制成与脐带间充质干细胞共培养的生物凝胶，上述单细胞悬液和脐带间充质干细胞悬液的加量相同，细胞数目相同。
4)将制备的生物凝胶注入6孔板进行培养。
5)在第1、4、7、14天观察细胞状态。
2、实验结果
当与脐带间充质干细胞凝胶共培养4天后，在实施例7的生物凝胶培养体系中，皮肤成纤维细胞的增殖能力相比于对照(即常规的RPMI1640培养体系)下降1.7倍，而血管内皮细胞和表皮干细胞增殖能力分别提升72％和61％；在实施例8的生物凝胶培养体系中，皮肤成纤维细胞的增殖能力相比于对照下降1.5倍，而血管内皮细胞和表皮干细胞增殖能力分别提升63％和60％；在实施例9的生物凝胶培养体系中，皮肤成纤维细胞的增殖能力相比于对照下降1.4倍，而血管内皮细胞和表皮干细胞增殖能力分别提升68％和59％。
对共培养体系下进行化疗刺激，在实施例7的生物凝胶培养体系中，血管内皮细胞和表皮干细胞的耐受能力分别提升60％；在实施例8的生物凝胶培养体系中，血管内皮细胞和表皮干细胞的耐受能力分别提升54％；在实施例9的生物凝胶培养体系中，血管内皮细胞和表皮干细胞的耐受能力分别提升55％。
在缺氧培养体系中，在实施例7的生物凝胶培养体系中，血管内皮细胞和表皮干细胞的耐受能力均提升40％；在实施例8的生物凝胶培养体系中，血管内皮细胞和表皮干细胞的耐受能力分别提升37％和38％；在实施例9的生物凝胶培养体系中，血管内皮细胞和表皮干细胞的耐受能力分别提升32％和35％。
观察各处理的细胞生长时间，在模仿人体的恒温培养环境下，对于实施例7的生物凝胶培养体系，各类细胞的培养时间均可以达到12天，对于实施例8和9的生物凝胶培养体系，各类细胞的培养时间均可以达到14天，而在无凝胶情况下(即使用常规的RPMI1640培养体系)，其培养时间约为3天。
实施例17本发明生物凝胶剂的动物实验
1、实验方法
1)取5-6周龄健康雄性C57小鼠24只，分笼饲养1周。
2)用水合氯醛将小鼠麻醉后背部剃毛，放入自制烫伤管(烫伤面直径1cm)。
3)灌入沸水，静置20s后取出，放回无菌环境培养。
4)在处理后48小时，观察创面，取出构建失败的模型小鼠。
5)在烫伤后的第3天，将剩余小鼠分为4组，治疗一组喷涂实施例7制备的生物凝胶，治疗二组喷涂实施例8制备的生物凝胶，治疗三组喷涂实施例9制备的生物凝胶，对照组喷涂安慰剂生理盐水。完成处理后用敷料覆盖。
6)在烫伤后第12天，处死小鼠，取出烫伤部位皮肤进行检测。
2、实验结果
通过免疫组化和荧光染色实验，经过治疗后，治疗一组(n＝5)的新生血管密度相比于对照组(n＝5)提升了84％，皮肤成纤维细胞(瘢痕主要来源)降低57％，治疗二组(n＝5)的新生血管密度相比于对照组提升了78％，皮肤成纤维细胞降低52％，治疗三组(n＝6)的新生血管密度相比于对照组提升了85％，皮肤成纤维细胞降低61％。
实施例18影响本发明生物凝胶剂治疗效果的因素考察
本申请发明人结合经验，利用动物实验对可能影响生物凝胶剂疗效的因素进行了初步考察。设置的组别包含以下三组：
实验组1：制备生物凝胶剂，方法同实施例7，不同之处在于，步骤一的具体方法为：将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第7代后，将培养基替换为含5％FBS和10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例4所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
实验组2：制备生物凝胶剂，方法同实施例8，不同之处在于，步骤一的具体方法为：将新生儿脐带组织取出，去除血管、皮膜和血块，分离出华通氏块，剪成1mm3大小后，放入无菌培养皿，用含0.1％胶原酶II的DMEM培养基进行消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含5％FBS和14％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含10％实施例5所述的干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即可进行液氮保存或后续使用。
实验组3：制备生物凝胶剂，方法同实施例7，不同之处在于，干细胞培养添加剂中的中药提取物的制备方法为：
1)准确称取已充分干燥的物料，包括芦根20g、蓝莲花10g、木槿花8g、甘草2g，用90％乙醇浸泡60分钟，并用组织破碎器磨碎；
2)用超声波破碎，功率600W，时间30分钟，12000rpm离心15min，取上清，然后用乙醇定容；
3)用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取5次；
4)将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干(-30mm Hg，45摄氏度)，残留物用无水乙醇溶解；
5)取1ml产物，用石油醚萃取后定容，以黄芪黄酮标准品制作标准曲线，用吸光度法对产物进行精确定量，用无菌水对剩余产物进行稀释，稀释至总黄酮含量为20mg/L。如无法达到此浓度，视为提取失败，产物应当废弃。
通过免疫组化和荧光染色实验，经过治疗后，实验组1(n＝5)的新生血管密度相比于对照组提升了32％，皮肤成纤维细胞(瘢痕主要来源)降低21％，实验组2(n＝5)的新生血管密度相比于对照组提升了35％，皮肤成纤维细胞降低19％，实验组3(n＝5)的新生血管密度相比于对照组提升了36％，皮肤成纤维细胞降低25％。可见以上生物凝胶剂对于烫伤的治疗效果要显著弱于实施例7-9，表明脐带间充质干细胞的培养过程、干细胞培养添加剂的浓度和中药提取物的提取过程都对生物凝胶剂的成分产生了影响，进一步影响了脐带间充质干细胞的生长状态，尤其是活性细胞因子的释放，因此对烫伤部位的修复产生了显著的影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种中药提取物，其特征在于，所述的中药提取物的制备方法包括以下步骤：按重量份称取充分干燥的物料：芦根15-25份、蓝莲花8-12份、木槿花6-8份、甘草1-3份，用75％-85％乙醇浸泡50-70分钟，并用组织破碎器磨碎；用超声波破碎，功率500-700W，时间20-40分钟，10000-15000rpm离心10-20min，取上清，然后用乙醇定容；用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取4-6次；将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干，残留物用无水乙醇溶解。
2.一种干细胞培养添加剂，其特征在于，所述的干细胞培养添加剂由干细胞提取物、中药提取物和血清组成，三者体积比为1:(18-30):(2-4)；所述的干细胞提取物的制备方法为：将华通氏块碎块用含胶原酶II的DMEM培养基消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基传代培养，再换用无血清DMEM培养基传代培养，2天传代一次，收集传代3-5代的细胞进行后续处理；用含EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗，再用无血清DMEM培养基重悬，超声波裂解破碎细胞，破碎产物离心后取上清；将上清用孔径为5000埃的滤器过滤；所述的中药提取物如权利要求1所述，且其总黄酮含量不小于20mg/L；所述的血清选自去蛋白胎牛血清、健康人血清和患者自体血清中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的干细胞培养添加剂，其特征在于，所述的超声波裂解破碎细胞，其具体参数是100-150W，10-20S，15-25次，10-20S间隔。
4.根据权利要求2所述的干细胞培养添加剂，其特征在于，所述的用孔径为5000埃的滤器过滤，具体是使用超滤管超滤提纯和浓缩，时间为25-40min，压力为0.25-0.35MPa。
5.一种治疗难治性皮肤破损的生物凝胶剂，其特征在于，所述的生物凝胶剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一：分离培养脐带间充质干细胞
将分离的脐带间充质干细胞使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含4％-6％FBS和体积浓度8％-12％权利要求2所述干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含体积浓度8％-12％权利要求2所述干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即进行液氮保存或后续使用；
步骤二：制备生物凝胶剂
将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为(1-5)*104个/ml；所述的凝固剂选自葡聚糖和壳聚糖配方、透明质酸和甲基纤维素配方以及改性聚乙二醇配方中的一种或几种；
所述的葡聚糖和壳聚糖配方包括：
凝固剂A：制备方法如下：明胶用磷酸盐缓冲液溶解，终浓度4％-6％，加入12-18ml乙二胺，调整pH至4.5-6.5，加入2-2.5g EDC，室温反应过夜，用PBS透析后冻干并液氮保存；
凝固剂B：主要成分为氧化葡聚糖和酸化壳聚糖，氧化葡聚糖制备方法如下：将葡萄糖制备成8％-12％水溶液，加入6-6.5g过氧碘酸钠，避光反应3.5-4.5小时后加入1.5-2.5ml乙二醇，用水透析66-78小时后冻干并液氮保存；酸化壳聚糖制备方法如下：将壳聚糖用1.8％-2.2％丙烯酸溶解，55-65摄氏度反应42-54小时后用丙酮沉淀提纯，产物用水溶解后加入0.4％-0.6％京尼平，避光反应20-28小时后超滤，冻干并液氮保存；上述两种成分按(18-22):1的比例混合即为凝固剂B；
所述的透明质酸和甲基纤维素配方包括：
凝固剂A：由II型胶原蛋白、透明质酸和矿物油组成，三者重量比为：(3-3.5):(6-7):1；
凝固剂B：制备方法如下：将甲基纤维素用pH＝11-13的氢氧化钠溶液溶解，调整浓度至3.5％-4.5％，55-65摄氏度反应3.5-4.5小时；
改性聚乙二醇配方包括：
凝固剂A：为含有细胞维持剂的三乙醇胺溶液，细胞维持剂包括10μg/L Ternessin-C和细胞因子，所述的细胞因子包括10μg/L血管内皮生长因子、20μg/L成纤维细胞生长因子、5μg/L表皮生长因子和5μg/L干细胞生长因子，还包括三乙醇胺磷酸盐缓冲液，三乙醇胺浓度为0.49％，pH7.0；
凝固剂B：4臂-聚乙二醇-乙烯砜。
6.根据权利要求5所述的生物凝胶剂，其特征在于，当所述的凝固剂为葡聚糖和壳聚糖配方时，步骤二具体为：将4.5-6ml细胞悬液中加入凝固剂A约180-220mg，充分溶解后加入凝固剂B约270-330mg，充分混匀。
7.根据权利要求5所述的生物凝胶剂，其特征在于，当所述的凝固剂为透明质酸和甲基纤维素配方时，步骤二具体为：将4.5-6ml细胞悬液中加入凝固剂A约180-220mg，充分溶解后加入凝固剂B约1.10-1.15ml，充分混匀。
8.根据权利要求5所述的生物凝胶剂，其特征在于，当所述的凝固剂为改性聚乙二醇配方时，步骤二具体为：取1.2-1.6ml凝固剂A与0.12-0.16g凝固剂B进行混合，混合充分后加入4.5-6ml细胞悬液，混匀。
9.权利要求5所述的生物凝胶剂在制备治疗难治性皮肤破损的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的难治性皮肤破损为烫伤、烧伤或糖尿病足。
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