CN109985064B - 间充质干细胞分泌提取物的用途、间充质干细胞分泌提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种间充质干细胞分泌提取物在制备抑制疼痛药物中的应用，能够抑制疼痛，提高疼痛患者生活质量；充分利用了间充质干细胞培养中分泌大量活性物质因子的特点，最大限度发挥了细胞培养上清液的功效，降低废弃的细胞培养上清液作为生物垃圾对自然环境和人类健康存在的潜在危害，也降低了间充质干细胞作为细胞治疗的成本。

Description

间充质干细胞分泌提取物的用途、间充质干细胞分泌提取物 及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种间充质干细胞分泌提取物的用途、间充质干细胞分泌提取物及其制备方法。

背景技术

慢性疼痛是一种不愉快的感觉性和情绪性体验，这种体验跟明确的、或潜在的、或自己认为的组织损伤有关，疼痛持续或反复发作超过三个月定义为慢性疼痛。全世界约有15亿人饱受慢性疼痛的困扰，被比喻为一种不死的癌症。2018年6月，世界卫生组织修订国际疾病分类，慢性疼痛被定义为疾病。慢性疼痛包括软组织及关节劳损性或退变疼痛、椎间盘源性疼痛、神经源性疼痛。从美国的统计数据看到，2012年的慢性疼痛医疗支出，超过了心脏病、肿瘤和糖尿病三大人类健康杀手的费用总和。由此可见，慢性疼痛所造成的医疗负担极重，全社会都应尽早重视起来。

对于慢性疼痛的治疗，目前主要还是以手术和服用止痛药为主，手术带来的创伤性不言而喻，止痛处方药也只能缓解疼痛而未能根除潜在病因。干细胞疗法正在改变整个医疗行业，合理地利用这一科学进步，人类有望使慢性疼痛的影响最小化。干细胞治疗也有望成为提高慢性疼痛患者生活质量的一种突破性方法。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是一种体内的种子修复细胞，在适当条件下可以分化为包括神经、心脏、肌肉、血管、软骨、骨骼、脂肪、肾脏、肝脏、皮肤等器官或组织的细胞。此外，间质干细胞还具有独特的免疫调节功能，能够控制炎症的同时修复机体内受损的组织。

间充质干细胞能够修复机体损伤组织，控制炎症，同时促使自体细胞新生的机理一方面是其自身的增殖分化能力，可以分化成不同的体细胞以代替受损的机体细胞，更重要的一点是其强大的细胞因子分泌功能，形成免疫调节因子(HGF、LIF)、趋化因子(RANTES、SDF-1α、fractalkine、MIP-1α、MCP-1、MCP-2)、支持祖细胞的营养因子(IL-6、FGF-2、PDGF-AA、PDGF-BB、EGF)、血管再生因子(VEGF165、FGF-2、PDGF-AA、PDGF-BB、EGF)、抑制疤痕因子(HGF、FGF-2)、抗凋亡因子(VEGF165、FGF-2、HGF)、伤口愈合相关因子(IL-6、IL-8、TGF-β1、MCP-1、VEGF、GM-CSF、TIMP-1)、各型胶原蛋白(I、II、III、IV型胶原蛋白)以及各种溶菌酶等系统的调控网络。这些细胞因子可有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。

但目前人们无论在实验研究，还是GMP(Good manufacturing practices,生产质量管理规范)生产中只关注间充质干细胞的生产，对间充质干细胞培养的上清液当作生物垃圾废弃，这极大地浪费了间充质干细胞在培养过程中分泌的生物活性物质。

如何得到一种能够抑制慢性疼痛的物质及充分利用充质干细胞分泌的活性物质，是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

针对如何得到一种能够抑制慢性疼痛的物质及充分利用充质干细胞分泌的活性物质的技术问题，本发明的目的在于提供一种间充质干细胞分泌提取物的用途、间充质干细胞分泌提取物及其制备方法。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了一种间充质干细胞分泌提取物的用途，所述间充质干细胞分泌提取物在制备抑制疼痛药物中的应用。

进一步地，所述抑制疼痛药物的使用方式是肌肉注射。

进一步地，所述抑制疼痛药物中间充质干细胞分泌提取物的用量为0.3±0.05mg/kg。

本发明还提供了一种如上所述的间充质干细胞分泌提取物，所述间充质干细胞分泌提取物的间充质干细胞来源于人的脐带、羊膜、胎盘、牙髓、骨髓以及脂肪中的任意一种或几种。

进一步地，所述间充质干细胞为第3～10代体外培养的传代间充质干细胞。

本发明还提供了一种如上所述的间充质干细胞分泌提取物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

传代间充质干细胞制备：将体外分离获得的间充质干细胞以无血清培养基进行细胞培养，于37±0.5℃培养直至细胞生长至85±5％融合时进行传代培养，获得传代间充质干细胞；

间充质干细胞分泌提取物原液制备：将所述传代的间充质干细胞进行细胞培养，于37±0.5℃培养直至细胞生长至85±5％融合后，于30～32℃继续培养6～8h，获得细胞培养上清物质，将所述细胞培养上清物质离心去除细胞碎片，获得间充质干细胞分泌提取物原液；

间充质干细胞分泌提取物脱敏粗产品制备：将所述间充质干细胞分泌提取物原液用0.22μm滤器过滤，获得的滤液用截留分子量为10KD的超滤管离心，获得间充质干细胞分泌提取物脱敏粗产品；

小分子激动剂去除：将所述间充质干细胞分泌提取物脱敏粗产品用截留分子量为3KD的超滤管离心，获得间充质干细胞分泌提取物。

进一步地，在所述小分子激动剂去除步骤后，还包括以下步骤：

用生理盐水调节间充质干细胞分泌提取物的蛋白总浓度为4±0.1mg/mL，按体积比6％添加Dextran40葡萄糖注射液，获得间充质干细胞分泌提取物蛋白稳定体系。

进一步地，所述制备方法中的过滤以及离心均在4±1℃条件下进行。

进一步地，所述间充质干细胞分泌提取物原液制备步骤中，于30～32℃继续培养6～8h培养前和培养后，分别测定细胞活率确认细胞活率大于90％后进行下一步操作。

进一步地，所述无血清培养基为质量浓度为5/10％血小板裂解物生理盐水溶液。

本发明提供了一种间充质干细胞分泌提取物在制备抑制疼痛药物中的应用，能够抑制疼痛，提高疼痛患者生活质量；充分利用了间充质干细胞培养中分泌大量活性物质因子的特点，最大限度发挥了细胞培养上清液的功效，降低废弃的细胞培养上清液作为生物垃圾对自然环境和人类健康存在的潜在危害，也降低了间充质干细胞作为细胞治疗的成本。

附图说明

图1本发明实施例1和2脐带间充质干细胞不同培养温度形态图；

图2本发明实施例3脐带间充质干细胞不同培养温度、时间细胞培养上清液细胞因子表达谱图；

图3本发明实施例2至4各制备步骤后蛋白总浓度变化谱图；

图4本发明实施例5间充质干细胞分泌提取物蛋白稳定体系保存效果图。

具体实施方式

下面以具体实施方式对发明作进一步详细说明

本发明参照特定的实施例进行了描述，但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不违背本发明的精神和范围。因此，本发明的说明书和附图应该认为是说明性的而非限制性的。

本发明提供的一实施例的间充质干细胞分泌提取物，其间充质干细胞分泌提取物的间充质干细胞来源于人的脐带、羊膜、胎盘、牙髓、骨髓以及脂肪中的任意一种或几种，以使该间充质干细胞分泌提取物了用于制备抑制疼痛药物。从而得到一种能够抑制疼痛，提高疼痛患者生活质量的药物；此外，还充分利用了间充质干细胞培养中分泌大量活性物质因子的特点，最大限度发挥了细胞培养上清液的功效，降低废弃的细胞培养上清液作为生物垃圾对自然环境和人类健康存在的潜在危害，也降低了间充质干细胞作为细胞治疗的成本。

可选地，该抑制疼痛药物的使用方式是肌肉注射。优选地，肌肉注射位置为疼痛部位。

进一步可选地，该抑制疼痛药物中的间充质干细胞分泌提取物用量为0.3±0.05mg/kg。可选地，可将间充质干细胞分泌提取物用注射用水/生理盐水稀释至4±0.1mg/mL罐装于西林瓶中；优选地，添加终体积比为6％的Dextran40葡萄糖注射液以形成蛋白稳定体系，从而延长抑制疼痛药物的保存期限。

作为一种可选实施方式，间充质干细胞分泌提取物选用的间充质干细胞为第3～10代体外培养的传代间充质干细胞。第3～10代体外培养的传代间充质干细胞在体外稳定存活，从而能够分泌较多数量和种类的活性物质以便进行提取。

本发明提供的上述的间充质干细胞分泌提取物的制备方法，包括以下步骤：

传代间充质干细胞制备：将体外分离获得的间充质干细胞以无血清培养基进行细胞培养，于37±0.5℃培养直至细胞生长至85±5％融合时进行传代培养，获得传代间充质干细胞；

间充质干细胞分泌提取物原液制备：将传代的间充质干细胞进行细胞培养，于37±0.5℃培养直至细胞生长至85±5％融合后，于30～32℃继续培养6～8h，获得细胞培养上清物质，将细胞培养上清物质离心去除细胞碎片，获得间充质干细胞分泌提取物原液；将传代的间充质干细胞于亚低温培养能够降低间充质干细胞培养上清液中的炎性因子，利于分离提取并避免该提取物用于抑制疼痛药物时引起炎症。

间充质干细胞分泌提取物脱敏粗产品制备：将间充质干细胞分泌提取物原液用0.22μm滤器过滤，获得的滤液用截留分子量为10KD的超滤管离心，获得间充质干细胞分泌提取物脱敏粗产品；

小分子激动剂去除：将间充质干细胞分泌提取物脱敏粗产品用截留分子量为3KD的超滤管离心，获得间充质干细胞分泌提取物。

可选地，在小分子激动剂去除步骤后，还包括以下步骤：用生理盐水调节间充质干细胞分泌提取物的蛋白总浓度为4±0.1mg/mL，按体积比6％添加Dextran40葡萄糖注射液，获得间充质干细胞分泌提取物蛋白稳定体系。如图4所示，间充质干细胞分泌提取物蛋白稳定体系能够使间充质干细胞分泌提取物中的蛋白质含量稳定，能够延长药物的保存期限。

优选地，上述制备方法中的过滤以及离心均在4±1℃条件下进行。

作为一种可选实施方式，所述间充质干细胞分泌提取物原液制备步骤中，于30～32℃继续培养6～8h培养前和培养后，分别测定细胞活率确认细胞活率大于90％后进行下一步操作。确认细胞活率能够确保细胞培养上清液中含有大量丰富的间充质干细胞分泌的活性成分以便于提取。

可选地，无血清培养基为质量浓度为5～10％血小板裂解物生理盐水溶液。

实施例1：生物安全性人源MSC的获得和培养

按MSC的临床试验产品标准，采用以下步骤获得和培养MSC细胞：

(1)采集健康人的脐带、羊膜、胎盘、脂肪等组织，磷酸缓冲液(PBS)洗掉血管中的残留血液；

(2)分离并去除血管组织及血细胞；

(3)将剩余组织剪碎至约1～2mm²组织块，移至0.1％胶原酶Ⅱ中，37℃消化2h，2,500r/min离心10min；

(4)取下层沉淀再用0.25％胰蛋白酶消化20min，2,500r/min离心10min；

(5)弃上清，保留沉淀，用PBS吹打成悬液，用100μm滤网过滤，2,000r/min离心10min，获得单细胞；

(6)PBS洗涤2次，以20,000/cm²的细胞密度接种于添加5％浓度人血小板裂解物的MSC无血清培养基中，置于37℃，5％CO₂饱和湿度环境下培养；

(7)培养2天后除去未贴壁细胞，更换新鲜培养基，每3～4天换新鲜培养基，当细胞生长至约80％融合时，按3,000/cm²的密度进行传代，采用代数为3～10代的MSC工作细胞株生产MSC培养上清。

实施例2：亚低温培养以降低MSC培养上清中的炎性因子

(1)取实施例1步骤(7)中获得的MSC工作细胞株，按3,000/cm²的密度接种于含有血小板裂解物新鲜培养基，置于37℃，5％CO₂饱和湿度环境下培养3～4天，当细胞生长至约80％融合时；

(2)以台盼蓝法测定细胞活率，确认细胞活率大于90％；

(3)将MSC细胞培养皿转移至30～32℃，5％CO₂饱和湿度环境下继续培养6-8h；

(4)以台盼蓝法测定细胞活率，确认细胞活率大于90％；

(5)吸取MSC细胞培养上清物质，进入下一步操作，并留样以ELISA法检测培养上清中炎症因子的表达水平；

(6)以机械刮削法收货MSC细胞，进入细胞传代；

(7)将收集所得的MSC培养上清液于4℃下，5000rpm离心8min去除细胞碎片，MSC离心上清液于-20℃下保存或直接进行下一步操作。

实施例1和2试验结果如表1和图1所示。

表1不同培养条件下间充质干细胞活率及表型检测结果表

实施例3：亚低温培养后MSC上清液的粗分离过滤

(1)将实施例2步骤(7)MSC离心上清液融化汇总；

(2)以40mL/管分装于50mL的离心管中，于4℃下，分别以3500rpm离心15min、4000rpm离心10min、5000rpm离心8min，去除蛋白絮凝；

(4)离心上清液用0.22um滤器过滤；

(5)过滤后上清液按15mL/管分装于50mL截留分子量10KD的超滤管中；

(6)于4℃下2500r/min离心15min；

(7)离心后合并各管上清浓缩液，此为MSC分泌提取物脱敏粗产品。

实施例4：P2X7R-NLRP3(ATP)小分子激动剂的去除

(1)将实施例3获得MSC分泌提取物脱敏粗产品按15mL/管分装于50mL截留分子量3KD的超滤管中；

(2)于4℃下，3800r/min离心30min，浓缩至终体积2mL；

(3)加入4℃预冷的静脉注射生理盐水(0.9％NaCl)，补充至终体积15mL；

(4)于4℃下，3800r/min离心30min，浓缩至终体积1.5-2.0mL；

(5)加入4℃预冷的静脉注射生理盐水(0.9％NaCl)，补充至终体积15mL；

(6)于4℃下，3800r/min离心30min，浓缩至终体积1.5-2.0mL；

(7)合并各管浓缩液。

实施例2、3、4的实验结果如图2、图3所示。

实施例5：终浓度调节以及蛋白稳定体系建立

(1)将实施例4步骤(7)获得的浓缩液，按10mL/管分装于离心管中；

(2)于4℃下，10000r/min离心20min，收集上清液，抛弃蛋白絮凝沉淀；

(3)测定所得的浓缩物的蛋白含量，用预冷的静脉注射生理盐水(0.9％NaCl)稀释浓缩液，调整蛋白总浓度为4mg/mL；

(4)按6％(v/v)的终浓度，添加Dextran40葡萄糖注射液于蛋白浓缩液中，建立蛋白稳定体系；

(5)0.22um滤膜除菌过滤，所得溶液为终产品，按2mL/支分装于西林瓶中；

(6)抽取样品进行质控。

实施例5的实验结果如下图4所示

实施例6：质量检测控制

(1)理化检测项目包括澄明度、颜色、pH值、重金属含量，具体的质量标准如下：

澄明度：澄清透明；

颜色：微黄；

pH：6-8；

重金属含量：符合国家药典静脉注射针剂标准；

渗透压：280-310mOsm。

(2)生化检测项目包括细菌、真菌、支原体、衣原体、浓度、内毒素，具体的质量标准如下：

细菌：阴性；

真菌：阴性；

支原体：阴性；

衣原体：阴性；

内毒素：小于0.25EU/ml；

浓度：4mg/mL。

实施例7：关节炎疼痛动物试验

参照此疼痛模型建立标准方法，在大鼠尾根部皮内注射福氏完全佐剂，注射2小时后局部皮肤炎性红肿，出现机械痛敏与热痛敏行为反应，在18h左右可达高峰，持续6天左右。此模型与人的类风湿性关节炎很相似。

在模型建立后的第18h注射实施例3至6制备的间充质干细胞分泌提取物，按照0.3mg/kg的剂量在炎症疼痛局部部位注射，对照组以注射用水比对，连续3天使用后观察效果。

以热板测痛仪测量每只小鼠的痛阈(即痛反应情况潜伏期，指小鼠触热板至舔后足的时间)，对照组的痛阈按100％计算，求出给药组的痛阈提高率，结果显示间充质干细胞提取因子显著降低福氏完全佐剂处理过动物的痛阈。

实施例8：糖尿病神经痛动物试验

用胰岛素缺乏的NOD(Non-obese diabetes，非肥胖糖尿病)大鼠诱导模型，在大鼠腹腔单次注射链佐霉素，其可损坏胰岛素分泌细胞，快速产生高血糖症状，可导致长时间的热和机械痛觉过敏以及冷热的痛觉异常。

在模型建立后的第3天注射实施例3至6制备的间充质干细胞分泌提取物，按照0.3mg/kg的剂量在胰腺炎症疼痛局部部位注射，对照组以注射用水比对，连续3天使用后观察效果。

以热板测痛仪测量每只小鼠的痛阈(即痛反应情况潜伏期,指小鼠触热板至舔后足的时间)，对照组的痛阈按100％计算，求出给药组的痛阈提高率，结果显示间充质干细胞提取因子显著降低糖尿病神经痛动物的痛阈。

实施例7、8的试验结果如表2所示。

表2间充质干细胞分泌提取物对不同类型疼痛动物模型的作用

以上所述仅是本发明的部分选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种间充质干细胞分泌提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

传代间充质干细胞制备：将体外分离获得的间充质干细胞以无血清培养基进行细胞培养，于37±0.5℃培养直至细胞生长至80±5%融合时进行传代培养，获得传代间充质干细胞；

间充质干细胞分泌提取物原液制备：将所述传代的间充质干细胞进行细胞培养，于37±0.5℃培养直至细胞生长至80±5%融合后，于30~32℃ 继续培养6~8h，获得细胞培养上清物质，将所述细胞培养上清物质离心去除细胞碎片，获得间充质干细胞分泌提取物原液；

间充质干细胞分泌提取物脱敏粗产品制备：将所述间充质干细胞分泌提取物原液用0.22μm滤器过滤，获得的滤液用截留分子量为10KD的超滤管离心，获得间充质干细胞分泌提取物脱敏粗产品；

小分子激动剂去除：将所述间充质干细胞分泌提取物脱敏粗产品用截留分子量为3KD的超滤管离心，获得间充质干细胞分泌提取物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述小分子激动剂去除步骤后，还包括以下步骤：

用生理盐水调节间充质干细胞分泌提取物的蛋白总浓度为4±0.1mg/mL，按体积比6%添加Dextran40葡萄糖注射液，获得间充质干细胞分泌提取物蛋白稳定体系。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中的过滤以及离心均在4±1℃条件下进行。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞分泌提取物原液制备步骤中，于30~32℃继续培养6~8h培养前和培养后，分别测定细胞活率确认细胞活率大于90%后进行下一步操作。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述无血清培养基为质量浓度为5~10%血小板裂解物生理盐水溶液。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞分泌提取物的间充质干细胞来源于人的脐带、羊膜、胎盘、牙髓、骨髓以及脂肪中的任意一种或几种。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，述间充质干细胞为第3~10代体外培养的传代间充质干细胞。

8.一种间充质干细胞分泌提取物，其特征在于，所述间充质干细胞分泌提取物由如权利要求1至7任意一项所述的制备方法制得。

9.一种如权利要求8所述的间充质干细胞分泌提取物的用途，其特征在于，所述间充质干细胞分泌提取物在制备抑制疼痛药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的间充质干细胞分泌提取物的用途，其特征在于，所述抑制疼痛药物的使用方式是肌肉注射。

11.根据权利要求9所述的间充质干细胞分泌提取物的用途，其特征在于，所述抑制疼痛药物中间充质干细胞分泌提取物的用量为0.3±0.05mg/kg。

Images