KR102456805B1 - 불멸화 개줄기세포 또는 이의 엑소좀풍부배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

불멸화 개줄기세포 또는 이의 엑소좀풍부배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 불멸화 개줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 개지방줄기세포(canine adipose-derived mesenchymal stem cells, cADMSC)를 HPV16의 E6 및 E7 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)로 처리하여 분화유도하여 얻은 불멸화 개줄기세포 (기탁번호: KCTC 14389BP), 상기 불멸화 개줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

불멸화 개줄기세포 또는 이의 엑소좀풍부배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating anti-inflammatory diseases comprising immortalized canine mesenchymal stem cells and their exosome-rich conditioned medium}
본 발명은 불멸화 개줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 개지방줄기세포(canine adipose-derived mesenchymal stem cells, cADMSC)를 HPV16의 E6 및 E7 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)로 처리하여 분화유도하여 얻은 불멸화 개줄기세포(immortalized canine adipose-derived mesenchymal stem cells: im-cADMSC, 기탁번호: KCTC 14389BP), 상기 불멸화 개줄기세포의 엑소좀풍부배양액(exosome-rich conditioned medium, ERCM)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
최근 피부질환이 도시인과 반려동물에서 크게 증가하고 있다. 즉, 감염성 피부질환은 물론, 미세먼지 등의 환경오염과 건조한 기후, 꽃가루, 집안의 카펫에 서식하는 진드기 등등 직접적으로 접촉성 피부질환을 유발하는 원인 뿐만 아니라 면역과민반응을 유발하는 다양한 알러젠에 노출되는 기회가 점차 커지고 있다. 특히 반려동물은 외부에서 흙이나 잔디밭에서 뒹굴기도 하고, 서로 싸우기도 하며, 쓰레기통 등 환경오염물질에 노출될 기회가 많아 피부염 발생이 빈번하다. 더욱이 반려동물 중 개는 수명이 10~15년으로 10세 이상에서는 감염병, 피부염, 관절염, 호흡기질병 등 염증성 질환으로 고통받게 된다.
관절염은 퇴행성 골관절염(osteoarthritis, OA)과 염증성 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)으로 구별된다. 골관절염은 나이가 들어감에 따라 하중에 의해 관절연골이 퇴행성으로 마모되면서 ebernated bone surfaces가 부딪히면서 통증을 유발하고, 골두가 옆으로 자라 osteophytes가 형성되어 운동장애를 유발한다. 이에 비해 류마티스 관절염은 관절강 내로 neutrophils, macrophages, lymphocytes, dendritic cells, plasma cells 등의 염증세포가 침윤되면서 염증성 synovial membranes이 증식하여 pannus를 형성함으로써 심하게 붓고 통증이 유발되며, 관절골두의 변형 및 유합으로 운동장애를 유발한다. 이러한 염증반응은 관절 이외에도 여러 장기를 침범하는 전신성 만성 염증성 질환으로 확대되기도 한다. 류마티스 관절염의 원인은 아직 명확히 밝혀지지는 않았으나 현재는 자가면역 질환의 일종으로 유전적 및 환경적 요인에 의한 면역세포의 편향된 분화가 그 원인인 것으로 보고되고 있다. 즉, CD4+ T helper cells (Th1) 등의 활성화로 collagen과 같은 관절강 내의 proteins에 대한 자가항체가 형성되면 interferon-γ (IFN-γ), interleukin-2 (IL-2), complements 등의 chamoattraction에 의해 macrophages가 동원되며, macrophages에서 분비되는 tumor-necrosis factor-α (TNF-α)에 의해 다양한 세포로부터 cytokines이 분비됨에 따라 nitric oxide synthase (NOS)와 cyclooxygenase-II (COX-II)가 활성화되어 염증반응이 극대화된다.
따라서 아토피 피부염이나 류마티스 관절염 치료를 위해 NOS 억제제인 스테로이드(corticosteroids)와 COX-II 억제제인 비스테로이드성 소염제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)가 널리 사용되고 있다. 하지만 스테로이드는 장기간 사용 시 효과가 떨어지고 면역기능을 억제하는 심각한 부작용을 유발할 수 있으며, 비스테로이드성 소염제는 일시적인 통증과 염증을 완화시켜 주지만 근본적인 치료에는 한계가 있고 위궤양 등 2차적인 부작용을 야기한다.
한편, 최근에는 줄기세포(stem cells)가 면역조절 기전을 통해 다양한 피부염 및 관절염 등을 효과적으로 개선시켜 주는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 제대혈줄기세포(umbilical cord blood stem cells, UCBSC)를 피하로 주사하면 장기간 아토피 피부염의 재발을 방지할 수 있고, 지방줄기세포(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSC)를 관절강이나 혈관 내로 주사하면 관절염을 효과적으로 치료할 수 있고, 신경줄기세포(neural stem cells, NSC)를 혈관 내로 주사했을 때 말초 면역계를 조절함으로써 다발성경화증을 회복시켜 주는 것으로 밝혀졌다. 하지만 줄기세포를 효율적으로 사용하려면, 환자로부터 반복적으로 채취하여 충분한 숫자로 증식배양해야 하는 어려움이 있다. 따라서 한 번 채취한 줄기세포를 불멸화하여 계속 사용할 수 있는 줄기세포주(stem cell line)를 확립할 경우, ① 반복적으로 채취할 때의 환자의 고통을 줄여 줄 수 있고, ② 줄기세포 시술비용이 크게 감소하며, ③ 줄기세포의 특성이 지속적으로 유지되어 동일한 효과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, ④ 나이 많은 환자로부터 얻은 줄기세포의 활력/증식능 저하 문제를 해결할 수 있다.
세포 이식에 사용되는 줄기세포는 크게 배아줄기세포와 성체줄기세포로 구분된다. 배아줄기세포는 inner cell mass에서 기원하며 체내의 모든 세포로 분화할 수 있지만 종양으로 발전할 수 있어서 아직 치료제로 사용하기에는 기술적으로 풀어야 할 문제가 많이 남아 있다. 반면, 성체줄기세포는 성숙한 개체에서 얻을 수 있으며, 종양발생 위험이 없이 활용할 수 있는 장점이 있다. 성체줄기세포는 골수, 제대혈, 지방조직 등에서 얻을 수 있는데, 골수줄기세포는 채취할 때 고통이 따르며, 제대혈줄기세포는 출산 시에만 채취할 수 있는데 동물이 가정에서 출산할 때는 미생물 오염이 심하여 동물병원에서 출산할 때 무균 채취해야 한다. 이에 비해 지방줄기세포는 양이 많고, 동물병원에서 쉽게 무균 채취할 수 있다.
인간 또는 동물로부터 분리한 1차세포(primary cells)는 연속 배양할 때 계속 자라지 못하고 제한된 수의 분열을 한 후 성장이 정지하는데, 이를 in vitro 세포복제의 노화(replicative senescence)라 하며, 이 세포가 노화되지 않고 정상세포로 무한 증식할 수 있는 능력을 지니는 것을 불멸화세포(immortalized cells)라 한다. 따라서 본 발명은 한 번 채취로 계속 증식 배양하여 염증성 질환을 치료할 수 있는 불멸화 개줄기세포를 확립하고, 더 나아가 줄기세포로부터 유효성분인 기능물질을 다량으로 함유한 엑소좀풍부배양액을 수득함으로써 대표적인 염증성 질환인 아토피 피부염과 류마티스 관절염 모델에서 그 효능을 확인하였다.
대한민국 등록특허 10-1740357
세포의 노화는 체내에서 일생 동안 진행되는 현상으로, 세포에 내재하는 노화프로그램에 의한 세포생리활성의 변화에 기인한다. 세포 불멸화의 방법으로는 크게 SV40, hTERT, HPV E6/E7, EBV, MycT58A, RasV12 및 p53 등의 유전자를 탑재하는 방법이 있으며, 이 방법들은 복제노화(replicative senescence)를 극복하고 성공적으로 세포분화를 무한히 영속하도록 유도한다. 세포 불멸화를 위한 일반적인 전략으로 simian virus 40 (SV40) T 항원을 이용하는 것인데, 최근 연구에서 SV40T 항원이 telomerase 활성을 유도할 수 있음이 보고되어 다양한 분야에서 손쉽게 불멸화를 유도할 수 있는 방법으로 인정받고 있다. 가장 최근에는 chromatin 말단소체(telomere)의 길이를 유지하도록 돕는 telomerase reverse transcription protein (TERT)이 정상세포의 불멸화 시 안정한 유전형질과 특정 표현형질 마커들을 유지하는 특성을 나타내는 등 방법론적으로 우수한 불멸화 전략으로 보고되었다. 하지만 상피세포와 같은 특정 세포에서 TERT의 과발현이 세포 불멸화를 유도하지 못하거나 세포사멸을 유도하는 등의 문제를 내포하고도 있어 일반적인 불멸화 방법으로는 제한성이 있다. 그럼에도 불구하고 TERT 과발현이 줄기세포(특히, mesenchymal stem cells, MSC)에서 그 줄기세포의 특성을 증가시킨다는 보고가 있어 전략적인 불멸화 방법으로 고려할 수 있다.
본 발명자들은 이와 같이 전반적인 기술고찰을 통해 human papillomavirus (HPV)의 E6/E7이 각각 hTERT의 프로모터 활성화와 telomerase 활성화를 도와 안정적인 세포의 불멸화를 성공적으로 유도할 전략으로 판단되었다. 아울러 본 발명에서는 형질전환 벡터(transfection vector)에 저항성을 띠는 특징을 감안하여 불멸화 성공률을 높이는 방법으로 viral vector (retroviral 및 lentiviral) systems을 도입하였다. Retroviral vector는 분열하는 세포에서 효과적으로 불멸화 유도가 가능하며, 이는 retroviral vector가 능동적으로 핵막을 통과할 수는 없지만, 세포가 분열하는 동안 나타나는 핵막의 disintegration 과정에서 viral DNA가 유전체로 들어가 integration됨으로써 가능한 방법으로 안정적인 불멸화가 가능하다. 반면, lentiviral vector는 HIV genome인 복합구조로 구성되어 있는데, retrovirus가 가지는 기본유전자(env, gag, pol) 이외에 조절유전자(tat, rev)와 보조유전자(vpr, vif, vpu, nef)를 더 가지고 있어 핵막을 능동적으로 통과하여 분열세포 및 비분열세포의 불멸화에 사용될 수 있다. 이는 HIV 유전자 중 vpr 유전자, gag 유전자와 integrase 효소에 의해 만들어지는 이입 전 복합물질이 대상 세포의 핵막을 직접 통과할 수 있는 장점이 중요한 전략이 될 수 있으며, 이런 이유로 유전자 도입의 방법으로 in vitro 및 in vivo 모두에서 각광받는 viral vector에 속한다. 숙주세포로의 유전자 전달을 위해 필요한 바이러스 입자들은 3가지 plasmids 즉, 전달하고자 하는 유전자가 재조합된 바이러스 vector, 재조합 바이러스 생산에 필요한 단백질 plasmids (예, gag, pol, tat, rev, nef, vpr, vpu and vif)를 포함하는 packaging plasmid, 그리고 피막(vesicular stomatitis virus G: VSV-G) 단백질 plasmid에 의한 일시적 transduction에 의해 보통 3×106 IU/mL 정도의 재조합 바이러스 입자를 얻을 수 있다.
따라서 본 발명에서는 줄기세포의 불멸화 전략으로 분열세포와 비분열세포 모두에 감염시킬 수 있는 능률을 가진 lentiviral vector를 활용하여 세포복제노화(replicative senescence)를 억제함으로써 불멸화세포시스템을 구축하고자 하였다. HPV의 E7 단백질은 기능·구조적으로 adenoviurs의 E1A 단백질과 유사하며 일부 유형의 세포를 불멸화하는 데에도 사용된다. E7 단백질은 그 자체로 epithelial cells을 불멸화시킬 수 있지만, E6 및 E7의 발현은 형질전환효율을 증가시킨다. 불멸화 유도를 위해 Accession No. NC_001526.2 정보를 탑재한 Lenti-HPV-16 E6/E7 particles (도 1)을 적용하였으며, 각 과정은 각 시약의 제조사 지침에 따라 수행하였다. 상기 과정에 따라 제조된 불멸화 개줄기세포를 기탁번호: KCTC 14389BP 하에 기탁하였다.
상기 준비한 불멸화 개줄기세포(1x106 cells/mL)를 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에 접종하고 5% 이산화탄소(CO2) 공급 배양기에서 37℃의 온도로 24시간 동안 배양하였다. 이후 줄기세포로부터 엑소좀이 풍부하게 함유된 배양액(ERCM)을 수득하기 위해 상기 배양 배지에 TNF-α를 50 ng/mL의 농도로 첨가하고 산소(O2) 농도를 3%로 낮춘 후, 24시간 동안 배양한 다음, 배양액을 채취하여 필터로 거른 후 저온에서 10배 농축하여 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀풍부배양액을 수득하였다. 한편, 비교 예로써, 불멸화 줄기세포로부터 엑소좀이 함유된 배양액을 수득하는 과정에서, TNF-α를 처리하지 않고 산소 농도를 21%로 유지한 채 정상상태로 배양한 줄기세포 정상배양액(CM)을 수득하였다.
그 결과, 본 발명에 따른 불멸화 개줄기세포 및 이의 배양액의 경우 Compound-48/80로 인한 전신성 쇼크, 가려움증, 혈액 내 히스타민 억제 효과 및 피부염 억제 효과 뿐만 아니라, Collagen-II로 인한 류마티스 관절염 억제 효과가 우수함이 확인되었으며, 특히 불멸화 개줄기세포를 함유한 배양액에 TNF-α를 처리하고, 1~5%의 저산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하여 수득한 불멸화 개줄기세포 엑소좀 풍부 배양액의 경우, TNF-α의 처리 없이 정상상태로 배양한 배양액에 비해서 더욱 우수한 피부염 및 관절염 치료 효과가 있는 것으로 나타났다.
본 발명은 항염증 활성을 갖는 개지방줄기세포(canine adipose-derived mesenchymal stem cells, cADMSC)를 HPV16의 E6 및 E7 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)로 처리하여 분화유도하여 얻은 불멸화 개줄기세포(기탁번호: KCTC 14389BP)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 불멸화 개줄기세포(기탁번호: KCTC 14389BP) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 불멸화 개줄기세포 엑소좀 풍부 배양액의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “줄기세포”는 특정 세포로 분화가 진행되지 않은 세포로서, 필요한 경우, 신경, 피부, 혈액, 근육, 골, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “엑소좀(exosomes)”은 정교한 RNA 및 단백질 운반물질이 들어있는 작은 크기(30~150 nm)의 소포로, 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "염증성 질환(Inflammatory diseases)"은 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α (tumor necrosis factor-α), IL-1 (interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘 (prostagladins), 루코트리엔(leucotrienes) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료“는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하는데, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적으로 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 본 발명의 목적상 상기 치료는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 포함하는 것으로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "완화"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 질환이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명은 개지방줄기세포(canine adipose-derived mesenchymal stem cells, cADMSC)를 Lenti-HPV-16 E6/E7 플랫폼을 이용하여 불멸화함으로써 지속적인 증식배양을 통해 반복적인 줄기세포 채취 없이 동일 특성 및 효능을 가진 불멸화 개줄기세포주(DC-immortalized canine adipose-derived mesenchymal stem cells, DC-im-cADMSC)를 확립하였다. 본 발명은 또한 상기 불멸화 개줄기세포, 상기 불멸화 개줄기세포의 배양액, 특히 상기 불멸화 개줄기세포로부터 수득한 다량의 엑소좀이 함유된 엑소좀풍부배양액을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물이 피부염 및 관절염에 우수한 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 염증 치료제로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 줄기세포 불멸화 플랫폼 Lenti-HPV-16 E6/E7 시스템을 나타낸다.
도 2는 줄기세포를 불멸화하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 줄기세포가 불멸화되었음을 RT-PCR 유전자 분석과 ICC 단백질 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 정상산소농도와 저산소농도에서 배양한 후의 정상(비불멸화) 줄기세포와 불멸화 줄기세포의 생존율 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 정상배양액(CM)과 엑소좀풍부배양액(ERCM) 내 엑소좀 함량을 CD9 지표에 대한 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 개지방줄기세포와 줄기세포 배양액이 Compound-48/80으로 인한 가려움증을 억제함을 나타내는 그래프이다.
도 7은 개지방줄기세포와 줄기세포 배양액이 Compound-48/80으로 인한 혈액 내 히스타민을 억제함을 나타내는 그래프이다.
도 8은 개지방줄기세포와 줄기세포 배양액이 Compound-48/80으로 인한 피부염을 억제함을 나타내는 그래프이다.
도 9는 개지방줄기세포와 줄기세포 배양액이 Collagen-II로 유발된 류마티스 관절염을 억제함을 나타내는 육안검사 점수이다.
도 10은 개지방줄기세포와 줄기세포 배양액이 Collagen-II로 유발된 류마티스 관절염을 억제함을 나타내는 조직검사 현미경사진이다.
도 11은 개지방줄기세포와 줄기세포 배양액이 Collagen-II로 유발된 류마티스 관절염을 억제함을 나타내는 조직검사 점수이다.
이하, 발명의 구체적인 구현예에 따른 불멸화 개줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 대하여 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 이는 발명의 하나의 예시로써 제시되는 것으로, 이에 의해 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니며, 발명의 권리범위 내에서 구현예에 대한 다양한 변형이 가능함은 당업자에게 자명하다.
본 명세서 전체에서 특별한 언급이 없는 한 "포함" 또는 "함유"라 함은 어떤 구성 요소(또는 구성 성분)를 별다른 제한 없이 포함함을 지칭하며, 다른 구성 요소(또는 구성 성분)의 부가를 제외하는 것으로 해석될 수 없다.
제1구현예에 따르면,
본 발명은 항염증 활성을 갖는 개지방줄기세포(canine adipose-derived mesenchymal stem cells, cADMSC)를 HPV16의 E6 및 E7 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)로 처리하여 분화유도하여 얻은 불멸화 개줄기세포(기탁번호: KCTC 14389BP)를 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 불멸화 개줄기세포(기탁번호: KCTC 14389BP)에 있어서, 상기 불멸화 개줄기세포는 피부염 또는 류마티스 관절염 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 불멸화 개줄기세포는 Compound-48/80로 인한 전신성 쇼크, 가려움증, 혈액 내 히스타민 억제 효과, 피부염 억제 효과, Collagen-II로 인한 류마티스 관절염 억제 효과를 가질 수 있다.
제2구현예에 따르면,
본 발명은 불멸화 개줄기세포(기탁번호: KCTC 14389BP) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 배양액은 불멸화 줄기세포를 함유한 배양액에 TNF-α를 처리하고, 1~5%의 저산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하여 수득하여 엑소좀이 풍부한 것을 특징으로 한다. 바람직하기는, 상기 배양액은 불멸화 줄기세포를 함유한 배양액에 TNF-α를 처리하고, 3%의 저산소농도 조건 하에서 24시간 배양하여 수득하여 엑소좀이 풍부할 수 있다. 상기 TNF-α는 3 내지 100 ng/mL의 농도로 처리될 수 있다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 염증성 질환은 아토피성 피부염, 뇌염, 염증성 장염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐혈병성 쇼크증, 폐섬유증, 미분화 척추관절증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증질환, 대장염, 염증성 장질환, 1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 반응성 관절염(Reactive Arthritis), 골관절염, 건선, 공피증, 골다공증, 아테롬성 동맥경화증, 심근염, 심내막염, 심낭염, 낭성 섬유증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 나병, 매독, 라임 질환(Lyme), 보렐리아증(Borreliosis), 신경성-보렐리아증, 결핵, 사르코이드증(Sarcoidosis), 낭창, 원판성 낭창, 동창성 루프스, 루프스 신염, 전신성 홍반성 루프스, 황반변성, 포도막염, 과민대장 증후군, 크로씨병, 쇼그랜 증후군, 섬유근통, 만성피로 증후군, 만성피로 면역부전 증후군, 근육통성 뇌척수염, 근위축성 측삭경화증, 파킨스병 및 다발경화증로 이루어진 군으로부터 하나 또는 그 이상 선택되는 것을 특징으로 한다. 바람직하기는, 상기 염증성 질환은 아토피성 피부염 또는 류마티스 관절염일 수 있다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 Compound-48/80로 인한 전신성 쇼크, 가려움증, 혈액 내 히스타민 억제 효과, 피부염 억제 효과, Collagen-II로 인한 류마티스 관절염 억제 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사 용액의 형태 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 약제학적으로 유효한 양은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 줄기세포는 개체당 1천~2억 세포, 엑소좀풍부배양액은 체중 ㎏당 1 내지 50 mg을 매일 또는 격일로 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
제3구현예에 따르면,
본 발명은 불멸화 개줄기세포(기탁번호: KCTC 14389BP) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 완화용 식품 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 완화용 식품 조성물에 있어서, 상기 배양액은 불멸화 줄기세포를 함유한 배양액에 TNF-α를 처리하고, 1~5%의 저산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하여 수득하여 엑소좀이 풍부한 것을 특징으로 한다. 바람직하기는, 상기 배양액은 불멸화 줄기세포를 함유한 배양액에 TNF-α를 처리하고, 3%의 저산소농도 조건 하에서 24시간 배양하여 수득하여 엑소좀이 풍부할 수 있다. 상기 TNF-α는 3 내지 100 ng/mL의 농도로 처리될 수 있다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은 Compound-48/80로 인한 전신성 쇼크, 가려움증, 혈액 내 히스타민 억제 효과, 피부염 억제 효과, Collagen-II로 인한 류마티스 관절염 억제, 개선 또는 완화 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 완화용 식품 조성물은 상기 유효 성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 염증성 질환의 예방 또는 완화용 식품 조성물은 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다. 이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.
제4구현예에 따르면,
A) 개지방줄기세포(canine adipose-derived mesenchymal stem cells, cADMSC)를 HPV16의 E6 및 E7 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)로 처리하여 분화유도하여 불멸화 개줄기세포를 얻는 단계;
B) 상기 불멸화 개줄기세포를 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 접종하여 5%의 이산화탄소 공급 배양기에서 배양하는 단계; 및
C) 상기 배양 배지에 TNF-α를 첨가하고 TNF-α를 처리하고 1~5%의 저산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하는 단계를 포함하는 불멸화 개줄기세포 엑소좀풍부배양액의 제조 방법을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 불멸화 개줄기세포 엑소좀 풍부 배양액의 제조 방법에 있어서, 상기 불멸화 개줄기세포는 기탁번호: KCTC 14389BP인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 불멸화 개줄기세포 엑소좀 풍부 배양액의 제조 방법에 있어서, 상기 TNF-α는 3 내지 100 ng/mL의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 불멸화 개줄기세포 엑소좀풍부배양액의 제조 방법에 있어서, 상기 불멸화 개줄기세포 엑소좀풍부배양액은 피부염 또는 류마티스 관절염 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 불멸화 개줄기세포 엑소좀 풍부 배양액은 Compound-48/80로 인한 전신성 쇼크, 가려움증, 혈액 내 히스타민 억제 효과, 피부염 억제 효과, Collagen-II로 인한 류마티스 관절염 억제 효과를 가질 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1. 줄기세포 불멸화
(1) 줄기세포 불멸화 과정
나이 2살의 건강한 수컷 포메라이언종 개로부터 지방조직을 채취하고, 이미 참고문헌에 제시된 방법에 따라 지방줄기세포를 분리, 배양하였다. 불멸화하기 위한 세포는 60 mm2 culture dish에 70%가 되도록 준비한 후 1 mL culture medium, 2 mL pLenti-III-HPV-16 E6/E7 particle (Abm), 그리고 5 μg/mL polybrene (Sigma-Aldrich)을 혼합하여 8시간 배양한 후 같은 medium 혼합액으로 교체 후 3일 동안 배양하였다(도 2). 그 다음, culture medium으로 교체하여 불멸화된 세포를 관찰하면서 불멸화 특징 시 나타나는 유전자 발현(표 1)과 단백질 생산을 각각 RT-PCR과 면역세포화학염색(immunocytochemistry, ICC) (표 2)으로 확인하였다.
표 1: 줄기세포 불멸화를 확인하기 위한 유전자 분석 reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) primers 목록
Gene Primer Sequence Accession No.
HPV-16 E6/E7 5’ primer 5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG NC_001526.2
3’ primer 5’-TAGTCAGCCATGGGGCGGAGA
HPV-16 E6/E7
(NO selection)		 5’ primer 5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
3’ primer 5’-GAAAGCCATACGGGAAGCAATAG
Canine β-actin 5’ primer 5’-GAGCTACGAACTACCCGACG AF021873.2
3’ primer 5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC
표 2: 줄기세포 불멸화를 확인하기 위한 단백질 분석 immunocytochemistry (ICC) 항체 목록
Gene Anti-body Species Catalog No.
HPV-16 E6 1 Ab’ Mouse monoclonal antibody SC-460
2 Ab’ Anti-mouse IgG (H+L), F(ab’)2
Alexa Fluor 555 conjugate		 4409S
HPV-16 E7 1 Ab’ Mouse monoclonal antibody SC-264
2 Ab’ Anti-mouse IgG (H+L), F(ab’)2
Alexa Fluor 555 conjugate		 4409S
(2) RT-PCR을 이용한 줄기세포 불멸화 확인
불멸화 후 최소 일주일 정도 배양하여 일정 부분의 세포를 분리하여 Trizol (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)로 total RNA를 추출하였다. 2 μg의 total RNA를 대상으로 Oligo dT primer와 TOP scriptTM Reverse Transcriptase (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 사용한 역전사반응을 통해 PCR의 주형으로 사용할 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 이용하여 RT-PCR을 진행하였으며, RT-PCR master mix는 10 μL 2X enzyme Mastermix, 7 μL RNase-free water, 각각 1 μL primer (각 10 pmole), 그리고 1 μL cDNA로 조성하였다. PCR 프로그램은 95℃에서 10분, denature 95℃에서 15초, annealing 67.4℃에서 15초, 그리고 extension 72℃에서 10초이며 35 cycles로 진행하였다. 유전자의 발현 정도는 β-actin primer를 standard로 하여 유전자의 발현량을 확인하였으며, primers는 Gene bank와 시약에 기재되어 있는 정보를 바탕으로 제작되었다.
(3) ICC를 이용한 줄기세포 불멸화 확인
세포를 4-well chamber slide에 seeding하고 세포가 안정화될 때까지 37℃, 5% CO2로 조정된 배양기에서 배양하였다. 안정화 이후 30분간 4% paraformaldehyde으로 fixation, 20분간 0.25% Trixon-X 100으로 permeabilization하였다. Slide를 1% bovine serum albumin (BSA)으로 2시간 동안 blocking 한 후 primary antibody를 4℃에서 overnight 반응하였다. 다음 과정으로 형광발색단이 결합된 secondary antibody를 적용하였으며, 핵 염색을 위한 counter staining을 수행하였다. 모든 과정 사이에 phosphate buffered saline (PBS)를 이용해 3회씩 washing해 주었으며, 최종적으로 slide를 형광현미경(Eclipse Ti-S, Nikon, Tokyo, Japan)에서 600배의 배율로 관찰하였다.
(4) 줄기세포 불멸화 확인 결과
줄기세포 불멸화 여부를 확인하고자, primary cells (대조군)과 함께 세포의 모양(morphology)를 비교하고, pLenti-III-HPV-16 E6/E7 particles 삽입으로 인한 HPV 유전자 발현을 RT-PCR로 분석하였으며, ICC를 통해 HPV 항체로 단백질 생산을 확인하였다. 불멸화된 개지방줄기세포는 배양과정에서 약간의 morphology 변화가 관찰되었다. 즉, 불멸화 세포에서 primary cells에 비해 세포의 길이가 약간 짧아졌으며(도 3A), doubling time 주기가 감소하여 세포의 성장속도가 빨라진 것으로 확인되었다. 유전자 발현은 불멸화된 세포에서 HPV 유전자가 과발현된 것이 확인되었으며(도 3B), 단백질 생산 역시 도 3C의 노란색 화살표를 따라 세포 핵 내 HPV 과발현으로 인해 primary cells에 비해 형광 발색이 강하게 나타나 불멸화가 성공적으로 이루어졌음이 검증되었다.
또한, 정상(비불멸화) 개줄기세포(cADMSC)와 불멸화 개줄기세포(im-cADMSC)를 정상의 산소농도(20%)와 저산소농도(3%)에서 2일 동안 배양하면서 생존율 변화를 측정한 결과, 비불멸화 줄기세포는 정상 산소농도에서 2일만에 2배 가까이(188%) 증식했지만 저산소농도에서는 대부분 사멸하여(17%) 저산소 환경에서 생존하지 못하는 것으로 확인되었다 (도 4). 이에 비해 불멸화 줄기세포는 정상 산소농도에서 2일 만에 2배 이상(225%) 증식하여 정상세포보다 빠른 증식율을 나타냈으며, 저산소 농도에서도 152%의 증식능을 나타내 저산소 환경에 저항성을 보이는 것으로 확인되었다.
(5) 줄기세포 엑소좀 함량 분석 결과
불멸화 줄기세포를 산소농도 21%에서 배양한 정상배양액(CM)과 TNF-α 처리 후 산소농도 3%에서 저산소배양한 엑소좀풍부배양액(ERCM)의 엑소좀 함량을 CD9에 대한 RT-PCR로 분석한 결과, ERCM에서 CM에 비해 50배 이상의 CD9 지표가 검출되어 ERCM 내 고농도 엑소좀 함유가 확인되었다.
실시예 2. 줄기세포의 아토피 피부염 치료효능
(1) 줄기세포의 전신성 쇼크반응 억제효과
Mast cells로부터 histamine을 유리시켜 알러지반응을 유도하는 Compound-48/80으로 인한 급성 전신성 쇼크반응(active systemic anaphylaxis, ASA)에 대한 개줄기세포의 방어효과를 평가하였다. 용량별 (1x104~1x105 cells) 정상(비불멸화) 개줄기세포, 불멸화 개줄기세포, 100 μL의 정상배양액 또는 엑소좀풍부배양액을 마우스의 복강 내로 주사하고, 30분 후 치사량의 Compound 48/80 (8 mg/5 mL/kg)을 복강 내 주사하였다. 이후 60분간 동물의 사망률을 검사하였다.
시험 결과, 8 mg/kg의 Compound-48/80만을 투여한 대조군에서는 100%의 동물이 사망한 반면, 1x104 cells, 3x104 cells 및 1x104 cells의 정상(비불멸화) 줄기세포(cADMSC)를 미리 투여한 군에서는 각각 70%, 30% 및 10%의 동물만이 사망하여 우수한 알러지 쇼크반응 억제효과를 나타냈다(표 3). 이에 비해, 1x104 cells, 3x104 cells 및 1x104 cells의 불멸화 줄기세포(im-cADMSC)를 미리 투여한 군에서는 각각 50%, 10% 및 0%의 동물만이 사망하여 정상 줄기세포보다 더 우수한 알러지 쇼크반응 억제효과를 보여 주었다. 더 나아가 줄기세포 대신 줄기세포 배양액을 투여했을 때에도 쇼크반응 억제효과를 보여주었는바, 100 μL의 정상배양액(CM) 투여군에서는 30%, 엑소좀풍부배양액 투여군에서는 10%의 동물이 사망하여 ERCM의 우수한 효능이 확인되었다.
표 3: 개지방줄기세포와 줄기세포 배양액이 Compound-48/80으로 인한 전신성 쇼크반응 (사망) 결과
투여군(용량) Compound-48/80 (용량) 사망률(%)
대조군 - 8 mg/kg 10/10 (100)
정상 (비불멸화)
개줄기세포
(cADMSC)		 1x104cells 8 mg/kg 7/10 (70)
3x104cells 8 mg/kg 3/10 (30)
1x105cells 8 mg/kg 1/10 (10)
불멸화 개줄기세포
(im-cADMSC)		 1x104cells 8 mg/kg 5/10 (50)
3x104cells 8 mg/kg 1/10 (10)
1x105cells 8 mg/kg 0/10 (0)
정상배양액(CM) 100 μL 8 mg/kg 3/10 (30)
엑소좀풍부배양액(ERCM) 100 μL 8 mg/kg 1/10 (10)
(2) 줄기세포의 아토피 피부염(가려움증) 억제효과
Mast cells로부터 histamine을 유리시켜 알러지반응을 유도하는 Compound-48/80으로 인한 급성 피부 알러지반응인 가려움증에 대한 개줄기세포의 방어효과를 평가하였다. 3x104 cells의 정상(비불멸화) 개줄기세포(cADMSC), 불멸화 개줄기세포(im-cADMSC), 100 μL의 정상배양액 또는 엑소좀풍부배양액을 Compound-48/80 (50 μg/50 μL/site)과 혼합한 후 마우스의 피하로 주사하고, 30분간 긁는 횟수(scratching behaviors)를 기록하였다.
시험 결과, 50 μg/50 μL/site의 Compound-48/80만을 투여한 대조군에서는 30분 동안 78회의 가려움증(긁는 횟수)을 나타낸 데 비해, 3x104 cells의 정상(비불멸화) 줄기세포를 혼합 투여한 군에서는 44회, 3x104 cells의 불멸화 줄기세포를 혼합 투여한 군에서는 28회의 긁는 횟수를 보여 불멸화 줄기세포가 정상 줄기세포보다 우수하였다(도 6). 더 나아가 줄기세포 대신 줄기세포 배양액을 투여했을 때에도 가려움증이 완화되었는 바, 100 μL의 정상배양액(CM) 투여군에서는 48회, 엑소좀풍부배양액(ERCM) 투여군에서는 33회의 긁는 횟수를 보여 ERCM이 CM보다 우수하였다.
(3) 줄기세포의 아토피 피부염 (blood histamine) 억제효과
더 나아가 동물의 혈액을 채취하여 혈청 histamine 농도를 측정한 결과, 정상동물의 혈액 내 histamine 농도는 3.2 ng/mL였지만, Compound-48/80만을 주사한 동물의 혈액 histamine 농도는 8.8 ng/mL로 크게 증가하였다(도 7). 이에 비해, 정상 줄기세포를 혼합 투여한 군에서는 5.3 ng/mL, 불멸화 줄기세포를 혼합 투여한 군에서는 2.9 ng/mL의 histamine 농도를 나타내 불멸화 줄기세포가 정상 줄기세포보다 우수한 histamine 감소효과를 보여 주었다. 더 나아가 줄기세포 대신 줄기세포 배양액을 투여했을 때에도 histamine 농도가 감소하였는 바, 100 μL의 정상배양액(CM) 투여군에서는 6.1 ng/mL로, 엑소좀풍부배양액 (ERCM) 투여군에서는 3.7 ng/mL로 낮아져 ERCM이 CM보다 우수하였다.
(4) 줄기세포의 아토피 피부염(dermatitis score) 억제효과
또한, 동물의 피부조직을 채취하여 조직슬라이드를 제작하여 피부병변을 점수화(scoring)한 결과, 정상동물 (5.0점 만점에 0.2점)에 비해 Compound-48/80으로 아토피 피부염을 유발한 동물에서는 3.8점으로 심한 피부변병을 나타냈다(도 8). 이에 비해, 정상 줄기세포를 혼합 투여한 군에서는 2.6점으로, 불멸화 줄기세포를 혼합 투여한 군에서는 1.4점으로 피부병변이 크게 완화되어 불멸화 줄기세포가 정상 줄기세포보다 우수한 피부염증 감소효과를 보여 주었다. 더 나아가 줄기세포 대신 줄기세포 배양액을 투여했을 때에도 피부병변이 효과적으로 완화되었는 바, 100 μL의 정상배양액(CM) 투여군에서는 3.0점으로, 엑소좀풍부배양액(ERCM) 투여군에서는 1.8점으로 낮아져 ERCM이 CM보다 우수하였다.
실시예 3. 줄기세포의 류마티스 관절염 치료효능
(1) 류마티스 관절염 유발 및 줄기세포 투여
9주령의 수컷 DBA 1J 마우스에 2차례에 걸쳐 bovine type II collagen (Collagen-II)를 투여하여 관절염을 유발하였다. 즉, 1차에 Collagen-II에 동량의 Freund's complete adjuvant (FCA)를 넣은 유화액 200 μL (200 μg)를 마우스 꼬리의 기저부에 피내로 투여하였다. 2차 boosting 투여는 1차 투여 21일 후 동일한 Collagen-II를 Freund's incomplete adjuvant (FIA) 현탁하여 100 μL (100 μg)를 1차 투여부위로부터 조금 떨어진 부위의 꼬리 기저부에 피내로 투여하였다.
Collagen-II의 2차 boosting 투여 다음 날 1x105 cells의 정상(비불멸화) 개줄기세포 (cADMSC), 불멸화 개줄기세포(im-cADMSC), 100 μL의 정상배양액(CM) 또는 엑소좀풍부배양액(ERCM)을 마우스의 복강 내로 주사하였다.
(2) 육안 관절염 증상(gross arthritis score) 억제효과
2차 Collagen-II boosting 투여일인 21일부터 2일 간격으로 45일째까지 육안관찰 및 촉진을 통해 염증의 발생여부 및 증상의 정도를 아래의 관절염 지수에 따라 점수화하여 기록하고, 사지의 scores를 합산하여 최고 score를 16점으로 하였다.
0점: 정상
1점: 발가락과 발목에 국한된 약한 부종 및 발적
2점: 발가락과 발목 이상으로 확대된 약한 부종 및 발적
3점: 발가락과 발목 이상으로 확대된 중등도의 부종 및 발적
4점: 전체 다리로 확장(또는 유합)된 심한 부종 및 발적
시험 결과, 육안적인 관절염 소견에서 21일째의 Collagen-II의 boosting 투여 2일 후인 23일째부터 관절의 부종이 확인되었으며, 이후 지속적으로 관절염 지수가 상승하여 1주일 후에는 평균 score 2.7 (최대 16.0), 2주일 후에는 약 4.2, 그리고 종료시점인 45일째에는 약 6.3에 도달하였다(도 9). 특히 35일경에 심한 발적 및 부종과 함께 관절의 변형 및 유합으로 ankylosis가 발생하는 동물이 발견되었다. 이에 비해, 정상 줄기세포를 투여한 군에서는 관절염 유발이 약 1주일간 유의하게 억제되었으며, 이후에도 전체적으로 20-30% 낮은 경향을 나타내었고, 최종 4.7에 이르렀다. 특히 불멸화 줄기세포를 투여했을 때는 관절염 지수가 크게 낮아졌는 바, Collagen II 투여 대조군에 비해 50-65% 억제되어 45일째에도 평균 score 2.8에 머물러 심한 부종 및 ankylosis를 보이는 동물은 발견되지 않았다. 더 나아가 줄기세포 대신 줄기세포 배양액을 투여했을 때에도 초기부터 관절염 증상이 상당히 완화되었는 바, 100 μL의 정상배양액(CM) 투여군에서는 45일째에 score 5.1, 엑소좀풍부배양액(ERCM) 투여군에서는 score 3.6로 낮아져 ERCM이 CM보다 우수하였다.
(3) 현미경 관찰 관절염(microscopic arthritic score) 억제효과
시험 45일째에 부검을 실시하였다. 부검 시 에테르로 흡입마취시켜 배대정맥으로부터 혈액을 채취하고, 뒷다리를 적출하였다. 적출한 다리를 10% 포르말린 용액에 1주일간 고정하였다. 고정한 발목 부위를 다시 1주일간 탈회한 후 조직슬라이드를 제작하고 hematoxylin & eosin (H&E)으로 염색하였다. 이렇게 제작된 슬라이드를 광학현미경으로 검경하여 조직병리학적 이상유무와 그 정도를 아래의 관절염 지수에 따라 점수화하였다.
0점: 이상없음
1점: 미약한 국소적 염증세포 침윤(<20%)
2점: 중등도의 염증세포 침윤(20-30%)
3점: 심한 염증세포 침윤(30-50%), 단 판누스(pannus)는 형성되지 않음
4점: 심한 염증세포 침윤(>50%), 단 판누수 형성
정상대조군의 관절은 관절강 내 및 주위조직에 염증반응이 전혀 없고, 관절의 골두 역시 매끈한 원형을 유지하고 있었다(도 10). 이에 비해 Collagen-II로 유발한 관절염에서는 관절강 내외에 심한 염증세포의 침윤과 함께 pannus 형성에 따른 관절 뼈의 변형 및 유합이 확인되었다. 이에 비해, 정상 줄기세포를 투여한 군에서는 관절 내외의 염증반응이 상당이 완화되었으며, 특히 관절골두의 변형이 거의 동반되지 않았다. 특히 불멸화 줄기세포를 투여했을 때는 일부 동물에서 국소적인 염증만이 관찰되었을 뿐 관절의 전체적인 구조가 온전히 보존되어 있었다. 더 나아가 줄기세포 대신 줄기세포 배양액을 투여했을 때에도 관절병변이 효과적으로 완화되었는 바, 100 μL의 정상배양액(CM) 투여군에서는 염증반응이 상당히 완화되었으며, 엑소좀풍부배양액(ERCM) 투여군에서는 병변이 거의 회복되어 ERCM이 CM보다 우수하였다
이러한 효과를 점수화했을 때, Collagen-II 유도 관절염 유발군에서는 평균 score 2.78 (최대 8.00)을 나타낸 데 비해, 정상 줄기세포 투여군에서는 score 1.11을 보여 주었다(도 11). 특히 불멸화 줄기세포 투여 시에는 염증과 관절변형이 크게 완화되어 score 0.44의 탁월한 효과를 발휘하였다. 더 나아가 정상배양액(CM) 투여군에서는 score 1.30으로, 엑소좀풍부배양액(ERCM) 투여군에서는 score 0.72으로 낮아져 ERCM이 CM보다 우수하였다
실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC14389BP
수탁일자 : 20201126

Claims (10)

  1. 개지방줄기세포(canine adipose-derived mesenchymal stem cells, cADMSC)를 HPV16의 E6 및 E7 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)로 처리하여 분화유도하여 얻은 불멸화 개줄기세포 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서,
    상기 염증성 질환은 전신성 쇼크반응, 아토피 피부염 또는 류마티스 관절염인 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 불멸화 개줄기세포는 기탁번호 KCTC 14389BP로 수탁된 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배양액은 불멸화 줄기세포를 함유한 배양액에 TNF-α를 처리하고, 1~5%의 저산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하여 수득하여 엑소좀이 풍부한 것을 특징으로 하는 것인, 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 TNF-α는 3 내지 100 ng/mL의 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는 것인, 약제학적 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. A) 개지방줄기세포(canine adipose-derived mesenchymal stem cells, cADMSC)를 HPV16의 E6 및 E7 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)로 처리하여 분화유도하여 불멸화 개줄기세포를 얻는 단계;
    B) 상기 불멸화 개줄기세포를 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 접종하여 5%의 이산화탄소 공급 배양기에서 배양하는 단계; 및
    C) 상기 배양 배지에 TNF-α를 첨가하고 1~5%의 저산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하는 단계를 포함하는 불멸화 개줄기세포 엑소좀 풍부 배양액의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서.
    상기 불멸화 개줄기세포는 기탁번호 KCTC 14389BP로 수탁된 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 TNF-α는 3 내지 100 ng/mL의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 불멸화 개줄기세포 엑소좀 풍부 배양액은 아토피성 피부염 및 류마티스 관절염 억제 효과가 우수한 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
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