CN111297899A - 一种脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎药物中的应用，所述新型冠状肺炎由2019‑nCoV冠状病毒引起的。本发明通过静脉注射人源脐带间充质干细胞悬液制剂用于治疗新型冠状肺炎，显著降低了重症或危重症患者体内的炎症因子水平，减轻了肺水肿，有效缓解了急性呼吸窘迫综合征，降低了病死率。

Description

一种脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎药物中的 应用

技术领域

本发明涉及新型冠状肺炎治疗药物领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞在制备治疗 新型冠状肺炎药物中的应用。

背景技术

2019-nCoV感染肺炎后一部分患者会发展为重症及危重症，目前对其发病机制尚不完 全清楚。一般认为，机体感染2019-nCoV后导致免疫功能失调，尤其是淋巴细胞和巨噬细胞被持续激活后分泌大量细胞因子以募集更多的免疫细胞聚集到肺部攻击被病毒感染的细胞，而被攻击的细胞死亡裂解产物又不断放大上述反应，从而引起细胞因子风暴综合征(CSS)，其临床特点是全身性炎症、高铁蛋白血症、血流动力学不稳定和以ARDS为 首的多器官功能衰竭(MOF)，最终危及生命。柳叶刀杂志曾报道2019-nCoV感染重症 肺炎有85％的患者出现呼窘迫，31％的患者出现急性心脏损伤，23％的患者出现急性肾损 伤，此部分病人IL-2、IL-7、IL-10、GSCF、IP10、MCP1、MIP1A和TNF-α较轻症病 人均明显增高，提示包括肺在内的急性损伤可能是由于强烈的炎性反应引起。此外，冠状 病毒引起的人类疾病主要是呼吸系统感染，通过人体细胞表面的血管紧张素转换酶2 (ACE2)受体进入人体细胞，ACE2主要表达于上皮细胞，包括肺上皮细胞、食道上皮、 复层上皮细胞、回肠、结肠的吸收性肠上皮细胞。病毒感染后表现为弥漫性的肺部损伤、 肺间隔内毛细血管扩张充血伴炎性细胞浸润、肺泡上皮大量脱落、肺间隔明显破坏、肺泡 腔内渗出物机化、肺间质内小动脉血管壁损伤等病理学特征，说明除了病毒本身的致病作 用外，机体的变态反应在其中扮演重要角色。因此，及时有效地进行免疫系统调节，避免 或控制细胞因子风暴的发生及其规模，是治疗2019-nCoV感染重症肺炎的关键。

糖皮质激素(GCS)是临床常用的抗炎药物，其基本机制是GCS与靶细胞浆内的GCS受体(G-R)相结合后可影响细胞因子、炎症介质及一氧化氮合成酶等生成而产生抗炎效应。但有研究表明GCS不但不能改善重症肺炎患者预后，还会增加二重感染的风险；此 外，GCS的诸多副作用也限制了其在重症肺炎治疗中的应用。由于目前临床上仍缺乏安全 有效的免疫调节药物，因此，探索新型特异的免疫调节药物对治疗2019-nCoV感染重症 肺炎非常必要。

间充质干细胞(MSCs)是一种具有自我更新和多向分化能力的成体干细胞，已在包括脂肪、脐带、胎盘以及牙髓组织等多种成体组织中分离得到。已有越来越多的研究证实了MSCs在体内体外的免疫调控作用以及对免疫活性细胞反应的调节作用。

T淋巴细胞在许多自身免疫疾病和炎症疾病的起始和发展中都起到了非常重要的作 用。因此人们广泛地研究MSCs对T淋巴细胞活化、增殖、分化的调节。其中就有研究指 出在混合淋巴细胞反应(MLR)或是受多克隆活化剂刺激后，人MSCs能抑制T淋巴细胞的增 殖。研究认为间充质干细胞是抑制了细胞分裂使细胞周期停留在G0/G1期，而并不是诱导细 胞凋亡，相反MSCs还能减少T淋巴细胞的凋亡，支持T淋巴细胞的存活，体现间充质干细 胞的免疫调节特性，而不是单纯的免疫抑制。研究发现MSCs有两种途径抑制T淋巴细胞 的增殖，一是通过细胞-细胞接触，另一种是分泌细胞因子。MSCs受到炎性因子，如INF- γ刺激后，细胞黏附分子(PD-L1，CD54)、血管细胞黏附分子(VCAM-1，即CD106)的表达 上调，这不仅促进了细胞-细胞的接触，同时促进了MSCs对T淋巴细胞的抑制。同时MSCs 还可分泌转化生长因子β1(TGF-β1)、吲哚胺2，3双加氧酶(IDO)、一氧化氮(NO)、白细胞介 素10(IL-10)、前列腺素E2(PGE2)、肝细胞生长因子(HGF)等作用于T细胞，抑制T细胞 的增殖和活性。

除抑制T淋巴细胞增殖和活性外，MSCs还能抑制B淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)及树突状细胞(DC)增殖和活性。B淋巴细胞是适应性免疫中另一种重要的 免疫细胞，主要负责体液免疫和产生抗体。有研究认为MSCs通过使细胞停留在G0/G1期来 抑制B淋巴细胞增殖，而不是诱导凋亡，同时与MSCs作用于T细胞的机制类似，MSCs能 减少B细胞产生IgG、IgM、IgA抗体，并且还能抑制B细胞表面趋化因子受体的表达，改变 B细胞的趋化特性。巨噬细胞是固有免疫反应中一类细胞，来源于单核细胞，它的功能也受到 MSCs的调节。巨噬细胞对微环境的反应表现出较高的可塑性，因此巨噬细胞可以分为两型： 促炎型巨噬细胞M1型和抗炎型巨噬细胞M2型。最近几年的研究发现MSCs能通过上调 的COX2分泌PGE2调节巨噬细胞，诱导M1型向M2型转化，以此加速损伤修复过程。此外 还能分泌TSG-6，和巨噬细胞表面的CD44结合，降低了TLR2/NFκB的信号，从而降低了炎 症反应。NK细胞是固有免疫的重要效应细胞，具有细胞溶解毒性，参与机体对感染和癌症的 防御。NK细胞通过分泌许多炎症因子，比如TNF-α和IFN-γ来实现它们的效应功能。MSCs 通过可溶性因子，如之前提到的IDO及PGE2等细胞因子抑制NK细胞增殖，通过细胞- 细胞接触抑制NK细胞毒性，同时还可减少NK细胞表面的活化标记，如NKp44、NKp30、 NKG2D和CD132。树突状细胞是机体最重要的抗原递呈细胞。DC细胞主要的功能是加工、 递呈抗原给记忆性T细胞，从而启动T细胞介导的免疫反应。MSCs能改变DC细胞的表型、 细胞因子释放、分化和成熟以及抗原递呈的能力。MSCs能使其停留在G0期从而抑制其增 殖，还能通过分泌PGE2和IL-6抑制DC细胞抑制树突状细胞成熟过程中CD40、CD83、 CD86的增加并且抑制树突状细胞的内吞作用，从而抑制其生物学功能的发挥。MSCs对异 常或剧烈的免疫反应的主要呈递和效应细胞均有明显的抑制作用，同时MSCs通过分泌 TGF-β、IL-6、IL-10或表IDO促进CD4+辅助性T淋巴细胞(Th0)向调节性T细胞(Treg) 分化和增殖。Treg细胞是维持机体免疫耐受的重要因素之一，并通过主动调节的方式抑制 存在于正常机体内潜在的自身反应性T细胞的活化与增殖，从而协同MSCs降低炎症反应。 近年来，MSCs不仅在治疗移植物抗宿主病及红斑狼疮等自身免疫性疾病的临床研究中， 也在治疗肺损伤及其损伤后肺组织纤维化的基础研究与临床研究中体现出了良好的安全 性和有效性。

另外，研究提示MSCs可能具有一定的协同抗病毒效应。虽然现有研究均不能证明MSCs具有直接的抗病毒活性，但有采用脐带MSCs治疗耐药性难治性HIV感染患者的临 床研究提示MSCs可增加循环中幼稚的和中枢记忆的CD4-T细胞计数，并恢复免疫不应答 患者(INR)中HIV-1特异性IFN-g和IL-2的产生，有效促进INR宿主免疫重建，逆转 HIV-1感染导致的INR免疫缺陷。此外，乙肝终末期肝病患者输注MSCs配合常规抗病毒 治疗和其他对症处理，能降低乙肝患者的感染率，从而提高终末期肝病患者的生存率。因 此，虽然MSCs没有直接抗病毒作用且其自身存在被病毒感染的可能，但输入健康的MSCs 可能通过重塑患者的免疫系统而提高抗病毒药物的治疗作用。

发明内容

本发明提供一种脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎药物中的应用。本发明针 对性解决2019-nCoV新型冠状病毒引起的重症肺炎患者因免疫功能失调引发″细胞因子风 暴″导致的以急性呼吸功能衰竭为首发的多器官功能损害以及受损脏器纤维化问题，建立 采用异体人源hUC-MSCs治疗2019-nCoV新型冠状病毒引起的重症肺炎的技术体系，评价 其疗效，为治疗2019-nCoV新型冠状病毒引起的重症肺炎探索新途径。

本发明的方案如下：一种脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎(新型冠状病毒 肺炎，英文简称：COVID-19)药物中的应用，所述新型冠状肺炎由2019-nCoV冠状病毒引起。

所述脐带间充质干细胞尤其适用于重型、危重型或合并其他并发症的新型冠状肺炎患 者。

作为优选，所述脐带间充质干细胞来源于自体或异体脐带人源间充质干细胞(hUC-MSCs)，人源脐带间充质干细胞容易获得和培养，用于治疗新型冠状肺炎时无毒 副作用。

作为优选，所述脐带间充质干细胞采用MSCPro XenoFree medium(品牌：rFib；货号： CCM0016-01)培养基扩增培养，培养5代以内，能够得到高纯度高活性的脐带间充质干细胞。

作为优选，所述脐带间充质干细胞制成细胞悬液静脉滴注发挥作用，细胞悬液中间充 质干细胞含量是48～70万/mL。作为优选，细胞混悬液使用CIP solution(品牌：rFib；货 号：CHM0016-01)，或使用生理盐水+人血白蛋白+那屈肝素钙注射液重悬脐带间充质干细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明通过静脉注射人源脐带间充质干 细胞悬液制剂用于治疗新型冠状肺炎，显著降低了重症或危重症患者体内的炎症因子水 平，减轻了肺水肿，有效缓解了急性呼吸窘迫综合征，降低了病死率。

附图说明

图1为小鼠肝脏病理切片HE染色图；

图2为小鼠炎症因子变化图；

图3为危重症患者COVID-19的主要症状及治疗情况图；

图4是患者免疫细胞的动态变化图；

图5为患者采用人源脐带间充质干细胞静脉注射前后的肺部CT图像；

图6为患者采用人源脐带间充质干细胞静脉注射后的胸片变化图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局 限于以下技术方案。

以下实施例采用的人源脐带间充质干细胞采用MSCPro XenoFree medium(品牌：rFib； 货号：CCM0016-01)培养基扩增培养5代以内，由云南济慈再生医学研究院有限公司提 供。细胞提供方拥有ISO9001质量管理体系证书。

实施例1

hUMSCs在应用于临床之前，本申请发明人发现hUMSCs细胞培养液具有良好的免疫调节功能。

材料和方法：

动物：雄性C57BL/6小鼠。

细胞：人源脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)。

细胞处理方法：按1×10⁶密度在10cm培养皿中培养过hUMSCs细胞48h的培养液通过0.22μm滤膜(Millipore)过滤除去细胞或细胞碎片，并使用超滤离心管浓缩100倍。

急性免疫肝损伤模型制作方法：18只雄性C57BL/6小鼠分为3组，模型对照组(ConA+PBS)，按照25mg/kg体重通过尾静脉注射溶于PBS中的刀豆蛋白诱导急性肝损 伤，30分钟后，通过尾静脉注射PBS；负对照组(PBS+PBS)，即用PBS制作模型，PBS 治疗；hUMSCs细胞培养液治疗组(ConA+hUMSCs)按照25mg/kg体重通过尾静脉注射 溶于PBS中的刀豆蛋白诱导急性肝损伤，30分钟后，通过尾静脉注射浓缩的hUMSCs细 胞培养基。尾静脉注射培养基或PBS 8小时后，采用心脏采血法处死小鼠，采集小鼠的血 液和肝脏。

将肝脏用PFA固定，脱水，包埋，制作4μm厚的石蜡切片，进行HE染色和显微镜 观察。

按照说明书，使用ELISA试剂盒(上海酶联)检测血清中IL-6和TNF-α的含量。每 组测试了6个独立重复样本，数据显示为均值±SD。

统计学方法：采用SPSS19.0进行数据统计分析，计量资料采用均数±标准差(χ±s) 表示，采用配对样本t检验，P＜0.05表示具有统计学差异。

结果：使用刀豆蛋白A(Concanavalin A，CoA)诱导急性肝损伤C57BL/6小鼠模型，分为负对照组(PBS+PBS)，即用PBS制作模型，PBS治疗；模型对照组(ConA+PBS)， 即用ConA诱导制作急性肝损伤模型，PBS治疗；hUMSCs细胞治疗组(ConA+hUMSCs)， 即用ConA诱导制作急性肝损伤模型，hUMSCs细胞培养液治疗。治疗后，通过肝脏病理 切片HE染色，可明显看出：模型对照组小鼠肝脏坏死明显(图1B1-B3)，UCMSC培养 液治疗的小鼠肝脏无明显异常状态(出血、坏死等)(图1C1-C3)，和负对照组相似(图1 A1-A3)。

模型对照组血清中炎性因子IL-6和TNF-α的含量相对负对照组上升，具有统计学意义 (P＜0.05)；hUMSCs培养液治疗组血清IL-6和TNF-α的含量相对模型对照组下降，接近负对照组的水平，没有明显的肝损伤症状(图2D，E)。图2中D和E炎性因子IL-6和 TNF-α的ELISA检测，和负对照组相比，模型对照组血清中炎性因子IL-6和TNF-α的含 量上升，结果具有统计学意义(P＜0.05)。以上结果表明，人源脐带间充质干细胞细胞培 养液具有良好的体内免疫调节功能，基于该实验及其他一系列研究，发明人将人源脐带间 充质干细胞应用于临床治疗NCP。

实施例2

扩增培养后的hUMSCs使用生理盐水+1％人血白蛋白+2‰那屈肝素钙注射液制成细 胞混悬液药物制剂，100mL细胞混悬液中含有5×10⁷个间充质干细胞。

本实施例将细胞混悬液药物制剂用于新型冠状肺炎危重症covid19型患者，该患者基 本情况如下：

病人在给药后，身体各项指标如图3～图5所示。在治疗期间使用抗生素预防感染，同 时胸腺素α1也一起使用。第一次注射后，未见明显副作用，耐受性良好。如表1所示，第二次给药后，血清胆红素、CRP、ALT/AST逐渐降低，其他生命体征改善。从2月13日 起，气管插管也被拔掉，病人也可以在地上行走。

图4中a、b、c、d分别是患者白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、CD细胞计数的动态 变化，箭头表示hUCMSCs治疗的日期。对于白细胞(正常范围3.5-9.5×109/L)和中性粒细 胞(正常范围1.8-6.3×109/L)，虚线表示上阈值。而对于淋巴细胞(正常范围1.1-3.2×109/L) 和T细胞亚群，虚线表示较低的阈值。

如图4所示，第二次给药后，白细胞计数和中性粒细胞计数下降到正常水平，淋巴细 胞计数也上升到正常水平。更重要的是CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞计数也 显著升高至正常水平。由于患者住院第7天就开始使用胸腺肽α1，故胸腺肽α1独自发挥 作用的可能不大。结果表明hUCMSCs或结合胸腺素α1可以大大减少炎症反应，恢复受损 伤的免疫细胞和器官。

表1病人的主要临床实验室特征

*Indicates the day of hUCMSCs therapy

表1中第一列从上往下指标依次为：肌酐、直接胆红素、间接胆红素、总胆红素、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨 酶、c反应蛋白、血清降钙索、D二聚体、脑钢肽前体。

患者肺部CT图像如图5所示，1月29日(A1-A3)CT提示左右肺均有病变及肿块密 度增高影，右肺可见毛玻璃样阴影，密度不均，支气管充气。(B1-B3)2月16日CT图像 显示左右肺明显缓解，只能看到一些条纹阴影和一小片毛玻璃阴影。1月29日和2月16 日的胸部CT图像相比，肺炎明显减轻。2月17日患者转出ICU，生命体征和临床实验室 指标基本恢复正常。

另外，西双版纳也对其中一位新型冠状患者进行了间充质干细胞静脉滴注，注射时间 为2月6日、9日、13日；并分别于2月8日、10日、13日拍胸片，分别如图6中a、b、 c所示，对比三张胸片，发现病人情况明显好转。

由上述临床试验结果发现，本发明通过静脉注射人源脐带间充质干细胞悬液制剂用于 治疗新型冠状肺炎，显著降低了重症或危重症患者体内的炎症因子水平，减轻了肺水肿， 有效缓解了急性呼吸窘迫综合征，加快患者治愈时间。

实施例3

脐带间充质干细胞分离、扩增以及细胞制品的制备

种子库原代分离

进入种子库前确定供体信息、病史、及传染病情况(供体HBV、HCV、HIV、梅毒检 测为阴性)，分离的脐带无水肿，无褶皱，有弹性。脐带间充质干细胞培养至P2代，建 立种子库。采用培养基MSCPro XenoFree medium(品牌：rFib；货号为：CCM0016-01) 对细胞进行培养。

具体操作步骤为：

1.1配制组织消化液，包括胶原酶，透明质酸酶，硫酸庆大霉素和DEME/F-12；

1.2取出脐带，弃干净脐血，分离华通氏胶，在胶原酶溶液中反复剪碎成大约 0.5-1mm3的组织块，时长为3min～15min；

1.3将剪碎组织转移至2个50mL离心管中，分别加入20mL组织消化液，放至 摇床消化0.5～3.5h、37℃，60rpm；

1.4用10mL移液管吸取等体积的DMEM/F-12加入上述50mL离心管中，用移液 管吹打混匀细胞悬液；

1.5 400rpm，离心5min，尽可能吸取上清，用70μm滤膜过滤至新的50mL离心管 内，然后分装至15mL离心管内，400g，5min，离心完用5mL MSCPro XenoFree medium (品牌：rFib；货号为：CCM0016-01；下同)重悬沉淀，吹打10次混匀，细胞计数，细 胞悬液平均接种至2个T25培养瓶中，补充MSCPro XenoFree medium至终培养体积为 5mL，将培养瓶转至37℃、5％CO2培养箱内培养；

1.6剩下的组织块，用10mL移液管吸取5mL Recombinant Trypsin EDTA Solution至上述50mL离心管中，丢弃移液管，37℃摇床继续消化30min；

1.730min后，吸取1mL MSCPro XenoFree medium至上述50mL离心管中，用移 液管吸取10mL DMEM/F-12至上述50mL离心管中，吹打混匀，400rpm，离心5min， 丢弃未消化组织块；尽可能吸取上清用70μm滤膜过滤至新的50mL离心管内，然后分装 至15mL离心管内，400g，离心5min，剩余组织块丢弃；

1.8离心完用5mL MSCPro XenoFree medium重悬沉淀，吹打10次混匀，细胞计数，剩余悬液接种至2-4个T25培养瓶中，将培养瓶转至37℃、5％CO2培养箱内培养；

1.9每隔2～4天，使用MSCPro XenoFree medium进行换液；

1.10细胞传代至P2代，内毒素、病毒、真菌、支原体、细菌和细胞表型等检测合格后，作为种子库细胞冻存；细胞冻存使UCMSC冻存保护液(品牌：rFib，货号： CFM0001-MS)。

工作库细胞扩增

从种子库复苏P2代脐带间充质干细胞继续扩增培养，建立工作库。采用培养基MSCPro XenoFree medium对细胞进行扩增培养，

即UC-MSC P2-P5代。工作细胞库中检验UC-MSC生物学特性，包括内毒素、病毒、 真菌、支原体、细菌，细胞表型，细胞三系分化功能，细胞免疫调节功能，端粒酶活性等。

脐带间充质干细胞制剂的制备

3.1工作库的贮存细胞经检定合格后复苏用于制备细胞制剂；

3.2复苏P5代细胞，离心，使用合人血白蛋白的生理盐水溶液洗涤细胞2次；

3.3细胞重悬于CIP solution(品牌：rFib；货号：CHM0016-01)，制备为细胞制品。

实施例4

细胞的操作过程同实施例3，但细胞制品制备时，P5代细胞重悬于合生理盐水+1％人 血白蛋白+2‰那屈肝素钙注射液的溶媒中，放置在在2-4℃保存2-8h后进行细胞活率检测， 如表2所示。

表2

由上述临床试验结果发现，本发明通过静脉注射人源脐带间充质干细胞悬液制剂用于 治疗新型冠状肺炎，显著降低了重症或危重症患者体内的炎症因子水平，减轻了肺水肿， 有效缓解了急性呼吸窘迫综合征，加快患者治愈时间。

Claims (6)

1.一种脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎药物中的应用，其特征在于，所述新型冠状肺炎由2019-nCoV冠状病毒引起。

2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎药物中的应用，其特征在于，所述脐带间充质干细胞尤其适用于重型、危重型或合并其他并发症的新型冠状肺炎患者。

3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎药物中的应用，其特征在于，所述脐带间充质干细胞为自体或异体人源脐带间充质干细胞。

4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎药物中的应用，其特征在于，所述脐带间充质干细胞采用MSCPro XenoFree medium培养基扩增培养，培养5代以内。

5.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎药物中的应用，其特征在于，所述脐带间充质干细胞制成细胞悬液静脉滴注发挥作用，细胞悬液中间充质干细胞含量是48～70万/mL。

6.根据权利要求5所述的脐带间充质干细胞在制备治疗新型冠状肺炎药物中的应用，其特征在于，所述脐带间充质干细胞使用CIP solution或者生理盐水+人血白蛋白+那屈肝素钙注射液制成细胞悬液。

Images