CN114561349A - Il18，il12，il15处理的间质干细胞所产生的外泌体及抗病毒应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了IL18，IL12，IL15处理的间质干细胞所产生的外泌体及抗病毒应用，涉及生物医药技术领域。该外泌体由细胞因子组合物对间质干细胞进行预处理所产生，所述细胞因子组合物包含IL18，IL12及IL15中的至少两种细胞因子。本发明提供的抗病毒性肺炎活性增强的间质干细胞的外泌体，相比未经预处理的人间质干细胞所分泌的外泌体可以有更好的抗病毒性肺炎活性以用于治疗病毒性肺炎引起的免疫炎症反应，降低炎症反应对肺部组织的破坏，起到组织器官修复的作用；预处理后人间质干细胞所分泌的外泌体具有均一性更好、免疫调节性蛋白更高、外泌体颗粒含量更多等特点；可应用于制备治疗病毒性肺炎或由病毒性肺炎引起的免疫炎症药物。

Description

IL18，IL12，IL15处理的间质干细胞所产生的外泌体及抗病毒 应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及IL18，IL12，IL15处理的间质干细胞所产生的外泌体及抗病毒应用，该外泌体具有抗病毒性肺炎活性增强的作用。

背景技术

自2019年年底起，肆虐全球的新冠病毒所引起的病毒性肺炎引起了世界各国医药界的关注，此类病毒变异速度快，一旦感染疾病，疾病进程较快，有基础性疾病的患者在感染新冠病毒后，容易发展为重型病毒性肺炎并导致急性呼吸窘迫综合征，体内细胞因子风暴等。目前针对病毒性肺炎的治疗手段，临床一般以采取支持治疗、抗病毒治疗、免疫治疗、糖皮质激素治疗为主，而对重症、危重症患者采取呼吸支持、防治并发症等。可以预见的是，在目前治疗手段中，对于重型、危重型病毒性肺炎患者，特别是正在流行的新冠病毒性肺炎患者来说，临床治疗手段相对常规，应对相关并发症时也往往以支持治疗为主。而当发生由病毒引起的体内细胞因子风暴时，往往治疗手段相对匮乏，仅能以支持治疗为主，依靠患者自身痊愈。在新冠病毒性肺炎研究过程中，有研究者提出使用间质干细胞进行治疗及预防重型、危重型病程的发生，均取得较好的效果。

间质干细胞是一类具有自我更新、自我复制、多向分化能力的干细胞，除了在组织器官修复上有一定的临床研究价值外，因为其低免疫原性及较好的免疫抑制功能被广泛的应用在相关免疫性疾病的临床治疗中。间质干细胞可以通过旁分泌的方式，抑制体内细胞炎症因子激活的免疫细胞，减少炎症反应，降低机体内发生细胞因子风暴的风险。且目前大部分间质干细胞输注治疗的案例中，使用的均为异体间质干细胞，尽管间质干细胞具有较低的免疫原性，但是始终存在可能致瘤、更强的排斥反应等风险。而在目前的临床研究中，有大量的证据表明，间质干细胞主要通过旁分泌作用调节体内炎症环境，而旁分泌作用的实现除了通过分泌细胞因子之外，间质干细胞所分泌的外泌体等囊泡体也起到了重要的调节作用。

外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。外泌体，目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。学术界对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发，外泌体在这些方面上的发展潜力都是巨大的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是目前针对病毒性肺炎的治疗手段匮乏，治疗效果不佳。

为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：

本发明提供IL18，IL12，IL15处理的间质干细胞所产生的外泌体，该外泌体具有抗病毒性肺炎活性增强的作用，其由细胞因子组合物对间质干细胞进行预处理所产生，所述细胞因子组合物包含IL18，IL12及IL15中的至少两种细胞因子。

优选地，所述细胞因子组合物至少包含IL18，IL12及IL15。

实验结果确认，相比于普通(未经预处理)的间质干细胞所产生的外泌体，经过包含IL18，IL12及IL15的细胞因子组合物预处理后的间质干细胞的外泌体在针对病毒性肺炎上具有更好的抗病毒肺炎活性【图1】；且预处理后的人间质干细胞所产生的外泌体具有以下特征，即均一性更好，免疫调节蛋白含量更高，外泌体颗粒含量更多。【图2】【图7】。

在本说明书中，术语“外泌体”是指细胞向外分泌的包含了复杂RNA和/或蛋白质的小膜泡(30-150nm)，存在于几乎所有真核生物的体液。为了执行凝固、胞间通讯及识别细胞性免疫的功能性作用，外泌体起到了输送作用。

在本说明书中，所述“抗病毒肺炎活性”是指经过至少包含IL18，IL12，IL15的细胞因子组合物处理后的间质干细胞及其外泌体对T细胞的免疫抑制功能。

需要说明的是，IL18属于IL1超家族，主要通过巨噬细胞产生，可以刺激多种细胞类型并且具有多效性功能。IL18是促发Ⅰ型反应的促炎细胞因子，与IL12可以在被脂多糖等微生物产物感染后诱导细胞介导的免疫。IL18、IL12可以联合作用于CD4+、CD8+T细胞和NK细胞以诱导产生IFN-γ，这在激活巨噬细胞和其他细胞产生进一步的细胞免疫起到重要作用。已有相关报道证明，IL18和IL12可以组合抑制IL4依赖性IgE和IgG1的产生并增强B细胞中IgG2a的产生，且更为重要的是，在没有IL12或IL15的情况，IL18很难诱导IFN-γ的产生，因此本说明书针对IL18、IL12、IL15在体内的协同作用的特点，采用此三种细胞因子赋能脐带间质干细胞，并使之产生相应的外泌体用于治疗病毒性肺炎。

其进一步地技术方案为，所述外泌体的获取方式为，经过预处理后的间质干细胞在更换基础培养基后对其饥饿处理，然后收集培养上清进行梯度离心，获得浓缩后的抗病毒性肺炎活性增强的间质干细胞的外泌体。

在本发明的另一实施方式中，所述“外泌体”的获取方式为，更换基础培养基饥饿处理，收集培养上清通过差速超速离心获得，并通过纳米粒径分析仪以及western blot检测鉴定。【图7】

其进一步地技术方案为，所述预处理是指将细胞因子组合物加入到基础培养基中配置成预处理培养基，将间质干细胞加入到预处理培养基中进行培养。所述基础培养基为培养哺乳动物细胞的任一培养基。如：可使用达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基和F12的混合物(DMEM/F12)、RPMI 1640等等。

在本发明的一实施方式中，细胞因子组合物可选择IL18，IL12，IL15的中相应至少二种细胞因子进行组合后加入基础培养基中，配置预处理培养基对间质干细胞进行预处理。

在本发明的一实施方式中，上述包含IL18，IL12，IL15至少两种的细胞因子组合物的选择方式是基于疾病发展进程所决定的，根据疾病发生时机体内的炎症表达水平确定细胞因子组合的方式后进行间质干细胞的预处理。

其进一步地技术方案为，所述预处理培养基中，所述IL18的浓度为120ng/ml至400ng/ml、IL12的浓度为10ng/ml至250ng/ml、IL15的浓度为100ng/ml至300ng/ml。

更优选地，所述IL18的浓度为125ng/ml至250ng/ml、IL12的浓度为80ng/ml至180ng/ml、IL15的浓度为110ng/ml至200ng/ml。

更优选地，所述IL18的浓度为125ng/ml、IL12的浓度为150ng/ml、IL15的浓度为120ng/ml。【图3】

在本发明中，所述“体外免疫抑制实验”为将激活后人外周血单个核细胞(PBMC)与间质干细胞所产生的外泌体于体外接触培养72小时，检测PBMC的增殖情况。在本说明书中，判断标准如下：增强T细胞抑制增殖能力s1/s2>1.5(更优的s1/s2>2，最优的s1/s2>2.5),s1为预处理后的人脐带间质干细胞所产生的外泌体对T细胞的抑制百分比，s2为原始的普通人脐带间质干细胞所产生的外泌体对T细胞的抑制百分比。【图4】

在本发明中，所述“病毒性急性肺炎模型治疗实验”为在使用鼠适应性H1N1病毒(PR8)对小鼠进行疾病造模后的第3天，尾静脉注射1×106个人脐带间质干细胞进行治疗，并于造模后第14天处死小鼠取其肺组织进行病理切片，与对照组一同进行HE染色，判断治疗效果。

在本发明的另一实施方案中，所述“增强对病毒性肺炎的抗炎活性”是指在对病毒性肺炎小鼠模型上，使用本说明书中的预处理后的间质干细胞和/或其外泌体进行治疗后，出现明显的治疗效果；【图5】

其进一步地技术方案为，所述预处理的时间为8到24小时。

更优选地，所述预处理的时间为15小时。【图6】

其进一步地技术方案为，所述饥饿处理的时间为12到36小时。

更优选地，所述饥饿处理的时间为24小时。

其进一步地技术方案为，所述间质干细胞，其来源包含人体组织中的骨髓、脂肪、胎盘、脐带、牙髓。

更优选地，所述间质干细胞为人脐带间质干细胞。

本发明提供的外泌体，具有抗病毒性肺炎活性增强的作用。

本发明还提供所述的外泌体在制备治疗病毒性肺炎或由病毒性肺炎引起的免疫炎症药物中的应用。

与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：

本发明提供的抗病毒性肺炎活性增强的间质干细胞的外泌体，相比未经预处理的人间质干细胞所分泌的外泌体可以有更好的抗病毒性肺炎活性以用于治疗病毒性肺炎引起的免疫炎症反应，降低炎症反应对肺部组织的破坏，起到组织器官修复的作用；预处理后人间质干细胞所分泌的外泌体具有均一性更好、免疫调节性蛋白更高、外泌体颗粒含量更多等特点；可应用于制备治疗病毒性肺炎或由病毒性肺炎引起的免疫炎症药物。

在体外免疫抑制实验中，本发明用细胞因子组合物预处理后的人间质干细胞所分泌的外泌体对T细胞的抑制能力要优于普通人间质干细胞所分泌的外泌体。

在病毒性急性肺炎模型的治疗实验中，本发明用细胞因子组合物预处理后的人间质干细胞及其外泌体对疾病模型肺部保护程度要优于普通人间质干细胞及其外泌体对疾病模型肺部保护程度。

附图说明

图1为采用不同组合处理的人脐带间质干细胞所产生的外泌体在对病毒性肺炎小鼠的生存曲线对比图，其中，正常组：没有经过任何处理的动物疾病模型组；PBS组：使用PBS进行治疗的动物疾病模型组；对照组：使用普通MSC来源的外泌体进行治疗的动物疾病模型组；因子组合①：使用含有IL18，IL12，IL15的细胞因子组合物处理的动物疾病模型组；因子组合②：使用含有IFN-γ，IL21，IL23的细胞因子组合物处理的动物疾病模型组。

图2为采用不同组合处理的人脐带间质干细胞所产生的外泌体携带的免疫调节因子变化图；其中，对照组：使用普通MSC来源的外泌体进行治疗的动物疾病模型组；因子组合①：使用含有IL18，IL12，IL15的细胞因子组合物处理的动物疾病模型组；因子组合②：使用含有IFN-γ，IL21，IL23的细胞因子组合物处理的动物疾病模型组。

图3为使用因子组合①处理时，不同的细胞因子浓度对人脐带间质干细胞所产生的外泌体携带的免疫调节因子变化图。

图4为采用不同组合处理的人脐带间质干细胞所产生的外泌体的体外对CD3+T细胞标记CFSE后增殖抑制百分比柱状图；其中，对照组：使用普通MSC来源的外泌体进行治疗的动物疾病模型组；因子组合①：使用含有IL18，IL12，IL15的细胞因子组合物处理的动物疾病模型组；因子组合②：使用含有IFN-γ，IL21，IL23的细胞因子组合物处理的动物疾病模型组。

图5为急性肺炎模型下预处理前后人脐带间质干细胞所产生的外泌体的疗效对比图，其中正常组：没有经过任何处理动物组；PBS组：使用PBS进行治疗的动物疾病模型组；对照组：使用普通MSC来源外泌体进行治疗的动物疾病模型组；因子组合①：使用含有IL18，IL12，IL15的细胞因子组合物处理的动物疾病模型组；因子组合②：使用含有IFN-γ，IL21，IL23的细胞因子组合物处理的动物疾病模型组。

图6为在不同的预处理时间下，因子组合①对人脐带间质干细胞的体外免疫抑制功能的影响(A为各组治疗急性肺炎模型下的肺部切片H&E染色；B为各组检测CD3+T细胞标记CFSE后增殖抑制百分比柱状图，可以发现预处理15小时的抑制效果最佳)。

图7为不同细胞因子组合物预处理后人脐带间质干细胞的外泌体的鉴定结果(A为各组的粒径分析结果，可以发现因子组合①组处理得到的外泌体的粒径均一度最好；B为各组粒径分析下，每ml中含有的外泌体颗粒数；C为各组western blot检测外泌体相关标记物表达情况)；其中，对照组：使用普通MSC来源外泌体进行治疗的动物疾病模型组；因子组合①：使用含有IL18，IL12，IL15的细胞因子组合物处理的动物疾病模型组；因子组合②：使用含有IFN-γ，IL21，IL23的细胞因子组合物处理的动物疾病模型组。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明中，所用试剂和试验材料均可从市售渠道获取，其中生物材料来源如下：

IL18，IL12，IL15等细胞因子购自R&D公司。

实施方案1用细胞因子组合物预处理人脐带间质干细胞

间质干细胞的分离及培养：

S1、在医学伦理委员会的监督下，从健康供体获取新鲜脐带进行华通氏胶的分离，对华通氏胶进行剪碎，采用贴壁法培养，在无血清培养系统下进行原代细胞的获取和扩增，所述无血清培养基为：Ultraculture(Lonza)+市售MSCs培养因子。

S2、对原代细胞进行扩增并于P2代进行冻存为种子细胞。

本说明书中，所述“P2代”指原代细胞在培养瓶和/或细胞工厂中，经过2次融合度达到100％并消化重新种入培养瓶和/或细胞工厂后的代次。

S3、用细胞因子组合物预处理人脐带间质干细胞：

将冻存的种子细胞复苏，按5000-13000cells/cm2接种在培养瓶和/或细胞工厂中，其中在本说明书中，培养瓶最佳接种密度为6500cells/cm2，细胞工厂最佳接种密度为12000cells/cm2。

当细胞融合度达到75％以上时，可以开始使用细胞因子组合物对其进行预处理，其中在本说明书中，最佳细胞融合度为90％。将旧的细胞培养基更换为含有IL18，IL12，IL15等细胞因子组合物的预处理培养基，与细胞接触培养8到24小时。

本发明实施例的预处理中，细胞因子组合物所采用的不同细胞因子的组合类型包括：因子组合①IL18，IL12，IL15；因子组合②IFN-γ，IL21，IL23。

在本说明书中，预处理培养基中细胞因子的优选浓度为125ng/ml IL18、150ng/mlIL12、120ng/ml IL15。

在本说明书中，预处理培养基与细胞接触培养时间为8到24小时，优选地，在本实施例中，培养时间为15小时。

S4、将经过预处理后的细胞更换无血清培养基，饥饿处理24小时后，收集细胞培养上清液，作为外泌体提取的原液。

实施方案2经细胞因子组合物预处理的人脐带间质干细胞外泌体的获取方法

在本说明书中，所述“无血清培养基”可以使用市售的任意哺乳动物细胞培养基，例如：达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基和F12的混合物(DMEM/F12)、RPMI 1640等等；优选的，本实施例中使用Ultraculture培养基(Lonza)。

S5、将S4收集得到的培养上清进行切向流浓缩，除去大于300kD的杂质，浓缩50至100倍，在本实施例中，优选地，浓缩倍数为60倍；

S6、将浓缩液进行超速离心，具体实施方法为：

S601、4℃下，10,000g，离心30min，保留离心上清；

S602、将步骤S601的离心上清在4℃下，100,000g，离心90min，保留离心沉淀；

S603、将步骤S602的离心沉淀加入20ml D-PBS在4℃下，100,000g，离心90min，保留离心沉淀，即获得分离后的外泌体；

S604、使用1ml D-PBS溶解并混匀离心沉淀后，于-80℃下保存备用。

实验设置的正常组、PBS组以及对照组的区别如下：

正常组：没有经过任何处理动物组；PBS组：使用PBS进行治疗的动物疾病模型组；对照组：使用普通MSC来源外泌体进行治疗的动物疾病模型组。

对获得的外泌体进行鉴定，本发明采用的鉴定方式：通过纳米粒径分析仪检测外泌体大小，使用透射电镜拍摄外泌体显微照片及western blot检测外泌体特异标志物CD63和CD9的表达情况。

实施方案3对预处理前后人脐带间质干细胞所产生的外泌体的体外免疫抑制试验

将间质干细胞在体外与人外周血单个核细胞共培养，是检测间质干细胞在体外免疫抑制能力的重要实验检测方法。

本发明中，将人外周血单个核细胞标记CFSE且经过激活后，分别与普通人脐带间质干细胞所产生的外泌体、及预处理的人脐带间质干细胞所产生的外泌体(预处理中，细胞因子组合物中采用的组合类型包括：因子组合①IL18，IL12，IL15；因子组合②IFN-γ，IL21，IL23)进行共培养，可以看到经过80小时的共培养后，经过因子组合①预处理的人脐带间质干细胞所产生的外泌体的免疫抑制效果明显优于普通人脐带间质干细胞所产生的外泌体和因子组合②预处理的人脐带间质干细胞所产生的外泌体的免疫抑制效果。

从流式检测结果上看，与因子组合①预处理的人脐带间质干细胞所产生的外泌体共培养的CD3+总T细胞的增殖比例明显下降，增殖下降比例明显高于与普通人脐带间质干细胞所产生的外泌体和因子组合②预处理的人脐带间质干细胞所产生的外泌体共培养的CD3+总T细胞。

如图4，从抑制百分比统计，与因子组合①预处理的人脐带间质干细胞所产生的外泌体共培养的CD3+总T细胞的抑制效果好，抑制比例明显高于与普通人脐带间质干细胞所产生的外泌体和因子组合②预处理的人脐带间质干细胞所产生的外泌体共培养的CD3+总T细胞的抑制比例。

此外，发明人将因子组合①预处理人脐带间质干细胞的时间对体外免疫抑制疗效的影响也做了相应的探究。如图6，结果表明，因子组合①预处理人脐带间质干细胞15小时时，因子组合①预处理人脐带间质干细胞及其外泌体免疫抑制效果可以达到最佳水平。

实施方案4不同因子组合物预处理的人脐带间质干细胞所产生的外泌体治疗病毒性肺炎小鼠模型

H1N1病毒诱导小鼠急性肺损伤是一个经典的模拟人病毒性或自身免疫性急性肺炎的动物模型。在这一模型中，急性免疫应答在介导肺损伤中发挥了主导作用，多种免疫细胞(T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞)和炎性因子(IFN-γ、IL-1β、IL6、TNF-α等)都参与了急性肺炎的病例过程，受到病毒感染的小鼠肺部会出现大量的免疫细胞浸润、红细胞析出、肺部结构性损伤。

在本发明中，将普通人脐带间质干细胞所产生的外泌体、因子组合①预处理的人脐带间质干细胞所产生的外泌体具有免疫抑制功能的特性，应用于治疗病毒性急性肺炎上。

结果发现，普通人脐带间质干细胞所产生的外泌体在对病毒性急性肺炎有一定的治疗效果，说明普通人脐带间质干细胞所产生的外泌体能够对体内激活的免疫细胞具有一定的免疫抑制作用，但由于普通人脐带间质干细胞所产生的外泌体未经过细胞因子组合物的预处理，并未含有更多的抑炎因子或相关调节性蛋白，因此治疗作用效果有限。

在急性肺炎疾病模型中，本发明用细胞因子组合物预处理过的人脐带间质干细胞所产生的外泌体表现出了优于普通人脐带间质干细胞所产生的外泌体的免疫抑制能力。这一结果与本说明书中的体外实验中得出的结论相符，本发明提供的用细胞因子组合物对人脐带间质干细胞预处理所产生的外泌体用于治疗病毒性急性肺炎具有增强作用。

又在本发明中，针对不同预处理时间的人脐带间质干细胞的治疗效果进行了比较。结果表明，在造模第3天后，使用不同预处理时间的因子组合物预处理的人脐带间质干细胞所产生的外泌体治疗疾病模型，其中，15小时的预处理组，治疗效果达到最佳。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。

以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种抗病毒性肺炎活性增强的间质干细胞的外泌体，其特征在于，由细胞因子组合物对间质干细胞进行预处理所产生，所述细胞因子组合物包含IL18，IL12及IL15中的至少两种细胞因子。

2.如权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述外泌体的获取方式为，经过预处理后的间质干细胞在更换基础培养基后对其饥饿处理，然后收集培养上清进行梯度离心，获得浓缩后的外泌体。

3.如权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述预处理是指将细胞因子组合物加入到基础培养基中配置成预处理培养基，再将间质干细胞加入到预处理培养基中进行培养；所述基础培养基为培养哺乳动物细胞的任一培养基。

4.如权利要求3所述的外泌体，其特征在于，所述预处理培养基中，所述IL18的浓度为120ng/ml至400ng/ml、IL12的浓度为10ng/ml至250ng/ml、IL15的浓度为100ng/ml至300ng/ml。

5.如权利要求4所述的外泌体，其特征在于，所述IL18的浓度为125ng/ml至250ng/ml、IL12的浓度为80ng/ml至180ng/ml、IL15的浓度为110ng/ml至200ng/ml。

6.如权利要求3所述的外泌体，其特征在于，所述预处理的时间为8到24小时。

7.如权利要求2所述的外泌体，其特征在于，所述饥饿处理的时间为12到36小时。

8.如权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述间质干细胞，其来源包括人体组织中的骨髓、脂肪、胎盘、脐带、牙髓。

9.如权利要求1-8任一项所述的外泌体，其特征在于，具有抗病毒性肺炎活性增强的作用。

10.如权利要求1-8任一项所述的外泌体在制备治疗病毒性肺炎或由病毒性肺炎引起的免疫炎症药物中的应用。

Images