JP7116501B2 - 幹細胞材料およびその製造方法 - Google Patents

Description

VKPM H-154

本発明の実施形態に合致する組成物および方法は、一般に、少なくとも細胞生物学、分子生物学、および医学の分野に関係する。より詳細には、本発明の実施形態は、幹細胞、幹細胞馴化培地、幹細胞馴化培地を得る方法および、幹細胞並びに幹細胞馴化培地の用途に関するものである。

間葉系幹細胞、すなわちＭＳＣは、間葉系細胞タイプに分化する可能性のある、多能性間質細胞であり、例として、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞などがある。ＭＳＣは、多能性を維持しながら、自己再生ができるという優れた能力を有する。骨髄ＭＳＣは現在、様々な治療の臨床治験に応用されている。培養中のＭＳＣを分離、精製、複製するための手順は当技術分野では公知のことである。

ＭＳＣは、ビーズを用いて単層培養（つまり二次元培養）あるいは三次元培養することが可能である。これら標準的な方法は、生理学的環境に極めて類似した状態でＭＳＣの増殖を可能にする。ＭＳＣの挙動は生体内と生体外の環境では異なり得ることが報告されている。異なるＭＳＣ株間の相違は、概して、分離技術と生体外培養条件の相違にあると考えられる。例えば、増殖条件の相違は、細胞表面のマーカーの発現に影響を及ぼすことを含め、生体外での細胞の挙動に影響を及ぼす可能性がある。細胞の表面での特異的マーカーの発現は、異なる細胞株を区別する、あるいは細胞株の系統を確認するのに使用することが可能である。

すべての細胞は（ＭＳＣを含む）は、培養中に生物学的生産物を産生する。例えば、ＭＳＣは培養中に２００以上の独自のタンパク質を産生することが知られている。培養中にＭＳＣによって産生される特定の生物学的生産物は、様々なＭＳＣに特性を与え区別するために使用することが可能である。しかしながら、同じ供給源からのＭＳＣを使用しても、分離技術や生体外培養条件の違いが分泌生物学的生産物の生成に影響を与え、変化を生じさせることがある。もちろん、理想的な細胞増殖条件からの逸脱が、培養物の老化および喪失を招くことも知られている。

本発明の一態様によると、ある特徴を１つあるいはそれ以上持つ、ウィスターラットの骨髄に由来する間葉系幹細胞の固有株が得られる。例えば、間葉系幹細胞の株は０.７×１０^６個の細胞を７５ｃｍ^２フラスコに播種し、少なくとも９６時間培養した場合：
（ａ）培地交換の２４時間以内で、少なくとも４.５ ｍＭの乳酸塩を産生することができる；
（ｂ）培地交換の２４時間以内で、少なくとも１５０ ｐｇ／ｍｌのＧＲＯ／ＫＣを産生することができる；
（ｃ）培地交換の２４時間後のＯＰＧの産生量が２５０ ｐｇ／ｍｌ未満である；
あるいは（ｄ）培地交換の２４時間後のＴＧＦ－β３の産生量が８０ ｐｇ／ｍｌ未満である。
別の態様によれば、０.７×１０^６個の細胞を７５ｃｍ^２フラスコに播種し少なくとも１５０時間培養した場合：
（ｅ）培地交換の２４時間以内に培養培地のｐＨが７.０未満に低下する；
もしくは（ｆ）培地交換の２４時間以内に培養培地のｐＨが細胞の非存在下での培養培地のｐＨから少なくとも０.４単位減少する。培養培地はＣＯ_２を５％添加したＲＰＭＩ－１６４０培地としてもよい。さらに、同じ幹細胞株は、ｐＨ７.０５未満で少なくとも１つの集団が倍増され得る。幹細胞株はまた、ＣＤ２９とＣＤ４４マーカーの陽性発現および、ＣＤ１１ｂとＣＤ４５マーカーの陰性発現によっても特徴づけられることがある。

本発明の別の態様は、特定の調整期間中培養地に複数の固有幹細胞を維持することで調製することが可能な、馴化培地に関する。ある態様では、培養培地は５％のＣＯ_２を添加したＲＰＭＩ－１６４０である。細胞は、ＣＯ_２の大気中濃度や低酸素条件を含む様々な条件下で培養培地中に維持することができる。本発明の態様によって、調整期間は多様になり得る。例えば、調整期間は少なくとも１２時間としてもよく、または、馴化培地が少なくとも１５０ ｐｇ／ｍｌのＧＲＯ／ＫＣを含むに十分な期間としてもよい。
本発明の別の態様では、馴化培地は少なくとも以下の１つを満たすことができる：
（ａ）ＧＲＯ／ＫＣの含有量が少なくとも５００ ｐｇ／ｍｌ、
（ｂ）ＶＥＧＦの含有量が少なくとも４０００ ｐｇ／ｍｌ、
（ｃ）ＯＰＧの含有量が２５０ ｐｇ／ｍｌ未満、
もしくは
（ｄ）ＴＧＦ－β３の含有量が８０ ｐｇ／ｍｌ未満。

本発明の別の態様は、固有の幹細胞株または固有の細胞によって調整された培地を含む組成物に関する。また、組成物には適切な担体を含めることができる。担体には、液体、クリーム、エアゾール、ローション、軟膏、ヒドロゲルを含めることができるが、これらに限定されない。本発明の態様のいくつかにおいては、組成物は、幹細胞のいくつかまたはすべてを除去するように処理され得る。
他の態様においては、組成物は、ＯＰＧの含有量が２５０ ｐｇ／ｍｌ未満、またはＴＧＦ－β３の含有量が８０ ｐｇ／ｍｌ未満の馴化培地を含めることができる。

本発明の態様によれば、固有の幹細胞株、馴化培地もしくは組成物は、注射、移植、もしくは局所適用により被検体に投与することが可能である。本発明の他の態様によると、細胞、馴化培地もしくは組成物は、縫合糸、包帯、編地メッシュ、インプラント、ステント、移植組織、ウェットワイプ、または歯周パッド、あるいは他の供給手段（アプリケータ）に適用することが可能である。細胞、馴化培地もしくは組成物には、例えば、火傷治療、スキンケア、血管新生、脈管形成、臓器または組織の治癒、化粧品、組織炎症、細菌感染症、創傷適用、糖尿病、薬学および眼科学用途、瘢痕の削減、育毛促進、免疫療法の適用と免疫矯正療法、皮膚や骨髄または臓器の移植、臓器や組織の治療、あるいはヒトまたは動物の他の病気の治療のためなど、様々な用途がある。

本発明の上記および／または他の態様は、添付の図面を参照して、その実施形態例を詳細に説明することで、より明確になる。

マーカーのタイプおよびマーカーの相対パーセンテージを含む、ｈｂ－ＭＳＣの表面細胞マーカーのフローサイトメトリー分析を図示したものである。 継代Ｎｏ.９（ｐ９）時点でのｈｂ－ＭＳＣからのギムザ染色された染色体を図示している。 ｈｂ－ＭＳＣとコントロールの、ＰＣＲ分析の電気泳動図を図示している。 ＲＰＭＩ－１６４０培地とｈｂ－ＭＳＣ組成物によって治療されて９日後のマウスの創傷の比較を示している。 ＲＰＭＩ－１６４０培地とｈｂ－ＭＳＣ組成物によって治療されたマウスの創傷の創傷閉鎖の相対速度を示している。 ＲＰＭＩ－１６４０培地、ｒｂ－ＭＳＣ 馴化培地、およびｈｂ－ＭＳＣ馴化培地について、経時的なｐＨの変化を図示している。 ｒｂ－ＭＳＣおよびｈｂ－ＭＳＣの細胞培養中の乳酸塩濃度（ｍＭ）の変化を図示している。

以下、添付図面を参照し、本発明の様々な実施形態例を説明する。本発明の態様は本明細書に記載の実施形態に限定されることなく、様々な形態で実施することができる。本明細書を通して使用されるいかなる見出しまたは小見出しも便宜上の目的でのみ使用しており、請求項の範囲および意味を限定するものでは決してないことを理解すべきである。最後に、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数を示す「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上ほかに明確に指示されない限り、複数の指示物を含むことを理解すべきである。

本発明の実施形態の１つは、新規間葉系幹細胞株（以下「ｈｂ－ＭＳＣ株」と称する）に関するものである。ｈｂ－ＭＳＣ株のサンプルは、ロシア国立工業用微生物コレクション（ＶＫＰＭ）に受託番号Ｈ－１５４として寄託されている。細胞株はＭＳＣＲ０５Ｐ０９という名称で寄託されている。ｈｂ－ＭＳＣ株の表面細胞マーカーの発現は間葉系幹細胞のものと一致する。

本発明の別の実施形態は、ｈｂ－ＭＳＣによって調整された培地およびこれを得る方法に関するものである。馴化培地は複数の生物学的機能を有する無数の生物学的生産物、小分子およびエキソソームを含む。

その他の実施形態はｈｂ－ＭＳＣの組成物に関する。ｈｂ－ＭＳＣ組成物は以下のものを含み得る：
（１）ｈｂ－ＭＳＣ、ｈｂ－ＭＳＣの培養によって調整された培地、あるいはそれらの任意の組み合わせ；および
（２）適切な担体。
ｈｂ－ＭＳＣ、ｈｂ－ＭＳＣによって調整された培地、およびｈｂ－ＭＳＣ組成物は、任意の状態で使用され、当技術分野で周知の任意の方法を用いて送達され、様々な用途に使用することが可能である。

細胞は、培地を利用して生体外で継代される。適切な培地としては、ＲＰＭＩ－１６４０、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、イスコフ培地、マッコイ培地、または細胞増殖のための十分な栄養を含有する任意のその他培地を含むが、これらに限定されるものではない。これら培地は、調製または商業的供給源から入手することが可能である。

間葉系細胞を、それらが好む増殖環境から引き離すことは、典型的には、細胞増殖の減少または停止、プラスチック接着性の消失、および／または細胞形態の変化をもたらす。細胞増殖に関する重要な変化要素の１つは、細胞増殖中の環境のｐＨである。典型的には、培養中の条件が生理学的ｐＨから逸脱する場合、幹細胞は増殖しない（あるいは増殖速度の減少に見舞われる）。このような理由から培養培地は、典型的には、細胞培養中は緩衝液として機能する。すべての細胞は増殖と生存のため、少量のＣＯ_２を生成し必要とする。いくつかの培養培地の例では、溶解したＣＯ_２は、培地のｐＨを緩衝するためＣＯ_２／重炭酸反応を用いて重炭酸イオンと平衡状態になっている。ＣＯ_２は培地に自由に溶解し、水と反応して炭酸を生成する。細胞が代謝し、より多くのＣＯ_２を生成すると、培地のｐＨが低下する。最適ｐＨ範囲７.２から７.４は培地に重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）を添加し、培地上の大気中のＣＯ_２濃度を調整することで、維持可能となる。培地の緩衝能はＮａＨＣＯ_３の量により決定される。一般的に、ＮａＨＣＯ_３を１.２から２.２ ｇ／ｌに設定した緩衝能で最適なｐＨを達成するためにＣＯ_２が５％添加される。別の例では、ＮａＨＣＯ_３を３.７ ｇ／ｌに設定した緩衝能で最適なｐＨを達成するために、ＣＯ_２が１０％添加される。添加ＣＯ_２が培養地の緩衝能を下回ると、培養地のｐＨを適正なレベルに保つことができず、これが老化につながる可能性がある。

細胞培養培地は、所望の細胞培養を援護しあるいは維持するため、必要に応じて、ビタミン、成長因子、ホルモン、タンパク質、糖および／または抗酸化剤のような成分を追加することが可能である。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの血清を添加することが可能であることも理解すべきである。例えば、１０％の添加ＦＢＳを培地に加えることもあり得るし、また血漿を動物の血清と同じ量加えることも可能である。あるいは、添加血清および／または添加血漿が存在しない状態でも、細胞を培養液中で維持し増殖させることが可能である。細胞により調整された培地が、培養培地に代えてあるいは培地に加えて使用され得る。

ｈｂ－ＭＳＣ株はウィスターラットの骨髄から分離することができる。ｈｂ－ＭＳＣ株を分離する方法は一般的には少なくとも以下を含む:
（１）初代ラット骨髄細胞から継代Ｎｏ．１細胞を確保する；
（２）ｐ１ラット間葉系幹細胞を適正なフラスコに播種する；
（３） 最初のインキュベーション工程、この工程で、最初の細胞インキュベーション時間の間、最初に設定されたＣＯ_２濃度で細胞がインキュベーションされる；
（４）第二のインキュベーション工程、この工程で、２番目の細胞インキュベーション時間の間、２番目に設定されたＣＯ_２濃度で細胞がインキュベーションされる；
（５）ｈｂ－ＭＳＣの採取。

初代ラット骨髄幹細胞は、ウィスターラットの脛骨または大腿骨の骨髄から公知の方法によって採取できる。細胞採取後、細胞ペレットを再懸濁し、プラスチック組織培養フラスコに播種し、３７℃、ＣＯ_２濃度５％の加湿雰囲気下で、培養培地（例えばＦＢＳを１０％ 添加したＲＰＭＩ－１６４０）中でインキュベーションすることができる。約７０％コンフルエントまで成長した接着細胞を、継代Ｎｏ.１（ｐ１）と称する。

１つの実施形態では、最初の所定濃度のＣＯ_２は、一般的に培地製造者によって決定されるので、培地の緩衝能のために処方されたＣＯ_２濃度に合致するように設定することも可能である。例えば、ＲＰＭＩ－１６４０培地を培養に使用する場合、最初の所定のＣＯ_２濃度は５％に設定することができる。同じ実施形態で、第二の所定濃度のＣＯ_２は、一般的に培地製造者によって決定されるので、培地の緩衝能のために規定されたＣＯ_２濃度から少なくとも５０％低減することも可能である。ＲＰＭＩ－１６４０培地の場合、規定ＣＯ_２濃度は５％である。したがってこの方法の実施形態の１つによれば、第二の所定濃度のＣＯ_２は、２.５％未満に設定されるべきである。別の実施形態では第二の所定濃度は大気中のＣＯ_２濃度（すなわち約ＣＯ_２濃度０.０３％）に設定することも可能である。当業者であれば、培養液中の第二の所定ＣＯ_２濃度が増加する場合、ｈｂ－ＭＳＣ株を分離するため第二のインキュベーション時間を増加させる必要（例えば、１つあるいはそれ以上の追加の継代が必要とされる）が有り得ることを理解するだろう。

１つの実施形態では、第一のインキュベーション時間は０～４細胞継代にすることもできる。第一のインキュベーション時間が０継代の場合、第一のインキュベーション工程は完全にスキップされることを理解すべきである。別の実施形態では、第一のインキュベーション時間は、培養において、１つの集団が倍増するのに必要とされる時間数（例えば約２０から４８時間）から約７００時間の期間である。１つの実施形態では、第二のインキュベーション時間は１から８細胞継代の間であっても可能である。さらなる実施形態では第二のインキュベーション時間は、培養において、１つの集団が倍増するのに必要とされる時間数（例えば約２０から４８時間）から約２５００時間の期間である。例えば、細胞は１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０中、ＣＯ_２濃度０.０３％の雰囲気下で４継代を経ることが可能である。当業者であれば、必要であればいずれかのインキュベーション工程中にＣＯ_２濃度の調整が可能であることを理解するだろう。

「継代」とは、希釈の有無にかかわらず、１つの培養フラスコから新鮮な培養培地を含む別の培養フラスコに細胞を再分配することと理解されるべきである。例えば単一の細胞継代は以下を含むことができる：
（１）培養フラスコの表面上に細胞を播種すること（例えば１７５ ｃｍ^２の表面積上におよそ２.０×１０^６個の細胞）；
（２）培養培地を追加すること（例えばＲＰＭＩ－１６４０）；
（３）特定のＣＯ_２雰囲気の設定；
（４）適正な温度（例えば３７℃）に設定されたインキュベーターに培養フラスコを入れる；
（５）培養フラスコ内の細胞を所定の期間（「所定の培養期間」）維持する；
（６）細胞増殖のために、必要に応じて新鮮な培養培地を供給する；そして
（７）細胞の剥離および再播種。

各継代について、細胞は所定の培養期間が約３０～７００時間の培養培地中で維持される。１つの実施形態では、所定の培養期間は９６時間未満である。別の実施形態では所定の培養期間は約９６～１６８時間である。さらに別の実施形態では、所定の培養の期間は１６８時間を超える。さらに、所定の培養期間は細胞コンフルエントに基づくことができる。１つの実施形態では、所定の培養期間は、細胞がおよそ５０％コンフルエントに達するのに必要な時間である。別の実施形態では、細胞がおよそ５０％から７０％コンフルエントの間に達した後に、細胞を継代する。さらなる実施形態では、細胞がおよそ７０％コンフルエントに達した後に、細胞を継代する。

ｈｂ－ＭＳＣ株は、任意の数の次元（Ｄ）で細胞を培養することによって分離される。例えば、細胞は、ビーズ（０Ｄ）、単層（２Ｄ）あるいは３Ｄ足場を用いて培養することができる。ｈｂ－ＭＳＣ株はまた、様々なシステムを用いて分離することも可能である。ｈｂ－ＭＳＣ株は、オープンコンテナシステムあるいはクローズドコンテナシステム、またはそれらの組み合わせを用いて分離され得る。１つの実施形態では、ｈｂ－ＭＳＣ株はクローズドコンテナシステムを用いて分離することができる。クローズドコンテナシステムでは、細胞培養フラスコは非透過性の蓋で閉鎖され、添加ＣＯ_２へのアクセスを防ぐことができる。別の実施形態では、ｈｂ－ＭＳＣ株は、ＣＯ_２濃度の制御が可能な細胞培養室内のオープンフラスコを用いて分離することができる。別の実施形態において、ｈｂ－ＭＳＣ株は、ＣＯ_２濃度の制御ができる細胞培養室内で、ガス透過性膜で封をしたフラスコ内で分離することができる。

当業者であれば、上記で挙げた様々な細胞培養方法は、単に例として提供されているものであり、いかなる請求項の範囲をも制限する目的で使用されるものではないと理解するだろう。当業者は、手順、インキュベーション期間、培養期間、培地、血清またはＣＯ_２濃度および他の変化要素は、培養中の細胞の挙動を考慮に入れ変化させる必要が有ることを理解するだろう。

本発明の別の実施形態は、固有のｈｂ－ＭＳＣ株に関する。細胞表面マーカー発現は、この株の間葉性の識別に利用できる。細胞表面マーカーは、例えばフローサイトメトリーを含む任意の適切な方法を用いて確認することができる。実施例４に記載され図１で示されているようにｈｂ－ＭＳＣを得る方法は、ｈｂ－ＭＳＣの表面マーカーに変化をもたらさず、ｈｂ－ＭＳＣが、ラット骨髄間葉系幹細胞のものと一致する表面マーカーを示すという結論を導くことができる。

図２は継代Ｎｏ.９（ｐ９）のｈｂ－ＭＳＣからのギムザ染色された染色体を図示する。図３はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析の結果を示す。ＣＯＸ－１とＶＮ１Ｒ１遺伝子をラットミトコンドリアおよび核ＤＮＡのマーカーとしてそれぞれ利用した。継代Ｎｏ.９では、核型は、正常２倍体（すなわち２ｎ=４２）である。以下の実施例１に記載するように、細胞株のＰＣＲ分析は、これらがラット細胞であることを確認した。当業者は、細胞の核型分析が細胞の遺伝的安定性を確認するならば、細胞は任意の数の継代で維持し得ることを理解するだろう。

ｈｂ－ＭＳＣ株は、多くの様々な特徴付け方法を用いて示すことが可能なように、ラットから得られた幹細胞の他の株とは著しく異なる。標準条件下で得られたラットの間葉系幹細胞を培養して、典型的なラット間葉系幹細胞と固有のｈｂ－ＭＳＣ株との間の相違を示した。この比較目的で調製した典型的なラット間葉系細胞株をｒｂ－ＭＳＣ株と名付けた。ｒｂ－ＭＳＣ株を得るため、ｐ１ラット間葉系細胞を、実施例２に記載したように、当技術分野で公知の標準条件に従い継代した。

実施例７（および図６）は、ｈｂ－ＭＳＣとｒｂ－ＭＳＣ株との間の培地ｐＨの差異を示し、これは２つの株を区別するために使用することができる。別の比較において、ｈｂ－ＭＳＣ株は、培養中の乳酸塩の総濃度によってｒｂ－ＭＳＣ株と区別することができる。ｈｂ－ＭＳＣ株をｒｂ－ＭＳＣ株から区別する別の方法は、実施例８（および表３に示す）で説明するように、それぞれの株によって調整された培地中に見られる種々の因子を比較することである。もちろん、ｈｂ－ＭＳＣ株はまた、当業者に公知の他の方法によって特徴付けることもできる。

本発明の実施形態は、ｈｂ－ＭＳＣから分化した細胞または細胞株にも関連している。細胞株は、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、または他の細胞を含むことができる。脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞に分化する方法は、当技術分野において公知である。幹細胞株を遺伝子改変するための方法も公知である。遺伝子改変ｈｂ－ＭＳＣから作製された幹細胞株、および遺伝子改変ｈｂ－ＭＳＣから分化した任意の細胞株も、本発明の範囲内である。

当業者は、ｈｂ－ＭＳＣを特徴付ける様々な方法は、説明目的のためにのみ提供されることを理解している。ｈｂ－ＭＳＣの実施形態は、開示された様々な特徴付け方法のそれぞれを満たす必要はなく、いくつかの実施形態は、本明細書に開示される１つまたは複数の特徴付け方法のみを満たすことができる。

本発明の１つの実施形態は、以下で「ｈｂ－ＭＳＣ馴化培地」と呼ばれるｈｂ－ＭＳＣによって調整された培養培地に関連している。１つの実施形態において、馴化培地は以下の工程により生産される；（１）複数のｈｂ－ ＭＳＣを適切なフラスコに播種する；（２）培養培地を供給する；（３）調整期間中培養培地中でｈｂ－ＭＳＣを維持する；（４）馴化培地を採取する。馴化期間は数時間、数日、または数週間であってもよく、その間に培養培地は生物学的生産物が豊富になる。適切な時に（例えば、増殖因子、タンパク質および小胞などの生物学的生産物が培地中で望ましいレベルに達するように培地を調整した後）、馴化培地を採取することができる。例えば、馴化培地は、ｈｂ－ＭＳＣが、３、６、２４、３０、４８、５４、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０、２６４、２８８、３１２または３６６時間、または他の期間培養された後に、採取することができる。ｈｂ－ＭＳＣを培養することによって得られた馴化培地は、無菌条件下で処理されるか、必要に応じて滅菌される。当業者は、培養に使用されるフラスコへの細胞の付着以前の馴化培地の採取は、増殖培地からの細胞の除去をもたらし、それは用途によっては好ましくないことを理解するでしょう。

１つの実施形態では、ｈｂ－ＭＳＣは、馴化培地を除去した後にｈｂ－ＭＳＣに培養培地を追加することによって、追加培地を調整するために再使用することができる。当業者は、細胞が再利用され得る回数が、培地を調整するために使用される時間ならびに細胞コンフルエントに依存することを理解しているだろう。異なった時間経過後に採取されたｈｂ－ＭＳＣ馴化培地（例えば、３、６、２４、３０、４８、５４、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０、２６４、２８８、３１２または３６６時間、または他の時間）、単一継代培養内においてｈｂ－ＭＳＣを再使用して採取された馴化培地、ｈｂ－ＭＳＣの異なる継代から集められた培地は、単一のｈｂ－ＭＳＣ馴化培地を形成するために組み合わせることができるということを理解すべきである。

任意の細胞によって調整された培地は、培養中に分泌、排出、放出、または他の方法で産生される様々な生物学的生産物を含み得る。例えば、馴化培地は、増殖因子、抗炎症因子、シグナル伝達因子、ホルモン、調節因子、酵素、エキソソームを含む小胞、または任意の他の化合物などの生物学的生産物を含む。細胞培養方法および培地のｐＨは、細胞によって放出される生物学的生産物のタイプおよび量に影響を及ぼす。最初に播種された細胞の濃度は、馴化培地中に存在する生物学的生産物の量に影響することも理解されるべきである。添加血清の追加は、血清が一定量の種々の生物学的生産物を含むので、調整前の培地中の因子の初期濃度に影響を及ぼすことも理解されるであろう。ｈｂ－ＭＳＣによって調整された培地中のこれらの因子の濃度を測定すると、この培地はｒｂ－ＭＳＣによって調整された培地と有意に異なることが示される。市販のアッセイを用いて、細胞によって産生される因子の濃度を測定することができる（例えば、ＥＭＤ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅまたはＥｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なアッセイ）。正確な測定は、アッセイにおいて使用される抗体対に依存することになり、従って、検出される因子の濃度は、使用されるアッセイまたは測定技術に依存して変化し得ることを理解すべきである。実施例８には、特定の期間におけるｒｂ－ＭＳＣおよびｈｂ－ＭＳＣ株の因子濃度の比較を示す。

１つの実施形態では、馴化培地は、一般的に培地製造業者によって決定されている通り、培地の緩衝能に対して処方されたＣＯ_２濃度でｈｂ－ＭＳＣを維持することによって形成することができる。ＲＰＭＩ－１６４０培地の場合、規定のＣＯ_２濃度は５％である。別の実施形態では、馴化培地は、一般的に培地製造業者によって規定されている通り、培地の緩衝能に対して処方されたＣＯ_２濃度から少なくとも５０％低減されたＣＯ_２濃度でｈｂ－ＭＳＣを維持することによって形成することができる。別の実施形態では、馴化培地は、ｈｂ－ＭＳＣを大気中のＣＯ_２濃度（すなわち、ＣＯ_２濃度０.０３％）で維持することによって形成することができる。

１つの実施形態では、馴化培地は、ｈｂ－ＭＳＣを大気中のＯ_２濃度（すなわち、１７％）で維持することによって形成することができる。別の実施例では、馴化培地は、１０％未満に減少したＯ_２濃度でｈｂ－ＭＳＣを維持することによって形成することができる。別の実施形態では、馴化培地は、２％未満に減少したＯ_２濃度でｈｂ－ＭＳＣを維持することによって形成することができる。例えば生体内の骨髄環境を模倣するために、低濃度のＯ_２（低酸素状態）を使用することができる。

いくつかの実施形態では、馴化培地は濃縮形態で使用可能である。例えば、馴化培地は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて１～１００倍の濃度で濃縮することができる。必要とされる適切な濃度は、馴化培地の用途に依存する。

１つの実施形態では、採取された生の馴化培地をさらに処理して、特定の生物学的生産物を添加／除去、および／または濃縮／希釈する。生産物の分離および精製に使用される方法は、最適な生物学的活性が維持されるように選択されるべきである。例えば、成長因子、調節因子、ペプチドホルモン、抗体、エキソソームまたは任意の他の所望の生物学的化合物を精製することが望ましい。上記を実施する方法としては、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、または遠心分離が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、馴化培地中に存在するエキソソームまたは任意の他の小胞は、馴化培地中で濃縮することができるか、馴化培地から除去することができる。

別の実施形態では、馴化培地を凍結乾燥することができる。凍結乾燥された馴化培地は、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、細胞培養培地、調整された細胞培養培地、水、またはそれらの混合物を、これらに制限されることなく含む任意の適切な希釈剤を利用して再構成することができる。馴化培地は、元の馴化培地と同じ濃度で再構成が可能である。別の実施形態では、凍結乾燥された馴化培地は、濃度係数が１～１００の範囲で変化する、元の馴化培地と比較して、より濃縮された形態で再構成が可能である。

ｈｂ－ＭＳＣ株は、多種多様な培地を調整するために使用することができる。いくつかの実施形態では、培養培地に追加の胎児血清、および／または、血漿を添加することが可能である。１つの実施形態では、培地を２０％ＦＢＳ存在下にて調整する。別の実施形態では、培地を１０％ＦＢＳ存在下にて調整する。別の実施形態では、培地を７％ＦＢＳ存在下にて調整する。別の実施形態では、培地を３％ＦＢＳ存在下にて調整する。別の実施形態では、培地はＦＢＳ非存在下にて調整する。他の実施形態では、細胞が特定のコンフルエントに達した後、低血清または無血清馴化培地を形成するために、低濃度の血清または無血清培地を代わりに使用することができる。

本発明の他の実施形態は、ｈｂ－ＭＳＣ組成物に関連している。ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、ｈｂ－ＭＳＣ、ｈｂ－ＭＳＣ馴化培地、またはそれらの組み合わせを含み得る。ｈｂ－ＭＳＣ組成物は適切な担体をも、含み得る。ｈｂ－ＭＳＣ組成物中のｈｂ－ＭＳＣ馴化培地の総量は、０.００００１～９９.９９容積％の間で変動する可能性がある。

ｈｂ－ＭＳＣ組成物の実施形態は、ｈｂ－ＭＳＣ、ｒｂ－ＭＳＣ、または培地の用途／目的に基づいて選択された他の細胞と組み合わせたｈｂ－ＭＳＣ馴化培地を含み得る。例えば、ｈｂ－ＭＳＣ組成物に添加することができる細胞は、自己細胞、同種異系細胞または異種細胞を含み得る。

異なる実施形態では、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、任意の他の馴化培地または所望の比率の訓化培地の任意のコンビネーションを組み合わせた、ｈｂ－ＭＳＣまたはｈｂ－ＭＳＣ馴化培地を含む。ｈｂ－ＭＳＣ組成物はまた、自己細胞、同種異系細胞または異種細胞によって調整された培地と組み合わせた、ｈｂ－ＭＳＣまたはｈｂ－ＭＳＣ馴化培地を含む。別の例では、ｈｂ－ＭＳＣ馴化培地を、ヒト間葉系幹細胞により調整された培地と組み合わせることができる。

ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、バクテリア、ウイルス、マイコプラズマ、または菌類による汚染のない状態に保たなくてはならない。１つの実施形態では、この状態は、細胞培養および処理中の滅菌処理条件によって達成される。別の実施形態において、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、あるレベルの抗菌活性を提供するための医薬防腐剤を含有する。いくつかの実施形態では、防腐剤は、溶液のコンタミネーションによって引き起こされる二次細菌感染、真菌感染、またはアメーバ感染を制限することができる。他の実施形態では、防腐剤の付加は、腐敗を防ぎ潜在能力を維持することによって、ｈｂ－ＭＳＣまたはｈｂ－ＭＳＣ馴化培地の貯蔵寿命を延ばす。非限定的な例として、防腐剤は、洗剤、酸化剤、キレート剤、または五価アンチモン、第四級アンモニウムおよび有機水銀を含む代謝阻害剤を含有できる。防腐剤の例としては、チメロサール、クレゾール、ホルマリン、塩化ベンザルコニウムまたはベンジルアルコールが含まれる。

さらに別の実施形態において、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、抗炎症剤、抗菌剤、鎮痛剤、抗真菌剤、殺菌剤、消毒剤、ビタミン剤、日焼け止め剤、抗生物質、抗遊離基剤、金属イオン封鎖剤、塩基性化または酸性化剤、香料、界面活性剤、賦形剤、天然産物または天然産物の抽出物を添加することができる。添加物には、有機小分子、有機金属化合物、ポリマー、無機塩、タンパク質、成長因子、ケモカイン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または酵素を含むことができる。さらなる実施形態では、培地には、糖、タンパク質、インスリン、シグナル伝達タンパク質、または着色剤、香料または甘味料を含む任意のさらなる小分子が添加できる。添加物にはまた、等張性または化学的安定性を高める物質のような少量の添加物を含むことができる。

当業者は、ｈｂ－ＭＳＣ組成物のための適切な担体が、例えば、液体、クリーム、エアゾール、ローション、軟膏またはヒドロゲルを含むことを理解するだろう。これらの担体は、水性添加剤（培地を含む）、非水性添加剤、油、標準脂肪物質、通常のゲル化剤、緩衝剤、増粘剤、懸濁剤、乳化剤、保湿剤、皮膚軟化剤、親水性または親油性の活性剤の添加を基にしている。これらの様々な成分の量は、ｈｂ－ＭＳＣ組成物の用途および所望の効果に依存して変化するだろう。当然のことながら、当業者は、「適切な担体」は、２つ以上の担体、および／または、他の成分の混合物を含むことを理解するだろう。

本明細書において開示されるｈｂ－ＭＳＣ組成物は、任意の研究、診断、治療または商業目的を含み、且つこれらに限定されない様々な目的のために使用することができる。ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、例えば、火傷治療、スキンケア、血管新生、脈管形成、臓器または組織の治癒、化粧品、組織炎症、細菌感染症、創傷適用、糖尿病、薬学および眼科学用途、瘢痕の削減、育毛促進、免疫療法の用途と免疫矯正療法、皮膚や骨髄または臓器の移植、臓器や組織の治療、もしくはヒトまたは動物の他の病気の治療のために使用することができる。

ここで言う「治療」とは、疾患、障害または症状、またはその任意の指標もしくは徴候の、治癒、治療、改善、重症度の軽減、または経時的な減少を含む。ｈｂ－ＭＳＣまたはｈｂ－ＭＳＣ馴化培地は、ｈｂ－ＭＳＣ組成物と同じまたは類似の目的のために使用できることを理解すべきである。

ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、皮膚科学的または美容的用途、食品添加物または動物飼料添加物、細胞の培養、および医薬用途にも使用することができる。ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、予防的治療、急性傷害に応じて、または慢性的な傷害の治療に使用することができる。１つの実施形態では、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、ヒトの病気または症状の治療のために使用される。別の実施形態において、治療には、獣医学的な用途が含まれる。

１つの実施形態では、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、皮膚創傷、骨折、胃潰瘍または糖尿病性潰瘍、膵臓、肝臓、腎臓、脾臓、血管の損傷および、熱傷の治癒のような、他の内的または外的な傷口を含む創傷の治療に好適に使用することができる。例えば、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、実施例５に記載され、図４および図５に示されるように、創傷治癒の促進、加速のための局所適用において使用することができる。別の実施形態において、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、外科的切除またはドレナージを必要とする創傷を治療するために使用することができる。例えば、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、創傷組織の灌流の増加をもたらし得る。

ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、目尻のしわ、眉間のしわ、瘢痕の処置を含む、皮膚の美容処置や、紫外線や加齢によって誘発される有害な作用に起因するような他の皮膚状態を修復する目的で使用することができる。

ｈｂ－ＭＳＣ組成物の送達は、当技術分野における公知の方法で行うことができる。例えば、送達のためのいくつかの実施形態は、部位特異的、局所的、経口的、経鼻的、静脈内、皮下、皮内、経皮、筋肉内または腹腔内投与であり得る。さらなる実施形態において、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、制御された徐放性媒体における使用のために製剤化される。

特定の場合に適用されるｈｂ－ＭＳＣ組成物の実際の好適な量、投与様式、および投与間隔は、利用される特定の組成物、処方される特定の組成物、適用様式、特定の傷害、治療される患者に応じて変化することが認識される。各特定の症例の投薬量は、従来の考察、例えば、適切な従来の薬理学的プロトコルを用いて決定され得る。薬学的化合物の用量を決定する技術に熟練した医師および調剤者が、適切な用量を決定できる。

ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、任意の状態で使用することができる。例えば、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、錠剤、カプセル、皮膚パッチ、吸入器、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、液状洗浄剤、坐剤、ローション、クリーム、軟膏、注射剤、ゲル、ヒドロゲル、薄膜、パウダー、美容液、膏薬、ファンデーション、フェーシャルマスク、リップケア製品、日焼け止め、シャンプー、ディープコンディショナーを含むコンディショナー、ヘアトリートメントなどのヘアケア製品、肌用クレンジング剤、スクラブ剤、コンパクト製剤、またはその他当業者の公知の任意の形態にすることが可能である。

いくつかの実施形態において、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、縫合糸、医療器材、または移植器具をコーティングするために使用することができる。別の実施形態では、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、縫合糸、包帯、インプラント、ステント、移植組織、または歯周塗布薬と組み合わせることができる。ｈｂ－ＭＳＣ組成物はまた、ウェットワイプで使用することも可能である。ｈｂ－ＭＳＣ組成物はまた、創傷治癒を促進するために、創傷充填材として添加してもよく、既存の創傷充填組成物に添加されてもよい。別の実施形態では、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、アイシャドー、ケーキ状ファンデーション、コンパクトまたは他の化粧品に添加することもできる。

さらなる実施形態では、ｈｂ－ＭＳＣ組成物の液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとることができ、あるいは、使用前に適切な担体を用いて構成するための乾燥生成物として提供することが可能である。

別の実施形態において、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、一定期間、凍結することができる。あるいは、ｈｂ－ＭＳＣ組成物を一定時間凍結乾燥し、かつ冷凍保存することができる。あるいは、上記のようにｈｂ－ＭＳＣ組成物を再構成し、一定期間冷凍保存することができる。あるいは、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、室温（例えば、約２８℃）と０℃との間の温度で貯蔵、保存することができる。使用される温度範囲は排他的なものではなく、当業者は用途の性質に応じて利用される代替の温度範囲を想定することができる。

別の実施形態では、使用前にｈｂ－ＭＳＣ組成物を室温にすることができる。あるいは、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、室温より低い温度で適用することができる。あるいは、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、温度が生物学的材料を変性させるに十分なほど高くない限り、室温より高い温度で利用することができる。

以下の実施例は、本発明の特定の実施形態の実証のために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明者によって見出されたものであり、本発明の特定の実施形態を実施するための方法を構成すると考えられることは、当業者には理解されるべきことである。しかしながら、当業者であれば、本開示の観点から、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、以下の実施例に多くの変更を加えることができることを理解するべきである。

（実施例１） ― ｈｂ－ＭＳＣ細胞の種の識別
ＰＣＲ分析を使用して、細胞が実際にラット由来であることを確認した。ＰＣＲ分析のために、ＣＯＸ－１およびＶＮ１Ｒ１遺伝子をそれぞれミトコンドリアおよび核ＤＮＡのために用いた。多重ＰＣＲ法を用いてＣＯＸ－１遺伝子の増幅を行い、標準ＰＣＲを用いてＶＮ１Ｒ１遺伝子の増幅を行った。３８歳のヒト男性、３２歳のヒト女性およびウィスターラットからの血液サンプルを対照として使用した。市販のキット（ＰＲＥＰ－ＧＳ－ＧＥＮＥＴＩＣＳ、ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ロシア）を製造業者の指示に従って使用し、細胞培養物からＤＮＡを分離した。全てのプライマーは市販されており、Ｅｖｒｏｇｅｎ ＬＬＣ社から購入した。

ＰＣＲ分析に用いた特異的プライマーは以下の通り：
・ ＣＯＸ１－ｈｕｍａｎ:
ｆ`－ＴＡＧＡＣＡＴＣＧＴＡＣＴＡＣＡＣＧＡＣＡＣＧ
および
ｒ`－ＴＣＣＡＧＧＴＴＴＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＣ
・ＣＯＸ１－ｒａｔ:
ｆ`－ ＣＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＧＴＡＣＡＴＣ
および
ｒ`－ ＧＧＣＴＣＧＧＧＴＧＴＣＴＡＣＡＴＣＴＡＧＧ
・ＶＮ１Ｒ１－ｈｕｍａｎ:
ｆ`－ＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＣＴＣＣ
および
ｒ`－ＧＡＧＴＧＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡ
・ＶＮ１Ｒ１－ｒａｔ:
ｆ`－ ＡＧＡＡＧＡＧＴＴＡＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡ
および
ｒ`－ＧＧＧＧＣＴＧＡＡＣＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣ

ＰＣＲ産物の電気泳動は、ＳｕｂＣｅｌｌＧＴ電気泳動システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を利用して２％アガロースゲル上で行った。ＥＣＸ－Ｆ１５.Ｃ（Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ社）トランスイルミネーターを用いてゲルを視覚化した。電気泳動図を図３に示す。具体的には、図３において、レーン１~５はＣＯＸ１遺伝子塩基対を示す。レーン１は対照ヒトＤＮＡの結果を示し、レーン２は対照ラットＤＮＡの結果を示す。レーン３および４は、ｈｂ－ＭＳＣサンプルの結果を示す。レーン５は陰性対照を示す。レーン７～１０はＶＮ１Ｒ１遺伝子塩基対を示す。レーン１０は対照ヒトおよび対照ラットＤＮＡの混合物を示す。レーン９および７は、ｈｂ－ＭＳＣサンプルの結果を示す。レーン８は陰性対照である。「Ｍ」はＤＮＡ断片マーカーレーンを意味する。電気泳動により、ｈｂ－ＭＳＣがラットから分離され、ヒト細胞由来の物質で汚染されていないことが確認された。

（実施例２） － ｒｂ－ＭＳＣの培養
標準的な条件下で得られたラット間葉系幹細胞を培養し、固有の分離されたｈｂ－ＭＳＣ株と典型的なラット間葉系幹細胞（ｒｂ－ＭＳＣ）との間の差異を示すために評価した。

ｒｂ－ＭＳＣ株およびｈｂ－ＭＳＣ株の両方を、ウィスターラット脛骨または大腿骨の骨髄から採取した初代細胞から分離した。全ての細胞の培養はＧＭＰ条件下で行った。１つの実施形態では、初代細胞を得るための手順は以下の通りである。動物を麻酔し、安楽死させた。滅菌条件下で、各ラットの大腿骨および脛骨の両方を切除した。骨髄は、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＭＥＭ－Ｅａｒｌｅ培地で洗浄することによって押し出した。骨髄充填物の懸濁液をピペットで分散し、７０μｍメッシュのナイロンフィルターで連続的に濾過し、２００Ｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを培地に再懸濁した。１匹のラットの細胞をプラスチックフラスコに播種し、３７℃、ＣＯ_２濃度５％の加湿雰囲気下でインキュベートした。３日目に、赤血球および他の非接着性細胞を除去し、新鮮な添加培地を加えてさらなる増殖を可能にした。７０％コンフルエントに成長した接着性細胞を初代培養細胞（ｐ１）と定義した。

ｒｂ－ＭＳＣ株を得るために、ｐ１ラット間葉系細胞を、当技術分野で公知の標準的な条件に従って、ＲＰＭＩ－１６４０について規定した製造者の指針に従って継代した。ｐ１細胞をＣａ^２+-Ｍｇ^２+フリーの、ハンクス溶液（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｈ９３９４－５００ｍｌ）で洗浄し、０.２５％トリプシンＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｔ４４２４－１００ｍｌ）と３７℃で５～１０分間インキュベートすることにより剥離した。次に、５％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｆ６７６５）補充ハンクス溶液を添加して、トリプシンを不活性化した。細胞を２００Ｇで１０分間遠心分離し、１５％ＦＢＳを添加した１～２ｍｌのＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁し、ノイバウエル計算盤を備えた血球計数グリッドを用いて手作業で計数した。次に、１５％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｆ６７６５）、１００単位／ｍｌペニシリン－１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｐ４４５８）、１００ｎｇ／ｍｌアムホテリシン（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ａ２９４２）、２ｍＭ Ｌグルタミン（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｇ７５１３）、ＲＰＭＩ－１６４０培地用０.００５ｍｌ／ｍｌビタミン（１００ｘ）（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｒ７２５６）、ＲＰＭＩ－１６４０培地用０.００５ｍｌ／ｍｌアミノ酸（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｒ７１３１）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｒ５８８６）を用いて、細胞を１.０×１０^６細胞／フラスコの密度で７５ ｃｍ^２フラスコにｐ２として播種した。透過性の無菌フィルターキャップを有するフラスコを、ＣＯ_２濃度５％雰囲気の加湿インキュベーター内で、３７℃でインキュベートした。１０～１４日の期間にわたり、または７０％コンフルエントに達するまで、ＲＰＭＩ－１６４０培地（１５％ＦＢＳを添加）を３日ごとに交換した。継代Ｎｏ. ２（ｐ２）の後、細胞を１７５ ｃｍ^２フラスコに２×１０^６個細胞／フラスコの密度で播種し、ＦＢＳを１０％添加したＲＰＭＩ－１６４０を使用した。その後の継代培養ごとに、細胞を同様に播種し、７０％コンフルエントまで増殖させた。７０％コンフルエントの後、細胞を分配し、プラスチック培養フラスコ内に再播種した。継代５（ｐ５）ｒｂ－ＭＳＣをｈｂ－ＭＳＣ株との比較として用いた。

（実施例３） － ｈｂ－ＭＳＣの培養
ｈｂ－ＭＳＣ株を得るために、ｐ１ラット間葉系細胞を以下の手順に従って培養した。最初に、ｐ１細胞をＣａ^２+-Ｍｇ^２+フリーのハンクス溶液（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｈ９３９４－５００ｍｌ）で洗浄し、０.２５％トリプシンＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｔ４４２４－１００ｍｌ）と共に、３７℃で５～１０分間インキュベートすることにより剥離した。次に、５％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｆ６７６５）添加ハンクス溶液を加え、トリプシンを不活性化した。細胞を２００Ｇで１０分間遠心分離し、１５％ＦＢＳを補充した１～２ｍｌのＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁し、ノイバウエル計算盤を備えた血球計数グリッドを用いて手作業で計数した。次に、１５％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｆ６７６５）、１００単位／ ｍｌペニシリン－１００μｇ／ ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｐ４４５８）、１００ｎｇ／ｍｌアムホテリシン（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ａ２９４２）、２ｍＭ Ｌグルタミン（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｇ７５１３）、ＲＰＭＩ－１６４０培地用０.００５ｍｌ／ｍｌビタミン（１００ｘ）（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｒ７２５６）、ＲＰＭＩ－１６４０培地用０.００５ｍｌ／ｍｌアミノ酸（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｒ７１３１）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｒ５８８６）を用いて、７５ ｃｍ^２フラスコに１.０×１０^６個細胞／フラスコの密度で細胞をｐ２として播種した。透過性の無菌フィルターキャップを有するフラスコを、ＣＯ_２濃度５％雰囲気の加湿インキュベーター内で、３７℃でインキュベートした。ＦＢＳを１５％添加したＲＰＭＩ－１６４０培地を、１０～１４日の期間にわたり、または７０％コンフルエントに達するまで、３日ごとに交換した。

継代Ｎｏ. ２（ｐ２）に続いて、細胞を１７５ ｃｍ^２フラスコに２×１０^６個細胞／フラスコの密度で播種し、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ－１６４０を使用した。培養物は、ＣＯ_２濃度５％雰囲気の加湿インキュベーター内で、３７℃で培養を続けた。第３継代（ｐ３）に続いて、ＣＯ_２濃度を下げて細胞を継代した。ＣＯ_２濃度を低下させるために、培養フラスコを大気ＣＯ_２条件下で非透過性キャップにより密封し、３７℃でインキュベートした。以下のすべての継代で添加ＣＯ_２は使用しなかった。先述した通り、ＦＢＳを１０％添加した新鮮なＲＰＭＩ－１６４０培地を添加し、約１４日の期間にわたり３日または４日ごとに交換した。各継代について、細胞を同様に播種し、７０％コンフルエントまで増殖させた。７０％コンフルエントの後、細胞を分配し、プラスチック培養フラスコ内に再播種した。継代９（ｐ９）ｈｂ－ＭＳＣをｒｂ－ＭＳＣと比較した。ＰＣＲ分析（Ｎａｎｏｄｉａｇｏｓｔｉｋａ ＬＬＣ社、ＲＵＳ）は、ｈｂ－ＭＳＣがバクテリア、ウイルス、マイコプラズマ、または菌類による汚染がないことを確認した。

ｈｂ－ＭＳＣ株は、１０％ＤＭＳＯおよび５０％ＦＢＳ培地を用いて、２ミリリットル（ｍｌ）アンプル中３.０×１０^６～５.０×１０^６個細胞濃度で、液体窒素温度で保存した。

（実施例４） － ｈｂ－ＭＳＣのフローサイトメトリーの特徴付け
ｈｂ－ＭＳＣおよびｒｂ－ＭＳＣ株の細胞表面マーカーを識別するために、フローサイトメトリー実験を行った。この実験の目的のために、５０μｌの対応する抗体を１００μｌの細胞懸濁液に添加した。懸濁液を５秒間、高速旋回攪拌（ＢｉｏＶｏｒｔｅｘＶ１、ＢｉｏＳａｎ）し、光を遮断した状態で+４℃で３０分間静置した。インキュベーション後、混合物を５００μｌの食塩水で希釈し、遠心分離により２回洗浄して過剰の試薬を除去した。各遠心分離は４００Ｇで１０分間（ＥＬＭＩ）行った。各サンプルにおいて、少なくとも１０,０００カウントを分析した。ＷｉｎＭＤＩ２.７分析プログラムを用いて分析した結果を、図１に示す。ｒｂ－ＭＳＣおよびｈｂ－ＭＳＣ株によって発現される表面マーカーの概要を以下の表１に示す。

典型的な骨髄ラット間葉系細胞は、ＣＤ４４とＣＤ２９マーカーの陽性発現および、ＣＤ４５とＣＤ１１ｂマーカーの陰性発現を示す。上記表１に示すように、ｈｂ－ＭＳＣ株は、ラットの骨髄間葉系幹細胞の表面マーカーと一致する表面マーカーを示す。これは、ｈｂ－ＭＳＣを得る方法により、細胞の表面マーカーが変化しないことを実証している。

（実施例５） － 創傷閉鎖の形態計測学的研究
形態計測学的研究を、実験用マウスの創傷治癒過程を追跡するために行った。すべての動物実験は、Ｋ.Ｉ. Ｓｃｒｉａｂｉｎにちなんで命名されたモスクワ州獣医学および生物工学アカデミーの獣医手術部門で行われた。全ての実験には、生後３～５ヶ月、体重が約２２～２５グラムの白色の実験用マウスを使用した。各実験で合計６匹のマウスを使用した。各麻酔された動物の新たに剃毛された肩甲骨領域を直径約０.５ｃｍの大きさで切開した。切開後、動物を１群あたり３匹のマウスで対照およびサンプル群に分類した。それぞれの創傷を撮影して、デジタル形態計測パラメータを得た。切開３０分後に、各創傷をＲＰＭＩ－１６４０またはｈｂ－ＭＳＣ組成物の５０μｌ滴で処置した。この実施例では、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、実施例８に記載のようなｈｂ－ＭＳＣ馴化培地を含み、異なる調整時間（９６、１４４、１９２、２１６、２４０、２６４および２８８時間）ごとに採取された馴化培地は一つの容器にまとめられた。組成物はまた、防腐剤としての塩化ベンザルコニウム（ＢＥＫ）、および界面活性剤としてのトリトンＸ－１００を含んでいた。創傷サイズを１５日間、毎日１回測定した。ｈｂ－ＭＳＣ組成物およびＲＰＭＩ－１６４０を、創傷評価後、１日１回、各群の各動物に適用した。ｈｂ－ＭＳＣ組成物およびＲＰＭＩ－１６４０培地で処置した創傷の比較治癒過程を示すデジタル画像を図４に示す。図４は、処置後１日目の対照群（ＲＰＭＩ－１６４０で処置した）のマウス、および処置後９日目の同じマウスを示す。図４はまた、処置の１日目のサンプル群（ｈｂ－ＭＳＣ組成物で処置した）のマウス、および処置後９日目の同じマウスを示す。ｈｂ－ＭＳＣ組成物対ＲＰＭＩ－１６４０を用いた平均創傷サイズに対する処置の効果を図５に示す。

（実施例６） － ｈｂ－ＭＳＣ組成物の治療効果
ｈｂ－ＭＳＣ組成物の治療効果をテストするために、実験は、イヌ（６５+）、ネコ（８０+）、ウマ（４０+）、家畜（２５+）、げっ歯類（２００+）、鳥類（１５+）など、様々な動物に実施された。ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、上記の実験被検体における様々な状態を治療するために使用された。本実施例で用いたｈｂ－ＭＳＣ組成物は、実施例５と同様のものであった。これらの治療法には以下のものが含まれる:
１）手術後の切開部位を含む創傷適用；
２）化学火傷を含む火傷の処置；
３）糖尿病性潰瘍を含む潰瘍；
４）瘻；
５）化膿炎症、結膜炎、角膜炎、乳腺炎、蜂窩、胃炎、皮膚炎を含む組織の炎症や細菌感染症；
６）骨折を含む整形外科適用、また；
７）皮膚、靭帯、筋肉組織を含む様々な組織の治療。
実験では、以下の方法で、ｈｂ－ＭＳＣ組成物を送達した：局所、経口、経鼻、静脈、皮下、皮内、経皮、筋肉内および腹腔内。また、ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、エアゾールとして滅菌ナプキンを使用し、患部に直接適用した（乳頭ディップカップを含む）。ｈｂ－ＭＳＣ組成物は、上記のすべての状態の治療に有効で、再生効果改善、創傷閉鎖速度、炎症および局所細菌の転移増殖の著しい減少、抗菌作用、血管新生および脈管形成、組織の瘢痕の減少と患部の毛包の修復を示した。これらの実験で示された実質的な再生効果は、実施例５で説明したマウス創傷実験の結果と一致した。いずれの場合も、動物はｈｂ－ＭＳＣ組成物で治療した後、健康状態を維持した。すべてのケースにおいて、毒性、刺激、感作と生体内蓄積が評価された。ｈｂ－ＭＳＣ組成物の投与から３０日以内の全動物に対する全追跡指標は、血液検査によって評価されたように正常範囲内に留まった。腎臓、肝臓、肺、脾臓、腸、軟組織の組織像は、ｈｂ－ＭＳＣ 組成物の適用による急性または慢性毒性の兆候を示さなかった。また、アレルギー反応、感染症、または他の副作用が記録された実例もなかった。
まとめると、これらの実験によって、火傷治療、スキンケア、血管新生、脈管形成、臓器または組織の治癒、化粧品、組織炎症、細菌感染症、創傷適用、糖尿病、薬学および眼科学用途、瘢痕の削減、育毛促進、免疫療法の適用と免疫矯正療法、皮膚や骨髄または臓器の移植、臓器や組織の治療、またはその他の病気の治療を含むヒトと動物の多種多様な状態の安全かつ効果的な治療のために、ｈｂ－ＭＳＣ組成物を使用することができることが示された。

（実施例７） － ｒｂ－ＭＳＣおよびｈｂ－ＭＳＣの細胞株によって調整された培養培地の分析
培養培地におけるｈｂ－ＭＳＣとｒｂ－ＭＳＣの影響を比較するために、各細胞株をそれぞれ、９個の別々の７５ｃｍ^２フラスコに０.７×１０^６個細胞／フラスコの密度で播種した。細胞は、３７℃に設定されたインキュベーター内でＣＯ_２を５％添加したＲＰＭＩ－１６４０／１０％ ＦＢＳで継代された。細胞フラスコは、ガス透過性の蓋で封じた。２４、４８、９６、１４４、１９２、２１６、２４０、２６４および２８８ 時間の、合計９期間、分析した。一つの細胞フラスコを、所定の時間ごとに分析した。培地は、３日（７２時間）、５日（１２０時間）、７日（１６８時間）、そしてその後毎日、残りのすべての試料瓶で交換した。９期間のそれぞれで、培地の乳酸塩濃度とｐＨを測定した。４８時間の測定を除いて、培地が交換されてから２４時間後に測定が行われるように、期間を選択した。乳酸塩は、生化学分析器を活用し、ＳＰＩＮＲＥＡＣＴ の乳酸塩特性決定キットを用いて三重に測定した。ｐＨは電子ｐＨ計（ＭＥＴＴＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯ社、ＩｎＬａｂ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｐｒｏ）を用いて測定した。細胞数もそれぞれの期間で測定し、細胞は、７.０５未満のｐＨで倍増する少なくとも１つの集団を形成した。

図６は、この実施例で説明した細胞採取時に測定された、生のＲＰＭＩ－１６４０培養培地、ｒｂ－ＭＳＣ馴化培地、およびｈｂ－ＭＳＣ馴化培地に対する時系列のｐＨの変化を示す。図７は、培養時のｒｂ－ＭＳＣおよびｈｂ－ＭＳＣ株の乳酸塩濃度（ｍＭ）の変化を示す。エラーバ―は、乳酸塩濃度の一つの標準偏差を表す。以下の表は、図６および図７のデータに基づく、この実施例におけるｒｂ－ＭＳＣおよびｈｂ－ＭＳＣに対する各種測定値の比較を示す。

（実施例８） － ｒｂ－ＭＳＣおよびｈｂ－ＭＳＣ細胞株によって調整された培地における因子比較
ｒｂ－ＭＳＣおよびｈｂ－ＭＳＣ株は、株が培地で維持されているときに、各株によって生成された因子を比較することによって区別することができる。ｈｂ－ＭＳＣとｒｂ－ＭＳＣによって産生された因子を比較するために、各細胞株を、７つの別々の７５ｃｍ^２フラスコに、０.７×１０^６個細胞／フラスコの密度で播種した。３７°Ｃに設定されたインキュベーター内で、ＣＯ_２を５％添加したＲＰＭＩ－１６４０／１０％ ＦＢＳで細胞が継代された。当業者は、添加血清の追加は、調整前の培地中の因子の開始濃度に影響を与えることを理解するだろう。細胞フラスコをガス透過性のキャップで封じた。９６、１４４、１９２、２１６、２４０、２６４、および２８８ 時間の、合計７期間、分析した。一つの細胞フラスコを、所定の時間ごとに分析した。培地は、３日（７２時間）、５日（１２０時間）、７日（１６８時間）、そしてその後毎日、残りのすべての試料瓶で交換した。培地が交換されてから２４時間後に測定が行われるように、期間を選択した。因子分析は、Ｅｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｒａｔ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙ ２７－Ｐｌｅｘ Ｐａｎｅｌ、ＴＧＦ－Ｂｅｔａ ３－Ｐｌｅｘ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＡｒｒａｙとＲａｔ Ｂｏｎｅ １－Ｐｌｅｘ Ａｒｒａｙを使用して実施された。表１で比較した具体的因子は、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、インターフェロンガンマ誘発タンパク質１０ （ＩＰ－１０）、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ／ＫＣ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、破骨細胞形成抑制因子（ＯＰＧ）、形質転換増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）、形質転換増殖因子β２（ＴＧＦ－β２）、形質転換増殖因子β３（ＴＧＦ－β３）である。当業者には理解されているように、多重測定値は検量線に依存し、従ってある程度変化する可能性があることを理解されるべきである。

分析された期間中に観察される因子の範囲を、以下の表３に要約する。因子の濃度は、細胞が培養される期間およびフラスコ内の細胞数に依存する可能性があることが理解されるべきである。

（ｒｂ－ＭＳＣ株とｈｂ－ＭＳＣ株の比較分析）

ｒｂ－ＭＳＣ株からｈｂ－ＭＳＣ株を区別する方法は数多くある。２つの株を区別する１つの方法は、細胞増殖中のｐＨを測定することである。実施例７では、ｒｂ－ＭＳＣ株とｈｂ－ＭＳＣ株によって調整された培地（ＲＰＭＩ－１６４０）のｐＨを２８８時間にわたり測定している。培養前に、ＲＰＭＩ－１６４０のｐＨは約７.０１と測定された。期待通り、ＲＰＭＩ－１６４０の規定ＣＯ_２添加量（すなわち５％）は、実験の全期間中、対照ＲＰＭＩ－１６４０のｐＨを７.２に効果的に緩衛した。ｒｂ－ＭＳＣ培養物のｐＨは、全実験期間を通して約７.０８から７.２に留まった。しかし、ｈｂ－ＭＳＣについては、ｐＨは、２４時間後の約７.２から、続く２１６時間の間に約６.６に減少し、実験期間中、約ｐＨ ６.６のままであった。１５０時間の培養後、培地のｐＨは、培地交換の２４時間以内に７.０ 未満に減少する。同様に、１５０時間の培養後、培地のｐＨは、培地交換の２４時間以内に、ＲＰＭＩ－１６４０のｐＨから少なくとも０.４単位で減少する。ｒｂ－ＭＳＣ株とｈｂ－ＭＳＣ株によって調整された培地のｐＨの差は、２つの株が異なることを示している。

ｒｂ－ＭＳＣ株からｈｂ－ＭＳＣ株を区別する別の方法に、実施例７に記載のように培地中の細胞による乳酸塩の産生を測定するものがある。図７は、ｈｂ－ＭＳＣ株が、ｒｂ－ＭＳＣ株によって産生される濃度を超える濃度の乳酸塩を産生することを示す。約９６時間の培養後、ｈｂ－ＭＳＣは、培地交換の２４時間以内に少なくとも４ ｍＭの乳酸塩を産生し、培地交換の２４時間以内に１２.４ ｍＭもの乳酸塩を産生することができる。対照的に、ｒｂ－ＭＳＣ株によって生成される乳酸塩の濃度は、培地交換の２４時間以内に３ｍＭを超えることはない。ｒｂ－ＭＳＣ株とｈｂ－ＭＳＣ株によって調整された培地中の乳酸塩濃度の差異は、２つの株が異なることを示している。

ｒｂ－ＭＳＣ株からｈｂ－ＭＳＣ株を区別する別の方法に、各株によって調整された培地の評価をする方法がある。この比較のため、実施例８で説明したように培地を採取した。因子測定の結果を上記表３にまとめる。ｒｂ－ＭＳＣ株によって調整された培地とｈｂ－ＭＳＣ株によって調整された培地中の因子濃度の違いは、２つの株が異なることを示すものである。

全体として、上記の特徴付け方法では、ｈｂ－ＭＳＣ株とｒｂ－ＭＳＣ株は異なるという結論に至る。

以上、本発明の典型的な実施形態について特に詳細に説明したが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲およびそれと均等のものによって定義される本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更を行うことができることを理解するだろう。

Claims (18)

1. 複数かつ非胎児性の間葉系幹細胞から得られた馴化培地であって、
   少なくとも７６０ｐｇ／ｍｌの血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と、
   少なくとも１５０ｐｇ／ｍｌのＣＸＣＬ１（ＧＲＯ／ＫＣ）と、
   形質転換増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）と、
   形質転換増殖因子β２（ＴＧＦ－β２）と、
   を含み、且つ細胞が除去された馴化培地。
2. 少なくとも４０００ｐｇ／ｍｌの血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と、
   少なくとも１０００ｐｇ／ｍｌのＣＸＣＬ１（ＧＲＯ／ＫＣ）と、
   少なくとも７５０ｐｇ／ｍｌの形質転換増殖因子β１（ＴＧＦ－β１）と、
   少なくとも２５０ｐｇ／ｍｌの形質転換増殖因子β２（ＴＧＦ－β２）と
   を含む、請求項１記載の馴化培地。
3. 前記ＶＥＧＦの含有量が少なくとも８０００ｐｇ／ｍｌである、請求項１又は２記載の馴化培地。
4. 前記馴化培地がインターロイキン１０（ＩＬ－１０）及び／又はインターフェロンガンマ誘発タンパク質１０（ＩＰ－１０）を更に含むものである、
   請求項１乃至３のいずれか１項記載の馴化培地。
5. 前記馴化培地は、破骨細胞形成抑制因子（ＯＰＧ）の含有量が２５０ｐｇ／ｍｌ未満であり、
   形質転換増殖因子β３（ＴＧＦ－β３）の含有量が８０ｐｇ／ｍｌ未満である、
   請求項１乃至４のいずれか１項記載の馴化培地。
6. 前記馴化培地は、
   破骨細胞形成抑制因子（ＯＰＧ）の含有量が９０ｐｇ／ｍｌ未満であり、形質転換増殖因子β３（ＴＧＦ－β３）の含有量が４０ｐｇ／ｍｌ未満であると共に、
   ＶＥＧＦ，ＩＰ－１０，ＩＬ－１０，ＧＲＯ／ＫＣ，ＯＰＧ，ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２及びＴＧＦ－β３の総量が１４８７ｐｇ／ｍｌ以上２６５８８ｐｇ／ｍｌ以下である、請求項４記載の馴化培地。
7. 前記馴化培地は、前記間葉系幹細胞として、０．７×１０^６個の間葉系幹細胞が７５ｃｍ^２フラスコに播種され、少なくとも９６時間培養された場合に、以下（ａ）乃至（ｄ）のうち少なくとも１つの追加の特徴を有するものを用いて調整されたものである、請求項１乃至６のいずれか１項記載の馴化培地。
   （ａ）細胞は、培地交換の２４時間以内に少なくとも４.５ｍＭの乳酸塩を産生する；
   （ｂ）細胞は、培地交換の２４時間以内に少なくとも１５０ｐｇ／ｍｌのＧＲＯ／ＫＣを産生する；
   （ｃ）細胞の、培地交換２４時間後のＯＰＧ産生量が２５０ｐｇ／ｍｌ未満である。
   または
   （ｄ）細胞の、培地交換２４時間後のＴＧＦ－β３産生量が８０ｐｇ／ｍｌ未満である。
8. 前記間葉系幹細胞は前記（ａ）乃至（ｄ）のうち少なくとも２つの特徴を有する、請求項７記載の馴化培地。
9. 前記間葉系幹細胞は、ＣＤ２９とＣＤ４４マーカーの陽性発現および、ＣＤ１１ｂとＣＤ４５マーカーの陰性発現によって特徴づけられ、少なくとも９０％の前記間葉系幹細胞が２ｎ＝４２の核型を示すことを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか１項記載の馴化培地。
10. 前記馴化培地は受託番号Ｈ－１５４としてロシア国立工業用微生物コレクション（ＶＫＰＭ）に寄託された間葉系幹細胞株によって調整されたものである、請求項１乃至９のいずれか１項記載の馴化培地。
11. 前記馴化培地は少なくとも２つの異なる期間前記間葉系幹細胞によって調整された培養培地の組み合わせである、請求項１乃至１０のいずれか１項記載の馴化培地。
12. 前記間葉系幹細胞は骨髄由来であり、前記馴化培地は破骨細胞形成抑制因子（ＯＰＧ）の含有量が５０ｐｇ／ｍｌ未満である、請求項１乃至１１のいずれか１項記載の馴化培地。
13. 治療用途のために被験体に投与するための請求項１乃至１２のいずれか１項記載の馴化培地及び担体を備えた組成物。
14. ＴＧＦ－β２の含有量が、少なくとも１５０ｐｇ／ｍｌである、請求項１３記載の組成物。
15. ＧＲＯ／ＫＣの含有量が、少なくとも２５０ｐｇ／ｍｌである、請求項１３又は１４記載の組成物。
16. 前記担体が、液体、クリーム、エアゾール、ローション、軟膏またはヒドロゲルを含むものである、請求項１３乃至１５のいずれか１項記載の組成物。
17. 防腐剤及び界面活性剤をさらに含み、
    前記防腐剤が、１つ以上のチメロサール、クレゾール、ホルマリン、塩化ベンザルコニウム、またはベンジルアルコールであり、前記界面活性剤がトリトンＸ－１００（登録商標）である、請求項１３乃至１６のいずれか１項記載の組成物。
18. 火傷治療、スキンケア、皮膚の治療的処置、血管新生及び脈管形成の刺激、創傷または損傷を伴う臓器または組織の治癒、組織炎症の治癒、創傷適用、創傷又は損傷を伴う眼科組織の治癒、瘢痕の削減、発毛の刺激、患部の毛包の修復、皮膚や骨髄または臓器の移植に伴う創傷の治癒、または内的又は外的な傷口を含む潰瘍を伴う臓器や組織の治療に使用され、そして注入、インプラント、または局所適用することにより投与されるためのものである、請求項１３乃至１７のいずれか１項記載の組成物。

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