CN107429228A - 干细胞材料及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的各个方面涉及一种新的间充质干细胞系(hb‑MSC)、由hb‑MSC细胞系调节的培养基以及各种hb‑MSC组合物。hb‑MSC组合物可以包含多个hb‑MSC、hb‑MSC条件培养基或其组合。hb‑MSC组合物还可以包含合适的载体。还描述了hb‑MSC细胞、条件培养基及其组合物的使用方法。

Description

干细胞材料及制备方法
技术领域
与本发明实施例一致的组合物和方法通常至少涉及细胞生物学、分子生物学和医学领域。更具体地说，本发明实施例涉及干细胞、干细胞条件培养基、获得干细胞条件培养基的方法以及干细胞和干细胞条件培养基的用途。
背景技术
间充质干细胞(MSC)是可能分化为间充质细胞类型(例如，脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞)的多潜能基质细胞。MSC具有很强的自我更新能力，同时保持其多潜能性。骨髓MSC目前正在临床试验中应用于各种治疗。分离、纯化和复制培养物中的MSC的方法在本领域中是众所周知的。
可以使用磁珠，在单层(即二维)或三维系统中培养MSC。这些标准方法可以使MSC在与其生理环境极为相似的条件下生长。已证明MSC行为在体内和体外环境中可能不同。不同MSC细胞系之间的差异通常可归因于分离技术和体外培养条件的差异。例如，生长条件的变化可影响体外细胞行为，包括影响细胞表面标志物的表达。细胞表面特异性标志物的表达可用于区分不同细胞系或确认细胞系的谱系。
所有细胞(包括MSC)在培养过程中可产生生物制品。例如，已知MCS在培养过程中产生超过200种独特的蛋白质。MSC在培养过程中产生的特定生物制品可用于表征和区分不同MSC。然而，即使使用相同来源的MSC，分离技术和体外培养条件的差异也可影响和改变分泌生物制品的产生。当然，还知道偏离理想的细胞生长条件可能导致培养物的衰老和损失。
发明内容
根据本发明的其中一个方面，提供了一种来自Wistar大鼠的骨髓的独特的间充质干细胞系，其具有一个或多个特定特征。例如，当将0.7×106个细胞接种到75cm2培养瓶中并培养至少96小时时，间充质干细胞系可以：(a)在更换培养基后24小时内，产生至少4.5mM乳酸盐；(b)在更换培养基后24小时内，产生至少150pg/ml的GRO/KC；(c)在更换培养基后24小时后，产生低于250pg/ml的OPG；或者(d)在更换培养基后24小时后，产生低于80pg/ml的TGF-β3。根据本发明的另一个方面，当将0.7×106个细胞接种到75cm2培养瓶中并培养至少150小时时：(e)在更换培养基后24小时内，培养基的pH值降至7.0以下；或者(f)在更换培养基后24小时内，培养基的pH值与不含细胞的培养基的pH值相比下降至少0.4个单位。培养基可以是补充有5％CO2的RPMI-1640培养基。此外，相同干细胞系在pH值低于7.05时，至少能进行一次群体倍增。干细胞系的特征还表现为CD29和CD44标志物的表达呈阳性以及CD11b和CD45标志物的表达呈阴性。
本发明的一个单独方面涉及一种条件培养基，该培养基可以通过将培养基中的多个独特干细胞保持在特定的调节期进行制备。一方面，培养基是补充有5％CO2的RPMI-1640。细胞可以在各种条件(包括大气中的CO2浓度或缺氧条件下)下保持在培养基中。根据本发明的该方面，调节期可能不同。例如，调节期可以为至少12小时，也可以为足以使条件培养基含有至少150pg/mL GRO/KC的时间段。在本发明的另外一个方面中，条件培养基可以至少包含以下一种产物：(a)至少500pg/mL的GRO/KC；(b)至少4000pg/ml的VEGF；(c)低于250pg/ml的OPG；或者(d)低于80pg/ml的TGF-β3。
本发明的另外一个方面涉及一种包含独特干细胞系或由独特细胞调节的培养基的组合物。组合物还可以包括合适的载体。载体可以包括液体、乳膏剂、气雾剂、洗剂、软膏剂、水凝胶，但并不限于此。在本发明的某些方面，可以对组合物进行处理，以除去部分或全部干细胞。在另外一个方面，组合物可以包含低于250pg/mL OPG或低于80pg/ml TGF-β3的条件培养基。
根据本发明的各个方面，独特的干细胞系、条件培养基或组合物可以通过注射、植入或通过局部应用给予受试者。根据本发明的其他方面，可将细胞、条件培养基或组合物应用于缝线、绷带、针织网、植入物、支架、移植物、湿巾、牙周垫或其他给药器械。细胞、条件培养基或组合物具有多种用途，包括，例如烧伤治疗、皮肤护理、血管生成、血管发生、器官或组织愈合、化妆品、组织炎症、细菌感染、伤口应用、糖尿病、制药和眼科应用、减轻疤痕、刺激毛发生长、免疫治疗应用和免疫修复治疗、皮肤、骨髓或器官移植、器官或组织治疗，或用于治疗人或动物的其他疾病。
附图说明
通过参考附图详细描述本发明实施例，本发明的上述和/或其他方面将变得更加明显，其中：
图1显示了hb-MSC表面细胞标志物的流式细胞术分析，包括标志物类型和标志物的相对百分比。
图2显示了来自第9代(p9)hb-MSC的Giemsa染色的染色体。
图3显示了hb-MSC和对照的PCR分析的电泳图。
图4显示了RPMI-1640培养基和hb-MSC组合物处理后9天小鼠伤口的比较。
图5显示了RPMI-1640培养基和hb-MSC组合物处理的小鼠伤口的相对伤口闭合速度。
图6显示了RPMI-1640培养基、rb-MSC条件培养基和hb-MSC条件培养基的pH值随时间的变化。
图7显示了在hb-MSC和rb-MSC细胞培养过程中乳酸盐浓度(mM)的变化。
具体实施方式
在本文的以下部分，将参照附图说明本发明的各个实施例。本发明的各个方面可以以各种形式实施，并不限于本文所阐述的实施例。应当理解，整个说明书中使用的任何标题或副标题仅为方便起见而提供，并不以任何方式限制权利要求的范围或含义。最后，应当理解，本说明书和所附权利要求中，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括多个所指物，除非内容另外清楚地规定。
本发明的一个实施例涉及新型间充质干细胞系(以下简称“hb-MSC”细胞系)。hb-MSC细胞系的样品已保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)，登录号为H-154。细胞系以名称MSCR05P09保藏。hb-MSC细胞系的细胞表面标志物的表达与间充质干细胞的表达一致。
本发明的另外一个实施例涉及由hb-MSC调节的培养基及其获得方法。条件培养基含有大量生物制品、小分子和具有多种生物功能的外来体。
另一个实施例涉及hb-MSC组合物。hb-MSC组合物可包含：(1)hb-MSC、由hb-MSC培养物调节的培养基或其任何组合物；以及(2)适当的载体。hb-MSC、由hb-MSC调节的培养基和hb-MSC组合物可以在任何状态下使用，使用本领域已知的任何方法给予，并用于各种应用中。
使用培养基在体外进行细胞传代。合适的培养基包括但不限于RPMI-1640、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、Ham F12、Iscove、McCoy或含有足够营养物质用于细胞生长的任何其他培养基。这些培养基可以制备获得或通过商业来源获得。
剥夺间充质细胞的优选生长环境通常会导致细胞增殖减慢或停止、塑性粘附力降低和/或细胞形态改变。与细胞生长相关的一个重要变量是细胞增殖期间的环境pH值。通常，当培养条件偏离生理pH值时，干细胞不会生长(或增殖速率下降)。因此，培养基通常在细胞培养过程中作为缓冲液。所有细胞产生并需要少量的CO2用于生长和存活。在培养基的一些示例中，使用CO2/碳酸氢盐反应使溶解的CO2与碳酸氢根离子达到平衡，以缓冲培养基的pH值。CO2易溶于培养基中并与水反应形成碳酸。随着细胞代谢并产生更多CO2，培养基的pH值降低。通过用碳酸氢钠(NaHCO3)补充培养基并调节培养基上空气中CO2的水平可以维持最佳pH范围(7.2-7.4)。培养基的缓冲能力由NaHCO3量决定。一般来说，规定补充5％的CO2，以在1.2-2.2g/L NaHCO3设定的缓冲容量下达到最佳pH值。作为另一个示例，规定补充10％的CO2，以在3.7g/L NaHCO3设定的缓冲容量下达到最佳pH值。如果补充的CO2量低于培养基的缓冲容量，则培养基的pH值可能不会保持在适当水平，这可能会导致衰老。
细胞培养基还可以包含其他组分，如支持或维持理想的细胞培养物所需的维生素、生长因子、激素、蛋白质、糖和/或抗氧化剂。应当理解，可以加入血清，如胎牛血清(FBS)。例如，可将10％补充的FBS加入培养基中，或者可将与动物血清相同体积的血浆加入培养基中。或者，也可以在没有补充血清和/或补充血浆的情况下，维持和繁殖培养物中的细胞。由细胞调节的培养基也可以用于代替培养基或者用于加到培养基中。
hb-MSC细胞系可以从Wistar大鼠的骨髓分离得到。分离hb-MSC细胞系的方法通常包括至少以下几个步骤：(1)从原代大鼠骨髓细胞获得第1代(p1)细胞；(2)将p1大鼠间充质干细胞接种到合适培养瓶中；(3)第一个孵育步骤，将细胞在第一个预定CO2浓度下孵育第一个孵育周期；(4)第二个孵育步骤，将细胞在第二个预定CO2浓度下孵育第二个孵育周期；(5)收集hb-MSC。
可以根据众所周知的方法从Wistar大鼠胫骨或股骨骨髓中收获原代大鼠骨髓干细胞。收获细胞后，细胞团块可重新悬浮，接种到塑料组织培养瓶中，并在培养基(例如，补充有10％FBS的RPMI-1640)中于37℃下在5％CO2加湿气氛中孵育。生长至约70％汇合度的贴壁细胞称为第1代(p1)细胞。
在一个实施例中，可将第一个预定CO2浓度设定为与培养基缓冲容量规定的CO2浓度(通常由培养基生产商确定)保持一致。例如，当将RPMI-1640培养基用于培养时，可将第一个预定CO2浓度设定为5％。在同一个实施例中，可将第二个预定CO2浓度从培养基缓冲容量规定的CO2浓度(通常由培养基生产商确定)降低至少50％。对于RPMI-1640培养基，规定的CO2浓度为5％。因此，根据该方法的一个实施例，第二个预定CO2浓度应设定在2.5％以下。在另一个实施例中，可将第二个预定浓度设定为大气中的CO2浓度(即约0.03％CO2)。本领域普通技术人员将理解，如果培养物中第二个预定CO2浓度增加，则可能需要增加第二个孵育周期(例如，可能需要一次或多次额外的传代)，以分离hb-MSC细胞系。
在一个实施例中，第一个孵育周期可以在0至4次细胞传代之间。应当理解，在第一个孵育周期为零代的情况下，完全跳过第一个孵育步骤。在另一个实施例中，第一个孵育周期是在培养物中实现一次群体倍增所需小时数(例如，约20-48小时)至约700小时之间的时间段。在一个实施例中，第二个孵育周期可以处于1至8次细胞传代之间。在另一个实施例中，第二个孵育周期是在培养物中实现一次群体倍增所需小时数(例如，约20-48小时)至约2500小时之间的时间段。例如，在含有10％FBS的RPMI-1640中，细胞可以在0.03％CO2气氛中传代四次。本领域普通技术人员将理解，可以根据需要在任一孵育步骤期间调节CO2浓度。
“传代”应被理解为，在稀释和未稀释的情况下，将细胞从一个培养瓶再分配到另一个含有新鲜培养基的培养瓶。例如，一次细胞传代可以包括：(1)将细胞接种到培养瓶的表面上(例如，将约2.0×106个细胞接种在175cm2的表面积上)；(2)加入培养基(例如，RPMI-1640)；(3)设定规定的CO2气氛；(4)将培养瓶放置在适当温度(例如，37℃)的孵育器中；(5)将培养瓶中的细胞保持预定的时间(“预定培养时间”)；(6)根据细胞生长需要提供新鲜培养基；以及(7)分离和再接种细胞。
对于每次传代，将细胞保持在培养基中，其预定培养时间约为30-700小时。在一个实施例中，预定培养时间低于96小时。在另一个实施例中，预定培养时间约为96-168小时。在又一个实施例中，预定培养时间高于168小时。此外，预定培养时间可以根据细胞汇合度确定。在一个实施例中，预定培养时间为细胞达到约50％汇合度所需的时间。在另一个实施例中，细胞在达到约50％-70％汇合度之后进行传代。在又一个实施例中，细胞在达到约70％汇合度后进行传代。
可以通过以任何维度(D)数培养细胞来分离hb-MSC细胞系。例如，可以使用磁珠(0D)、单层(2D)或3D支架培养细胞。hb-MSC细胞系也可以使用各种系统进行分离。hb-MSC细胞系可以使用开放容器系统或密闭容器系统或其组合进行分离。在一个实施例中，hb-MSC细胞系可以使用密闭容器系统进行分离。在密闭容器系统中，细胞培养瓶使用不渗透盖封闭，可防止接触补充的CO2。在另一个实施例中，可以在允许控制CO2浓度的细胞培养室内，使用开放培养瓶分离hb-MSC细胞系。在另一个实施例中，可以在允许控制CO2浓度的细胞培养室内，在透气膜封闭的培养瓶中分离hb-MSC细胞系。
本领域普通技术人员将理解，上述培养细胞的各种方法仅作为示例提供，不可以用于限制任何权利要求的范围。本领域普通技术人员还将理解，考虑到培养期间细胞的行为，可能需要改变操作方法、孵育时间、培养时间、培养基、血清或CO2浓度等变量。
本发明的另一个实施例涉及独特的hb-MSC细胞系。细胞表面标志物表达可用于确认该细胞系的间充质性质。可以使用任何合适的方法(包括例如流式细胞术)鉴定细胞表面的标志物。如示例4所述及图1所示，获得hb-MSC的方法不会导致hb-MSC表面标志物发生改变，由此可以得出以下结论，hb-MSC表现出与大鼠骨髓间充质干细胞一致的表面标志物。
图2显示了来自第9代(p9)hb-MSC的Giemsa染色的染色体，而图3显示了聚合酶链反应(PCR)分析的结果。COX-1和VN1R1基因分别用作大鼠线粒体和核DNA的标志物。第9代的核型是正常二倍体(即，2n＝42)。如下文示例1所述，细胞系的PCR分析证实这些是大鼠细胞。本领域普通技术人员将理解，如果核型分析证实细胞具有遗传稳定性，细胞可以保持任何传代数。
hb-MSC细胞系与从大鼠获得的其他干细胞系显著不同，可以使用许多不同的表征方法进行说明。对在标准条件下获得的大鼠间充质干细胞进行培养，以显示典型的大鼠间充质干细胞与独特的hb-MSC细胞系之间的差异。将出于比较目的制备的典型大鼠间充质细胞系称为rb-MSC细胞系。为了获得rb-MSC细胞系，如示例2所述，按照本领域已知的标准条件对p1大鼠间充质细胞进行传代。
示例7(及图6)显示了hb-MSC与rb-MSC细胞系培养基pH值之间的差异，该差异可用于区分两个细胞系。在另一项比较中，可以通过培养物中乳酸盐的总浓度区分hb-MSC细胞系与rb-MSC细胞系。区分hb-MSC细胞系与rb-MSC细胞系的另一种方法是，如示例8所述(如表3所示)，比较由各细胞系调节的培养基中发现的各种因子。当然，hb-MSC细胞系也可以通过本领域普通技术人员已知的其他方法进行表征。
本发明实施例还涉及从hb-MSC分化的细胞或细胞系。细胞系可以包括脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞或其他细胞。分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞的方法是本领域众所周知的。基因修饰干细胞的方法也是众所周知的。由基因修饰的hb-MSC和从基因修饰的hb-MSC分化的任何细胞系制得的干细胞系也在本发明范围内。
本领域普通技术人员将理解，提供表征hb-MSC的各种方法仅用于说明目的。hb-MSC的实施例无需满足所披露的每一种表征方法，并且部分实施例可能仅满足本文所披露的一种或多种表征方法。
本发明的一个实施例涉及由hb-MSC调节的培养基，以下称为“hb-MSC条件培养基”。在一个实施例中，条件培养基可以通过以下步骤制备：(1)将多个hb-MSC接种到合适的培养瓶中；(2)提供培养基；(3)将培养基中的hb-MSC保持在调节期；以及(4)收集条件培养基。调节期可以是数小时、数天甚至数周，在该期间培养基变得富含生物制品。适当时(例如，调节培养基，使生物制品(例如，生长因子、蛋白质和囊泡)达到培养基中所需水平)，可以收集条件培养基。例如，可以在将hb-MSC培养3、6、24、30、48、48、54、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312、366小时或其他时间段后，收集条件培养基。通过培养hb-MSC获得的条件培养基可以在无菌条件下处理或灭菌(根据需要)。本领域普通技术人员将理解，在细胞附着到培养用培养瓶之前收集条件培养基将导致随着生长培养基一起除去细胞，根据不同用途可能不需要这些生长培养基。
在一个实施例中，可以再次使用hb-MSC，通过在除去条件培养基之后向hb-MSC中加入培养基来调节更多的培养基。本领域普通技术人员将理解，细胞可以重复使用的次数取决于用于调节培养基的小时数以及细胞汇合度。应当理解，在不同时间段收集的hb-MSC条件培养基(例如，每3、6、24、30、48、48、54、72、96、120、144、168、192、216、240、264 288、312、366小时或其他时间段)、通过在一次传代范围内重复使用hb-MSC收集的条件培养基或从hb-MSC的不同传代数收集的培养基可以组合，以形成单个hb-MSC条件培养基。
由任何细胞调节的培养基可以包含在培养过程中分泌、排泄、释放或以其他方式产生的各种生物制品。例如，条件培养基可以包含生物制品，例如生长因子、抗炎因子、信号因子、激素、调节因子、酶、包含外来体的囊泡或任何其他化合物。细胞培养方法和培养基的pH值可能会影响细胞释放的生物制品的类型和数量。还应当理解，最初接种的细胞浓度可能会影响条件培养基中存在的生物制品数量。还应理解，添加补充血清将影响调节之前培养基中各种因子的起始浓度，因为血清中含有一定量的各种生物制品。对hb-MSC调节培养基中的这些因子的浓度进行测量，结果显示该培养基与由rb-MSC调节的培养基显著不同。可以使用市售检测试剂盒测量由细胞产生的各种因子的浓度(例如，从EMD Millipore或Eve Technologies获得的检测试剂盒)。应当理解，精确测量取决于检测试剂盒中使用的抗体对，因此检出的因子浓度可能随着所用检测试剂盒或测量技术的不同而变化。示例8描述了在特定时间段内rb-MSC和hb-MSC细胞系的因子浓度比较。
在一个实施例中，可将hb-MSC保持在培养基缓冲容量规定的CO2浓度(通常由培养基生产商确定)下以形成条件培养基。对于RPMI-1640培养基，规定的CO2浓度为5％。在另一个实施例中，可将hb-MSC保持在从培养基缓冲容量规定的CO2浓度(通常由培养基生产商确定)降低至少50％的CO2浓度下以形成条件培养基。在另一个实施例中，可将hb-MSC保持在大气中的CO2浓度(即，0.03％CO2)下以形成条件培养基。
在一个实施例中，可将hb-MSC保持在大气中的O2浓度(即，17％)下以形成条件培养基。在另一个实施例中，可将hb-MSC保持在降低至10％以下的O2浓度下以形成条件培养基。在另一个实施例中，可将hb-MSC保持在降低至2％以下的O2浓度下以形成条件培养基。例如，可以使用低O2浓度(缺氧条件)，以模拟体内骨髓环境。
在一些实施例中，条件培养基可以浓缩形式使用。例如，使用本领域中任何已知的方法，可将条件培养基浓缩1至100倍。所需的适当浓度将取决于条件培养基的用途。
在一个实施例中，进一步加工收集的未经处理条件培养基，以添加/除去和/或浓缩/稀释特定生物制品。应选择用于产物分离和纯化的方法，以保持最佳生物活性。例如，可能需要纯化生长因子、调节因子、肽激素、抗体、外来体或所需的任何其他生物化合物。这些方法包括但不限于凝胶色谱、离子交换、金属螯合亲和层析、高压液相色谱(HPLC)、疏水作用色谱或离心。在另一个实施例中，条件培养基中存在的外来体或任何其他囊泡可以在条件培养基中浓缩或从条件培养基中除去。
在另一个实施例中，可冻干条件培养基。冻干的条件培养基可以使用任何合适的稀释剂进行复溶，其中稀释剂包括但不限于生理盐水、磷酸盐缓冲液、细胞培养基、条件细胞培养基、水或其混合物。条件培养基可以以与原始条件培养基相同的浓度进行复溶。在一个单独的实施例中，与浓缩1至100倍的原始条件培养基相比，冻干的条件培养基可以浓缩倍数更高的浓度进行复溶。
hb-MSC细胞系可用于调节各种不同的培养基。在一些实施例中，还可以向培养基中补充额外的胎儿血清和/或血浆。在一个实施例中，在存在20％FBS的条件下调节培养基。在另一个实施例中，在存在10％FBS的条件下调节培养基。在另一个实施例中，在存在7％FBS的条件下调节培养基。在另一个实施例中，在存在3％FBS的条件下调节培养基。在另一个实施例中，在不存在FBS的条件下调节培养基。在其他实施例中，在细胞达到特定汇合度之后，可以使用降低浓度的血清或无血清培养基作为替代物，以形成低血清或无血清条件培养基。
本发明的另一个实施例涉及一种hb-MSC组合物。hb-MSC组合物可以包含hb-MSC、hb-MSC条件培养基或其组合。hb-MSC组合物还可以包含合适的载体。hb-MSC组合物中hb-MSC条件培养基的总量可以在0.00001％-99.99％之间变化(按体积计)。
hb-MSC组合物的实施例可以包括与hb-MSC、rb-MSC或基于培养基的用途/目的选择的其他细胞组合的hb-MSC条件培养基。例如，可以向hb-MSC组合物中加入的细胞可以包括自体细胞、同种异体细胞或异种细胞。
在不同的实施例中，hb-MSC组合物可以包括与任何其他条件培养基或任何条件培养基组合(以任何所需比例)组合的hb-MSC或hb-MSC条件培养基。hb-MSC组合物还可以包括与由自体细胞、同种异体细胞或异种细胞调节的培养基组合的hb-MSC或hb-MSC条件培养基。在另一个示例中，hb-MSC条件培养基可以与由人间充质干细胞调节的培养基组合。
hb-MSC组合物应保持无细菌、病毒、支原体或真菌污染。在一个实施例中，这可以通过细胞培养和加工期间的无菌处理条件来实现。在另一个实施例中，hb-MSC组合物含有药用防腐剂，以提供一定水平的抗微生物活性。在一些实施例中，防腐剂可以限制由溶液污染引起的继发性细菌、霉菌或变形虫感染。在其他实施例中，通过防止生物降解和保持效力，添加防腐剂延长了hb-MSC或hb-MSC条件培养基的有效期。在一个非限制性示例中，防腐剂可以包括洗涤剂、氧化剂、螯合剂或包括五价锑、季铵和有机汞制剂在内的代谢抑制剂。防腐剂的示例包括硫柳汞、甲酚、福尔马林、苯扎氯铵或苯甲醇。
在另一个实施例中，hb-MSC组合物中可以补充抗炎剂、抗菌剂、止痛剂、抗真菌剂、杀菌剂、消毒剂、维生素、遮光剂、抗生素、用于对抗自由基的试剂、螯合剂、碱化剂或酸化剂、芳香剂、表面活性剂、填充剂、天然产物或天然产物的提取物。补充剂可以包括有机小分子、有机金属化合物、聚合物、无机盐、蛋白质、生长因子、趋化因子、DNA、RNA或酶。在其他实施例中，培养基中可以补充糖、蛋白质、胰岛素、信号蛋白或任何其他小分子，包括着色剂、调味剂或甜味剂。补充剂还可以含有少量添加剂，例如增强等渗性或化学稳定性的物质。
本领域普通技术人员将理解，用于hb-MSC组合物的合适的载体可以包括例如液体、乳膏剂、气雾剂、洗剂、软膏剂或水凝胶。这些载体可以基于水性辅料(包括培养基)、非水性辅料、油类、标准脂肪物质、常规胶凝剂、缓冲液、增稠剂、悬浮剂、乳化剂、保湿剂、软化剂、亲水或亲脂性活性物质的添加。各种成分的用量将随着hb-MSC组合物用途和所需效果的不同而不同。当然，本领域普通技术人员将理解，“合适的载体”可以包括两种或多种载体和/或其他成分的混合物。
本文所披露的hb-MSC组合物可用于多种目的，包括但不限于任何研究、诊断、治疗或商业目的。hb-MSC组合物可用于治疗多种病症，包括例如烧伤治疗、皮肤护理、血管生成、血管发生、器官或组织愈合、化妆品、组织炎症、细菌感染、伤口应用、糖尿病、制药和眼科应用、减轻疤痕、刺激毛发生长、免疫治疗应用和免疫修复治疗、皮肤、骨髓或器官移植、器官或组织治疗，或用于治疗人或动物的其他疾病。
本文中使用的“治疗”包括疾病、障碍或病症或其任何参数或症状的治愈、补补、改善、严重程度减轻或病程缩短。应当理解，hb-MSC或hb-MSC条件培养基可以用于与hb-MSC组合物相同或相似的目的。
hb-MSC组合物还可用于皮肤病学或化妆品应用、食品添加剂或动物饲料添加剂、细胞培养以及制药学应用。hb-MSC组合物可用于预防性治疗，以应对急性损伤或用于治疗慢性损伤。在一个实施例中，hb-MSC组合物可用于治疗人类疾病或病症。在另一个实施例中，治疗可以包括兽医应用。
在一个实施例中，hb-MSC组合物可有助于治疗伤口，包括皮肤伤口、骨折、胃溃疡或糖尿病性溃疡、胰腺、肝脏、肾脏、脾脏、血管损伤和其他内部或外部伤口，以及治疗烧伤。例如，如示例5所述以及图4和图5所示，hb-MSC组合物可用于局部应用，以促进和/或加速伤口愈合。在另一个实施例中，hb-MSC组合物可用于治疗本来需要手术切除或引流的伤口。例如，hb-MSC组合物可以加快伤口组织的灌注。
hb-MSC组合物可用于皮肤美容治疗，包括治疗皱纹、眉间纹、瘢痕或修复其他皮肤状况，例如由紫外光引起的有害作用和正常老化所产生的皮肤病。
hb-MSC组合物给予可以本领域中任何已知的方式进行。例如，用于此类给予方式的一些实施例可以是位点特异性、局部、经口、经鼻、静脉内、皮下、皮内、经皮、肌内或腹膜内给予。在其他实施例中，可以配制hb-MSC组合物，用于缓控释载体。
应当理解，在特定情况下，hb-MSC组合物的实际优选量、给予方式和给予间隔将随着所使用的特定组合物、所配制的特定组合物、应用方式以及接受治疗的特定损伤和受试者的不同而不同。可以使用常规考虑因素(例如，通过适当的常规药理学方案)确定各种特定情况的剂量。在确定药物化合物剂量方面具有丰富经验的医师和开具处方者能够确定合适的剂量。
hb-MSC组合物可以在任何状态下使用。例如，hb-MSC组合物可以采取片剂、胶囊、皮肤贴剂、吸入剂、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳剂、液体洗剂、栓剂、洗剂、乳膏剂、软膏剂、注射剂、凝胶、水凝胶、薄膜、粉末、血清、药膏、粉底、面膜、唇部护理产品、防晒剂、护发产品(如洗发剂)、护发素(包括深层护发素)、护发护理、皮肤清洁产品、去角质产品、紧致制剂或本领域技术人员已知的任何其他合适的形式。
在一些实施例中，hb-MSC组合物可用于涂覆缝线、医疗设备或植入器械。在另一个实施例中，hb-MSC组合物可与缝线、绷带、植入物、支架、移植物或牙周应用组合使用。hb-MSC组合物也可以用于湿巾。还可以将hb-MSC组合物作为伤口填充物添加或添加到现有伤口填充组合物中，以加速伤口愈合。在另一个实施例中，还可将hb-MSC组合物加入到眼影、水粉饼、粉饼或其他化妆品中。
在其他实施例中，hb-MSC组合物的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或作为干性产品呈现，以在使用前用合适的载体构建。
在另一个实施例中，hb-MSC组合物可冷冻保存一段时间。或者，hb-MSC组合物可冻干并冷冻保存一段时间。或者，hb-MSC组合物可以按照上述方法复溶并冷冻保存一段时间。或者，可以将hb-MSC组合物储存或保持在室温(例如，约28℃)与0℃之间的温度下。所用温度范围并不是固定的，本领域技术人员可以根据应用性质的不同使用替代温度范围。
在另一个实施例中，hb-MSC组合物可以在使用前置于室温下。或者，hb-MSC组合物可以在低于室温的温度下使用。或者，只要温度没有高到使生物材料变性，也可以在高于室温的温度下使用hb-MSC组合物。
示例
包括以下示例，以证明本发明的某些实施例。本领域技术人员应当理解，以下示例中所披露的技术为发明者发现的技术，可用作实施本发明某些实施例的模式。但是，根据目前的信息披露，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对以下示例进行若干改变。
示例1–hb-MSC细胞的种属鉴定
进行PCR分析，确认细胞确实来自大鼠。对于PCR分析，COX-1和VN1R1基因分别用于线粒体和核DNA。使用多重PCR对COX-1基因进行扩增，使用标准PCR对VN1R1基因进行扩增。使用来自38岁男性、32岁女性和Wistar大鼠的血样作为对照。根据生产商说明，使用市售试剂盒(PREP-GS-GENETICS,DNA Technology,Russia)从细胞培养物中分离DNA。所有引物均可购自Evrogen,LLC。
PCR分析用特定引物为：
人COX1：f`-TAGACATCGTACTACACGACACG和
r`-TCCAGGTTTATGGAGGGTTC。
大鼠COX1：f`-CGGCCACCCAGAAGTGTACATC和
r`-GGCTCGGGTGTCTACATCTAGG。
人VN1R1：f`-TGGTCTGGGCCAGTGGCTCC和
r`-GAGTGTTTTCCTTGTCCTGCAGGCA。
大鼠VN1R1：f`-AGAAGAGTTACTGGCCCAAGGGACA和
r`-GGGGCTGAACGCTGGGAAGC。
使用SubCellGT电泳系统(Bio-Rad)，在2％琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳分析。使用ECX-F15.C(Vilber Lourmat)透射仪对凝胶进行显像。电泳图如图3所示。具体地说，图3中的泳道1-5显示了COX1基因碱基对。泳道1显示了对照人DNA的结果，泳道2显示了对照大鼠DNA的结果。泳道3和4显示了hb-MSC样品的结果。泳道5显示了阴性对照。泳道7-10显示了VN1R1基因碱基对。泳道10显示了对照人和对照大鼠DNA的混合物。泳道9和7显示了hb-MSC样品的结果。泳道8显示了阴性对照。“M”表示DNA片段标志物泳道。电泳证实，hb-MSC是从大鼠中分离得到，没有被来自人细胞的物质污染。
示例2–rb-MSC培养
培养并评价在标准条件下获得的大鼠间充质干细胞，以显示独特的分离的hb-MSC细胞系与典型的大鼠间充质干细胞(rb-MSC)之间的差异。
从Wistar大鼠胫骨或股骨骨髓收集的原代细胞中分离出rb-MSC细胞系和hb-MSC细胞系。所有细胞培养均在GMP条件下进行。在一个实施例中，获得原始细胞的方法如下。将动物麻醉并人道处死。在无菌条件下，切下每只大鼠的股骨和胫骨。通过用补充有15％胎牛血清(FBS)的MEM-Earle培养基进行冲洗，挤出骨髓。通过移液分散骨髓栓悬浮液，依次通过70μm网状尼龙过滤器过滤，并在200G下离心10分钟。弃去上清液，将细胞团块重新悬浮于培养基中。将来自一只大鼠的细胞接种到塑料培养瓶中，并在37℃下在5％CO2加湿气氛中孵育。第三天，除去红细胞和其他非贴壁细胞，加入新鲜的补充培养基，使其进一步生长。将生长至70％汇合度的贴壁细胞定义为原代培养细胞(p1)。
为了获得rb-MSC细胞系，按照本领域已知的标准条件，根据生产商为RPMI-1640规定的指导方针，对p1大鼠间充质细胞进行传代。p1细胞用无Ca2+–Mg2+Hanks溶液(Sigma,USA,H9394-500ml)洗涤，并通过与0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma,USA,T4424-100ml)一起在37℃下孵育5-10分钟进行分离。然后，加入补充5％FBS(Sigma,USA,F6765)的Hanks溶液，灭活胰蛋白酶。将细胞在200G下离心10分钟，重新悬浮于补充有15％FBS的1-2ml RPMI-1640培养基中，并用血细胞计数器网格与Neubauer法则进行手动计数。然后，使用补充有15％FBS(Sigma,USA,F6765)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Sigma,USA,P4458)、100ng/ml两性霉素(Sigma,USA,A2942)、2mL L-谷氨酰胺(Sigma,USA,G7513)、用于RPMI-1640培养基的0.005ml/ml维生素(100x)(Sigma,USA,R7256)以及用于RPMI-1640培养基的0.005ml/ml氨基酸(Sigma,USA,R7131)的RPMI-1640培养基(Sigma,USA,R5886)，将细胞作为p2铺在75cm2培养瓶中，密度为1.0x 106个细胞/培养瓶。将带有可渗透、无菌过滤器盖的培养瓶在37℃下于5％CO2气氛的加湿孵育器中孵育。RPMI-1640培养基(补充有15％FBS)在10-14天的时间内每3天(或达到70％汇合度)更换一次。在第2代(p2)之后，使用补充有10％FBS的RPMI-1640培养基，将细胞铺在175cm2培养瓶中，密度为2x 106个细胞/培养瓶。对于随后的每一次传代，以相似方式铺板细胞，并生长至70％汇合度。达到70％汇合度后，细胞分裂，并重新接种到塑料培养瓶中。第5代(p5)rb-MSC用于与hb-MSC细胞系比较。
示例3–hb-MSC培养
为了获得hb-MSC细胞系，按照以下方法培养p1大鼠间充质细胞。首先，p1细胞用无Ca2+–Mg2+Hanks溶液(Sigma,USA,H9394-500ml)洗涤，并通过与0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma,USA,T4424-100ml)一起在37℃下孵育5-10分钟进行分离。然后，加入补充5％FBS(Sigma,USA,F6765)的Hanks溶液，灭活胰蛋白酶。将细胞在200G下离心10分钟，重新悬浮于补充有15％FBS的1-2ml RPMI-1640培养基中，并用血细胞计数器网格与Neubauer法则进行手动计数。然后，使用补充有15％FBS(Sigma,USA,F6765)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Sigma,USA,P4458)、100ng/ml两性霉素(Sigma,USA,A2942)、2mL L-谷氨酰胺(Sigma,USA,G7513)、用于RPMI-1640培养基的0.005ml/ml维生素(100x)(Sigma,USA,R7256)以及用于RPMI-1640培养基的0.005ml/ml氨基酸(Sigma,USA,R7131)的RPMI-1640培养基(Sigma,USA,R5886)，将细胞作为p2铺在75cm2培养瓶中，密度为1.0x 106个细胞/培养瓶。将带有可渗透、无菌过滤器盖的培养瓶在37℃下于5％CO2气氛的加湿孵育器中孵育。RPMI-1640培养基(补充有15％FBS)在10-14天的时间内每3天(或达到70％汇合度)更换一次。
在第2代(p2)之后，使用补充有10％FBS的RPMI-1640培养基，将细胞铺在175cm2培养瓶中，密度为2x 106个细胞/培养瓶。培养物在37℃下于5％CO2气氛的加湿孵育器中继续生长。在第3代(p3)之后，细胞以降低的CO2浓度进行传代。为了降低CO2浓度，在大气CO2条件下用不渗透盖密封培养瓶，并在37℃下孵育。在之后的所有传代中均未使用补充CO2。如前所述，加入补充有10％FBS的新鲜RPMI-1640培养基，在约14天的时间内每3天或4天更换一次。对于每一次传代，以相似方式铺板细胞，并生长至70％汇合度。达到70％汇合度后，细胞分裂，并重新接种到塑料培养瓶中。将第9代(p9)hb-MSC与rb-MSC进行比较。PCR分析(Nanodiagostika,LLC,RUS)证实，hb-MSC没有受到细菌、病毒、支原体或真菌的污染。
使用10％DMSO和50％FBS培养基，将hb-MSC细胞系保存在液氮温度下(hb-MSC细胞系浓度为每2ml安瓿中3.0×106至5.0×106个细胞)。
示例4-hb-MSC流式细胞术表征
进行流式细胞术实验，以鉴定hb-MSC和rb-MSC细胞系的细胞表面标志物。出于本实验的目的，将50μl相应的抗体加入到100μl细胞悬浮液中。将悬浮液涡旋振荡5秒钟(BioVortexV1,BioSan)，并避光保持在+4℃下30分钟。孵育后，将混合物用500μl盐水溶液稀释，并通过离心洗涤两次，以除去过量试剂。每次在400G下离心10分钟(ELMI)。对每份样品分析至少10,000个计数。使用WinMDI 2.7分析程序分析结果，如图1所示。rb-MSC和hb-MSC细胞系表达的表面标志物汇总见下表1。
表1-rb-MSC和hb-MSC细胞系表面标志物
典型的骨髓大鼠间充质细胞对CD44、CD29标志物的表达呈阳性，对CD45和CD11b标志物的表达呈阴性。如上表1所示，hb-MSC细胞系表现出与大鼠骨髓间充质干细胞一致的表面标志物。这表明获得hb-MSC的方法不会导致细胞表面标志物发生改变。
示例5-伤口闭合的形态学研究
进行形态学研究，以追踪实验室小鼠的伤口愈合过程。所有动物实验均在莫斯科国立兽医与生物技术研究所兽医学系(得名于K.I.Scriabin)进行。所有实验均使用体重约22-25g的3至5月龄的白色实验室小鼠。每项实验共使用6只小鼠。每只动物麻醉后，在刚剃除被毛的肩胛区制作直径约为0.5cm的切口。制作切口后，将动物分为对照组和样品组，每组3只小鼠。拍摄每个伤口的照片，获得数字式形态计量参数。制作切口后30分钟，每个伤口用一滴(50μl)RPMI-1640培养基或hb-MSC组合物处理。在该示例中，如示例8所述，hb-MSC组合物包含hb-MSC条件培养基，其中，将在每个不同调节时间段(96、144、192、216、240、264和288小时)收集的条件培养基在一个容器中进行组合。该组合物还包含防腐剂苯扎氯铵(BEK)和表面活性剂Triton X-100。每天测量一次伤口尺寸，持续15天。评估伤口后，将hb-MSC组合物和RPMI-1640培养基每天一次施用于各组中的每只动物。显示用hb-MSC组合物和RPMI-1640培养基处理的伤口的比较愈合过程的数字图像如图4所示。图4显示了对照组小鼠(用RPMI-1640培养基处理)在处理第1天和同一只小鼠在处理第9天的情况。图4还显示了样品组小鼠(用hb-MSC组合物处理)在处理第1天和同一只小鼠在处理第9天的情况。使用hb-MSC组合物与RPMI-1640培养基处理对平均伤口尺寸的治疗效果如图5所示。
示例6-hb-MSC组合物的治疗效果
为了检测hb-MSC组合物的治疗效果，对多种动物进行了实验，包括犬(65+)、猫(80)、马(40+)、家畜(25+)、啮齿动物(200+)及鸟类(15+)。使用hb-MSC组合物治疗上述试验动物的各种病症。在该示例中使用的hb-MSC组合物与示例5相同。这些治疗包括：1)伤口应用，包括术后切口部位；2)烧伤治疗，包括化学灼伤；3)溃疡，包括糖尿病性溃疡；4)瘘；5)组织炎症或细菌感染，包括脓性炎症、结膜炎、角膜炎、乳腺炎、蜂窝织炎、胃炎和皮炎；6)骨科应用，包括骨折；以及7)治疗各种组织，包括皮肤、韧带和肌肉组织。在实验中，通过以下方法给予hb-MSC组合物：外用、经口、经鼻、静脉内、皮下、皮内、经皮、肌内和腹膜内。此外，使用无菌纸巾作为气雾剂并通过直接施用于受影响区域(包括通过使用乳头药浴杯)给予hb-MSC组合物。hb-MSC组合物可有效治疗所有上述病症，受影响区域显示再生作用得到改善、伤口闭合速度加快、炎症和局部细菌定植显著降低、抗微生物作用及血管生成和血管发生增强、组织瘢痕形成减少和毛囊恢复。在这些实验中观察到的明显再生作用与示例5中描述的小鼠伤口实验的结果一致。在所有情况下，用hb-MSC组合物处理后动物均保持健康。对于所有情况，评估了毒性、刺激性、致敏性和生物积累。所有动物给予hb-MSC组合物后30天内的所有追踪指标均保持在血液检查评估的正常范围内。肾、肝、肺、脾、肠和软组织的组织学没有表现出给予hb-MSC组合物产生的任何急性或慢性毒性迹象。也没有记录到过敏反应、感染或其他不良影响的情况。总之，这些实验表明，hb-MSC组合物可用于安全有效地治疗人类和动物的各种病症，包括烧伤治疗、皮肤护理、血管生成、血管发生、器官或组织愈合、化妆品、组织炎症、细菌感染、伤口应用、糖尿病、制药和眼科应用、减轻疤痕、刺激毛发生长、免疫治疗应用和免疫修复治疗、皮肤、骨髓或器官移植、器官或组织治疗，或其他疾病的治疗。
示例7-rb-MSC和hb-MSC细胞系调节培养基的分析
为了比较hb-MSC与rb-MSC对培养基的影响，将各细胞系铺在9个单独的75cm2培养瓶中，密度为0.7×106个细胞/培养瓶。在设定为37℃的孵育器中，将细胞在补充有5％CO2的RPMI-1640/10％FBS中传代。用透气盖封闭细胞培养瓶。共分析了9个时间段：24、48、96、144、192、216、240、264和288小时。在每个规定的时间段对一个培养瓶中的细胞进行分析。在3天(72小时)、5天(120小时)、7天(168小时)之后，更换所有剩余小瓶中的培养基，之后每天更换培养基。在9个时间段的每个时间段测量培养基的乳酸盐浓度和pH值。除了48小时测量之外，选择了这些时间段，以便在更换培养基后24小时进行测量。使用生化分析仪，用乳酸盐表征试剂盒(SPINREACT)测量乳酸盐(一式三份)。使用电子pH计(METTLER TOLEDOInLab Versatile Pro)测量pH值。还在每个时间段测量细胞计数，并在pH低于7.05的情况下细胞至少进行一次群体倍增。
图6显示了在本示例中描述的细胞收集时间测量的纯RPMI-1640培养基、rb-MSC条件培养基和hb-MSC条件培养基的pH值随时间的变化。图7显示了培养期间rb-MSC和hb-MSC细胞系的乳酸盐浓度(mM)变化。误差线表示乳酸盐浓度的一个标准偏差。下表(基于图6和图7中的数据)显示了本示例中rb-MSC和hb-MSC的各种测量值比较。
表2-hb-MSC和rb-MSC细胞系的区分方法
示例8-rb-MSC和hb-MSC细胞系调节培养基的因子比较
rb-MSC和hb-MSC细胞系可以通过比较各细胞系保持在培养基中时各细胞系产生的因子进行区分。为了比较hb-MSC和rb-MSC产生的因子，将各细胞系铺在7个单独的75cm2培养瓶中，密度为0.7×106个细胞/培养瓶。在设定为37℃的孵育器中，将细胞在补充有5％CO2的RPMI-1640/10％FBS中传代。本领域普通技术人员将理解，添加补充血清将影响调节之前培养基中各种因子的起始浓度。用透气盖封闭细胞培养瓶。共分析了7个时间段：96、144、192、216、240、264和288小时。在每个规定的时间段对一个培养瓶中的细胞进行分析。在3天(72小时)、5天(120小时)、7天(168小时)之后，更换所有剩余小瓶中的培养基，之后每天更换培养基。选择了这些时间段，以便在更换培养基后24小时进行测量。使用EveTechnologies Rat Cytokine Array/Chemokine Array 27-Plex Panel、TGF-Beta 3-PlexCytokine Array和Rat Bone 1-Plex Array进行因子分析。表1中比较的特异性因子包括白细胞介素-10(IL-10)、干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)、CXCL1(GRO/KC)、血管内皮生长因子(VEGF)、骨保护素(OPG)、转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β2(TGF-β2)、转化生长因子β3(TGF-β3)。应当理解，多重测量取决于校准曲线，因此可以在一定程度上进行改变(如本领域普通技术人员所理解)。
在分析时间段内观察到的因子范围汇总见下表3。应当理解，因子浓度可能取决于细胞培养的时间段和培养瓶中的细胞数。
表3-rb-MSC和hb-MSC的因子浓度比较(pg/ml)
因子 rb-MSC hb-MSC
IL-10 0-12 12-38
IP-10 7-26 18-120
GRO/KC 14-100 460-5600
VEGF 300-2400 760-15800
OPG 540-3200 0-90
TGF-β1 550-2600 67-2000
TGF-β2 520-3200 170-2900
TGF-β3 100-610 0-40
rb-MSC和hb-MSC细胞系的比较分析
有很多区分rb-MSC细胞系与hb-MSC细胞系的方法。区分两个细胞系的一种方法是在细胞生长期间测量培养基的pH值。示例7描述了在288小时内测量由rb-MSC和hb-MSC细胞系调节的培养基(RPMI-1640)的pH值。培养前，测得的RPMI-1640的pH值约为7.01。与预期相同，在实验的整个持续时间内，用于RPMI-1640的规定量补充二氧化碳(即5％)将对照RPMI-1640的pH值有效缓冲至7.2。在整个实验期间，rb-MSC培养物的pH值保持在约7.08-7.2之间。但是，对于hb-MSC，在随后216小时过程中，pH值从24小时的约7.2降至约6.6，并且整个实验期间保持在约6.6。培养150小时后，培养基的pH值在更换培养基后24小时内降至7.0以下。与此相似，培养150小时后，培养基的pH值在更换培养基后24小时内从RPMI-1640培养基的pH值降低至少0.4个单位。由rb-MSC和hb-MSC细胞系调节的培养基pH值差异表明两个细胞系是不同的。
区分hb-MSC细胞系与rb-MSC细胞系的另一种方法是，按照示例7所述，测量培养基中细胞产生的乳酸盐。图7显示hb-MSC产生的乳酸盐浓度超过rb-MSC产生的乳酸盐浓度。在培养约96小时后，hb-MSC在更换培养基后24小时内产生至少4mM乳酸盐，并可在更换培养基后24小时内产生多达12.4mM的乳酸盐。相比之下，rb-MSC产生的乳酸盐浓度在更换培养基后24小时内从未超过3mM。rb-MSC与hb-MSC细胞系调节培养基中的乳酸盐浓度差异表明两个细胞系是不同的。
区分hb-MSC细胞系与rb-MSC细胞系的另一种方法是对各细胞系调节的培养基进行评价。出于比较目的，按照示例8所述收集培养基。因子测量的结果汇总见上表3。rb-MSC与hb-MSC调节培养基中的因子浓度差异表明两个细胞系是不同的。
总之，上述表征方法可得出以下结论，即hb-MSC细胞系与rb-MSC细胞系是不同的。
尽管已经参考本发明的示例性实施例具体显示和描述了本发明，但是本领域普通技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以按照下列权利要求及其等同规定，在形式和细节上进行各种改变。

Claims (59)

1.保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)的间充质干细胞系，登录号为H-154。
2.一种间充质干细胞系，当将0.7×106个细胞接种到75cm2培养瓶中并培养至少96小时时，所述间充质干细胞系具有以下特征中的至少一个：(a)在更换培养基后24小时内，所述细胞产生至少4.5mM的乳酸盐；(b)在更换培养基后24小时内，所述细胞产生至少150pg/ml的GRO/KC；(c)在更换培养基后24小时后，所述细胞产生低于250pg/ml的OPG；或者(d)在更换培养基后24小时后，所述细胞产生低于80pg/ml的TGF-β3。
3.权利要求2所述的干细胞系，其中所述细胞来源于骨髓。
4.权利要求3所述的干细胞系，其中所述细胞来源于Wistar大鼠的骨髓。
5.权利要求2所述的干细胞系，其中所述细胞在低于7.05的pH时至少进行一次群体倍增。
6.权利要求2所述的干细胞系，其中当将0.7×106个细胞接种到75cm2培养瓶中并培养至少150小时时，所述细胞具有以下附加特征中的至少一个：(e)在更换培养基后24小时内，培养基的pH值降至7.0以下；或者(f)在更换培养基后24小时内，培养基的pH值与不含细胞的培养基的pH值相比下降至少0.4个单位。
7.权利要求6所述的干细胞系，其中所述干细胞在补充有5％CO2的RPMI-1640培养基中培养。
8.权利要求2所述的干细胞系，其中所述细胞在更换培养基后24小时内产生至少460pg/ml的GRO/KC。
9.权利要求2所述的干细胞系，其中所述细胞在更换培养基后24小时后产生低于90pg/ml的OPG。
10.权利要求2所述的干细胞系，其中所述细胞在更换培养基后24小时后产生低于40pg/ml的TGF-β3。
11.权利要求2所述的干细胞系，具有权利要求2中所述特征中的至少两个。
12.权利要求2所述的干细胞系，具有权利要求2中所述特征中的至少三个。
13.权利要求2所述的干细胞系，其中所述细胞的特征表现为CD29和CD44标志物的表达呈阳性以及CD11b和CD45标志物的表达呈阴性。
14.权利要求2所述的干细胞系，其中所述细胞中的至少90％表现出2n＝42的核型。
15.一种条件培养基，通过包括以下步骤的方法制备：
提供培养基；
将来自权利要求1所述的干细胞系的多个干细胞在培养基中保持一个调节期，从而调节所述培养基；以及
收集条件培养基。
16.一种条件培养基，通过包括以下步骤的方法制备：
提供培养基；
将权利要求2所述的细胞在培养基中保持一个调节期，从而调节培养基；以及
收集条件培养基。
17.权利要求16所述的条件培养基，其中所述培养基是补充有5％CO2的RPMI-1640。
18.权利要求16所述的条件培养基，其中所述细胞保持在CO2的大气浓度下。
19.权利要求16所述的条件培养基，其中所述细胞保持在缺氧条件下。
20.权利要求16所述的条件培养基，其中所述细胞来源于Wistar大鼠的骨髓。
21.权利要求16所述的条件培养基，其中所述调节期为至少12小时。
22.权利要求16所述的条件培养基，其中所述调节期是足以使条件培养基含有至少150pg/mL的GRO/KC的时间段。
23.一种条件培养基，包含：由多个间充质干细胞调节的培养基，其中所述条件培养基包含以下中的至少一种：(a)至少500pg/mL的GRO/KC；(b)至少4000pg/ml VEGF；(c)低于250pg/ml的OPG；或者(d)低于80pg/ml的TGF-β3。
24.权利要求23所述的条件培养基，其中所述条件培养基至少含有2500pg/mL的GRO/KC。
25.权利要求23所述的条件培养基，其中所述条件培养基至少含有8,000pg/mL的VEGF。
26.权利要求23所述的条件培养基，其中所述条件培养基含有低于50pg/mL的OPG。
27.权利要求23所述的条件培养基，其中所述条件培养基含有低于50pg/mL的TGF-β3。
28.权利要求23所述的条件培养基，其中所述条件培养基可以被冻干和复溶，并且其中，复溶的条件培养基的浓缩系数可在1-100之间。
29.一种组合物，包含：
权利要求15所述的条件培养基；以及
可接受的载体。
30.权利要求29所述的组合物，其中所述组合物中条件培养基的总量可以在按体积计0.00001％-99.99％之间变化。
31.一种组合物，包含：
权利要求16所述的条件培养基；以及
可接受的载体。
32.权利要求31所述的组合物，还包含由权利要求2所述的细胞调节第二调节期的第二培养基。
33.权利要求31所述的组合物，其中所述组合物中条件培养基的总量可以在按体积计0.00001％-99.99％之间变化。
34.权利要求31所述的组合物，其中进一步处理所述条件培养基以从所述条件培养基中除去至少90％的细胞。
35.权利要求31所述的组合物，其中用于调节培养基的所述细胞来源于Wistar大鼠的骨髓。
36.权利要求31所述的组合物，其中用于调节培养基的所述细胞的特征表现为CD29和CD44标志物的表达呈阳性以及CD11b和CD45标志物的表达呈阴性。
37.权利要求31所述的组合物，还包含多个权利要求2所述的细胞。
38.权利要求31所述的组合物，其中所述载体包括液体、乳膏剂、气雾剂、洗剂、软膏剂或水凝胶。
39.一种组合物，包含：
由多个间充质干细胞调节的培养基；以及
合适的载体，其中所述组合物包含低于250pg/mL的OPG或低于80pg/ml的TGF-β3。
40.权利要求39所述的组合物，其中所述组合物还包含至少150pg/ml的TGF-β2。
41.权利要求39所述的组合物，其中所述组合物还包含至少250pg/ml的GRO/KC。
42.权利要求39所述的组合物，其中调节所述培养基至少12小时。
43.使用权利要求15中所述条件培养基的一种方法，包括将权利要求15所述的条件培养基给予受试者。
44.使用权利要求29中所述组合物的一种方法，包括将权利要求29所述的组合物给予受试者。
45.使用权利要求39中所述组合物的一种方法，包括将权利要求39所述的组合物给予受试者。
46.一种治疗器械，包括包含权利要求44所述的组合物的施用器，其中所述施用器包括缝线、绷带、针织网、植入物、支架、移植物、湿巾或牙周垫。
47.权利要求23所述的条件培养基，用于烧伤治疗、皮肤护理、血管生成、血管发生、器官或组织愈合、化妆品、组织炎症、细菌感染、伤口应用、糖尿病、制药和眼科应用、减轻疤痕、刺激毛发生长、免疫治疗应用和免疫修复治疗、皮肤、骨髓或器官移植物、器官或组织的治疗。
48.权利要求23所述的条件培养基，其中通过注射、植入或局部施用所述条件培养基给予所述条件培养基。
49.权利要求29所述的组合物，用于烧伤治疗、皮肤护理、血管生成、血管发生、器官或组织愈合、化妆品、组织炎症、细菌感染、伤口应用、糖尿病、制药和眼科应用、减轻疤痕、刺激毛发生长、免疫治疗应用和免疫修复治疗、皮肤、骨髓或器官移植、器官或组织治疗。
50.权利要求29所述的组合物，其中通过注射、植入或局部施用所述组合物给予所述组合物。
51.权利要求39所述的组合物，用于烧伤治疗、皮肤护理、血管生成、血管发生、器官或组织愈合、化妆品、组织炎症、细菌感染、伤口应用、糖尿病、制药和眼科应用、减轻疤痕、刺激毛发生长、免疫治疗应用和免疫修复治疗、皮肤、骨髓或器官移植、器官或组织治疗。
52.权利要求39所述的组合物，其中通过注射、植入或局部施用所述组合物给予所述组合物。
53.权利要求1所述的间充质干细胞系，其中将所述干细胞系的一个或多个干细胞用于烧伤治疗、皮肤护理、血管生成、血管发生、器官或组织愈合、化妆品、组织炎症、细菌感染、伤口应用、糖尿病、制药和眼科应用、减轻疤痕、刺激毛发生长、免疫治疗应用和免疫修复治疗、皮肤、骨髓或器官移植、器官或组织治疗。
54.权利要求1所述的间充质干细胞系，其中通过注射、植入或局部施用所述干细胞给予一个或多个所述干细胞。
55.权利要求2所述的间充质干细胞系，其中将所述干细胞系的一个或多个干细胞用于烧伤治疗、皮肤护理、血管生成、血管发生、器官或组织愈合、化妆品、组织炎症、细菌感染、伤口应用、糖尿病、制药和眼科应用、减轻疤痕、刺激毛发生长、免疫治疗应用和免疫修复治疗、皮肤、骨髓或器官移植、器官或组织治疗。
56.权利要求2所述的间充质干细胞系，其中通过注射、植入或局部施用所述干细胞给予所述一个或多个干细胞。
57.权利要求31所述的组合物，还包含防腐剂和表面活性剂。
58.权利要求39所述的组合物，还包含防腐剂和表面活性剂。
59.权利要求58所述的组合物，其中所述防腐剂是硫柳汞、甲酚、福尔马林、苯扎氯铵或苄醇中的一种或多种，所述表面活性剂是tritonX-100。
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