CN108184890A - 一种用于动物原代细胞培养的消毒液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物细胞工程技术领域，具体涉及一种用于动物体外细胞培养的消毒液及其制备方法，所述复配消毒剂主要包括组分：青霉素、硫酸链霉素、硫酸庆大霉素、两性霉素B，本发明的复配消毒剂能在不影响细胞存活的条件下，具有广泛的抗菌谱，能够同时抑制大部分革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和霉菌的生长，实现高效的动物细胞原代培养组织样本消毒以及预防细胞传代过程的微生物污染。

Description

一种用于动物原代细胞培养的消毒液及其制备方法
技术领域
本发明属于动物细胞工程技术领域，具体涉及一种用于动物细胞体外培养的消毒液及其制备方法。
背景技术
动物细胞原代培养是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。分为肿瘤细胞原代培养与非肿瘤细胞原代培养(包括已分化的普通细胞培养和未分化的干细胞培养)。原代培养获取的细胞具有二倍体遗传性，接近和反映体内生长特性，可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，原代细胞培养作为一种研究手段在药物敏感性试验、细胞分化、基因功能和调控机制等领域获得了广泛的应用。
按照培养对象的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。在动物细胞培养过程中需要根据离体细胞的特点，需要提供适宜的温度、CO2分压、pH、渗透压和营养条件，以维持其在体外生长、增殖。哺乳动物细胞培养的温度通常控制在37℃，鱼类的温度控制约在26℃。温度过高或过低时，均不利于细胞生长甚至会导致细胞死亡。动物细胞最适宜pH一般控制在7.2～7.4，在此范围细胞生长活跃，增殖速度快，如果过低或过高性，细胞会因为细胞膜受损而死亡。细胞培养液中需含有细胞增殖、生长所需要的各种营养物质。能够提供细胞生长所需的能量物质(N源、C源)、代谢调节控制的物质(无机盐、维生素、激素)，以及所需要的pH和渗透压环境。
由于细胞培养基营养丰富，细胞在体外无抵抗微生物的能力，导致微生物易于在细胞培养体系中进行增殖，并产生多种有毒的代谢产物，如酶、抗原及毒素等，导致细胞培养基的成分、pH和渗透压等细胞生存所必需的体外环境发生改变，对细胞的生存产生毒害作用。细胞作为一个生物体，亦会对培养环境中的污染物作出相应的反应，造成培养细胞生物学特性改变，从而影响实验结果的准确性。因此保持细胞培养环境无微生物污染是进行细胞培养成功的必要条件。
动物原代细胞培养时，首先需要从动物体内提取目标组织样本进行体外培养。不同来源的样本受微生物污染的情况差别较大，例如来源于哺乳动物消化道和呼吸道等对外开放的器官，以及来源于淡水或海洋中的软体动物如贝类等，目标组织直接暴露于环境中，污染的微生物种类有多种。虽然有些目标组织虽然本身是无菌的，如哺乳动物的肝脏、心脏和肌肉组织，但由于大部分取样动物通常是处于带菌状态，严格的器械消毒和无菌操作有助于减少微生物污染的概率，但不能够完全避免微生物的污染。动物原代培养细胞只有在无菌环境生长才能够生长良好，为了成功进行细胞的体外原代培养，通常需要对目标组织块进行消毒处理。
微生物的污染通常包括细菌、霉菌、支原体和病毒。在体外细胞培养的过程中，最常见的微生物污染是细菌和霉菌。目前在动物细胞原代培养组织样本的取样过程中，需要用不同的消毒剂对其进行消毒处理，以防止微生物的污染。
目前现有的消毒液包括化学消毒剂和抗生素等2大类，其中常见的化学消毒剂包括：70％乙醇溶液、8％NaCIO、15％甲酚皂、0.1％HgCI2、1％过氧乙酸等。常用的抗生素有：双抗(青霉素、硫酸链霉素)，硫酸庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素、制霉菌素和两性霉素B等。
利用消毒剂来杀灭微生物需要一定的工作浓度和作用时间，常用的化学消毒剂在杀菌工作浓度下通常对细胞也有灭活作用。为了保证细胞的存活，化学消毒剂通常用于动物原代细胞培养取样时的初步洗涤和消毒，用于除去样本上沾染的大部分微生物。例如通常利用70％的乙醇溶液洗涤样本30-60秒。为了在保证细胞存活的条件下彻底杀灭可能污染的微生物，通常需要利用一定浓度的抗生素溶液对样本进行进一步处理，以达到预防微生物污染的目的。现有的实验结果表明，庆大霉素和卡那霉素在终浓度为700U/ml和1000U/ml时对金黄葡萄球菌、枯草杆菌可以达到最佳抑菌效果，又能最大限度地保持细胞活性。含有100ug/mL多粘菌素B和青链霉素的混合液对G-短黄杆菌污染有较好的抑制效果。在培养基中加入两性霉素50ug/mL可以抑制霉菌的污染。
不同的抗生素有不同的抗菌谱，但由于方法学的限制通常无法准确判断取样组织污染的微生物种类和数量。如果污染的微生物对应用的抗生素不敏感，单纯增加抗生素浓度并不能够显著提高消毒效果。此外，抗生素随着剂量的加大，对细胞的毒性也会随着加大。基于上述原因，多种抗生素联合应用对动物细胞原代培养组织样本的消毒效果优于单个抗生素处理。
目前市场上的抗生素复配消毒液仅见有青链霉素复配消毒液，或庆大霉素和两性霉素B的复配消毒液。青链霉素复配消毒液对大部分革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌细菌和螺旋体等微生物有良好的抑制和杀灭作用，如溶血性链球菌、肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌、鸡沙门氏菌、白喉杆菌、炭疽杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、副伤寒杆菌、嗜血杆菌、巴氏杆菌，淋病球菌、梅毒螺旋体等，但对于霉菌和病毒等微生物无抑制效果。
庆大霉素和两性霉素B复配消毒液对部分革兰氏阴性菌细菌和霉菌，如：对大肠杆菌、产气杆菌、克雷白杆菌、奇异变形杆菌、某些吲哚变形杆菌、绿脓杆菌、某些奈瑟菌、某些无色素沙雷杆菌、新型隐球菌等细菌，对球孢子菌属、孢子丝菌属和念珠菌属等真菌在低浓度时有抑制作用。
由于青链霉素复配消毒液和庆大霉素两性霉素B复配消毒液的抗菌谱仅部分重叠，在哺乳动物的体外细胞原代培养过程中，单纯用青链霉素复配消毒液或庆大霉素和两性霉素B的复配消毒液预防微生物污染的效果均不十分理想。因此在进行动物原代细胞培养的过程中，通常会根据动物组织的来源不同，常规选用青链霉素预混液与其他不同的抗生素尝试对取样组织块进行消毒处理，以达到预防微生物污染的目的。由于无法准确判断取样组织污染的微生物种类和数量，这种消毒处理样本的结果具有不确定性，成功获得的无污染的体外组织样本需要经过多次试验后才有可能完成。在样本来源稀缺时，会严重影响细胞培养的成功率。由于抗生素对污染微生物的杀灭是一个时间过程，在动物细胞原代培养阶段的继代培养过程中，也需要继续添加广谱抗生素以抑制或杀灭微生物的生长以维持细胞的正常生长。
由于在细胞原代培养过程中存在上述问题，开发研制一种复配消毒液在不影响细胞存活的条件下，具有广泛的抗菌谱，能够同时抑制大部分革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌细菌和霉菌的生长，实现高效的动物细胞原代培养组织样本消毒是现有技术中亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明公开了一种动物细胞体外培养的复配消毒剂及制备方法，解决目前现有复配抗生素(青链霉素复配液、庆大霉素和两性霉素B复配液)溶液抗菌谱较窄，在动物原代细胞培养过程中对取样组织块进行消毒不能够同时预防细菌和霉菌污染的问题；其二，在细胞原代培养阶段的细胞传代培养过程中，在培养基中添加复配抗生素溶液，能够有效预防和抑制细胞培养过程中微生物的污染(细菌和霉菌)。
本发明所述的一种动物细胞体外培养的复配消毒剂主要包括以下组分抗生素：
青霉素；
硫酸链霉素；
硫酸庆大霉素；
两性霉素B。
所述复配消毒剂各组分配比：
优选的所述硫酸庆大霉素占所述复配消毒剂各组分配比为8.0-12.0g/L。
优选的，所述复配消毒剂各组分配比：
另一方面，本发明公开了一种动物细胞体外培养的复配消毒剂的制备方法，所述方法包括步骤：
步骤一：精密称取两性霉素B，加去氧胆酸钠，加灭菌注射用水，滴加氢氧化钠溶液至溶液澄清，再加盐酸溶液得到溶液1。
步骤二：称取青霉素、硫酸链霉素和庆大霉素加PBS缓冲液溶解得到溶液2。
步骤三：将溶液1与溶液2进行混合后用PBS缓冲液定容，用无菌微孔滤膜过滤除菌，然后分装，避光冷冻保存。
优选的，所述氢氧化钠溶液浓度为0.1mol/L。
优选的，所述盐酸溶液浓度为0.1mol/L。
优选的，所述无菌微孔滤膜孔径小于0.22um。
优选的，所述冷冻保存为-20℃。
再一方面，本发明提供了一种动物细胞体外培养的复配消毒剂的使用方法，包括：常温解冻；用PBS缓冲液、Hank’s缓冲液或其他与待培养细胞等渗的缓冲液进行稀释。
所述动物细胞体外培养为哺乳动物细胞原代培养。
进一步，本发明提供了一种用于海洋软体动物原代培养的复配消毒剂的使用方法，包括：用人工海水缓冲液进行稀释，稀释10-200倍应用于取样组织的消毒处理或培养基稀释50-200倍后用于预防细胞传代过程中的微生物污染。
本发明的复配消毒剂能在不影响细胞存活的条件下，具有广泛的抗菌谱，能够同时抑制大部分革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌细菌和霉菌的生长，实现高效的动物细胞原代培养组织样本消毒。
附图说明
图1为本发明实施例2大鼠血管平滑肌组织体外培养细胞第6天的显微镜照片；
图2为本发明实施例3雌性大鼠尿道组织体外培养细胞第18天的显微镜照片；
图3为本发明实施例4SD大鼠软骨组织体外培养细胞第12天的显微镜照片；
图4为本发明实施例5SD大鼠软骨组织体外培养细胞第12天的显微镜照片；
图5为本发明实施例6兔软骨组织体外培养细胞第12天的显微镜照片；
图6为本发明实施例7泥蚶腹足组织体外培养细胞第33天的显微镜照片；
图7为本发明实施例8泥蚶腹足组织体外培养细胞第17天的显微镜照片；
图8为本发明实施例9青蚶腹足组织体外培养细胞第6天的显微镜照片；
图9为本发明对比例1青蚶腹足组织体外培养细胞第6天的显微镜照片；
图10为本发明对比例2青蚶腹足组织体外培养细胞第6天的显微镜照片；
图11为本发明对比例3青蚶腹足组织体外培养细胞第6天的显微镜照片；
图12为本发明对比例4青蚶腹足组织体外培养细胞第6天的显微镜照片。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体的实施方式对本发明的内容做详细的说明，但是具体的实施方式并不是对本发明内容的限制。
实施例1：复配消毒剂的制备
精密称取两性霉素B 25mg，加去氧胆酸钠20.5mg，加灭菌注射用水10ml，用0.1mol/L氢氧化钠溶液2.0ml滴加至溶解(PH值约11.5)，再加0.1mol/L盐酸溶液1.8ml(氢氧化钠用量的90％)为溶液1。称取1000000U青霉素、1g硫酸链霉素和0.8g硫酸庆大霉素加PBS缓冲液80ml溶解为溶液2。将溶液1与溶液2进行混合后用PBS缓冲液定容到100ml，用0.22um的无菌微孔滤膜过滤除菌，然后5ml分装西林瓶中，-20℃避光冷冻保存。上述抗生素贮备液为100倍储备液，临用前用培养基或相应缓冲液稀释。
实施例2：大鼠血管平滑肌组织细胞体外原代培养
1取200g-250g左右的大鼠，用乙醚麻醉后固定在手术台上。
2 75％的乙醇溶液消毒皮肤，眼科剪剪开皮肤，用新的无菌眼科镊及眼科剪分离并取出胸主动脉，然后放入盛有预冷消毒缓冲液PBS的培养皿中；或分离下来的血管放入预冰的DMEM的培养皿中，迅速转入细胞培养室的超净工作台。
3在超净台分离血管中膜，用眼科镊夹去血管外的血凝块和脂肪组织，在用眼科剪把血管剪开，用两把眼科弯镊，刮去血管内膜。然后刮取血管中膜。用一个弯镊压住血管，另一弯镊同时压住血管往下推，中膜由于受力并与外膜分离开来。
4把中膜转移入另一盛有含20％胎牛血清的DMEM的培养皿中，用眼科剪将血管段剪成约lmm3的组织块。
5用无菌巴氏吸管将组织块转入25ml细胞培养瓶中，在组织块上滴2-3滴含20％胎牛血清的DMEM。将培养瓶轻轻翻转使瓶底朝上，旋松瓶盖，于培养箱(37℃，5％CO2)内放置2～3h，待组织块干涸与瓶底贴附后将培养瓶翻转过来平放，向瓶中加入含20％胎牛血清的DMEM 3ml，放入培养箱(37℃，5％CO2)内。6天后再向培养瓶中加入含20％胎牛血清的DMEM3ml，继续放入培养箱(37℃，5％CO2)内静置。
6 6天后取出培养瓶，倒置显微镜下观察可见贴壁的组织块周围有少量细胞生长。
本实施例中添加于消毒液和培养基中所使用的抗生素贮备液配比见下表。
抗生素 青霉素 硫酸链霉素 硫酸庆大霉素 两性霉素B
终浓度 80U/ml 100μg/ml 80μg/ml 2.5μg/ml
7 6d后显微镜下拍照，实验结果见图1。
实施例3：雌性大鼠尿道组织的原代细胞培养
1取200g-250g左右的雌性大鼠断头处死，解剖分离尿道组织。
2将大鼠尿道组织块在预冷PBS缓冲液中分离成约1mm3的小块。
3将1mm3的组织块放入10ml含有复配消毒液预冷的PBS缓冲液中消毒20min后，弃液体。
4用预冷的PBS缓冲液冲洗组织块3次。
5用无菌巴氏吸管将组织块放入培养24培养板，加入少量含有复配消毒液的DMEM培养基置于37℃，5％二氧化碳培养箱中进行培养约4h。
6加入培养基至总体积约1.5ml培养基，置于含有5％二氧化碳的37℃进行细胞原代培养。
7根据细胞生长情况，约12d后进行细胞扩大培养，即将细胞直接消化传代至25cm2的细胞瓶中。
8约3d后待其生长面积达95～100％时进行扩大培养，即将细胞按照1:3的比例直接消化传代至75cm2的细胞瓶中进行扩大培养。对上述细胞进行常规液氮冻存备用。本实施例中添加于消毒液和培养基中所使用的抗生素贮备液配比见下表。
抗生素 青霉素 硫酸链霉素 硫酸庆大霉素 两性霉素B
终浓度 150U/ml 100μg/ml 80μg/ml 2.5μg/ml
9 18d后显微镜下拍照，实验结果见图2。
实施例4：SD大鼠软骨组织细胞体外原代培养1
1将1只SD大鼠放入塑料箱里，通入二氧化碳，窒息致死，用75％乙醇消毒，解剖。
2无菌条件下切取股骨头、膝关节处未骨化的透明软骨，放入盛有预冷的PBS消毒缓冲液的培养皿中。
3去除残余的软组织,用眼科剪将软骨块剪成大小约1mm3之后，转移至新的培养皿中，PBS洗2次，每次2min，弃上清，放入离心管内。
4用DMED培养液将培养板孔润湿，将上述组织碎块放入培养板孔内，使其贴于培养板，倒置约一个小时，放正，缓慢加入培养液使组织块保持贴壁。放入恒温培养箱(37℃，5％CO2)培养12d后显微镜下观察拍照。
本实施例中添加于消毒液和培养基中所使用的抗生素贮备液配比见下表。
抗生素 青霉素 硫酸链霉素 硫酸庆大霉素 两性霉素B
终浓度 100U/ml 80μg/ml 80μg/ml 2.5μg/ml
5 12d后显微镜下拍照，实验结果见图3。
实施例5：SD大鼠软骨组织细胞体外原代培养2
1参照实施例4的方法。
本实施例中添加于消毒液和培养基中所使用的抗生素贮备液配比见下表。
抗生素 青霉素 硫酸链霉素 硫酸庆大霉素 两性霉素B
终浓度 100U/ml 150μg/ml 80μg/ml 2.5μg/ml
2 12d后显微镜下拍照，实验结果见图4。
实施例6：兔软骨组织细胞体外原代培养1
1兔耳缘静脉注射空气处死。
2手术剪刀剪取腿部毛发，用75％乙醇消毒皮肤，解剖。无菌条件下切取膝关节处未骨化的透明软骨，放入盛有预冷的PBS消毒缓冲液的培养皿中。
3去除残余的软组织,用眼科剪将软骨块剪成大小约1mm3之后，转移至新的培养皿中，PBS洗2次，每次2min，弃上清，放入离心管内。
4用DMEM培养液将培养板孔润湿，将上述组织碎块放入培养板孔内，使其贴于培养板，倒置约一个小时，放正，缓慢加入培养液使组织块保持贴壁。放入恒温培养箱(37℃，5％CO2)培养12d后显微镜下观察拍照。
本实施例中添加于消毒液和培养基中所使用的抗生素贮备液配比见下表。
抗生素 青霉素 硫酸链霉素 硫酸庆大霉素 两性霉素B
终浓度 100U/ml 100μg/ml 120μg/ml 2.5μg/ml
5 12d后显微镜下拍照，实验结果见图5。
实施例7：泥蚶腹足组织体外原代细胞培养1
1取3龄的泥蚶若干个，用粗毛刷刷洗泥蚶外表面，在添加有抗生素(青霉素200U/ml+200ug/ml硫酸链霉素)的过滤海水中暂养24h用于减少青蚶自身携带的细菌数量。
2实验时将泥蚶体表用70％酒精棉擦拭干净，打开壳，用灭菌海水(生理盐水)冲洗泥蚶组织，置于无菌操作台上。
3用解剖器具剪取腹足组织，置于冰浴无菌培养皿中用无菌脱脂棉球沾取70％乙醇溶液对腹足进行擦拭消毒，以擦去粘性液体。
4投入包含10ml预冷消毒液的培养皿中在冰浴条件下进行消毒，20min后更换消毒液，期间缓慢摇晃培养皿，重复消毒3次。
5除去消毒液，用未加血清的含复合抗生素的培养基溶液冲洗10次，无菌眼科剪把组织块剪成1mm3小块后，用无菌巴氏吸管将组织块转移到用血清表面预处理的24孔培养板中，密度6-10块/孔。在26℃生化培养箱中倒置贴壁培养4-14h(根据细胞贴壁情况决定)后,正置每孔加入1mL培养基,恒温静置培养6d、17d后观察细胞生长状况。
6 12d后细胞用于传代。
实施例中所使用的消毒缓冲液配比见下表。
药品 NaCl Na2SO4 HEPES
终浓度 25.5g/L 0.8g/L 2.86g/L
抗生素贮备液配比见下表。
抗生素 青霉素 硫酸链霉素 硫酸庆大霉素 两性霉素B
终浓度 100U/ml 100μg/m 40μg/ml 2.5μg/ml
培养基配比见下表。
药品 NaCl KCl MgCl2.6H2O Mg2SO4.7H2O HEPES CaCl2.2H2O
终浓度 18.05g/L 0.29g/L 5.48g/L 4.28g/L 2.86g/L 1.2g/L
抗生素 青霉素 硫酸链霉素 硫酸庆大霉素 两性霉素B 胎牛血清 pH
终浓度 100U/ml 100μg/ml 40μg/ml 2.5μg/ml 15％ 7.4
7分别称量上述各种药品于RPMI-1640培养液中搅拌溶解，在加入抗生素贮备液后抽滤，最后加入血清。
8 33d后显微镜拍照结果见图6。
实施例8：泥蚶腹足组织体外原代细胞培养2
1参照实施例7的方法，实施例中所使用的消毒缓冲液配比同实施例7。
抗生素贮备液配比见下表。
抗生素 青霉素 硫酸链霉素 硫酸庆大霉素 两性霉素B
终浓度 100U/ml 100μg/m 80μg/ml 2.5μg/ml
培养基配比见下表。
2分别称量上述各种药品于RPMI-1640培养液中搅拌溶解，在加入抗生素贮备液后抽滤，最后加入血清。
3 17d后显微镜下拍照，实验结果见图7。
实施例9：青蚶腹足组织体外原代细胞培养3
1参照实施例7的方法，实施例中所使用的消毒缓冲液配比同实施例7。
抗生素贮备液配比见下表。
抗生素 青霉素 硫酸链霉素 硫酸庆大霉素 两性霉素B
终浓度 100U/ml 100μg/m 80μg/ml 0.25μg/ml
培养基配比见下表。
药品 NaCl KCl MgCl2.6H2O Mg2SO4.7H2O HEPES CaCl2.2H2O
终浓度 18.05g/L 0.29g/L 5.48g/L 4.28g/L 2.86g/L 1.2g/L
抗生素 青霉素 硫酸链霉素 硫酸庆大霉素 两性霉素B 胎牛血清 pH
终浓度 100U/ml 100μg/ml 80μg/ml 0.25μg/ml 15％ 7.4
2分别称量上述各种药品于DMEM培养液中搅拌溶解，在加入抗生素贮备液后抽滤，最后加入血清。
3 6d后显微镜下拍照，实验结果见图8。
对比例1：青蚶腹足组织体外原代细胞培养4
1参照实施例7的方法，实施例中所使用的消毒缓冲液配比同实施例7。
抗生素贮备液配比见下表
抗生素 青霉素 硫酸链霉素 硫酸庆大霉素 两性霉素B 卡拉霉素
终浓度 100U/ml 100μg/m 80μg/ml 2.5μg/ml 4ug/ml
培养基配比见下表。
药品 NaCl KCl MgCl2.6H2O Mg2SO4.7H2O HEPES CaCl2.2H2O
终浓度 18.05g/L 0.29g/L 5.48g/L 4.28g/L 2.86g/L 1.2g/L
抗生素 青霉素 硫酸链霉素 硫酸庆大霉素 两性霉素B 胎牛血清 卡拉霉素
终浓度 100U/ml 100μg/ml 80μg/ml 2.5μg/ml 15％ 4ug/ml
2调节pH为7.4
3 6d后显微镜下拍照，实验结果见图9，由于抗生素种类较多，有较好的预防微生物污染效果，但导致细胞无法正常生长。
对比例2：青蚶腹足组织体外原代细胞培养5
1参照实施例7的方法，实施例中所使用的消毒缓冲液配比同实施例7。
抗生素贮备液配比见下表
抗生素 青霉素 硫酸链霉素 硫酸庆大霉素 两性霉素B
终浓度 100U/ml 100μg/m 80μg/ml 25μg/ml
培养基配比见下表。
药品 NaCl KCl MgCl2.6H2O Mg2SO4.7H2O HEPES CaCl2.2H2O
终浓度 18.05g/L 0.29g/L 5.48g/L 4.28g/L 2.86g/L 1.2g/L
抗生素 青霉素 硫酸链霉素 硫酸庆大霉素 两性霉素B 胎牛血清 pH
终浓度 100U/ml 100μg/ml 80μg/ml 25μg/ml 15％ 7.4
2 6d后显微镜下拍照，实验结果见图10，由于两性霉素浓度加大，较好的预防微生物污染效果，但导致细胞无法正常生长。
对比例3：青蚶腹足组织体外原代细胞培养6
1参照实施例7的方法，实施例中所使用的消毒缓冲液配比同实施例7。
抗生素贮备液配比见下表
抗生素 青霉素 硫酸链霉素
终浓度 100U/ml 100μg/m
培养基配比见下表
药品 NaCl KCl MgCl2.6H2O Mg2SO4.7H20 血清
终浓度 18.05g/L 0.29g/L 5.48g/L 4.28g/L 15％
药品 青霉素 硫酸链霉素 HEPES CaCl2.2H2O pH
终浓度 100U/ml 100μg/ml 2.86g/L 1.2g/L 7.4
2 6d后显微镜下拍照，实验结果见图11，青蚶腹足组织外植体在体外未见细胞正常生长，显微镜下显示发生了微生物污染。
对比例4：青蚶腹足组织细胞体外原代培养
1参照实施例7的方法，实施例中所使用的消毒缓冲液配比同实施例7。
抗生素贮备液配比见下表
抗生素 硫酸庆大霉素 两性霉素B
终浓度 80μg/ml 2.5μg/ml
培养基配比见下表
药品 NaCl KCl MgCl2.6H2O Mg2SO4.7H20 血清
终浓度 18.05g/L 0.29g/L 5.48g/L 4.28g/L 15％
药品 硫酸庆大霉素 两性霉素B HEPES CaCl2.2H2O pH
终浓度 80μg/ml 2.5μg/ml 2.86g/L 1.2g/L 7.4
2 6d后显微镜下拍照，实验结果见图12，青蚶腹足组织外植体在体外未见细胞正常生长，显微镜下显示发生了微生物污染。
表1为不同配比消毒液对组织块法体外培养青蚶腹足组织细胞成功率的影响
表1
组织块法体外培养青蚶腹足组织细胞参照实施例7的方法，以及实施例中所使用的消毒缓冲液配比。每个配方处理组制备的组织块用巴氏吸管转移到1块24孔细胞培养板中(6个/孔)。培养6天后显微镜下低倍镜检，有细胞游离出组织块边缘生长，划归成功孔，如图6。有明显微生物污染，划归污染孔，如图12.；无游离细胞生长，也无明显微生物生长，划归无细胞生长组，如图10。
不同抗生素配比如下表2。
表2
抗生素 青霉素 硫酸链霉素 硫酸庆大霉素 两性霉素B
配方1 终浓度 100U/ml 100μg/m 80μg/ml 25μg/ml
配方2 终浓度 100U/ml 100μg/m 80μg/ml 0.25μg/ml
配方3 终浓度 100U/ml 100μg/m 80μg/ml 2.5μg/ml

Claims (10)

1.一种动物细胞体外培养的复配消毒剂，由以下组分抗生素组成：
青霉素；
硫酸链霉素；
硫酸庆大霉素；
两性霉素B。
2.根据权利要求1所述的复配消毒剂，各组分配比：
3.根据权利要求2所述的复配消毒剂，其中硫酸庆大霉素组分配比8.0-12.0g/L。
4.根据权利要求1所述的复配消毒剂，各组分配比：
5.权利要求1-4任一权利要求所述的动物细胞体外培养的复配消毒剂的制备方法，所述方法包括步骤：
步骤一：精密称取两性霉素B，加去氧胆酸钠，加灭菌注射用水，滴加氢氧化钠溶液至溶液澄清，再加盐酸溶液得到溶液1；
步骤二：称取青霉素、硫酸链霉素和庆大霉素加PBS缓冲液溶解得到溶液2；
步骤三：将溶液1与溶液2进行混合后用PBS缓冲液定容，用无菌微孔滤膜过滤除菌，然后分装，避光冷冻保存。
6.根据权利要求5所述的制备方法，所述氢氧化钠溶液浓度为0.1mol/L。
7.根据权利要求5所述的制备方法，所述盐酸溶液浓度为0.1mol/L。
8.根据权利要求5所述的制备方法，所述无菌微孔滤膜孔径小于0.22um。
9.根据权利要求5所述的制备方法，所述冷冻保存为-20℃。
10.权利要求1-4任一权利要求所述的动物细胞体外培养的复配消毒剂的使用方法，包括：常温解冻；用PBS缓冲液、Hank’s缓冲液与待培养细胞等渗的缓冲液进行稀释。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111034711A (zh) * 2019-12-19 2020-04-21 海南一龄医疗产业发展有限公司 高效清除细胞培养过程中微生物污染的组合物及方法
CN112080461A (zh) * 2020-09-14 2020-12-15 内蒙古自治区农牧业科学院 一种动物原代干细胞除菌培养液的制备方法
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