CN1816330A - 抗菌组合物,方法和系统 - Google Patents

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Abstract

公开了包括至少一种EDTA盐的抗菌组合物。这些组合物具有广谱的抗微生物和抗真菌活性以及抗凝血特性。所述抗菌组合物还具有证实的穿透和分解微生物粘液，或生物膜的活性。它们对于人和医学应用是安全的，而且可用于预防感染，或减少已存在的或确定的感染的增殖，和/或消除已存在的或确定的感染。

Description

抗菌组合物，方法和系统
发明的技术领域
本发明涉及用于各种医学应用，以及通常消毒应用，包括工业和环境消毒应用的抗菌组合物，方法和系统。本发明的组合物具有抗微生物，抗真菌，抗病毒和抗阿米巴特性，而且也可用作抗凝血剂。乙二胺四乙酸(EDTA)的特定盐和组合物(C10H12N2Na4O8)，以特定的浓度和pH水平使用。示例性的应用包括抑制，减少或消除微生物和/或真菌微生物在表面，在溶液中，或以复合形式，如在生物膜中的存在。示例性的方法包括，在物体的表面提供抗菌涂层来减少感染的发生，和通过用抗菌溶液进行冲洗，浸泡和/或漂洗，使其与物体和/表面接触，来抑制微生物群的增殖，减少或消除微生物群。
发明背景和现有技术的描述
感染在其中卫生条件重要的许多领域，如在保健中是显著的问题。成问题的感染可能起因于细菌，真菌，阿米巴，原生动物和/或病毒微生物。一旦形成感染，在预防感染和减少或消除感染中都遇到了挑战。感染的环境可能包括物体的表面，液体和液体导管，和/或人或动物。
醇溶液和异丙醇擦拭通常用于消毒表面，而且已经显示具有抗菌活性。发现70％的异丙醇溶液具有最有效的抑制抗微生物作用。这种浓度的醇溶液是相当昂贵的，而且迅速挥发，大大削弱了它们的功效而且增加了它们的成本。而且，尽管异丙醇溶液可用于表面，包括人皮肤，和用于各种医学应用，这种浓度的醇溶液不能为了医学目的施用于人，除了体表。
在保健领域，各种类型的感染和起因是常见的，而且经常导致比较久的住院，导致较高的医院成本。甚至更坏地，每年超过90,000患者的死亡归因于医院感染-也即，在医院或在其它的保健环境获得的感染。用于医院的感染监测已经变成医院实践不可分割的部分。疾病控制和预防中心(CDC)前20多年进行的研究，证明了这些监测活动在减少医院感染发生中的功效。尽管对医院感染问题给予了关注，然而，感染率没有显著地降低，而且医院感染仍然是重要的风险和重要的健康问题。
医学和兽医领域中一个成问题的感染源发现于导管中，而且尤其是在留置导管中。导管在危急护理患者中已经成为必需品，然而导管内部常常是主要的感染源。导管用于输送液体，血液制品，药物，和营养素，以及用于血液透析，血液滤过，腹膜透析，血样提取，患者状况的监控，等等。经皮导管常常通过导管的皮肤渗透被感染。已经发现，百分之七十(70％)的医院血液感染发生在使用中枢性静脉导管的患者中。Daouicher等，New Engl.J.Med.340：1-8(1999)。
尤其是，在一些方法中，导管必须植入，而且保持相对长时间植入患者体内，例如，超过30天。静脉内(IV)处理导管和导尿管一般植入相当一段时间。由于插入区域的损伤，和患者的疼痛，这种导管不能频繁地取出和植入。导管产生的细菌已经显示成为主要的尿路感染源。在怀孕期间接受浅肤插入中心导管的患者还发现处于显著的感染并发症的风险中。Ogura等，Am.J.Obstet.Gynecol.188(5)：1223-5(2003)。此外，中央静脉导管感染，其导致导管相关的脓毒已经引用为居家静脉输入营养期间最频繁的并发症。Reimund等，ClinicalNutrition，21(1)：33-38(2002)。由于感染的风险，导管法可能局限于当该方法绝对必要时的紧急情况。这严重地危害了患者的健康。
在涉及导管的大多数规定的医学方法之后，导管用盐水冲洗，然后充满液体，如盐水或肝素溶液，以防止血液在导管内凝固，抑制患者血液回流到导管中，以及防止气体进入导管。用于冲洗导管的液体称为“封闭-冲洗(lock-flush)”，而冲洗之后或停用期间用于充满导管的液体称为“封闭”溶液。
传统地，导管已经用生理盐水或提供抗凝血活性的肝素溶液封闭。肝素和盐水有时联合使用。生理盐水通常用于封闭短期的外周静脉内导管，但是没有抗凝血或抗微生物的活性。肝素溶液一般用于封闭血管的导管。肝素具有抗凝血活性，但是它没有抗微生物作用，而且不能防止或缓解感染。还有强烈的暗示即封闭肝素溶液可有助于肝素诱导的血小板减少，其是一种发生在接受肝素注射的患者类型中的严重的出血并发症。
推荐的导管封闭溶液包括Taurolidine，柠檬酸和柠檬酸钠。一个最新的公开(Kidney International，Sept.2002)描述了使用70％的醇溶液作为用于皮下注射导管口的封闭溶液。使用醇作为封闭溶液是有问题的，因为它不是抗凝血剂，而且因为存在与这种溶液进入血液相关的风险。该发明人还没有觉察到任何表明70％醇溶液具有任何生物膜消灭活性的证据。
传染病中心(CID)出现的趋势和推荐是用特异性或者宽范围的抗生素系统地处理现存的导管感染。并不推荐在封闭溶液中使用抗生素来防止感染。使用抗生素来治疗已存在的导管感染具有某些风险，包括：(1)产生抗生素抗性株的风险；(2)抗生素不能杀死固着的，或深层生物膜，细菌，其可能需要使用毒性浓度的抗生素；和(3)延长的抗生素疗法的高成本。涂有抗菌的或抗生素材料的导管是有用的。不过，这些涂层的导管可能只提供相对短期的有限保护。
一般而言，游离的浮游生物可能对抗生素是敏感的。不过，细菌和真菌通过在表面聚集，并产生经常称为细胞外聚合物(EPS)的粘性保护性物质，以形成生物膜而可能变得不受抗生素的影响。因为微生物的增殖，可能发生超过50种遗传上调或下调，导致形成更具抗生素抗性的微生物生物膜。医生遇到的三分之二的细菌感染归因于生物膜。Netting，Science News，160：28(2001)。
生物膜形成是细菌生活周期中的一个遗传控制过程，其在微生物的细胞生理学方面产生许多变化，与在浮游生物(自由浮动)状况下的生长相比，常常包括抗生素抗性的增强(多达100到1000倍)。随着微生物的生长，过度拥挤和营养短缺的问题，引起微生物的的脱落以寻找新的位置和资源。这些新脱落的微生物迅速地恢复到它们的最初游离-浮游阶段，而且再度对抗生素敏感。不过，游离的-浮游生物可能进入患者的血液，引起血液感染，其产生临床征兆，例如，发烧，和更严重的感染相关症状。生物膜的固着筏可能脱落并附着于组织表面，如心瓣膜，这引起生物膜增殖和严重的问题，如心内膜炎。
在工业的环境中，生物膜形成是很常见的，而且通常称为生物淤积。例如，生物膜生长于机械结构上，如过滤装置，是饮用水分配系统生物污染的主因。工业环境中的生物膜形成可能导致材料老化，产品污染，机械堵塞和加工系统的传热阻抗。生物膜形成和产生的污染，也是食品制备和加工业中一个常见的问题。
对于更加复杂的情况，常规的敏感性试验只测量游离的-浮游生物的抗生素敏感性，而不是生物膜状态中的微生物。结果，对患者施用抗生素的剂量，如通过导管，总之很少对可能存在于导管中的生物膜阶段的微生物具有预期的作用。生物膜微生物可能继续脱落更多的浮游生物，或者可能进入休眠，而且以后增殖作为一个明显的复发性感染。
为了通过使用抗生素来根除生物膜微生物，实验室必须确定杀死特定遗传生物膜阶段的微生物所需的抗生素浓度。需要高度专业化的设备以提供用于消除生物膜的最小浓度。此外，目前的诊断方案非常耗时，而且常常许多天得不到结果，例如，5天。这种时间周期明显不允许迅速治疗感染。这种延误，和感染的合理担忧，可能导致广谱抗菌素的过度使用，和继续的不必要的导管去除和替换过程。广谱抗菌素的过度使用，可能导致产生不能有效治疗的抗生素抗性菌株。不必要的导管去除和替换是痛苦的，费用大，而且可能导致对导管插入位点组织的损伤和损害。
生物膜的抗生素抗性，以及抗生素应用的并发症，如产生抗生素抗性株的风险，已经使抗生素治疗成为不受欢迎的选择。因此，抗生素应用限于有症状的感染，预防性抗生素一般不用于预防污染。因为生物膜可能作为大多数抗生素的选择性表型的抗性障碍，所以导管必须常常去除以便消除导管相关的感染。导管的去除和置换对患者来说是耗时的，对患者形成压力，而且使医疗复杂化。因此，需要用于杀死微生物，而且尤其是那些存在于导管内部的微生物，而不需要从机体除去导管的方便的而且有效的方法。
除了细菌和真菌感染之外，阿米巴感染可能是非常严重和痛苦的，而且可能危急生命。例如，几种棘阿米巴菌已经发现能感染人。棘阿米巴菌在世界范围内发现于土壤和灰尘，和淡水源以及微咸水和海水中。它们经常发现于加热，通风和空调元件，加湿器，透析元件和接触透镜随身用具中。除了微生物和真菌感染外，棘阿米巴菌感染，在医疗和牙科装置，包括牙刷，假牙及其它牙齿用具，等等中可能也是常见的。棘阿米巴菌感染常常起因于接触透镜及其它与人身体接触的卫生器材的不适当贮存，操作和消毒，棘阿米巴菌可能通过切口，伤口，鼻孔，眼睛等等进入皮肤。
存在许多不同种类的导致成问题感染的微生物，包括各种细菌和真菌。不过，目前消除感染的方法，通常应用能有效抗有限数量的不同微生物的溶液。Root等(Antimicrobial Agents and Chemotherapy，32：1627-1633(1988))描述了体外应用EDTA二钠来抗特定的导管相关的表皮葡萄球菌病原体分离物。
EDTA传统上用作金属螯合剂，而且与其它活性化合物一起用于各种目的。EDTA常常以低浓度，用作血液标本采集和测试的体外抗凝血剂，用作抗氧化剂协同剂，也可以添加到溶液中，例如，作为药物制剂的螯合剂，稳定剂，或防腐剂。EDTA可以各种形式存在，其中一些是钠盐形式的，如二钠，三钠，四钠盐，其它的是金属螯合物如铁，铜，镁，等等。EDTA的某些形式，结合其它物质作为佐剂，用于治疗感染导管的组合物中。当用于临床装置中，或用于人或动物应用的组合物中时，该溶液通常调整到生理，或中性pH的范围。
PCT公开WO 02/05188中描述了醇与添加剂，如EDTA的非钠盐形式的组合。PCT公开WO 00/72906 A1描述了抗微生物剂，例如，抗生素，与第二组试剂，其可以是EDTA的非钠盐形式的冻干混合物，作为螯合剂用于导管冲洗。美国专利5,688,516中，具有抗凝血剂，螯合剂如EDTA，和抗微生物剂如二甲胺四环素的组合物，描述了用于涂层卫生器材并且抑制导管感染。在特定描述的实施例中，EDTA的二钠形式调为7.4的生理pH，用于该组合物。PCT公开WO 99/09997描述了用抗真菌剂与螯合剂如EDTA的组合来治疗真菌感染。
感染产生问题的其它区域，包括与眼睛有关的卫生器材和使用材料，如接触透镜，巩膜扣，缝合材料，眼内透镜等等。尤其是，要强调开发消毒假眼，例如，接触透镜的方法。细菌生物膜可能参与眼睛感染，而且允许细菌存在于与眼睛接触或移植入眼睛中的非生物表面。生物膜还可能在眼睛的生物表面形成。Zegans等，DNA Cell Biol.，21：415-20(2002)。几种形式的角膜炎也可能起源于原生动物阿米巴，其可能污染透镜消毒液体。美国专利5,300,296中描述了EDTA四钠盐和碱金属盐的眼科制剂，缓冲到pH 6-8用于接触透镜的消毒。美国专利5,998,488中描述了EDTA及其它物质，如环化糊精和硼酸的眼科组合物。
在牙科领域，置于口腔的物品，如牙科工具，和牙科与正牙装置如保持器，桥，假牙，等等，需要保持在无菌条件中，尤其是贮存期间和置于口腔中之前。另外，感染可转移到血液中，并变得严重。美国专利6,077,501中描述了EDTA与其它的活性组分一起用于假牙清洁组合物中。
供水也有微生物及其它种类感染的倾向。储水装置，以及供水和排水导管经常被感染。医学和牙科诊所中装液体的桶的内表面，提供了一个适于微生物感染和生长的环境，而且微生物的附着和高保护性生物膜的形成在液体贮存和供给装置中常常是存在问题。
需要预防和破坏各种环境中感染的改良方法和组合物。这种抗菌溶液将具有广谱的抗微生物特性。尤其是，该溶液应该能够穿透保护膜以消除保护膜中的微生物。该方法和溶液应该是安全的足以用作预防措施，以及用于治疗已存在的感染。
发明概述
本发明提供了包括，基本上由，或由一种或多种高于生理pH的pH，和规定浓度的EDTA盐组成的抗菌溶液。本发明人已经发现，某些EDTA组合物具有强大的抗菌活性和作为广谱抗微生物剂的功能，以及作为抗许多致病酵母菌株的杀真菌剂的功能。本发明的EDTA组合物，在杀死致病生物膜微生物，在减少和消除已存在的生物膜，以及预防保护膜形成中也是非常有效的。本发明的EDTA组合物和组合，更进一步显示了抗原生动物和抗阿米巴活性。根据已公开的报道，更进一步地期待本发明EDTA组合物能显示抗病毒活性。
本发明的EDTA制剂能安全的用于人给药，而且是生物相容的和无腐蚀性的。它们可能还具有抗凝血特性，因此可用于预防和/或治疗各种导管相关的感染。本发明的抗菌溶液具有许多应用，包括用作用于各种导管的封闭和封闭冲洗溶液，用作防腐剂或用于对各种医疗，牙科和兽医装置，仪器及其它物体，表面，等等进行消毒的溶液。此外，它们可用于工业，和食品制备和操作装置中的消毒。
本发明的抗菌组合物，可预防性地应用，用于预防感染，或减少和/或消除已存在的或形成的感染。提供了预防或治疗物体或表面具有不需要的微生物感染的方法，这种方法包括使表面或物体与本发明的组合物接触。本发明的组合物，因此可用于抑制微生物群和/或真菌病原体的生长和增殖，包括抑制生物膜的形成和增殖；抑制原生动物群的生长和增殖；抑制阿米巴群的生长和增殖；和预防阿米巴感染，尤其是棘阿米巴菌感染。
本发明还提供了基本上消除微生物群，包括浮游的微生物群和生物膜形式的微生物群的方法，以及基本上消除棘阿米巴菌群的方法。这种方法包括，使感染的物体或表面，或怀疑被感染的物体或面与本发明的组合物接触。根据用于不同方法的抗菌组合物，可能需要不同的接触时间来抑制不同群的形成和增殖，和/或基本上消除不同的群。实施例中提供了用于不同组合物的合适接触时间，而且其还可通过常规试验确定。
在一个实施方案中，本发明的抗菌组合物具有至少4种，优选至少5种以下特性：抗凝血特性；抗广谱浮游生物形式细菌的抑制和/或杀菌活性；抗广谱真菌病原体的抑制和/或杀菌活性；抗广谱固着的，或生物膜形式的细菌的抑制和/或杀菌活性；抗原生动物感染的抑制活性；抗棘阿米巴菌感染的抑制活性；至少以适度的体积对接触的患者是安全并且生物相容的；至少以适度的体积对患者的血液是安全并且生物相容的；对工业物体和表面安全而且相容。
EDTA的可溶性盐可用于本发明的组合物。EDTA的钠盐通常是可获得的，而且普遍使用的包括二钠，三钠和四钠盐，但是也可使用其它的EDTA盐，包括铵，二铵，钾，二钾，铜二钠，镁二钠，铁钠盐，及其组合，只要它们具有所需的抗菌，杀真菌，抗原生动物和/或抗阿米巴特性，而且它们能充分地溶于所需的溶剂。可以使用EDTA盐的不同组合物，而且优选用于特定的应用。重要地，在大多数实施方案中，本发明的组合物和方法不使用传统的抗生素试剂，因此不会促进抗生素抗性微生物的产生。
本发明的抗菌组合物包括由或基本上由一种或多种EDTA盐溶液组成，其pH高于生理pH。优选地，这种组合物的pH至少为8.0。优选地，本发明的组合物的pH在8.5到12.5，9.5到11.5，或10.5到11.5的范围内。EDTA的盐通常以至少0.01％ w/v的量存在。在优选的实施方案中，本发明的组合物包括至少一种EDTA的盐，其量为0.2％到10％ w/v，更优选0.2％到6.0％ w/v，最优选0.2％到4.0％ w/v。
在特定的实施方案中，本发明的组合物包括，或基本上由一种溶剂和至少一种浓度为0.01％到10％ w/v的EDTA的盐组成，其中该溶液的pH为至少9.0，而且具有抗广谱细菌的杀菌活性。优选地，该至少一种EDTA的盐为三钠或四钠EDTA。溶剂一般选自水，盐水，醇及其组合。在一个实施方案中，溶剂是水和乙醇的组合。
本发明的抗菌组合物，可用作封闭和封闭冲洗溶液，用于各种类型的内通路导管，包括用于输送液体，血液制品，药物和营养，排出液体或血液，透析，监控患者状况等等的血管导管。本发明的抗菌溶液也可用作导尿管，鼻管，咽喉管，等的封闭和封闭冲洗溶液。如下所述的一般溶液参数适于这些用途。在一个实施方案中，抗菌溶液包括，由或基本上由一种或多种EDTA钠盐组成，其pH高于生理pH，用于保持内部血管内接入装置的开放。还提供了用于对导管及其它医疗试管，如鼻管等等进行消毒的方法，而且该方法包括使导管或其它的医疗试管与本发明的消毒组合物接触。
在另一个实施方案中，提供了本发明的抗菌组合物，其包括，由或基本上由一种或多种EDTA钠盐组成，其pH大于生理pH，作为消毒溶液，用于卫生器材如假牙及其它牙科的，牙正和/或牙周装置，用于接触透镜及其它光学装置，用于医学和兽医仪器，装置等，以及作为消毒溶液用于表面和物体的消毒。还提供了对这种装置进行消毒的方法，该方法包括使装置与本发明的抗菌组合物接触。通常，本发明的抗菌组合物，可用作浸泡溶液，用于牙科，牙正和牙周装置，包括牙刷，也可用作浸泡溶液，用于接触透镜及其它光学装置，以及医学和兽医仪器，装置等等。用于这些应用，本发明的抗菌组合物通常配制成溶液，或以干燥形式提供，添加合适的溶剂到其中以形成溶液。
在另一个实施方案中，配制了本发明的抗菌组合物，用于溶液，凝胶，乳剂及其它设计用于局部应用的制品，作为防腐剂，擦拭剂，抗菌治疗剂等。本发明的抗菌组合物还可用作与绷带，敷料，伤口愈合试剂和装置等相关的抗菌剂。在相关的实施方案中，提供了用于伤口愈合的覆盖物，如绷带和敷料，其中覆盖物浸渗有一种或多种本发明的组合物。
本发明的抗菌组合物，还可用于工业装置如储水和分配系统，水净化，增湿和减湿装置，和用于食品制备，加工和包装装置，以抑制，减少或基本上消除自由浮动和固着形式的微生物群，以及许多真菌，阿米巴和原生动物群。工业设备和表面可与本发明的抗菌组合物接触，用本发明的抗菌组合物冲洗，或浸泡于本发明的抗菌组合物中。还提供了定时释放的抗菌组合物制剂，以提供随时间的治疗，尤其是在经常难以到达的位点。
附图说明
图1A-1D显示了使用琼脂稀释法测定的抗基本上由EDTA二钾；EDTA二铵；EDTA二钠；EDTA三钠；和EDTA四钠组成的EDTA盐溶液的各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌微生物的最低抑制浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。细菌微生物分离自人患者体内与导管相关的感染。实验技术描述于实施例1中。
图2显示了使用琼脂稀释法测定的抗EDTA的不同制剂的各种真菌微生物的MIC和MBC浓度。实验技术描述于实施例1中。真菌微生物收集自人患者样品。
图3A和3B显示了抗基本上由EDTA铜二钠；EDTA镁二钠；和EDTA铁钠组成的EDTA盐溶液的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌微生物的MIC和MBC数据。细菌微生物分离自人患者中与导管相关的感染。实验技术描述于实施例1中。
图4A-4C显示了抗基本上由EDTA铜二钠与EDTA四钠；EDTA铜二钠与二钾以及EDTA铜二钠和二铵组成的组合EDTA盐溶液的各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌微生物的MIC和MBC数据。细菌微生物分离自人患者中与导管相关的感染。实验技术描述于实施例1中。
图5A-5C显示了抗基本上由EDTA四钠与EDTA二铵；EDTA四钠与二钾；和EDTA二铵与二钾组成的组合EDTA盐溶液的各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌微生物的MIC和MBC数据。细菌微生物分离自人患者中与导管相关的感染。实验技术描述于实施例1中。
图6显示了使用实施例2描述的方法测定的各种微生物的最低生物膜消除浓度(MBEC)值，以mg/ml EDTA四钠(w/v)表示。
图7显示了用基本上由EDTA四钠组成的40mg/ml(w/v)浓度的抗菌组合物感染的肾血液透析导管进行处理的试验结果。
图8显示了用基本上由EDTA四钠组成的20-100mg/ml(w/v)浓度的抗菌组合物对感染的肾血液透析导管，以及一个动脉和一个静脉导管进行处理的试验结果。
发明详述
在许多组合物中EDTA以低浓度与其它的活性组分组合使用作为稳定剂或防腐剂。本发明的抗菌组合物包括较高浓度的EDTA，优选包括至少0.01％的EDTA盐，按每体积溶液的重量计算(w/v)，而且可包括高达15％(w/v)的EDTA盐。对于许多应用，本发明的抗菌组合物优选包括至少0.1％(w/v)的EDTA盐而且低于10％(w/v)的EDTA盐，更优选0.1％(w/v)EDTA盐到8.0％(w/v)的EDTA盐，最优选0.1％到6.0％的EDTA盐。如下所述，示例性的组合物包括3.6-4.4％(w/v)EDTA盐的水溶液，或0.01-0.2％(w/v)EDTA盐的水和乙醇混合物溶液。
用于各种应用的所需的EDTA盐的浓度取决于使用的EDTA盐，或盐的组合，处理的感染类型，达到某种程度，用于抗菌组合物的溶剂。例如，当使用包括乙醇的水溶剂时，相对于用于水作为溶剂的组合物中的EDTA盐的浓度，可以降低提供想要的活性水平所需要的EDTA盐的浓度。包括一种或多种EDTA盐的抗菌组合物，如下面提供的示例性数据所示已经证明了在0.01％到30％或更高的浓度范围的抑制和/或杀菌功效。本发明抗菌组合物中，用于抑制，杀菌，杀真菌，生物膜消除及其它用途所需的EDTA盐的“有效”浓度可通过如下面提供的实施例中所述的常规实验测定。
英国药典(BP)规定5％的EDTA二钠溶液的pH为4.0到5.5。BP还规定7.0到8.0的pH范围用于EDTA三钠溶液。下面的实施例10中提供了其它EDTA盐水溶液的pH值。在生理pH时，EDTA钠盐以EDTA二钠与三钠的组合存在，而且EDTA三钠盐是主要的。在美国，制备用于注射的药物EDTA“二钠”一般用氢氧化钠滴定到pH为6.5到7.5。在该pH时，EDTA溶液实际上主要包括EDTA三钠，而且二钠盐的比例较低。包括用于医学或保健应用的EDTA钠盐的其它组合物通常被调节到基本上为生理pH。
在某些实施方案中，本发明的抗菌组合物包括，基本上由或由处于EDTA钠盐溶液(或EDTA钠盐的组合)组成，其以高于生理的pH，优选以高于8.0的pH，以高于8.5的pH，以高于9的pH，以高于9.5的pH，或以高于10的pH。在其它的实施方案中，本发明的抗菌组合物包括，基本上由，或由EDTA钠盐溶液(或EDTA钠盐的组合)组成，其以8.5到12.5的pH，以9.5到11.5的pH，或以10.5到11.5的pH。当用于这里时，术语“EDTA盐”可指单价盐，如二钠，三钠或四钠盐，或另外的EDTA盐形式，或它可指这些盐的组合。EDTA盐的组合物取决于用于配制组合物的EDTA盐，与组合物的pH。对于包括所需pH范围的EDTA钠盐的本发明抗菌组合物(上面规定的)，EDTA钠盐主要以三钠与四钠盐形式存在。
在一个实施方案中，本发明的抗菌组合物包括或基本上由至少EDTA三钠与四钠盐的组合组成。在另一个实施方案中，本发明的抗菌组合物包括或基本上由至少EDTA三钠与四钠盐的组合组成，其中组合物中至少10％的EDTA以四钠盐的形式存在。在其它的实施方案中，本发明的抗菌组合物包括或基本上由至少EDTA三钠与四钠盐的组合组成，其中组合物中至少50％或至少60％的EDTA以三钠盐的形式存在。在另一个实施方案中，本发明的抗菌组合物包括或基本上由EDTA二钠，三钠与四钠的组合组成，其中组合物中低于10％的EDTA以二钠盐的形式存在。
包括，或基本上由，或由除了，或除EDTA钠盐之外的EDTA盐组成的抗菌组合物具有不同的″有效″pH范围。用于抑制，杀菌，杀真菌，生物膜根除及其它用途的本发明抗菌组合物中所需EDTA盐的“有效”pH范围可通过常规实验测定。
在一些实施方案中，如上所述，本发明的抗菌组合物由EDTA盐组成，抗菌溶液由溶于溶剂，通常为水溶剂如水或盐水的EDTA盐组成。在其它的实施方案中，如上所述，本发明的抗菌组合物基本上由通常溶于水溶剂如水或盐水中的EDTA盐组成。基本上由EDTA盐，或EDTA盐的组合组成的本发明抗菌组合物，基本上不含其它具有显著抗微生物和/或抗真菌活性的活性物质。在该上下文中，显著的抗微生物和/或抗真菌活性指抗微生物和/或抗真菌活性为浓度为4.0％，pH10.5时，EDTA钠盐组合物的水溶液至少具有50％的抗微生物和/或抗真菌活性。
在一些实施方案中，本发明的抗菌组合物包括具有指定浓度，指定pH范围的EDTA盐，而且除如上所述的EDTA盐之外，可能包括含有活性组分的材料。其它的抗微生物或杀菌生物组分可以掺入本发明的抗菌组合物中，但是由于产生抗生素和杀菌抗性微生物的可怕结果，传统的抗生素和杀虫剂应用通常被阻止。在一些实施方案中，包括指定浓度和pH范围的EDTA盐的本发明抗菌组合物基本上不含其它具有显著的抗微生物和/或抗真菌活性的活性物质。
其它的活性和非活性组分也可掺入本发明的抗菌组合物中，只要他们不有害地影响EDTA盐的活性和/或稳定性。蛋白水解试剂也可掺入抗菌组合物中用于某些应用。制备用于局部施用的抗菌组合物，例如，可包括各种膏剂，乳剂和皮肤护理组合物如芦荟(aloe vera)，等等。提供于溶液制剂中的本发明抗菌组合物还可包括其它的活性和非活性组分，只要它们没有消极地妨碍EDTA盐的活性和/或稳定性。
本发明的组合物可以溶液或干燥形式应用。溶液中，EDTA盐优选溶于溶剂，该溶剂可包括水溶液，如水或盐水，或另一种生物相容的溶液，其中EDTA盐是可溶的。也可使用其它的溶剂，包括醇溶液。在一个实施方案中，本发明的EDTA盐组合物可在水和乙醇的混合物中配制。这种溶液是高效的，而且可通过在水中制备浓缩的EDTA盐原液，然后引入所需浓度的乙醇来制备。大约0.01％到10％，w/v的EDTA盐浓度是合适的，和大约0.1％到大约10％v/v的乙醇浓度提供有效的抗菌组合物。在一些实施方案中，水中大约2mg/ml(0.2％w/v)的EDTA盐浓度与大约1％(v/v)的乙醇浓度能非常有效的抗广谱菌株。当使用EDTA钠盐时，这些抗菌组合物的pH范围如上所述。也可使用生物相容的非水溶剂，只要EDTA盐可溶解并在贮存和使用期间保持在溶液中。
本发明的EDTA溶液优选以无菌的和非致热形式提供，而且可以任何方便的方式包装。在一些实施方案中，本发明的抗菌EDTA组合物可与卫生器材一起提供或作为卫生器材的一部分提供，如提供于预先填充的注射器或其它的卫生器材。组合物可在无菌条件下制备，或它们可在制备和/或包装之后，使用任何各种适合的灭菌技术进行灭菌。可以提供EDTA溶液的单一或多种用途的小瓶，注射器或容器。本发明的系统包括含有本发明的EDTA溶液的这种小瓶，注射器或容器。
本发明的组合物也可以基本上“干燥的”形式提供，如位于桶或导管，或医学或工业仪器如导管或管道，或容器等等的表面上的基本上干燥的涂层。本发明的EDTA组合物的这种基本上干燥的形式可以粉末或冻干形式提供，其可以通过添加溶剂重组以形成溶液。EDTA组合物基本上干燥的形式，或者提供作为涂层，或可掺入凝胶或其它的类型的载体中，或者做成胶囊，或者进行包装，和提供于表面上作为涂层或提供于容器中。在溶液存在时，可以制备这种基本上干燥形式的本发明EDTA组合物，以便该基本上干燥的组合物形成具有如上所述组成和特性的EDTA溶液。在某些实施方案中，可使用不同的胶囊或贮存技术，以便根据延伸的暴露于溶液而实现EDTA的有效时间释放。在该实施方案中，基本上干燥的EDTA溶液可提供随时间延长期和/或依据多次暴露于溶液的抗菌活性。
包含EDTA的组合物在医学使用和施用给人时具有非常确实的安全模式。每天，3小时灌输多达3000mg EDTA二钠的剂量，用于治疗人的高钙血症，而且是可以良好耐受的。EDTA盐还可与其它的组分一起存在于用于医学和人健康应用的许多溶液中，而且已经确定对于人体外和体内使用都是安全的。EDTA盐可以合理价格获得，而且在溶液中随时间是稳定的。
本发明抗菌组合物的配制和生产通常是简明的。在一个实施方案中，本发明所需的抗菌组合物可通过在水溶剂如净化水中溶解至少一种EDTA盐来达到所需的浓度并调整EDTA盐溶液的pH到所需的pH来进行配制。在其它实施方案中，本发明所需的抗菌组合物可通过在溶剂中溶解至少一种EDTA盐来配制，其中EDTA盐或盐的组合是可溶的以提供浓缩的，溶解的EDTA盐溶液。然后可添加另外的溶剂或组分。或者，溶解的EDTA盐组合物可以除了溶液以外的形式配制，如局部制品。抗菌溶液然后可以使用传统方法进行灭菌，如高压灭菌，紫外线照射，过滤，超滤，和/或其它的方法。EDTA溶液优选的摩尔渗透压浓度范围是240-500mOsM/Kg，更优选300-420mOsm/Kg。该溶液优选使用USP材料制备。
包括，基本上由，或由三或四钠盐，或其混合物组成的抗菌组合物优选用于许多应用，而且可使用除三和四钠盐之外的EDTA钠盐制备，如EDTA二钠很容易获得。EDTA二钠溶液在溶液中具有低于本发明组合物所需pH范围的pH。不过，使用pH调节物质，如氢氧化钠，乙酸钠或其它的熟知pH调节试剂，把pH调节到所需范围后，使用二钠盐制备的EDTA溶液转变为优选的本发明组合的EDTA二，三和/或四钠盐组合物。因此，不同形式和组合的EDTA盐可用于制备本发明的EDTA组合物，只要在使用之前，将组合物的pH调节到所需的pH范围。在一个实施方案中，可通过在水溶液中以3％-5％重量/容积的基础溶解EDTA二钠，并添加足以提供8.5到12.0的所需pH的氢氧化钠量来提供主要由EDTA三和四钠的混合物组成的抗菌组合物。
包括，基本上由或由如上所述的至少一种EDTA盐组成的本发明抗菌组合物也可用于许多其它的应用。EDTA溶液可用作抗菌溶液，用于浸泡，漂洗，或接触医疗，牙科和兽医的表面和物体。本发明的EDTA溶液，例如，可用于贮存和/或消毒接触透镜及其它光学装置；用于贮存和/或消毒牙科装置如假牙，桥，保持器，牙刷，等等；和用于贮存和/或消毒医疗，牙科和兽医装置和仪器。在这些应用中，装置或表面可与本发明的EDTA溶液接触，或浸泡于本发明的EDTA溶液中，其时间为足以基本上消除微生物和/或杀真菌感染。本发明的EDTA组合物另外可用于消毒水及其它液体供给线路。可通过使用本发明的EDTA组合物间歇性地冲洗该线路来对液体供给线路进行消毒。同样，本发明的EDTA组合物可用于消除水供给和贮存设备中的生物膜，和微生物(包括一些病毒和原生动物)以及真菌群。
已经使用本发明包含EDTA的组合物，进行了许多实验测试和方法以确定它们的特性和它们作为抗菌组合物的功效。下面详细描述了几种实验方法。提供了这些方法和实验结果，只是为了用于示例的目的，而不是为了以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
使用琼脂稀释法，测定抗各种EDTA制剂的微生物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)数据
使用如下所述的琼脂稀释法，测定了不同革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌和酵母微生物对几种不同EDTA制剂的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。也测试了不同微生物对EDTA盐组合的MIC和MBC。
革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌微生物分离自患有导管相关感染的人患者，以确保细菌染色是主动致病的，而且是常见的人导管相关的细菌感染类型。酵母微生物收集自患有严重的败血病感染的患者。对微生物进行编目录，并保藏于Leeds大学的Peter Kite实验室中。
通过将相应的试剂级的EDTA盐溶解于蒸馏水中形成所需的EDTA盐浓度(w/v)，来制备各种EDTA盐溶液和组合的EDTA盐溶液。制备每种EDTA盐或EDTA盐组合的浓缩EDTA盐母液，并用于测定各种微生物的MIC和MBC。使用EDTA四和三钠盐，而不是使用EDTA二钠，并调节溶液的pH以达到所需的pH范围，来制备EDTA四和三钠溶液。EDTA盐溶液在使用之前进行灭菌，并4℃贮存。
琼脂稀释法方案
制备琼脂
●把2升营养琼脂置于蒸汽浴中，并保持大约1小时(直到熔化)。
●使琼脂冷却到50℃。
●收集20个灭菌的(125ml)玻璃瓶，并将100ml营养琼脂分装到每个玻璃瓶中。使用200mg/mL原液，添加0.5，1.0，1.5，2.0，4，6，8，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80，90和100mg/mL EDTA四钠(或测试的其它EDTA盐或EDTA盐组合)到该玻璃瓶中。
●将20mL琼脂倾入到灭菌的皮氏培养皿中，并允许进行分组。倾入另外3个平板。用它们包含的EDTA浓度对平板进行标记。对每个浓度都进行该操作。
●然后可以把这些平板贮存于4℃冰箱中，直至使用。
接种平板
●在营养肉汤中过夜培养23个革兰氏阳性微生物和19个革兰氏阴性微生物的培养物。
●使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)，将各培养物稀释至106cfu/mL。
●使用自动平板接种器，用21个微生物对每个平板进行接种。
●37℃孵育平板过夜。
●第二天对生长进行+或-打分。
●使用消毒的滤纸，把培养物从最初的平板转移到新鲜的Cled琼脂平板，以测定MBC。
●37℃孵育复制平板过夜。
●第二天对生长进行+或-打分。MIC和MBC被称作没有生长的最低浓度。
结果显示于图1A-5C。图1A-1D显示了许多革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物抗基本上由EDTA二钾；EDTA二铵；EDTA二钠；EDTA三钠和EDTA四钠组成的EDTA盐溶液的MIC和MBC数据(表示为mg/ml EDTA溶液，w/v)。
图2显示了酵母抗基本上由EDTA四钠；EDTA二钾；和EDTA二铵组成的EDTA盐溶液的MIC和MBC数据(表示为mg/ml EDTA溶液，w/v)。
图3A和3B显示了革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物抗基本上由EDTA铜二钠；和EDTA镁二铵和EDTA铁钠组成的EDTA盐溶液的MIC和MBC数据(表示为mg/ml EDTA溶液，w/v)。
图4A-4C显示了革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物抗基本上由EDTA铜二钠与四钠；EDTA铜二钠与EDTA二钾；EDTA铜二钠和二铵组成的组合EDTA盐溶液的MIC和MBC数据(表示为mg/ml EDTA溶液，w/v)。
图5A-5C显示了革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物抗基本上由EDTA四钠与二铵；EDTA四钠与二钾；EDTA二铵与二钾组成的组合EDTA盐溶液的MIC和MBC数据(表示为mg/ml EDTA溶液，w/v)。
几种EDTA盐与EDTA盐组合能以合理的浓度有效抑制和/或消除广谱的细菌菌株。前面在人与动物中的医学测试和应用，已经确定了用于EDTA钠盐的优良生物适应性模式，虽然还没有确定其它EDTA盐的生物适应性。EDTA四和三钠盐仿佛能最有效的抗广谱病原菌。此外，已经，或可容易地确定它们用于人和兽医应用的生物适应性，而且它们可以节约成本并且是稳定的。另外EDTA四钠盐具有作为抗凝血剂的活性，而且在水溶剂中是高度可溶的。基于上面所述的这些因素和实验，选择EDTA四和三钠盐作为用于本发明抗菌组合物最有希望的候选物。
实施例2
使用修饰的Calgary装置方法，测定抗EDTA四钠的微生物的最低生物膜消除浓度(MBEC)数据
生物膜形成是细菌污染中的一个重要因素。有效的抗菌组合物优选具有降低生物膜增殖，或防止或抑制生物膜形成的能力。因此我们测试了4个候选的EDTA四钠抗菌溶液，以测定它是否能防止或抑制生物膜的形成。使用修饰的Calgary装置方法，确定了抗EDTA四钠的各种微生物的最低生物膜消除浓度(MBEC)。Calgary方法描述于Olsen等，Canadian Journal of Veterinary Research，66：86-92(2002)和美国专利6,599,714中。该方法和结果描述如下。
通过把试剂级的EDTA四钠盐溶解于蒸馏水中形成所需的EDTA盐浓度(w/v)，来制备EDTA四钠盐溶液。制备浓缩的EDTA四钠盐母液，用于测定固着的，或生物膜形式的各种微生物的MBEC。EDTA四钠溶液在使用之前进行灭菌并4℃贮存。
方法
形成生物膜：
●使用100ml所需微生物的Muller Hinton过夜肉汤。
●移取200μL到96孔微滴定板的所有孔中。置于带有96个针的盖子上。以200rpm的速度，37℃在定轨摇床上孵育24小时。
感病性试验：
●使用上面形成的生物膜。
●把盖子(带有销)置于含有250μL所需浓度的测试试剂的新96孔微滴定板中。37℃孵育1到2小时。(不在摇床上)。
●以1，3，6，和24小时的时间间隔，通过插入螺丝刀并拔出销到孔中，而从盖子除去每个浓度的4个销。
●把每个浓度3个销置于5ml PBS洗涤液中，并倒置一次。
●把3个销置于3mL PBS中，并超声处理15分钟。滤出2μL到3X CLED平板上，并使用消毒的塑料展开器进行展开。37℃孵育过夜。第二天读取克隆数。
●把剩余的活动销(每种浓度)置于600μL 4％的甲醛生理盐水中，用于SEM。
图6显示使用该方法测定的各种微生物的MBEC值，以mg/mlEDTA四钠(w/v)表示。结果证明，40mg/ml的EDTA四钠(4％w/v)对于所有测试的微生物群而言是有效的生物膜消除浓度。
下面提供了通过MBEC实验产生的各种微生物的示例性数据。EDTA四钠用于所有的实验，其以三个重复进行。
表1：微生物：250E.coli
  EDTA浓度mg/mL   1小时后的克隆数/mL   3小时后的克隆数/mL   6小时后的克隆数/mL   24小时后的克隆数/mL
  0   40152   53285   64234   6133
  48175   62044   56934   4960
  43796   61314   76642   5120
  5   0   520   80   0
  0   540   80   0
  0   620   133   730
  10   0   0   0   0
  0   0   0   0
  0   0   0   0
  15   0   0   0   0
  0   0   0   0
  0   0   0   0
  20   0   0   0   0
  0   0   0   0
  0   0   0   0
对于250E.coli，MBEC＝10mg/mL EDTA四钠。
表2：微生物：J26铜绿假单胞菌
  EDTA浓度mg/mL   1小时后的克隆数/mL   3小时后的克隆数/mL   6小时后的克隆数/mL   24小时后的克隆数/mL
  0   86861   4400   92701   66667
  89781   3060   79562   35036
  94891   3080   83212   41606
  5   0   0   0   0
  0   0   0   0
  0   0   0   0
  10   0   0   0   0
  0   0   0   0
  0   0   0   0
  15   0   0   0   0
  0   0   0   0
  0   0   0   0
  20   0   0   0   0
  0   0   0   0
  0   0   0   0
对于J26铜绿假单胞菌，MBEC＝＜5mg/mL EDTA四钠。
表3：微生物：292阴沟肠杆菌
  EDTA浓度mg/mL   1小时后的克隆数/mL   3小时后的克隆数/mL   6小时后的克隆数/mL   24小时后的克隆数/mL
  0   1.00E+06   103704   94444   91241
  1.00E+06   118519   131481   116667
  1.00E+06   107407   100000   131481
  5   69343   35036   36496   0
  67153   15974   32197   0
  67153   19697   39416   0
  10   38686   12035   80   0
  42336   17803   219   0
  40909   18561   0   0
  15   8000   8133   379   0
  8533   8133   219   0
  7467   8267   133   0
  20   13786   2840   0   0
  12473   2820   0   0
  14661   2600   0   0
对于292阴沟肠杆菌，MBEC＝＜5mg/mL EDTA四钠。
表4：微生物：H.Enterococcus sp.
  EDTA浓度mg/mL   1小时后的克隆数/mL   3小时后的克隆数/mL   6小时后的克隆数/mL   24小时后的克隆数/mL
  0   5600   3520   4000   6133
  8133   3980   3440   4720
  6800   3920   3760   4640
  5   1380   780   80   0
  1160   580   100   0
  1140   500   120   0
  10   40   0   0   0
  100   0   0   0
  20   0   0   0
  15   40   0   20   0
  0   0   0   0
  80   0   20   0
  20   1480   730   160   0
  1560   379   160   0
  2000   320   140   0
对于H.Enterococcus sp.，MBEC＝＜5mg/mL EDTA四钠。
表5：微生物：J22阴沟肠杆菌
  EDTA浓度mg/mL   1小时后的克隆数/mL   3小时后的克隆数/mL   6小时后的克隆数/mL   24小时后的克隆数/mL
  0   124074   107407   105556   101852
  116667   91241   105556   120370
  112963   98540   92701   100000
  5   6400   267   2040   0
  5200   133   2160   0
  8933   379   1820   0
  10   3540   1920   267   80
  3040   2900   160   1532
  3760   2340   219   800
  15   2620   1560   740   0
  2100   1740   720   0
  2720   1580   920   0
  20   2040   80   960   0
  2360   1460   840   0
  1620   133   560   0
对于J22阴沟肠杆菌，MBEC＝15mg/mL EDTA四钠。
表6：微生物：R81普通变形杆菌
  EDTA浓度mg/mL   1小时后的克隆数/mL   3小时后的克隆数/mL   6小时后的克隆数/mL   24小时后的克隆数/mL
  0   62044   81752   112963   59259
  55474   73723   103704   68519
  54015   78832   107407   59124
  5   3160   160   3460   0
  4000   400   3120   0
  4000   160   3140   0
  10   1520   730   400   0
  1920   533   1460   0
  1900   438   160   0
  15   2960   379   1100   0
  2580   80   780   0
  2560   400   1220   0
  20   4560   400   1520   0
  4480   320   1280   0
  2820   240   720   0
对于R81普通变形杆菌，MBEC＝＜5mg/mL EDTA四钠。
实施例3
对患者阳性导管的体外导管封闭处理方法
开发了使用候选的40mg/ml(4％ w/v)EDTA四钠溶液的导管封闭处理方法，并用于测试各种微生物感染阳性的样品患者血液透析导管。对测定为具有微生物感染的导管，使用EDTA四钠进行导管封闭处理，并在不同的时间点进行克隆计数。在第一个实验中，所有导管都用4％ w/v EDTA四钠进行处理，而在另一个实验中，导管用不同浓度的EDTA四钠溶液进行处理。制备EDTA四钠溶液，并如上面实施例1和2中所述进行贮存。方法和结果如下所述。
方法：
●通过沿着每个腔冲洗1mL无菌磷酸盐缓冲盐水，筛选除去有感染嫌疑的肾血液透析导管。使用展开到血液琼脂平板上并孵育的1和10μL等分试样，进行定量培养。
●导管首先于4℃贮存，直到筛选后，而且外部腔用醇擦拭进行消毒。
●在封闭处理测试之前，筛选的阳性导管用营养肉汤使用5mL注射器进行封闭，并37℃孵育过夜，以确保生物膜活力，并确保具有感染微生物的所有内腔表面的总复制。
●过夜孵育之后，每个导管腔都用5mL无菌盐水进行冲洗，而且从远端切取2个1cm的碎片，每个都置于1mL 1M的无菌氯化钙中，(用于中和试剂)，一个用于扫描电子显微镜检术(SEM)，另一个用于在消毒的通用容器中进行培养。
●为进行培养程序，全部在室温下置于超声处理槽15分钟，然后涡旋20秒。
●使用置于血液琼脂平板上的1μl和10μl等分试样，并通过无菌的塑料L形棒条体展开，37℃孵育过夜，而且第二天进行克隆计数，来进行定量培养。
●导管用合适浓度的EDTA四钠封闭液体进行冲洗和封闭，并于37℃孵育18小时。
●在3，6和18小时孵育时，切断导管远端的2个1cm碎片，并在1mL 1M的无菌氯化钙溶液中进行中和。
●如前面所述的，以每个时间间隔，接着进行定量计数程序，而且1个碎片用于SEM。
将17个感染的肾血液透析导管用40mg/ml(4％ w/v)浓度的由EDTA四钠组成的抗菌组合物进行处理。结果显示于图7中。另外10个感染的肾导管，以及一个动脉和一个静脉导管，用由EDTA四钠组成的抗菌组合物，以20-100mg/ml(2-10％ w/v)的浓度进行处理。结果显示于图8中。
结果证明，处理24小时之后，40mg/ml(4％ w/v)的EDTA四钠能有效杀死或显著地降低大多数的微生物群。这种浓度的EDTA四钠可安全的用于人及其它动物，且被认为是有效的，因此是用于本发明抗菌组合物和方法的所需浓度。
实施例4
EDTA四钠对棘阿米巴菌的作用和EDTA四钠处理的克雷伯氏杆菌对棘阿米巴菌的影响
棘阿米巴属的几个种能感染人。棘阿米巴菌感染常常是不适当贮存接触透镜及其它接触到人体的卫生器材导致的结果。棘阿米巴菌以细菌群为食，而且对许多处理有抗性。如下测试了如上所述制备的EDTA四钠对棘阿米巴菌群的作用。还使用Pages盐水和生理盐水作为溶剂，制备了EDTA四钠组合物。还使用以下方法，试验性地测试了EDTA四钠处理的克雷伯氏杆菌对棘阿米巴菌的作用。
EDTA四钠对棘阿米巴菌的作用
方法：
●在测试之前，新鲜的血液琼脂平板用Klebsiella edwardsii于37℃孵育18小时。
●使用EDTA四钠原液(100mg/mL)，在Page′s盐水中达到浓度为22和44mg/mL。
●把每个浓度9mL的液体置于无菌的玻璃试管中。把9mL无菌的Page′s盐水置于另一个无菌玻璃试管中，作为对照。
●在6mL无菌Page′s盐水中制备克Klebsiella edwardsii的悬浮液。调整至McFarland标准5。
●添加1mL该悬浮液到各连续稀释物和对照中。取决于克雷伯氏杆菌悬浮液的稀释系数，每个浓度现在都为20和40mg/mL。对照仍然不含EDTA四钠。在生理盐水中重复所有浓度。
●进行涡旋混合。每个试管现在都包含McFarland 0.5的克雷伯氏杆菌悬浮液。
●刮取整个棘阿米巴菌平板的表面，并悬浮于1.5mL Page′s盐水中。涡旋。
●添加200μL棘阿米巴菌悬浮液到每个连续稀释物和对照中。
●把试管置于30℃的孵育器中24小时。
●孵育之后，3000rpm离心各试管10分钟。
●倒掉上清液并重悬浮沉淀。
●把双份10μL的每个稀释物和对照，置于带有克雷伯氏杆菌菌苔的非营养琼脂平板中。沿着每个平板的中心割一个凹槽，以防止移动，并把10μL待测试的稀释物置于每个侧面上。
●用黑色记号笔标记每个接种位点。
●30℃孵育平板72小时。
●使用X10的放大目镜光学显微镜，通过直接平板目测，从每个接种位点开始，检查棘阿米巴菌菌的生长。
表7：用EDTA四钠孵育24小时后的生长
  EDTA的浓度mg/mL(溶液)   棘阿米巴菌的生长
  0(Pages盐水)   +++
  0(Pages盐水)   +++
  20(Pages盐水   ++
  20(Pages盐水)   ++
  40(Pages盐水)   -
  40Pages盐水)   -
  0(生理盐水)   +++
  0(生理盐水)   +++
  20(生理盐水)   ++
  20(生理盐水)   ++
  40(生理盐水)   -
  40(生理盐水)   ++
表8：用EDTA四钠孵育24小时后的生长(重复)
  EDTA的浓度mg/mL   棘阿米巴菌的生长
  0(Pages盐水)   +++
  0(Pages盐水   +++
  20(Pages盐水)   ++
  20(Pages盐水)   ++(营养体存在)
  40(Pages盐水)   -
  40Pages盐水)   -
  0(生理盐水)   +++
  0(生理盐水)   +++
  20(生理盐水)   --
  20(生理盐水)   --
  40(生理盐水)   +++
  40(生理盐水)   ++(营养体存在)
表9：用EDTA四钠孵育48小时后的生长
  EDTA的浓度mg/mL   棘阿米巴菌的生长
  0(Pages盐水)   +++(营养体存在)
  0(Pages盐水)   +++(营养体存在)
  20(Pages盐水)   -
  20(Pages盐水   -
  40(Pages盐水)   -
  40(Pages盐水)   -
  0(生理盐水)   +++
  0(生理盐水)   +++
  20(生理盐水)   -
  20(生理盐水)   -
  40(生理盐水)   -
  40(生理盐水)   -
结果证明在Pages和生理盐水中暴露48小时之后，20-40mg/ml(2-4％ w/v)的EDTA四钠能有效减少或基本上消除棘阿米巴属群。使用水作为溶剂制备的EDTA四钠组合物也是有效的(数据未显示)。
这些结果表明，本发明的抗菌组合物适于用作浸泡溶液，用于各种医学设备与装置，包括接触透镜，和牙科，牙矫正和/或牙周病学装置。本发明的抗菌组合物，在其它的应用中也能有效的基本上消除棘阿米巴属群，包括在淡水和海水贮存和分配系统中，在加热，通风，和空气调节器装置，加湿器，透析装置等中。
棘阿米巴属以细菌群为食。因此我们用本发明的抗菌EDTA组合物处理的细菌群测试了对喂食了处理的细菌群的棘阿米巴属是否有任何影响。
EDTA四钠处理的克雷伯氏杆菌对棘阿米巴菌的影响
方法：
●在测试之前，新鲜血液琼脂平板用Klebsiella edwardsii于37℃孵育18小时。
●使用EDTA四钠原液(100mg/mL)，使在Page′s盐水中达到浓度为22和44mg/mL。
●把每个浓度的9mL溶液置于无菌的玻璃试管中。把9mL无菌的Page′s盐水置于另一个无菌玻璃试管中，作为对照。
●用6mL无菌Page′s盐水制备Klebsiella edwardsii的悬浮液。调节到McFarland标准5。
●添加1mL该悬浮液到每个连续稀释物和对照中。取决于克雷伯氏杆菌悬浮液的稀释系数，每个浓度现在都为20和40mg/mL。对照仍然不含EDTA四钠。在生理盐水中重复所有浓度。
●进行涡旋混合。每个试管现在都包含McFarland 0.5的克雷伯氏杆菌悬浮液。
●37℃孵育试管过夜。
●第二天，300rpm离心试管10分钟。倒出上清液；添加10mL新鲜盐水或Page′s盐水，重悬浮并再离心。倒出上清液并重悬于1mL盐水或者Page′s盐水中。
●刮取整个棘阿米巴菌平板的表面，并悬浮于1.5毫升5mL Page′s盐水中。涡旋。
●添加200μL棘阿米巴菌悬浮液到3个含有9mL盐水的试管中，和3个含有3mL Page′s盐水的试管中。标记每个试管的用于与克雷伯氏杆菌孵育的EDTA浓度。
●添加1mL重悬的克雷伯氏杆菌到含有棘阿米巴菌的合适试管中。
●把试管置于30℃的孵育器中24小时。
●设置另一套试管来如前所述用EDTA于37℃孵育克雷伯氏杆菌过夜。
●孵育之后，以3000rpm离心每个包含棘阿米巴菌的试管10分钟。
●倒掉上清液并重悬沉淀。
●把双份10μl的每个稀释物和对照置于带有克雷伯氏杆菌菌苔的非营养琼脂平板上(不用EDTA孵育)。沿着每个平板的中心割一个凹槽，以防止移动，并把10μL待测试的稀释物置于每个侧面上。
●用黑色记号笔标记每个接种位点。
●30℃孵育平板。
●使用X10的放大目镜光学显微镜，通过直接平板目测，从每个接种位点开始，检查棘阿米巴菌的生长。
●把剩余的棘阿米巴菌悬浮液置于含有新鲜盐水或者新鲜Page′s盐水的一套新试管中。
●洗涤并重悬克雷伯氏杆菌，其已经如前所述用EDTA孵育过夜，并添加到含有棘阿米巴菌的各个合适的试管中。
●30℃孵育试管过夜。
●孵育之后，3000rpm离心每个试管10分钟。
●倒掉上清液并重悬沉淀。
●把双份10μl的每个稀释物和对照置于带有克雷伯氏杆菌菌苔的非营养琼脂平板上(不用EDTA孵育)。沿着每个平板的中心割一个凹槽，以防止移动，并把10μL待测试的稀释物置于每个侧面上。
●用黑色记号笔标记每个接种位点。
●30℃孵育平板。
●使用X10的放大目镜光学显微镜，通过直接平板目测，从每个接种位点开始，检查棘阿米巴属的生长。
表10：用克雷伯氏杆菌孵育24小时之后棘阿米巴菌的生长
(预先用EDTA孵育)
  EDTA的浓度mg/mL   棘阿米巴菌的生长
  0(Pages盐水)   +++
  0(Pages盐水)   --
  20(Pages盐水)   ++
  20(Pages盐水)   ++
  40(Pages盐水)   ++
  40(Pages盐水)   -
  0(生理盐水)   +++
  0(生理盐水)   +++
  20(生理盐水)   ++
  20(生理盐水)   ++
  40(生理盐水)   -
  40(生理盐水)   -
表11：用克雷伯氏杆菌孵育48小时之后棘阿米巴属的生长
(预先用EDTA孵育)
  EDTA的浓度mg/mL   棘阿米巴属的生长
  0(Pages盐水)   +++
  0(Pages盐水)   +++
  20(Pages盐水)   +
  20(Pages盐水)   -
  40(Pages盐水)   -
  40(Pages盐水)   -
  0(生理盐水)   +++
  0(生理盐水)   +++
  20(生理盐水)   -
  20(生理盐水)   -
  40(生理盐水)   -
  40(生理盐水)   -
这些结果证明，棘阿米巴菌的生长可被抑制，而且通过用本发明的抗菌EDTA组合物处理棘阿米巴菌以其为食的细菌群，可以基本上消除棘阿米巴菌群。EDTA四钠浓度为20-40mg/mL(2-4％ w/v)的抗菌EDTA组合物是有效的。这证实，本发明的抗菌组合物可用于一些应用，如用于各种医学器械和设备，包括接触透镜和牙科/牙矫正/牙周病学装置的浸泡溶液，以及用于其它的应用如淡水和海水贮存和分配系统，用于加热，通风和空气调节器装置，加湿器，透析装置等中。
实施例5
进行这些实验来测定EDTA四钠组合物是否防止附着和粘附到微生物的硅管上。如果可以防止附着和粘附到微生物的硅试管中，生物膜的形成可降低。下面提供了使用的实验方案和获得的结果。
方法：
●用熔化的蜡填充硅试管的1cm切片，以密封每个内腔，于4℃硬化。
●把4个切片置于30mL无菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，作为对照。把8个切片置于30mL 4％的EDTA四钠中。
●30分钟之后，把来自PBS的4个切片和来自4％ EDTA四钠的4个切片，置于热封闭的净化容器中，并允许干燥。
●把剩余的4个切片转移到30mL无菌的PBS中进行漂洗，然后允许如前所述的风干。
●一旦干燥，把全部12个切片置于105cfu/mL混合的微生物(37℃生长于营养肉汤中的克雷白氏杆菌和CNS的过夜培养物)中，37℃孵育。
●30分钟之后，移取每个类型2个切片，并在2×30mL无菌的PBS中进行漂洗。如前所述的风干。使用分离的洗涤和用于每个类型的干燥导管，以防止污染。
●把每个切片置于离心管中的1mL PBS中，在超声波水浴中进行超声波处理15分钟。
●滤出每个试管50uL以对数稀释置于自动平板接种器上，一式两份。
●滤出每个试管1/10稀释的双份。
●37℃孵育平板过夜。在自动平板读数器ProtoCOL上读取克隆数。6小时之后重复。
对照和EDTA处理的导管切片的结果显示如下。
表12
  导管切片的类型   孵育时间   导管切片的数目   净克隆数(cfu/mL)   1/10的克隆数(cfu/mL)
  对照   30分钟   1   240220   00
  对照   30分钟   2   280140   10
  对照   6小时   1   14801120   00
  对照   6小时   2   52005467   78005800
  风干的EDTA   30分钟   1   240400   1333800
  风干的EDTA   30分钟   2   267720   00
  风干的EDTA   6小时   1   12801120   168008800
  风干的EDTA   6小时   2   22402340   2133316000
  漂洗的EDTA   30分钟   1   267379   00
  漂洗的EDTA   30分钟   2   10400   00
  漂洗的EDTA   6小时   1   19801740   960012800
  漂洗的EDTA   6小时   2   36003660   190008600
纯净的EDTA溶液的结果发现更具重复性，因此对这些进行了更进一步地分析。由于切片置于1mL溶液中，每mL的计数等于每个切片的计数。
表13
  导管切片的类型   30分钟后的平均克隆计数(cfu/切片)   6小时后的平均克隆计数(cfu/切片)
  对照   880   3317
  风干的EDTA   407   1745
  漂洗的EDTA   421   2745
表14
  导管切片的类型   30分钟后从对照的平均cfu/切片降低的％   6小时后从对照的平均cfu/切片降低的％
  风干EDTA   53.8％   47.4％
  漂洗EDTA   52.2％   17.3％
用克雷伯氏杆菌+CNS进行24小时重复：
表15
  导管切片的类型   30分钟后的平均克隆计数(cfu/切片)   6小时后的平均克隆计数(cfu/切片)   24小时后的平均克隆计数(cfu/切片)
  对照   377   9205   105806
  风干EDTA   273   3720   70370
  漂洗EDTA   474   9499   77051
表16
  导管切片的类型   30分钟后从对照的平均cfu/切片降低的％   6小时后从对照的平均cfu/切片降低的％   24小时后从对照的平均cfu/切片降低的％
  风干EDTA   27.4％   59.6％   33.5％
  漂洗EDTA   +25.7％   +31.9％   27.2％
+表示从对照的平均cfu/切片的增加
铜绿假单胞菌的结果：
表17
  导管切片的类型   30分钟后的平均克隆计数(cfu/切片)   6小时后的平均克隆计数(cfu/切片)   24小时后的平均克隆计数(cfu/切片)
  对照   6400   341994   1290000
  风干EDTA   4108   30000   474494
  漂洗EDTA   5200   153758   1150000
表18
  导管切片的类型   30分钟后从对照的平均cfu/切片降低的％   6小时后从对照的平均cfu/切片降低的％   24小时后从对照的平均cfu/切片降低的％
  风干EDTA   35.8   91.2   63.2
  漂洗EDTA   18.8   55.0   10.9
这些结果证明了细菌群在风干的和漂洗的导管切片上至少短期的降低。
实施例6
当EDTA四钠与乙醇组合时，改变的MBC值
用水和乙醇配制具有大范围EDTA四钠浓度的溶液(0，0.1，0.5，1，2，3，4和8mg/ml，w/v)(以达到水中最终的乙醇浓度为0，0.1，0.5，1，5，10，20和40％)来测试单独的EDTA溶液，单独的醇溶液，和EDTA/醇溶液的功效。在蒸馏水中制备浓缩的EDTA四钠原液，并添加乙醇到该浓缩的含水原液中，以提供合适的乙醇浓度。
方法：
●在营养肉汤中37℃培养微生物过夜。
●醇和EDTA四钠的原液用于填充网格图形的96孔平板(每个培养物1个)，使用具有0，0.1，0.5，1，2，3，4和8mg/ml，w/vEDTA的四钠的含0，0.1，0.5，1，5，10，20和40％，v/v醇的水异丙醇溶剂溶液。
●每个孔含有150μL每种稀释物和50μL的1×108cfu/mL的微生物。
●在5分钟，6小时和24小时的时间周期内，通过把96个销盖置于平板上(和置于每个孔中)，然后把盖子转移到96孔平板上，来培养每个孔，每个孔中含有300μL营养肉汤。37℃孵育过夜。在孵育期间，37℃孵育每个接种物平板。
●24小时之后记录每个孔的混浊。
几种微生物的结果显示如下。
表19
  微生物  EDTA四钠的MBC(mg/mL)   醇的MBC(％)   EDTA四钠(mg/mL)+醇(％)的MBC
  E.coli  3   10   0.5和0.5
  变形杆菌  3   10   2和1
  CNS(I)  8   10   2和1
  克雷伯菌  8   10   1和1
  金黄色葡萄球菌  0.1   0.1   0.1和0.1
  假单胞菌  2   10   2和1
  CNS(II)  8   10   0.5和0.5
溶于水中的EDTA四钠溶液比乙醇(单独)溶液更有效的杀死测试的微生物。组合EDTA四钠的醇溶液能以最低浓度杀死测试的微生物。1％醇的2mg/ml(0.2w/v)EDTA四钠溶液提供了极好的结果，而且对所有测试的微生物都有杀菌效果。这种抗菌溶液以低于单独的EDTA四钠水溶液或者单独的EDTA四钠的乙醇溶液浓度的EDTA四钠和乙醇是有效的。而且，它可以节约成本，安全而且便于制备和使用。用于局部施用的本发明抗菌组合物因此包括处于混合的水溶剂和乙醇中的EDTA盐。
实施例7
EDTA四钠在乙醇中的溶解度和对pH的影响
测试了EDTA四钠在乙醇中的溶解度，而且测量了各种四钠溶液在醇溶剂中的pH。
方法：
●通过1.5mL大小10-100mg范围的微量离心管称出双份的EDTA四钠。添加1mL 74％的乙醇到每个试管中，并涡旋30s。
●添加0.5ml无菌蒸馏水到双份称重的EDTA四钠中，并涡旋混合，接着添加0.5ml的74％的乙醇。
●测试每个EDTA四钠试管的pH，其中观察到溶解。
实验结果证明，EDTA四钠完全不溶于74％的乙醇溶液。而且该结果进一步证明，当四钠溶于蒸馏水，浓度在10-100mg/ml，w/v的范围内时，添加乙醇后EDTA四钠保留在溶液中。因此一个优选的技术包括，首先把EDTA盐溶于水溶液中，然后添加乙醇或EDTA盐较少可溶或不溶于其中的另一种溶剂。用这种方式制备的EDTA盐溶液预期随时间是稳定的。各种溶液测量的pH值如下：
        74％乙醇，单独                pH 7.8
        水                            pH 7.1
        +10mg EDTA四钠                pH 9.0
        +20mg EDTA四钠                pH 10.8
        +40mg EDTA四钠                pH 11
        +80mg EDTA四钠                pH 11.15
        +100mg EDTA四钠               H 11.25
实施例8
121℃高压灭菌对EDTA四钠溶液的影响
我们测试了高压灭菌对EDTA四钠溶液的影响，以测定高压灭菌是否可用于在使用之前对EDTA四钠溶液进行灭菌。
使用的方法和结果描述如下。
方法：
●50℃在无菌水和无菌的，熔化营养琼脂中制备双份的0，20，80和100mg/mL的EDTA四钠。
●留下一组于室温中(不加热)，而一组进行高压灭菌(加热)。
●第二天把所有的琼脂瓶置于蒸汽机中熔化40分钟。
●测量扩散带：使用木塞打孔器，在16个新鲜血液琼脂平板中打出2个洞。
●制备0.5McFarland的CNS悬浮液，并使用无菌的药签涂板到整个平板，以产生菌苔。
●移取150μl每种四钠溶液到双份的打出的洞中，并于37℃孵育过夜。
●第二天测量扩散带并记录结果。
以区带大小测量的结果如下所示。绘制了对照随浓度变化的区带，以在测试样品中测定实际的EDTA浓度，其也如下所示。这些结果证明EDTA四钠组合物的高压灭菌，无论是在无菌水还是在琼脂中，实质上都不影响EDTA四钠组合物的抗微生物活性。
表20：以mm计的区带大小
  EDTA的浓度mg/mL   溶于无菌水中的EDTA(对照)   溶于高压灭菌水中的EDTA   琼脂中的EDTA   高压灭菌琼脂中的EDTA
  0   00   00   00   00
  20   13.213.2   11.611.6   13.513.5   12.712.7
  80   16.116.1   15.215.2   17.217.2   15.315.3
  100   17.117.1   17.017.0   17.117.1   16.416.4
表21：EDTA的实际浓度
  起始的EDTA浓度mg/mL   无菌水中的EDTA(对照)   高压灭菌水中的EDTA   琼脂中的EDTA   高压灭菌琼脂中的EDTA
  0   0   0   0   0
  20   20   16   26   19
  80   80   60   101   62
  100   100   98   100   83
实施例9
121℃高压灭菌对不同EDTA制剂的影响
我们测试了高压灭菌对EDTA不同制剂溶液的影响，以测定高压灭菌是否可用于在使用之前对各种EDTA溶液进行灭菌。使用的方法和结果如下所述。
方法：
配制琼脂
●把50mL营养琼脂溶液置于7×100mL的无菌玻璃瓶。
●添加不含EDTA粉末到第一个瓶子中(标记的0)
添加2000mg的EDTA粉末到第二个瓶子中(标记为40mg/mLauto)
●添加4000mg EDTA粉末到第三个瓶子中(标记为80mg/mLauto)
●添加5000mg EDTA粉末到第四个瓶子中(标记为100mg/mLauto)
●不添加EDTA到第五，六和七个瓶子中，(但是它们标记为40，80和100mg/mL非高压灭菌的)，保留于室温。
●对每种EDTA制剂进行这些操作，以进行测试，对所有的瓶子进行高压灭菌，auto标记，于121℃高压灭菌20分钟。
●第二天把所有的瓶子置于蒸汽浴中以熔化琼脂用于倾倒。
●一旦熔化，在添加合适量的EDTA到标记为非高压灭菌的瓶子之前，使其冷却到50℃。所有的瓶子待用测定。.
测量扩散带：
●使用木塞打孔器，在7个新鲜血液琼脂平板中打出2个洞。
●制备0.5McFarland的CNS悬浮液，并使用无菌的药签涂板到整个平板，以产生菌苔。
●从每个瓶子移取150μl到2个分离的“打出的孔”中，并于37℃孵育过夜。
●对每种EDTA制剂进行该操作。
●第二天测量扩散带并记录结果。使用两个洞，并对每个区带进行2次测量。
EDTA铜和EDTA铁溶液不产生任何区带。因此，使用该方法不能测量加热对这些溶液的影响。下面提供了测量的EDTA二铵，EDTA二钾和EDTA镁溶液的区带大小。绘制了对照随浓度变化的区带大小，以在测试(加热)样品中测定实际的EDTA浓度，而且结果提供如下。
表21：区带大小(mm)
  EDTA的浓度mg/mL   EDTA二铵未加热   EDTA二铵加热   EDTA二钾未加热   EDTA二钾加热   EDTA镁未加热   EDTA镁加热
  0   0000   0000   0000   0000   0000   0000
  40   18.318.318.318.3   17.917.917.917.9   16.216.216.216.2   15.515.515.515.5   6.86.86.86.8   10.610.610.610.6
  80   19.719.719.719.7   19.719.719.719.7   18.918.918.918.9   18.318.318.318.3   10.010.010.010.0   10.810.810.810.8
  100   20.020.020.020.0   20.620.620.620.6   18.218.218.218.2   20.020.020.020.0   8.38.38.38.3   11.811.811.811.8
表22：高压灭菌EDTA的实际值
  EDTA的浓度mg/mL   EDTA二铵加热   EDTA二钾加热   EDTA镁加热
  0   0   0   0
  40   39   38   ＞140
  80   80   71   ＞140
  100   150   ＞140   ＞140
结果证明高压灭菌没有削弱大多数EDTA盐组合物的功效。本发明抗菌组合物的高压灭菌因此可以在制备之后进行，以提供无菌的抗菌组合物。
实施例10
EDTA盐，氯化钙和柠檬酸钠的pH值
使用蒸馏水作为溶剂，在规定的浓度，测量各种EDTA盐，氯化钙和柠檬酸钠溶液的pH值。该结果显示如下。
        10％的EDTA游离酸              pH 4.7
        10％的EDTA二铵                pH 4.38
        10％的EDTA钙钠                pH 6.68
        10％的EDTA二钾                pH 4.5
        10％的EDTA铜                  pH 6.15
        10％的EDTA四钠                pH 11.6
        2％的EDTA四钠                 pH 11
        氯化钙中和的TS EDTA           pH 7.3
        氯化钙，1摩尔                 pH 3.8
        50％，25％的柠檬酸钠          pH 8.5
实施例11
确定EDTA溶液的抗凝血特性
使用下列方法证实EDTA溶液的抗凝血特性。
方法：
●100μl大浓度范围(0.5-100mg/mL)的EDTA四钠或二钠溶液的等分试样，调节到pH 11.0-11.6，置于带帽的塑料试管中。
●添加900μl来自健康志愿者的新鲜血液到每个EDTA溶液的等分试样中，并通过每隔一定间隔倒置血液试管来温和混合。
结果显示，包含血液而没有EDTA溶液的对照试管的凝血时间为10-23分钟。含有EDTA二钠溶液的试管的凝血时间都超过5天。浓度大于1mg/mL的EDTA四钠试管的凝血时间超过了5天。浓度为0.5mg/mL的EDTA四钠试管在28分钟内凝结。因此EDTA四钠以超过1mg/ml(1％w/v)的浓度可作为有效的抗凝血剂。
实施例12
四钠盐悬浮液的摩尔渗透压浓度
使用标准的实验技术，测定水和生理盐水中，各种浓度的EDTA四钠溶液的摩尔渗透压浓度和红血球裂解。通过添加50μl EDTA血液到2ml每个浓度的每种溶液中2小时，测定红血球的裂解。血浆摩尔渗透压浓度为275-295m/osmol。
表23
  摩尔渗透压浓度(m/osmol)   红血球裂解
  溶于蒸馏水中的2％的EDTA四钠   140   ++
  溶于蒸馏水中的4％的EDTA四钠   277   +
  溶于生理盐水的2％的EDTA四钠   219   +/-
  溶于生理盐水的4％的EDTA四钠   588   -
实施例13
3种EDTA盐对溶解人造尿晶体(AUC)的功效
导尿管的一个问题是尿晶体趋向于在导管表面积累。尿晶体的沉积可促进微生物的定殖和/或生物膜的形成，以及降低导管的流量。因此，与导尿管一起使用能降低尿晶体形成的消毒组合物是合乎需要的。使用如下所述的方法测试了3种EDTA盐溶液对溶解人造尿晶体的功效。
材料：
●25ml塑料通用容器中的人造尿与尿素酶一起于45℃孵育7天。
●100mg/ml的EDTA二铵，二钾和四钠溶液。
方法：
●以4000rpm离心人造尿晶体2分钟。
●慢慢地倾倒上清液，并在水中洗涤晶体，接着进行离心。
●在水中重悬晶体，并把200μl的等分试样装到4个通用容器中。
●于室温下，添加4ml 100mg/ml的每种EDTA盐溶液，以及作为对照的水到每个通用容器中。
●1，2和3小时以后，目测观察与对照相比晶体的溶解。
结果显示如下。相较于水溶液，所有的EDTA盐溶液都减少了尿结晶沉积。因此，EDTA盐溶液适合用于导尿管。
表24
  溶液   晶体沉积
  水+AUC   +++++
  EDTA四钠+AUC   ++
  EDTA二铵+AUC   +
  EDTA二钾+AUC   +/-
这里引用的所有参考文献，包括专利文献和非专利出版物，都以其全部内容引入这里作为参考。
虽然在上述说明书中，本发明已经描述了某些相关的优选实施方案案，而且列举了许多详细描述作为示例的目的，但是本领域的技术人员显而易见，本发明适于其它的实施方案，而且这里详细描述的某些内容可以进行一些改变，而不背离本发明的基本原则。

Claims (39)

1.一种抗菌溶液，包括至少一种浓度为至少0.01％w/v的乙二胺四乙酸(EDTA)盐，与至少一种溶剂，其中所述溶液的pH至少为8.0，而且具有抗广谱细菌的杀菌活性。
2.权利要求1的溶液，其中所述溶液的pH为8.5到12.5。
3.权利要求2的溶液，其中所述溶液的pH为9.5到11.5。
4.权利要求3的溶液，其中所述溶液的pH为10.5到11.5。
5.权利要求1的溶液，其中所述至少一种EDTA盐选自：EDTA二钠；EDTA三钠；EDTA四钠；EDTA铵；EDTA二铵；EDTA钾；EDTA二钾；EDTA铜二钠；EDTA镁二钠；EDTA铁钠；及其组合。
6.权利要求5的溶液，其中所述至少一种EDTA盐选自：EDTA三钠；EDTA四钠；及其组合。
7.权利要求1的溶液，其中所述至少一种EDTA盐以0.2％w/v到10.0％w/v的浓度存在。
8.权利要求7的溶液，其中所述至少一种EDTA盐以0.2％w/v到6.0％w/v的浓度存在。
9.权利要求8的溶液，其中所述至少一种EDTA盐以0.2％w/v到4.0％w/v的浓度存在。
10.权利要求1的溶液，其中所述溶剂选自：水；盐水；醇；及其组合。
11.权利要求10的溶液，其中所述溶剂是水和乙醇的组合。
12.权利要求11的溶液，其中所述溶液包括含量为0.1％到10％v/v的乙醇。
13.权利要求1的溶液，其中所述溶液具有抗浮游生物形式和固着形式的细菌的杀菌活性。
14.权利要求1的溶液，其中所述溶液更进一步具有至少一种选自如下的特性：
(a)抗凝血活性；
(b)抗真菌病原体的杀真菌活性；
(c)抗原生动物感染的抑制活性；
(d)抗阿米巴感染的抑制活性；
(e)至少以适度的体积，对接触的患者是安全和生物相容的；
(d)至少以适度的体积，对患者的血液是安全和生物相容的；和
(e)对工业物体和表面是安全的和生物相容的。
14.权利要求1的溶液，其中所述溶液是无菌的和无热原的。
15.一种干燥形式的权利要求1的抗菌溶液，用溶剂进行重组后形成权利要求1的溶液。
16.权利要求1的溶液制剂，其适于局部施用到表面和物体。
17.权利要求1的溶液的限时释放制剂，其提供了延长时间的抗菌活性。
18.一种抗菌溶液，其包括溶剂与至少一种浓度为0.01％到15％w/v的EDTA钠盐，其中所述溶液的pH至少为9.0，而且具有抗广谱细菌的杀菌活性。
19.权利要求15的溶液，其中所述溶剂选自：水；盐水；醇；及其组合。
20.一种抗菌溶液，其基本上由至少一种浓度为至少0.1％w/v的乙二胺四乙酸(EDTA)盐，与至少一种溶剂组成，其中所述溶液的pH至少为8.0，而且具有抗广谱细菌的杀菌活性。
21.权利要求20的溶液，其中所述溶液的pH为8.5到12.5。
22.权利要求20的溶液，其中所述溶液的pH为9.5到11.5。
23.权利要求20的溶液，其中所述溶液的pH为10.5到11。
24.权利要求20的溶液，其中所述至少一种EDTA盐选自：EDTA二钠；EDTA三钠；EDTA四钠；EDTA铵；EDTA二铵；EDTA钾；EDTA二钾；EDTA铜二钠；EDTA镁二钠；EDTA铁钠；及其组合。
25.权利要求24的溶液，其中所述至少一种EDTA盐选自：EDTA三钠；EDTA四钠；及其组合。
26.权利要求20的溶液，其中所述至少一种EDTA盐以0.02％w/v到10.0％w/v的浓度存在。
27.权利要求26的溶液，其中所述至少一种EDTA盐以0.02％w/v到6.0％w/v的浓度存在。
28.权利要求27的溶液，其中所述至少一种EDTA盐以0.02％w/v到4.0％w/v的浓度存在。
29.权利要求20的溶液，其中所述溶剂选自：水；盐水；醇；及其组合。
30.权利要求29的溶液，其中所述溶剂是水和乙醇的组合。
31.权利要求29的溶液，其中所述溶液包括含量为0.1％到10％v/v的乙醇。
32.权利要求20的溶液，其中所述溶液具有抗浮游生物形式和固着形式的细菌的杀菌活性。
33.一种用于抑制位于表面上或物体内部的至少一种不需要的微生物群生长和增殖的方法，包括使表面或物体与权利要求1-32任一项的溶液接触。
34.权利要求33的方法，其中所述不需要的微生物选自：微生物群；真菌病原体；原生动物群；和阿米巴群。
35.权利要求34的方法，其中所述不需要的微生物是棘阿米巴菌。
36.权利要求33的方法，其中所述表面或物体选自：导管；医疗试管和导管；血管内装置；移植的卫生器材；医学和兽医仪器；接触透镜；光学移植物；牙科，牙正和牙周装置；水贮存，分配和处理设备；工业设备；和食品制备和加工设备。
37.一种用于抑制生物膜生长和增殖的方法，其包括使生物膜与权利要求1-32任一项的溶液接触。
38.一种用于伤口愈合的覆盖物，其中所述覆盖物用权利要求1-32任一项的溶液浸泡。
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