ES2645062T3 - Inhibición y tratamiento de biopelículas gastrointestinales - Google Patents

Abstract

Una composición para su uso en la inhibición o el tratamiento de una infección por biopelícula gastrointestinal, que comprende combinar una cantidad farmacéuticamente eficaz de una celulasa estable a ácidos, una glucoamilasa, un complejo de hemicelulasa/pectinasa estable a ácidos, ß-glucanasa, un complejo de proteasa/peptidasa que tiene actividad de dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV), quitosanasa, lisozima y Serratia peptidasa con al menos uno de un vehículo, adyuvante, excipiente, tampón y diluyente farmacéuticamente aceptable.

Description

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DESCRIPCION

Inhibicion ytratamiento de biopelfculas gastrointestinales ANTECEDENTES

Una "biopeKcula" es un fenomeno muy conocido y puede definirse como una poblacion de celulas procariotas que crecen sobre una superficie y encerradas en un material polimerico de matriz de extracelular auto-producido, que media en la adhesion de las celulas entre sf y a superficies. Las biopelfculas no son simplemente ensamblajes pasivos de celulas que se pegan a superficies, sino que son sistemas biologicos estructuralmente y dinamicamente complejos. En comparacion con celulas que son planctonicas en la naturaleza, las bacterias que crecen en las biopelfculas presentan un fenotipo diferente con respecto a la tasa de crecimiento y transcripcion genica. Vease
http://en.wikipedia.org/wiki/Biofilm.

Las biopelfculas no deseadas han sido responsables, por ejemplo, de la incrustacion de torres de agua de refrigeracion, tubenas de agua, unidades de membrana y plantas de procesamiento de alimentos. Las biopelfculas son tristemente diffciles de erradicar. Los microbios en las biopelfculas industriales se protegen de los productos qmmicos antimicrobianos, bacteriofagos medioambientales y amebas fagocfticas (Donlan RM, Costerton JW. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev 2002; 15167-293).

Ademas de su importancia en la industria, las biopelfculas pueden estar implicadas en un significativo porcentaje de infecciones microbianas humanas (Potera C. Forging a link between biofilms and disease. Science 1999; 283: 18378). Parsek y Singh propusieron cuatro criterios para definir una etiologfa de biopelfcula de una infeccion: las bacterias patogenas estan asociadas a la superficie o son adherentes a un sustrato; el examen directo revela bacterias en agrupaciones, encerradas en una matriz de constituyentes bacterianos o de hospedador; la infeccion esta localizada; y la infeccion es resistente a terapia con antibioticos a pesar de la sensibilidad a antibioticos de los organismos planctonicos constituyentes (Parsek MR, Singh PK. Bacterial biofilms: an emerging link to disease pathogenesis. Annu Rev Microbiol 2003;57:677-701).

Las infecciones por biopelfculas pueden estar implicadas en la etiologfa de caries dental, enfermedad periodontal, fibrosis qmstica (FQ), infecciones de las vfas respiratorias, endocarditis de valvula nativa, prostatitis bacteriana cronica, otitis media e infecciones vaginales. Los microorganismos de biopelfculas tambien participan en infecciones relacionadas con los implantes, en los que se forman poblaciones microbianas adherentes sobre las superficies de cateteres, valvulas cardfacas protesicas, protesis articulares y otros dispositivos (Donlan RM. Biofilms and deviceassociated infections. Emerg Infect Dis 2001;7:277-81).

El tubo digestivo proporciona un reservorio para muchas bacterias de biopelfculas resistentes a antibioticos, que incluyen especies de Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa y especies de Acinetobacter (Donskey CJ. The role of the intestinal tract as a reservoir and source for transmission of nosocomial pathogens. Clin Infect Dis 2004;39:219-26). El patogeno oportunista humano, Pseudomonas aeruginosa, es una causa importante de mortalidad relacionada con infeccion entre los pacientes cnticamente enfermos, y conlleva uno de los indices de letalidad mas altos de todas las infecciones por Gram-negativos. Aunque tradicionalmente se ha considerado que los pulmones son un sitio importante de infeccion por P. aeruginosa entre pacientes cnticamente enfermos, surgen un numero significativo de estas infecciones como resultado de la contaminacion directa de las vfas respiratorias por la flora gastrointestinal o por la diseminacion hematogena de los intestinos al parenquima del pulmon. Metodos eficaces para la inhibicion, reduccion y/o tratamiento de P. aeruginosa tendnan un impacto significativo para esta afeccion.

Con respecto a las biopelfculas en el intestino, ahora se sabe que las bacterias pueden existir, por ejemplo, como biopelfculas en el epitelio colonico, dentro de la capa de modo que lo cubre, y sobre partfculas de comida en la luz (MacFarlane S, MacFarlane GT. Composition and metabolic activities of bacterial biofilms colonizing food residues in the gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 2006;72:6204-11; Probert HM, Gibson GR. Bacterial biofilms in the human gastrointestinal tract. Curr Issues Intest Microbiol 2002;3:23-7). Las bacterias asociadas a biopelfcula gastrointestinal incluyen Bacteroides ssp., Clostridium ssp., Fusobacterium ssp., Klebsiella ssp., Spirochaetes ssp., Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Bifidobacterium ssp., y cocos Gram-positivos.

El documento WO 2004/066945 A2 se refiere a composiciones de enzima hidrolttica para reducir las condiciones de tejido implicadas en biopelfculas, tales como trastornos gastrointestinales.

El documento US 6.759.040B1 se refiere a la preparacion y el uso de mezclas de enzimas hidrolfticas que degradan biopelfculas de especificidad multiple.

Asf, no se ha satisfecho una necesidad de composiciones mejoradas relacionadas con la reduccion de biopelfculas dentro del intestino de mairnferos. La presente invencion proporciona estas y/u otras ventajas.

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SUMARIO

La presente invencion se refiere a una composicion para su uso en la inhibicion o el tratamiento de una infeccion por biopeKcula gastrointestinal, que comprende combinar una cantidad farmaceuticamente eficaz de una celulasa estable a acidos, una glucoamilasa, un complejo de hemicelulasa/pectinasa estable a acidos, p-glucanasa, un complejo de proteasa/peptidasa que tiene actividad de dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV), quitosanasa, lisozima y Serratia peptidasa con al menos uno de un vehuculo farmaceuticamente aceptable, adyuvante, excipiente, tampon y diluyente. Asf, las presentes composiciones se refieren a la reduccion de biopelfcula(s) gastrointestinal(es) en el intestino de animales.

En la memoria descriptiva se describen metodos que incluyen el cribado de composiciones anti-biopelfcula fisiologicamente aceptables, que incluyen, por ejemplo, composiciones nutraceuticas, terapeuticas o farmaceuticas, que comprenden enzimas anti-biopelfcula y otros componentes adecuados para la ingestion oral por mamfferos tales como seres humanos, y metodos de preparacion y uso o administracion de tales composiciones. Estos metodos se refieren a cribar enzimas digestivas en modelos de biopelfcula para identificar enzimas utiles y composiciones para las composiciones anti-biopelfcula fisiologicamente aceptables y metodos de tratamiento tratados en el presente documento. Tales enzimas pueden cribarse como agentes unicos, mezclas de agentes, o en combinacion con agentes antimicrobianos, agentes quelantes, lactoferrina, hierbas medicinales u otros componentes segun se desee.

Las composiciones anti-biopelfcula fisiologicamente aceptables usan enzimas digestivas para la inhibicion y reduccion de biopelfcula patogena en el tubo gastrointestinal de seres humanos.

Por ejemplo, las composiciones anti-biopelfcula fisiologicamente aceptables y metodos pueden referirse al uso de celulasas, hemicelulasas, lisozima, pectinasas, amilasas, DNasa I, Serratia peptidasa, y otras hidrolasas que son capaces de digerir la matriz de exopolisacarido y exoprotema de biopelfculas.

En un aspecto de la presente invencion, las presentes composiciones anti-biopelfcula fisiologicamente aceptables se refieren a composiciones anti-biopelfcula fisiologicamente aceptables orales para su uso en un metodo de inhibicion y tratamiento de biopelfculas gastrointestinales patogenas en seres humanos.

Las presentes composiciones anti-biopelfcula fisiologicamente aceptables se refieren a agentes que son transmitidos por los alimentos, transmitidos por el agua o son nosocomiales. Infecciones por biopelfcula adicionales pueden ser resistentes a antibioticos y/o recurrentes. Las composiciones anti-biopelfcula fisiologicamente aceptables pueden usarse conjuntamente con antibioticos o antimicrobianos. Ademas, estas composiciones anti-biopelfcula fisiologicamente aceptables pueden usarse en pacientes cuyas infecciones por biopelfcula han dejado de responder a antibioticos o antimicrobianos.

Estos y otros aspectos, caractensticas y realizaciones se exponen dentro de la presente solicitud, que incluye la siguiente Descripcion detallada. A menos que se establezca expresamente de otro modo, todas las realizaciones, aspectos, caractensticas, etc., pueden mezclarse y emparejarse, combinarse y permutarse de cualquier manera deseada.

DESCRIPCION DETALLADA

Las biopelfculas gastrointestinales en mairnferos participan en una variedad de posibles enfermedades, bien como causantes de tales enfermedades o bien haciendolas empeorar. Las presentes composiciones se refieren a la reduccion de biopelfcula(s) gastrointestinal(es) en el intestino de animales y son para su uso en metodos que incluyen inhibir, tratar o reducir biopelfculas en el sistema gastrointestinal.

Cribado de enzimas anti-biopelicula

Pueden modificarse dispositivos de biopelfcula, tales como el dispositivo de biopelfcula de Calgary (Ceri et al, 1999; documento US 7.041.470), por ejemplo, que va a usarse conjuntamente con los metodos anteriormente mencionados, para identificar composiciones anti-biopelfcula fisiologicamente aceptables, para cribar para enzimas que (a) estan disponibles por via oral; (b) son generalmente reconocidas como seguras (GRAS); (c) son conocidas o puede establecerse que retienen su actividad durante el paso a traves del estomago; y (d) son activas en romper biopelfculas en sistemas modelo. Pueden usarse otros dispositivos que son adecuados para el estudio de biopelfculas que afectan a los seres humanos. Como se trata en Ceri, un dispositivo de biopelfcula de Calgary (CBD) proporciona ensayo rapido y reproducible de susceptibilidades de biopelfculas a antibioticos usando 96 biopelfculas equivalentes en una placa de 96 pocillos estandar (u otro numero adecuado segun se desee), cuyas biopelfculas se exponen entonces a los antibioticos en investigacion. En la presente discusion, tales biopelfculas de cribado se exponen a concentraciones de enzima como se tratan en el presente documento. La formacion de biopelfculas puede ir, por ejemplo, seguida de microbiologfa cuantitativa y microscopfa electronica de barrido.

Enzimas a modo de ejemplo que tratan o inhiben biopeliculas

El crecimiento bacteriano sobre una superficie gastrointestinal frecuentemente implica la auto-produccion de una matriz extracelular rica en polisacaridos que proporciona soporte estructural para la formacion de comunidades de

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biopeftcula. Enzimas que rompen las matrices de biopeftcula de estos organismos dentro del tubo gastrointestinal son el objeto de los metodos en el presente documento.

La(s) enzima(s) particular(es) que van a usarse pueden seleccionarse segun las propiedades, si se conocen, de la biopeftcula espedfica que va a eliminarse, o puede usarse una combinacion de varias enzimas que tienen diferentes actividades enzimaticas. La composicion de la matriz extracelular es compleja y variable entre diferentes especies bacterianas e incluso dentro de las mismas especies en diferentes condiciones medioambientales. A pesar de su composicion heterogenea, los exopolisacaridos son un compuesto tfpico de la matriz de biopeftcula, que proporcionan el armazon en el que se insertan celulas microbianas. Entre los muchos diferentes exopolisacaridos que se han descrito, parece que la celulosa y la N-acetilglucosamina unida en p-1,6 son los componentes mas comunes de la matriz de biopeftcula de muchas bacterias diferentes.

En un aspecto, las composiciones anti-biopeftcula fisiologicamente aceptables adecuadas comprenden preferentemente una cantidad de agentes de p-1,6-N-acetil-D-glucosamina (poli-p-1,6-GlcNAc) anti-polimericos para dispersar sustancialmente poli-p-1,6-GlcNAc y asf capaces de degradacion significativa de biopeftcula. Por ejemplo, vease Itoh Y, Wang X, Hinnebusch BJ, Preston JF, Romeo T. Depolymerization of p-1,6-N-acetyl-D-glucosamine disrupts the integrity of diverse bacterial biofilms. J Bacteriol 2005;187;382-7). En algunas realizaciones, para este y otros agentes, tanto solos como en combinacion, tal reduccion significativa significa, si se mide in vitro, una reduccion logarftmica de 1, normalmente 1,5, o 3,0-3,8 o mejor. In vivo, tal reduccion significativa puede ser una reduccion sustancial de uno o mas smtomas asociados a una infeccion por biopeftcula, o incluso eliminacion sustancial de uno o mas smtomas asociados a una infeccion por biopeftcula. Agentes anti-GlcNAc a modo de ejemplo incluyen una p-hexosaminidasa previamente identificada y enzima dispersante de biopeftcula de A. actinomycetemcomitans, DspB o dispersina B, que hidroliza espedficamente los enlaces glucosfdicos de poli-p-1,6- GlcNAc y rompe la biopeftcula bacteriana (Kaplan JB, Ragunath C, Ramasubbu N, Fine DH. 2003. Detachment of Actinobacillus actinomycetem comitans biofilm cells by an endogenous p-hexosaminidase activity. J Bacteriol 2003;185:4693-8). La dispersina B escinde el poftmero de N-acetilglucosamina unido en p(1,6) usando una maquinaria catafttica similar a otras hexosaminidasas de la familia 20 que escinden restos de N-acetilglucosamina unidos en p(1,4). La dispersina B y hexosaminidasas similares con actividad en biopeftculas son adecuadas para su uso en los metodos, composiciones anti-biopeftcula fisiologicamente aceptables tratadas en el presente documento. Los agentes anti-poli-p-1,6-GlcNAc pueden usarse junto con celulasa, tratada adicionalmente mas adelante.

Segun la presente invencion, las composiciones anti-biopeftcula fisiologicamente aceptables comprenden una celulasa en una cantidad capaz de degradacion significativa de biopeftcula. Tales celulasas pueden tener actividad contra, por ejemplo, celulosa en una biopeftcula de Salmonella u otros. Celulasa se refiere a una clase de enzimas producidas principalmente por hongos, bacterias y protozoos que catalizan la hidrolisis de celulosa. Sin embargo, tambien son celulasas producidas por otros tipos de organismos tales como plantas y animales. Las celulasas que se han usado como enzimas digestivas son conocidas por ser estables a acidos. Estas incluyen, pero no se limitan a, celulasas de especies de Aspergillus. Se conocen varios tipos diferentes de celulasas, que se diferencian estructuralmente y mecamsticamente. El numero EC para este grupo de enzimas es EC 3.2.1.4. La reaccion catalizada es la endohidrolisis de enlaces 1,4-p-D-glucosfdicos en celulosa. Otros nombres para las celulasa son: Endoglucanasa, endo-1,4-p-glucanasa, carboximetilcelulosa, endo-1,4-p-D-glucanasa, p-1,4-glucanasa, p-1,4- endoglucanohidrolasa, celudextrinasa, avicelasa. Se han usado celulasas in vitro en la rotura de biopeftculas sobre implantes medicos a condiciones de pH acido (Loiselle M, Anderson KW, The use of cellulase in inhibiting biofilm formation from organisms commonly found on medical implants. Biofouling 2003;19:77-85). En realizaciones tfpicas, la(s) celulasa(s) en el presente documento son resistentes a desnaturalizacion/inactivacion a un intervalo de pH de 1,0 a 5,0 y 10 a 14, poseen actividad hidrolftica a traves de un intervalo de pH de 1 a 14, tienen actividad hidrolftica eficaz dentro del entorno gastrico a un pH en ayunas de 1,0 a 3,0 y en presencia de comida y otro material ingerido, y/o poseen actividad hidrolftica eficaz a un pH de 6,5 a 7,5 que engloba pH fisiologico en el intestino delgado y colon.

Fuentes comerciales de celulasas, hemicelulasas y otras enzimas que pueden usarse incluyen las siguientes: Deerland Enzymes, Kennesaw, GA (
www.deerland-enzymes.com); National Enzyme Company (
www.nationalenzyme.com); Specialty Enzymes (
www.specialtyenzymes.com); y otras. Las enzimas pueden derivarse de cualquier fuente adecuada tal como fuentes vegetales, bacterianas, fungicas o animales.

Segun la presente invencion, la composicion anti-biopeftcula fisiologicamente aceptable comprende celulasa, glucoamilasa, complejo de hemicelulasa/pectinasa, p-gluconasa, un complejo de proteasa/peptidasa que tiene actividad de dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV), quitosanasa, lisozima y Serratia peptidasa con al menos un veldculo farmaceuticamente aceptable, diluyentes, excipientes, tampones, o adyuvantes. Vedculos o diluyentes, excipientes, tampones, adyuvantes, y similares, farmaceuticamente aceptables son no toxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas.

En una realizacion adicional, la cantidad de celulasa por dosis oral es aproximadamente 100-300 CU, y normalmente aproximadamente 200 CU; la cantidad de complejo de hemicelulasa/pectinasa es aproximadamente 60-100 HSU, y normalmente aproximadamente 80 HSU; la cantidad de p-gluconasa es aproximadamente 6-10 BGU, y normalmente aproximadamente 8 BGU; la cantidad de proteasa acida es aproximadamente 15-25 SAP, y normalmente aproximadamente 20 SAP; y, la cantidad de proteasa alcalina es aproximadamente 15-25 HUT, y normalmente aproximadamente 20 HUT.

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En todavfa realizaciones adicionales, la cantidad de celulasa por dosis oral oscila de 1 a 10.000 CU, la cantidad de complejo de hemicelulasa/pectinasa oscila de 1 a 8.000 HSU, la cantidad de p-gluconasa oscila de 1 a 1000 BGU, la cantidad de proteasa acida oscila de 1 a 10.000 SAP, y la cantidad de proteasa alcalina oscila de 1 a 40.000 HUT.

En una realizacion adicional, la composicion anti-biopelfcula fisiologicamente aceptable comprende ademas una cualquiera o mas de las siguientes en una cantidad capaz de una cantidad capaz de degradacion significativa de biopelfcula: disacaridos, amilasa, a-amilasa, p-amilasa, endoglucanasa, xilanasa, lipasa, bromelama, papama, ficina, proteasa de kiwi, cualquier proteasa o proteinasa derivada de planta, o fitasa.

En una realizacion adicional, la composicion anti-biopelfcula fisiologicamente aceptable contiene ademas una cualquiera o mas de las siguientes enzimas espedficas en una cantidad capaz de degradacion de biopelfcula: 1,2- 1,3-a-D-manano manohidrolasa, 1,3-p-D-xilano xilanohidrolasa, 1,3-p-D-glucano glucanohidrolasa, 1,3(1,3;1,4)-a-D- glucano 3-glucanohidrolasa, 1,3(1,3;1,4)-p-D-glucano 3(4)-glucanohidrolasa, 1,3-1,4-a-D-glucano 4-

glucanohidrolasa, 1,4-a-D-glucano glucanohidrolasa, 1 ,4-a-D-glucano glucohidrolasa, 1,4-(1,3:1,4)-p-D-glucano 4- glucanohidrolasa, 1,4-p-D-glucano glucohidrolasa, 1,4-p-D-xilano xilanohidrolasa, 1,4-p-D-manano mananohidrolasa, 1,5-a-L-arabinanohidrolasa, 1,4-a-D-glucano maltohidrolasa, 1,6-a-D-glucano 6-glucanohidrolasa, 2,6-p-fructano fructanohidrolasa, a-dextrina 6-glucanohidrolasa, a-D-galactosido galactohidrolasa, a-D-glucosido glucohidrolasa, a- D-manosido manohidrolasa, acilneuraminil hidrolasa, galactohidrolasa de polisacarido capsular de Aerobacter, p-D- fructofuranosido fructohidrolasa, p-D-fucosido fucohidrolasa, a-D-fructano fructohidrolasa, p-D-galactosido galactohidrolasa, p-D-glucosido glucohidrolasa, p-D-glucuronosido, glucuronosohidrolasa, p-D-manosido manohidrolasa, p-N-acetil-D-hexosaminida N-acetilhexosamino hidrolasa, celulosa-sulfato sulfohidrolasa, colagenasa, dextrina 6-a-D-glucanohidrolasa, glucoprotema-fosfatidilinositol fosfatidohidrolasa, hialuronato 4- glucanohidrolasa, hialuronoglucuronidasa, pectina pectilhidrolasa, peptidoglicano N-acetilmuramoilhidrolasa, fosfatidilcolina 2-acilhidrolasa, fosfatidilcolina 1-acilhidrolasa, poli(1,4-a-D-galacturonido), poli(1,4-(N-acetil-p-D- glucosaminida))-glucanohidrolasa, proteasas, sacarosa a-glucosidasa, triacilglicerol acilhidrolasa, triacilglicerol protema-acilhidrolasa.

Otro grupo de enzimas que puede emplearse en el presente documento es un sub-grupo de serina proteasas comunmente designadas subtilisinas. Una subtilisina es una serina proteasa producida por bacterias Gram-positivas u hongos. Han sido determinadas las secuencias de aminoacidos de varias subtilisinas, que incluyen al menos seis subtilisinas de cepas de Bacillus, concretamente, subtilisina 168, subtilisina BPN, subtilisina Carlsberg, subtilisina DY, subtilisina amylosacchariticus y mesentericopeptidasa, una subtilisina de un actinomycetales, termitasa de Termoactinomyces vulgaris, y una subtilisina fungica, proteinasa K de Tritirachium album.

Una lipasa a modo de ejemplo como se trata anteriormente puede ser una lipasa microbiana. Como tal, la lipasa puede seleccionarse de lipasas de levadura, por ejemplo, Candida, y lipasas bacterianas, por ejemplo Pseudomonas o Bacillus, lipasas; o fungicas, por ejemplo, Humicola o Rhizomucor.

Ejemplos de amilasas utiles en los metodos, etc., en el presente documento incluyen amilasas de Bacillus, por ejemplo, amilasa de Bacillus stearothermophilus, amilasa de Bacillus amyloliquefaciens, amilasa de Bacillus subtilis o amilasa de Bacillus licheniformis o amilasas de Aspergillus, por ejemplo amilasa de Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.

Otro grupo de enzimas utiles en los metodos, etc., en el presente documento incluye pectinasas que pertenecen a las clases de enzimas poligalacturonasas (EC 3.2.1.15), pectinesterasas (EC 3.2.1.11), pectinliasas (EC 4.2.2.10) y hemicelulasas tales como endo-1,3-p-xilosidasa (EC 3.2.1.32), xilano 1,4-p-xilosidasa (EC 3.2.1.37) y a-L- arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55). Un organismo fuente adecuado para pectinasas puede ser Aspergillus niger o Aspergillus aculeatus.

La lisozima, tambien conocida como muramidasa o N-acetilmuramida glucanohidrolasa, es una enzima de 14,4 kilodalton (EC 3.2.1.17) que dana paredes de celulas bacterianas catalizando la hidrolisis de enlaces 1,4-p entre el acido N-acetilmuramico y restos de N-acetil-D-glucosamina en un peptidoglicano y entre restos de N-acetil- D-glucosamina en quitodextrinas. La lisozima se encuentra en saliva, lagrimas y polimorfonucleocitos y tiene actividad antibacteriana conocida. La enzima funciona atacando peptidoglicanos (encontrados en las paredes celulares de bacterias, especialmente bacterias Gram-positivas) e hidrolizando el enlace glucosfdico que conecta el acido N-acetilmuramico con el cuarto atomo de carbono de la N-acetilglucosamina. La lisozima se ha usado en el tratamiento de otitis media y sinusitis (documento US 7.060.674). Se han usado composiciones de lisozima oral en el tratamiento de diversas afecciones en seres humanos, que incluye artritis (documento US 7.229.809).

Otra enzima que puede emplearse en las composiciones en el presente documento es la desoxirribonucleasa I (DNasa I), una fosfodiesterasa capaz de hidrolizar acido polidesoxirribonucleico. La DNasa I se ha purificado de diversas especies a diversos grados. La DNasa I, cuando se inhala, afecta la capacidad de P. aeruginosa para formar biopelfculas en los pulmones en los estadios de desarrollo iniciales. La DNasa I hidroliza el ADN presente en esputo/moco de pacientes con fibrosis qrnstica y reduce la viscosidad en los pulmones, promoviendo la eliminacion mejorada de secreciones. Enzimas que son estables a acidos son candidatos para su uso conjuntamente con los metodos, composiciones anti-biopelfcula fisiologicamente aceptables, etc., tratados en el presente documento. Las actividades de DNasa I son clasificables en tres grupos basandose en sus diferentes distribuciones en tejido de

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DNasa I. La DNasa I de tipo parotida es secretada de la glandula parotida y debe pasar a traves de las condiciones muy acidas en el estomago.

Las composiciones anti-biopelfcula fisiologicamente aceptables, en el presente documento van a ser tomadas por la boca, normalmente al menos 1 hora antes o 1 hora despues de una comida o consumo de alimento. Las composiciones anti-biopelfcula fisiologicamente aceptables, en el presente documento normalmente van a tomarse 2 a 4 veces por dfa (otros intervalos pueden ser apropiados en ciertas circunstancias), y el regimen normalmente va a ser seguido durante un periodo prolongado, por ejemplo al menos aproximadamente 1 o 2 meses.

La preparacion de enzima puede combinarse con un antimicrobiano natural tal como aceite de oregano, berberina o acido undecilenico, o con un antibiotico o antimicrobiano de venta con receta. La preparacion de enzima puede combinarse con la ingestion oral de uno o mas microorganismos probioticos. La Organizacion Mundial de la Salud define los organismos probioticos como microorganismos vivos que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren un beneficio a la salud en el hospedador. La preparacion de enzima puede combinarse con uno o mas prebioticos. Un prebiotico se define como "componentes selectivamente fermentados que permiten cambios espedficos, ya sea en la composicion y/o la actividad en la microflora gastrointestinal que confieren beneficios al bienestar y la salud del hospedador" (Roberfroid M. Prebiotics: the concept revisited. JNutr 2007;137(3 Suppl 2):830S-7S).

Metodos relacionados con las composiciones en el presente documento incluyen metodos de cribado, preparacion y uso, que incluyen la fabricacion de medicamentos.

Por ejemplo, los metodos incluyen metodos de cribado de una composicion anti-biopelfcula fisiologicamente aceptable adecuada para administracion por via oral a un mairnfero, mientras que retiene la eficacia en el intestino, comprendiendo el metodo proporcionar una pluralidad significativa de muestras de una biopelfcula diana viva sobre al menos un sustrato; aplicar a cada una de la pluralidad de muestras uno del intervalo de dosis de un agente anti- biopelfcula candidato seleccionado del grupo que comprende celulasa estable a acidos y un agente de p-1,6-N- acetil-D-glucosamina (poli-p-1,6-GlcNAc) anti-biopelfcula anti-polimerico, en condiciones tales que las muestras de la biopelfcula diana puedan crecer ausentes de un efecto anti-biopelfcula significativo debido al agente anti-biopelfcula candidato; y, determinar si cada uno del intervalo de dosis de agente anti-biopelfcula candidato inhibio o no el crecimiento de su muestra respectiva.

Los metodos pueden comprender ademas cribar tanto la celulasa estable a acidos anti-biopelfcula como el agente anti-poli-p-1,6-GlcNAc anti-biopelfcula. El agente anti-poli-p-1,6-GlcNAc anti-biopelfcula puede ser una hexosaminidasa tal como dispersina B. Los metodos puede comprender ademas cribar al menos uno de un complejo de hemicelulasa/pectinasa estable a acidos, p-gluconasa, proteasa acida, proteasa alcalina o Serratia peptidasa. La cantidad de celulasa puede ser equivalente a una dosis de aproximadamente 100-300 CU, la cantidad de complejo de hemicelulasa/pectinasa puede ser aproximadamente 60-100 HSU, la cantidad de p-gluconasa puede ser aproximadamente 6-10 BGU, la cantidad de proteasa acida puede ser aproximadamente 15-25 SAP y la cantidad de proteasa alcalina puede ser aproximadamente 15-25 HUT.

Los metodos tambien pueden comprender cribar al menos un agente estable a acidos seleccionado de los siguientes: un disacarido; amilasa; a-amilasa; p-amilasa; glucoamilasa; endoglucanasa; xilanasa; lipasa; lisozima; una enzima con actividad de dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV); quitosanasa; bromelama; papama; ficina; proteasa de kiwi; cualquier proteasa o proteinasa derivada de planta, o fitasa. La lipasa puede ser una lipasa microbiana, tal como de al menos una de Candida, Pseudomonas, Bacillus, Humicola o Rhizomucor. La amilasa puede ser al menos una de una amilasa de Bacillus o amilasa de Aspergillus. El cribado puede comprender al menos una pectinasa que puede ser al menos una de una poligalacturonasa (EC 3.2.1.15), pectinesterasa (EC 3.2.1.11), pectinliasa (EC 4.2.2.10) o hemicelulasa. La pectinasa puede ser al menos una pectinasa de Aspergillus niger o pectinasa de Aspergillus aculeatus.

Los metodos pueden comprender ademas cribar al menos uno de los siguientes: 1,2-1,3-a-D-manano manohidrolasa, 1,3-p-D-xilano xilanohidrolasa, 1,3-p-D-glucano glucanohidrolasa, 1,3(1,3;1,4)-a-D-glucano 3- glucanohidrolasa, 1,3(1,3;1,4)-p-D-glucano 3(4)-glucanohidrolasa, 1,3-1,4-a-D-glucano 4-glucanohidrolasa, 1,4-a-D- glucano glucanohidrolasa, 1,4-a-D-glucano glucohidrolasa, 1,4-(1,3:1,4)-p-D-glucano 4-glucanohidrolasa, 1,4-p-D- glucano glucohidrolasa, 1,4-p-D-xilano xilanohidrolasa, 1,4-p-D-manano mananohidrolasa, 1,5-a-L-

arabinanohidrolasa, 1,4-a-D-glucano maltohidrolasa, 1,6-a-D-glucano 6-glucanohidrolasa, 2,6-p-fructano fructanohidrolasa, a-dextrina 6-glucanohidrolasa, a-D-galactosido galactohidrolasa, a-D-glucosido glucohidrolasa, a- D-manosido manohidrolasa, acilneuraminil hidrolasa, galactohidrolasa de polisacarido capsular de Aerobacter, p-D- fructofuranosido fructohidrolasa, p-D-fucosido fucohidrolasa, a-D-fructano fructohidrolasa, p-D-galactosido galactohidrolasa, p-D-glucosido glucohidrolasa, p-D-glucuronosido, glucuronosohidrolasa, p-D-manosido manohidrolasa, p-N-acetil-D-hexosaminida N-acetilhexosamino hidrolasa, celulosa-sulfato sulfohidrolasa,

colagenasa, dextrina 6-a-D-glucanohidrolasa, glucoprotema-fosfatidilinositol fosfatidohidrolasa, hialuronato 4- glucanohidrolasa, hialuronoglucuronidasa, pectina pectilhidrolasa, peptidoglicano N-acetilmuramoilhidrolasa, fosfatidilcolina 2-acilhidrolasa, fosfatidilcolina 1-acilhidrolasa, poli(1,4-a-D-galacturonido), poli(1,4-(N-acetil-p-D- glucosaminida))-glucanohidrolasa, proteasas, sacarosa a-glucosidasa, triacilglicerol acilhidrolasa, triacilglicerol protema-acilhidrolasa.

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Los metodos pueden comprender ademas cribar una subtilisina estable a acidos, una DNasa I estable a acidos, aceite de oregano, berberina, acido undecilenico, un antibiotico de venta con receta, un antimicrobiano de venta con receta, un microorganismo probiotico o un prebiotico.

En algunos aspectos, los metodos comprenden inhibir una infeccion por biopelfcula gastrointestinal en un mairnfero, comprendiendo el metodo: identificar la presencia de la infeccion por biopelfcula gastrointestinal, administrar por via oral al marnffero una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un agente anti-biopelfcula que comprende una celulasa estable a acidos o un agente de p-1,6-N-acetil-D-glucosamina (poli-p-1,6-GlcNAc) anti-polimerico en al menos un vehnculo farmaceuticamente aceptable, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para producir degradacion significativa de biopelfcula dentro del sistema gastrointestinal del mai^ero. En realizaciones adicionales, los metodos comprenden administrar uno o mas de los otros aspectos de las composiciones en el presente documento.

La composicion puede ser para su uso como una sustancia terapeutica activa, para su uso en la fabricacion de un medicamento para inhibir o tratar una biopelfcula gastrointestinal en un mai^ero, o para la fabricacion de un medicamento capaz de reducir smtomas asociados a una biopelfcula gastrointestinal en un paciente humano, por ejemplo que comprende combinar una cantidad farmaceuticamente eficaz de al menos uno de una celulasa estable a acidos anti-biopelfcula o un agente de p-1,6-N-acetil-D-glucosamina (poli-p-1,6-GlcNAc) anti-polimerico anti- biopelfcula en una cantidad capaz de degradacion significativa de biopelfcula con al menos uno de un vehnculo, adyuvante, excipiente, tampon y diluyente farmaceuticamente aceptable.

Dianas de biopelicula a modo de ejemplo

Organismos de biopelicula diana a modo de ejemplo, que incluyen tanto organismos nativos como infecciosos de biopelicula, se tratan a continuacion.

Enterococos

Los enterococos, aunque parte de la flora normal del tubo gastrointestinal humano, han sido reconocidos como una importante causa de infeccion nosocomial durante dos decadas y comunmente estan implicados en infecciones de las vfas urinarias, bacteremia, infecciones intrabdominales y de heridas quirurgicas, infecciones relacionadas con cateteres y endocarditis.

Staphylococcus

Los estafilococos patogenos pueden formar biopelfculas en las que muestran una resistencia mas alta a los antibioticos y el sistema de defensa inmunitario que sus homologos planctonicos. Staphylococcus aureus es un patogeno comun asociado a infecciones nosocomiales. Puede persistir en la practica clmica y obtener resistencia elevada a agentes antimicrobianos mediante la formacion de biopelfculas. Staphylococcus aureus esta entre los principales patogenos que causan infecciones de la circulacion sangumea capaces de formar biopelfculas en tejido de hospedador y dispositivos medicos permanentes y de persistir y producir enfermedad. Las infecciones producidas por S. aureus estan siendo cada vez mas diffciles de tratar debido a la creciente resistencia a antibioticos (por ejemplo, vancomicina o Staphylococcus aureus resistente a meticilina). En un entorno de biopelicula particularmente, los microbios presentan resistencia potenciada a agentes antimicrobianos.

Pseudomonas

El patogeno oportunista humano, Pseudomonas aeruginosa, es una causa importante de mortalidad relacionada con infeccion entre los pacientes cnticamente enfermos, y conlleva uno de los indices de letalidad mas altos de todas las infecciones por Gram-negativos. Aunque tradicionalmente se ha considerado que los pulmones son un sitio importante de infeccion por P. aeruginosa entre pacientes cnticamente enfermos, surgen un numero significativo de estas infecciones como resultado de la contaminacion directa de las vfas respiratorias por la flora gastrointestinal o por la diseminacion hematogena de los intestinos al parenquima del pulmon. Pseudomonas aeruginosa produce graves infecciones en pacientes inmunologicamente comprometidos y es un patogeno importante en pacientes con fibrosis qrnstica. Un mecanismo de virulencia importante es la formacion de una biopelicula mucoide. El alginato secretado es un constituyente crucial de la matriz de biopelicula mucoide. Sin embargo, los mutantes negativos para alginato de P. aeruginosa tambien son capaces de formar biopelfculas no mucoides, que muestran una arquitectura diferente de la de biopelfculas formadas por P. aeruginosa mucoide que produce en exceso alginato (Nivens DE, Ohman DE, Williams J, Franklin MJ. Role of alginate and its O acetylation in formation of Pseudomonas aeruginosa microcolonies and biofilms. J Bacteriol 2001;183: 1047-57; Wozniak DJ, Wyckoff TJ, Starkey M, Keyser R, Azadi P, OToole GA, Parsek MR. Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PAI 4 and PAOI Pseudomonas aeruginosa biofilms. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:7907-12).

Helicobacter pylori

H. pylori es uno de los patogenos humanos mas comunes que infectan al 50 % de la poblacion mundial. Esta asociado con ulceras duodenales, ulceras gastricas, gastritis y carcinoma gastrico. El tratamiento de H. pylori es diffcil, implicando regfmenes multifarmaco y periodos de tratamiento extensos. Hay una tasa de recafda del 10-20 %.

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Estudios recientes documentan la importancia de biopelmulas en la patogenesis de la enfermedad por H. pylori (Coticchia JM et al. Presence and density of Helicobacter pylori biofilms in human gastric mucosa in patients with peptic ulcer disease. J Gastrointest Surg. 2006;10:883-9). Una formulacion multienzimatica oral mantiene la gran promesa de facilitar la eliminacion de biopelmula de H. pylori y la erradicacion de patogenos de H. pylori, reduciendo asf el riesgo de gastritis, enfermedad de ulcera peptica y cancer gastrico.

Listeria

El patogeno transmitido por los alimentos Listeria es el agente causante de la listeriosis, una enfermedad grave donde la forma abierta tiene una grave mortalidad superior al 25 %. Listeria monocytogenes puede sobrevivir y crecer durante un amplio intervalo de condiciones medioambientales tales como temperaturas de refrigeracion, pH bajo y alta concentracion de sales. Esto permite al patogeno vencer la preservacion de alimentos y las barreras de seguridad, y plantea un posible riesgo para la salud humana. Listeria monocytogenes puede encontrarse espedficamente en alimentos crudos, tales como leche lfquida sin pasteurizar, verduras crudas y aves de corral cocinadas. Tiene la capacidad de crecer a bajas temperaturas; permitiendo asf que crezca en alimentos refrigerados. Se creyo que Listeria monocytogenes estaba exclusivamente asociado a infecciones en animales, pero recientemente esta especie patogena tambien ha sido aislada, en su forma durmiente, en el tubo digestivo de pequenos porcentajes de la poblacion humana (Rouquette C, Berche P. The pathogenesis of infection by Listeria monocytogenes. Microbiologia 1996;12:245-58).

Campylobacter

Campylobacter jejuni es una especie de bacterias microaerofilas Gram-negativas en forma de bastones curvadas comunmente encontradas en heces de animales. Es una de las causas mas comunes de gastroenteritis humana en el mundo. La intoxicacion alimentaria producida por especies de Campylobacter puede ser gravemente debilitante, pero es raramente potencialmente mortal. Se ha asociado con el posterior desarrollo de smdrome de Guillain-Barre (GBS), que normalmente se desarrolla dos a tres semanas despues de la enfermedad inicial. El alimento contaminado es una fuente importante de infecciones aisladas, con comida incorrectamente preparada y aves de corral normalmente la fuente de las bacterias. La infeccion con C. jejuni normalmente produce enteritis, que se caracteriza por dolor abdominal, diarrea, fiebre y malestar general. Se muestra que el principal patogeno gastrointestinal, Campylobacter jejuni, existe como tres formas de biopelmula de monoespecie en cultivo lfquido (Joshua GW, Guthrie-Irons C, Karlyshev AV, Wren BW. Biofilm formation in Campylobacter jejuni. Microbiology 2006;152(Pt 2):387-96).

Bacillus anthracis

Bacillus anthracis es una bacteria formadora de endosporas Gram-positiva y es el agente etiologico del carbunco pulmonar, gastrointestinal y cutaneo. En areas endemicas en las que interaccionan seres humanos y ganado, se informan comunmente casos cronicos de carbunco cutaneo. Actualmente, hay algunos datos conocidos por el inventor que explican la importancia del modo de vida de la biopelmula de B. anthracis, incluso se han caracterizado biopelmulas en otros patogenos y especies de Bacillus no patogenas, que incluyen Bacillus cereus y Bacillus subtilis, respectivamente. B. anthracis forma facilmente biopelmulas que son inherentemente resistentes a los antibioticos comunmente recetados (Lee K, Costerton JW, Ravel J, Auerbach RK, Wagner DM, Keim P, Leid JG. Phenotypic and functional characterization of Bacillus anthracis biofilms. Microbiology 2007;153(Pt 6): 1693-701).

Yersinia

La yersiniosis es una enfermedad infecciosa producida por una bacteria del genero Yersinia. En los Estados Unidos, la mayona de las enfermedades humanas son causadas por una especie, Y. enterocolitica. La infeccion por Y. enterocolitica se produce casi siempre en ninos jovenes. Smtomas comunes en ninos son fiebre, dolor abdominal y diarrea. Los smtomas gastrointestinales son comunes en tanto los estados agudos como cronicos de la yersiniosis. La infeccion es casi siempre adquirida por comer alimento contaminado, especialmente productos de cerdo crudos o poco cocinados. El beber leche sin pasteurizar contaminada o agua sin tratar tambien puede transmitir la infeccion.

Yersinia pestis, el agente causante de la peste bubonica, se transmite a roedores y seres humanos por las picaduras de pulgas cuyos proventnculos estan bloqueados por una densa masa de bacterias de biopelmula. (Tan L, Darby C. A movable surface: formation of Yersinia sp. biofilms on motile Caenorhabditis elegans. J Bacteriol. 2004; 186:508792). El bloqueo priva de comida a la pulga y la estimula para picar repetidamente en busqueda de comidas de sangre, extendiendo asf las bacterias a nuevos hospedadores. Los modelos de biopelmula usando Caenorhabditis elegans pueden usarse para identificar enzimas que matan biopelmulas de Yersinia (Styer KL, Hopkins GW, Bartra SS , Piano GV, Frothingham R,Aballay A. Yersinia pestis kills Caenorhabditis elegans by a biofilm-independent process that involves novel virulence factors. EMBO reports 2005;10:992-7).

Especies de Brucella

Los seres humanos son generalmente infectados por una de tres vfas: comer o beber algo que esta contaminado con Brucella, respirar el organismo (inhalacion), o haber entrado las bacterias en el cuerpo a traves de heridas de la piel. La forma mas comun de infectarse es por comer o beber productos de leche contaminados.

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Salmonella

Salmonella enterica, un patogeno transmitido por los alimentos que produce salmonelosis, se produce por la ingestion de bacterias que invaden el epitelio intestinal y se multiplican allf Salmonella enterica es conocida por formar biopelmulas, y su union a, y crecimiento sobre, celulas eucariotas se facilita por exopolisacaridos (Ledeboer & Jones, 2005). La mayona de las personas infectadas con Salmonella desarrollan diarrea, fiebre y calambres abdominales 12 a 72 horas despues de la infeccion. La enfermedad normalmente dura 4 a 7 dfas, y la mayona de las personas se recuperan sin tratamiento. Sin embargo, en algunas personas la diarrea puede ser tan grave que el paciente necesita ser hospitalizado. En estos pacientes, la infeccion por Salmonella puede extenderse de los intestinos a la corriente sangumea, y entonces a otros sitios del cuerpo y puede producir la muerte, a menos que la persona se trate inmediatamente.

Shigella

Hay varios tipos diferentes de bacterias Shigella: Shigella sonnei, tambien conocida como Shigella del "grupo D", representa dos tercios de la shigelosis en los Estados Unidos. La shigelosis es una enfermedad infecciosa producida por un grupo de bacterias llamadas Shigella. La mayona de los infectados por Shigella desarrollan diarrea, fiebre y colicos a partir de un dfa o dos despues de que se expongan a las bacterias. Algunas bacterias de Shigella han llegado a ser resistentes a los antibioticos. Un segundo tipo, Shigella flexneri, o Shigella del "grupo B", representa casi todo el resto. Otros tipos de Shigella continuan siendo causas importantes de enfermedad en el mundo en desarrollo. Un tipo encontrado en el mundo en desarrollo, Shigella dysenteriae tipo 1, produce epidemias mortales alli.

Typhi (fiebre tifoidea)

Salmonella enterica serovariedad Typhi produce la fiebre tifoidea, una fiebre enterica que es posiblemente mortal. Portadores asintomaticos pueden portar bacterias en la vesmula biliar. Salmonella typhi vive solo en seres humanos. Personas con fiebre tifoidea portan las bacterias en su circulacion sangumea y tubo digestivo. Ademas, un pequeno numero de personas, llamados portadores, se recuperan de la fiebre tifoidea, pero continuan portando las bacterias. Tanto las personas enfermas como los portadores excretaron S. typhi en sus heces (excrementos). Salmonella typhi se transmite en alimentos contaminados, agua y bebidas. Recientemente se desarrollo un sistema para analizar la formacion de biopelmulas de Salmonella sobre cubreobjetos de vidrio (Prouty AM, Schwesinger WH, Gunn JS. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun 2002;70:2640-9).

Escherichia coli

Escherichia coli enterotoxigenica se dirige el intestino delgado donde el efecto de barrera de la microflora autoctona es bajo debido a la acidez y los movimientos peristalticos mas altos en esta region. Este organismo se adhiere a y coloniza el moco con el fin de provocar un efecto patogeno (Knutton S, Lloyd DR, Candy DC, McNeish AS. In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies. Infect Immun 1984;44:514-8). Esto significa que el patogeno y/o sus toxinas pueden adherirse facilmente a enterocitos expuestos e invadir el hospedador.

Vibrio cholerae (colera)

Vibrio cholerae es un patogeno facultativo Gram-negativo que es el agente causante del colera, una enfermedad diarreica devastadora que afecta a millones de personas en el mundo en desarrollo cada ano; sobrevive en reservorios acuosos, probablemente en forma de biopelmulas.

Entamoeba histolytica

La amebiasis intestinal invasiva, producida por Entamoeba histolytica, se inicia con la union de trofozottos a la capa de moco colonico, rotura de moco y/o agotamiento, y adherencia a y citolisis de celulas epiteliales e inflamatorias hospedadoras. Un modelo de trabajo actual de la amebiasis intestinal sugiere que el microentorno del intestino hospedador, particularmente las mucinas intestinales y la biopelmula bacteriana, pueden influir en el comportamiento de las amebas patogenas. Las enzimas que rompen la biopelmula bacteriana seran utiles en la inhibicion y el tratamiento de la amebiasis.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1:

Documentacion de una actividad anti-biopelicula de formulacion multienzimatica

Se realizaron experimentos iniciales con una formulacion multienzimatica que consistfa en celulasa - 2000 CU, glucoamilasa - 50 AGU, hemicelulasa/pectinasa - 300 HSU, beta-glucanasa - 100 BGU, complejo de proteasa/peptidasa con actividad de DPP-IV - 100.000 HUT, quitosanasa - 100 unidades, lisozima - 200.000 SHU y Serratia peptidasa - 1000 unidades. Estas actividades enzimaticas estuvieron contenidas en una mezcla de 500 mg que incluyo 20 mg de L-leucina. La formulacion multienzimatica se probo durante una serie de diluciones de

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50 mg/ml a 0,34 mg/ml. Las diluciones se hicieron en caldo de Mueller Hinton con ajuste de cationes esteril (CAMHB) o caldo de dextrosa de Sabouraud (SDB) para levaduras.

La formulacion multienzimatica se probo in vitro contra Escherichia coli O157:H7, Klebsiella pneumoniae ATCC 4352, Candida paratropicalis ATCC 99916 y Candida albicans SJ2083133. Aunque Candida albicans forma biopelfculas significativas in vivo, no es un formador predecible de biopelfculas in vitro, pero se incorporo en el experimento debido a su importancia clmica.

El proceso experimental para la prueba de susceptibilidad antimicrobiana de alto rendimiento uso un ensayo de dispositivo de biopelfcula de Calgary (MBEC™ P&G, Innovatech). El protocolo estandar puede dividirse en una serie de etapas, que se detallan a continuacion.

Cultivo de organismos y formacion de las biopelfculas.

a. Usar una reserva criogenica (a -70 °C), extender un primer sub-cultivo de los organismos bacterianos enumerados anteriormente sobre agar triticasa de soja (TSA).

b. Incubar a 37 °C durante 24 horas y guardar la placa envuelta en parafilm a 4 °C.

c. Del primer sub-cultivo, extender un segundo sub-cultivo sobre TSA.

Incubar a 37 °C durante 24 horas. El segundo sub-cultivo debe usarse en el plazo de 24 horas a partir del momento en el que se saco por primera vez de la incubacion.

d. Usar el segundo sub-cultivo para crear un inoculo en 3 ml de agua de esteril que se corresponde con un patron 0,5 de McFarland (1,5 x 108 celulas por ml) en un tubo de ensayo de vidrio usando un hisopo de algodon esteril.

e. Diluir esta disolucion 1:30 en CAMHB (o 1:10 en SDB para levadura).

f. Invertir el organismo diluido 3-5 veces para lograr la mezcla uniforme del organismo.

g. La densidad celular sera confirmada por dilucion en serie y depositar en placa muestras por triplicado del inoculo sobre TSA o SA.

h. El organismo diluido restante (22 ml) se colocara en las depresiones de un dispositivo MBEC HTP de 96 pocillos.

i. Poner la tapa del dispositivo de MBEC de 96 pocillos sobre la placa de fondo que contiene el organismo.

j. Poner el dispositivo en un agitador de balanceo en una estufa de incubacion humidificada a 37 °C durante 24 horas establecida a 3-4 balanceos por minuto.

k. Se usaron placas de poli-L-lisina para cultivar C. paratropicalis y C. albicans. Estas se prepararon diluyendo 0,1 % (peso/volumen) de disolucion de poli-L-lisina (Sigma P8920) 10X en agua desionizada que se esterilizo por filtracion.

Se prepararon placas de microtitulacion de 96 pocillos esteriles bajo una campana de flujo laminar.

Cada placa incluyo controles de esterilidad, controles de crecimiento y pocillo de exposicion a antibioticos. Se uso gentamicina para las bacterias y anfotericina B para Candida en intervalos de concentracion de 1024 mcg/ml a 1 mcg/ml. Los organismos se probaron usando momentos de tiempo de exposicion de 24 horas. Se evaluo una placa por organismo por momento de tiempo. Se usaron muestras por triplicado para evaluar el impacto de la formulacion multienzimatica sobre la formacion de biopelfculas.

Se determinaron la concentracion inhibitoria minima planctonica (MIC) y la concentracion bactericida minima MBC despues de incubar la placa de exposicion a 35 ± 2°C durante 24 horas. La determinacion de MIC se hizo por inspeccion visual. La MIC se define como la concentracion minima que inhibe el crecimiento del organismo. Los resultados de MBC se determinan tras la incubacion de 24 horas por +/- crecimiento.

Los resultados de concentracion de erradicacion de biopelfcula minima (MBEC) se determinaron tras la incubacion de 24 horas a partir de los paneles de MBEC usando el lector de placas conjuntamente con los datos de reduccion de log10. La turbidez se evaluo visualmente en los pocillos de la placa de recuperacion. Alternativamente, se uso un lector de placas de microtitulacion para obtener mediciones de densidad optica a 630 nm (DO630). Pocillos transparentes (DO630 < 0,1) son evidencia de la erradicacion de biopelfculas. La MBEC se define como la concentracion minima de antibiotico que inhibe el crecimiento de la biopelfcula.

Los resultados del experimento 1 fueron los siguientes:

a. Escherichia coli O157:H7 - No se observaron puntos de corte de MIC, MBC y MBEC con la multienzima probada. La formulacion multienzimatica no tuvo actividad anti-biopelfcula en absoluto, excepto las 2 concentraciones probadas mas bajas. Los datos se tabulan a continuacion:

Estadistica*

Reduccion logantmica

Placa - Reduccion logantmica de enzima (prueba de GC) Reduccion logantmica frente a GC

Dilucion (mg/ml)

Filtrada 1 2 3 Mean ± DE P S/NS*

50,00

-0,42 0,70 0,31 0,16 0,39 0,28 0,00 S

25,00

0,53 1,18 1,37 1,53 1,36 0,17 0,00 S

12,50

1,70 1,64 2,00 1,64 1,76 0,21 0,00 S

6,25

2,78 1,70 2,00 1,58 1,76 0,22 0,00 S

3,13

0,78 0,20 0,53 0,78 0,50 0,29 0,00 S

1,56

0,58 0,78 1,00 0,88 0,89 0,11 0,00 S

0,78

0,14 0,25 0,23 0,23 0,23 0,01 0,00 S

*Prueba de la T de Student bilateral de datos no emparejados (para significacion estadfstica, p < 0,05)

5 b. Klebsiella pneumoniae ATCC 4352 - Para MIC y MBC no se observaron puntos de corte a las concentraciones probadas. El valor de MBEC para la formulacion multienzimatica fue 6,25 mg/ml. La formulacion multienzimatica tuvo actividad anti-biopelfcula con reducciones logantmicas de 3,0 - 3,8 a las concentraciones de 50 - 6,25 mg/ml y ~1,5 para las concentraciones mas bajas. Los datos se tabulan a continuacion:

Estadistica*

Reduccion logantmica

Placa - Reduccion logantmica de enzima (prueba de GC) Reduccion logantmica frente a GC

Dilucion (mg/ml)

Filtrada 1 2 3 Media ± DE P S/NS*

50,00

3,65 3,87 3,39 4,35 3,87 0,48 0,00 S

25,00

3,02 3,35 3,65 3,57 3,52 0,16 0,00 S

12,50

2,87 3,17 3,04 3,04 3,09 0,07 0,00 S

6,25

2,04 3,65 3,44 3,35 3,48 0,15 0,00 S

3,13

1,57 1,23 2,35 1,50 1,69 0,58 0,00 S

1,56

0,44 1,39 1,50 1,50 1,46 0,06 0,00 S

0,78

0,44 1,50 1,74 1,74 1,66 0,14 0,00 S

0,39

1,65 1,14 2,04 1,57 1,58 0,45 0,00 S

*Prueba de la T de Student bilateral de datos no emparejados (para significacion estadfstica, p < 0,05)

10 c. Candida paratropicalis ATCC 99916 - No se observaron valores de corte de MIC, MBC y MBEC a las concentraciones probadas. La formulacion multienzimatica tuvo actividad anti-biopelfcula con una reduccion logantmica a las concentraciones entre 25 mg/ml y 1,56 mg/ml. Los datos se tabulan a continuacion:

Estadistica*

Reduccion logantmica

Placa - Reduccion logantmica de enzima (prueba de GC) Reduccion logantmica frente a GC

Dilucion (mg/ml)

Filtrada 1 2 3 Media ± DE P S/NS*

50,00

-0,40 -0,36 -0,51 -0,36 -0,41 0,08 0,00 S

25,00

-0,54 -0,06 0,16 -0,27 -0,06 0,21 0,00 S

12,50

0,94 1,34 1,16 1,64 1,38 0,24 0,00 S

6,25

1,16 0,94 1,64 1,34 1,30 0,35 0,00 S

3,13

1,34 1,16 1,04 1,64 1,28 0,32 0,00 S

1,56

0,46 1,34 1,16 1,16 1,22 0,10 0,00 S

0,78

0,94 1,04 0,60 -0,06 0,52 0,55 0,00 S

0,39

0,04 0,34 1,04 -0,06 0,44 0,56 0,00 S

*Prueba de la T de Student bilateral de datos no emparejados (para significacion estadfstica, p < 0,05)

d. Candida albicans SJ2083133 no formo de forma fiable biopeKcula y no pudo evaluarse la multienzima.

EJEMPLO 2:

El Experimento 2 evaluo la formulacion multienzimatica anterior sin y con 125 mg de acido etilendiaminatetraacetico 5 disodico para la actividad anti-biopelfcula contra Staphylococcus aureus ATCC 29213 y Staphylococcus aureus MRSA U de C #18. El medio de crecimiento y las condiciones fueron TSB/TSA, aerobias y 35 ± 2 °C. El diseno experimental y las condiciones fueron como se han descrito anteriormente para el experimento 1.

Los resultados del experimento 2 fueron los siguientes:

Staphylococcus aureus ATCC 29213 - Se encontro que MIC, MBC y MBEC para la formulacion multienzimatica no 10 tema puntos de corte a las concentraciones probadas. La formulacion multienzimatica no tuvo actividad anti- biopelfcula en absoluto, excepto las concentraciones probadas mas bajas. Las reducciones logantmicas frente a los controles de crecimiento (GC) fueron significativos al nivel de P<0,05. Los datos se tabulan a continuacion:

Reduccion logantmica

Placa - Reduccion logantmica de enzima (prueba de GC)

Dilucion (mg/ml)

Filtrada 1 2 3 Media ± DE

50,00

2,38 1,90 1,90 1,58 1,79 0,19

25,00

3,15 3,01 2,81 2,38 2,73 0,32

12,50

3,55 1,65 1,81 0,53 1,33 0,70

6,25

1,38 1,78 2,74 2,08 2,20 0,49

3,13

0,85 3,01 1,55 1,74 2,10 0,79

1,56

1,85 2,16 2,01 1,81 1,99 0,17

0,78

0,44 -0,19 2,65 0,78 1,08 1,44

0,34

0,08 0,38 -0,10 0,53 0,27 0,33

Staphylococcus aureus ATCC 29213 - Se encontro que la MBEC para la formulacion multienzimatica con EDTA no 15 tema punto de corte a las concentraciones probadas. Se observo que la MBC para multienzima/EDTA tema el punto

de corte a 3,13 mg/ml y se encontro que la MIC para multienzima/EDTA tema el punto de corte a 1,56 mg/ml. La reduccion logantmica para multienzima/EDTA muy superior a la reduccion logantmica para la formulacion

multienzimatica y a una concentracion mucho mas baja para multienzima/EDTA que muestra que multienzima/EDTA tiene un efecto mucho mayor en la erradicacion de la biopeKcula bacteriana. Los datos se tabulan a continuacion.

Reduccion logantmica

Placa - Reduccion logantmica de enzima/EDTA (prueba de GC)

Dilucion (mg/ml)

Filtrada 1 2 3 Media ± DE

50,00

2,85 2,38 3,85 1,85 2,69 1,03

25,00

3,55 2,81 5,85 5,85 4,84 1,76

12,50

2,38 3,55 5,85 5,85 5,09 1,33

6,25

2,71 3,38 3,85 5,85 4,36 1,32

3,13

3,85 5,85 5,85 5,85 5,83 0,00

1,56

2,65 3,85 3,38 3,55 3,59 0,24

0,78

2,16 5,85 5,85 3,85 5,19 1,16

0,34

0,95 0,30 0,65 0,49 0,48 0,18

Staphylococcus aureus MRSA 399 - Se encontro que MIC, MBC y MBEC para la formulacion multienzimatica no 5 teman punto de corte a las concentraciones probadas. La formulacion multienzimatica presento actividad anti- biopeKcula a traves de un intervalo de concentraciones, aunque la actividad era incoherente. Se indica la variabilidad entre las muestras por triplicado. Los datos se tabulan a continuacion.

Reduccion logantmica

Placa - Reduccion logantmica de enzima (prueba de GC)

Dilucion (mg/ml)

Filtrada 1 2 3 Media ± DE

50,00

-1,27 3,73 0,73 3,73 2,73 1,73

25,00

3,73 3,73 0,25 3,73 2,57 2,01

12,50

-0,75 -2,75 3,73 -0,88 0,03 3,33

6,25

1,72 3,73 3,73 -0,05 2,47 2,18

3,13

1,42 1,72 0,42 3,73 1,96 1,66

1,56

-0,48 -0,32 -1,88 -0,12 -0,77 0,96

0,78

-1,88 -0,27 -1,45 0,65 -0,36 1,05

0,34

-1,39 1,72 -0,27 3,73 1,72 2,00

EJEMPLO 3:

10 Staphylococcus aureus MRSA 399 - Se encontro que la MBEC para la formulacion multienzimatica con EDTA no tema punto de corte a las concentraciones probadas. Se observo que MIC y MBC para la formulacion multienzimatica con EDTA teman el punto de corte a 1,56mg/ml. La formulacion multienzimatica con EDTA mas potente y mas eficaz en la erradicacion de la biopelfcula bacteriana en comparacion con la multienzima ya que la formulacion multienzimatica con la reduccion logantmica mas grande de EDTA es a una concentracion mas baja que

15 la reduccion logantmica mas grande de multienzima. La observacion es que la enzima/EDTA para actividades de MIC y MBC indica propiedades antimicrobianas significativas, ademas de anti-biopelfcula. Los datos se tabulan a continuacion.

Reduccion logantmica

Placa - Reduccion logantmica de enzima/EDTA (prueba de GC)

Dilucion (mg/ml)

Filtrada 1 2 3 Media ± DE

50,00

-1,60 0,61 3,73 -0,27 1,35 2,10

5

10

15

20

25

Reduccion logaritmica

Placa - Reduccion logaritmica de enzima/EDTA (prueba de GC)

25,00

-2,97 3,73 3,73 -1,75 1,90 3,16

12,50

0,95 3,73 3,73 3,73 3,73 0,00

6,25

3,73 0,73 3,73 0,42 1,63 1,83

3,13

3,73 3,73 3,73 1,72 3,06 1,16

1,56

1,72 1,72 3,73 3,73 3,06 1,16

0,78

0,73 3,73 3,73 3,73 3,73 0,00

0,34

3,73 3,73 3,73 3,73 3,73 0,00

Todos los terminos usados en el presente documento se usan segun sus significados habituales, a menos que el contexto o definicion indique claramente de otro modo. Tambien a menos que se indique expresamente de otro modo, el uso de "o" incluye "y" y viceversa. Terminos no limitantes no deben interpretarse como limitantes, a menos que se establezca expresamente, o el contexto indique claramente, de otro modo (por ejemplo, "que incluye", "que tiene" y "que comprende" normalmente indican "que incluye sin limitacion"). Formas en singular, incluyendo en las reivindicaciones, tales como "un", "una", "el" y "la" incluyen la referencia en plural, a menos que se establezca expresamente, o el contexto indique claramente, de otro modo.

El alcance de las presentes composiciones anti-biopelfcula fisiologicamente aceptables, sistemas y metodos, etc., incluye tanto conceptos de medios mas funcion como etapa mas funcion. Sin embargo, las reivindicaciones no deben interpretarse como que indican una relacion "medios mas funcion", a menos que la palabra "medios" este espedficamente citada en una reivindicacion, y no deben interpretarse como que indican una relacion de "medios mas funcion" donde la palabra "medios" esta citada espedficamente en una reivindicacion. Similarmente, las reivindicaciones no deben interpretarse como que indican una relacion de "etapa mas funcion", a menos que la palabra "etapa" este espedficamente citada en una reivindicacion, y deben interpretarse como que indican una relacion de "etapa mas funcion" donde la palabra "etapa" esta espedficamente citada en una reivindicacion.

De lo anterior se apreciara que, aunque realizaciones espedficas han sido tratadas en el presente documento para fines de ilustracion, pueden hacerse diversas modificaciones sin desviarse del espmtu y alcance de la discusion en el presente documento. Por consiguiente, los sistemas y metodos, etc., incluyen tales modificaciones, ademas que no deben interpretarse como limitantes, a menos que se establezca expresamente, o el contexto indique claramente, de otro modo (por ejemplo, "que incluye", "que tiene" y "que comprende" normalmente indican "que incluye sin limitacion"). Formas en singular, incluyendo en las reivindicaciones, tales como "un", "una", "el" y "la" incluyen la referencia en plural, a menos que se establezca expresamente, o el contexto indique claramente, de otro modo.

De lo anterior se apreciara que, aunque realizaciones espedficas han sido tratadas en el presente documento para fines de ilustracion, pueden hacerse diversas modificaciones.

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion para su uso en la inhibicion o el tratamiento de una infeccion por biopelfcula gastrointestinal, que comprende combinar una cantidad farmaceuticamente eficaz de una celulasa estable a acidos, una glucoamilasa, un complejo de hemicelulasa/pectinasa estable a acidos, p-glucanasa, un complejo de proteasa/peptidasa que tiene actividad de dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV), quitosanasa, lisozima y Serratia peptidasa con al menos uno de un vehfculo, adyuvante, excipiente, tampon y diluyente farmaceuticamente aceptable.
2. 2. La composicion para su uso en la inhibicion o el tratamiento de una infeccion por biopelfcula gastrointestinal segun la reivindicacion 1, en la que la composicion comprende ademas un agente anti-poli-p-1,6-A/-acetil-D-glucosamina (anti-poli-p-1,6-GlcNAc) seleccionado de hexosaminidasa o dispersina B.
3. 3. La composicion para su uso en la inhibicion o el tratamiento de una infeccion por biopelfcula gastrointestinal segun la reivindicacion 1 o 2, en la que la cantidad de celulasa por dosis oscila de 1 a 10.000 CU, la cantidad de complejo de hemicelulasa/pectinasa oscila de 1 a 8.000 HSU y la cantidad de p-gluconasa oscila de 1 a 1000 BGU.
4. 4. La composicion para su uso en la inhibicion o el tratamiento de una infeccion por biopelfcula gastrointestinal segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composicion comprende ademas una cantidad eficaz de al menos un agente estable a acidos seleccionado de los siguientes: un disacarido; a-amilasa; p-amilasa; endoglucanasa; xilanasa; lipasa; bromelama; papama; ficina; proteasa de kiwi; cualquier proteasa o proteinasa derivada de planta; o fitasa.
5. 5. La composicion para su uso en la inhibicion o el tratamiento de una infeccion por biopelfcula gastrointestinal segun la reivindicacion 1 a 4, en la que la composicion comprende ademas al menos una enzima estable a acidos en una cantidad capaz de degradacion de biopelfcula, la al menos una enzima seleccionada de las siguientes: 1,2-1,3-a-D- manano manohidrolasa, 1,3-p-D-xilano xilanohidrolasa, 1,3-p-D-glucano glucanohidrolasa, 1,3(1,3;1,4)-a-D-glucano 3-glucanohidrolasa, 1,3(1,3;1,4)-p-D-glucano 3(4)-glucanohidrolasa, 1,3-1,4-a-D-glucano 4-glucanohidrolasa, 1,4-a- D-glucano glucanohidrolasa, 1,4-a-D-glucano glucohidrolasa, 1,4-(1,3:1,4)-p-D-glucano 4-glucanohidrolasa, 1,4-p-D- glucano glucohidrolasa, 1,4-p-D-xilano xilanohidrolasa, 1,4-p-D-manano mananohidrolasa, 1,5-a-L-

   arabinanohidrolasa, 1,4-a-D-glucano maltohidrolasa, 1,6-a-D-glucano 6-glucanohidrolasa, 2,6-p-fructano fructanohidrolasa, a-dextrina 6-glucanohidrolasa, a-D-galactosido galactohidrolasa, a-D-glucosido glucohidrolasa, a- D-manosido manohidrolasa, acilneuraminil hidrolasa, galactohidrolasa de polisacarido capsular de Aerobacter, p-D- fructofuranosido fructohidrolasa, 1-D-fucosido fucohidrolasa, a-D-fructano fructohidrolasa, p-D-galactosido galactohidrolasa, 13-D-glucosido glucohidrolasa, p-D-glucuronosido, glucuronosohidrolasa, p-D-manosido

   manohidrolasa, p-N-acetil-D-hexosaminida N-acetilhexosamino hidrolasa, celulosa-sulfato sulfohidrolasa,

   colagenasa, dextrina 6-a-D-glucanohidrolasa, glucoprotema-fosfatidilinositol fosfatidohidrolasa, hialuronato 4- glucanohidrolasa, hialuronoglucuronidasa, pectina pectilhidrolasa, peptidoglicano N-acetilmuramoilhidrolasa, fosfatidilcolina 2-acilhidrolasa, fosfatidilcolina 1-acilhidrolasa, poli(1,4-a-D-galacturonido), poli(1,4-(N-acetil-p-D- glucosaminida))-glucanohidrolasa, proteasas, sacarosa a-glucosidasa, triacilglicerol acilhidrolasa, triacilglicerol protema-acilhidrolasa.
6. 6. La composicion para su uso en la inhibicion o el tratamiento de una infeccion por biopelfcula gastrointestinal segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la composicion comprende ademas una subtilisina estable a acidos en una cantidad capaz de degradacion de biopelfcula.
7. 7. La composicion para su uso en la inhibicion o el tratamiento de una infeccion por biopelfcula gastrointestinal segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la composicion comprende ademas DNasa I estable a acidos en una cantidad capaz de degradacion de biopelfcula.
8. 8. La composicion para su uso en la inhibicion o el tratamiento de una infeccion por biopelfcula gastrointestinal segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la composicion comprende ademas al menos uno de aceite de oregano, berberina, acido undecilenico, un antibiotico de venta con receta, un antimicrobiano de venta con receta, un microorganismo probiotico o un prebiotico.