JPH11503317A

JPH11503317A - エキソポリサッカリド分解酵素およびその使用

Info

Publication number: JPH11503317A
Application number: JP8530006A
Authority: JP
Inventors: ファン・スペイブルーク，ミシェル・エム・ペー; ブルヘマン，ヘールト; ファン・プール，ヨーゼフ; ファン・ペー，クリスティン・ローラ・イグナティウス; ファンダメ，エリック・イェー
Original assignee: ベッツディアボーン・インコーポレイテッド
Priority date: 1995-04-07
Filing date: 1996-04-09
Publication date: 1999-03-26
Also published as: EP0820516A2; AU705804B2; AU5500296A; CA2215996A1; ATE214099T1; NO974545L; WO1996031610A2; WO1996031610A3; DE69619665T2; NO974545D0; NZ306445A; KR19980703611A; DE69619665D1; EP0820516B1; ES2174068T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、エキソポリサッカリド分解酵素、エキソポリサッカリドを分解しうる酵素組成物、および特に表面上の生物皮膜の減少または除去、および該表面上の生物皮膜形成の防止に関する。さらに具体的には、本発明は、水系(水保持系、流体系)の表面上の生物皮膜の減少、除去および／または防止のための、酵素および／または酵素組成物(少なくとも１種のエキソポリサッカリド分解酵素を含有する)の使用に関する。さらに、本発明は、エキソポリサッカリド分解酵素を産生する細菌株、およびストレプトミセス属の新たに単離した菌株から調製したエキソポリサッカリド分解酵素に関する。具体的には、本発明のエキソポリサッカリド分解酵素は、コラン酸分解酵素である。

Description

【発明の詳細な説明】エキソポリサッカリド分解酵素およびその使用本発明は、エキソポリサッカリド分解酵素、エキソポリサッカリドを分解しうる酵素組成物、および特に表面上の生物皮膜の減少または除去、および該表面上の生物皮膜形成の防止に関する。さらに具体的には、本発明は、水系(水保持系、流体系)の表面上の生物皮膜の減少、除去および／または防止のための、酵素および／または酵素組成物(少なくとも１種のエキソポリサッカリド分解酵素を含有する)の使用に関する。さらに、本発明は、エキソポリサッカリド分解酵素を産生する細菌株、およびストレプトミセス(Streptomyces)属の新たに単離した菌株から調製したエキソポリサッカリド分解酵素に関する。具体的には、本発明のエキソポリサッカリド分解酵素は、コラン酸(colanic acid)分解酵素である。固体表面への微生物の付着は、水系においては普通のことである。一般にこの現象は生物付着と呼ばれ、微生物の層は生物皮膜と呼ばれる。生物皮膜堆積は、 (1)大量の流体から表面への物質の輸送およびその後の付着、(2)生物皮膜内での微生物の代謝、(3)皮膜表面での流体の剪断応力、(4)表面物質および粗雑性、(5 )付着制御処置、が関与する過程の結果である。異なる工業過程における生物皮膜形成に関連する問題は、エネルギー損失、材料品質低下および過程の効率低下である。エネルギー損失は、海運業および流体分配系における動力消費の増加ならびに冷却塔における熱交換能力の低下を意味する。固体表面に隣接する生物皮膜層によって引き起こされる材料品質低下は、腐食および腐敗を意味する。過程の効率低下は、水処理、パルプおよび紙工業ならびに水質データ収集において見られる。また、生物付着は健康管理にも関係している。これらは、例えば、歯苔の形成、疾患を引き起こす真核組織への微生物細胞の付着、飲料水の品質、生物皮膜から工業用水系への病原生物の放出である。工業用プロセス水または運転水系(例えば、冷却水系または紙工場の開放もしくは閉鎖水循環系など)は、微生物増殖に適した条件を供し、その結果として水保持系の表面に生物皮膜(または、スライム)を形成させる。特に冷却水系の場合には、これらの生物皮膜堆積は、熱交換の低下、パイプライン接続部の損傷および系内の腐食を導きうる。このようにして過程制御に悪影響が出ることがあり、これが上記工業過程の効率を低下させ、生成物の品質を損なうことがある。これに加えて、生物皮膜またはスライムの堆積は、より高いエネルギー消費を導くのが普通である。生物皮膜形成の増加によって最も影響を受けるのは、パルプ、紙、板および織物の製造などの工業過程である。例えば抄紙機の場合、かなり大量の水が、「白水系」と呼ばれる回路系中を再循環している(一次または二次回路、即ち、白水ＩまたはII)。分散したパルプを含有するこの白水は、微生物増殖のための理想的な培養培地を構成する。工業用の水系とは別に、生物皮膜形成は、他の環境における表面でも、例えば健康管理における限外濾過および透析膜においても起こりうる。本発明の範囲内で酵素組成物を、生物皮膜形成が起こる任意の系において、スライムを防止および除去するために利用することができる。生物皮膜またはスライムは、細菌、特にグラム陰性細菌、例えばシュードモナス(Pseudomonas)、アシネトバクター(Acinetobacter)およびエーロバクター(Aer obacter)に加えて、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、デスルホビブリオ(D esulfovibrio)、エシェリキア(Escherichia)、スフェロチルス(Sphaerotilus)、エンテロバクター(Enterobacter)およびサルシナ(Sarcina)によって形成される。グラム陰性細菌の細胞壁構造は、スライム形成に特に寄与する因子である。この細胞壁は、タンパク質、リポポリサッカリドおよびリポタンパク質からなる外部膜に加えてアミノ酸およびアセチルアミノ糖からなるペプチドグリカンから構成される。対照的に、グラム陽性細菌、例えばバシルス(Bacillus)の細胞壁は、大部分がテイコン酸(teichonic acid)とペプチドグリカンから構成される。さらに生物皮膜は、真菌および酵母、例えばプルラリア・プルランス(Pullula ria pullulans)、アルテルナリア(Alternaria)種、レンジテス(Lenzytes)、レンチヌス(Lentinus)、ポリポルス(Polyporus)、フォメス(Fomes)、ステリウム(Ste rium)、アスペルギルス(Aspergillus)、フサリウム(Fusarium)、ペニシリウム(P enicillium)、カンジダ(Candida)、サッカロミセス(Saccharomyces)およびバシドマイセテス(Basidomycetes)によっても形成される。生物皮膜は種々の微生物を含むことができる。生物皮膜内に、グラム陰性およびグラム陽性細菌、真菌および藻類の種を見い出すことができる。生物皮膜の成長は、不活性表面における有機分子(即ち、脂質、タンパク質、糖)の濃縮によって開始される。次いで、この層への微生物の引き付けおよびその後のエキソポリマーによる付着が起こる。次いで、この付着した微生物は、独立した微小コロニーを形成する。しばらく後に、さらに多くのコロニーが互いに成長したときに、真の生物皮膜が形成される。この生物皮膜は、定常状態に達するまで厚くなる。流体から既存の生物皮膜への微生物の引き付けは、生物皮膜から流動流体への微生物の剪断によって相殺される。生物皮膜の厚みは、基質濃度に応じて増加する。厚い生物皮膜内の一部の領域は栄養物を消費し尽くし、その結果として弱い構造になる。これらの弱い点が分離して、生物マトリックス中に穴を創製する。その後のこれら穴上の流れの作用がより多くの物質を分離することができ、薄い生物皮膜を残す。生物皮膜がより厚くなるにつれて、表面近くに嫌気性領域が現れる。この領域において、微生物は表面を破壊することができる。一般に、生物皮膜中の微生物は、多量のグリコカリックスと呼ばれる細胞外バイオポリマーに囲まれている。このグリコカリックスは、「グラム陽性細菌のペプチドグリカン層の表面またはグラム陰性細菌の外側膜の表面に対して遠位の細菌表面構造を含むあらゆるポリサッカリド」と定義される。これらの細胞外ポリサッカリドは、エキソポリサッカリド(ＥＰＳ)として知られている。このグリコカリックスは、細胞壁において規則的に配列した糖タンパク質(Ｓ- 層と呼ばれる)から、または細胞表面において繊維状ポリサッカリドマトリックス(カプセル)からなることができ、溶媒中に部分的に流出することもある。このカプセルを高度に組織化することができる。ときには、微生物を取巻くポリサッカリドカプセルが細胞表面に共有結合していないことが観察される。次いで、細胞をペレット化すると、上清中にグリコカリックスが残る。グリコカリックスに囲まれた微小コロニーは、両方の娘細胞が同じグリコカリックス内に捕捉されるように細胞複製が起こることによって生成する。グリコカリックスバイオポリマーの分子間結合は、二価陽イオンによって影響を受ける。ＥＤＴＡによるこれら陽イオンのキレート形成は、生物皮膜を分離させるのに有効である。何人かの研究者が、現在既知の細菌グリコカリックスの機能について全般的な結論を得ている。これは、 (1)固体表面への、または他の原核もしくは真核細胞への細胞の接着において、および (2)培地からの有機栄養物の捕捉において、機能を有しており、 (3)カプセルを十分かつ高度に組織化して粒子を排除し、微生物を環境から保護することができる。このグリコカリックスを、抗生物質、抗体、バクテリオファージに対する第１の防御壁と考えることができる。生物皮膜が微生物物質単独からなることはめったにない。無機物、例えばＣa ＣＯ₃、アルミナ、シリカ、鉄、マグネシウム、銅がスライムの一部となることが多い。紙粉砕機においては、多数の物質、例えば繊維、充填剤、ピッチ、ロジンサイズ剤などが皮膜中に含まれうる。細菌スライムの堆積は殺生物剤によって最も効果的に制御することができるが、これら殺生物剤の効果は、運転水中の微生物を死滅させ、こうしてスライム生成を防止することに基づいている。しかし、生物皮膜生成細菌は、浮遊細菌よりも毒性物質に対してはるかに耐性が高い。従って、極めて高濃度の殺生物剤が生物皮膜の除去のために必要になる。この理由は、生物皮膜細胞の成長が遅く、代謝の活発性が低いため、ならびに、これら細胞がグリコカリックス(これは、毒性物質を固定化するイオン交換樹脂として作用するだけでなく、疎水性／親水性の障壁としても作用する)によって保護され、殺生物剤が細胞に到達するのを妨げるためである。さらに、殺生物剤は、環境との関係が提起され、その毒性のゆえに取扱い時に大きな問題が生じる。このため、生物皮膜を排除する別の方法が過去において求められており、酵素が特に注目されていた。生物皮膜マトリックスは異質でありうる。このマトリックスは主としてポリサッカリドから構築される。従って、スライム除去の分野での研究は、特にポリサッカリドを加水分解する酵素(以下においては、ポリサッカリダーゼと言う)の研究に集中していた。ポリサッカリダーゼなどの酵素を用いてグリコカリックスを分解すること、こうして工業用の水系においてスライム形成を防止すること、または生物皮膜を除去することは、当分野では周知である。工業的なスライムまたは生物皮膜の組成に関する異なる見方にそれぞれ基づいて、上記目的に対していくつかの方法が既に示唆されている。第１の方法は、スライム中に分泌されたエキソポリサッカリドに対しては活性ではないが、細胞壁中のポリサッカリドに対して活性である分解酵素を用いるものである。即ち、これらの酵素は細胞壁を破壊し、細菌を死滅させる。例えば、 DE 37 41 583には、細胞壁中の１,３-グルコース結合に対して分解酵素活性を有するプロテアーゼとグルカナーゼからなる混合物の使用が開示されている。しかし、細菌細胞を保護するスライム層が、これら酵素の細胞壁への到達を妨げることがある。第２の方法は、工業的なスライムが、１種類の細菌種によって産生される単一のポリサッカリド型からなると考えるものである。例えば、US 3,824,184および US 3,773,623には、多種多様の細菌によって産生され、レバンを分解するレバンヒドロラーゼの使用が開示されている。しかし、レバンは、スクロースにより増殖する細菌によって産生されるにすぎない。紙粉砕機または冷却系に関しては、スクロースが有意量で存在する可能性は低く、従ってレバンは生物皮膜の重要成分ではないであろう。 CA 1,274,442およびWO 90/02794は、主としてシュードモナス種によって産生されるアルギネートを分解する酵素アルギン酸リアーゼの使用を開示している。しかし、シュードモナス種は実地条件下で大量のアルギン酸リアーゼを産生することはほとんどなく、このようなアルギン酸リアーゼの使用は限定された価値しか持たない。さらに工業的なスライムは、常に、工業的立地に依存して変化しうる異種微生物の集団によって産生される。それぞれの微生物はそれ自身の典型的なエキソポリサッカリド(ＥＰＳ)を産生するので、工業的なスライム(生物皮膜)が単一のエキソポリサッカリドからなることは決してないであろう。 US 4,055,467には、冷却塔における生物皮膜形成を防止するためのペントサナーゼ-ヘキソサナーゼの使用が開示されている。第３の方法は、多数の異なるヘテロポリサッカリドが工業的スライム中に存在しているという事実から出発する。これらのポリサッカリドが、主として、非常に複雑な配列にあるグルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ラムノース、リボース、グルコサミン、ガラクトサミン、マンヌロン酸、ガラクツロン酸およびグルクロン酸からなることが当分野で周知である[ケンネ(L.Kenne)ら、「ポリサッカリド」、アスピナル(G.Aspinall)編、Vol.II(1983)、アカデミック・プレス(Academic Press)；サザーランド(I.W.Sutherland)、「原核細胞の表面炭水化物」中、アカデミック・プレス、ロンドン(1977)、27-96]。さらに、夥しい他の糖成分が、比較的少量で存在している。従って、工業的スライムにある種の効果を有するためには、多数の異なる酵素活性を組合せるべきと考えられた。しかし、スライムのモノサッカリド組成の知識は、生物皮膜の除去を成功させる酵素混合物を規定するには十分ではない。それぞれのモノサッカリドは、多くの異なる方法で結合することができる。例えば、グルコースは、α-１,２、α-１,３、α-１,４、α-１,６、β-１,２、β-１, ３、β-１,４またはβ-１,６結合することができる。これらのそれぞれに対して、別の酵素活性を付加することができる。また、隣接するモノサッカリドおよびサッカリド上の置換基が、ある種のポリサッカリダーゼの活性にとって非常に重要である。さらに、１つのポリサッカリダーゼ(生物皮膜中に存在するポリサッカリドのブロックを構成する主サッカリドの１つに対して、多数の可能な活性の１つを有する)あるいは数種類のポリサッカリダーゼの混合物であっても、生物皮膜中の複雑な組成のヘテロポリサッカリドに対しては効果を持たないか、または非常に限定された効果しか持たないと予想されるのが普通であろう。しかし、ある種の複雑な混合物がヘテロポリサッカリドの分解に対して陽性効果を示すことが当分野でわかっている。US 5,071,765およびEP-A-0 388 115は、β-およびα-１,４- 結合したグルコースおよび細胞外タンパク質をそれぞれ攻撃するセルラーゼ、α -アミラーゼおよびプロテアーゼの混合物の使用に関する。このアミラーゼがスライム分子の外側に傷を付け、これによりセルラーゼを構造中に侵入させ、スライムを分解することが開示されている。しかし、スライムが外側に特異的にα- １,４-結合を持ち、内側にβ-１,４-結合を持つことは決して証明されていた訳ではない。 US 5,238,572には、ガラクトシダーゼ、ガラクツロニダーゼ、ラムノシダーゼ、キシロシダーゼ、フコシダーゼ、アラビノシダーゼおよびα-グルコシダーゼからなる群から選択される酵素の組合せが開示されている。生物皮膜形成を防止するための第４の方法は、スライム形成の最初の段階、即ち、細菌の付着を制御することである。EP-A-0 425 017には、微生物がその一部において、II型エンドグリコシダーゼと反応する結合によって表面に結合されていることが開示されている。これら種類の酵素(エンド-β-Ｎ-アセチルグルコサミニダーゼ、エンド-α-Ｎ-アセチルガラクトサミニダーゼおよびエンド-β-Ｎ- アセチルガラクトシダーゼ)は、糖タンパク質中に見い出される特異的な内部グリコシド結合を切断することができる。これら酵素の一部が分解性でもあることが知られている。生物皮膜除去または生物皮膜防止のために多数の異なる酵素法が当分野で提案されているが、これらは多数の酵素の組合せを必要とするか、または１種類のみもしくは数種類の酵素を使用する限り、これらは限定された作用範囲しか持っていなかった。さらに、これらの方法は、スライムの除去または制御は別にして、水系の表面への細菌付着を防止し、付着した細菌の分離にも効果のある組成物を供することができなかった。従って、本発明の課題は、広い作用範囲を有する酵素または酵素組成物を提供することである。好ましくは、この組成物は、細菌の付着を防止し、かつ、系の表面に既に付着している細菌を分離しうるものであるべきである。特に、１種類の酵素のみまたは非常に少ない種類の酵素の単純な混合物をそれぞれ含有する製剤を提供すべきである。この組成物はどのような殺生物剤をも含有しないのが有利である。この酵素または酵素群は、当分野で既知の酵素または酵素混合物よりも少ない量の酵素の使用を可能にする活性を有しているべきである。即ち、本発明の目的は、通常の殺生物剤の欠点を回避するが、それらの効果を達成するかまたは越える、水系の表面の生物皮膜の減少および／または除去のための、およびスライム形成の防止のための組成物および方法をそれぞれ利用可能にすることである。本発明によれば、この課題は、水系において見い出される細菌、特に腸内細菌科の群からの細菌によって産生されるエキソポリサッカリドを分解しうる少なくとも１つの酵素を含有する酵素組成物を提供することにより解決される。本発明の酵素および酵素組成物は、水系の表面の生物皮膜の減少および／または除去および／またはスライム形成の防止に有用である。本発明の特定の態様においては、本発明の酵素は、コラン酸を分解することができる。本発明において、生物皮膜の減少、除去および／または防止とは、生物皮膜中のエキソポリサッカリドの減少および／または除去、および／または水系表面のエキソポリサッカリドの付着の防止を包含する。腸内細菌科の細菌は遍在性の微生物であり、これら細菌と結合して、カプセルまたはゆるいスライムのどちらかとして大量のスライムを構築することができる。腸内細菌科の細菌は、紙粉砕機ならびに冷却水[ドリユー・ケミカル・コーポレイション(Drew Chemical Corporation)、「工業用水処理の原理」、1978、第2 版、p.90]において、または飲料水分配系[レケバリアー(LeChevallier)ら：Appl .& Env.Microb．53，1987，2714-2724]において見い出される。この群の細菌は、コラン酸として知られているＭ-抗原ポリサッカリドを含むエキソポリサッカリドを産生することが知られている[アスピナル(Aspinall)、「ポリサッカリド」、アカデミック・プレス(1983)、314]。本発明によれば、驚くべきことに、エキソポリサッカリド分解酵素、特にコラン酸分解酵素を含有する組成物が広い活性を持ち、異なる種類の多数の微生物に対して活性であることが見い出された。本発明の範囲内で、エキソポリサッカリド分解酵素(本明細書においては、エキソポリサッカリダーゼまたはＥＰＳアーゼとも言う)またはコラン酸分解酵素のそれぞれは、微生物、特に細菌起源のものまたはファージ放出酵素のどちらであってもよい。本発明の好ましい態様によれば、組成物は、変性条件下にドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)によって測定したときに約１００kＤaの分子量を有する、細菌起源の細胞外酵素であるエキソポリサッカリド分解酵素(エキソポリサッカリダーゼ)を含有する。好ましくは、この酵素は、適当な培地においてストレプトミセス菌株ＧＤＲ-７を培養することによって製造する。この菌株は、ブダペスト条約のもとで1994年7月27日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション[American Type Culture Collection(ＡＴＣＣ)：12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，アメリカ合衆国]に寄託されており、この寄託は受託番号ＡＴＣＣ５５６０１に対応している。本発明の酵素および酵素組成物は、この細菌株ＡＴＣＣ５５６０１を、または当分野で周知の方法によってこの細菌株ＡＴＣＣ５５６０１から、もしくはファージゲノムから得た該酵素をコードする遺伝子[サザーランド、「原核細胞の表面炭水化物」、1977、p.232]で形質転換した適当な宿主細胞(微生物、特に細菌、植物または動物細胞)を培養することによって調製する。上記の細菌から、またはファージの培養によって、または遺伝子工学の方法によって得た酵素を、粗酵素培養上清の形態またはその精製された形態(即ち、酵素を細胞および培地から分離する)のどちらかで、スライム形成の防止および／または生物皮膜の減少および／または除去のために使用することができる。酵素の回収および精製のための適当な方法は、当分野で周知である。本発明の好ましい態様においては、細菌宿主細胞、特にストレプトミセス属の細菌宿主細胞(該酵素をコードする遺伝子または遺伝子群を保持する)を、適当な培地において培養することによって該酵素を調製する。特に、ＡＴＣＣ受託番号５５６０１に対応するストレプトミセス菌株ＧＤＲ-７またはそれから導かれる細胞株が、本発明の酵素(即ち、エキソポリサッカリダーゼ)の製造に最も適している。本発明の最も好ましい態様においては、このエキソポリサッカリダーゼは、変性条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥによって測定したときに、約１００kＤaの分子量を有する。また、エキソポリサッカリド分解活性を有する酵素を産生しうるストレプトミセス菌株ＡＴＣＣ５５６０１の突然変異体、変異体または形質転換体も、本発明によれば好ましい。さらに、適当な宿主細胞、特に細菌、植物または動物細胞において、ストレプトミセス菌株ＡＴＣＣ５５６０１由来のエキソポリサッカリダーゼ分解酵素をコードする遺伝子またはそのフラグメントを発現させ、そしてクローン化することもできる。本明細書において、「酵素」なる用語は、エキソポリサッカリドを分解しうる該酵素の生物学的に活性な類似体、(天然および合成の)変異体、フラグメントおよび化学的に修飾した誘導体を包含する。本発明によれば、酵素の１次、２次および／または３次構造を、その生物学的活性が保持される限り、修飾することができる。本発明によれば、本エキソポリサッカリダーゼ(精製された形態または粗製の形態)は、他の細菌株、例えばクレブシエラ(Klebsiella)、シュードモナス(Pseu domonas)、キサントモナス(Xanthomonas)などに対しても活性である。即ち、この活性は、腸内細菌科の細菌に加えて種々の細菌種を含む系における生物皮膜除去において、酵素組成物の有効性に寄与する。本発明の範囲内で、本酵素組成物は、ポリサッカリダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼおよびグリコプロテアーゼからなる群からの少なくとも１種の酵素をさらに含有する。１つの態様においては、少なくとも１種のプロテアーゼ、例えば、バシルス・リケニフォルミス(Bacillus Licheniformis)によって産生されるセリンプロテアーゼ(この酵素はアルカリプロテアーゼと呼ばれることが多い)、ストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)のXXI型プロテアーゼおよびバシルス・ポリミキサ(Bacillus polymyxa)IX型メタロプロテアーゼからなる群からのプロテアーゼを追加使用するのが好ましい。清浄用組成物において最も広く使用されているプロテアーゼは、バシルス属の種々の菌株から得られるアルカリプロテアーゼである。ノボ・ノルディスク・バイオインダストリアルズ社(NOV O Nordisk Bioindustrials Inc.)からエスペラーゼ(Esperase^R)およびアルカラーゼ(Alcalase^R)、ならびに、ジスト-ブロケイズ(Gist-Brocades)からマクサターゼ(Maxatase^R)およびマクサカル(Maxacal^R)などの商標名で市販されているプロテアーゼが、ＥＰＳアーゼとの混合に有用な望ましいアルカリ安定性の性質およびタンパク質分解活性を有している。特に、アスペルギルス・サイトイ(Asper gillus saitoi)のアスペルギルス酸プロテイナーゼとエキソポリサッカリダーゼとの組合せが最も有利である。さらに、本組成物は、少なくとも１種の酵素安定化剤、特にグリセロール、ソルビトール、グルコースおよびＥＤＴＡからなる群から選択される安定化剤を含有していてもよい。本発明の酵素組成物は、水系表面の生物皮膜の減少および／または除去のために、および／またはスライム形成の回避のためにプロセスにおいて成功裏に使用される。このようなプロセスにおいて、本組成物は、単一位置において、または異なる複数の位置において水系に添加される。本酵素組成物が１を越える(活性) 成分を含有しているときには、ある種の状況下では、異なる複数の部位においてこれら成分を添加するのが望ましいこともある。本酵素組成物は、系の体積に応じて、発酵ブロスの１〜１０,０００ppm、好ましくは５〜５００ppmの量で添加してよい。コラン酸分解活性に関する本発明の好ましい態様によれば、０.００１〜１００,０００単位／ml、好ましくは０.０１〜１０,０００単位／mlの範囲の濃度で添加する。本発明の酵素組成物は、生物皮膜を生成する微生物を含む任意の水系、即ち開放または閉鎖の工業用プロセス水系における、スライム防止および生物皮膜除去に適している。本発明の酵素組成物の使用は、紙工場における開放または閉鎖の水回路、特に白水回路に、または冷却回路に特に適している。さらに、この使用には、工業用の冷却水塔、水貯蔵タンク、水分配系、パルプおよび紙粉砕水ならびに限外濾過および透析膜における、および健康管理における生物皮膜除去が含まれる。また、発酵において、粘度制御のために、または特定のモノもしくはオリゴサッカリドの製造のために使用することができる。本発明に従い、腸内細菌科の細菌によって産生されるエキソポリサッカリドを加水分解(分解)する単一の酵素が、多種多様の細菌によって形成される生物皮膜の防止に、および既存の生物皮膜の減少および／または除去に適していることは特に驚くべきことであった。さらに、単一微生物のエキソポリサッカリドに対して活性なこの単一酵素が、広く複数のエキソポリサッカリドに対して高い活性を発揮することは全く予想外のことであった。本発明の利点は、特に、この酵素が生物付着過程の開始時点であっても既にその活性を現し、エキソポリサッカリダーゼが生物皮膜の形成前に細菌の付着を防止する点にある。さらに、この酵素は、水系の表面から生物皮膜を効率的に除去し、既に付着した細菌を分離することができる。本発明によれば、スライムの減少、生物皮膜形成の防止および除去に関して相乗的または少なくとも付加的な効果が、エキソポリサッカリダーゼと、ポリサッカリダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼおよびグリコプロテアーゼからなる群からの少なくとも１種の別の酵素(プロテアーゼが最も好ましい)とを組合せることによって達成される。この効果は、バシルス・リケニフォルミスのセリンエンドプロテアーゼ、ストレプトミセス・グリセウスのXXI型プロテアーゼまたはバシルス・ポリミキサIX 型メタロプロテアーゼなどのプロテアーゼによって、および特にアスペルギルス・サイトイ由来のアスペルギルス酸プロテイナーゼによって特に増強される。本発明によれば、本酵素および酵素組成物は、(a)細菌付着の防止、(b)付着細菌の分離、および／または(c)生物皮膜の分解に適している。殺生物剤の代わりにエキソポリサッカリダーゼまたは酵素組成物を使用するのが好ましいが、殺生物剤との組合せも可能であり、ある種の場合には望ましいこともある。また、本発明の酵素および／または酵素組成物を、当業者には明らかである界面活性剤および分散剤などの適当な界面活性物質と組合せることもできる。適当な界面活性剤は、陽イオン、非イオン、陰イオン、両性および双性イオン界面活性剤から選択してよい。このような適当な界面活性剤の一部の例には、次のものが含まれるが、これらに限定はされない：適当な陰イオン界面活性剤としては、アルキルベンゼンスルホン酸、アルキル硫酸、アルキルポリエトキシエーテル硫酸、パラフィンスルホン酸、α-オレフィンスルホン酸、α-スルホカルボン酸およびそのエステル、アルキルグリセリルエーテルスルホン酸、脂肪酸モノグリセリド硫酸およびスルホン酸、アルキルフェノールポリエトキシエーテル硫酸、２ -アシルオキシ-アルカン-１-スルホン酸およびβ-アルキルオキシアルカンスルホン酸の水溶性塩が含まれ、適当な非イオン界面活性剤としては、水溶性エトキシル化物質、例えば脂肪アルコールアルコキシレート(脂肪アルコールエトキシレート、第一および第二エトキシレートを含む)、アルキルフェノールアルコキシレート(アルキルフェノールエトキシレートを含む)、およびＥＯＰＯ(エトキシレート-プロポキシレート)ブロックポリマーが含まれる。以下に実施例を挙げて本発明を説明する。実施例において、エキソポリサッカリドを分解しうる酵素(エキソポリサッカリダーゼまたはＥＰＳアーゼと言う)は、栄養培地におけるストレプトミセス種ＡＴＣＣ５５６０１の発酵、その後のブロスからの酵素の回収によって製造する。以下に、それぞれ菌株ストレプトミセス種、酵素の製造および回収、酵素調製物の活性を測定するための検定、ならびに生物皮膜の防止および除去における助剤としての酵素の利用の詳細な説明を挙げる。実施例１エキソポリサッカリドを分解しうる酵素を産生するストレプトミセス菌株ＡＴＣＣ５５６０１、該酵素の単離および同定１．菌株の説明酵素を産生する菌株ＡＴＣＣ５５６０１を、１６Ｓ rＲＮＡ分析および化学分類学マーカーによりストレプトミセス属に属すると同定した。種の同定は、これらデータによっては得ることができなかった。形態学的マーカー：気生菌糸体貧／灰色胞子鎖螺旋状メラニン生成陽性基質菌糸体褐色拡散性色素赤色化学分類学マーカー：ＬＬ-ジアミノピメリン酸有ミコール酸無メナキノンＭＫ-９(Ｈ₄)、ＭＫ-９(Ｈ₆)、ＭＫ-９(Ｈ₈) 脂肪酸プロフィール：イソおよびアンテイソ分岐した脂肪酸この微生物を、本明細書においてはストレプトミセス種と言う。この微生物は、1994年7月27日にブダペスト条約のもとでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)[12301 Parklane Drive，Rockville，MD 20852，アメリカ合衆国]に寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号５５６０１に対応している。ストレプトミセス種(ＡＴＣＣ５５６０１)は好ましいエキソポリサッカリダーゼ供給源を構成するが、説明したようなエキソポリサッカリダーゼを産生する有用なストレプトミセス属細菌の他の種を同定することができる。２．菌株の増殖および酵素の産生菌株(ＡＴＣＣ５５６０１)は、種々の通常の培地(例えば、トリプシン-ダイズ寒天)で容易に増殖する。気生菌糸体の形成は、デンプン無機塩寒天などの特定の培地に限定される。適当な炭素源、例えばグルコース、グリセロール、ラクトース、フルクトース、スクロース、デンプンなどを含有する適当な培養培地において微生物ストレプトミセス種を培養することによって、酵素を産生させることができる。窒素源として、別の物質、例えばアンモニウム塩、硝酸塩など、および／または複合有機窒素源、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、ダイズエキス、ダイズ粉、コーンスチープリカー、ディスティラーズ・ドライド・ソルブルス、カゼイン、綿実タンパク質などを使用することができる。無機塩には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マンガン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第二鉄、硫酸亜鉛、塩化カルシウムなどが含まれる。さらに、有機刺激剤、例えばコラン酸、ビタミン、ソイトーン(soytone)、コーンスチープリカーなどを加えることもできる。また、消泡剤を添加することもできる。本発明の構成内の好ましい培養培地は、例えば、サッラ(M.Sarra)ら[Biotechnology Letters 15（1993）559-564]により記載されている。発酵の初期pＨは、５.５〜８であるのが好ましい。また、このpＨを発酵中に、好ましくはpＨ５〜９に、より具体的にはpＨ５.５〜８に制御してもよい。発酵は、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で起こる。発酵パラメーターおよび接種物の大きさに依存して、通常の発酵には０.５〜３日間を要する。発酵は、通常の液内発酵として、または表面培養として行なうことができる。ストレプトミセス種(ＡＴＣＣ５５６０１)を用いる発酵による酵素の直接製造に加えて、該酵素をコードする遺伝子またはそのフラグメントを、適当な発現ベクターにおいてクローニングおよび発現させることができる。加水分解酵素をクローニングするための方法は当業者には周知であり、あらゆる適当なクローニング法を本発明のエキソポリサッカリダーゼの調製に使用することができる。この点に関しては、マニアティスらの文献[J.Sambrook，E.F.FritschおよびT.Mani atis、「分子クローニング」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、第2版、1989]が参考になる。３．酵素の回収および下流プロセッシング発酵後に、遠心または濾過によって細胞を除去することができる。必要なら、当分野で既知の方法、例えば、濾過、凍結乾燥、水性２相系を用いる抽出または有機溶媒(アセトンなど)もしくは無機塩(硫酸アンモニウムなど)を用いる沈殿によって酵素をさらに濃縮および／または精製することができる。必要なら、クロマトグラフィー法、例えばゲル透過、イオン交換、アフィニティークロマトグラフィーまたは当分野で既知の他の方法を用いて、上清ブロスを濃縮および精製することができる。濃縮要因が必要ではないときには、粗製の上清、好ましくは細胞除去後の上清を、酵素の粗供給源として用いることができる。４．酵素検定の説明Ａ．エキソポリサッカリダーゼが活性であるか否かを、以下で説明する方法( 塗抹平板法または「スポット試験」とも言う)により定性的に検定することができる。細菌株を、液体培地、例えばトリプチカーゼ-ダイズブロス、栄養ブロスにおいて対数期になるまで増殖させた。次いで、この培養物(１００μl)を、好ましくは高いＣ／Ｎ比を有する固体培地上にスポットした。適当な培地は、例えば、サッラ(M.Sarra)ら[Biotechnology Letters 15（1993）559-564]によって記載されている。得られた培養物を、均一なスライム状の培地被覆物が現れるまで、３０℃で２または３日間インキュベートした。次いで、エキソポリサッカリダーゼ (１０μl)をスライム層の頂上に添加した。透明な穴(即ち、「ハロー」)が現れたときに、この酵素は、評価した菌株に対して活性であるとみなした。Ｂ．また、酵素の活性を、粘度検定によって定量的に検定することができる。酵素が、細菌、それが産生するスライムおよび／またはポリサッカリドの試験試料に対して活性であれば、このような試験試料への酵素の添加は、ポリサッカリドの酵素加水分解により粘度の低下を引き起こすであろう。エキソポリサッカリド(以下においてはＥＰＳとも言う)の溶液を調製し(後記の実施例２の方法による)、ある量の酵素と共にインキュベートした。次いで、この混合物を１００℃で１０分間加熱して酵素を不活性化した。次に、この不活性化した混合物を全量１６mlになるまで蒸留水で希釈した。次いで、ウッベローデ粘度計を用いて粘度を測定した。１単位の活性を、ある条件下(即ち、pＨ７および３０℃)で３０分間に５０％の粘度低下を引き起こした酵素量とした。粘度低下は、以下の式に従って決定した： [式中、ブランク１粘度は、ＥＰＳ溶液への添加前に酵素を不活性化したものであり、ブランク２粘度は、ＥＰＳ溶液の代わりに緩衝液(３ml)を含む溶液に酵素を添加したものである]。５．ＡＴＣＣ５５６０１により産生されたエキソポリサッカリダーゼの特徴このエキソポリサッカリダーゼは、変性条件下にＳＤＳ-ＰＡＧＥによって測定したときに、約１００kＤaの分子量を有する細胞外酵素である。温度の関数としての活性を図１に示す。最高の活性が４５℃付近に見られる。図２は、pＨの関数として活性を示すものである。最適pＨはpＨ４.５〜５.５に位置している。得られた酵素の熱安定性の研究により、３５℃で３.５時間および５０℃で４５分間の半減期が示された。この熱安定性は、当分野で既知の方法により、例えば、グリセロール、ソルビトール、グルコース、ＥＤＴＡなどの添加によって高めることができる。この酵素は、バシルス・リケニフォルミスのセリンエンドプロテアーゼ[例えば、アルカラーゼ(Alcalase^R)-ノボ(Novo)、エスペラーゼ(Esperase^R)-ノボ]、ストレプトミセス・グリセウスのXXI型プロテアーゼ、バシルス・ポリミキサIX 型メタロプロテアーゼなどのプロテアーゼによって不活性化されない。アスペルギルス・サイトイ由来のアスペルギルス酸プロテイナーゼと組合せると、さらに高い活性の調製物が得られる。ＥＰＳアーゼとアスペルギルス酸プロテイナーゼとの組合せは、１／９９〜９９／１のＥＰＳアーゼ／プロテイナーゼの範囲で活性(細菌付着の防止、付着した細菌の分離および／または生物皮膜の除去に関する活性)に影響を与える。スライム制御に使用するためには、エキソポリサッカリダーゼとこれらプロテアーゼなどを組合せるのが有益である。スライム除去に適する他のプロテアーゼは、当分野では、例えばEP 0 590 746から周知である。６．ＡＴＣＣ５５６０１の培養に由来する上清ブロスの活性特異的なエキソポリサッカリダーゼ活性とは別に、対応する糖のｐ-ニトロフェニル誘導体を用いて以下の活性を検出した：＊Ｎ-アセチル-β-Ｄ-グルコサミニダーゼ＊α-Ｌ-フコシダーゼまた、スルファニルアミド-アゾカゼイン[トマレリ(R.M.Tomarelli)ら：J.Lab .Clin.Med．34，1949，428]を用いて、プロテアーゼ活性が観察された。酵素を以下の培養物コレクションの菌株からなる細胞層にスポットしたときに、透明作用を見ることができた：エンテロバクター・クロアセ（Enterobacter Cloacae）NCTC 9395 クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）LMG 3055 クレブシエラ・テリゲナ（Klebsiella terrigena）LMG 3207 クレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）LMG 3065 クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）LMG 2095 シュードモナス・ピケッチー（Pseudomonas picketii）LMG 5942 キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）NRRL 1453。水系の種々の細菌に対するＥＰＳアーゼの活性は、スライム試料から単離した細菌を用いる定性酵素検定(上記４.Ａのスポット試験)によって確認した。細菌をポテト-デキストロース寒天で増殖させ、３０℃で４８時間インキュベートしてスライムの全面層を形成させた。ＥＰＳアーゼの３％保存溶液を調製した。次いで、ＥＰＳアーゼの３％保存溶液(１０μl)を層の上にスポットした。この結果は以下の通りであった：この実験は、本発明のＥＰＳアーゼが腸内細菌科の細菌に対してだけでなく他の細菌種(即ち、アクロバクテリウムおよびシュードモナス)に対しても活性であることを示すものである。しかし、エンテロバクター菌株に対する活性は、他の菌株に対する活性よりもさらに顕著である。また、本発明のＥＰＳアーゼを他の市販の酵素と組合せて使用することもできる。ＥＰＳアーゼ(３％保存溶液、ここでは３％ＥＰＳアーゼと言う)を３種類の市販酵素、即ちノボ・ノルディスク(Novo Nordisk)から得られるエスペラーゼ(E sperase^R)、セレフロ(Cereflo^R)およびガマナーゼ(Gamanase^R)と共に用いて、上記のスポット試験を繰返した。エスペラーゼは、バシルス属の好アルカリ性の種の液内発酵によって製造されるセリン型プロテアーゼである。セレフロは、バシルス・スブチリス(Bacillus Subtilis)の液内発酵によって製造される精製細菌性β-グルカナーゼ調製物である。この酵素は、麦芽および大麦のβ-グルカン(１,４-β-、１,３-β-グルカン)を、３〜５個のグルコース単位を含むオリゴサッカリドに分解するエンドグルカナーゼである。ガマナーゼは、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)から調製されるガラクトマンナナーゼ(１,４-β-Ｄ-マンナンマンナノヒドロラーゼ)である。この酵素は、マンナン、ガラクトマンナンおよびグルコマンナン中のβ(１-４) 結合をランダムに加水分解する。この試験においては、細菌単離体に対して以下の組合せを使用した。酵素は５０：５０比で混合した。それぞれの混合物(１０μl)を細菌層にスポットした。 (a) ３％ＥＰＳアーゼ＋エスペラーゼ８.０Ｌ（５０／５０） (b) ３％ＥＰＳアーゼ＋セレフロ２００Ｌ（５０／５０） (c) ３％ＥＰＳアーゼ＋ガマナーゼ１.５Ｌ（５０／５０）この結果は以下の通りであった：上記の結果は、本発明のＥＰＳアーゼが他の市販の酵素と組合せて使用するのに適していることを実質的に示すものである。７．生物皮膜の防止および除去能力生物皮膜形成は、工業用冷却水塔、水貯蔵タンク、水分配系、パルプおよび紙粉砕水、健康管理における限外濾過および透析膜などの異なる環境で発生する。紙粉砕機のプロセス水を想定した実験(後記を参照)において、本発明の対象であるエキソポリサッカリダーゼの適用は、生物皮膜を互いに結合させているスライムを加水分解することによって、対照と比較して生物皮膜の厚みを減少させた。本酵素の適用は、２つの機構によって、即ち細菌の付着を防止することによって、および付着した細菌の分離を促進することによって、生物皮膜の形成を減少させる。生物皮膜の防止または除去に必要なエキソポリサッカリダーゼの量は、系の汚染に依存する。目安として、１〜１０,０００ppm、好ましくは５〜５００ppmの用量が適当である。コラン酸分解活性に関しては、０.００１〜１００,０００単位／ml、好ましくは０.０１〜１０,０００単位／mlの用量が適当である。酵素を、１回(ショック)で、またはパルス的に投与することができ、必要なら連続的に添加することができる。液体配合物を投与する方が容易であるので、該酵素を含有する液体組成物が好ましい。必要なら、例えばタブレット形態にある乾燥生成物を添加することもできる。液体配合物として添加するときには、当分野で既知の方法に従って、例えばグルコース、ソルビトール、グリセロール、ＥＤＴＡなどの添加によって、酵素を安定化するのが好ましい。実施例２定量検定のための代表的なエキソポリサッカリド構造、または「ＥＰＳ」構造を、ガレッグ(Garegg)ら[Acta Chem.Scand．1971，25(4)，1185-1194]の方法に従って調製することができる。細菌株、好ましくはエンテロバクター・クロアセ (Enterobacter cloacae)ＮＣＴＣ９３９５を、以下の組成を有する固体培地(p Ｈ７)で増殖させた。細菌を３０℃で４８時間増殖させた。次いで、細菌をかき取り、リン酸緩衝液 (pＨ７)中に懸濁させた。次に、この溶液を３００００Ｇで３０分間遠心した。この上清を蒸留水に対して透析し、０.１ＮＮaＯＨの添加によってpＨ１０〜１１にした。この調製物中に存在するＥＰＳを、２倍容量の冷アセトン(−１８℃) の添加によって沈殿させた。次いで、得られたＥＰＳを凍結乾燥した。実施例３ストレプトミセス種菌株ＡＴＣＣ５５６０１を、以下の培地(pＨ７)を入れたエルレンマイヤーフラスコ中で増殖させた。この培養物を、３０℃および２５０rpmの回転振盪器で３６時間増殖させた。エンテロバクター・クロアセＮＣＴＣ９３９５に対するスポット試験によって活性を測定した。透明な穴が１時間以内に現れ、高いエキソポリサッカリダーゼ活性が示された。次いで、ブロスを遠心し、その上清を硫酸アンモニウムで６５％飽和にした。この沈殿を凍結乾燥し、エキソポリサッカリダーゼ(ＥＰＳアーゼ)の粗供給源として用いた。実施例４実施例３に記載した凍結乾燥ＥＰＳアーゼ粉末(２g)を、トリス緩衝液(０.１Ｍ、pＨ７)(１００ml)に溶解した。腸内細菌科ＥＰＳ(０.５g)を、トリス緩衝液 (０.１Ｍ、pＨ７)(１００ml)に溶解した。ＥＰＳアーゼ(１ml)をＥＰＳ溶液(３m l)と混合し、３０℃で３０分間インキュベートした。３０分後に、混合物を１００℃で５分間加熱することによって反応を停止させた。第１のブランクは、予め不活性化した酵素(１ml)とＥＰＳ(３ml)を含んでいた。第２のブランクも不活性化した酵素(１ml)を含んでいたが、ＥＰＳ溶液をトリス緩衝液(３ml)によって置換した。３つの試料の粘度を、自動表示により３０℃でウッベローデ粘度計を用いて測定した。結果を表１に示す。エキソポリサッカリダーゼはＥＰＳ溶液の粘度の明らかな低下を引き起こすが、これはエキソポリサッカリドの分解を示すものである。実施例１の４.Ｂの式によって計算すると、この粘度低下は９１.９％であった。実施例５生物皮膜の除去を試験するために、生物付着反応器を用い、紙粉砕機の湿末端部分を模擬した。この発酵器中で増殖している細菌は、紙粉砕機の障害となる単離体であり、腸内細菌科に属し、大量のＥＰＳを産生することが知られている。この混合容器において、細菌を希釈水および栄養物と混合した。以下の濃度の栄養物をこの試験ユニットに使用した。この混合容器を、円形金属試験片を装着したＰＶＣ導管に接続した。これら試験片を、酵素添加の前後に重量測定した。また、全浮遊固形分を、酵素の添加中にモニターした。このユニットを、pＨ７および３０〜３５℃の温度で運転した。平均滞留時間は１時間であった。７日間にわたって生物皮膜を形成させた。この期間の後に、２〜５mm厚みの生物皮膜が形成された。酵素として、ストレプトミセス種のエルレンマイヤー培養物の粗製上清を用いた。酵素を４等分してショック投与で添加した。各ショック投与は４５００ppmの用量に相当した。重量測定結果を図３に示す。添加開始の２４時間後に、７５％の生物皮膜が除去された。添加と同時に、除去を目で追跡することができた。混合容器中に形成された生物皮膜の比較的大きい部分が、酵素の添加時に剥離した。この除去は連続的に起こらず、段階的に起こった。これは、恐らくは、装置中に形成された大量のスライムによるものであろう。実施例６ＥＰＳアーゼの防止能力を、ＩＲ検知器を備えた第２の装置系で評価した。ＩＲ吸収は、生物皮膜の厚さに直線的な相関関係がある。この装置を以下の条件で運転した：紙粉砕機からの単離体をここでも接種物として用いた(実施例５を参照)。装置系の細菌濃度は、まず５.０・１０⁶ＣＦＵ／mlに設定した。ＥＰＳアーゼは、１日４回、３０分間用いた。この系における最高濃度は、３０分後に２００ppmであった。酵素処理した装置中の生物皮膜形成は、未処理の装置中での形成を大きく下回っていた(図４)。両装置は同時に運転した。これは、エキソポリサッカリダーゼが生物スライムの除去に有用なだけでなく、その防止にも有用であることを示唆している。実施例７観察された生物皮膜の除去および防止効果が単にＥＰＳの酵素的加水分解によるものかどうかを確認するために、以下の実験を行った。紙粉砕機からの細菌単離体を、次の組成を有する液体培地(pＨ７)で培養した：２つの５００mlのエルレンマイヤーにこの培地(１００ml)を入れ、細菌を接種した。一方のエルレンマイヤーにＥＰＳアーゼ溶液(１ml)を添加した。両エルレンマイヤー中での増殖を、６００nmで光学密度を測定することにより追跡した。３０時間後の発酵終了時に、エルレンマイヤーの内容物を遠心し、上清の粘度を測定した(表２)。ＥＰＳの形成はＥＰＳアーゼの投与によって防止される。両エルレンマイヤーの光学密度は同等の結果を与えたので、増殖は影響を受けない(図５)。この実験は、ストレプトミセス種の上清がＥＰＳに対する効果のみを発揮すること、および酵素調製物が細胞の増殖を制限または死滅させないことを示す。上記の実験はさらに、この酵素を用いてＥＰＳ形成微生物の発酵中にレオロジーおよび粘度パラメーターを制御することができたことを示す。これを、粘度制御の目的で、エキソポリサッカリドが産生される発酵に用いることができる。これは発酵槽中の酸素移動を強め、撹拌のためのエネルギー消費を軽減するであろう。さらに、エキソポリサッカリダーゼを、単離された(即ち、精製された)形態で使用することができる。単離は、当分野で周知の酵素の回収および精製のための適当な方法によって行うことができる。また、この酵素を用いて、酸加水分解の代わりに、産生後のポリサッカリドを加水分解することができる。この応用例はポリサッカリドからの糖の意図的な分離である。例えば、このポリサッカリドはコラン酸であってもよい。実施例８ＥＰＳ形成生物(実施例７を参照)にＥＰＳを産生させた。次いで、この培養物を遠心し、合成粉砕機(ミル)緩衝液中に再懸濁した。多くの酵素が殺生物剤によって不活性化されうることは既知であるので、各実験を２部分に分けた。酵素が存在しない殺生物剤対照および増殖対照とは別に、酵素および殺生物剤を同時に添加した組(同時実験)、および殺生物剤を酵素の１時間後に添加した別の組(連続実験)が存在した。このような方法で、殺生物剤が添加される前に、酵素が培養物の増殖中に形成されたＥＰＳを分解する機会を持つようにした。ブロノポール(Bronopol)(２−ブロモ−２−ニトロ−１,３−プロパンジオール)に対する結果が表３に示されているが、陽性効果が示された。酵素を殺生物剤の前に供したときには、３時間後の９９.９９％死滅のために必要な濃度は半減する(即ち、２５から１２.５ppmに)。また、カーソン(Kathon)ＷＴ (５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン)およびグルタルアルデヒドを用いたときの結果も示されている。実施例９さらに様々な細菌および細菌が産生したスライムについてＥＰＳアーゼの活性を示すために、アシネトバクター種を粘度検定を用いて試験した(実施例１の４. Ｂを参照)。エンテロバクター種を比較のために同時に試験した。分析のために選択した具体的な試料は、単細胞細菌の大きなプレート計測数( 顕微鏡によって測定)と、さらにスライム状マトリックスを有していることに基づいて選択した。アシネトバクター種は、アシネトバクター・バウマニー(Acine tobacter baumannii)／遺伝的種２を含有し、シュードモナス・メンドシナ(Pseu domonas mendocina)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluores cens)Ｃ、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)Ａおよびアシネトバクター・カルコアセチクス(Acinetobacter calcoaceticus)／遺伝的種２を含むものとして同定した。エンテロバクター種は、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebs iella pneumoniae)Ａを含有し、クレブシエラ・テリゲナ(Klebsiella terrigena )を含むものとして同定した。生物皮膜を、実施例５の生物付着反応装置を用いてアシネトバクター種およびエンテロバクター種の両方について産生させた。次いで、生物皮膜スライムを円形金属試験片の壁から単離し、それぞれを同じ高速遠心に供してそれぞれのエキソポリサッカリド溶液を分離した。それぞれのエキソポリサッカリド溶液の試料にＥＰＳアーゼの３％保存溶液(「３％ＥＰＳアーゼ」)を１０００ppmの濃度で添加し、その後、５０rpmおよび３５℃で２時間インキュベートした。粘度の減少を、熱不活性化対照および水を考慮した上で計算した(実施例１の４.Ｂの方法による)。この結果は以下の通りであった：これらの結果は、本発明のＥＰＳアーゼが腸内細菌科の細菌に対して活性であるというだけでなく、水系において普通に見い出される他の細菌に対しても活性であるということを示すものである。実施例１０ＥＰＳ形成に好ましい適当な培地中で微生物を増殖させ、アセトン沈澱によって培地からＥＰＳを集め、最終産物を凍結乾燥することによって、紙粉砕機からの細菌単離体(エンテロバクター)からエキソポリサッカリド(ＥＰＳ)を精製した。エンテロバクターを、以下の培地(使用容量１.２リットル)を含む２リットルの発酵槽中で増殖させた。培地組成は、次の通りである(１リットルに対してgまたはmlで示す)：バクト-ペプトン(７ｇ)；ＮaＣl(５ｇ)；Ｋ₂ＨＰＯ₄(３ｇ)；ＫＨ₂ＰＯ₄(０.９ｇ)；グルコース(１５ｇ)および消泡剤８２７０[ディアボーン・ケミカルズ(Deaborn Chemicals)](０.０５ml)。発酵は、７５０rpmで撹拌しながらpＨ７.０および３０℃で行い、培地の体積に対して１分あたり０.６体積の空気を通気した。５６時間後に、発酵ブロスを、１３,６００ｘｇで１時間遠心して細胞を除去した。氷冷アセトン(１リットル)を培養物の上清分画(１９００ml) に添加した。これは、混合物表面に浮遊するゼラチン状物質を与えた。このゼラチン状物質を表面からすくい取り、残りの溶液のpＨを１ＮＮaＯＨの添加によってpＨ１１に調整した。アセトン(５００ml)をさらに添加し、この溶液を４℃ で２４時間冷却した。これは、溶液の表面に浮遊したゼラチン状物質をさらに与えた。この物質を表面から回収し、最初のゼラチン状分画と一緒にした。この混合分画を４℃で一晩ミリＱ(Milli-Q)水に溶解し、次いで透析物の伝導度が０.０３７μΩ／cm²になるまでミリＱ水に対して徹底的に透析した。透析後に透析物を凍結乾燥し、４℃で保存した。実施例１１ゲル透過クロマトグラフィーは、実施例１０で調製したエンテロバクターＥＰＳが２・１０⁶以上のＭwを持つことを示す。１０⁴〜１０⁶の領域中には他の分子量分画は観察されない。ＥＰＳアーゼを用いて３時間接触させた後に、分解産物は見られなかったが、粘度はそのときまでに既に実質的に減少していた。２４時間後には、Ｍw＞２・１０⁶のピークは消失し、新たな広いピークが４・１０⁵に見られる。これは、さらに長いインキュベーション時間であっても実質的に一定のままである。ＧＰＣによって示されるＥＰＳアーゼによる精製ＥＰＳの分解を図６に示す。実施例１２実施例１０に従って調製したＥＰＳのグリコシル組成分析を、カルボキシル基の還元の前後での酢酸アルジトールの調製およびＧＣ分析によって行った。この方法は、ヨーク(York)らが記載している[Methods Enzymol．118（1985）3 -40]。簡単に説明すると、少量のエンテロバクターＥＰＳを２Ｍトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)を用いて１２１℃で２時間、加水分解した。得られたモノサッカリドを、重水素化ホウ素ナトリウムを用いてそのアルジトールに還元した。次いで、得られたアルジトールを、ピリジン中で無水酢酸を用いてアセチル化した。この酢酸アルジトールを、スペルコ(Supelco)のキャピラリーＳＰ２３３０カラムを用いてＧＣ分析した。存在するウロン酸のタイプを特徴づけるために、少量の試料を８０℃で数時間、１ＭＨＣl／メタノールで処理した。グルクロン酸またはガラクツロン酸などのいずれかの酸性糖のメチルエステルを含む得られたメチルグリコシドを、重水素化ホウ素ナトリウムを用いて還元した。この操作は、ウロン酸のメチルエステルを対応するヘキソースに還元する。例えば、グルクロン酸メチルエステルはグルコースに還元される。次いで上記のように、得られた混合物をＴＦＡで加水分解し、酢酸アルジトールに変換した。ＧＣ分析は上記のように行う。グリコシル結合分析は、部分的にメチル化した酢酸アルジトールを調製および分析することによって行った。これは、シュカノ(Ciucanu)およびケレック(Kere k)[Carbohydrate Res.，131（1984）209-217]の方法によって行った。この方法において、試料をジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、粉末の水酸化ナトリウムを添加してＤＭＳＯ陰イオンを生成させた。これを室温で数時間撹拌した後、過剰のヨウ化メチルを添加してパーメチル化ポリサッカリドを得た。この時点で、パーメチル化した試料を２つの部分に分けた。一方の部分は、上記のようにＴＦＡ中で加水分解し、酢酸アルジトールに変換した。ポリサッカリドの第２の部分はメタノール中の１ＭＨＣlにおいてメタノール分解し、得られた部分的にメチル化されたメチルグリコシドを重水素化ホウ素ナトリウムで処理して、あらゆる部分的にメチル化されたウロン酸残基を対応するヘキソースに変換した。この変換が為されると、これらの糖残基はＣ-６に結合した２個の重水素原子を持つことになり、これにより、これらを質量スペクトル分析によって通常のヘキソースと区別することが可能になる。次いで、上記のように、得られたパーメチル化されカルボキシル還元されたメチルグリコシドを加水分解し、部分的メチル化アセテートに変換した。両部分の分析は、スペルコのＳＰ２３３０キャピラリーカラムを用いて、組合せＧＣ-ＭＳによって行った。結果グリコシル組成およびメチル化の結果を以下の表４に示す。表４に示した組成についての分析は、カルボキシル基還元の前に行った。カルボキシル基還元の後には、グルコース量が有意に増加し、このＥＰＳ中に存在するウロン酸残基のタイプがグルクロン酸であることを示した。表５は、この細胞外ポリサッカリドのグリコシル結合分析の結果を示すものである。カルボキシル基還元後の結合分析は別のピークを与え、これは４,６-結合ガラクトースなどと等量で存在する４-結合グルクロン酸と同定された。これらの結果は、このＥＰＳが、１：１：１：１：１：１比の４-結合フコース：３,４-結合フコース：３-結合グルコース：３-結合ガラクトース：４-結合グルクロン酸：４,６-結合ガラクトースを有することを示すものである。これらの結合は、コラン酸に対して既に公表されている構造[アスピナル(G.Aspinall)編、「ポリサッカリド」、第II巻(1983)、アカデミック・プレス(Academic Press)を参照]に概ね一致する。実施例１３別の装置研究を行って、ＥＰＳアーゼが腸内細菌科の細菌による生物付着を防止することを確認した(実施例６を参照)。これらの装置研究に使用したＥＰＳアーゼは、実施例３に従って得た。生物皮膜防止能力は、実施例５に記載した装置を用いて評価した：試験ＡＥＰＳアーゼの投与処方：(９４ppm)４.４・１０⁵単位のコラン酸分解活性／Ｌのピーク濃度を与える１日４回３０分間。これは３５％抑制を与えた。試験ＢＥＰＳアーゼの投与処方：４４単位のコラン酸分解活性／Ｌのピーク濃度を与える１日４回３０分間。これは３０％抑制を与えた。装置研究のためのＥＰＳアーゼの活性単位は、次のように測定した：１．ＥＰＳ発酵ブロスから、５０mＭＭＥＳ(pＨ５.５)[ＭＥＳ＝２-(Ｎ-モルホリノ)エタンスルホン酸]中の連続希釈液を調製した。２．各希釈液からの２５μlを、４８時間経過したエンテロバクター菌叢表面にスポットした。３２℃で６０分間、インキュベートを行った。３．透明な領域の直径を測定した。４．各透明領域の直径を、対応する希釈値と乗じた。５．全生成物の合計が、ＥＰＳアーゼ単位／０.０２５mlに釣り合う。実施例１４以下の実験は、ＥＰＳアーゼがエキソポリサッカリド分解酵素であること、即ち、ＥＰＳアーゼ活性が腸内細菌科の細菌に限定されないことに対する別の証拠を与えるものである。以下に挙げた野外スライムから単離して同定した細菌を用いて、上記実施例１の６に記載した実験を繰返した。以下の単離体の細胞層においてハローが見られた。不活性化した酵素を使用すると、ハローが生じなかった。エンテロバクター種の単離体１エンテロバクター種の単離体２シュードモナス・フラギクレブシエラ・ニューモニエＡシュードモナス・メンドシナシュードモナス・フルオレッセンスエンテロバクター・アスブリエ図面の説明図１は、実施例１の酵素の活性を、温度の関数として示すものである。図２は、実施例の酵素の活性を、pＨの関数として示すものである。最適値は、pＨ４.５〜５.５に位置している。図３は、生物皮膜除去の結果を、実施例１の酵素を用いた時間の関数として示すものである(実施例５を参照)。図４は、スライム防止の結果を、実施例１の酵素を用いた時間の関数として示すものである(実施例６を参照)。図５は、ＥＰＳ生成の防止の結果を、実施例１の酵素を用いた時間の関数として示すものである(実施例７を参照)。図６は、ＧＰＣで測定したときの、ＥＰＳアーゼによる精製ＥＰＳの分解を示すものである(実施例１１を参照)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ファン・プール，ヨーゼフベルギー、ベー−2140ボルゲルホウト、ヘルムストラート14 １／２番 (72)発明者ファン・ペー，クリスティン・ローラ・イグナティウスベルギー、ベー−9880アールター、ロスティネドレーフ48番 (72)発明者ファンダメ，エリック・イェーベルギー、ベー−9032ウォンデルヘム、カットウィルヘンストラート10番

Claims

【特許請求の範囲】１．ストレプトミセス菌株ＡＴＣＣ５５６０１を適当な培地中で培養することによって得られうるエキソポリサッカリド分解酵素。２．酵素が、変性条件下にＳＤＳ-ＰＡＧＥで測定したときに、約１００kＤa の分子量を有することを特徴とする請求項１に記載の酵素。３．エキソポリサッカリド酵素がコラン酸を分解しうるものであることを特徴とする請求項１または２に記載の酵素。４．適当な宿主細胞中で、ストレプトミセス菌株ＡＴＣＣ５５６０１由来のエキソポリサッカリド分解酵素をコードする遺伝子またはそのフラグメントをクローニングおよび発現させることによって得られうるエキソポリサッカリド分解酵素。５．エキソポリサッカリド酵素がコラン酸を分解しうるものであることを特徴とする請求項４に記載の酵素。６．宿主細胞が細菌細胞であることを特徴とする請求項４または５に記載の酵素。７．細菌細胞がストレプトミセス属から得られるものであることを特徴とする請求項６に記載の酵素。８．請求項１〜７のいずれかに記載の少なくとも１種のエキソポリサッカリド分解酵素を含有することを特徴とする、水系表面の生物皮膜を減少、除去および／または防止するための酵素組成物。９．コラン酸を分解しうる少なくとも１種の酵素を含有することを特徴とする、水系表面の生物皮膜を減少、除去および／または防止するための酵素組成物。 10．コラン酸分解酵素が細菌起源のものであることを特徴とする請求項９に記載の組成物。 11．組成物が、ポリサッカリダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼおよびグリコプロテアーゼからなる群からの少なくとも１種の酵素をさらに含有することを特徴とする請求項８〜10のいずれかに記載の組成物。 12．酵素が、バシルス・リケニフォルミスによって産生されるセリンエンドプロテアーゼ、ストレプトミセス・グリセウスのXXI型プロテアーゼ、バシルス・ポリミキサIX型メタロプロテアーゼ、およびアスペルギルス・サイトイのアスペルギルス酸プロテイナーゼからなる群から選択されるプロテアーゼであることを特徴とする請求項11に記載の組成物。 13．ストレプトミセスＡＴＣＣ５５６０１を適当な培地中で培養することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素の製造方法。 14．適当な宿主細胞中でストレプトミセスＡＴＣＣ５５６０１由来のエキソポリサッカリド分解酵素をコードする遺伝子またはそのフラグメントをクローニングおよび発現させることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素の製造方法。 15．水系表面の生物皮膜を減少、除去および／または防止するための、請求項１〜７のいずれかに記載の酵素および／または請求項８〜12のいずれかに記載の組成物の使用。 16．水系が、開放または閉鎖の工業用プロセス水または冷却水系であることを特徴とする請求項15に記載の使用。 17．工業用プロセス水系が、紙工場における開放または閉鎖の水回路であることを特徴とする請求項16に記載の使用。 18．表面が限外濾過または透析膜であることを特徴とする請求項15に記載の使用。 19．エキソポリサッカリドを分解するための、請求項１〜７のいずれかに記載の酵素および／または請求項８〜12のいずれかに記載の組成物の使用。 20．ＡＴＣＣ５５６０１に一致するかまたはそれから導かれるストレプトミセス菌株。