JP2015128428A - 高純度のプラスミドdna調製物及びその調製方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】低レベル又は検出不能なレベルのコラン酸及び他のコンタミネーション物質を有する高純度のプラスミド組成物、並びにこれらを調製する方法の提供。【解決手段】コラン酸分解酵素で処理された、グラム陰性菌のプラスミドDNAと、前記グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり0.1mg未満のコラン酸とを含む、グラム陰性菌のプラスミド組成物。生物テロリズム、環境科学、食品科学、法医学、分子生物学、並びに衛生及び医療の分野における多様な適用を含め、広範囲にわたり使用される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本発明は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、2008年4月30日に出願された米国仮出願第61/125,916号明細書、及び2008年4月30日に出願された同第61/125,923号明細書の利益を主張するものである。
発明の分野
本開示は一般に、低レベルであるか又は検出不能なレベルのコラン酸及び他のコンタミネーション物質を有する高純度のプラスミド組成物、並びにこれらを調製するための方法に関する。このような方法において有用なポリペプチドについてもまた説明される。本明細書に記載の方法及び組成物は、生物テロリズム、環境科学、食品科学、法医学、分子生物学、並びに健康及び医療の分野における多様な適用を含めた使用範囲を有する。
生物内に核酸を導入する任意の適用に重要なステップは、医薬グレードであることが多い高純度の核酸を作製する必要である。このような精製核酸は、安全性、効力、及び有効性についての薬物の品質基準を満たさなければならない。加えて、複数グラムの量のDNAを作製するのに用いられうる拡張可能な方法を有することも望ましい。したがって、結果として得られる核酸の安全性若しくは有効性を損なうか、又はスケールアップを困難若しくは非実用的とする、毒性の化学物質、突然変異誘発物質、有機溶媒、又は他の試薬を必要としない、高純度の核酸を作製するための方法を有することが望ましい。また、患者に投与されると毒性反応を誘発し得る、コンタミネーションしたエンドトキシンを含まない核酸を調製することも望ましい。汚染性エンドトキシンの除去は、例えば、高レベルのエンドトキシン及びコラン酸を細胞外膜の不可欠な成分として有するグラム陰性(−)菌の供給源からプラスミドDNAが精製される場合に特に重要である。
プラスミドは、宿主細菌内に残留し、ここで増殖する、自己複製性の遺伝子エレメントである。基本的に、特定のDNAフラグメントの操作を伴う全ての分子遺伝学的方法は、大量の特定のDNAフラグメント(又は前記フラグメントに由来するタンパク質/RNA)を作製するのにプラスミドDNAを用いる。
細菌宿主又はプラスミド供給源の選択は一般に、歴史的な視点を反映する。大腸菌(Escherichia coli; E. coli)K−12株は、増殖が容易であり、代謝研究に適するため、Stanley Cohen及びHerb Bayerは、1970年代初期における彼らの画期的な分子遺伝学的実験に該菌株を選択した。また、これらの同じ特性により、大腸菌K−12は、細菌遺伝学者が研究対象とする主要な微生物ともなった。この同じ大腸菌株は、各種の遺伝学的適用に極めて良好な宿主であることが分かったため、今日の分子遺伝学者は、これを日常的な手順に用いている。さらに、過去25年間において、大腸菌K−12は、組換えDNA分子を増殖させるための無毒の生物学的宿主であることも分かっている。弱毒化された大腸菌K−12株は、実験室環境の外では繁殖せず、ヒト腸内において通常見出される遺伝学的により頑健な大腸菌血清型に対して対抗することは不可能である。
様々な技術の中でも、プラスミドDNAを分離及び精製するのに現在利用可能な方法は、ポリエチレングリコール(PEG;polyethylene glycol)、界面活性剤、並びにヘキサミンコバルト、スペルミジン、及びポリビニルピロリドン(PVP;polyvinylpyrollidone)などの他の成分などの添加剤の使用と組み合わせた、イオン交換クロマトグラフィー(Duarte et al., Journal of Chromatography A, 606 (1998), 31-45)及びサイズ排除クロマトグラフィー(Prazeres, D. M., Biotechnology Techniques Vol. 1, No. 6, June 1997, p 417-420)を用いる。DNAをコンタミネーション物質から分離するさらなる方法は、サイズ排除クロマトグラフィーに依拠し、これは、サイズのわずかな差違に基づいて、エンドトキシン及び他のコンタミネーション物質から核酸を分離するものである。これらの方法は一般に許容されるが、所望の純度レベルの核酸(例えば、スーパーコイル状DNA及び/又はニック入りDNA(又は弛緩型DNA)を含めたDNA)を、効率的かつ費用効果の高い形で分離することは不可能でありうる。
細菌調製物から作製され、弛緩型プラスミドDNA及びスーパーコイル状プラスミドDNAの混合物を含有することが多いプラスミドDNA調製物は、多くの細菌宿主により生成されるエンドトキシンが、該プラスミドDNAを受容する宿主において、発熱若しくは敗血症、又は場合によって死亡などの炎症反応を引き起こすことが知られているため、FDAにより要請される通り、エンドトキシンの除去を必要とすることが多い。これらのエンドトキシンは一般に、グラム陰性(−)菌の外膜成分であるリポ多糖又はこれらのフラグメントであり、宿主細胞のDNA調製物及び宿主細胞の膜又は高分子中に存在する。このため、エンドトキシンの除去は、治療的又は予防的に用いるためのプラスミドDNAの精製における重要なステップでありうる。プラスミドDNA溶液からのエンドトキシンの除去は、エンドトキシンの負に帯電した構造を主に用いる。しかし、プラスミドDNAもまた負に帯電しており、したがって、分離は、これらの分子の両方に結合し、特定の条件下において、エンドトキシンに結合したままでプラスミドDNAを優先的に溶出する陰イオン交換樹脂により達成されることが多い。無視できない量のエンドトキシンがプラスミドDNAと共に溶出し、かつ/又は達成されるプラスミドDNAの回収が極めて低度であるため、このような分離の結果としてもたらされる除去は部分的であるに過ぎない。
したがって、小容量又は大容量の微生物発酵物からの小スケール及び大スケールのプラスミドDNAの単離及び精製は、改善されたプラスミド調製方法の開発を必要とする。また、核酸が再現可能な形で同じ構造を保ちながら分離及び精製されうることも、プラスミドベースの研究及び治療には望ましく、また、哺乳動物の身体に対する不純物の有害作用を回避するために、核酸は、高純度まで分離及び精製されていることが必要である。
遺伝子治療に用いられるプラスミドDNAは、大腸菌K−12から単離されることが典型的である。リポ多糖(LPS;lipopolysaccharides)としても知られるエンドトキシンは、大腸菌などのグラム陰性菌の顕著な細胞膜成分であることが知られている。実際、一部の報告は、大腸菌外膜の脂質部分が完全にエンドトキシン分子から構成されていることを示唆する(Qiagen Plasmid Purification Handbook, July 1999)。
LPSは、糖残基と負に帯電したリン酸基とが複雑に入り組んだ疎水性のリピドA部分を含有する。LPSのリピドA部分は、エンドトキシン活性を示しており、哺乳動物において、強力で、生命を脅かす可能性のある炎症反応を引き起こす。この炎症反応は、発熱、血圧の低下、局所的な炎症、及び敗血症性ショックを特徴とする。リピドAは、血清リポ多糖結合タンパク質(LBP;lipopolysaccharide-binding protein)に結合し、単球、内皮細胞、及び多型核白血球上において発現するCD14受容体を介するシグナル伝達を誘発することによりこの反応を誘導する(Ingalls, R.R. et al. 1998. J. Immunol. 161:5413-5420)。エンドトキシンは、マウスに注射すると極めて致死性であり、注射の1時間以内に死亡を引き起こす。エンドトキシンはまた、細胞内におけるトランスフェクション効率を大幅に低下させることも知られている(Weber, M., et al. 1995. Biotechniques 19:930-940)。したがって、エンドトキシンを含まないプラスミドDNAを遺伝子治療適用に用いることの重要性が強調されて久しい。
遺伝子治療において用いられるDNA試料の毒性を低下させようとする努力の中で、多数の研究者が、DNA試料からLPS及び他のエンドトキシンを除去することに努めてきた。しかし、近年の証拠は、ごくわずかな量のLPSを有するDNA試料も、著しい量で投与される場合には、それでもなお毒性であることを示している。したがって、臨床的に用いられるDNA調製物の安全性を確保するにはDNA試料のさらなる毒性成分を同定及び除去しなければならない。
エンドトキシン分子の化学構造及び特性、並びにそれらがミセル構造を形成する傾向は、当初、LPS及びプラスミドDNAの共精製をもたらした。例えば、LPSとプラスミドDNAとは、CsCl中において同様の密度を示すため、CsClによる超遠心分離手順において、DNAはLPSと共精製されることが多い。加えて、ミセル状のLPSは、サイズ排除樹脂上においても、大型のDNA分子と共に分離される。同様に、LPS分子上に存在する負電荷は、陰イオン交換樹脂上におけるDNAとのそれらの共精製をもたらす形で、陰イオン交換樹脂とも相互作用する。
細胞壁の多糖は、細菌、酵母、植物、藍藻、原虫、真菌、昆虫、及び哺乳動物を含めた各種の供給源から単離されるDNAにコンタミネーションすることが報告されている(Edelman, M. . 1975. Anal. Biochem. 65:293-297; Do, N. and Adams, R.P. 1991. Biotechniques 10:162-166; Chan, J.W. and Goodwin, P.H. 1995. Biotechniques 18:419-422)。
植物のゲノムDNAにコンタミネーションする植物多糖は、エンドヌクレアーゼによる制限処理及びポリメラーゼ連鎖反応の両方を阻害することが報告されている(Robbins, M. et al. 1995. Benchmarks 18: 419-422)。さらに、粘菌であるモジホコリカビ(Physarum polycephalum)から精製された多糖は、DNAポリメラーゼ活性を阻害することが報告されており(Shioda, M. and K. Murakami-Murofushi. 1987. Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:61-66)、ウニ胚に由来する酸性の多糖は、RNAポリメラーゼ活性を阻害することが知られている(Aoki, Y. and H. Koshihara. 1972. Biochim. Biophys. Acta 272:33-43)。
文献では、プラスミドDNAを精製する複数の方法が説明されているが、これらの方法は一般に、仮にそうだとしても、一部の多糖を除去するに過ぎない。例えば、リピドAの精製方法は、リピドAの疎水性特性に基づく。したがって、これらの方法は、リピドA及びリピドAに共有結合した多糖を除去する。しかし、リピドAに共有結合しているのは、大腸菌の莢膜多糖のうちのごく小部分であるので、プラスミドDNAの標準的な調製及び精製の手順において除去されるのはそれらのうちの少量であるに過ぎない(Jann, B. and K. Jann. 1990. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 150:19-42; Wicken, A.J. 1985. In: Bacterial Adhesion, D.M. Pletcher (ed.), Plenum Press: New York, pp. 45-70)。大腸菌の莢膜多糖の一部は、脂質部分としてホスファチジン酸を有するが、ホスファチジン酸は、標準的なプラスミド単離手順において加水分解されることが典型的である。したがって、これらの多糖が、疎水性(すなわち、リピドAによる結合の存在)に基づいてエンドトキシンを枯渇させる、現在用いられる方法によってDNAから除去されることはない。
市販される複数のキット(カリフォルニア州、バレンシア、Qiagen社製;ミズーリ州、セントルイス、Sigma Chemical社製)を含めて、大腸菌から単離されるDNA中におけるエンドトキシン陽性LPSレベルを低下させるための複数の方法が開発されている(Neudecker, F. and S. Grimm. 2000. Biotechniques 28:107-110)。Quiagen社製のキットを用いて精製されたDNAは一般に、清浄なプラスミドDNAの「ゴールドスタンダード」であると考えられている。Quiagen社製のキットは、LPSを除去するようにデザインされているだけでなく、プラスミドDNA調製物中においてRNAを消化するRNアーゼも包含する。実際、大半のDNA精製方法は、RNアーゼによる消化ステップを包含する。しかし、高量のRNアーゼはDNAを消化し始めるので、プラスミドDNAに添加しうるRNアーゼの量には制限がある。
現行の標準的な精製手順を用いてDNAから多糖を分離することは困難である。DNA及び多糖のいずれも、エタノール及びポリエチレングリコール(PEG)などの有機溶媒により沈殿する。多糖は陰イオン性であるので、陰イオン交換樹脂を用いると、多糖はDNAと共精製される。さらに、高分子量の多糖とプラスミドDNAとは、CsCl中において同様の密度を示す。
DNAからの多糖コンタミネーション物質の除去には、アフィニティークロマトグラフィーが提起されている。例えば、初期の文献は、タンパク質を除去したDNA画分に、Sepharoseに結合したコンカナバリンAによるカラム中を通過させるアフィニティークロマトグラフィーを用いて、植物、昆虫、真菌、及び藻類を含めた各種の供給源からのDNAの精製について報告している(Edelman, M. 1975. Anal. Biochem. 65:293-297)。残念ながら、大腸菌の多糖は一般に、コンカナバリンAに結合する糖を含有しない。同様に、レクチンによるアフィニティークロマトグラフィーも、真菌及び植物から単離されたDNAから多糖コンタミネーション物質を除去するのに有用であることが報告されている(Do, N. and R.P. Adams 1991. Biotechniques 10:162-166)が、レクチンにより認識される糖は、大腸菌などの生物に由来する大半の多糖中には存在しない。
グラム陰性菌ペレットの塩による洗浄もまた、細菌のゲノムDNAを精製する方法として提起されている(Cahn, J.W. and P.H. Goodwin. 1995. Biotechniques 18:519-422)。DNA中に存在する多糖が、制限酵素による消化に対して引き起こす妨害のために、塩による洗浄は、DNAの精製を改善する方法として示唆された。しかし、これらの方法のいずれによっても、プラスミドDNA中に見出される全ての多糖が有効に除去されることはなかった。
国際公開第WO95/20594号パンフレット及び米国特許第5,969,129号明細書は、トウモロコシ及び他の植物からのゲノムDNAのバッチ精製のための方法について説明している。この精製方法は、DNA/多糖の混合物からDNAを単離するのに、ボロン酸基を含有するポリマーゲルを用いた。
臨床で用いる「清浄な」DNAを調製する際に医師が重視する全ての点はLPSの除去に集中しているが、近年の報告では、「LPSを含まない」DNAも、高用量時においてはそれでもなお毒性を示すことが示唆されている。例えば、50〜300mgのDNA及び低量のLPSを含有するDNA−リポソーム複合体の静脈内注射後には、毒性によりマウスの死亡がもたらされるのに対して、同等濃度のリポソームの注射は毒性効果を及ぼさないことが、研究者らにより観察されている。LPS量を低下させたDNAを用いるトランスフェクション後においては、遺伝子発現が低下することもまた観察されている。近年の報告は、純粋とされるDNAの筋肉内注射後において、炎症及び著明な免疫反応がもたらされることをさらに示唆している(Fields, P.A. et al. 2000. Molec. Therap. 1:225-235)。したがって、純粋で、臨床グレードであり、LPSレベルが低いと考えられているDNAであっても、動物において毒性反応をもたらす。
国際公開第WO95/20594号パンフレット 米国特許第5,969,129号明細書
Duarte et al., Journal of Chromatography A, 606 (1998), 31-45 Prazeres, D. M., Biotechnology Techniques Vol. 1, No. 6, June 1997, p 417-420 Qiagen Plasmid Purification Handbook, July 1999 Ingalls, R.R. et al. 1998. J. Immunol. 161:5413-5420 Weber, M., et al. 1995. Biotechniques 19:930-940 Edelman, M. . 1975. Anal. Biochem. 65:293-297 Do, N. and Adams, R.P. 1991. Biotechniques 10:162-166 Chan, J.W. and Goodwin, P.H. 1995. Biotechniques 18:419-422 Robbins, M. et al. 1995. Benchmarks 18: 419-422 Shioda, M. and K. Murakami-Murofushi. 1987. Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:61-66 Aoki, Y. and H. Koshihara. 1972. Biochim. Biophys. Acta 272:33-43 Jann, B. and K. Jann. 1990. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 150:19-42 Wicken, A.J. 1985. In: Bacterial Adhesion, D.M. Pletcher (ed.), Plenum Press: New York, pp. 45-70 Neudecker, F. and S. Grimm. 2000. Biotechniques 28:107-110 Cahn, J.W. and P.H. Goodwin. 1995. Biotechniques 18:519-422 Fields, P.A. et al. 2000. Molec. Therap. 1:225-235
本発明の様々な態様の中には、高純度のプラスミドDNA組成物の提供がある。コラン酸分解活性を有するポリペプチドと同様、このようなプラスミド組成物を調製する方法もまた説明される。これらのポリペプチドは、高純度のプラスミドDNA調製物を調製するのに有用であり、また、コラン酸を分解するための方法においても有用である。
すなわち、本発明は、以下の[1]〜[116]に関する。
[1]グラム陰性菌のプラスミドDNAと、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のコラン酸とを含む、グラム陰性菌のプラスミド組成物。
[2]グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満のコラン酸を含む、上記[1]に記載の組成物。
[3]検出可能なコラン酸を含まない、上記[1]又は[2]に記載の組成物。
[4]ビシンコニン酸(BCA)アッセイによる測定で検出可能なコラン酸を含まない、上記[1]に記載の組成物。
[5]グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のウロン酸をさらに含む、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の組成物。
[6]グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満のウロン酸をさらに含む、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の組成物。
[7]検出可能なウロン酸を含まない、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の組成物。[8]ウロン酸アッセイによる測定で検出可能なウロン酸を含まない、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の組成物。
[9]グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のフコースをさらに含む、上記[1]〜[8]のいずれかに記載の組成物。
[10]グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満のフコースをさらに含む、上記[1]〜[9]のいずれかに記載の組成物。
[11]検出可能なフコースを含まない、上記[1]〜[9]のいずれかに記載の組成物。
[12]フコースアッセイによる測定で検出可能なフコースを含まない、上記[1]〜[9]のいずれかに記載の組成物。
[13]多糖選択的標識剤と混合したとき、目視により検出可能な多糖を含まない、上記[1]〜[12]のいずれかに記載の組成物。
[14]多糖選択的標識剤が、(4,6−ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセイン(DTAF)である、上記[13]に記載の組成物。
[15]グラム陰性菌のプラスミドDNA、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のコラン酸、及びグラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のウロン酸を含む、グラム陰性菌のプラスミド組成物。
[16]グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のフコースをさらに含む、上記[15]に記載の組成物。
[17]検出可能なコラン酸、ウロン酸、及びフコースを含まない、上記[16]に記載の組成物。
[18]グラム陰性菌のプラスミドDNAと、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満のコラン酸と、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満のフコース酸とを含む、グラム陰性菌のプラスミド組成物。
[19]グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満のウロン酸をさらに含む、上記[15]に記載の組成物。
[20]検出可能なコラン酸、フコース、ウロン酸、染色体若しくはゲノムDNA、RNA、タンパク質、及び/又はエンドトキシンコンタミネーション物質をさらに含まない、上記[19]に記載の組成物。
[21]プラスミドDNAを含有する水性組成物を、ポリペプチドにより処理してコラン酸を消化させるステップと、処理された水性組成物から、前記プラスミドDNAを分離するステップとを含むプラスミドDNAの精製方法。
[22]水性組成物が、粗細菌溶解物、部分精製された細菌溶解物、及び抽出された細菌核酸を含有する水溶液から選択される、上記[21]に記載の方法。
[23]水性組成物が、粗細菌溶解物である、上記[21]に記載の方法。
[24]水性組成物が、部分精製された細菌溶解物である、上記[21]に記載の方法。[25]水性組成物が、抽出された細菌核酸を含有する水溶液である、上記[21]に記載の方法。
[26]分離するステップが、処理された水性組成物を、クロマトグラフィー材料と混合することを含む、上記[21]〜[25]のいずれかに記載の方法。
[27]クロマトグラフィー材料が、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、及びアフィニティークロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される、上記[26]に記載の方法。
[28]分離するステップが、処理された水性組成物をアフィニティークロマトグラフィー樹脂と混合することと、その後、前記処理された水性組成物を疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂と混合することとを含む、上記[26]に記載の方法。
[29]ポリペプチドによる処理前に水性組成物を前処理して、前記水性組成物からエンドトキシンを部分的に除去し、前記前処理が、前記水性組成物をクロマトグラフィー材料と混合するステップを含む、上記[21]〜[29]のいずれかに記載の方法。
[30]アフィニティークロマトグラフィー樹脂が、ボロン酸ベースの化合物又はボロン酸含有化合物を含む、上記[28]に記載の方法。
[31]クロマトグラフィー材料が陰イオン交換樹脂である、上記[29]に記載の方法。
[32]陰イオン交換樹脂が四級アンモニウム樹脂を含む、上記[31]に記載の方法。[33]水性組成物を濾過して、プラスミドDNAからエンドトキシンをさらに分離するステップをさらに含む、上記[21]〜[33]のいずれかに記載の方法。
[34]濾過するステップが、クロマトグラフィー材料から、処理された水性組成物を溶出させた後で実施される、上記[33]に記載の方法。
[35]ポリペプチドが組換えポリペプチドである、上記[21]〜[34]のいずれかに記載の方法。
[36]水溶性組成物からエンドトキシンを部分的に除去するために、前記水溶性組成物をポリペプチドによる処理前に前処理し、前記前処理が、前記水溶性組成物をクロマトグラフィー材料と混合するステップを含み;前記ポリペプチドによる処理後にアフィニティークロマトグラフィー樹脂と混合し、その後、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂と混合し;前記疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂からプラスミドDNAを溶出した後で、前記プラスミドDNAからエンドトキシンをさらに分離するために、濾過することを含む、上記[21]に記載の方法。
[37]ポリペプチドが、配列番号1又は配列番号2に対して少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号1又は配列番号2の保存的アミノ酸置換を含む、上記[21]〜[36]のいずれかに記載の方法。
[38]ポリペプチドが、配列番号1又は配列番号2に対して少なくとも98%の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号1又は配列番号2の保存的アミノ酸置換を含む、上記[21]〜[36]のいずれかに記載の方法。
[39]ポリペプチドが配列番号1である、上記[21]〜[36]のいずれかに記載の方法。
[40]ポリペプチドが配列番号2である、上記[21]〜[36]のいずれかに記載の方法。
[41]プラスミドDNAがグラム陰性菌のプラスミドDNAである、上記[1]に記載の方法。
[42](a)プラスミドDNAを含有する水性組成物を、陰イオン交換樹脂と混合することにより、前記水性組成物を前処理するステップと、(b)前記前処理された水性組成物をポリペプチドにより処理して、コラン酸を消化させるステップと、(c)前記プラスミドDNAを、前記処理された水性組成物から分離するステップであり、前記処理された水性組成物をアフィニティークロマトグラフィー樹脂と混合すること、及び、その後、前記処理された水性組成物を疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂と混合することを含むステップと、(d)前記プラスミドDNAを濾過するステップとを含むプラスミドDNAの精製方法。
[43]陰イオン交換樹脂が四級アンモニウム樹脂を含む、上記[42]に記載の方法。[44]アフィニティークロマトグラフィー樹脂が、ボロン酸ベースの化合物又はボロン酸含有化合物を含む、上記[42]又は[43]に記載の方法。
[45]ポリペプチドが、配列番号1又は配列番号2に対して少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号1又は配列番号2の保存的アミノ酸置換を含む、上記[42]〜[44]のいずれかに記載の方法。
[46]ポリペプチドが、配列番号1又は配列番号2に対して少なくとも98%の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号1又は配列番号2の保存的アミノ酸置換を含む、上記[42]〜[44]のいずれかに記載の方法。
[47]ポリペプチドが配列番号1である、上記[42]〜[44]のいずれかに記載の方法。
[48]ポリペプチドが配列番号2である、上記[42]〜[44]のいずれかに記載の方法。
[49]プラスミドDNAがグラム陰性菌のプラスミドDNAである、上記[42]〜[48]のいずれかに記載の方法。
[50]ポリペプチドが組換えポリペプチドである、上記[42]〜[48]のいずれかに記載の方法。
[51]配列番号1に対して少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号1の保存的アミノ酸置換を含むポリペプチド。
[52]アミノ酸配列が、配列番号1に対して少なくとも95%の相同性、及び配列番号1の保存的アミノ酸置換を有する、上記[51]に記載のポリペプチド。
[53]アミノ酸配列が、配列番号1に対して少なくとも98%の相同性、及び配列番号1の保存的アミノ酸置換を有する、上記[51]に記載のポリペプチド。
[54]アミノ酸配列が、配列番号1に対して少なくとも99%の相同性、及び配列番号1の保存的アミノ酸置換を有する、上記[51]に記載のポリペプチド。
[55]アミノ酸配列が配列番号1である、上記[51]〜[54]のいずれかに記載のポリペプチド。
[56]配列番号2に対して少なくとも90%の相同性、及び配列番号2の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
[57]アミノ酸配列が、配列番号2に対して少なくとも95%の相同性、及び配列番号2の保存的アミノ酸置換を有する、上記[56]に記載のポリペプチド。
[58]アミノ酸配列が、配列番号2に対して少なくとも98%の相同性、及び配列番号2の保存的アミノ酸置換を有する、上記[56]に記載のポリペプチド。
[59]アミノ酸配列が、配列番号2に対して少なくとも99%の相同性、及び配列番号2の保存的アミノ酸置換を有する、上記[56]に記載のポリペプチド。
[60]アミノ酸配列が配列番号2である、上記[56]〜[59]のいずれかに記載のポリペプチド。
[61]精製ポリペプチドである、上記[51]〜[60]のいずれかに記載のポリペプチド。
[62]組換えポリペプチドである、上記[51]〜[61]のいずれかに記載のポリペプチド。
[63]配列番号7又はその相補配列と少なくとも90%の配列同一性を共有する核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド。
[64]核酸配列が、配列番号7又はその相補配列と少なくとも95%の配列同一性を共有する、上記[63]に記載のポリヌクレオチド。
[65]核酸配列が、配列番号7又はその相補配列と少なくとも98%の配列同一性を共有する、上記[63]に記載のポリヌクレオチド。
[66]核酸配列が、配列番号7又はその相補配列と少なくとも99%の配列同一性を共有する、上記[63]に記載のポリヌクレオチド。
[67]核酸配列が配列番号7である、上記[63]〜[66]のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
[68]配列番号8又はその相補配列と少なくとも90%の配列同一性を共有する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
[69]核酸配列が、配列番号8又はその相補配列と少なくとも95%の配列同一性を共有する、上記[68]に記載のポリヌクレオチド。
[70]核酸配列が、配列番号8又はその相補配列と少なくとも98%の配列同一性を共有する、上記[68]に記載のポリヌクレオチド。
[71]核酸配列が、配列番号8又はその相補配列と少なくとも99%の配列同一性を共有する、上記[68]に記載のポリヌクレオチド。
[72]核酸配列が配列番号8である、上記[68]〜[71]のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
[73]プラスミド、ウイルス、及びバクテリオファージからなる群から選択される、上記[63]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[74]プラスミド又はバクテリオファージである、上記[73]に記載のベクター。
[75]バクテリオファージである、上記[73]に記載のベクター。
[76]核酸配列が、配列番号7又はその相補配列と少なくとも99%の配列同一性を共有する、上記[73]に記載のベクター。
[77]核酸配列が配列番号7である、上記[73]〜[76]のいずれかに記載のベクター。
[78]プラスミド、ウイルス、及びバクテリオファージからなる群から選択される、上記[68]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[79]プラスミド又はバクテリオファージである、上記[78]に記載のベクター。
[80]バクテリオファージである、上記[78]に記載のベクター。
[81]核酸配列が、配列番号8又はその相補配列と少なくとも99%の配列同一性を共有する、上記[78]に記載のベクター。
[82]核酸配列が配列番号8である、上記[78]〜[81]のいずれかに記載のベクター。
[83]組換え発現ベクターである、上記[73]に記載のベクター。
[84]組換え発現ベクターである、上記[78]に記載のベクター。
[85]生物学的材料中におけるコラン酸を消化させる方法であって、前記生物学的材料を、コラン酸を消化することが可能なポリペプチドと接触させるステップを含む方法。
[86]生物学的材料が細菌粘液である、上記[85]に記載の方法。
[87]生物学的材料が、粗細菌溶解物、部分精製された細菌溶解物、及び抽出された細菌核酸を含有する水溶液から選択される、上記[85]に記載の方法。
[88]生物学的材料が、粗細菌溶解物である、上記[85]に記載の方法。
[89]生物学的材料が、部分精製された細菌溶解物である、上記[85]に記載の方法。
[90]生物学的材料が、抽出された細菌核酸を含有する水溶液である、上記[85]に記載の方法。
[91]ポリペプチドが組換えポリペプチドである、上記[85]〜[90]のいずれかに記載の方法。
[92]コラン酸が細菌の細胞膜内に存在する、上記[86]に記載の方法。
[93]生物学的材料が生物膜である、上記[85]に記載の方法。
[94]ポリペプチドが、配列番号1又は配列番号2に対して少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号1又は配列番号2の保存的アミノ酸置換を含む、上記[85]〜[93]のいずれかに記載の方法。
[95]ポリペプチドが、配列番号1又は配列番号2に対して少なくとも98%の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号1又は配列番号2の保存的アミノ酸置換を含む、上記[85]〜[93]のいずれかに記載の方法。
[96]ポリペプチドが配列番号1である、上記[85]〜[93]のいずれかに記載の方法。
[97]ポリペプチドが配列番号2である、上記[85]〜[93]のいずれかに記載の方法。
[98]細菌高分子を含有する水性組成物からのエンドトキシンの除去方法であって、前記水性組成物中におけるコラン酸を消化させるステップと、その後、前記水性組成物を、クロマトグラフィー材料と混合し、前記細菌高分子からエンドトキシンを分離するステップとを含む方法。
[99]水性組成物が細菌溶解物に由来する、上記[98]に記載の方法。
[100]ポリペプチドによる処理前に細菌溶解物を前処理して、前記溶解物からエンドトキシンを部分的に除去する、上記[99]に記載の方法。
[101]前処理が、細菌溶解物をクロマトグラフィー材料と混合するステップを含む、上記[100]に記載の方法。
[102]細菌高分子がプラスミドDNAを含む、上記[98]〜[101]のいずれかに記載の方法。
[103]プラスミドDNAがグラム陰性菌のプラスミドDNAである、上記[102]に記載の方法。
[104]水性組成物を、コラン酸分解活性を有するポリペプチドで処理することによりコラン酸を消化させる、上記[98]〜[104]のいずれかに記載の方法。
[105]クロマトグラフィー材料が、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、及びアフィニティークロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される、上記[98]〜[104]のいずれかに記載の方法。
[106]クロマトグラフィー材料が陰イオン交換樹脂である、上記[101]に記載の方法。
[107]陰イオン交換樹脂が四級アンモニウム樹脂を含む、上記[106]に記載の方法。
[108]アフィニティークロマトグラフィー樹脂が、ボロン酸樹脂又はボロン酸ベースの樹脂を含む、上記[105]に記載の方法。
[109]クロマトグラフィー材料から生体高分子を溶出させた後で、水性組成物を濾過して、前記生体高分子からエンドトキシンをさらに分離するステップをさらに含む、上記[98]〜[108]のいずれかに記載の方法。
[110]水性組成物を、まず、アフィニティークロマトグラフィー樹脂と混合し、その後、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂と混合する、上記[98]に記載の方法。
[111]アフィニティークロマトグラフィー樹脂が、ボロン酸樹脂又はボロン酸ベースの樹脂を含む、上記[110]に記載の方法。
[112]ポリペプチドが組換えポリペプチドである、上記[98]〜[111]のいずれかに記載の方法。
[113]ポリペプチドが、配列番号1又は配列番号2に対して少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号1又は配列番号2の保存的アミノ酸置換を含む、上記[98]〜[112]のいずれかに記載の方法。
[114]組換えポリペプチドが、配列番号1又は配列番号2に対して少なくとも98%の相同性を有するアミノ酸配列、及び配列番号1又は配列番号2の保存的アミノ酸置換を含む、上記[98]〜[112]のいずれかに記載の方法。
[115]ポリペプチドが配列番号1である、上記[98]〜[112]のいずれかに記載の方法。
[116]ポリペプチドが配列番号2である、上記[98]〜[112]のいずれかに記載の方法。
したがって、略述すると、本発明は、グラム陰性菌のプラスミド組成物を対象とする。組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNAと、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のコラン酸とを含む。例えば、一実施形態において、組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満のコラン酸を含む。別の実施形態において、組成物は、検出可能なコラン酸を含まない。これら及び他の実施形態において、組成物はまた、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり0.1mg未満のウロン酸、及び/又はグラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり0.1mg未満のフコースも含みうる。例えば、一実施形態において、組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり0.05mg未満のウロン酸をさらに含む。別の実施形態において、組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり0.05mg未満のフコースを含む。他の実施形態において、組成物は、検出可能なレベルのウロン酸及び/又はフコースを含まない。
本発明の別の態様は、グラム陰性菌のプラスミドDNA、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のコラン酸、及びグラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のウロン酸を含む、グラム陰性菌のプラスミド組成物を対象とする。
本発明の別の態様は、グラム陰性菌のプラスミドDNAと、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満のコラン酸と、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満のフコース酸とを含む、グラム陰性菌のプラスミド組成物を対象とする。一実施形態において、組成物は、検出可能なコラン酸、フコース、ウロン酸染色体若しくはゲノムDNA、RNA、タンパク質、及び/又はエンドトキシンによるコンタミネーション物質を含まない。
本発明の別の態様は、プラスミドDNAの精製方法を対象とする。一実施形態において、該方法は、プラスミドDNAを含有する水性組成物を、ポリペプチドにより処理してコラン酸を消化させるステップと、処理された水性組成物から、該プラスミドDNAを分離するステップとを含む。
本発明の別の態様は、プラスミドDNAの精製方法であって、(a)プラスミドDNAを含有する水性組成物を陰イオン交換樹脂と混合することにより、前記水性組成物を前処理するステップと、(b)前記前処理された水性組成物をポリペプチドにより処理して、コラン酸を消化させるステップと、(c)前記プラスミドDNAを、前記処理された水性組成物から分離するステップであり、前記分離するステップが、前記処理された水性組成物をアフィニティークロマトグラフィー樹脂と混合すること、及び、その後、前記処理された水性組成物を疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂と混合することを含むステップと、(d)前記プラスミドDNAを濾過するステップとを含む方法を対象とする。
本発明の別の態様は、配列番号1に対して少なくとも90%の相同性を有するポリペプチド、及びその保存的アミノ酸置換を対象とする。一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1に対して少なくとも95%の相同性、及びその保存的アミノ酸置換を有する。別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有する。
本発明の別の態様は、配列番号2に対して少なくとも90%の相同性を有するポリペプチド、及びその保存的アミノ酸置換を対象とする。一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2に対して少なくとも95%の相同性、及びその保存的アミノ酸置換を有する。別の実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を有する。
本発明の別の態様は、配列番号7又はその相補体と少なくとも90%の配列同一性を共有する核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチドを対象とする。一実施形態において、核酸配列は、配列番号7又はその相補体と少なくとも95%の配列同一性を共有する。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号7の核酸配列を有する。
本発明の別の態様は、配列番号8又はその相補体と少なくとも90%の配列同一性を共有する核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチドを対象とする。一実施形態において、核酸配列は、配列番号8又はその相補体と少なくとも95%の配列同一性を共有する。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号8の核酸配列を有する。
本発明の他の態様は、ポリヌクレオチドを含むベクターであって、プラスミド、ウイルス、及びバクテリオファージからなる群から選択されるベクターを対象とする。一態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号7又はその相補配列と少なくとも90%の配列同一性を共有する。別の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号8又はその相補配列と少なくとも90%の配列同一性を共有する。いずれかの態様の一実施形態において、ベクターは、プラスミド又はバクテリオファージである。いずれかの態様の好ましい実施形態において、ベクターはバクテリオファージである。
本発明の別の態様は、生物学的材料中におけるコラン酸を消化させる方法であって、前記生物学的材料を、コラン酸を消化することが可能なポリペプチドと接触させるステップを含む方法を対象とする。一実施形態において、生物学的材料は、粗細菌溶解物、部分精製された細菌溶解物、及び抽出された細菌核酸を含有する水溶液から選択される。別の実施形態において、生物学的材料は、細菌粘液である。別の実施形態において、生物学的材料は、生物膜である。
本発明の別の態様は、細菌高分子を含有する水性組成物からのエンドトキシンの除去方法であって、前記水性組成物中におけるコラン酸を消化させるステップと、その後、前記水性組成物をクロマトグラフィー材料と混合し、前記細菌高分子からエンドトキシンを分離するステップとを含む方法を対象とする。特定の実施形態において、前記水性組成物は、細菌溶解物に由来する。
他の態様及び特徴は、一部は明らかであり、一部は本明細書の後出で指摘される。
上述では、後続する本発明の詳細な説明がよりよく理解されうるように、本発明の複数の態様についてやや幅広く概括した。本発明の特許請求の範囲の対象を形成する、本発明のさらなる特徴及び利点を以下で説明する。開示される概念及び具体的な実施形態が、組成物及び方法を改変又は再デザインして本発明と同じ目的を実施するためのベースとして容易に用いられうることを、当業者は理解されたい。このように改変又は再デザインされた組成物及び方法は、付属の特許請求の範囲に示される、本発明の精神及び範囲から逸脱しないことを、当業者は認識されたい。
図1A、図1B、図1C、図1Dは、1つの実施形態に従うコラン酸分解酵素のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。 図1A、図1B、図1C、図1Dは、1つの実施形態に従うコラン酸分解酵素のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。 図1A、図1B、図1C、図1Dは、1つの実施形態に従うコラン酸分解酵素のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。 図1A、図1B、図1C、図1Dは、1つの実施形態に従うコラン酸分解酵素のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。 いくつかの異なるDNAプラスミド試料を、多糖の視覚化及び定量化のためのこのゲル電気泳動法を用いて試験したゲルを示す。 図3〜8は、配列番号1〜6のポリペプチド配列を示す。 図3〜8は、配列番号1〜6のポリペプチド配列を示す。 図3〜8は、配列番号1〜6のポリペプチド配列を示す。 図3〜8は、配列番号1〜6のポリペプチド配列を示す。 図3〜8は、配列番号1〜6のポリペプチド配列を示す。 図3〜8は、配列番号1〜6のポリペプチド配列を示す。 図9〜10は、配列番号7及び配列番号8のポリヌクレオチド配列を示す。 図9〜10は、配列番号7及び配列番号8のポリヌクレオチド配列を示す。 配列番号9〜17のポリペプチド配列を示す。 図12〜14は、本明細書に記載されるプロセスに従って精製されたDNA−BIVリポソーム複合体の高用量でのiv注射後の120匹のマウスからの結果の表を示す。 図12〜14は、本明細書に記載されるプロセスに従って精製されたDNA−BIVリポソーム複合体の高用量でのiv注射後の120匹のマウスからの結果の表を示す。 図12〜14は、本明細書に記載されるプロセスに従って精製されたDNA−BIVリポソーム複合体の高用量でのiv注射後の120匹のマウスからの結果の表を示す。
略号及び定義
別段に定義しない限り、本明細書で用いられる当技術分野の全ての用語、表記、及び他の科学用語又は用語法は、本発明が関与する当業者により一般的に理解される意味を有することを意図する。場合によって、本明細書では、明確さ及び/又は容易な参照のために、一般的に理解される意味を有する用語を定義するが、本明細書におけるこのような定義の包含は、当技術分野において一般的に理解されていることについての実質的な差違を表すことを必ずしも意図しないものとする。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.において説明される、広範に用いられる分子クローニング法など、本明細書で説明されるか又は参照される技法及び手順の多くは、当業者により十分に理解され、従来の方法を用いて一般的に用いられている。適切な場合、別段に言及しない限りは、市販のキット及び試薬の使用を伴う手順が、製造元により規定されるプロトコール及び/又はパラメータに従って一般に実施される。
「類似体(analog)」という用語は、別の分子と構造的に類似するか、又はこれと類似であるか若しくはこれに対応する属性を共有する分子(例えば、CAE関連タンパク質)を指す。例えば、CAEタンパク質の類似体は、CAEに特異的に結合する抗体又はT細胞により特異的に結合されうる。
「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられる。したがって、「抗体」は、天然の場合もあり、従来のハイブリドーマ法により作製されるモノクローナル抗体など、人工の場合もある。抗CAE抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のほか、これらの抗体の抗原結合ドメイン及び/又は1若しくは複数の相補性決定領域を含有するフラグメントも含む。「抗体フラグメント」とは、その標的、すなわち、抗原結合領域に結合する、免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部として定義される。一実施形態において、それは、単一の抗CAE抗体及びそれらのクローン(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和化抗体を含めた)、並びに多重エピトープ特性を有する抗CAE抗体組成物を具体的に対象とする。
「相同体(homolog)」という用語は、例えば、対応する位置において同一であるか又は類似の化学的残基の配列を有することにより別の分子に対する相同性を示す分子を指す。
核酸との関連で用いられる、「ハイブリダイズする(hybridize)」、「ハイブリダイズする(hybridizing)」、「ハイブリダイズする(hybridizes)」などの用語は、好ましくは、ハイブリダイゼーション温度が37℃を上回り、0.1×SSC/0.1%SDS中における洗浄温度が55℃を上回る、50%ホルムアミド/6×SSC/0.1%SDS/100μg/ml ssDNA中におけるハイブリダイゼーションなど、従来のハイブリダイゼーション条件を指すことを意味する。
「単離された」又は「生物学的に純粋な」という語句は、その天然状態において見出される材料に通常付随する成分を実質的又は本質的に含まない材料を指す。したがって、本発明による単離ペプチドは、それらのインサイチュ環境におけるペプチドに通常併う物質を含有しないことが好ましい。例えば、核酸又はポリヌクレオチドは、それが、標的遺伝子以外の遺伝子に対応するか若しくはこれらに相補的であるか、又は標的遺伝子の産物若しくはそのフラグメント以外のポリペプチドをコードする、コンタミネーション物質のポリヌクレオチドから実質的に分離される場合に、「単離された」と言う。当業者は、核酸単離手順を用いて、単離ポリヌクレオチドを容易に得ることができる。タンパク質は、例えば、物理的方法、力学的方法、又は化学的方法を用いて、該タンパク質に通常併う細胞構成要素から、標的のタンパク質又はポリペプチドが除去される場合に、「単離された」と言う。当業者は、標準的な精製方法を用いて、単離タンパク質を容易に得ることができる。代替的に、単離タンパク質は、化学的方法により調製することもできる。
「哺乳動物」という用語は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、及びヒトを含めた哺乳動物として分類される任意の生物を指す。本発明の一実施形態において、哺乳動物はマウスである。本発明の別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
「モノクローナル抗体」という用語は、同じ核酸分子によりコードされる抗体のコレクションを指し、これは、典型的には各モノクローナル抗体がその抗原上における同じエピトープを認識するように、単一のハイブリドーマ又は他の細胞株により作製されてもよく、トランスジェニック哺乳動物によって作製されてもよい。「モノクローナル」という用語は、抗体を作製する特定の方法に限定されず、また、該用語は、特定の種、例えば、マウス、ラットなどにおいて作製される抗体に限定されることもない。「ポリクローナル抗体」という用語は、同じ抗原上における異なるエピトープを認識し、これに結合する、抗体の異種混合物を指す。ポリクローナル抗体は、例えば、粗血清調製物から得ることもでき、例えば、抗原アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することもでき、プロテインA/プロテインGアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することもできる。
本明細書で同定されるポリペプチド配列についての「百分率(%)によるアミノ酸配列の同一性(sequence identity)」という用語は、最大の百分率による配列同一性を達成するように該配列を整列し、必要な場合はギャップを導入した後における保存的置換は配列同一性の一部と考えない、特定のポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一な、候補配列内のアミノ酸残基の百分率として定義される。百分率によるアミノ酸配列の同一性を決定することを目的とするアライメントは、例えば、BLASTソフトウェア、BLAST-2ソフトウェア、ALIGNソフトウェア、ALIGN-2ソフトウェア、又はMegalign(DNASTAR社製)ソフトウェアなど、市販のコンピュータソフトウェアを用いて、当技術分野の範囲内にある各種の方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたる最大限のアライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、アライメントを測定するのに適切なパラメータを決定することができる。例えば、百分率によるアミノ酸配列の同一性は、配列比較プログラムであるNCBI-BLAST2(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))を用いて決定することができる。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、メリーランド州、ベセスダ、米国国立衛生研究所から入手することができる。NCBI-BLAST2は、複数の検索パラメータを用い、これらの検索パラメータの全ては、例えば、脱マスキング=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複雑度領域長(minimum low complexity length)=15/5、マルチパスe値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアライメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリックス=BLOSUM62を含めたデフォルト値に設定される。
本明細書で同定されるポリペプチドをコードする核酸配列についての「百分率(%)による核酸配列の同一性(sequence identity)」という用語は、最大の百分率による配列同一性を達成するように該配列を整列し、必要な場合はギャップを導入した後における、対象ポリペプチドの核酸配列内のヌクレオチドと同一な、候補配列内のヌクレオチドの百分率として定義される。百分率による核酸配列の同一性を決定することを目的とするアライメントは、例えば、BLASTソフトウェア、BLAST-2ソフトウェア、ALIGNソフトウェア、ALIGN-2ソフトウェア、又はMegalign(DNASTAR社製)ソフトウェアなど、市販のコンピュータソフトウェアを用いて、当技術分野の範囲内にある各種の方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたる最大限のアライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、アライメントを測定するのに適切なパラメータを決定することができる。例えば、百分率による核酸配列の同一性もまた、配列比較プログラムであるNCBI-BLAST2(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))を用いて決定することができる。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、メリーランド州、ベセスダ、米国国立衛生研究所から入手することができる。NCBI-BLAST2は、複数の検索パラメータを用い、これらの検索パラメータの全ては、例えば、脱マスキング=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複雑度領域長=15/5、マルチパスe値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアライメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリックス=BLOSUM62を含めたデフォルト値に設定される。
「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドであれ、デオキシヌクレオチドであれ、いずれの種類のヌクレオチドの修飾形態であれ、少なくとも10塩基又は10塩基対の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味し、DNA及び/又はRNAの一本鎖形態及び二本鎖形態が含まれることを意味する。当技術分野において、この用語は、「オリゴヌクレオチド」と互換的に用いられることが多い。ポリヌクレオチドは、チミジン(T)がまたウラシル(U)でもありうる、本明細書で開示されるヌクレオチド配列を含みうる(この定義は、DNAとRNAとの化学構造の違い、特に、RNAにおける4つの主要な塩基の1つが、チミジン(T)ではなくてウラシル(U)であるという観察に関連する)。
「ポリペプチド」という用語は、少なくとも約4、5、6、7、又は8アミノ酸のポリマーを意味する。本明細書の全体では、標準的な3文字又は1文字のアミノ酸表示が用いられる。当技術分野において、この用語は、「ペプチド」又は「タンパク質」と互換的に用いられることが多い。
「組換え」ポリヌクレオチド(例えば、DNA分子又はRNA分子)又は「組換え」ポリペプチドとは、インビトロにおける分子操作を受けたポリヌクレオチド又はポリペプチドである。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定可能であり、一般に、プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算値である。一般に、より長いプローブが、適正なアニーリングにより高い温度を必要とするのに対し、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは一般に、変性した核酸の融解温度未満の環境において相補鎖が存在する場合に、該核酸配列が再度アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との、所望される相同性の程度が高いほど、用いうる相対温度は高くなる。結果として、相対温度が高くなると反応条件がよりストリンジェントとなる一方で、低温ではそれほどストリンジェントでなくなる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについてのさらなる詳細及び説明については、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照されたい。
本明細書で定義される「ストリンジェントな条件」又は「高度なストリンジェンシーの条件」は、(1)低イオン強度及び高温、例えば、50℃で0.015M塩化ナトリウム/0.0015Mクエン酸ナトリウム/0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを用いて洗浄するか;(2)ハイブリダイゼーション時に、ホルムアミド、例えば、42℃で750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを伴う、pH6.5の0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%Ficoll/0.1%ポリビニルピロリドン/50mMリン酸ナトリウム緩衝液を伴う、50%(v/v)ホルムアミドなどの変性剤を用いるか;又は(3)42℃で50%ホルムアミド、5×SSC(0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト液、超音波処理したサケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、及び10%硫酸デキストランを用い、0.2×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中42℃、及び50%ホルムアミド中55℃で洗浄した後、55℃のEDTAを含有する0.1×SSCからなる高度のストリンジェンシーによる洗浄を行う条件により同定されるが、これらに限定されない。「中程度にストリンジェントな条件」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989における条件により説明されるがこれらに限定されず、上記の条件ほどストリンジェントでない洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度、及び%SDS)の使用を包含する。中程度にストリンジェントな条件の例は、20%ホルムアミド、5×SSC(150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト液、10%硫酸デキストラン、及び変性させてせん断処理した20mg/mLのサケ精子DNAを含む溶液中における37℃で一晩にわたるインキュベーション後の、約37〜50℃で1×SSC中におけるフィルターの洗浄である。当業者には、プローブ長などの因子を調整するのに必要な、温度、イオン強度などをどのようにして調整するかが分かるであろう。
「バリアント(variant)」という用語は、具体的に説明されるタンパク質(例えば、図1又は図2に示すCAEタンパク質)の(1又は複数の)対応する位置において、1又は複数の異なるアミノ酸残基を有するタンパク質など、説明される型又は基準からの変異を示す分子を指す。類似体は、変異体タンパク質の例である。スプライスアイソフォーム及び一塩基多型(SNP;single nucleotide polymorphism)は、変異体のさらなる例である。
本発明のコラン酸分解(CAE;colanic acid-degrading)活性を有するポリペプチドには、本明細書で具体的に同定されるポリペプチドのほか、過度の実験なしに、本明細書で概括されるか、又は当技術分野で容易に用いられる方法に従って単離/生成及び特徴づけされうる、対立遺伝子変異体、保存的置換による変異体、類似体、及び相同体も含まれる。異なるCAEタンパク質又はそれらのフラグメントの部分を組み合わせる融合体タンパク質のほか、CAEタンパク質と異種ポリペプチドとの融合タンパク質もまた含まれる。このようなCAEタンパク質を、本発明のタンパク質であるCAE関連タンパク質、又はCAEと総称する。「CAE関連タンパク質」という用語は、ポリペプチドフラグメント、又は少なくとも10、15、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、又は700を超えるアミノ酸によるCAEタンパク質配列を指す。
詳細な説明
本開示は一般に、「超清浄な」プラスミドDNA調製物、それらを調製する方法、及びこれらの方法において有用な酵素に関する。多糖、特に、コラン酸は、例えば遺伝子治療に用いられる場合にヒト及び哺乳動物において有害作用を誘導する「清浄」とされるプラスミドDNA調製物をコンタミネーションしていることが分かっている。文献では、これらの有害作用を誘導すると考えられる成分が同定されていない。DNA調製物中における多糖コンタミネーション物質の存在により有害な影響を受ける場合がある他の適用には、臨床診断法、法医学、及び、その上に核酸を包含するチップ及びマイクロアレイなど、他のバイオテクノロジーによる方法、及び分子的研究における方法(例えば、とりわけ、染色体の構築、転写開始部位の解析、X線結晶構造解析、及びDNA構造研究)が含まれる。DNA調製物からこのようなコンタミネーション物質分子を除去する切迫した必要が存在する。
したがって、本発明は、とりわけ、コラン酸分解活性を有する単離ポリペプチド、精製ポリペプチド、及び組換えポリペプチド、並びにそれらの使用を伴う方法を提供する。本発明はまた、このようなポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドも提供する。本明細書に記載のポリペプチドは、広範に用いられ、生物学的材料中においてコラン酸を消化させる方法、及び生体高分子を含めた組成物からエンドトキシンを除去する方法を可能とする。重要なこととして、これらのポリペプチドは、プラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のコラン酸を含む、プラスミドDNA調製物、好ましくはグラム陰性菌のプラスミドDNA、より好ましはプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満のコラン酸を含むプラスミドDNA調製物の調製も可能とする。特定の好ましい実施形態において、本明細書に記載の方法により調製されるプラスミド組成物中には、検出可能なコラン酸を見出すことができない。プラスミド組成物はまた、ウロン酸及びフコースなど、極めて低レベル、又は検出不能なレベルの他の多糖コンタミネーション物質も有しうる。
本開示は、本発明のポリペプチド化合物が、大半の大腸菌株を含めた広範な腸内細菌により生成されるエキソ多糖であるコラン酸(M抗原としても知られる)を消化することが可能であるという発見に部分的に関する。細菌に応じて、例えば、コラン酸は、酢酸及びピルビン酸と共に、フコース、グルコース、ガラクトース、及びグルクロン酸を様々な比率で含みうる(例えば、Sutherland, Biochem. J. 115, 935-945 (1969)を参照されたい)。上記で言及した通り、エンドトキシン及び多糖、また、特に、コラン酸は、例えば、治療的に用いられる核酸調製物をコンタミネーションすることが分かっており、現行の標準的な精製手順を用いて、核酸からコラン酸などのエンドトキシン及び多糖を分離することは困難である。
したがって、本明細書に記載のポリペプチドは一般に、材料中におけるコラン酸の消化に用いることができる。一般に、コラン酸を包含する任意の材料は、本明細書に記載のポリペプチドにより処理することができ、該材料は生物学的材料であることが典型的である。生物学的材料は、微生物、ヒト及び動物に由来する組織、並びに、例えば、地表又は地下の起源である、考古学的遺物、堆肥又は他の分解物質、泥炭湿原、植物物質、堆積物、スラッジ、土壌、及び廃水などの環境試料に由来するか、又はこれらの一部でありうる。特定の実施形態において、生物学的材料は、生体粘液である。これらの実施形態により、例えば、コラン酸は、完全な細菌の細胞膜内に存在しうる。他の実施形態において、生物学的材料は、粗細菌溶解物、部分精製された細菌溶解物、又は抽出された細菌核酸を含有する水溶液でありうる。別の実施形態において、生物学的材料は、生物膜でありうる。別の実施形態において、生物学的材料は、パルプ又はパルプ派生物(例えば、木材又は繊維供給源から機械的又は化学的に調製されたパルプ又はパルプ派生物など)でありうる。上記で言及した通り、本発明の他の態様により、本明細書に記載のポリペプチドは、細菌高分子(例えば、プラスミドDNA)を含む水性組成物からのエンドトキシンを除去する方法において用いることができる。特定の好ましい態様において、ポリペプチドは、プラスミドDNA、典型的には、グラム陰性菌のプラスミドDNAを精製する方法において用いられる。
プラスミドDNA組成物
本開示の1つの重要な態様は、高純度のプラスミド組成物及び医薬グレードのプラスミドDNA組成物である。例えば、これらの組成物は一般に、クロマトグラフィーステップ及び濾過ステップの1又は複数の組合せなど、従来の精製法と組み合わせる場合もあり、組み合わせない場合もある、本明細書で記載される、コラン酸の酵素的な消化方法により作製することができる。したがって、本発明は、コラン酸、フコース、及びウロン酸、並びに他のコンタミネーション物質を含めた多糖を本質的に含まず、したがって、医薬グレードのDNAである、高純度のプラスミド組成物を作製及び単離する方法を包含するか、又はさらに含む。極めて低レベルの、また、好ましくは検出不能なレベルのコラン酸及び他の多糖を有するのに加え、本明細書に記載の方法により作製及び単離されるプラスミドDNAは、コンタミネーション的な染色体DNA、RNA、タンパク質及びエンドトキシンのうちの1又は複数を含めた、一般に極めて低レベルのエンドトキシンを包含し、大半は閉じた環状形態であるプラスミドDNAを含有することが好ましい。本明細書に記載の方法により作製されるプラスミドDNAは、研究及びプラスミドベースの療法において用いるのに十分な純度である。
本発明のプラスミド組成物は、任意のサイズを有する任意の種類のベクターを包含しうる。例えば、本明細書に記載の方法により精製されうるプラスミドDNAのサイズ範囲は、約0.3kbp(ミニサークル又は最小転写単位)〜約50kbp、典型的には、3kbp〜20kbp以上(例えば、ファージ由来のシャトルベクターであるHAC、YAC、MAC、及びEBV又は他の非組み込み型ウイルスに由来するエピソームなど、5〜100kbp以上)でありうる。特定の実施形態において、DNAは、約0.3kbp、0.5kbp、0.75kbp、1kbp、3kbp、5kbp、10kbp、15kbp、又は20kbpのベクター骨格、治療用遺伝子、及び関連する調節配列を包含する。これはまた、一本鎖DNA(すなわち、M13に由来するDNAなど、0.3kb〜50kbなど)にも当てはまる。したがって、例えば、ベクター骨格は、約1〜50kbp以上(例えば、3〜20kbp)、又は約1〜50kb以上(例えば、3〜20kb)の挿入を保有することが可能でありうる。挿入は一般に、プラスミド組成物が用いられる適用に依存する。例えば、遺伝子治療又はワクチンベースの適用の場合、挿入は、任意の生物に由来するDNAを包含しうるが、哺乳動物由来であることが典型的であり、治療用タンパク質をコードする遺伝子に加え、プロモーター、ポリアデニル化配列、エンハンサー、遺伝子座制御領域などの調節配列も包含しうる。治療用タンパク質をコードする遺伝子はゲノム由来の場合があり、したがって、そのゲノム構成において反映される通り、又は相補的DNAに由来しうる通り、エキソン及びイントロンを含有しうる。例えば、このようなベクターは、高コピー数の複製により複製可能であり、治療用遺伝子を挿入するためのポリリンカーを有するベクター骨格、選択マーカーをコードする遺伝子、例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子を包含する場合があり、物理的には小型で安定的である。プラスミドのベクター骨格は、哺乳動物DNA、他の真核生物DNA、原核生物DNA、又はウイルスDNAのフラグメントの挿入を許容し、その結果として得られるプラスミドを、本明細書に記載の通りに精製することができ、インビボ若しくはエクスビボにおけるプラスミドベースの療法、又は他の使用において用いることができると有利である。プラスミド組成物はまた、細胞又は生物内への遺伝子導入、また特に、プラスミドDNA導入を改善するための、他の薬学的に許容される成分、緩衝剤、安定化剤、又は化合物も含みうる。
本明細書では一般に、「超清浄な」プラスミドDNA組成物が提供される。プラスミドDNA組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物であることが典型的である。本明細書に記載の通り、プラスミドDNA試料など、各種の細菌材料に由来するコラン酸コンタミネーションの除去を可能とする、効果的な酵素ベースの方法が開発されている。各種の実施形態において、方法の第1のステップは、コンタミネーション(例えば、プラスミドDNAコンタミネーション)源としてのコラン酸の検出を伴いうる。フコースが、コラン酸の約22%を示すことが知られているので、これは、例えば、試料(下記で説明される)中におけるフコースの存在についてアッセイすることにより、直接的又は間接的に達成することができる。
一実施形態において、プラスミドDNA組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNAと、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のコラン酸とを含む、グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物である。この実施形態においてより好ましくは、組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満のコラン酸を含む。特に好ましい一実施形態において、グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物は、検出可能なコラン酸を含まない。
本明細書の他の箇所で言及した通り、本発明のプラスミドDNA組成物が包含するウロン酸又はフコースなど、他の多糖コンタミネーション物質もまた、低レベル又は検出不能なレベルであることが好ましい。したがって、一実施形態において、グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のウロン酸を含む。グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物が含むウロン酸は、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満であることが、この実施形態においてはより好ましい。プラスミドDNA組成物中には、検出可能なウロン酸を見出し得ないことが好ましい。
これら及び他の実施形態において、グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のフコースを含む。グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物が含むフコースは、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満であることが、この実施形態においてはより好ましい。プラスミドDNA組成物中には、検出可能なフコースを見出し得ないことが好ましい。
組合せにおいて、グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のコラン酸と、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のウロン酸とを含みうる。例えば、グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mgのコラン酸と、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満のウロン酸とを含みうる。グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物中には、検出可能なコラン酸及び検出可能なウロン酸が存在しないことが好ましい。
別の組合せとして述べると、グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のコラン酸と、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のフコースとを含みうる。例えば、グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mgのコラン酸と、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満のフコースとを含みうる。グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物中には、検出可能なコラン酸及び検出可能なフコースが存在しないことが好ましい。
さらに別の組合せにおいて、グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のコラン酸と、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のウロン酸と、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のフコースとを含みうる。例えば、グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mgのコラン酸と、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満のウロン酸と、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.05mg未満のフコースとを含みうる。グラム陰性菌のプラスミドDNA組成物中には、検出可能なコラン酸、検出可能なウロン酸、及び検出可能なフコースが存在しないことが好ましい。
上記で論じたコラン酸、ウロン酸、及び/又はフコースのレベルを低下させるのに加えて、本明細書に記載のプラスミド組成物はまた、例えば、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.01mg未満の染色体若しくはゲノムDNA、RNA、タンパク質、及び/又はエンドトキシンによるコンタミネーション物質も包含しうるが、組成物が包含する染色体若しくはゲノムDNA、RNA、タンパク質、及び/又はエンドトキシンによるコンタミネーション物質は、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり0.001mg未満、0.0001mg未満、又は0.00001mg未満であることがより好ましい。例えば、一実施形態において、プラスミド組成物は、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり0.1mg未満(0.05mg未満であることがより好ましく;検出不能な量であることがさらにより好ましい)のコラン酸と、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり0.01mg未満(より好ましくは、0.001mg未満;さらにより好ましくは、0.0001mg未満)の宿主細胞染色体又はゲノムDNAによるコンタミネーション物質とを含みうる。プラスミド組成物はまた、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり0.1mg未満(0.05mg未満であることがより好ましく;検出不能な量であることがさらにより好ましい)のコラン酸と、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり0.01mg未満(0.001mg未満であることがより好ましく;0.0001mg未満であることがさらにより好ましい)の宿主細胞タンパク質によるコンタミネーション物質とも含みうる。
コラン酸、ウロン酸、フコース、及び他の多糖のレベルを検出するアッセイは一般に、当技術分野で知られており(又は、本明細書で説明される)、プラスミド組成物中に存在しうる染色体若しくはゲノムDNA、RNA、タンパク質、及び/又はエンドトキシンを検出する方法もまた一般に、当技術分野で知られている。
例えば、一実施形態において、本発明のプラスミド組成物は、ビシンコニン酸(BCA;bicinchoninic acid)アッセイにより測定される通り、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり0.1mg未満のコラン酸を包含しうるが、0.05mg未満(例えば、0.04、0.03、0.02、又は0.01mg)であることが好ましく、また、検出可能なコラン酸を包含し得ないことがより好ましい。適切なBCAアッセイは、例えば、Meeuwsen et al., Biosci. Bioeng. 89, 107-109 (2000);及びVerhoef et al., Carbohyd. Res. 340(11), 1780-1788 (2005)において説明されている。コラン酸レベルを測定す
るための例示的なBCAアッセイは、実施例16において見出される。
別の実施形態において、プラスミド組成物は、前節で列挙したレベルでコラン酸を包含する場合があり、ウロン酸アッセイにより測定される通り、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のウロン酸をさらに含みうるが、約0.05mg未満(例えば、0.04、0.03、0.02、又は0.01mg)であることが好ましく、また、検出可能なウロン酸をさらに含み得ないことがより好ましい。一般に、プラスミドDNA試料のウロン酸含量は、標準物質としての硫酸ヘパリン又はグルクロン酸により生成される標準曲線を用いて測定される。例えば、ウロン酸が総重量の約25%の硫酸ヘパリンを含むため、硫酸ヘパリンは、大腸菌に由来の多糖コンタミネーション物質に類似する。硫酸ヘパリンは、重量で50%の糖からなる。これらの糖の半分はグルコサミンであり、該糖の他の半分は、イズロン酸及びグルクロン酸であり、残りの硫酸ヘパリンは、硫酸及びアセチルアミドを包含する糖の修飾による寄与である。代替的に、グルクロン酸を用いて、ウロン酸の直接的な測定値に対する標準曲線を作製することもできる。ホウ酸/硫酸溶液(例えば、1.84の比重を有する、硫酸中に溶解させた0.025Mの四ホウ酸ナトリウム10水和物)を有するガラス製試験管内に標準溶液を入れて混合する。該混合物に、絶対エタノール中におけるカルバゾール溶液を添加し、全混合物をボルテックスし、沸騰水中に浸漬する。試験管を冷却し、分光光度計により、530nmにおける溶液の吸光度を読み取る。標準物質について得られた吸光度値を、標準物質の濃度に対してプロットする。DNA試料を同じ反応にかけた場合、530nmにおけるその吸光度値から、プラスミドDNA試料のウロン酸含量を外挿することができる。次いで、ウロン酸量に3.3〜9.1の範囲の数(試料中におけるコラン酸、ECA、並びにO−抗原及びK−抗原の発生率に応じる)を乗じることにより、プラスミドDNA試料の多糖含量を外挿することができる。ウロン酸レベルを測定するための例示的なウロン酸アッセイは、実施例16において見出される。
別の実施形態において、プラスミド組成物は、前節で列挙したレベルでコラン酸及び/又はウロン酸を包含する場合があり、フコースアッセイにより測定される通り、グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり約0.1mg未満のフコースをさらに含みうるが、約0.05mg未満(例えば、0.04、0.03、0.02、又は0.01mg)であることが好ましく、また、検出可能なフコースをさらに含み得ないことがより好ましい。試料中におけるフコース含量アッセイのための基本的な手順は、Morris, Anal. Biochem. 121, 129-134 (1982)において見出しうる。このアッセイのための溶液調製、並びに溶液及び試料の保管条件についての詳細な説明もまた公刊されている(Passonneau, J.V. and O.H. Lowry. 1974. In: Methods of Enzymatic Analysis, U.H. Bergmeyer (ed.), 2nd edition, Academic Press: New York, volume 4, pp. 2059-2072)。この方法を用いて、プラスミドDNA試料のフコースレベルが決定され、コラン酸濃度のレベルが計算された。本明細書の別の箇所で述べた通り、コラン酸は、各種の供給源に由来するプラスミドDNAにおいて、また、GMPグレードのプラスミドDNAにおいてさえも主要なコンタミネーション物質であることが判明した。フコースレベルを測定するための例示的なフコースアッセイは、実施例16において見出される。
これら及び他の実施形態において、グラム陰性菌のプラスミド組成物は、多糖選択的標識剤と混合したとき、目視により検出可能な多糖を含まないことが好ましい。一般に、多糖可視化アッセイは、多糖を蛍光剤により標識するステップと、例えば、電気泳動媒体上におけるそれらの存在を検出するステップとを伴う。本明細書に記載のプラスミド組成物と混合してこのような薬剤を用いるとき、検出可能な多糖が存在しないことが好ましい。一実施形態において、多糖選択的標識剤は、(4,6−ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセイン(DTAF)である。他の多糖選択的標識剤は当業者に知られているか又は明らかである。多糖選択的標識剤を用いる例示的なアッセイは、実施例16において見出される。
加えて、本明細書に記載のコラン酸分解方法の結果として、プラスミドDNA組成物の粘稠度も低下する。したがって、処理済みのプラスミドDNA組成物の粘稠度を、未処理のプラスミドDNA試料の粘稠度と比較することにより、コラン酸の存在を検出することができる。プラスミドDNAの粘稠度レベルを用いる例示的なアッセイは、実施例16において見出される。
一般に、プラスミド組成物中に存在するコラン酸のレベル(及び/或いはウロン酸、フコース、若しくは他の多糖、又は他のコンタミネーション物質のレベル)が低下すると、プラスミド組成物のLD50(被験集団の50%に対して致死的な用量)が上昇する。例えば、一実施形態では、コラン酸のレベルをグラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり0.1mg未満まで低下させることにより、プラスミド組成物の対応するLD50は少なくとも25%上昇するが、少なくとも50%であることがこの実施形態においてはより好ましい。コラン酸(及び他の多糖)のレベルをさらに低下させ、また、染色体若しくはゲノムDNA、RNA、タンパク質、及び/又はエンドトキシンなど、他のコンタミネーション物質のレベルであってもよいがこれらを同様に低下させることにより、プラスミド組成物の対応するLD50を少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも100%上昇させることができる。別の例として述べると、コラン酸のレベルをグラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり0.05mg未満まで低下させ、染色体若しくはゲノムDNA、RNA、タンパク質、及び/又はエンドトキシンによるコンタミネーション物質のレベルをグラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり0.01mg未満まで低下させることにより、プラスミド組成物の対応するLD50を少なくとも50%上昇させることができるが、少なくとも100%であることがこの実施形態ではより好ましい。
一般に、本発明のプラスミド組成物は、いくつか挙げるなら、生物テロリズム(薬剤の検出及び解析)、環境科学(例えば、農業、園芸、及び林業)、食品科学、法医学、分子生物学、衛生及び医療(例えば、遺伝子治療、診断法、組換えタンパク質発現)、並びに宇宙科学の分野における適用を含めた、広範囲の適用において用いることができる。本明細書に記載の高純度のプラスミド組成物は、インビボ又はエクスビボにおいて、例えば、遺伝子治療及びワクチンベースの適用において用いることができる(すなわち、プラスミド組成物は、ヒトを含めた哺乳動物に投与することができる)。付加的又は代替的に、プラスミド組成物は、従来の診断法及び法医学において用いて、例えば、このような方法の安定性、特異性、再現性、及び/又は感度を改善することができる。これには、例えば、環境に由来する、例えば、公共の上水道に由来する試料、食品に由来する、また、血液、唾液、痰、精液、口内スメア、尿、若しくは排便、細胞及び組織の生検並びに顕微鏡解剖物、羊水など、他の生物学的試料若しくは臨床的試料、又は植物、動物、若しくはヒト患者などの組織ホモジネートに由来する試料も含まれうる。本明細書に記載のプラスミド組成物の他の使用例には、微生物の遺伝子型決定;植物及び動物のDNAフィンガープリント法;土壌中、水中、植物中、及び動物中における病原微生物及び有益な微生物の検出;異なる生物学的実体により汚染された生物学的試料及び環境試料の法医学的同定;並びに、例えば、染色体の構築、転写情報の解析、X線結晶構造解析、及びDNA構造研究などの分子的研究が含まれる。プラスミド組成物はまた、例えば、蛍光、放射能、光干渉法、ラーマン分光光度法、半導体、又は他の電子技術を用いる核酸マイクロアレイ及び分子検出チップなど、とりわけ、遺伝子、突然変異、又はmRNAの発現レベルを検出する固体基質によるチップフォーマットと共に、又はこれらと組み合わせても用いることができる(例えば、米国特許第7,098,286号明細書;米国特許第6,924,094号明細書;及び米国特許第6,824,866号明細書(これらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい)。
方法
本明細書の別の箇所で述べた通り、本発明のポリペプチドは、広範囲の方法、特に、細菌試料などの生物学的材料、又は細菌高分子を含む組成物(水性組成物など)中におけることが典型的である、コラン酸の消化又は分解を伴うか、必要とするか、又は他の形でそこから利益を得る方法において用いることができる。一般に、生物膜(すなわち、生体表面若しくは不活性表面に対して、又は自身の表面上において付着性である、自己発生性のポリマーマトリックス内に封入された、構造化された微生物コミュニティー)、細菌溶解物、プラスミドDNAなどを含めた、望ましくないコラン酸を包含する生物学的材料を、本明細書に記載のポリペプチドにより処理することができる。
本明細書に記載の方法は一般に、生物学的材料中におけるコラン酸、又は他の形で生物学的材料を含む組成物中に存在するコラン酸の消化を伴う。一般に、方法では、材料中に存在しうるコラン酸を消化又は分解するのに、本明細書に記載のポリペプチドを用いる。例えば、本明細書に記載の方法の一実施形態は、生物学的材料に由来するコラン酸の消化を伴う。代替的に、方法は、細菌高分子を含有する水性組成物中におけるコラン酸の消化も伴いうる。別の代替法を目的として述べると、方法は、プラスミドDNAを含有する水性組成物をポリペプチドにより処理して、コラン酸を消化させるステップを伴いうる。
ポリペプチドは、試料中に存在するコラン酸を消化させるのに用いられ、したがって、ポリヌクレオチドは、コラン酸分解活性を有するか、又は他の形でコラン酸分解酵素である。具体的な一実施形態において、方法は、生物学的材料中において消化させるステップを伴い、方法は、生物学的材料を、コラン酸を消化することが可能なポリペプチドと接触させるステップを含む。生物学的材料は、例えば、粗細菌溶解物、部分精製された細菌溶解物、及び抽出された細菌核酸(グラム陰性菌のプラスミドDNAなど)を含有する水溶液でありうる。代替的に、生物学的材料は、細菌粘液でありうる。別の代替法を目的として述べると、生物学的材料は、グラム陰性菌を含む生物膜でありうる。別の代替的な実施形態において、細菌材料は、パルプ(例えば、木材パルプ又は繊維パルプ)の組成物、溶液、又は混合物中に存在しうる。別の実施形態において、方法は、細菌高分子を含有する水性組成物からのエンドトキシンの除去を伴い、該方法は、該水性組成物中におけるコラン酸を消化させるステップと、その後、該水性組成物を、クロマトグラフィー材料と混合し、該細菌高分子からエンドトキシンを分離するステップとを含む。好ましい一実施形態において、方法は、グラム陰性菌のプラスミドDNAなど、プラスミドDNAの精製を伴い、該方法は、プラスミドDNAを含有する水性組成物をポリペプチドにより処理してコラン酸を消化させるステップと、例えば、従来のクロマトグラフィー法を用いて、該処理された水性組成物からプラスミドDNAを分離するステップとを含む。ポリペプチドはまた、下記で説明される広範囲の産業的方法においても用いることができる。
具体的な態様では、プラスミドDNA試料からの、LPS以外の多糖を含めた多糖の除去を可能とする、プラスミドDNA試料からコンタミネーション性多糖を除去する方法が開発されている。加えて、プラスミドDNA試料からは、RNA及びLPSもまた除去される。したがって、本発明の方法の結果、下記で説明される極めて低レベルの、また、多くの場合において検出不能なレベルの多糖を含有する精製プラスミドDNAがもたらされる。コンタミネーション性多糖のレベルを同定することができなかった過去の方法と異なり、特定のステップを実施して、DNA試料中における多糖レベルを定量化することができ、これにより、探索者は、DNA試料からの多糖の除去を確認することができる。
一般に、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかを用いることができる。例えば、ポリペプチドは、配列番号1に対して少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む場合もあり、配列番号2に対して少なくとも90%の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの場合もある。具体的な一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有する。別の具体的な一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を有する。
本明細書に記載の方法のうちのいくつかのための出発材料は、大量の細菌材料、或いは、例えば、発酵若しくは細胞培養により調製されるか、環境から単離されるか、又は組織若しくは他の生物(例えば、真菌、細菌など)に由来する細菌細胞又は他の生体物質などの生物学的材料を含む水性組成物である。一実施形態において、生物学的材料は、大腸菌などの腸内細菌に由来する細菌細胞を含む。別の実施形態において、生物学的材料は、細菌粘液であり、例えば、この実施期形態によれば、コラン酸は、細菌の細胞膜内に存在する。好ましい実施形態において、生物学的材料は、グラム陰性菌のプラスミドDNA材料である。
本明細書に記載の方法への供給原料として、細菌(例えば、グラム(−)菌、グラム(+)菌、及び古細菌)、酵母、並びに哺乳動物細胞及び組換え細胞を含めた他の原核細胞及び真核細胞など、各種の細胞型を用いることができる。これら及び他の細胞型のうち、細菌細胞、また特に、大腸菌、サルモネラ(Salmonella)属、又はバチルス(Bacillus)属などのグラム陽性(+)菌細胞及びグラム陰性(−)菌細胞が好ましく、グラム陰性(−)菌細胞が最も好ましい。具体的な実施形態において、細菌はグラム陰性(−)菌細胞であり、該細菌は大腸菌であることが、この実施形態においてより好ましい。本明細書に記載の方法によれば、広範に選択される、十分に確立された大腸菌の宿主菌株が有用であり、とりわけ、Stratagene社(カリフォルニア州、ラホーヤ)、Qiagen社(カリフォルニア州、バレンシア)、New England BioLabs社(マサチューセッツ州、イプスウィッチ)、Promega社(ワイオミング州、マジソン)などの販売元から市販されている。
生物学的材料は、細菌溶解物又はその派生物であることが典型的である。したがって、細菌出発材料(例えば、細菌細胞など)を溶解させるか又は破壊して、溶解物を形成しなければならない。一般に、細菌溶解のステップは、細菌細胞を破砕し、これにより、核酸及び他の細胞成分を細胞から遊離させる従来の任意の方法を伴う。溶解の手順は、機械的方法、溶解剤若しくは溶解液、又はこれらの組合せの使用を伴いうる。
発酵又は細胞培養に由来する生物学的材料の場合、細胞は、下記で説明される化学的方法又は機械的方法により破壊され、粗溶解物を形成する。例えば、細菌培養物を用いる場合、細菌細胞を溶解させて、粗細菌溶解物を形成させる。このようにして、DNA、RNA、タンパク質、コラン酸、及び他の多糖を含めた細胞成分が細胞から放出される。特定の実施形態では、溶解物を、細胞のコンタミネーション物質及びエンドトキシンを除去する精製ステップなどの前処理ステップにかけ、これにより、部分的な精製溶解物(例えば、細菌溶解物)を形成させる。
溶解剤を用いる場合、溶解剤を用いて細胞膜を破砕し、これにより、細胞からDNA、RNA、及びタンパク質を放出させる。好ましい1つの溶解剤は、アルカリ溶液を含む。従来のアルカリ溶解手順では、例えば、水酸化カリウム(KOH)、水酸化リチウム(LiOH)、又は水酸化ナトリウム(NaOH)などの水酸化物塩を含めた各種の塩基を用いることができる。塩基は、水酸化ナトリウムであることが典型的である。溶解液中では、単独で、又はアルカリ溶液と組み合わせて界面活性剤を用いることが多い。一般に、また、適用に応じて、界面活性剤は、陽イオン界面活性剤の場合もあり、陰イオン界面活性剤の場合もあり、非イオン界面活性剤の場合もあり、両性イオン界面活性剤の場合もあり、これらの組合せの場合もある。例示的な陰イオン界面活性剤の1つは、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS;sodium dodecyl sulfate)である。例示的な両性イオン界面活性剤又は非イオン界面活性剤の1つは、Tween 20である。
単独で、又は溶解液及び溶解剤と組み合わせて用いられる、細菌細胞を溶解させる機械的方法には、撹拌、超音波処理、遠心分離、凍結/融解、フレンチプレス細胞破砕機などが含まれる。
細菌細胞を溶解させて、タンパク質及び核酸を放出させ抽出するアルカリ溶解法及び機械的方法は一般によく知られており、例えば、Sambrook et al., supraにおいて説明されている。
一部の実施形態では、宿主細胞の染色体DNA、タンパク質、及び膜部分が、溶解物の化学的処理又は遠心分離などにより少なくとも部分的に除去された、清浄化された溶解調製物を形成させ、これにより、プラスミドDNAを含有する溶液を残すことが望ましい場合がある。手順の様々な時点においてRNアーゼを添加して、RNAを実質的に含まない清浄化された溶解物を作製してもよい場合がある。本明細書の他の箇所で言及した通り、多くの細胞汚染物及び核酸汚染物に対する初期除去により、コラン酸の消化、及び/又は従来のクロマトグラフィー法を用いるプラスミドDNAのさらなる精製を改善することができる。清浄化された溶解物を作製する方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、水酸化ナトリウム又はその同等物(0.2N)及びドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(1%)により宿主細胞を処理し、遠心分離し、上清を廃棄することにより、清浄化された溶解物を作製することができる。清浄化された溶解物を作製するこの方法は、例えば、Burnboim et al., Nucl. Acids Res., 7, 1513 (1979);及びHorowicz et al., Nucl. Acids Res., 9, 2989 (1981)において一般的に説明されている。
多くの使用、例えば、遺伝子治療又はワクチンの形成など、治療的な使用の場合、試料を、コラン酸を分解するポリペプチドと接触させる前又は後に、細菌溶解物又は他の溶解物から得られる核酸をさらに精製することが望ましい場合がある。
上記の通りに細菌溶解物を形成させた後では、ポリペプチドによりコラン酸を消化させようと試みる前に、粗溶解物を分離法にかけ、存在する他の核酸、タンパク質、及び細胞汚染物の少なくとも一部を消失させることが一般に好ましい。したがって、例えば、一実施形態では、ポリペプチドによる処理前に、生体物質を含む材料又は組成物を、イオン交換クロマトグラフィー材料と組み合わせる。クロマトグラフィー材料は、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂であることが典型的である。好ましい実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、ジエチルアミノエチルセルロース(DEAE;diethylaminoethyl cellulose)を含む。一般に、プラスミドDNAを含めた従来のDNAに対する清浄化法を用いることができる。
生物学的材料はまた、ポリペプチドによる処理後において、クロマトグラフィー材料と混合することもできる。これは一般に、アフィニティークロマトグラフィー及び/又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを伴う。具体的な実施形態では、生物学的材料又は水性組成物を、この順序で、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂と混合し、ポリペプチドにより処理し、アフィニティークロマトグラフィー樹脂と混合し、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂と混合し、濾過にかける。
生物学的材料を溶解させるか、又は他の形で調製したら、該材料を、本明細書に記載のポリペプチドにより処理する。処理は、ポリペプチドが、生物学的材料又は組成物中に存在するコラン酸基質へと到達するように、該ポリペプチドを該材料と接触させるか又は混合するステップを伴うことが典型的である。生物学的材料及びポリペプチドをインキュベートして、酵素とコラン酸基質との間の十分な相互作用を可能とすることが好ましい。インキュベーションの持続時間は、消化させる試料のサイズ、用いられるポリペプチドの量、及び温度、雰囲気などの環境的因子に応じて、1〜6時間、6〜12時間、12〜24時間以上でありうる。インキュベーションは一般に、0℃〜100℃、より好ましくは25℃〜75℃(例えば、30℃〜50℃)の温度で実施される。一部の実施形態では、例えば、低温でインキュベーションを開始し、次いで、残りのインキュベーションサイクルにわたり温度を上昇させるか、又はこの逆など、インキュベーション方法を行う間に温度を変化させることが望ましい場合がある。
上記で言及した通り、本発明のポリペプチドによる処理の前又は後に、生物学的材料又は生物学的材料を含有する水性組成物を精製することが一般に望ましい。一般に、これは、材料又は組成物を、1又は複数のクロマトグラフィー法又は濾過にかけるステップを伴いうる。一実施形態では、クロマトグラフィーによる分離の組合せが用いられる。したがって、例えば、方法を行う間の様々な時点において、生物学的材料又は組成物をクロマトグラフィー材料と混合することができる。適切なクロマトグラフィー材料には、例えば、とりわけ、イオン交換クロマトグラフィー樹脂(陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂及び陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂など)、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、及びアフィニティークロマトグラフィー樹脂が含まれる。一実施形態において、クロマトグラフィー材料は、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、及びアフィニティークロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される。
上記で言及した通り、生物学的材料又は組成物は、ポリペプチドによる処理の前若しくは後において、又はポリペプチドによる処理の前及び後の両方において、(1又は複数の)クロマトグラフィー材料と混合することができる。例えば、試料をクロマトグラフィー材料と混合し、本明細書に記載のポリペプチドにより処理し、第2(又は第3、第4、第5など)のクロマトグラフィーステップにかけることができる。加えて、試料を従来の濾過法にかけ、さらに精製するか、又は試料からコンタミネーション物質を除去することもできる。濾過ステップは、方法の比較的早期において、例えば、酵素による処理前において行われる場合もあり、方法の比較的後期において、例えば、最終生成物の保管又は使用の前の最終濾過ステップとして行われる場合もある。
したがって、別の態様において、本発明の方法は、細菌溶解物試料中に存在するコラン酸を分解することが可能なポリペプチドの使用を含み、この使用の前又は後に、少なくとも1つのさらなるクロマトグラフィー法を行う。さらなるクロマトグラフィーステップは、最終精製ステップのうちの1又は複数として存在する場合もあり、試料若しくはプラスミド精製スキームの少なくとも終点又は終点近くに存在する場合もあり、コラン酸の消化ステップ前に存在する場合もあってよいか、又はこれが典型的である。したがって、1又は複数のイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー(例えば、ボロン酸アフィニティークロマトグラフィー)、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び濾過を、コラン酸分解ステップと組み合わせることが好ましい。他の技法には、ゲル透過クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト(I型及びII型)クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィーが含まれうる。一般に、核酸の分離を伴う任意の使用可能なクロマトグラフィープロトコールを使用に適合させることができる。加えて、ステップ又は技法のうちの任意の1又は複数において、高速クロマトグラフィーの技法又はシステムを用いることができる。したがって、本発明の方法は、イオン交換クロマトグラフィーの1又は複数のステップと共に、コラン酸消化ステップを含み、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー若しくはゲル透過クロマトグラフィー、及び/又は濾過(接線流濾過(TFF;tangential flow filtration)又はサイズ排除濾過)をさらに包含しうる。例えば、イオン交換クロマトグラフィーのステップは、流動化床イオン交換クロマトグラフィー、並びに軸方向及び/又は半径方向の高分解度陰イオン交換クロマトグラフィーの両方において実施されうる。好ましい一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーは、酵素が基質と相互作用する能力を阻害しうる粒子を除去する目的で、コラン酸分解ステップの前に行われる。
例えば、プラスミドDNAを精製するための、本明細書に記載の本発明の方法は拡張可能であり、したがって、大スケール生産へのスケールアップに適する。
本発明の一部の実施形態では、コラン酸分解ステップをさらなる精製ステップと組み合わせて、プラスミドDNAを含有する高純度生成物を結果としてもたらすことができる。例えば、凝集物除去(溶解物の濾過、沈殿、又は遠心分離など)、イオン交換クロマトグラフィー(陽イオン交換又は陰イオン交換など)、疎水性相互作用クロマトグラフィーのうちの少なくとも1つと組み合わせることができる。一実施形態では、コラン酸分解ステップの前にイオン交換クロマトグラフィーを行うことができる。これら及び他の実施形態では、コラン酸分解ステップの後に疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うことができる。好ましい実施形態では、細菌溶解の後にイオン交換クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーの後にアフィニティークロマトグラフィー(例えば、ボロン酸又は他の隣接ジオール若しくはシス−ジオール特異的化合物を用いる)を行い、この後に疎水性相互作用クロマトグラフィーを行う。これらのステップのうちの1又は複数の後又はこれらの間において、試料を、接線流ろ過などのろ過にかけることができる。これらのステップにより、真に拡張可能なプラスミド製造方法が可能となり、これにより、高レベルの純度を有する大量のプラスミドDNAを作製することができる。宿主細胞のDNA及びRNA、タンパク質、エンドトキシン、及びコラン酸コンタミネーション物質は、検出不能であることが好ましい。
上記で言及した通り、本発明の方法はまた、本適用による、本明細書に記載のステップと組み合わせた、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC;size exclusion chromatography)、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及び/又は他の使用可能なクロマトグラフィーの技法、方法、又はシステムのステップもさらに用いうる。
凝集物除去ステップはまた、結果として得られるプラスミドDNA生成物に対してより高い純度をもたらすのにも用いることができる。このステップを用いて、大部分の沈殿物質(凝集物)を除去することができる。凝集物除去を実施する1つの機構は、1〜5mm、また好ましくは3.5mmのグリッドフィルターなどを介する溶解物の濾過ステップの後で、研磨濾過ステップなどの深度濾過を介する。凝集物除去を実施する他の方法は、遠心分離又は沈殿を介する。代替的に、凝集物は、イオン交換クロマトグラフィーにより除去することができる。
したがって、エンドトキシン除去及び/又はプラスミドDNA精製の方法の様々な時点において、試料を、イオン交換クロマトグラフィー(例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィー)、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び濾過(例えば、0.2μm及び/又は0.45μmのフィルターを介して濾過する)のうちの1又は複数にかけることができ、また、2回、3回、又は4回以上濾過してもよく、クロマトグラフィー法にかけてもよい。
したがって、例えば、試料を、第1のクロマトグラフィー材料にかけ、ポリペプチドにより処理し、第2のクロマトグラフィー材料にかけ、第3のクロマトグラフィー材料にかけることができる。試料はまた、第1のクロマトグラフィーによる分離の後、又は第3のクロマトグラフィーによる分離の後など、一連の順序の様々な時点において濾過することもできる。試料をクロマトグラフィー材料にかけるステップはまた、該クロマトグラフィー材料から該試料の所望部分(精製プラスミドDNAを含有する部分など)を溶出させるステップと、該試料の所望されない部分を廃棄するステップも伴うことを理解されたい。クロマトグラフィー材料の性質に応じて、所望部分をクロマトグラフィー材料中に保持させ、別個のステップにおいて溶出させる一方で、所望されない物質に該材料中を流過させる場合もあり、又は所望されない材料をクロマトグラフィー材料中に保持させる一方で、所望部分にクロマトグラフィー材料中を流過させる場合もある。
上記のプロトコール中の様々な地点において、核酸の収量及び純度の分析的な決定を実施すると有利である。このようなアッセイは、各精製ステップの前及び後において実施されるほか、例えば、準備的なイオン交換クロマトグラフィー又は濾過に由来する各核酸含有画分に対しても実施されることが典型的である。これらの分析的決定を実施するための代表的な手段には、純度に対するHPLC解析、分光光度法による収量の推定、タンパク質解析のための銀染色及びSDS−PAGE、並びにDNA解析のためのアガロースゲル電気泳動及びサザンブロット法が含まれる。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法により、プラスミドDNA濃度(例えば、主にスーパーコイル状DNA又は他のプラスミドDNAを含めた)が約70%、75%、80%、85%、90%、95%、また好ましくは99%以上の精製濃縮物がもたらされる。
加えて、また一般に、中間体又は最終生成物中におけるコラン酸、ウロン酸、及び/又はフコースなど、多糖の存在を分析的に決定することも望ましい。コラン酸及び他の多糖の検出に適するアッセイは、本明細書の他の箇所で説明されている(例えば、実施例16において)。
以下では、粒子に対するクロマトグラフィー法及び濾過法がさらに詳細に説明される。
イオン交換クロマトグラフィー
上記で言及した通り、ポリペプチドによる処理の前又はその後において、イオン交換クロマトグラフィーを用いて生物学的試料を精製することができる。この方法は一般に、細菌溶解物又は溶解物の派生物中における核酸、例えば、プラスミドDNAを、コンタミネーション性のエンドトキシン、微量タンパク質、及び細胞内における残留コンタミネーション物質から分離する。コンタミネーション物質の特性及び溶液のpHに応じて、陽イオン交換を選択することもでき、陰イオン交換を選択することもできる。例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーは、負に帯電した(又は酸性の)分子を、正に帯電した支持体へと結合させることにより機能する。したがって、イオン交換クロマトグラフィーを用いると、それらの電荷に基づいて分子を分離することが可能となる。この技法により、分子ファミリー(酸性物質、塩基性物質、及び中性物質)を容易に分離することができる。多くのコンタミネーション物質を早期の画分において溶出させ、プラスミドDNAを後期の画分において溶出させる、段階的な溶出スキームを用いることができる。イオン交換クロマトグラフィーは、プラスミドDNA調製物からタンパク質及びエンドトキシンを除去する比較的一般的な方法である。イオン交換クロマトグラフィー又は用いられる他のクロマトグラフィーのステップ又は技法の任意の1又は複数は、固定相、移動クロマトグラフィー法、シミュレーションによる移動床法、及び/又は連続床によるカラム又はシステムを用いることができる。
本発明の方法で用いうるイオン交換カラムには、陽イオン交換カラム及び陰イオン交換カラムの両方が含まれる。より好ましい実施形態において、イオン交換クロマトグラフィー材料は、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂である。例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー材料樹脂は、ジエチルアミノエチルセルロース(DEAE)樹脂、トリメチルアミノエチル(TMAE;trimehylaminoethyl)樹脂、四級アミノエチル(QAE;quaternary amino ethyl)樹脂、又はポリエチルイミド(PEI;polyethyl imide)樹脂を含みうる。一実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、DEAEを含む。別の実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、四級アンモニウム樹脂を含む。例えば、クロマトグラフィーカラムには、1又は複数の、本明細書に記載の陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を充填することができる。カラムの最適の容量は、用いられる樹脂及び精製される核酸のサイズに基づき経験的に決定される。多くのプラスミドDNAの場合、好ましい樹脂は、小孔を伴わないか、又は小孔サイズが大きな、例えば、1000Åを超え、好ましくは約3000Å〜4000Åであり;ビーズサイズが中程度、例えば、直径約20〜500μmであり;マトリックス成分を滲出させない樹脂である。樹脂はまた、例えば、水酸化ナトリウムにより洗浄可能であり、反復使用を可能とすることも理想的である。
比較的弱い陽イオン性及び比較的強い陽イオン性のイオン交換カラムもまた用いることができる。比較的強い陽イオン交換カラムは、ポリヒドロキシル化され、スルホプロピルにより官能化されたポリマーによりコーティングされた表面、スルホプロピル基により官能化されたデキストランマトリックス、又はポリヒドロキシル化され、スルホエチルにより官能化されたポリマーによりコーティングされた表面を有することが典型的である。とりわけ、これらの材料の各々を用いる、強い陽イオン性のイオン交換カラムの例には、それぞれ、POROS HS(商標)、POROS S(商標)、及びSP-Sephadex(商標)カラムが含まれる。比較的弱い陽イオン交換カラムは、カルボキシメチルにより官能化されたデキストランマトリックス、又はカルボキシル基により官能化されたアクリルマトリックスを有することが典型的である。これらの材料の各々を用いる、弱い陽イオン交換カラムの例には、それぞれ、CM-Sephadex(商標)及びBio-Rex 70(商標)が含まれる。
本発明の方法では、比較的弱い陰イオン性及び比較的強い陰イオン性のイオン交換カラムもまた用いることができる。弱い陰イオン性のイオン交換カラムは、pH約9までの表面イオン化が可能なポリエチレンイミンによりコーティングされた表面、スルホン酸基を含有するスチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、又はジエチルアミノエチルにより官能化されたデキストランマトリックスを有することが典型的である。これらの材料の各々を用いる、弱い陰イオン交換カラムの例には、それぞれ、POROS PI(商標)カラム、Dowex 50(商標)カラム、及びDEAE-Sephadex(商標)が含まれる。比較的強い陰イオン交換カラムは、表面のイオン化が約1〜約14のpH範囲にわたる、四級化されたポリエチレンイミンによりコーティングされた表面を有することが典型的である。このような強い陰イオン性のイオン交換カラムの例には、それぞれ、POROS HQ(商標)カラム、又は SOURCE(商標)カラムが含まれる。上記で列挙したカラム用の樹脂は、Amersham/Pharmacia社(ニュージャージー州、ピスケイタウェイ)、PerSeptive Biosystems社(カリフォルニア州、フォスターシティー)、Toso Haas社(ペンシルベニア州、モンゴメリービル)、GE Healthcare社(ニュージャージー州、ピスケイタウェイ)、及び他の販売元から購入することができる。
試料を、カラム内に存在するイオン交換クロマトグラフィー樹脂と混合することが典型的である。カラムは、0.5mlのカラム、1.5mlのカラム、10mlのカラム、20mlのカラム、30mlのカラム、50mlのカラム、100mlのカラム、200mlのカラム、300mlのカラム、400mlのカラム、500mlのカラム、600mlのカラム、700mlのカラム、800mlのカラム、900mlのカラム、1000ml(1L)のカラム2000ml(2L)10Lのカラム、20Lのカラム、30Lのカラム、40Lのカラム、50Lのカラム、60Lのカラム、70Lのカラム、80Lのカラム、90Lのカラム、100Lのカラム、又は容量が100Lを超えるカラムのほか、容量が上記に列挙した容量の間にある他の任意のカラムでありうる。
イオン交換クロマトグラフィー材料は、使用前に約6.0〜約7.2の範囲のpH、及び約100mM〜200mMの範囲でありうる塩濃度で平衡化されることが典型的である。したがって、カラムは、約6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2のpH又はこれらのpH値の間の他の任意のpH、及び約100mM、125mM、150mM、175mM、200mMの塩濃度、又は上記で列挙した塩濃度の間の他の任意の濃度で平衡化することができる。クロマトグラフィー材料を平衡化するのに用いうる、一般に用いられる塩には、NaCl、KCl、又はKClのイオン強度に匹敵するように調整されうる他の任意の塩が含まれる。
イオン交換クロマトグラフィーの場合、充填材料及びこのような材料を調製する方法のほか、陰イオン交換クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーを調製、重合化、及び官能化し、これらを介してプラスミドDNAを溶出させ、分離する方法は、当技術分野でよく知られている。
加えて、大腸菌溶解物中のDNA分解酵素に起因するプラスミドの分解を阻害する、例えば、エチレンジアミン−テトラ酢酸(EDTA;ethylenediamine-tetraacetic acid)など、2価金属イオンのキレート化剤も用いることができる。2価金属イオンのキレート化剤の濃度は、0.1〜100mMであることが好ましい。
所望のタンパク質を陰イオン交換マトリックスに適用する場合、アミノエチル交換体、ジエチルアミノエチル交換体、四級アミノメチル交換体、四級アミノエチル交換体、ジエチル−(2−ヒドロキシプロピル)アミノエチル交換体、トリエチルアミノメチル交換体、トリエチルアミノプロピル交換体、及びポリエチレンイミン交換体が含まれるがこれらに限定されない任意の適切なマトリックスを用いて、所望のタンパク質の濾過を達成することができる。市販される陰イオン交換体の例には、DE32及びDE52(ニュージャージー州、フローラムパーク、WHATMAN社製)などのセルロースによるイオン交換体、DEAE-SEPHADEX C-25、QAE-SEPHADEX C-25, DEAE-SEPHADEX C-50、及びQAE-SEPHADEX C-50(ニュージャージー州、ピスケイタウェイ、Pharmacia社製)などのデキストランによるイオン交換体、DEAE BIO-GEL A(カリフォルニア州、ハーキュリー、BIO-RAD社製)、DEAE-SEPHAROSE CL-6B及びQ-SEPHAROSE Fast Flow(Pharmacia社製)などのアガロース又は架橋アガロース、MONO Q(Pharmacia社製)、DEAE-5-PW、及びHRLC MA7P(BIO-RAD社製)などの合成有機ポリマー、並びにDEAE Si5500及びTEAP Si100などのコーティング型シリカマトリックスが含まれる。陰イオン交換マトリックスは、極めて低い塩濃度で平衡化し、酸性及び軽度に塩基性のコンタミネーション物質の結合を促進するように、アルカリ性のpH(例えば、pH8.0〜11.5)で用いることが望ましい。
所望のタンパク質を陽イオン交換マトリックスに適用する場合、カルボキシメチル、スルホン酸、スルホエチル基、又はスルホプロピル基により官能化された任意のマトリックスを用いうることが意図される。陽イオン交換マトリックスは、塩基性及び軽度に酸性のコンタミネーション物質の結合を促進するように、酸性のpH(例えば、pH3.0〜6.5)で平衡化して用いることが望ましい。市販される陽イオン交換体の例には、セルロースベースのCM 23、CM 32、及びCM 52(WHATMAN社製);デキストランベースのCM-SEPHADEX C-25、SP-SEPHADEX C-25、CM-SEPHADEX C-50、及びSP-SEPHADEX C-50(Pharmacia社製);アガロース又は架橋アガロースベースのCM BIO-GEL A(BIO-RAD社製)、CM-SEPHAROSE Fast Flow及びS-SEPHAROSE Fast Flow(Pharmacia社製);合成有機ポリマーベースのMONO S(Pharmacia社製)、SP-5-PW及びHRLC MA7C(BIO-RAD社製)、並びにCM Si300及びSP Si100など、コーティング型シリカマトリックスが含まれる。
試料(例えば、核酸を含めた溶解物又はその派生物)は、核酸がカラムから溶出する濃度未満の塩濃度を含むローディング緩衝液により、カラムへと添加することが典型的である。特定の実施形態において、塩濃度は一般に、用いられる樹脂に応じて約10〜50mSである。一般に、より弱い陰イオン交換樹脂の場合、導電性のより低い溶液が用いられるのに対し、より強い陰イオン交換樹脂の場合、導電性のより高い溶液が用いられる。次いで、カラム数本分の容量の緩衝液によりカラムを洗浄して、樹脂に対する結合が弱い基質を除去する。次いで、例えば、トリス−HCl緩衝液中において最大1.5MのNaClを用いる従来の方法による、生理食塩液の緩やかな連続勾配を用いて、カラムから画分を溶出させる。カラムから試料画分を回収する。中程度のスケールの調製物(例えば、約100mg〜約3グラムの核酸)の場合、画分は少なくとも50ml〜2リットルであることが典型的であり、この場合、核酸のピークは、画分の容量が増加するにつれ、予測されるピークを超えると予測される。単一又は複数の画分に対して、核酸の収量及び純度の分析的決定を実施する。加えて、各画分に対してリムルス(LAL;Limulus ameobocyte lysate)アッセイ(例えば、エンドトキシンのリピドA部分を検出する)を実施して、残留エンドトキシンを決定することもでき、かつ/又は各画分に対して本明細書に記載の他のアッセイを実施して、各画分中におけるコラン酸又は類縁の多糖(下記で説明される)など、類縁の多糖コンタミネーション物質レベルを決定することもできる。高レベルの核酸及び低エンドトキシン又は低コラン酸を含有する画分は、別個の画分としてプール又は維持することができる。下記で説明される通り、結果として得られる核酸試料は、エンドトキシンレベル及び多糖レベル並びに所望の純度に応じて、再度濾過する(例えば、0.2μmのフィルターを介して)か、又はさらなるクロマトグラフィー法にかけることができる。
本明細書で開示されるイオン交換クロマトグラフィー材料の支持体マトリックスはそれほど重要ではないが、デキストラン、セルロース、架橋アガロース、合成有機ポリマー、コーティング型シリカ、又はアガロースに基づく支持体マトリックスが当技術分野では好都合であり、本明細書における使用に適する。
アフィニティークロマトグラフィー
上記で言及した通り、アフィニティークロマトグラフィーを付加的又は代替的に用いて生物学的試料を精製することができる。本発明の具体的な態様は、本明細書に記載のポリペプチドを用いるコラン酸分解方法と、消化された材料を、アフィニティークロマトグラフィー材料と混合して、コラン酸などの消化された多糖を選択的に除去するステップとを伴う。特に好ましいアフィニティークロマトグラフィー材料は、隣接ジオール又はシス−ジオールに対する親和性を有する。一実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー材料は、ボロン酸ベースの(boronic acid- or boronate-based)樹脂など、ボロン酸によるクロマトグラフィー樹脂である。
基本的な点において、アフィニティークロマトグラフィーは、分離される標的試料がそれに対して特異的な認識可能領域を含有する分子を、共有結合により適切な不溶性の支持体へと固定化することによる、選択的な吸着剤の調製を伴う。固定化された化合物を一般にリガンドと称し、支持体に対するリガンドの結合は、それが標的により認識される能力を妨げない形で達成されなければならないことが認識される。リガンドと精製される標的分子との親和性は、標的分子を含有する試料に、選択的吸着剤を含有するカラム内を流過させることにより達成することができる。その後、吸着マトリックスから望ましくない物質を遊離させるのに用いられる緩衝液によりカラムを洗浄した後、吸着した標的分子を溶出することにより精製を達成する。pH約7.2のリン酸緩衝生理食塩液など、ある容量の生理学的緩衝液にカラム内を流過させることにより洗浄を達成する。洗浄するステップにおいて用いられる緩衝液の容量は、標的分子の喪失を結果としてもたらすほど大量であるべきではないが、逆に、不純物を除去しないほどの限定量であるべきでもない。溶出とは、リガンドに対する標的分子の親和性、又は固体支持体に対するリガンド−標的分子複合体の親和性を低下させる溶媒を用いることにより、カラムから標的分子を除去するステップである。抗原に結合した抗体の溶出は、pHを変化させる塩勾配、イオン強度を変化させる段階的な緩衝勾配、又は他の方法により達成することができる。
理想的な固体支持体又はマトリックスは、マクロ多孔性、力学的安定性、活性化の容易さ、親水性、及び不活性、すなわち、非特異的な吸着が低度であることを含めた、複数の特徴を保有すべきである。これらの全ての点において理想的なマトリックスは存在せず、マトリックスは、経験的に決定されることが多い。当業者により一般的に用いられるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスには、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、セルロース、シリカ、及びポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)が含まれる。免疫吸着材の場合、そのタンパク質に対する高吸着能、高多孔性、親水性、化学的安定性、電荷の欠如、及び非特異的吸着に対する相対的不活性に起因して、ビーズ状のアガロースが一般に当業者に好まれている固体支持体である。
リガンドは、マトリックスに物理的に吸着させる場合もあり、二官能性試薬により、ヒドロキシル基又はアミノ基を含有するポリマーマトリックスに共有結合させる場合もある。結合は通常、マトリックスの活性化と、活性化したマトリックスに対するリガンドの結合との2つのステップを必要とする。活性化したマトリックスは市販されている。マトリックスに対するリガンドの結合を選択する方法は、一部はマトリックスの選択により、また、一部はリガンドの選択により決定される。
試料適用を準備する際に、アフィニティーカラムを平衡化するのに用いられる具体的な緩衝条件は、用いられる相互作用系の具体的な特性を反映すべきである。pH及びイオン強度を含めた、用いられる緩衝液の性質は、リガンド−標的分子系にとって最適であるべきである。カラムに適用される標的試料は、カラムを平衡化するのに用いられる同じ緩衝液中に含有されることが好ましいものとする。試料の適用及び吸着の後、出発緩衝液によりカラムを洗浄し、結合しなかった任意の試料及び任意の不純物を除去することができる。次いで、非特異的に吸着した基質を除去する目的で、出発緩衝液とは異なる緩衝液によりカラムを洗浄することも一般的である。
標的分子の溶出は、本明細書で示される方法が含まれるがこれらに限定されない多数の方法により達成することができる。結合複合体の親和性が十分に低下し、これにより、互いに対するか、又は固体支持体に対する有効な結合が破壊されるように、緩衝液の条件を変化させることができることが典型的である。これは、緩衝液のpH若しくはイオン強度、又はこれらの両方を変化させることによるか、或いはカオトロピックイオン、例えば、シアン酸イオンにより達成される。勾配溶出により分離を増大させることができる。溶出に適する方法には、KSCNなどのカオトロピック剤;有機溶剤、例えば、エチレングリコール、DMSO、又はアセトニトリル;変性剤、例えば、8Mの尿素又は6Mのグアニン;電気泳動による溶出;圧力誘導による溶出及び金属イオンによる溶出の使用が含まれる。不完全な溶出は、生成物の喪失及びカラム容量の喪失の両方を結果としてもたらす。溶出条件は、カラム1又は2本分の容量にカラム中を流過させた後に、生成物の完全な溶出が可能となることが理想的である。
アフィニティークロマトグラフィーについての詳細な議論は、Handbook of Affinity Chromatography, David S. Hage (ed.) CRC Press (2006);及びDean P. D. G., Johnson, W. S., Middle, F. A.により編集されたAffinity Chromatography: A Practical Approach;Pharmacia社(スウェーデン、ウプサラ、Pharmacia LKB Biotechnology社)により公刊されているAffinity Chromatography, Principles and Methods;及びImmunoaffinity Purification: Basic Principles and Operational Considerations, Yarmush, M. L, et al., (1992) Biotech Adv., 10:412-446において見出すことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いられるリガンドは、精製される標的分子に構造的に、また生物学的に密接に関連している。本発明の目的では、所望の試料(すなわち、プラスミドDNA)に結合してこれを溶出するのに適する任意のアフィニティークロマトグラフィー材料及びそのリガンドを用いることができる。一般には、これにより、各場合に特異的なリガンドの選択がなされる。
アフィニティークロマトグラフィー材料において用いられるリガンドは、ジオール複合体、好ましくは隣接ジオール又はシス−ジオールに対する特異性を有することが好ましい。例えば、コラン酸などの多糖は、隣接ジオール複合体を含有する。特に好ましい実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー材料は、ボロン酸によるアフィニティークロマトグラフィー材料である。ボロン酸によるアフィニティーカラムは、当初Weith et al, Biochemistry 9, 4396-4401, 1970により、糖成分及び核酸成分の分離に用いられ、それ以来、この技法は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、炭水化物、糖タンパク質、及び酵素を含めた、広範なシス−ジオール化合物の分離において用いられている。
一般的にボロン酸とシス−ジオールとの作用機序は、塩基性条件下におけるボロン酸のヒドロキシル化を伴い、ボロン酸は、三角形の共平面形態から四面体のボロン酸陰イオンへと変化し、次いで、これがシス−ジオールと共にエステルを形成しうる。結果として得られるジエステルは、酸性条件下で加水分解させることができ、これによりエステル形成反応が可逆化される。隣接ジオールを分離する他の方法は、Barry et al., Australian J. Chem. 37, (1984); Gable, Organometallics 13(6), 2486-88 (1994); Liu, J. Microbial Methods 29, 85-95 (1997); Kinrade et al., DaltonTrans. 3713-3716 (2003); and Zhao et al., Analytical Sciences, 22(5), 747 (2006)によって説明されている。
とりわけ、本方法のアフィニティークロマトグラフィー材料において用いるのに適するボロン酸リガンドには、例えば、3−アミノフェニルボロン酸(3aPBA;3-aminophenylboronic acid)、2−(((4−ボロノフェニル)−メチル)−エチルアンモニオ)エチル、2−(((4−ボロノフェニル)−メチル)−ジエチルアンモニオ)エチル、p−(ω−アミノエチル)フェニル−ボロネート、ポリ(p−ビニルベンゼンボロン酸)、N−(4−ニトロ−3−ジヒドロキシボリルフェニル)スクシンアミン酸、4−(N−メチル)カルボキサミド−ベンゼンボロン酸)、3−ニトロ−4−カルボキサミドベンゼンボロン酸、2−ニトロ−3−スクシンアミド−ベンゼンボロン酸、及び3−スクシンアミド−4−ニトロ−ベンゼンボロン酸が含まれる。好ましいボロン酸リガンドの1つは、3−アミノフェニルボロン酸(3aPBA)である。
ボロン酸によるアフィニティークロマトグラフィー材料を含めた、本明細書で開示されるアフィニティークロマトグラフィー材料のための広範な支持体マトリックスはそれほど重要ではないが、デキストラン、セルロース、アガロース、ポリアクリルアミド、シリカ、ポリスチレン、及びポリメタクリレートに基づく支持体マトリックスが当技術分野では好都合であり、本明細書における使用に適する。ボロン酸によるアフィニティーマトリックスは、例えば、Sigma-Aldrich社(ボロン酸ゲル;ポリメタクリレートによる支持体)(m−アミノフェニルボロン酸−アクリレート;アクリルビーズによる支持体);Bio-Rad社(Affi-Gel 601;ポリアクリルアミドによる支持体);Pierce社(固定化ボロン酸ゲル;ポリアクリルアミドによる支持体);及びTosoh社(m−アミノフェニルボロン酸−アガロース;アガロースによる支持体)(TSKgel Boronate-5PWカラム;ポリメタクリレートによる支持体)を含めた各販売元から市販されている。ボロン酸及びその誘導体を販売する他の販売元には、Denisco社(インド、ハイデラバード)及びSynthonix Corporation社(ニューカレドニア州、ウェイクフォレスト)が含まれる。
米国特許第5,969,129号明細書(参照によりその全体において本明細書に組み込まれる)に記載のボロン酸基を含有するポリマーゲルもまた用いることができる。
ボロン酸によるアフィニティークロマトグラフィーに用いられる原理、理論、及びデバイスはまた、Boronate Affinity Chromatography, Chapter 8, pages 215-230, Handbook of Affinity Chromatography, David S. Hage (ed.) CRC Press (2006)においても説明されている。
疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC;hydrophobic interaction chromatography)の材料及び方法が用いられる実施形態において、これらのクロマトグラフィー法は一般に、基材上における疎水性部分を用いて、精製される試料中の分子内における疎水性領域を引き寄せる。一般に、HIC用支持体は、クラスター化効果により作用し、これらの分子が会合する場合、共有結合又はイオン結合は形成又は共有されないのが典型的である。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、プラスミドの開環形態、並びに、ゲノムDNA、RNA、及びエンドトキシンなど、他のコンタミネーション物質を少なくとも部分的に除去するので有益である。
本発明の目的では、所望の試料(例えば、プラスミドDNA)に結合してこれを溶出するのに適する任意の疎水性相互作用マトリックスを用いることができる。このような疎水性相互作用マトリックスには、メチル基、エチル基、又は他のアルキル基など、非荷電基を含有する天然又は人工の表面が含まれるがこれらに限定されない。これらの基は、マトリックスを流過するタンパク質と疎水性結合を形成し、ポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドとマトリックス基との相互作用の強度に基づき、ポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドの分離を結果としてもたらす。樹脂材料の疎水性の程度は、媒体中の塩濃度又は溶出剤中の塩濃度に応じて変化しうる。疎水性相互作用カラムは通常、疎水性リガンド(例えば、アルキル基又はアリール基)が結合するベースマトリックス(例えば、架橋アガロース材料又は合成コポリマー材料)を含む。好ましい疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂は一般に、非置換であることが典型的な炭素原子2〜20個(例えば、炭素原子4〜18個、又は炭素原子6〜15個)の長さのアルキル部分を包含する。
疎水性相互作用クロマトグラフィー用ベース材料の小孔直径は一般に、500〜4000Åであるが、分離される試料及びその成分の分子サイズに応じ、前記範囲からおおよそのところで選択することができる。一般に、充填材料上における核酸の保持及び吸着能は小孔直径に応じて変化しうるので、分子サイズが比較的大きな核酸に対しては小孔直径が比較的大きなベース材料を用い、分子サイズが比較的小さな核酸に対しては小孔直径が比較的小さなベース材料を用いることが好ましい場合がある。
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、低圧又は高圧で実施することができ、比較的高い塩濃度(例えば、1.2〜1.7Mの硫酸アンモニウム)を用いる水性緩衝液の存在下でカラムを平衡化し、比較的低い塩濃度(例えば、1.2Mから0.5Mへと低下する硫酸アンモニウム勾配)を用いる水性緩衝液の存在下で溶出させる。ポリヌクレオチド及びポリペプチドはそれ自体、マトリックス上における疎水性基との、強度の異なる疎水性相互作用に基づき、すなわち、タンパク質の疎水性が上昇する順序で、選択的に溶出する。比較的低圧における適用のための、市販される疎水性相互作用マトリックスの例には、フェニル−SEPHAROSE(Pharmacia社製)、並びにブチル、フェニル、及びエーテルによるTOYOPEARL 650シリーズの樹脂(Toso Haas社製)が含まれる。市販される他の疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂には、低度又は高度の置換を伴うPhenyl SEPHAROSE 6 FAST FLOW(商標)カラム(スウェーデン、Pharmacia LKB Biotechnology, AB社製);Phenyl SEPHAROSE(商標)高速カラム(スウェーデン、Pharmacia LKB Biotechnology, AB社製);Octyl SEPHAROSE(商標)高速カラム(スウェーデン、Pharmacia LKB Biotechnology, AB社製);FRACTOGEL(商標)EMD Propylカラム又はFRACTOGEL(商標)EMD Phenylカラム(ドイツ、E. Merck社製);MACRO-PREP(商標)Metyl支持体又はMACRO-PREP(商標)t-Butyl支持体(カリフォルニア州、Bio-Rad社製);及びWP HI−Propyl(C3)(商標)カラム(ニュージャージー州、J. T. Baker社製)が含まれる。市販されるさらに他の疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂は、Sigma-Aldrich社(ミズーリ州、セントルイス)(例えば、TSK-GEL(登録商標)Butyl-NPR;TSK-GEL(登録商標)Ether-5PW;TSK-GEL(登録商標)Phenyl-5PW;これら及び他の各々の粒子サイズは様々でありうる);GE Healthcare社(ニュージャージー州、ピスケイタウェイ)(例えば、HiScreen Phenyl FF(高度又は低度の置換);HiScreen Butyl FF;HiScreen Butyl-S FF;HiScreen Octyl FF)から入手可能である。
疎水性相互作用マトリックスからの溶出は、段階的勾配又は直線的勾配により実施することができる。適切な溶出緩衝液は、当技術分野でよく知られている。適切なカラムサイズは、イオン交換クロマトグラフィー材料との関連で上記において説明されている。同様に、本明細書で開示される疎水性相互作用クロマトグラフィー材料のための支持体マトリックスもそれほど重要ではないが、デキストラン、セルロース、架橋アガロース、合成有機ポリマー、コーティング型シリカ、又はアガロースに基づく支持体マトリックスが当技術分野では好都合であり、本明細書における使用に適する。
疎水性相互作用クロマトグラフィーのためのベース材料の合成のほか、疎水性相互作用クロマトグラフィーを調製、重合化、及び官能化し、これらを介してプラスミドDNAなどの試料を溶出させ、分離する方法は、当技術分野でよく知られており、とりわけ、米国特許第6,441,160号明細書及び米国特許第7,169,917号明細書(その各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる)において説明されている。
濾過
特定の好ましい実施形態によれば、接線流濾過を含めた、1又は複数の濾過ステップ、限外濾過ステップ、又は膜分離ステップもまた実施する場合がある。サイズ排除フィルターを介する濾過を用いて、結果として生じる核酸喪失を最小としながら、少なくとも部分的にエンドトキシン及び他のコンタミネーション物質を除去することができる。例えば、多くの適用では、試料(例えば、プラスミドDNA)をさらに精製し、結果として得られる試料の塩濃度を低下させ、試料を濃縮し、かつ/又は、緩衝液をより適切な緩衝液と交換してその後に用いることが望ましい。治療的使用、例えば、遺伝子治療における使用の場合、接線流濾過のステップ又は他のステップから得られる核酸をさらに精製することが望ましい場合がある。
1又は複数の(初回又は最終の)濾過ステップ、限外濾過ステップ、又は膜分離ステップを実施して、(1又は複数の)その結果を一般に達成することができる。所望の場合、より後の段階において、核酸は高度に精製されることが典型的であり、膜を介して濾液中へと流過するのは主に溶質の低分子であるため、後続又は最終の膜分離ステップには、初回の精製で既に用いた膜よりMWCOが小さな限外濾過膜を用いることができる。例えば、多くのプラスミドDNAの場合、10,000〜100,000MWCO以上の膜を用いることができる。特に、濃縮された核酸溶液を取り扱う場合は、ホールドアップ容量が低下し、流量が増大し、収量が増大し、加工時間が短縮されるため、約100,000MWCOの膜の中空ファイバーデバイスが一般に用いられる。標準的な市販の濾過材料及び膜分離材料が、当技術分野で知られる標準的な技法によるこの方法における使用に適する。
フィルターがコンタミネーション物質を保持するように、それを介して汚染された組成物が流過する各種の多孔性フィルター媒体を用いることにより、流体からの、微粒子サイズのコンタミネーション物質の濾過が達成されている。コンタミネーション物質の保持は、機械的引張り又は動電学的粒子捕捉及び吸着により生じうる。機械的引張りでは、粒子が自身より小さな小孔を通過しようとすると、物理的な取込みにより保持される。動電学的捕捉機構の場合、粒子は多孔性フィルター内の表面と衝突し、射程の短い引力により表面上において保持される。動電学的捕捉を達成するには、電荷調節系を用いて、フィルターの表面電荷特徴を変化させることができる(例えば、国際公開第WO90/11814号パンフレットを参照されたい)。例えば、除去されるコンタミネーション物質が陰イオン性である場合、陽イオン性電荷調節剤を用いて、フィルターによりコンタミネーション物質が保持されるようにフィルターの電荷特徴を変化させることができる。
特定の実施形態では、濾過の前又は後において、両性イオン界面活性剤を含む水溶液により試料を処理する。適切な両性界面活性剤には、例えば、EMPIGEN BB(登録商標)(n−ドデシル−N,N−ジメチルグリシン)、ZWITTERGENT(登録商標)3-08、ZWITTERGENT(登録商標)3-10、ZWITTERGENT(登録商標)3-12、ZWITTERGENT(登録商標)3-14、ZWITTERGENT(登録商標)3-16、CHAPS、CHAPSOなどが含まれる。
好ましい一実施形態では、接線流濾過を用いて試料を濾過することができる。接線流濾過に用いられる原理、理論、及びデバイスは、Michaels, S. L. et al., "Tangential Flow Filtration" in Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications, W. P. Olson, ed., Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, III. (1995)において説明されている。例えば、接線流濾過により試料を濾過及び濃縮するには、一般に、保持される分子の分子量より実質的に低値の分子量カットオフ(MWCO;molecular weight cut off)により膜を選択する。一般的な法則は、分子量カットオフが、保持される分子の分子量の3分の1〜6分の1である膜を選択することである。膜をインストールし、接線流濾過システムを始動させ(水でフラッシュし、濾過物である水の流速及び完全性について調べることが典型的である)、試料を添加し、交差流を確立し、供給液圧及び保持液圧を設定し、濾過物を回収する。所望の濃度又は容量に到達したら、方法を停止させ、試料を回収する。
好ましい濾過方法の1つは、プラスミドサイズに応じて、分子量カットオフが30,000〜500,000MWCOの範囲にある限外濾過膜を用いる膜分離である。この膜分離のステップは、緩衝液交換後における濃縮を可能とする。上記の通り、例えば、30kDaの膜カットオフを用いる接線流濾過により、溶出物を3〜4倍濃縮して標的濃度とし、一定容量の膜分離により該濃縮物を緩衝液交換し、標的のプラスミド濃度に調整することが典型的である。次いで、結果として得られるプラスミドDNA溶液を、例えば、0.2μmのフィルターを介してさらに濾過し、典型的には、複数のアリコートに分割し、これを、さらに加工するまで、比較的低温(例えば、約0℃)の容器内で保存する。
付加的又は代替的に、フィルターは、エンドトキシン及び他のコンタミネーション物質にその中を流過させる一方で、核酸に結合するフィルターでありうる。望ましくない物質にフィルター内を流過させたら、該フィルターから核酸を溶出させ、回収することができる。
適切なサイズ排除フィルターは、例えば、Ambion社(テキサス州、オースチン)、GE Healthcare社(ニュージャージー州、ピスケイタウェイ)、Gelman社(ミシガン州、アナーバー)、Pall-Filtron社(ニューヨーク州、イーストヒルズ)、Roche社(スイス、バーゼル)、Sartorius社(ニューヨーク州、エッジウッド)、及びThermo Scientific Pierce社(イリノイ州、ロックフォード)を含めた各種の販売元から市販されている。用いられるフィルターは、核酸にその中を流過させる一方で、エンドトキシン及び他のコンタミネーション物質に結合するフィルターである。Pall Ultipor(登録商標)N66(登録商標)フィルターが、核酸の収量を増大させながら、実質的なエンドトキシンを除去することが分かっている。核酸を含有する溶解物溶液又は溶解物の派生物はまた、本明細書に記載の1又は複数のクロマトグラフィーステップ又は濾過ステップの前に、前濾過(例えば、0.45μmのフィルターを用いる)される場合もある。
例えば、上記のプロトコールに従い精製されたDNAを、遺伝子治療で用いられる脂質担体と複合体化する場合、好ましくは膜分離により、DNAを低導電性の緩衝液中へと交換することもまた望ましい場合がある。低導電性の緩衝液には、約10mS未満、好ましくは約1mS未満の任意の緩衝液が含まれることを意図する。
上記の濾過法に加えて、従来のゲル濾過法(すなわち、サイズ排除クロマトグラフィー材料を用いる)も用いることができる。例えば、Gel Filtration Principles and Methods, Edition AI, Amersham Biosciences, 2002を参照されたい。
本明細書に記載のポリペプチドは、コラン酸及び他の多糖の消化を必要とするか、又はそこから利益を得る各種の産業的方法において、付加的又は代替的に用いることができる。一般に、これは、例えば、これらの産業的方法から生じる腐食、腐敗、又は他の堆積を除去又は防止する目的で、本明細書に記載のポリペプチドにより、機械、生成物パイプライン及び/若しくは廃水パイプライン、並びに生成物、中間体、又は廃水自体を処理するステップを伴いうる。具体的な一例は、方法を行う間又はある時間経過にわたり形成されうる生物膜(例えば、グラム陰性菌などの細菌を含有する生物膜)の除去又は防止である(生物膜及び類似の物質は、流路及び導管を狭窄化又は遮断する場合もあり、機械部品又はシステム上における損耗を増大させる場合もある)。本明細書に記載のポリペプチドの使用から利益を得うる代表的な産業的方法には、例えば、製紙方法及びセルロース製造方法、膜の再構成及び清浄化、リサイクリング、廃水処理(例えば、好気性の固体及びスラッジの消化)、石油化学における精製及び廃棄物の浄化、高純度の水濾過及び水濾過システム、水冷却システム/熱交換器、並びに食品加工が含まれる。例えば、紙又はセルロースの加工業務の場合、生物膜は、中間体加工の流れにおいて形成される場合があり、これは、下流の加工に有害な影響を及ぼし、かつ/又は最終生成物の品質に影響を及ぼす場合がある。本明細書に記載のポリペプチドは、このような生物膜を除去、最小化、又は防止することにより、このような方法に利益をもたらしうる。
ポリペプチド
上記で言及した通り、本発明は、例えば、生物学的材料中において見出されうるコラン酸を分解することが可能なポリペプチドに関する。これには、例えば、大腸菌に由来するプラスミドDNAなど、大腸菌、サルモネラ属、又は他の腸内細菌科(enterobacteriaceae)などの細菌に由来する生物膜又は細菌の核酸調製物が含まれうる。本明細書に記載のポリペプチドはまた、高純度のグラム陰性菌のプラスミドDNA調製物の調製を可能とすることでも有利である。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、一般に配列番号1及びその保存的アミノ酸置換に対応するアミノ酸配列を含む。このポリペプチドは一般に、分子量が約84,354ダルトンである、全長のコラン酸分解ポリペプチドに対応する。一般に、ポリペプチドは、単離ポリペプチドである。特定の実施形態において、ポリペプチドは、細菌供給源である生物から単離され、精製される。ポリペプチドは、純度が少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、またより好ましくは少なくとも99%であるのが典型的である。
本明細書では、ポリペプチドフラグメントもまた提供される。このようなフラグメントは、N末端又はC末端で切断される場合もあり、例えば、全長タンパク質と比較して内部残基を欠く場合もある。例えば、特定のフラグメントは、ポリペプチドの所望の活性(例えば、生物学的活性又は他の形の活性)にとって本質的でないアミノ酸残基を欠く。具体的な一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2及びその保存的アミノ酸置換に一般的に対応するアミノ酸配列を含む。このポリペプチドは一般に、全長ポリペプチドの切断形に対応し、全長ポリペプチド(配列番号1)のうちの最初の106アミノ酸が不在である。
本明細書に記載の全長ポリペプチド及び切断型ポリペプチドに加え、例えば、ポリペプチドのDNAに適切なヌクレオチド変化を導入することにより、かつ/若しくは所望のポリペプチドを合成することにより、又はコラン酸分解活性を有する変異体のポリペプチドを単離及び精製することにより、ポリペプチドの変異体を調製しうることが意図される。当業者は、アミノ酸変化が、グリコシル化部位の数若しくは位置の変化、又は膜固着特徴の変化など、ポリペプチドの特定の翻訳後過程を変化させうることを理解するであろう。
本明細書に記載のポリペプチドの全長配列及び/若しくは切断型配列又は各種ドメインにおける変異は、例えば、文献(例えば、米国特許第5,364,934号明細書(参照によりその全体において本明細書に組み込まれる))に示される保存的突然変異及び非保存的突然変異のための技法及び指針のいずれかを用いて作製することができる。変異は、天然配列のポリペプチドと比較して、そのアミノ酸配列の変化を結果としてもたらすポリペプチドをコードする1又は複数のコドンの置換、欠失、又は挿入でありうる。変異は、ポリペプチドの1又は複数のドメイン内における他の任意のアミノ酸による、少なくとも1つのアミノ酸の置換を介してもよい。所望の活性に有害な影響を及ぼさずに、どのアミノ酸残基を挿入、置換、又は欠失しうるかを決定する際の指針は、ポリペプチド配列を、相同的なタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域において作製されるアミノ酸配列の変化の数を最小化することにより見出すことができる。アミノ酸の置換は、セリンによるロイシンの置換など、1つのアミノ酸を、類似の構造及び/又は化学的特性を有する別のアミノ酸により置換すること、すなわち、保存的アミノ酸置換の結果でありうる。挿入又は欠失は、約1〜5アミノ酸、5〜10アミノ酸、10〜25アミノ酸,25〜50アミノ酸、又は、100アミノ酸以上など、これを超える範囲であってもよい場合がある。許容される変異は、配列内において、アミノ酸の挿入、欠失、又は置換を体系的に作製し、結果として得られる変異体を、全長配列又は天然の成熟配列により示される活性について調べることにより決定することができる。
上記で言及した通り、ポリペプチドは、本明細書に記載の全長ポリペプチド又は切断型ポリペプチドの変異体でありうる。通常、ポリペプチド変異体は、本明細書に記載の全長ポリペプチド配列(例えば、配列番号1)に対して、少なくとも約80%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約81%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約82%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約83%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約84%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約85%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約86%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約87%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約88%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約89%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約90%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約91%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約92%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約93%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約94%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約95%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約96%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約97%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約98%のアミノ酸配列の同一性、また代替的に、少なくとも約99%のアミノ酸配列の同一性を有する。
切断型ポリペプチド変異体の場合、ポリペプチド変異体は通常、本明細書に記載の切断型ポリペプチド配列(例えば、配列番号2)に対して、少なくとも約80%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約81%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約82%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約83%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約84%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約85%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約86%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約87%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約88%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約89%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約90%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約91%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約92%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約93%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約94%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約95%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約96%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約97%のアミノ酸配列の同一性、代替的に、少なくとも約98%のアミノ酸配列の同一性、また代替的に、少なくとも約99%のアミノ酸配列の同一性を有する。
一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1及びその保存的アミノ酸置換に対して少なくとも約90%のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1及びその保存的アミノ酸置換に対して少なくとも約95%のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1及びその保存的アミノ酸置換に対して少なくとも約98%のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1及びその保存的アミノ酸置換に対して少なくとも約99%のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2及びその保存的アミノ酸置換に対して少なくとも約90%のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2及びその保存的アミノ酸置換に対して少なくとも約95%のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2及びその保存的アミノ酸置換に対して少なくとも約98%のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2及びその保存的アミノ酸置換に対して少なくとも約99%のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、例示的な対象とする保存的置換は表1に示される。このような置換の結果、生物学的活性の変化、又は所望の活性の低下がもたらされる場合は、アミノ酸のクラスに関して下記で説明される変化など、他のさらなる変化を導入し、生成物をスクリーニングすることができる。当技術分野では、このような保存的置換をコードすることが可能なコドンが知られていることが理解される。
アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づくアミノ酸置換により到達する、本発明のポリペプチド類似体は、本発明の範囲内にある。アミノ酸置換の作製において考慮しうる1つの因子は、アミノ酸のハイドロパシー指数である。タンパク質に相互作用性の生物学的機能を付与することにおける、アミノ酸のハイドロパシー指数の重要性は、Kyte and Doolittle (J. Mol. Biol., 157: 105-132, 1982)により論じられている。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特徴は、結果として得られるタンパク質の二次構造に寄与することが受容されている。タンパク質の二次構造は、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などの分子とのタンパク質の相互作用に影響を及ぼす。
その疎水性及び荷電特徴に基づき、各アミノ酸には、以下:イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/シスチン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(−0.4);トレオニン(−0.7);セリン(−0.8);トリプトファン(−0.9);チロシン(−1.3);プロリン(−1.6);ヒスチジン(−3.2);グルタミン酸/グルタミン/アスパラギン酸/アスパラギン(−3.5);リシン(−3.9);及びアルギニン(−4.5)のハイドロパシー指数が割り当てられている。
当技術分野で知られる通り、ペプチド又はタンパク質中の特定のアミノ酸を、同様なハイドロパシー指数又はハイドロパシースコアを有する他のアミノ酸に置換し、同様の生物学的活性を有する、すなわち、生物学的機能をなおも保持するペプチド又はタンパク質を結果としてもたらすことができる。このような変化を作製する場合、ハイドロパシー指数が±2以内であるアミノ酸を互いに置換し合うことが好ましい。より好ましい置換は、アミノ酸のハイドロパシー指数が±1以内の置換である。最も好ましい置換は、アミノ酸のハイドロパシー指数が±0.5以内の置換である。
類似のアミノ酸はまた、親水性にも基づいて置換することができる。米国特許第4,554,101号明細書は、その隣接するアミノ酸の親水性により支配されるタンパク質の親水性の局所的な最大平均値が、該タンパク質の生物学的特性と相関することを開示している。アミノ酸には、以下の親水性値:アルギニン/リシン(+3.0);アスパラギン酸/グルタミン酸(+3.0±1);セリン(+0.3);アスパラギン/グルタミン(+0.2);グリシン(0);トレオニン(−0.4);プロリン(−0.5±1);アラニン/ヒスチジン(−0.5);システイン(−1.0);メチオニン(−1.3);バリン(−1.5);ロイシン/イソロイシン(−1.8);チロシン(−2.3);フェニルアラニン(−2.5);及びトリプトファン(−3.4)が割り当てられている。したがって、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質中における1つのアミノ酸を、同様の親水性スコアを有する他のアミノ酸により置換し、同様の生物学的活性を有する、すなわち、正しい生物学的機能をなおも保持するタンパク質を結果としてもたらすことができる。このような変化を作製する場合、ハイドロパシー指数が±2以内であるアミノ酸を互いに置換し合うことが好ましく、±1以内の置換がより好ましく、±0.5以内の置換が最も好ましい。
本発明のポリペプチドの機能又は生物学的であるか若しくは他の同一性における実質的であるか又は小さな修飾はまた、とりわけ、(a)例えば、シート状若しくは螺旋状の立体構造としての、置換領域内におけるポリペプチド骨格の構造;(b)標的部位における分子の電荷若しくは疎水性;又は(c)側鎖の容量の維持に対するそれらの影響が著明に異なる置換を選択することによっても達成される。天然の残基は、一般的な側鎖特性:(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;(2)中性親水性:cys、ser、thr;(3)酸性:asp、glu;(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;(5)鎖の配向性に影響を与える残基:gly、pro;及び(6)芳香環性:trp、tyr、pheに基づき、群分けされる。
非保存的置換は一般に、これらのクラスのうちの1つであるか又は別のクラスのメンバーの交換を伴う。このように置換された残基はまた、保存的置換部位、又はより好ましくは、残りの(非保存的)部位内に導入することもできる。
例えば、配列番号1、2、3、4、5、及び/又は6に記載のアミノ酸配列中の実施形態において、アミノ酸ロイシン(L)は、代替的に、ロイシン(L)の場合もあり、イソロイシン(I)の場合もあり、アミノ酸アスパラギン酸(D)は、代替的に、アスパラギン酸(D)の場合もあり、アスパラギン(N)の場合もあり、アミノ酸グルタミン(Q)は、代替的に、グルタミン(Q)の場合もあり、リシン(K)の場合もあり、アミノ酸フェニルアラニン(F)は、代替的に、フェニルアラニン(F)の場合もあり、酸化メチオニンの場合もある。
既知の技法の中でも、アラニン走査、オリゴヌクレオチド媒介(部位指向)突然変異誘発、及びPCRによる突然変異誘発など、当技術分野で知られる方法を用いて変異を作製することができる。例えば、部位指向突然変異誘発(例えば、Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)を参照されたい)、カセットによる突然変異誘発(例えば、Wells et al., Gene, 34:315 (1985) を参照されたい)、制限選択による突然変異誘発(例えば、Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986) を参照されたい)、又は他の既知の技法をクローニングされたDNAに実施して、CAE変異体のDNAを作製することができる。走査アミノ酸解析はまた、連続配列に沿った1又は複数のアミノ酸を同定するのにも用いることができる。好ましい走査アミノ酸には、比較的小型で中性のアミノ酸がある。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインが含まれる。アラニンは、ベータ−炭素を超える側鎖を含まず、変異体主鎖の立体構造を変化させる可能性が低いため、この群の中でも典型的に好ましい走査アミノ酸である(例えば、Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)を参照されたい)。アラニンはまた、最も一般的なアミノ酸でもあるため、典型的に好ましい。さらに、アラニンは、埋覆された位置及び露出した位置の両方において見出されることが頻繁である(例えば、Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)を参照されたい)。アラニン置換が十分な量の変異体をもたらさないか、又は結果としてもたらされるポリペプチドのコラン酸分解能が低下するか若しくは存在しない場合は、別のアミノ酸を用いることもできる。
本明細書に記載のポリペプチドに対する共有結合修飾もまた、本発明の範囲内に包含される。例えば、共有結合修飾の1種には、ポリペプチドの標的とされるアミノ酸残基を、ポリペプチドの選択された側鎖又はN末端残基若しくはC末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることが含まれる。二官能性薬剤による誘導体化は、例えば、抗CAE抗体を精製する方法において用いられる、水に不溶性の支持体マトリックス若しくは表面に(1又は複数の)ポリペプチドを架橋するか、又はこの逆の場合に有用である。一般に用いられる架橋剤には、例えば、1,1−ビス(ジアゾアセチル)−2−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、4−アジドサリチル酸を有するエステル、3,3'−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)などのジスクシンイミジルエステルを含めたホモ二官能性イミドエステル、ビス−N−マレイミド−1,8−オクタンなどの二官能性マレイミド、及びメチル−3−[(p−アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートなどの薬剤が含まれる。具体的な一実施形態において、本明細書に記載の特定のポリペプチドのC末端におけるイソロイシンを除去するか又は欠失させ、末端のチロシンを露出させて、これを用いて、例えば、該ポリペプチドを、直接的に、又はスペーサーを介して不溶性のマトリックスに架橋し、アフィニティー樹脂又は固定化樹脂を形成することができる。
他の修飾には、例えば、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基の、それぞれ、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル残基及びトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン側鎖、アルギニン側鎖、及び/又はヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化(例えば、T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)を参照されたい)、N末端アミンのアセチル化、及び任意のC末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
本明細書で記載され、本発明の範囲内に包含されるポリペプチドに対する別種の共有結合修飾は、該ポリペプチドの天然のグリコシル化パターンの変化を含む。一般に、天然のグリコシル化パターンの変化は、ポリペプチド(例えば、全長)配列中に見出される1若しくは複数の炭水化物部分の欠失(内在するグリコシル化部位を除去するか、又は化学的及び/又は酵素的手段によりグリコシル化を欠失させることによる)、及び/又はポリペプチド配列中には存在しない1若しくは複数のグリコシル化部位の付加を伴う。加えて、これには、天然タンパク質のグリコシル化における質的変化が含まれる場合があり、これは、存在しうる各種の炭水化物部分の性質及び比率の対応する変化を伴う。
本発明のポリペプチドに対するグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変化させることにより達成することができる。変化は、例えば、ポリペプチド配列に対する(Oが結合したグリコシル化部位に対する)1若しくは複数のセリン残基若しくはトレオニン残基の付加、又はこれによる置換により作製することができる。本明細書に記載のアミノ酸配列(例えば、配列番号1、配列番号2など)は、DNAレベルでの変化を介して、特に、所望のアミノ酸へと翻訳されるコドンが生成されるように予め選択された塩基においてポリペプチドをコードするDNAを突然変異させることにより、変化させてもよい場合がある。
ポリペプチド上における炭水化物部分の数を増大させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的な結合を介する。このような方法は一般に、当技術分野、例えば、PCT国際公開第WO87/05330号パンフレット、及びAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)において説明されている。
本明細書に記載のポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的若しくは酵素的な形で達成することもでき、グリコシル化の標的として用いられるアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異による置換を介して達成することもできる。化学的な脱グリコシル化法は当技術分野で知られており、例えば、Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) 及びEdge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)により説明されている。ポリペプチド上における炭水化物部分の酵素的な切断は、Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)により説明される各種のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成することができる。
別種の共有結合修飾は、米国特許第4,640,835号明細書;同第4,496,689号明細書;同第4,301,144号明細書;同第4,670,417号明細書;同第4,791,192号明細書;又は同第4,179,337号明細書(これらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる)に示される形で、各種の非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのうちの1つに対する、本明細書に記載のポリペプチドの連結を含む。
付加的又は代替的に、本発明のポリペプチドはまた、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したポリペプチドを含むキメラ分子を形成する形でも修飾することができる。ポリペプチドはまた、それら検出を容易にする試薬によって標識することもできる。例えば、試薬は、蛍光標識(例えば、Prober et al., Science 238:336-340 (1987); Albarella et al.、欧州特許第0144914号明細書);化学標識(例えば、Sheldon et al.、米国特許第4,582,789号明細書;Albarella et al.、米国特許第4,563,417号明細書);及び/又は修飾塩基(例えば、Miyosh et al.、欧州特許第0119448号明細書)(これらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる)と組み合わせることができる。
一実施形態において、このようなキメラ分子は、それに対して抗タグ抗体が選択的に結合するエピトープをもたらす、タグポリペプチドとのポリペプチドの融合を含む。エピトープタグは一般に、ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシル末端に配置される。このようなエピトープタグを付されたポリペプチドの形態の存在は、該タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグを備えることによっても、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する別種のアフィニティーマトリックスを用いるアフィニティー精製を介して、ポリペプチドを容易に精製することが可能となる。各種のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体は、当技術分野でよく知られている。例には、c−mycタグ及びこれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7、及び9E10抗体(例えば、Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985) を参照されたい);flu HAタグポリペプチド及びその抗体である12CA5(例えば、Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988) を参照されたい);単純ヘルペス(Herpes Simplex)ウイルス糖タンパク質D(gD;glycoprotein D)タグ及びその抗体(例えば、Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)を参照されたい);並びにポリヒスチジン(poly−his;poly-histidine)又
はポリヒスチジン−グリシン(poly−his−gly;poly-histidine-glycine)タグが含まれる。他のタグポリペプチドには、α−チューブリンエピトープペプチド(例えば、Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)を参照されたい);FLAG(登録商標)ペプチド(Sigma-Aldrich社(ミズーリ州、セントルイス)製;また、Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)も参照されたい);KT3エピトープペプチド(例えば、Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)を参照されたい);及びT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ(Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990))が含まれる。
単離及び/又は精製を容易にするためには、例えば、当業者によく知られる遺伝子操作法を用いて、本明細書に記載のポリペプチドに、アミノ酸タグを付加することができる。例えば、特定の実施形態において、(1又は複数の)ポリペプチドは、タンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端において、1つの、またより好ましくは6つの連続するヒスチジン残基を包含しうる。このように連続するヒスチジン残基を、一般にヒスチジンタグと称する。末端の連続するヒスチジン残基は、発現した組換えタンパク質の検出及び/又は精製を容易にすることが可能であり、一般に、タンパク質の機能/活性/構造を妨げない。連続するヒスチジン残基は、5'-CAT-3'の3連残基を保有するプライマーを介して、タンパク質をコードする遺伝子内に組み込むことができる。いずれかの末端において連続するヒスチジン残基は、アミノ酸であるヒスチジンが、ニッケル(Ni2+)、亜鉛(Zn2+)、及び銅(Cu2+)などのキレート化遷移金属イオンに結合する能力を利用する、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質の精製に好都合な補助物質として用いられる。上記で言及した通り、他の技法には、T7エピトープ、mycエピトープ、及びV5aエピトープが含まれるがこれらに限定されない、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のエピトープ;また、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ又はマルトース結合タンパク質が含まれるがこれらに限定されない、適切なタンパク質パートナーに対する、本明細書に記載のポリペプチドの融合体が含まれるがこれらに限定されない。具体的な実施形態において、アミノ酸配列は、例えば、GSTタグ、Hisタグ、FLAG(登録商標)タグ、又はXPRESS(商標)タグなど、例えば、タンパク質の単離及び精製を可能とするアフィニティータグを含み;特定の好ましい実施形態において、該アフィニティータグは、Hisタグ(すなわち、1又は複数の、また好ましくは6つのヒスチジン残基)(例えば、配列番号3又は配列番号4を参照されたい)、FLAG(登録商標)オクタペプチド(DYKDDDDK)(例えば、配列番号5を参照されたい)、又はXPRESS(商標)オクタペプチド(DLYDDDK)の1又は複数のコピーを含む。これらのさらなるアミノ酸配列は、ポリペプチドのC末端のほか、ポリペプチドのN末端又はポリペプチド内の介在位置において付加することができる。
代替的な実施形態において、キメラ分子は、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域とのポリペプチドの融合体を含みうる。キメラ分子の2価形態(「イムノアドヘシン」とも称する)の場合なら、このような融合体は、IgG分子のFc領域に対する融合体でありうるであろう。Igの融合体は、Ig分子内における少なくとも1つの可変領域に代えて、ポリペプチドの可溶性形態(膜貫通ドメインを欠失した形態又は不活化形態)による置換を包含することが好ましい。具体的な実施形態において、免疫グロブリン融合体は、IgG1分子のヒンジ領域、CH2領域、及びCH3領域、又はヒンジ領域、CH1領域、CH2領域、及びCH3領域を包含する。免疫グロブリン融合体の作製については、米国特許第5,428,130号明細書;米国特許第6,165,476号明細書;米国特許第6,444,792号明細書;米国特許第7,442,778号明細書;及び米国特許第7,465,447号明細書(これらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる)もまた参照されたい。
ポリペプチドの調製
全長ポリペプチド(例えば、配列番号1に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含めた)及びポリペプチドフラグメント(例えば、配列番号2に対応するアミノ酸配列を含む切断型ポリペプチドを含めた)は、多くの従来の技法のいずれかにより調製することができる。一般に、本発明のポリペプチドは、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターにより形質転換するか、又はこれをトランスフェクトした宿主細胞を培養することにより調製することができる。特定の実施形態において、ベクターは、プラスミド、ウイルス、及びバクテリオファージから選択されるが、ベクターがバクテリオファージであることが、この実施形態ではより好ましい(例えば、実施例2を参照されたい)。ポリペプチドを作製するためのベクター、また特に、ファージによるベクターを調製する方法は、当技術分野でよく知られている。
一般に、細菌などの宿主細胞は、ポリペプチド作製のための、本明細書に記載の発現ベクター又はクローニングベクターをこれにトランスフェクトするか、又は該ベクターによりこれを形質転換し、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適切な形に改変した従来の栄養培地中で培養する。培地、温度、pHなどの培養条件は、過度の実験なしに、当業者により選択されうる。一般に、細胞培養の生産性を最大化するための原理、プロトコール、及び実践的な技法は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 及びSambrook et al., supraにおいて見出すことができる。
例えば、CaCl、CaPO、リポソームを介する方法、及び電気穿孔など、真核細胞のトランスフェクション及び原核細胞の形質転換の方法は当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じ、このような細胞に適する標準的な技法を用いて形質転換を実施する。Sambrook et al., supraで説明される、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、又は、例えば、電気穿孔が、原核生物には一般に用いられる。Shaw et al., Gene, 23:315 (1983);及びPCT国際公開第WO89/05859号パンフレットにより説明される通り、特定の植物細胞の形質転換には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)による感染が用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物細胞には、Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)によるリン酸カルシウム沈殿法を用いることができる。哺乳動物細胞による宿主系のトランスフェクションの一般的な態様も、米国特許第4,399,216号明細書(参照により本明細書に組み込まれる)において同様に説明されている。酵母内への形質転換は、Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) 及びHsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法により実施することが典型的である。しかし、核内へのマイクロインジェクション、電気穿孔、完全細胞との細菌プロトプラストの融合、又はポリカチオン、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなどによりDNAを細胞内に導入する他の方法もまた用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換する各種の技法については、Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 及びMansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)を参照されたい。
本明細書に記載のベクター内においてDNAをクローニング又は発現するのに適する宿主細胞には、原核細胞、酵母、又はより高等な真核細胞が含まれる。適切な原核動物には、エシェリキア(Escherichia)属、例えば、大腸菌、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、プロテウス(Proteus)属、サルモネラ(Salmonella)属、例えば、腸チフス菌(Salmonella typhimurium)、セラチア(Serratia)属、例えば、霊菌(Serratia marcescans)、及び赤痢菌(Shigella)属などの腸内細菌科のほか、枯草菌(B. subtilis)及びバチルス・リケニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、旧東ドイツ特許第266,710号明細書で開示されるバチルス・リケニフォルミス41P菌株)などのバチルス(Bacilli)属、緑膿菌(P. aeruginosa)などのシュードモナス(Pseudomonas)属、及びストレプトミセス(Streptomyces)属が含まれるがこれらに限定されない。宿主細胞は、最小量のタンパク質溶解酵素を分泌することが好ましい。例えば、菌株を改変して、宿主に内因的なタンパク質をコードする遺伝子内における遺伝子の突然変異を実行させることができる(例えば、米国特許第4,946,783号明細書を参照されたい)。代替的に、インビトロにおけるクローニングの方法、例えば、PCR又は他の核酸ポリメラーゼ反応も適する。
本発明のポリペプチドを作製するのに好ましい宿主細胞は原核細胞であるが、真正細菌及び古細菌を含めた細菌がより好ましい。グラム陽性菌及びグラム陰性菌を含めた真正細菌がこれらのうちで好ましい。グラム陰性菌がより好ましい。細菌の好ましい1種は、腸内細菌科である。腸内細菌科に属する細菌の例には、エシェリキア属、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、及び赤痢菌属が含まれる。適切な細菌の他の種類には、アゾトバクター(Azotobacter)属、シュードモナス属、リゾビウム(Rhizobia)属、ビトレオシラ(Vitreoscilla)属、パラコッカス(Paracoccus)属が含まれる。本明細書では、大腸菌が特に好ましい。
本発明のポリペプチドを作製するのに用いられる原核細胞は、Sambrook et al., supraにより一般に説明される培地を含めた、当技術分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適する培地中で増殖させる。細菌に適する培地には、AP5培地、栄養培地、ルリア−ベルターニ(LB;Luria-Bertani)培地、ナイトハルト最小培地、及びC.R.A.P.最小培地又はC.R.A.P.完全培地(例えば、米国特許第6,828,121号明細書を参照されたい)、並びに必要な栄養補充物質が含まれるがこれらに限定されない。培地はまた、発現ベクターを含有する原核細胞の増殖を選択的に可能とする、発現ベクターの構築に基づいて選択される選択剤も含有しうる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞を増殖させるための培地には、アンピシリンを添加する。炭素、窒素、及び無機リン酸の供給源以外の任意の必要な補充物質もまた、単独で、又は複合体による窒素供給源など、別の補充物質又は培地との混合物として、適切な濃度で包含されうる。培地はまた、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコール酸、ジチオエリトリトール、及びジチオトレイトールからなる群から選択される1又は複数の還元剤を含有してもよい場合もある。原核宿主細胞は、適切な温度で培養される。例えば、大腸菌を増殖させる場合、好ましい温度は、約20℃〜約39℃、より好ましくは約25℃〜約37℃の範囲であり、さらにより好ましくは約30℃である。任意の必要な補充物質もまた、単独で、又は複合体による窒素供給源など、別の補充物質又は培地との混合物として、適切な濃度で包含されうる。培地のpHは、主に宿主生物に応じて、約5.9以上の任意のpHでありうる。大腸菌の場合、pHは、約6.8〜約7.4であることが好ましく、約7.0であることがより好ましい。
原核微生物に加えて、糸状真菌又は酵母などの真核微生物も、ポリペプチドをコードするベクターに適するクローニング宿主又は発現宿主である。出芽酵母(Saccaromyces serevisiae)は、一般的に用いられる、下等の真核宿主微生物である。他の従来の宿主微生物には、例えば、ニューロスポラ(Neurospora)属の宿主、アオカビ(Penicillium)属の宿主、トリポクラジウム(Tolypocladium)属の宿主(国際公開第WO91/00357号パンフレット)、並びに偽巣性コウジ菌(A. nidulans)(Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984))及び ク
ロコウジカビ(A. niger)(Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985))など、アスペルギルス(Aspergillus)属の宿主などの糸状菌;例えば、K.ラクチス(K. lactis)(MW98−8C菌株、CBS683菌株、CBS4574菌株;Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 (1983))、K.フラジリス(K. fragilis)(ATCC 12,424)、K.ブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、K.ウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、K.ワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、K.ドロソフィラールム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906;Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990))、K.テルモトレランス(K. thermotolerans)、及びK.マルキシアーヌス(K. marxianus)など、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属の宿主(米国特許第4,943,529号明細書;Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991));ヤロウィア(yarrowia)属(欧州特許第0402226号明細書);メタノール資化酵母(Pichia pastoris)(欧州特許第0183070号明細書;Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988));カンジダ(Candida)属;トリコデルマ・レーセイ(Trichoderma reeseia)(欧州特許第0244234号明細書);アカパンカビ(Neurospora crassa)(Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979));分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach and Nurse, Nature, 290: 140 (1981);欧州特許第0139383号明細書);及びシュワニオミセス・オキシデンターリス(Schwanniomyces occidentalis)(欧州特許第0394538号明細書)などのシュワニオミセス(Schwanniomyces)属が含まれる。
メチロトロープ酵母もまた適切であり、これらには、ハンセヌラ(Hansenula)属、カンジダ(Candida)属、クロエケラ(Kloeckera)属、ピキア(Pichia)属、サッカロミセス(Saccharomyces)属、トルロプシス(Torulopsis)属、及びロドトルーラ(Rhodotorula)属からなる属から選択される、メタノールにより増殖可能な酵母が含まれるがこれらに限定されない。酵母のこのクラスを例示する代表的な種は、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)において見出すことができる。
グリコシル化ポリペプチドの発現に適する宿主細胞は一般に、多細胞生物に由来する。非脊椎動物細胞の例には、ショウジョウバエ(Drosophila)属S2細胞及びスポドプテラ(Spodoptera)属Sf9細胞などの昆虫細胞のほか、植物細胞も含まれる。有用な哺乳動物の宿主細胞株の例には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO;Chinese hamster ovary)細胞及びCOS細胞が含まれる。より具体的な例には、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO細胞;Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));ヒト胎児腎細胞株(293細胞、又は懸濁培養液中においてサブクローニングして増殖させた293細胞;Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977));ヒト肝細胞(Hep G2細胞、HB 8065細胞);ヒト肺細胞(W138細胞;ATCC CCL 75);SV40ウイルスにより形質転換されたサル腎細胞CV1株(COS−7細胞;ATCC CRL 1651);マウスセルトリ細胞(TM4細胞;Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));及びマウス乳癌細胞(MMT 060562細胞、ATCC CCL51)が含まれる。適切な宿主細胞の選択は、当技術分野内にあるものとみなされる。
同定されると、標的ポリペプチドをコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)を、クローニング(DNAの増幅)又は発現のための複製可能なベクター内へと挿入することができるが、各種のベクターが市販されている。例えば、ベクターは、コスミド、プラスミド、ファージ、又はウイルス粒子の形態でありうる。この目的には多くのベクターが使用可能であり、適切なベクターの選択は主に、ベクター内へと挿入される核酸のサイズ、及び該ベクターにより形質転換される特定の宿主細胞に依存する。適切な核酸配列(以下に記載の配列など)は、各種の手順によりベクター内へと挿入することができる。一般に、DNAは、当技術分野で知られる技法を用いて、(1又は複数の)適切な制限エンドヌクレアーゼ部位内へと挿入される。ベクターの構成要素には一般に、1又は複数のシグナル配列、複製起点、1又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列が含まれるがこれらに限定されない。これらの構成要素のうちの1又は複数を含有する適切なベクターの構築は、当業者に知られる標準的なライゲーション法を用いる。
ポリペプチドは、直接的に組換え作製することができるだけでなく、成熟タンパク質又は成熟ポリペプチドのN末端において特定の切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドでありうる、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え作製することができる。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成要素の場合もあり、ベクター内に挿入されるポリペプチドをコードするDNAの一部の場合もある。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp、又は熱安定性腸エンドトキシンIIリーダー配列からなる群から選択される、原核細胞のシグナル配列でありうる。例えば、酵母の分泌の場合、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー配列、アルファ因子リーダー配列(サッカロミセス属及びクルイベロミセス属のα因子リーダー配列を含めた;後者は、米国特許第5,010,182号明細書に記載される)、又は酸ホスファターゼリーダー配列、C.アルビカンス(C. albicans)グルコアミラーゼリーダー配列(欧州特許第0362179号明細書)、又はPCT国際公開第WO90/13646号パンフレットに記載のシグナル配列でありうる。哺乳動物の細胞発現の場合、同じであるか又は類縁の種により分泌されるポリペプチドに由来するシグナル配列など、哺乳動物のシグナル配列のほか、ウイルスの分泌リーダー配列も用いて、タンパク質の分泌を誘導することができる。
発現ベクター及びクローニングベクターはいずれも、1又は複数の選択された宿主細胞内においてベクターが複製されることを可能とする核酸配列を含有する。このような配列は、各種の細菌、酵母、及びウイルスについてよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製起点は、大半のグラム陰性菌に適し、2μプラスミドによる起点は酵母に適し、各種のウイルス(SV40ウイルス、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVウイルス、又はBPVウイルス)による起点は、哺乳動物細胞内におけるクローニングベクターに有用である。
発現ベクター及びクローニングベクターはまた、当技術分野において選択マーカーとも称する選択遺伝子も含有しうる。典型的な選択遺伝子は、(a)栄養要求性欠損を補完するタンパク質;(b)抗生剤又は他の薬物若しくは毒素、例えば、アンピシリン、G418、ハイグロマイシン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質;或いは(c)複合培地からは得られない極めて重要な栄養素を供給するタンパク質(例えば、バチルス属にとってのD−アラニンラセマーゼ)をコードする。
哺乳動物細胞に適する選択マーカーの一例は、DHFR又はチミジンキナーゼなど、コラン酸分解ポリペプチドをコードする核酸を取り込むコンピテント細胞の同定を可能とするマーカーである。野生型のDHFRを用いる場合に適切な宿主細胞は、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)により説明される通りに調製して増殖させる、DHFR活性が欠損するCHO細胞株である。酵母において用いるのに適する選択遺伝子は、酵母プラスミドYRp7中に存在するtrp1遺伝子である(例えば、Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)を参照されたい)。trp1遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えば、ATCC 44076又はPEP4−1株の選択マーカーをもたらす(例えば、Jones, Genetics, 85:12 (1977)を参照されたい)。
発現ベクター及びクローニングベクターは通常、mRNA合成を誘導する、ポリペプチドをコードする核酸配列に作動的に連結されたプロモーターを含有する。各種の潜在的な宿主細胞により認識されるプロモーターはよく知られている。原核宿主細胞と共に用いるのに適するプロモーターには、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系(例えば、Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980);欧州特許第0036776号明細書);β−ラクタマーゼ系及びラクトースプロモーター系(例えば、Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979));tacプロモーターなどのハイブリッドプロモーター(例えば、deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)を参照されたい)が含まれる。細菌系で用いられるプロモーターはまた、標的のポリペプチドをコードするDNAに作動的に連結されるシャイン−ダルガーノ(S.D.;Shine-Dalgarno)配列も含有しうる。
酵母宿主と共に用いるのに適するプロモーティング配列の例には、3−ホスホグリセリン酸キナーゼ(Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980))のプロモーター、又はエノラーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、3−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、及びトリオースリン酸イソメラーゼなど、他の解糖酵素(Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978))のプロモーターが含まれる。増殖条件により制御される、転写のためのさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、酸ホスファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ2、窒素代謝と関連する分解性酵素、マルトース及びガラクトースの有用性の一因となる酵素、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、イソチトクロームC、及びメタロチオネインのプロモーター領域である。酵母の発現で用いるのに適するベクター及びプロモーターは、欧州特許第0073657号においてさらに説明されている。
哺乳動物宿主細胞内におけるベクターからの標的ポリペプチドの転写は、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合的である場合、例えば、アデノウイルス(アデノウイルス2など)、トリ肉腫ウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス、鶏痘ウイルス(例えば、英国特許第2,211,504号明細書を参照されたい)、B型肝炎ウイルス、ポリオーマウイルス、レトロウイルス、及びサルウイルス40(SV40;Simian Virus 40)など、ウイルスのゲノムから得られるプロモーター、又は異種哺乳動物プロモーター(例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター)から得られるプロモーター、及び/又は熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御される。
多くの場合、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することにより、高等真核生物による、標的ポリペプチドをコードするDNAの転写を増大させることができる。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増大させる、典型的には約10〜300bpの、DNAに対するシス作用型エレメントである。哺乳動物遺伝子(アルブミン遺伝子、α−フェトタンパク質遺伝子、エラスターゼ遺伝子、グロブリン遺伝子、及びインスリン遺伝子)に由来する多数のエンハンサー配列が知られている。真核細胞ウイルスに由来するエンハンサーを用いることが典型的である。非限定的な例には、複製起点の後期側(bp100〜270)にあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ポリペプチドをコードする配列に対する5'側又は3’側の位置、典型的にはプロモーターから5’側の部位に配置されてベクター内へとスプライスされうる。
原核生物(例えば、細菌)及び/又は真核宿主細胞(酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、又は他の多細胞生物に由来する有核細胞)において用いられる発現ベクターはまた、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含有する。このような配列は一般に、原核生物、真核生物、又はウイルスのDNA又はcDNAの5’側の非翻訳領域、及び場合により3’側の非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、所望のポリペプチドをコードするmRNAの非翻訳部分内におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。組換え脊椎動物細胞の培養物中におけるポリペプチドの合成に対する適合化に適するさらに他の方法、ベクター、及び宿主細胞は、Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979);欧州特許第0117060号明細書;及び欧州特許第0117058号明細書において説明されている。
遺伝子の増幅及び/又は発現は、例えば、本明細書で提供される配列に基づく、適切に標識されたプローブを用いる、従来のサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法(例えば、Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)を参照されたい)、ドットブロット法(DNA解析)、又はインサイチュハイブリダイゼーションにより、試料中において直接測定することができる。代替的に、DNA二重鎖、RNA二重鎖、及びDNA−RNAハイブリッド二重鎖、又はDNA−タンパク質二重鎖を含めた、特定の二重鎖を認識しうる抗体も用いることができる。抗体には標識化が可能であり、また、二重鎖を表面に結合させる場合は、該表面上において二重鎖が形成されると、該二重鎖に結合した抗体の存在が検出されるように、アッセイを実施することができる。
代替的に、遺伝子の発現は、細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色、及び細胞培養物又は体液に対するアッセイなど、遺伝子産物の発現を直接的に定量化する免疫学的方法によって測定することもできる。免疫組織化学染色及び/又は体液試料に対するアッセイに有用な抗体は、モノクローナル抗体の場合もポリクローナル抗体の場合もあり、また、任意の哺乳動物内において調製することができる。抗体は、全長配列のポリペプチドに対して調製される場合もあり、本明細書で提供されるDNA配列に基づく切断型ペプチド又はフラグメントペプチドに対して調製される場合もあり、CAE DNAに融合し、特異的な抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製される場合もある。
ポリペプチドの形態は、培地から回収することもでき、宿主細胞の溶解物から回収することもできる。膜結合型の場合、適切な界面活性剤溶液(例えば、Triton-X 100)を用いて、又は酵素的切断により膜から放出させることができる。ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結−融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤など、各種の物理的又は化学的手段により破壊することができる。組換え細胞のタンパク質又はポリペプチドから、(1又は複数の)ポリペプチドを精製することが望ましい場合がある。適切な精製手順の例は、硫酸アンモニウム沈殿;等電点電気泳動;シリカ上又はDEAEなどの陽イオン交換樹脂上におけるクロマトグラフィー;エタノール沈殿;イオン交換カラムに対する分別;例えば、Sephadex G-75を用いるゲル濾過;ポリペプチドのエピトープタグを付した形態に結合する金属キレート化カラム;IgGなどのコンタミネーション物質を除去する、プロテインAによるSepharoseカラム;逆相HPLC;及びSDS−PAGEである。タンパク質精製のための各種の方法を用いることができ、このような方法は当技術分野で知られており、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)において説明されている。一般に、実施される(1又は複数の)精製ステップは、例えば、作製方法、作製される特定のポリペプチド、該ポリペプチドの(1又は複数の)下流における使用の性質に依存する。
例えば、代替的に、所望のペプチド及びそれらのフラグメントは、化学的に合成することもでき、天然の供給源である(1又は複数の)生物から抽出することもできる。別の代替的な手法は、酵素的消化により、例えば、特定のアミノ酸残基により規定される部位においてタンパク質を切断することが知られる酵素によりタンパク質を処理することにより、又はDNAを適切な制限酵素により消化させ、所望のフラグメントを単離することにより、ポリペプチド及びそれらのフラグメントを生成させるステップを伴う。さらに別の適切な技法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、所望のポリペプチド若しくはポリペプチドフラグメントをコードするDNA配列又はフラグメントを単離及び増幅するステップを伴う。PCRの5’プライマー及び3’プライマーには、DNAの所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドが用いられる。ポリペプチドがポリペプチドフラグメントである場合、該ポリペプチドフラグメントは、本明細書で開示される天然(すなわち、全長)ポリペプチドと、少なくとも1つの生物学的活性及び/又は免疫学的活性を共有することが好ましい。特定の場合において、ポリペプチドフラグメントは、全長ポリペプチドより大きな活性を示す場合もあり、全長ポリペプチドと比べ、別の形で最適化又は改善される場合もある。
本明細書に記載のポリペプチドを調製するには、当技術分野でよく知られる他の代替的な方法もまた用いることができる。例えば、ポリペプチド配列又はその一部は、固相法を用いる直接的なペプチド合成により作製することができる(例えば、Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)を参照されたい)。インビトロにおけるタンパク質合成は、自動化法を用いて実施することもでき、手動法により実施することもできる。自動化法による合成は、例えば、製造元の指示書に従いApplied Biosystems社製ペプチド合成器(カリフォルニア州、フォスターシティー)を用いて達成することができる。本明細書に記載のポリペプチドの各部分を個別に化学合成し、化学的又は酵素的方法を用いて組み合わせて、全長ポリペプチド、切断型ポリペプチド、又は他の変異体ポリペプチドを作製することができる。
ポリヌクレオチド
本開示の別の態様は、コラン酸分解(CAE)活性を有するポリペプチド若しくは酵素及び/又はCAE関連タンパク質及びそのフラグメント(上記で説明した)をコードするポリヌクレオチド、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド体、及びに関連分子;本明細書に記載のポリヌクレオチド若しくはmRNA配列又はその一部に相補的なポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド;並びにCAEをコードするポリヌクレオチド又は同mRNAにハイブリダイズするポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含めた単離形態であることが好ましい、ポリヌクレオチド及びこれらのフラグメント、並びにこれらの部分的若しくは完全な相補体、mRNA、及び/又はコード配列を提供する。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、一般に配列番号7に対応する核酸配列及びその相補体を含む。他の特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、一般に配列番号8に対応する核酸配列を含む。ポリヌクレオチドは、単離ポリヌクレオチドであることが好ましい。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、組換えポリヌクレオチドである。
本明細書では、ポリヌクレオチドの変異体もまた提供される。上記で説明した通り、ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの活性が実質的に低下しないように、1又は複数の置換、付加、欠失、及び/又は挿入を含有しうる。ポリヌクレオチドの活性に対する影響は一般に、本明細書に記載の通りに評価することもでき、従来の方法を用いて評価することもできる。一般に、ポリヌクレオチドの変異体は、本明細書で開示される、コラン酸分解活性を有する全長ポリペプチド若しくは切断型ポリペプチド、又は本明細書で開示される全長ポリペプチド若しくは切断型ポリペプチドの他の任意のフラグメントをコードする核酸配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する。変異体は、エンドトキシン分解能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の部分に対して、少なくとも約85%、87%、88%、又は89%の同一性を示すことが好ましく、また、少なくとも90%、92%、95%、96%、又は97%の同一性を示すことがより好ましい。百分率による同一性は、NCBIのウェブサイトで入手可能であり、本明細書の別の箇所で説明されるAlignアルゴリズム又はBLASTアルゴリズム(例えば、Altschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991; Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992を参照されたい)など、当業者によく知られるコンピュータアルゴリズムを用いることを含めた、任意の方法を用いて、ポリヌクレオチドの配列を、標的ポリヌクレオチドの対応する部分と比較することにより容易に決定することができる。
通常、変異体のポリヌクレオチドは、本明細書で開示される全長ポリペプチド配列をコードする核酸配列(例えば、配列番号7)と、少なくとも約80%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約81%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約82%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約83%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約84%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約85%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約86%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約87%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約88%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約89%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約90%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約91%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約92%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約93%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約94%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約95%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約96%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約97%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約98%の核酸配列同一性、また代替的に、少なくとも約99%の核酸配列同一性を有する。
切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの場合、ポリヌクレオチド変異体は通常、本明細書で開示される切断型ポリペプチド配列をコードする核酸配列(例えば、配列番号8)と、少なくとも約80%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約81%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約82%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約83%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約84%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約85%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約86%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約87%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約88%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約89%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約90%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約91%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約92%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約93%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約94%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約95%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約96%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約97%の核酸配列同一性、代替的に、少なくとも約98%の核酸配列同一性、また代替的に、少なくとも約99%の核酸配列同一性を有する。
一実施形態において、核酸分子は、配列番号7に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を共有する。例えば、核酸分子は、配列番号7に示される核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を共有する場合もあり、配列番号7に示される核酸配列と少なくとも98%の配列同一性を共有する場合もある。具体的な実施形態において、核酸分子は、配列番号7に示される配列を有する;すなわち、核酸分子は、配列番号7に示される核酸配列と100%の配列同一性を示す。
別の実施形態において、核酸分子は、配列番号8に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を共有する。例えば、核酸分子は、配列番号8に示される核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を共有する場合もあり、配列番号8に示される核酸配列と少なくとも98%の配列同一性を共有する場合もある。具体的な実施形態において、核酸分子は、配列番号8に示される配列を有する;すなわち、核酸分子は、配列番号8に示される核酸配列と100%の配列同一性を示す。
特定のポリヌクレオチド及びその変異体は、所望の標的ポリペプチドをコードする天然遺伝子の部分に対して実質的に相同的である。このようなポリヌクレオチド及び変異体に由来する一本鎖核酸(例えば、熱変性による)は、中程度にストリンジェントな条件下で、天然の標的ポリペプチドをコードする、天然のDNA配列又はRNA配列にハイブリダイズすることが可能である。中程度にストリンジェントな条件下で検出可能な形でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、特定の標的ポリヌクレオチドに対して相補的な、少なくとも10の連続ヌクレオチド、例えば、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500以上の連続ヌクレオチドを包含するヌクレオチド配列を有しうる。特定の好ましい実施形態において、このような配列(又はその相補体)は、その発現に対する妨害が所望される、特定の単一の標的ポリペプチドに固有であり、他の特定の実施形態において、該配列(又はその相補体)は、そのポリペプチド発現に対する妨害が所望される、2つ以上の類縁の標的ポリペプチドにより共有されうる。
本発明の配列特異的なヌクレオチドは、いくつかの基準のうちの1又は複数を用いてデザインすることができる。例えば、所望のポリペプチド(例えば、本明細書に記載のポリペプチドなど、コラン酸分解活性を有するポリペプチド)をコードする配列に対して同一な10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600以上の連続ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドをデザインするには、以下の特徴:(1)約1:1であるが、2:1又は1:2を超えないA+T/G+C比;(2)5'端におけるAAジヌクレオチド又はCAジヌクレオチド;(3)55℃未満である内部ヘアピンループの融解温度;(4)37℃未満であるホモ二量体の融解温度((3)及び(4)に記載の融解温度の計算は、当業者に知られるコンピュータソフトウェアを用いて決定することができる);(5)他の任意の既知のポリヌクレオチド配列内に存在すると同定されていない、少なくとも10〜20の連続ヌクレオチド配列(このような評価は、BLASTなど、公表されているデータベースを検索するのに当業者に利用可能なコンピュータプログラムを用いて容易に決定することができる)のうちの1又は複数を有する配列について、ポリヌクレオチド配列のオープンリーディングフレームを走査することができる。代替的に、ポリヌクレオチド配列は、各販売元(例えば、OligoEngine(商標)社(ワシントン州、シアトル);Dharmacon社(コロラド州、ラファイエット); Ambion社(テキサス州、オースチン);及びQIAGEN社(カリフォルニア州、バレンシア))から市販されているコンピュータソフトウェアを用いて、デザイン及び選択することができる。また、Elbashir et al., Genes & Development 15:188-200 (2000); Elbashir et al., Nature 411:494-98 (2001)も参照されたい。次いで、所望のポリヌクレオチドを、当技術分野で知られる方法に従い、それらが標的のポリヌクレオチドをコードする能力、所望の他のポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力、又は標的ポリペプチドの発現を妨げる能力について調べることができるが、これらの試験に基づく、特定のポリヌクレオチドの有効性の決定は、当業者に明らかであろう。
当業者はまた、遺伝子コードの縮重の結果として、多くのヌクレオチド配列が、本明細書に記載のポリペプチドをコードしうることも理解するであろう。すなわち、アミノ酸は、いくつかの異なるコドンのうちの1つによりコードされる可能性があり、1つの特定のヌクレオチド配列が別の配列と異なりうる(本明細書で開示され、当技術分野で知られるアライメント法により決定することができる)一方で、該配列は、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしうることを、当業者は容易に確認することができる。例として述べると、ポリペプチド中のアミノ酸ロイシンは、セリンの場合(TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、及びAGC)と同様、6つの異なるコドン(TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、及びCTG)のうちの1つによりコードされうる。例えば、プロリン、アラニン、及びバリンなど、他のアミノ酸も、異なる4つのコドン(プロリンの場合はCCT、CCC、CCA、CCG;アラニンの場合はGCT、GCC、GCA、GCG;また、バリンの場合はGTT、GTC、GTA、GTG)のうちの任意の1つによりコードされうる。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対する最小限の相同性を保有する。にもかかわらず、本発明では、コドンの使用の差違に起因して異なるポリヌクレオチドが具体的に意図される。
ポリヌクレオチドはまた、コドンを最適化した配列、すなわち、使用頻度が約20%未満の任意のコドンを置換することにより、特定の宿主種について最適化されたヌクレオチド配列も含みうる。コドンの最適化に加えた、誤ったポリアデニル化配列の除去、エキソン/イントロンスプライシングシグナル配列の除去、トランスポゾン様反復配列の除去、及び/又はGC含量の最適化により、所与の宿主種における発現について最適化されたヌクレオチド配列を、当技術分野では一般に、発現増強配列と称する。
ポリヌクレオチドはまた、それらの検出を容易にする試薬により標識することもできる。例えば、試薬は、蛍光標識(例えば、Prober et al., Science 238:336-340 (1987); Albarella et al.、欧州特許第0144914号明細書);化学標識(例えば、Sheldon et al.、米国特許第4,582,789号明細書;Albarella et al.、米国特許第4,563,417号明細書);及び/又は修飾塩基(例えば、Miyosh et al.、欧州特許第0119448号明細書)(これらの各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)と組み合わせることができる。
本発明のポリヌクレオチド又はそれらのフラグメントはまた一般に、特定の状況下で他の核酸分子に特異的にハイブリダイズすることも可能である。例えば、2つの核酸分子が、アンチパラレルな二本鎖核酸構造を形成することが可能な場合、該2つの分子は、互いに対して特異的にハイブリダイズ可能であると言われる。核酸分子又はポリヌクレオチドは、それらが完全な相補性を示す場合、別の核酸分子又はポリヌクレオチドの相補配列であると言われる。一方の分子の各ヌクレオチドが、他方の分子のヌクレオチドに対して相補的である場合、該分子は、完全な相補性を示すと言われる。2つの分子は、それらが、少なくとも従来の低度のストリンジェンシーの条件下で互いに対してアニールした状態を保つことを可能とするのに十分な安定性を伴って、互いに対してハイブリダイズしうる場合、最小限に相補的であると言われる。同様に、分子は、それらが、従来の高度のストリンジェンシーの条件下で互いに対してアニールした状態を保つことを可能とするのに十分な安定性を伴って、互いに対してハイブリダイズしうる場合も、相補的であると言われる。従来のストリンジェンシーの条件は、本明細書の他の箇所において、また、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989);及びHaymes et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)により説明されている。したがって、完全な相補性からの逸脱は、このような逸脱が、二本鎖構造を形成する分子の能力を完全には無効化しない限りにおいて許容される。したがって、核酸分子が、プライマー又はプローブとして用いられるためには、用いられる特定の溶媒及び塩濃度の下で安定的な二本鎖構造を形成するのに十分な程度に配列が相補的であることだけが必要である。
具体的な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、中程度にストリンジェントな条件下で、配列番号7及び配列番号8のうちの1又は複数に特異的にハイブリダイズする。
ポリヌクレオチドの調製
コラン酸分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めたポリヌクレオチドは、具体的に所望されるポリヌクレオチドの調製に有用であり、また、ポリヌクレオチド内で用いられるのに望ましい配列の同定及び選択にも有用な各種の技法のいずれかを用いて調製することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、適切な細菌、細胞、又は組織型から調製されたcDNAから増幅することができる。このようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅することができる。この手法の場合、配列特異的なプライマーは、本明細書で提供される配列に基づいてデザインすることができるが、また、購入することもでき、合成することもできる。増幅された部分は、よく知られた技法を用いて、適切なライブラリーから、全長遺伝子又はその所望の部分を単離するのに用いることができる。増幅に適する1又は複数のポリヌクレオチドプローブ又はポリヌクレオチドプライマーを用いて、ライブラリー(cDNAライブラリー又はゲノムライブラリー)をスクリーニングすることは、このような技法内にある。より大型の分子を包含するように、ライブラリーをサイズ選択することが好ましい。遺伝子の5’側領域及び上流領域を同定するには、ランダムプライミングされたライブラリー(random primed libraries)もまた好ましい。イントロンを得、5’側配列を伸長させるには、ゲノムライブラリーが好ましい。本発明により意図されるポリヌクレオチドに適する配列はまた、ポリヌクレオチド配列のライブラリーからも選択することができる。
ハイブリダイゼーション法の場合、よく知られた技法を用いて(例えば、ニック翻訳又は32Pによる末端標識を介して)、部分的な配列を標識することができる。次いで、変性した細菌コロニーを含有するフィルター(又はファージプラークを含有するローン)を、標識したプローブとハイブリダイズさせることにより、細菌ライブラリー又はバクテリオファージライブラリーをスクリーニングすることができる(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001を参照されたい)。ハイブリダイズするコロニー又はプラークを選択し、増殖させ、DNAを単離し、さらなる解析を行う。例えば、部分配列に由来するプライマー及びベクターに由来するプライマーを用いるPCRによりクローンを解析して、付加する配列の量を決定することができる。重複する1又は複数のクローンを同定するために、制限マップ及び部分配列を作製することができる。よく知られた技法を用いて適切なフラグメントをライゲーションすることにより、全長のcDNA分子を作製することができる。
代替的に、部分的なcDNA配列から、全長のコード配列を得るための、多数の増幅法も当技術分野では知られている。増幅が一般にPCRを介して実施されることは、このような技法内にある。このような技法の1つは、cDNA端の急速増幅又はRACEとして知られている。この技法は、ポリA領域又はベクター配列にハイブリダイズする内部プライマー及び外部プライマーの使用による、既知の配列の5’側及び3’側である配列の同定を伴う。市販される各種のキットのいずれかを用いて、増幅ステップを実施することができる。プライマーは、例えば、当技術分野でよく知られるソフトウェアを用いてデザインすることができる。プライマー(又は、例えば、プローブ及びアンチセンスのオリゴヌクレオチドを含めた、本明細書で意図される他の使用のためのオリゴヌクレオチド)は、長さが15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、又は32ヌクレオチドであり、GC含量が少なくとも40%であり、約54℃〜72度の温度で標的配列にアニールする。増幅される領域は、上記で説明される通りに配列決定することができ、重複配列は連続配列へと構築することができる。本発明により、一部の好ましい実施形態のために意図される特定のオリゴヌクレオチドは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33〜35、35〜40、41〜45、46〜50、56〜60、61〜70、71〜80、81〜90ヌクレオチド以上の長さであり得る。
本明細書に記載のヌクレオチド配列は、確立された組換えDNA法を用いて、他の各種のヌクレオチド配列に接合することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、プラスミド、ファージミド、ラムダファージ派生物、及びコスミドを含めた各種のクローニングベクターのいずれかの中へとクローニングすることができる。特に所望のベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが含まれる。一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物において機能的な複製起点、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1又は複数の選択マーカーを含有する(例えば、PCT国際公開第WO01/96584号パンフレット;PCT国際公開第WO01/29058号パンフレット;米国特許第6,326,193号明細書;米国出願公開第2002/0007051号明細書(これらの各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を参照されたい)。他のエレメントは所望の使用に依存するが、当業者には明らかであろう。例えば、本発明は、CAEポリペプチドなど、所望の標的ポリペプチドを発現させるためのベクターを含めた、組換え核酸構築物の調製におけるポリヌクレオチド配列の使用を意図するが、本発明はまた、トランスジェニック動物及びトランスジェニック細胞(例えば、その中における、1又は複数の所望のポリペプチド(例えば、標的のポリペプチド)の発現が容易となる細胞、細胞クローン、細胞株若しくは細胞系統、又は生物)も意図する。哺乳動物細胞内への侵入及びその中における発現を可能とするようにポリヌクレオチドを製剤化しうることは、特定の実施形態内にある。以下で説明する通り、このような製剤は、治療的な目的で特に有用である。標的細胞内におけるポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドの発現を達成する多くの方法が存在し、任意の適切な方法を用いうることを、当業者は理解するであろう。例えば、よく知られた技法を用いて、ポリヌクレオチドをウイルスベクター内へと組み込むことができる(例えば、米国出願公開第2003/0068821号明細書(その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい)。ウイルスベクターはさらに、選択マーカー(形質導入された細胞の同定又は選択において補助となる)の遺伝子、及び/又は、特異的な標的細胞上における受容体のリガンドをコードする遺伝子など、標的化部分の遺伝子を導入するか又は組み込んで、該ベクターを標的特異的とすることができる。標的化はまた、当業者に知られる方法により、抗体を用いて達成することもできる。
他の実施形態では、標準的な技法を用いて、1又は複数のプロモーターを同定し、単離し、かつ/又は本発明の組換え核酸構築物内へと組み込むことができる。本発明は、このようなプロモーター配列又は該配列の1若しくは複数のシス作用型若しくはトランス作用型の調節エレメントを含む核酸分子を提供する。このような調節エレメントは、本明細書に記載のポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を増強しうる。本明細書で提供されるゲノム配列に基づく標準的な技法を用いて、5’側の隣接領域を作製することができる。必要な場合は、PCRベースであるか又は他の標準的な方法を用いて、さらなる5’側配列を作製することができる。5’側領域は、標準的な方法を用いてサブクローニング及び配列決定することができる。プライマー伸長解析及び/又はRNアーゼ保護解析を用いて、cDNAから推測される転写開始部位を検証することができる。
プロモーター領域の境界を画定するには、様々なサイズの推定プロモーター挿入配列を、プロモーター又はエンハンサーを含まない適切なレポーター遺伝子を含有する異種発現系内へとサブクローニングすることができる。適切なレポーター遺伝子には、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子が含まれうる(例えば、Ui-Tei et al., FEBS Lett. 479:79-82 (2000)を参照されたい)。適切な発現系はよく知られており、よく知られた技法を用いて調製することもでき、市販品を購入することもできる。内部欠失構築物は、固有の内部制限部位を用いて作製することもでき、非固有の制限部位に対する部分的な消化により作製することもできる。次いで、構築物を、高レベルのポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドの発現を示す細胞内へとトランスフェクトすることができる。一般に、最小限の5’側隣接領域により最高レベルのレポーター遺伝子発現を示す構築物が、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結して、プロモーターにより誘導される転写を調節する能力について薬剤を評価するのに用いることができる。
機能的なプロモーターを同定したら、シス作用型及びトランス作用型のエレメントを位置特定することができる。シス作用型配列は一般に、既に特徴づけられた転写モチーフに対する相同性に基づき同定することができる。次いで、同定された配列内において点突然変異を発生させ、このような配列の調節的役割を評価することができる。このような突然変異は、部位特異的な突然変異誘発法又はPCRベースの戦略を用いて発生させることができる。次いで、上記で説明した通りに、変化させたプロモーターを、レポーター遺伝子の発現ベクター内へとクローニングし、レポーター遺伝子の発現に対する突然変異の影響を評価する。
抗体
本発明の一態様は、本発明の1若しくは複数のポリペプチドに特異的に結合する抗体、一本鎖抗原結合分子、又は他のタンパク質、及びそれらの相同体、融合体、又はフラグメントに関する。このような抗体を用いて、本発明のポリペプチドを定量的又は定性的に検出することができる。一般に、抗体又はペプチドが本発明のタンパク質分子又はペプチド分子に特異的に結合すると言われるのは、このような結合が、非関連分子の存在により競合的に阻害されない場合である。
本発明のポリペプチドの全部又は一部をコードするポリヌクレオチドを組換え法により発現させてタンパク質又はペプチドをもたらし、これらを用いて、発現したタンパク質又はペプチドに結合することが可能な抗体を誘発することができる。このような抗体は、例えば、このタンパク質についてのイムノアッセイで用いることができる。このようなタンパク質をコードする分子、又はそれらのフラグメントは、発現すると融合タンパク質が作製されるように、融合分子(すなわち、より大型の核酸分子の一部)でありうる。本発明の核酸分子のいずれかは、これらの核酸分子によりコードされるタンパク質又はペプチドをもたらすように、組換え法により発現させることができることが理解される。
ポリペプチド及びそれらのフラグメントに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体の場合もモノクローナル抗体の場合もあり、また、完全な免疫グロブリンを含む場合もあり、免疫グロブリンフラグメント(F(ab’)、F(ab’)など)の抗原結合部分を含む場合もあり、例えば、組換え法により作製可能な一本鎖免疫グロブリンを含む場合もある。専門家は、抗体の構築、操作、及び単離のための具体的な条件及び手順を説明する標準的な情報供給源について熟知していることが理解される(例えば、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる、Harlow and Lane, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)を参照され
たい)。
本明細書の別の箇所で論じた通り、このような抗体分子又はそれらのフラグメントは、診断的目的に用いることができる。抗体が診断的目的を意図する場合、例えば、リガンド基(ビオチンなど)又は検出可能なマーカー基(蛍光基、放射性同位体、又は酵素)によりそれらを誘導体化することが望ましい場合がある。本発明のタンパク質分子又はペプチド分子に結合する抗体を作製することができれば、これらの分子の模倣体化合物の同定が可能となる。一般に、模倣体化合物とは、特定の所望化合物又はその化合物のフラグメントではないが、にもかかわらず、その化合物を対象とする抗体に特異的に結合する能力を示す化合物である。一実施形態において、抗体は、ウサギポリクローナル抗体である。
キット
本発明の他の態様は、本明細書に記載の方法を実施するのに有用なキットを対象とする。一般に、本発明の方法を実施するためのキットは、それらの意図する機能に応じて、ある程度異なる形態を有することが好ましい。
キットは、パッケージ化され、それについてキットが評価される調製物の量に基づきその溶液容量が変化する試薬を含有する容器を包含することが典型的である。容器は一般に、本明細書に記載の方法を実施するのに有用な1又は複数の試薬を包含する。特定の実施形態において、キットは、区画化されたキットである;すなわち、キットは、同じであるか又は個別の容器内に含有される試薬を包含する。容器の例には、小型のガラス製容器、プラスチック製容器、又はプラスチック製若しくは紙製のストリップが含まれるがこれらに限定されない。これら及び他の類似の容器は、各種の試料及び試薬が交差汚染されず、各容器の薬剤又は溶液が1つの区画から別の区画へと定量的に添加されうるように、1つの区画から別の区画への、又は他の何らかの容器への、試薬の効果的な移動を可能とする。このような容器には、検査試料を受容する容器、本開示のポリペプチド又はポリヌクレオチドを含有する容器、本明細書に記載のポリペプチドを作製するための宿主細胞又は他の材料(例えば、ベクター、ウイルス、又はバクテリオファージ)を含有する容器、クロマトグラフィー材料(上記で説明した、イオン交換クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂のうちの1又は複数など)を含有する容器、洗浄試薬(リン酸緩衝生理食塩液、トリス緩衝液など)を含有する容器、及び/又はコラン酸などの多糖を検出するのに有用な試薬(以下の実施例16において詳述されるアッセイにおいて説明される試薬など)を含有する容器が含まれうる。キットは、本明細書に記載のCAEポリペプチドの供給源及び濃縮物(concentrations)を包含しうる。より大きなスケールの適用の場合、キットは一般に、同様の試薬及び溶液を包含するが、より大量に包含する。
例えば、キットは、本明細書に記載のCAEポリヌクレオチドをクローニングするのに適する細菌発現ベクターを包含しうる。代替的に、キットは、ポリヌクレオチド及び/又はポリペプチド自体も包含しうる。キットはまた、組換えクローンを発現ベクター内へと形質転換するための、コンピテントセルなどの細胞も包含しうる。キットはまた、本発明のポリペプチドを細菌から発現させるための培地(培養液など)も包含しうる。キットはまた、Qiagen社製品マニュアル及びSambrook et al.において溶液、II、及びIII(すなわち、それぞれ、pH8.0の10mM EDTA、pH5.5の1%SDS及び0.2N
NaOH、並びにpH5.5の3M酢酸カリウムを伴う25mMトリスHCl)として説明される3つの一般的なアルカリ溶解緩衝液のセット、及び/又は再懸濁溶液(例えば、pH8.0の10mMトリスHCl)も包含しうる。
例えば、一部の実施形態では、遠心分離ベースのスピンフィルター又はディスクフィルターが包含されうる。この適用で機能するスピンフィルターの1つのモデルは、Millipore Durapore遠心分離フィルター(マサチューセッツ州、ビレリカ、Millipore社製)である。加えて、又は代替法として述べると、遠心分離又は他のフィルター機構(例えば、ディスク)内にスチールウール、セルロース、又はポリマー/プラスチック材料を充填したフィルターも包含されうる。セラミック製のフィルターもまた包含されうる。珪藻土又は類似の化合物などのフィルター補助材もまた包含されうる。より大きなスケールの適用の場合、接線流フィルターも提供されうる。
具体的な一実施形態において、キットは、本明細書に記載のポリペプチドのうちの1又は複数を包含する。例えば、キット内に包含されるポリペプチドは、配列番号1及びその保存的アミノ酸置換に対して少なくとも90%、98%、99%、又は100%の相同性を有するアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドでありうる。具体的な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有しうる。付加的又は代替的に、キット内に包含されるポリペプチドは、配列番号2及びその保存的アミノ酸置換に対して少なくとも90%、98%、99%、又は100%の相同性を有するアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドでありうる。具体的な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列を有しうる。キット内に包含されるポリペプチドはまた、単離又は精製のためのタグ(例えば、Hisタグ又はFLAG(登録商標)タグ)も包含する場合があり、したがって、キット内に包含されるポリペプチドは、配列番号3、配列番号4、配列番号5、又は配列番号6に対応する。代替的に、キットは、配列番号1又は配列番号2のポリペプチド及びこれらの変異体と共に、このようなタグ付きポリペプチドを形成するのに用いうる試薬及び組成物も包含しうる。
キットはまた、使用のための指示書も包含することが典型的である。指示書は一般に、末端の使用者が所望の調製又はアッセイを実施することを可能とするのに適する。指示書は一般に、理解可能な表現で、例えば、少なくとも1つの調製又はアッセイのための試薬濃度、混合される試薬及び試料の相対量などのパラメータ、試薬/試料混合物のための維持時間又はインキュベーション時間、温度の要件又は優先条件などを説明する。指示書は、キットの外部又は内部の包装材上、キット内の小冊子、カード、若しくは他の用紙、及び/又はキット内に包含される容器(containers又はvessels)の外面上において印刷されうる。
本発明を詳細に説明してきたが、付属の特許請求の範囲において規定される本発明の範囲を逸脱しない限りにおいて、改変及び変更が可能であることは明らかであろう。さらに、本開示における全ての実施例は、非限定的な実施例として記載されることを理解されたい。
[実施例]
臨床(cGMP)グレードの調製物を含めた全てのプラスミドDNA調製物中には、コラン酸が有意なレベルで存在する。コラン酸は、グラム陰性菌の細菌細胞壁の約25%を占める。とりわけ、動物及びヒトにおける送達のための陽イオン担体と混合した場合、最大限の安全性を提供するためには、コラン酸を除去しなければならない。コラン酸は、RNAポリメラーゼ活性の阻害剤であるため、コラン酸の除去はまた、各プラスミドからの遺伝子発現も増大させる。BIV DNA−リポソーム複合体の静脈内(iv;intravenous)注射後におけるBalb/cマウスの内臓では、2.2〜4.4倍の範囲でレポーター(CAT;クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ;chloramphenicol acetyltransferase)遺伝子発現の増大が観察されている。コラン酸は、極めて大型の分枝状鎖であることが多いため、効果的に除去するためには分解しなければならないことが典型的である。
コラン酸がプラスミドDNA多糖の主要なコンタミネーション成分であることが同定されたので、プラスミドDNAからコラン酸を除去する方法を開発するための実験を実施した。以下ではコラン酸分解酵素(CAE;colanic acid degrading enzyme)と称する特定の酵素は、特定の溶解性バクテリオファージにより生成されることが報告されている(Hughes, K.A. et al. 1998. J. Appl. Microbiol. 85:583-590)。コラン酸分解酵素(CAE)は、研究者により部分的に精製されているに過ぎない。したがって、CAEを用いてコラン酸を除去する方法を開発するためには、該酵素を精製し、配列決定し、発現させなければならない。
コラン酸を過剰生成させる菌株である大腸菌株SC12078を溶解させる能力を有するバクテリオファージ(NST1)が同定された。精製CAEを単離するための供給源として、NST1バクテリオファージを単離及び使用した。特定の多糖分解酵素とのインキュベート後には、多糖の粘稠度が低下することが示されている(Sutherland, I.W. 1967. Biochem. J. 104:278-285)。したがって、コラン酸を含有する試料の粘稠度に影響を及ぼすそれらの能力により、CAEを含有するタンパク質試料を同定した。NST1から単離された精製CAEは、それがコラン酸の粘稠度を低下させる能力により示される通り、高レベルのCAE活性を示したことが分かった。
試料の粘稠度を低下させる能力についてのバイオアッセイにより同定される通りに精製CAEを単離し、それを質量分析及びエドマン分解にかけた。エドマン分解を用いて、15アミノ酸を同定した。質量分析により、8つのさらなるタンパク質フラグメントを配列決定したところ、各フラグメントは、6〜16アミノ酸を含有した。バクテリオファージデータベースを含め、公開されているタンパク質データベースをスクリーニングしたところ、ペプチドフラグメントとの1つのマッチも示されなかった。
ペプチド配列に基づき、一連の縮重オリゴヌクレオチドを調製した。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、NST1バクテリオファージから精製される、ゲノムDNAに由来するコラン酸分解酵素を配列決定した。CAEのオープンリーディングフレーム(ORF:open reading frame)を決定した。CAEのORFヌクレオチドを配列決定し、普遍的遺伝子コードを用いてCAEのアミノ酸配列を決定した。これらの配列を図1に示す。CAE ORFの始点及び終点に対して作製されたPCRプライマーを用いて、PCRによりNST1バクテリオファージのゲノムDNAからORF配列を増幅し、その後、酵母による発現ベクター内へとクローニングした。
新規に同定されたタンパク質である天然のコラン酸分解酵素(CAE)が、バクテリオファージから生成されているが、一般に、生成されるのはごく少量であり、4.5Lのファージ+細菌増殖物から約110ugであるに過ぎない。ペプチドとして生成された抗体である、このタンパク質に対するウサギポリクローナル抗体もまた作製されている。この抗体は活性が高く、ウェスタンブロット法、ELISAアッセイなどを含めた任意の目的に用いることができる。
大スケール量のCAEを作製するため、CAEの組換え体を作製して、プラスミドDNA調製物をさらに精製するのに用いた。酵母、バキュロウイルス、及び細菌中において全長の組換えCAEを作製する以前の試みは一般に不成功であり、不適正なタンパク質の折りたたみに起因すると考えられた。予測されるCAEの構造及び天然タンパク質のキモトリプシンによる消化を検討した後、本発明者らは、活性の喪失なしに、CAEタンパク質のアミノ末端(N末端)から107のアミノ酸を除去しうることを決定した。キモトリプシンは、この1つの位置であるアミノ酸106〜107において天然の全長タンパク質を切断する唯一のプロテアーゼであった。組換えCAEタンパク質は、いずれのプロテアーゼによっても切断されず、極めて安定的である(2年を超える)。本発明者らは、発現ベクターpET28a(Invitrogen社製;実施例9を参照されたい)を用いる細菌内において、CAEの機能的切断形態を作製した。切断型タンパク質は、16℃で一晩にわたり増殖させた大腸菌BL21(DE3)株内で作製し、次いで精製した。1Lの増殖物から、約10mgのCAE組換えタンパク質を作製することができる。
次いで、任意のプラスミドDNA調製物を、組換えCAEにより消化させ、さらに精製することができる。略述すると、プラスミドDNAを、CAEにより37℃で3時間にわたり消化させ、次いで、50℃で21時間にわたり消化させる。タンパク質を除去し、まずボロン酸によるクロマトグラフィーを介してDNAを精製する。プラスミドDNAはカラム内を流過し、これに結合しない。極めて小型のフラグメントを除き、大半の多糖はカラムに結合する。最も小型の消化された多糖を除去するため、最後に、両性界面活性剤の存在下におけるMacrosep 100型遠心分離式濃縮器ユニットによりDNA懸濁液を精製する。コラン酸は、プラスミドDNAに強く結合すると考えられるため、両性界面活性剤が一般に好ましい。
臨床グレードのプラスミドDNAを調製するのに用い、費用を低減するために、組換えCAEはまた、多数回にわたり再生され再使用されうる固体支持体上に配置することもできる。
本明細書に記載のアッセイによれば、コラン酸を含めた、検出可能なレベルの多糖は見出されない。
コラン酸の調製
コラン酸は、コラン酸を過剰生成することが知られている細菌株であるSC12078細菌を用いて調製した。SC12078細菌の数個のコロニーをプレートから採取し、クロラムフェニコール(10ug/ml)含有0.4%グリセロールを含む2リットルのLBブロス中に接種した。細菌を、37℃にて、230rpmのシェーカーインキュベータ中で1晩培養させた。培養物が約4.5〜約4.7の光学密度(OD,optical density)600に到達したときに、培養を停止した。
細菌を遠心分離により除去する前に、細菌のフラスコを軽く振とうして、培養培地中に放出されるコラン酸の量を増加させた。細菌を、6,000×gにて15分間、4℃での遠心分離によりペレットにした。細菌ペレットを廃棄し、上清を保存し、YM30メンブレンを備えるAmicon社製フィルター装置を用いて濃縮した。
3容量の氷冷エタノールを1容量の上清に加え、混合物を氷上に15分間置くことにより、コラン酸を濃縮上清から沈殿させた。混合物を10,000×gにて少なくとも15分間、0℃にて、又は上清が透明になるまで遠心分離することにより、沈殿物を回収した。沈殿物を最小限の量の滅菌水に溶解し、少なくとも3回水を交換して1晩透析した。
透析した溶液を凍結乾燥させたが、溶液を乾燥させるチューブを、溶液を加える前に確実に秤量して、凍結乾燥後の試料の重量を決定した。試料が一旦完全に乾燥すると、水を試料に加えて、凍結乾燥試料の2%溶液を作製した。
固体硫酸アンモニウムを、凍結乾燥試料の2%溶液に加えて、90%硫酸アンモニウム飽和溶液を得た。90%硫酸アンモニウム飽和溶液は、O抗原及びコラン酸を沈殿させた。10,000×gにて少なくとも15分間、0℃にて、又は上清が透明になるまで遠心分離することにより、沈殿した多糖を回収した。ペレットにした沈殿物を最小限の量の水に溶解し、少なくとも3回水を交換して1晩透析し、凍結乾燥させた。
凍結乾燥物を150mlの0.1Mリン酸ナトリウムpH7.2に溶解した。コラン酸は、凍結乾燥物溶液から、37.5mlのヘキサ−デシル−トリメチル−アンモニウムブロミド(セタブロン(cetavlon)又はセトリミドとも呼ばれる)を加えることにより沈殿させた。コラン酸沈殿物を、10,000×gにて少なくとも15分間、0℃にて、又は上清が透明になるまで遠心分離することにより回収した。
ペレットにした沈殿物を、100mlの1M NaCl中に溶解した。3容量の氷冷エタノールを1M NaCl溶液に加え、混合物を氷上に15分間置くことにより、コラン酸を再沈殿させる。混合物を10,000×gにて少なくとも15分間、0℃にて、又は上清が透明になるまで遠心分離することにより、コラン酸沈殿物を回収した。コラン酸沈殿物を最小限の量の滅菌水に溶解し、少なくとも3回水を交換して1晩、低温室にて透析した。
透析した溶液を凍結乾燥させたが、溶液を乾燥させるチューブを、溶液を加える前に確実に秤量して、凍結乾燥後の試料の重量を決定した。試料が一旦完全に乾燥すると、コラン酸を最小限の量の水に溶解して、滅菌チューブ中に等分し、−25℃にて貯蔵した。
NST1ファージの作製
NST1バクテリオファージは、コラン酸を過剰生成する株である大腸菌SC12078株を溶解するその能力により、CAEの良好な供給源と同定された。NST1バクテリオファージを単離して、精製CAEを単離するための供給源として用いた。
SC12078細菌の数個のコロニーを寒天プレートから採取し、0.4%クロラムフェニコール(10ug/ml)を含有する5mlのLB−グリセロール培地を含む2本の試験管に接種した。細菌を、37℃にて1晩培養させて、ファージストックそのものを調製した。5つの異なるNST1ファージ粒子数を含むファージストックの系列希釈(1:10、1:10、1:10、1:10−1及び1:10−2)を調製する。希釈は、107個のファージ粒子を含有する4℃にて貯蔵した1ulのファージストックに基づく。1晩培養物(200ul)を、1ulのファージストックと混合して、ファージの10濃度を作製する。次により高い濃度のファージ20ulと混合した180ulの1晩細菌培養物を含んで、さらなる希釈を作製する。107〜103個の粒子を含有する最高濃度を廃棄する。
より低い5つの希釈を、それぞれを3mlのLB+グリセロール上部寒天(0.7%のアガロース、55℃に保つ)と迅速に混合することによりプレートに播種した。混合物を、LB+クロラムフェニコール(10ug/ml)プレート上に迅速に注いだ。混合及び注入は迅速に行って、上部寒天の固化を避けるのが好ましい。次いで、プレートを逆さまにして37℃にて5時間インキュベートした。インキュベーションの後に、プレートをパラフィルムで包み、4℃にて貯蔵した。プラークを含まないプレートは廃棄する。
NST1ファージ上清の大規模生成
細菌株SC12078(コラン酸を過剰生成する株)を、LB−クロラムフェニコール含有(10ug/ml)寒天プレート上で維持し、4℃にて貯蔵した。実施例2に記載されるようなNST1ファージの数枚のプレートを、4℃にて貯蔵したLB−クロラムフェニコール(10mg/ml)寒天プレートの上に積層したLB−グリセロール上部寒天(アガロース0.7%)上で維持した。NST1がより長い貯蔵期間とともに生存能及び細菌への感染能を失うので、プレートは1カ月を超えて貯蔵しなかった。
SC12078細菌の数個のコロニーを、各試験管中に15mlのLB−グリセロール−クロラムフェニコール(10ug/ml)培地が含まれる4本の50ml滅菌試験管に接種した。コロニーを、37℃にて1晩、シェーカーインキュベータ中で成長させた。
各フラスコに1.5リットルのLB−グリセロール−クロラムフェニコール(10ug/ml)培地が含まれる3本の4リットルフラスコに、次いで、15mlの1晩培養物を接種した。細菌コロニーを、37℃にて、シェーカーインキュベータ(230rpm)中で約2〜4時間、溶液が0.12〜0.67のOD600を有するまで成長させた。
各フラスコに、次いで、30個のNST1ファージプラグを接種し、フラスコを37℃にて振とうしながら(230rpm)1晩インキュベートした。1晩インキュベートしたNST1ファージを接種したSC12078培養物のOD600を測定し、これは典型的に4.5〜4.7であった。これらの培養物を、4200rpm、4℃にて5分間、大きいオートクレーブ済み遠心分離瓶を用いて遠心分離した。NST1ファージを含む上清を、滅菌容器に注ぎ−80℃にて貯蔵したか、又は直ちに精製した。細菌細胞及びデブリを含むペレットは廃棄した。
コラン酸分解酵素の単離
ファージ上清を実施例3に記載されるようにして調製した。フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF,phenyl methyl sulfonyl fluoride)をファージ上清に0.1mMのPMSFの最終濃度まで加えて出発溶液を調製し、次いで4℃にて貯蔵した。
CAE精製のための出発溶液を卓上遠心分離機で、約4200rpmにて20分、4℃にて遠心分離した。得られた上清を回収し、保存し、ペレットを廃棄した。Amicon社製フィルター装置及びYM30メンブレンを用いて、上清の容量を4リットルから4ml試料まで低減させた。4ml試料を、ポリカーボネート遠心管中で40,000×gにて、SS34ローター中で60分間、4℃にてさらに遠心分離した。試料を、0.1mM PMSF含有10mM Tris HCl、pH7.5を少なくとも3回交換して1晩、低温室にて透析した。
Q Sepharose Fast Flowカラム(高さ10cm、直径1.5cm)を、10mM Tris HCl、pH7.5、0.1mM PMSFで、カラムから溶出される流体のpHが7.5になるまで平衡化した。透析した上清を平衡化したカラムに載せ、カラムを2カラム容量(約30ml)の10mM Tris HCl、pH7.5、0.1mM PMSFで洗浄した。
カラムを、10mM Tris HCl、pH7.5、0.1mM PMSF(150ml)から200mM Tris HCl、pH6.5、0.1mM PMSF(150ml)までの直線勾配を用いて、4mlのフラクション(合計で75フラクション)を回収しながら、1時間当たり7mlの流速で溶出した。回収したフラクションを、コラン酸分解活性について、以下の実施例5に記載されるような粘度計試験を用いて試験し、CAE活性を含むフラクションをプールした。
プールしたCAE活性フラクションを、次いで、使い捨てAmicon社製フィルター上で遠心分離により濃縮した。得られた濃縮物のタンパク質濃度を決定し、濃縮物の試料を、グラジュエントポリアクリルアミドゲル(4〜12%)で電気泳動した。電気泳動試料は、5つのタンパク質バンドを含んでいた。
タンパク質濃縮物を、次いで、0.1mM PMSF含有リン酸緩衝食塩水(PBS,phosphate buffered saline)、pH7.3〜7.4で平衡化したToyopearl HW-50F樹脂を含む120cmのカラムでサイズにより分離した。カラム溶出液を1mlフラクションで回収した。各フラクションをCAE活性について試験し、活性フラクションをプールした。
プールしたフラクションを、使い捨てAmicon社製フィルター上で遠心分離により濃縮した。濃縮物のタンパク質濃度を決定し、濃縮物の試料を、グラジュエントポリアクリルアミドゲル(4〜12%)で電気泳動した。単一のタンパク質バンドが得られ、これは約84,000ダルトンの分子量を有した。
タンパク質バンドは、標準的な手順により調製し、質量分析及びエドマン分解に供した。
バクテリオファージNST1から単離されたCAEの部分アミノ酸配列の同定
CAEタンパク質を、上記のようにして精製した。精製CAEタンパク質を、Applied Biosystems社製ProciseシーケンサーPROCISE-cLCを17サイクルで用いる質量分析と、エドマン分解とに供した。エドマン分解を用いて、N末端の15アミノ酸を以下に記載するようにして同定した。
ANSYNAYVANGSQTA(配列番号9)
質量分析により、8つのさらなるタンパク質フラグメントが配列決定され、各フラグメントは以下に記載するような6〜16アミノ酸を含んでいた。
LLEQGTGEALTDGVLR(配列番号10)
VPNSEVSLNALPNVQR(配列番号11)
LADYEFTSAPSNSK(配列番号12)
YSDLSTLN(配列番号13)
QLLFDTAPLA(配列番号14)
APYQVDDNL(配列番号15)
FGAYLPDD(配列番号16)
LGTLGG(配列番号17)
これらのペプチドフラグメント配列のそれぞれにおいて、アミノ酸ロイシン(L)は、実際にはロイシン(L)又はイソロイシン(I)のいずれかであり得、アミノ酸アスパラギン酸(D)は、実際にはアスパラギン酸(D)又はアスパラギン(N)であり得、アミノ酸グルタミン(Q)は、実際にはグルタミン(Q)又はリシン(K)であり得、アミノ酸フェニルアラニン(F)は、実際にはフェニルアラニン(F)又は酸化されたメチオニンであり得る。
コラン酸分解酵素のクローニング
A.縮合オリゴヌクレオチドプライマーの調製
縮合オリゴヌクレオチドプライマーを、上記のCAEタンパク質のタンパク質フラグメントからアミノ酸配列の縮合コドンを用いて調製する。
B.バクテリオファージゲノムDNAの調製
バクテリオファージNST1のゲノムDNAを、標準的なDNA精製法を用いて精製した。縮合オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、バクテリオファージゲノムDNAとハイブリッド形成させて、CAE遺伝子を以下に記載されるようにして同定した。
C.ゲノムDNAからのCAE遺伝子の配列決定及び増幅
CAE ORFの配列決定を、縮合プライマーを用いて開始し、次いで配列決定のその後の回について既知の配列に基づくプライマーを用いて、NST1バクテリオファージゲノムDNAに対して直接行った。CAE ORFは、NST1バクテリオファージゲノムDNAの両方の鎖で完全に配列決定した。
CAE ORFの最初と最後に合わせたプライマーを作製し、次いで、これらを用いてCAE遺伝子の配列を、NST1バクテリオファージゲノムDNAから、増幅中の誤りを避けるためにDeep Vent DNAポリメラーゼ(New England BioLabs社製)を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR,Polymerase Chain Reaction)を用いて増幅した。増幅DNAを、次いで、電気泳動し、適切なバンドを切り出し、ゲルから精製した。
コラン酸分解酵素の配列
CAEのヌクレオチド配列は、図9に示すように決定された。
ATGGCGAACA GCTATAATGC TTACGTGGCG AACGGTTCAC AGACCGCATT CCTCGTCACG 60
TTCGAGCAGC GCGTGTTCAC TGAGATTCAG GTGTACCTCA ACTCCGAACT CCAGACGGAA 120
GGGTACACCT ACAACTCTGT GACCAAACAG ATTATCTTCG ACACCGCCCC GCTCGCCGGG 180
GTGATTGTCC GACTCCAACG CTACACCTCT GAGGTTCTGC TGAACAAGTT TGGCCAAGAC 240
GCTGCCTTCA CCGGGCAGAA CCTTGACGAG AACTTTGAGC AGATTCTGTT CAAGGCTGAG 300
GAAACTCAGG AAGCATGGCT CGCGCCACTT GACCGCGCCG TCCGTGTTCC GAACTCCGAA 360
GTCTCCATCA ACGCATTACC GAACGTCGCT GGCCGCCGCA ACAAGGCACT GGGCTTTGAC 420
AGCAATGGTC AGCCGTTCAT GATTCCTCTG GTCGATATCC CGGACTCCGC GCTGGCGATT 480
GCTCTGGCAA TGGCTGACGG CGGTAAGTGG ATTGGTACTC TCGGCGGGGG CACGTTCCTC 540
GACCGTCAGG ATACCGTCTG CCTGTCCGAG TTCACCAACA ACACTGGGTA CGCCTCTGTC 600
GCCGCTGCGG TGCAGGCTTG CTTCGACTAT GCGAAAGCCA ACGGCAAGGT CGTTGACGCT 660
CGCGGCTGGG AAGGTACGGT GGATTCCACT GTGCTGATGG ACGGTATTGA GGTCGTCGGC 720
GGTACGTGGC ACGGCAAGGC TGACATTCGC CTGCTGAACT CCACCTTCCG CAACTTCGTG 780
GCCTCTACTG TCCGTGTCGC CTACTGGGGC GGCGAGGTGC GTATTGCTGA CTATGAGTTC 840
ACCAGCGCAC CGAGCAACTC CAAGGTTACG TCTATCCTGT TCCAAGGCAA CATCGCCGGG 900
GGCAGCTACG TCATTGAGAA CGGTATCCAC CGCAATGGTA AGTTCGGTAT TCTCCAACAG 960
GGTACTGGCG AGGCTATCAC CAACGGCGTT ATCCGTGGCA TCACCATGAT GGATATGCAG 1020
GGTGACGGTA TCGAGATGAA CGTAATCAAC AAGCACTATG ATGGTGGCCT GCTGATTGAG 1080
AACATCTTCC TTGAGAACAT CGACGGCACC AACGCGCCTA TCCCACTGTC CAACTGGGGC 1140
ATTGGTATCG GTATCGCTGG TCAAGGCCCG TTCGGTTGGG ATGCTGCTGA GACGCAGTAT 1200
GCGAAGAACG TCACTGTCCG TAACGTCCAT GCTCCGCGTG GTGTGCGTCA GGTCGTCCAC 1260
TTCGAGGTTA CGCGTGACAG CACCTGCGAG AACGTAGTGG CCAACCCTGA CCTGTCCGTC 1320
TCCATTGGTA CTGGCCTGAC TGCCGCTGGT GTAATCACGT ACGGCTGCAA GCGCATGACC 1380
ATTGACGGTG TAGTCGGTGA GCCTATGAAC ACCGGAGCAA CCTCTCCGAA CGATATTCGT 1440
ATCGTGATGT TGGAGTGGGG TGCGAACCAA GCAGGTGCTG GCGGTACGCC GGGTGCAGCT 1500
TGCCCATCGT TCGACATGAC CGTGCGTAAC GTGCAGACCC GTACCGGGCG CTTCTATGCT 1560
GGTGTCGGCT CCGACGATGA CAACACCAAC ACATATCACC TTGAAAACAT TCACTGTTAC 1620
AAGATGACGC TGTTTGGTGT GGCAACTCTG CTGAACATGA CCAACGTGAC TGGTGTGGTG 1680
TTCGACGCTG TAGGCGATGA CTCCAGCGGC GGTACGTCCT CCAACGGTCT GTACCCGCGT 1740
AAGAAGACTG TTCTCAACAT GGTGAACGTG AACTTCTACG GGCCGGGCAT GACCGAGGGT 1800
GCGCTGTACA GTAAGGCTCG CTACTCGGAT ATCAGCACGC TGAACTCCAA CGTGCGTGCT 1860
ATCCCGTACA CCAACATCCA AGGTAACGTG GGTGTCATCC TGTCTCCGGT CAACCGCATG 1920
TACACGCTGC CGAACGCCCT CGCTACCCTT GACGGTAATG AGTTCCCCAC CGGGAAAGAG 1980
TTCTGCGAAG GTACTGTGCT GTTCAAGACC GATGGCTCCG GTGGCAACTT CATCGTGACC 2040
CGGTTCGGTG CGTACATCCC GGATGACGGT AACAACTTCA AGGTGCGTGC TGCTGCCGCT 2100
GGCCAGACGT ATCTGGAGCA GAACCTGACT CCGGCTGGTA CTCAGGCTTC CACCTCGTGG 2160
CTGTACCATA AGCCAATCTC TGCTGGTACT CGACTCAATG TTCCGGGTGC CGGGCCGAGC 2220
GGCGGTACGC TCACTGTGAC GGTGGTGCGT GCTCCGTATC AGGTGGACAA CAACATCGGA 2280
AACCCGGTAC GCATCGACAT TACCCCGGCC ATTGTGACGG CAATCCCTGC GGGAACGCAG 2340
CTCGCCGCTA CCTACCCGGT GGCTTACATC TAA
(配列番号7)
アミノ酸配列は、ユニバーサル遺伝子コードを用いて決定し、図1のヌクレオチド配列とのアラインメント中に示す。エドマン分解では末端メチオニンが検出されなかった以外は、CAEのアミノ末端はエドマン分解の結果と一致した。さらに、CAEの分子量は84,354と決定され、ポリアクリルアミドゲル上のその位置により決定されたような配列決定されたタンパク質バンドの分子量に相当した。
プラスミドDNAの精製におけるコラン酸分解酵素の使用
プラスミドDNA試料を、コラン酸の存在について試験する。プラスミドDNA試料中にコラン酸が存在するならば、プラスミドDNAの試料を本発明の組換えコラン酸分解酵素とインキュベートする。CAEは、コラン酸をいくつかのより小さい多糖に消化し、これらは当該技術において知られる種々の方法によりプラスミドDNAから分離できる。プラスミドDNA試料は、次いで、CAEから分離され、さらに本明細書に記載されるようにして精製される。
ベクターpET-28A-C(+)中の、N末端の6ヒスチジンを含むアミノ酸107〜790(下線)である組換えCAEの構築
構築物中に含まれるアミノ酸:[(Nco1)MGHHHHHH・・・・ストップ(Xho1)]
MGHHHHHHLAPLDRAVRVPNSEVSINALPNVAGRRNKALGFDSNGQPFMIPLVDIPDSALAIALAMADGGKWIGTLGGGTFLDRQDTVCLSEFTNNTGYASVAAAVQACFDYAKANGKVVDARGWEGTVDSTVLMDGIEVVGGTWHGKADIRLLNSTFRNFVASTVRVAYWGGEVRIADYEFTSAPSNSKVTSILFQGNIAGGSYVIENGIHRNGKFGILQQGTGEAITNGVIRGITMMDMQGDGIEMNVINKHYDGGLLIENIFLENIDGTNAPIPLSNWGIGIGIAGQGPFGWDAAETQYAKNVTVRNVHAPRGVRQVVHFEVTRDSTCENVVANPDLSVSIGTGLTAAGVITYGCKRMTIDGVVGEPMNTGATSPNDIRIVMLEWGANQAGAGGTPGAACPSFDMTVRNVQTRTGRFYAGVGSDDDNTNTYHLENIHCYKMTLFGVATLLNMTNVTGVVFDAVGDDSSGGTSSNGLYPRKKTVLNMVNVNFYGPGMTEGALYSKARYSDISTLNSNVRAIPYTNIQGNVGVILSPVNRMYTLPNALATLDGNEFPTGKEFCEGTVLFKTDGSGGNFIVTRFGAYIPDDGNNFKVRAAAAGQTYLEQNLTPAGTQASTSWLYHKPISAGTRLNVPGAGPSGGTLTVTVVRAPYQVDNNIGNPVRIDITPAIVTAIPAGTQLAATYPVAYI ストップ(配列番号4)。
N末端の8個のさらなるアミノ酸を含むアミノ酸107〜790からのCAEのPCR増幅領域を、制限酵素Nco1及びXho1で消化し、これもまたNco1及びXho1で消化したベクターpET-28a-c (+)のマルチクローニングサイトに連結した。この構築物を形質転換し、発現宿主BL21 (DE3)中で、50mg/リットルのカナマイシンを含有するHyper Broth培地中で成長させた。大規模培養物を37℃にて、225rpmで振とうしながらOD600が0.5に到達するまで成長させた(約2〜4時間)。温度を16℃に変更し、成長を30分間継続した。次いで、IPTGを0.015mMの最終濃度まで加え、成長をさらに20時間継続した。次いで、組換えCAEを、N末端の6ヒスチジンと選択的に結合するNi-NTAカラムで精製する。結合したタンパク質を次いで溶出し、濃縮し、貯蔵緩衝液中で再構成し、4℃の冷蔵庫中で貯蔵した。
発現宿主BL21 (DE3)への組換えCAEクローンの形質転換
1バイアルのOne Shot(登録商標)BL21 (DE3)細胞を氷上で融解させる。1〜5μlの容量の10ngのプラスミドDNAを細胞に加え、穏やかにタッピングすることにより混合する。細胞をピペット操作で混合してはならない。バイアルを氷上で30分間インキュベートする。42℃の水浴中で正確に30秒間インキュベートする。混合又は振とうしてはならない。バイアルを42℃浴槽から取り出し、直ちに氷上に置く。250μlの予め温めたSOC培地をバイアルに加える。バイアルをマイクロ遠心分離ラックに入れ、テープでバイアルをラックに固定する。振とうインキュベータ中にラックを横向けに入れ、バイアルを37℃にて正確に1時間、225rpmにて振とうする。20〜200μlの各形質転換反応物を、80μg/mlのカナマイシンを含有する2枚のLBプレート上に播種する。2つの異なる容量をプレートに播種して、少なくとも一方のプレート上に良好に間隔が開いたコロニーが確実に得られようにする。残りの形質転換反応物は、+4℃にて貯蔵して、必要であれば次の日にプレートに播種してよい。プレートを逆さまにし、37℃にて1晩インキュベートする。
組換えCAEを発現する細菌の培養
単一コロニー又はグリセロールストックからの30μlを、50mg/リットルのカナマイシンを含有する30mlのLB培地に接種する。37℃にて、225rpmで振とうしながら1晩インキュベートする。24mlの1晩培養物を、50mg/リットルのカナマイシンを含有する2リットルのHyper Broth培地に加える。培養物を37℃にて、225rpmで振とうしながらOD600が0.5に到達するまで培養させる(約2〜4時間)。温度を16℃に変更し、振とうを30分間継続する。IPTGを0.015mMの最終濃度まで加え、培養を20時間継続する。細胞を4800×gにて15分間の遠心分離により採集し、ペレットを−80℃にて貯蔵する。
組換えCAEの精製
溶液を作製する。使用直前にPMSFを加える。
A.20mM Tris−HCl pH8.0、0.25M NaCl、10%グリセロール、10mMイミダゾール、0.1ml/リットルのβ−メルカプトエタノール、1mM PMSF。
B.20mM Tris−HCl pH8.0、0.25M NaCl、10%グリセロール、125mMイミダゾール、0.1ml/リットルのβ−メルカプトエタノール、0.1mM PMSF。
C.20mM Tris−HCl pH8.0、0.25M NaCl、10%グリセロール、500mMイミダゾール、0.1ml/リットルのβ−メルカプトエタノール、0.1mM PMSF。
D.20mM Tris−HCl pH8.0、0.25M NaCl、10%グリセロール、0.1mM PMSF。
Ni-NTAカラム(2リットルの培養物についてベッド体積20ml)を、200mlの緩衝液Aで平衡化する。細胞ペレット(2リットル培養物から)を融解し、150mlの緩衝液Aに懸濁する。細胞ペーストをMICROFLUIDIZER PROCESSOR(モデルM-110Y)を用いて破砕し(製造者の使用説明に従って)、40,000×gで遠心分離して、透明な上清を得る。上清をNi-NTAカラムに載せ、600mlの緩衝液Aで洗浄し、次いで、80mlの緩衝液Bで洗浄する。結合した組換えCAEを、80mlの緩衝液Cで溶出する。溶出物を、30Kカットオフを有するAmicon社製Ultra-4遠心分離フィルターユニットに加える。2800×g、4℃にてスピンして、溶出物を濃縮する。残余物を、元の試料容量まで緩衝液Dを用いて再構成する。このプロセスを3回反復する。得られた合計タンパク質を調べる。
組換えCAEを用いるプラスミドDNAの消化
プラスミドDNAを、2.5リットルのLB培養物からEndoFree Plasmid Gigaキットを用いて精製する(製造者の使用説明に従って)。プラスミドDNAを、4mlの0.05Mリン酸カリウム緩衝液、pH6.5に溶解する。適切な量の組換えCAE(プラスミドDNA:CAE=10:1)を加え、37℃にて3時間インキュベートする。温度を50℃に変え、21時間インキュベートする。
ボロン酸アフィニティークロマトグラフィー
ボロン酸クロマトグラフィーを用いて、RNA、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、チミングリコール含有DNA及びベンゾ(a)ピレン:DNA付加物を含む試料の精製が行われている(Schott, H. et al. 1973. Biochemistry 12:932-938; Singh, N. and R.C. Wilson. 1999. J. Chromatography 840:205-213; Jerkovic, B. et al. 1998. Anal. Biochem. 255:90-94; Pruess-Schwartz, D. et al. 1984. Cancer Res. 44:4104-4110)。しかし、ボロン酸クロマトグラフィーは、今までプラスミドDNAをうまく精製できていなかった。なぜなら、プラスミドDNA中に存在する多糖の実質的な量の存在、及び遺伝子療法におけるこれらの多糖の毒性の影響について誰も同定していなかったからである。
市販のボロン酸アフィニティー樹脂は、シス−ジオール基含有化合物に結合する。好ましいボロン酸アフィニティーカラムは、Pierce、Rockford、Ilから得ることができる。このボロン酸カラムは、ポリアクリルアミド球状ビーズと共役したm−アミノフェニルボロン酸をゲル1ml当たり100ミリモル含む。
ボロン酸カラムを、0.2M酢酸アンモニウム、pH8.8中で平衡化した。プラスミドDNA試料をエタノール中で沈殿させ、沈殿物を70%エタノールで洗浄した。洗浄したDNAペレットを、0.2M酢酸アンモニウム、pH8.8中に溶解した。DNA溶液を、次いで、ボロン酸カラムに、2mlのボロン酸カラム材料当たりおよそ10mgのDNAにて載せた。カラムを、次いで、0.2M酢酸アンモニウム、pH8.8で洗浄した。カラム洗浄物をフラクションに回収し、各フラクションの260nmでの光学密度(O.D.)を測定した。最高のO.D.260nmを有するフラクションをプールし、第2のボロン酸カラムに載せた。第2のカラムを、0.2M酢酸アンモニウム、pH8.8で洗浄した。カラム洗浄物からのフラクションを回収し、それらのそれぞれのO.D.260nmを測定した。最高のO.D.260nmを有するフラクションをプールし、エタノールを用いてDNAを沈殿させた。沈殿物を70%エタノールで洗浄し、10mM Tris緩衝液、pH8.0に再懸濁した。DNA試料を濾過滅菌し、−20℃にて使用時まで貯蔵した。
プラスミドDNAは、ボロン酸カラムに結合せず、洗浄緩衝液とともにボロン酸カラムを通過した。一方、多糖コンタミネーション物質、RNA及びLPSは、ボロン酸カラムに結合したか又は吸着された。0.1Mギ酸を用いて多糖フラクションを溶出することにより、ボロン酸カラムを再生した。ボロン酸カラムを、次いで洗浄し、0.1M塩化ナトリウム及び0.02%アジ化ナトリウム中で貯蔵した。
精製DNA試料を、次いで、本発明の多糖の検出及び定量の方法に供した。各精製試料を、1又は複数の多糖検出法に供した(すなわち、ウロン酸検出法、フコース検出法及び/又は蛍光標識法)。多糖検出法の結果は、ボロン酸クロマトグラフィーを用いることにより、多糖の含量が検出不可能なレベルまで低減されたDNA試料が得られたことを一貫して示した。これらのデータは、以下の表2に示す。
MACROSEP浄化
ボロン酸クロマトグラフィーの後に、最高のOD260を有するフラクションをプールする。プラスミドDNAを、2容量の100%冷エタノールと、1/10容量の3M酢酸ナトリウム、pH5.2を用いて沈殿させる。−20℃にてインキュベートする(1時間〜O/N)。13000rpmにて15分間、4℃でスピンする。ペレットを、1mlの70%エタノールで2回洗浄し、13000rpmにて5分間スピンする。風乾し、ペレットを、0.1%zwittergentを含有する14mlの10mM Tris−HCl、pH8.0に再懸濁する。37℃にて15分間インキュベートする。溶液を、300Kのカットオフを有するMacrosep 100遠心濃縮器ユニットに加える(製造者の使用説明に従って)。3500rpmにて1時間、30℃にてスピンして、プラスミドDNAを濃縮する。残余物を、元の試料容量まで0.1%zwittergentを含有する10mM Tris−HCl、pH8.0を用いて再構成する。3500rpmにて1時間、30℃にてスピンする。このプロセスを3回反復する。残余物を、元の試料容量まで10mM Tris−HCl、pH8.0を用いて再構成する。3500rpmにて1時間、30℃にてスピンする。このプロセスを2回反復する。プラスミドDNAを、2容量の100%冷エタノールと、1/10容量の3M酢酸ナトリウム、pH5.2とを用いて沈殿させる。−20℃にてインキュベートする(1時間〜O/N)。13000rpmにて15分間、4℃にてスピンする。ペレットを1mlの70%エタノールで2回洗浄し、13000rpmにて5分間スピンする。風乾し、プラスミドDNAペレットを滅菌水に再懸濁し、最終濃度を5mg/mlに調整する。
プラスミドDNA試料中の多糖の定量
プラスミドDNA試料のいずれの精製方法も、実質的に全てのコンタミネーション多糖をうまく除去できることを確実にするために、そのような精製プロセスの前後のDNAへの多糖のコンタミネーションを評価するための手段を開発した。
3つのアッセイを開発したが、1つはウロン酸レベルの検出に基づき(多糖が高レベルのウロン酸を含有することが知られている)、1つはフコースレベルに基づき(フコースがコラン酸の22%を構成することが知られている)、1つはゲル電気泳動された試料中の蛍光標識された多糖の視覚的検出に基づいた。
1.ウロン酸アッセイ
大腸菌は、O抗原及びK抗原関連多糖(O-and K-antigen associated polysaccharides)、コラン酸並びに腸内細菌共通抗原(ECA,enterobacterial common antigen)を含むいくつかの主要なクラスの多糖を発現する。コラン酸は、高分子量形及び低分子量形の両方で存在するが、ECAは、典型的には低分子量形である。O抗原及びK抗原関連多糖は、リピドAと結合しているバリアントと、リピドAと結合していないその他のバリアントとを有する。リピドA結合多糖は、共有結合しているか又は非共有結合しているかのいずれかであり得る。リピドA結合多糖は、典型的に、低分子量バリアントである。リピドAと結合していないO抗原及びK抗原関連多糖は、高分子量及び低分子量のバリアントとして存在する。
これらの大腸菌莢膜多糖のそれぞれ、特にプラスミドDNA調製物中で見出される長鎖で分岐状の多糖は、ウロン酸を含有する。例えば、コラン酸は、およそ11重量%がウロン酸である。腸内細菌共通抗原(ECA)は、約33重量%のウロン酸からなり、O抗原及びK抗原関連多糖は約25重量%のウロン酸を有する。
プラスミドDNA試料のウロン酸含量を、ヘパリン硫酸及びグルクロン酸を標準物質として作製した標準曲線を用いて測定した。ヘパリン硫酸は、大腸菌からのコンタミネーション物質に類似する。なぜなら、ウロン酸は、ヘパリン硫酸の合計重量の約25%を構成するからである。ヘパリン硫酸は、50%が糖類からなる。これらの糖類の半分はグルコサミンであり、これらの糖類の残りの半分はイズロン酸及びグルクロン酸である。ヘパリン硫酸の残りは、サルフェート及びアセチルアミドを含む糖類の修飾が寄与する。代わりに、グルクロン酸を用いて、ウロン酸の直接測定のための標準曲線を創出できる。
標準曲線を、溶液1ミリリットル当たり0.0、0.05、0.1、0.2又は0.5mgの標準物質を含有する0.1mlのヘパリン又はグルクロン酸の標準物質を用いて作製する。標準溶液(0.1ml)を、3mlのホウ酸塩/硫酸溶液(すなわち、比重1.84の硫酸に溶解した0.025Mテトラホウ酸ナトリウム10水和物)を含むガラス試験管に入れ、よく混合する。0.1mlの0.125%カルバゾールの無水エタノール溶液を混合物に加え、全体の混合物をボルテックスする。各試験管の上部を覆い、試験管を沸騰水中に10分間浸漬する。試験管を冷却させ、溶液の530nmの吸光度を分光光度計で読み取る。標準物質について得られた吸光度の値を、標準物質の濃度に対してプロットする。プラスミドDNA試料のウロン酸含量は、DNA試料が同じ反応を受けたときの530nmでのその吸光度の値から推定できる。
プラスミドDNA試料の多糖含量は、次いで、ウロン酸の量に、3.3〜9.1の範囲の数値(試料中のコラン酸、ECA並びにO抗原及びK抗原の普及率に依存して)を乗じることにより推定できる。プラスミドDNA試料のウロン酸含量は、ヘパリン及びグルクロン酸標準物質を用いて作製した標準曲線から計算した。2つの標準曲線から得られた結果は、実質的に同じであった。
この方法を用いて、多くのプラスミドDNA調製物のウロン酸含量を評価した。このようなDNA調製物は、ヒト薬物試験で用いるためにある会社により調製されたGMPグレードのDNA、及び臨床グレードのDNAを含んだ。「GMP」は、米国食品医薬品局により、優良製造規則(GMP,Good Manufacturing Practice)として知られる規則に従って製造された化合物を表すために用いられる用語である。GMPにより製造される化合物は、ヒトでの使用のために安全であると考えられる。種々のプラスミドDNA調製物を試験した結果を、以下の表2に示す。
2.フコースアッセイ
グラム陰性細菌は、およそ25%のコラン酸からなることが知られているので、プラスミドDNA調製物も、コラン酸についてのアッセイに供した。コラン酸アッセイは、DNA1mg当たりに存在するフコースの量に基づいた。コラン酸は、2:2:1:1:3(フコース:ガラクトース:グルコース:ウロン酸:その他の修飾物)の比で22%フコースからなるが、その他の多糖コンタミネーション物質はフコースを含有しないか、又は少量のフコースのみを含有する。よって、フコースアッセイにより、精製プラスミドDNA調製物中のコラン酸コンタミネーション物質の量の同定が可能になった。
例えば、ウロン酸アッセイにより見積もってDNA1mg当たり約0.7mgの多糖を含有するプラスミドDNA調製物は、DNA1mg当たり0.14mgのフコース又は約0.64mgのコラン酸を有した。プラスミドDNA調製物中の主な多糖コンタミネーション物質はコラン酸であることが全般的に見出された。
コラン酸は、臨床グレードのプラスミドDNA中でさえ高いレベルで存在したので、プラスミドDNA試料のいずれの精製方法も、実質的に全てのコンタミネーションされたコラン酸をうまく除去できることを確実にする必要がある。よって、このような精製プロセスの前後のDNAへのコラン酸の汚染を評価するための方法を開発した。
試料中のフコース含量のアッセイのための基本的な手順は、Morrisによる論文(Morris, J.B. 1982. Anal. Biochem. 121:129-134)中に見出すことができる。このアッセイのための溶液調製並びに溶液及び試料についての貯蔵条件の詳細な記載は、既に発表されている(Passonneau, J.V. and O.H. Lowry. 1974. In: Methods of Enzymatic Analysis, U.H. Bergmeyer (ed.), 2nd edition, Academic Press: New York, volume 4, pp. 2059-2072)。
アッセイされるDNA試料(450ug)を3mlのバイアルに移し、凍結乾燥させる。各試料に、200ulの5.5Mトリフルオロ酢酸を加え、反応バイアルをテフロン(登録商標)裏打ちキャップで密閉する。試料を100℃にて4時間加熱することにより、加水分解を達成する。室温まで冷却した後に、トリフルオロ酢酸を、換気フードの下でアルゴン気流を用いて除去する。残った残渣を、次いで、212ulの滅菌水中に再溶解する。425ugの最初のDNA試料に相当する、得られた試料の200ulだけをフコースアッセイに用いる。
Morrisにより記載される方法(1982. Anal. Biochem. 121:129-134)を用いて、200ulの試料及び標準物質を、1.5mlの微量遠心管にピペットを用いて入れる。用いた標準物質は、0ugフコースから200ugフコースまでの濃度範囲のフコース溶液である(0、1、12.5、25、50、100及び200ugのフコース)。
遠心管を氷上に置き、50ulの1mg/mlフコース脱水素酵素溶液を加え、その後、50ulの200uM NAD+を加える。遠心管を混合し、4℃にて3時間インキュベートする。酵素反応を停止するために、50ulの1N NaOHを各遠心管に加え、60℃にて10分間インキュベートする。次いで、遠心管を氷上で冷却し、試料を50ulの1M塩化水素酸と混合して、試料を中和する。
各試料から50ulの等分を回収し、新しい1.5ml微量遠心管に移す。各試料に250ulのサイクリング試薬(200mM Tris pH8.4;50mM酢酸アンモニウム;0.5mM ADP;100mMラクテート;5mMアルファ−ケトグルタレート;20unit/mlラクテート脱水素酵素;20unit/mlグルタメート脱水素酵素)を加え、溶液を混合し、室温にて1時間インキュベートする。各遠心管を沸騰水中で2分間加熱することにより、サイクリング試薬の酵素反応を停止する。
遠心管を氷上で冷却し、次いで、250ulのピルベート試薬(800mMイミダゾール緩衝液、pH6.2;0.45mM NADH;0.06unit/mlラクテート脱水素酵素)を加え、遠心管を混合する。遠心管を、次いで、室温にて水浴中で1〜2分間温めた後に、30℃のインキュベータに20分間入れる。ピルベート反応を、各試料に200ulの1.5M HClを加えて溶液を混合することにより停止する。
各遠心管の内容物を、次いで、15mlのキャップ付き試験管に移し、2.5mlの6N NaOHを加えて混合する。次いで、試験管を60℃にて10分間インキュベートする。試料を室温まで冷却した後に、4mlの滅菌水を各試験管に加え、試験管を逆さまにして、蛍光測定に供する。
各試料の一部(300ul)を、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに等分する。3〜5ウェルを滅菌水で満たし、ブランクとして用いる。蛍光光度計を、360nm励起フィルター及び465nm発光フィルターを用いて設定する。標準物質及び試料の蛍光を読み取り、ブランクの蛍光を減じる。標準物質の蛍光読み取り値を標準曲線としてグラフにし、プラスミドDNA試料中のフコースの量を、標準曲線からの内挿法により決定する。
この方法を用いて、プラスミドDNA試料のフコースレベルを決定し、コラン酸レベルの濃度を算出した。コラン酸は、種々の供給源からのプラスミドDNAにおいて、GMPグレードのプラスミドDNAにおいてさえも主なコンタミネーション物質であることが一貫して見出された。
3.ゲル電気泳動したDNA試料の蛍光検出
プラスミドDNA試料中の多糖の検出のために開発された視覚的方法は、プラスミドDNA試料中の多糖を選択的に標識できる物質で試料を標識することを含んだ。このような物質の1つは、(4,6−ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセイン(DTAF,(4,6-dichlorotriazinyl) aminofluorescein)(Molecular Probes社製、Eugene、OR)である。DTAFは、それらがウロン酸を含有していても含有していなくても全ての多糖を特異的に標識する。この蛍光プローブは、多糖又は炭水化物中に見出されるヒドロキシル基と反応し、よって、ウロン酸検出を用いるアッセイ方法を超える応用を有するプローブである。
DTAFはDNAを標識しない。なぜなら、DNAは利用可能な遊離のヒドロキシル基を有さないからである。DNA中の全ての利用可能なヒドロキシル基は、リン酸化される。この特異性により、DTAFは、DNAをその多糖コンタミネーション物質から区別するために好ましい標識となる。DTAFを本発明の方法において用いたが、多糖とDNAとの標識の特異性を提供する任意の蛍光標識が、本発明の方法において有用であることを当業者は理解する。
DNA及び多糖は、1つのゲル上で並行して泳動される試料中で視覚化できる。DNAは、試料をゲルに加える前に、エチジウムブロミド(EtBr,ethidium bromide)で前処理される。多糖はDTAFで標識される。プラスミドDNA試料は、1つのゲル上の2つのレーン中で、一方のレーン中にEtBrで染色された試料、及び他方のレーン中にDTAFで染色された試料を用いて泳動できる。このことにより、プラスミドDNA試料中の多糖及びDNAの含量を視覚化することが可能になる。
DNA及び多糖の標準物質(40ulの2mg/ml溶液)を、10ulの3M酢酸ナトリウム、pH5.2、その後、200ulの冷エタノールを加えることにより沈殿させた。試料を−20℃にて30分間インキュベートし、次いで、10,000rpmにて4分間、Eppendorf社製微量遠心分離機で遠心分離した。沈殿物を、次いで、10ul酢酸ナトリウム及び200ulエタノール中に懸濁し、再び遠心分離した。沈殿物を、次いで、200ulエタノールに再懸濁し、再び遠心分離し、50ulの0.1M炭酸ナトリウム、pH10.5に溶解した。
新鮮なDTAF懸濁物を、60mg/mlのDTAFをカーボネート緩衝液に懸濁することにより調製する。全てのDTAFが溶液にはならないので、得られた懸濁物をボルテックスした後に、これを各試料に加える。新鮮なDTAF懸濁物の5ulの試料(冷暗所に保存された)を、溶解した試料に、0分、45分及び90分の一定時間間隔で加える。DTAF懸濁物のそれぞれの添加の際に、反応混合物をボルテックスし、暗所にて室温に置く。10ulの酢酸ナトリウム及び325ulのエタノールを加えて各試料を沈殿させることにより、2.5時間後に反応を停止する。これらの試料を−20℃にて45分間インキュベートすることにより、沈殿が促進される。試料を、次いで遠心分離し、沈殿物を25ulの酢酸ナトリウム及び500ulのエタノールで3回洗浄する。試料を、最後に、500ulのエタノールで洗浄し、暗所にて室温で20分間乾燥させる。
洗浄した試料を、40ulのTrisアセテートEDTA(TAE,Tris Acetate EDTA)緩衝液に溶解し、2.5ul〜20ulの試料をゲルに供する。DTAFと反応しなかったDNA試料は、EtBrの存在下でゲルの他のレーンに加えた。ラムダDNA−Hind III消化物及びPhiX174DNA−HaeIII消化物を、ゲルマーカーとして泳動する。
ゲルは、1%アガロースTrisアセテートEDTAゲル、pH8.3である。ゲルも泳動緩衝液もエチジウムブロミドを含まない。ゲルを45分間、90ボルトにて電気泳動する。サンプル緩衝液が、ラムダHind IIIマーカーレーンを除いて、DTAF蛍光を消光させるブロモフェノールブルーを含まないようにしなければならないことに注意することが重要である。
図2は、いくつかの異なるDNAプラスミド試料を、多糖の視覚化及び定量化のためのこのゲル電気泳動法を用いて試験した場合のゲルを示す。LPS(Sigma Chemical Company社製、St.Louis、Mo.)及びリピドAの脂肪酸部分が除去された「解毒化」LPS(Sigma Chemical Company社製、St.Louis、Mo.)を、ゲルのレーン10及び8にそれぞれ対照として加えた。レーン1〜4及び12は、ウロン酸含量を表1に示すプラスミドDNA試料のDTAF染色を示す。レーン5、7、9、11及び13には試料を載せていない。レーン6は、Qiagen社製のエンドトキシン非含有DNA試料(精製プラスミドDNAの現在考えられる最良の基準)のDTAF染色を示す。
図2に示すゲルのレーン14〜20は、異なるDNA試料のEtBr染色の結果を示す。レーン14〜17は、レーン1〜4でDTAFを用いて染色されたのと同じEtBrで染色されたDNA試料である。レーン18は、EtBrで染色されたレーン12で示すDNA試料である。レーン19は、DTAFで染色されたレーン6で示す、Qiagen社製のエンドトキシン非含有DNA試料のEtBr染色である。レーン20は、EtBrで標識された高分子量及び低分子量のDNAマーカーの混合物である。
結果は、多糖及びDNAがゲル上の異なる位置に泳動され、DTAFが、DNA試料中に含まれる多糖のみを標識し、エチジウムブロミドがDNAのみを標識したことを示した。Qiagen社製のエンドトキシン非含有DNAを含む全てのDNA試料は、検出可能なレベルの多糖を含んでいた。LPS及び解毒化LPSも、検出可能なレベルの多糖を含んでいた。よって、「解毒化」LPS(Sigma Chemical Company社製、St. Louis、Mo.)は、全てのリピドAがおそらく除去されているが、解毒化LPS試料を含むレーン8において、まだ著しいレベルの多糖が検出された。
これらのデータを以下の表3に示す。
4.プラスミドDNA試料中で見出された多糖の毒性
プラスミドDNA試料中で検出された多糖のレベルが臨床的に著しいかを決定するために、試料の急性毒性研究を動物において行った。6週齢のBalb/cマウスに、DNA−リポソーム複合体を静脈内注射したが、このリポソームは、発表された手順に従って調製した(Nancy Smyth Templeton, et al. July 1997. Nature Biotechnology 15:647-652)。各群20匹のマウスに注射し、注射後1週間追跡した。結果を表4に示す。
結果は、DNA1mg当たり0.4mgの多糖を含有する100ulのDNAの静脈内注射により、注射後18時間以内に全てのマウスが死亡したことを示した。これとは対照的に、50ulの同じDNAの注射により、注射後1週間以内にいずれの動物も死亡しなかった。同様の結果が、種々の供給源からのDNA試料を用いて得られた。
DNA1mg当たり約0.26mgの多糖のレベルを含有するプラスミドDNAは、50ugのDNAを、免疫低下トランスジェニックマウスに1週間に1回、3カ月間注射した場合に、遺伝子発現が低下することが見出された。プラスミドDNA調製物がDNA1mg当たり検出不可能なレベル(0.03mg未満)の多糖を含有する場合、動物に有害な影響はなかった。
清浄DNAは、ウロン酸アッセイ又はDTAFでの染色により測定して検出可能な多糖を含有しない。
**注射したリポソームの量は、100μlのDNAとともに注射した量と等しかった。
我々は、マウスにおいてさらなるインビボ研究も行って、我々のDNA精製手順を、切断型CAE組換えタンパク質を用いて試験した。これらの研究は、正常マウス(Balb/c)及び膵臓腫瘍を有するか又は有さないSCIDマウスにおいて行った。SCIDマウスは、コラン酸に対してより感受性が高く、リポソーム及びその他の陽イオン性担体と複合させた40ugの商業的に製造されたプラスミドDNAを含有するiv注射で死亡するが、Balb/cマウスは、50ugをちょうど超えるプラスミドDNAのレベルで死亡する。図12〜14に示す表において、我々は、合計で120匹のマウスが、本発明のプロセスに従って精製された、高用量のDNA−BIVリポソーム複合体のiv注射後に生存したことを示した。
5.BCA試薬を用いるCAE検出のためのアッセイ
原理:コラン酸酵素(6×His−CAE)及びその他のカルボヒドラーゼは、それらの基質を分解する際に還元末端を増加させる。このプロトコルに示す小型化高感度ビシンコニン酸(BCA,bicinchoninic acid)還元値アッセイは、糖類の還元末端を検出する。このアッセイは、任意の多糖を分解する全てのカルボヒドラーゼ;エキソ型又はエンド型のいずれの機構を有する酵素をも検出するために用いることができる。しかし、培養培地、タンパク質及び基質を原因とするバックグラウンド吸光度を低下させるように注意すべきである。
材料及び装置:
コラン酸(CA):0.05Mリン酸カリウム緩衝液pH6.5中に2μg/μl
6×His−CAE:0.05Mリン酸カリウム緩衝液pH6.5中に0.5μg/μl
ウシ血清アルブミン(BSA,Bovine Serum Albumin):0.05Mリン酸カリウム緩衝液pH6.5中に0.5μg/μl
緩衝液:0.05Mリン酸カリウム緩衝液pH6.5
Micro BCAタンパク質アッセイキット(Pierce社製品#23235)
可視光96ウェル反応プレート(Applied Biosystems社製、Part#4306737)
96ウェル、平底非組織培養検査済み非滅菌PVCフレキシブルプレート(Falcon社#353912)又はFisherbrand社製平底96ウェルプレート、透明、PS、非滅菌(Cat#12565501)
マルチチャネルピペット
96ウェルプレートリーダー
37℃及び50℃のインキュベータ
96ウェルプレートをスピンするためのローターを有する遠心分離機
大まかな手順:大まかに、このアッセイは、96ウェルフォーマットを用い、各ウェルは、2μgのCAE(テスト)又はBSA(ブランク)と、100μgのCAの混合物を、110μlの合計容量の緩衝液中に含み、これを37℃にて3時間、その後、50℃にて21時間インキュベートする。その後、100μlの各反応混合物を新しい96ウェルプレートに移し、ここに、100μlの新しく調製したBCA試薬を加え、37℃にて2時間インキュベートし、RTまで15分間冷却し、550nmにてマルチプレートリーダーを用いて読み取りを行う。
詳細な手順:可視光96ウェル反応プレート(Applied Biosystems社製)中に、等分のブランクの合計容量(すなわち緩衝液+CA+BSA)は、3重で110μlであり、すなわち、以下のものをこの順序で加える、56μl緩衝液+50μlの2μg/μl CA+4μlの0.5μg/μl BSA。
等分のテストの合計容量(すなわち緩衝液+CA+6×His CAE)は、3重で110μlであり、すなわち、以下のものをこの順序で加える、56μl緩衝液+50μlの2μg/μl CA+4μlの0.5μg/μl 6×His−CAE。
全てのウェルを、提供されるストリップキャップを用いて密閉する。プレートを、1500rpmにてRTで1分間スピンする。キャップをウェルから外し、マルチチャネルピペットを用いて穏やかにピペット操作で3回上下することにより混合する。キャップを用いてウェルを再び密閉し、プレートを37℃のインキュベータ中で3時間インキュベートする。
プレートを50℃のインキュベータに移し、1晩、合計で21時間インキュベートする。
プレートを、1500rpmにてRTで1分間スピンする。
マルチチャネルピペットを用いて、各ウェルの試料100μlを、新しい96ウェルプレートに等分する(Falcon又はFisherbrand社製)。
Micro BCAキット中で提供される3つの試薬、すなわちMA+MB+MCを、0.5:0.48:0.02の比で、全てのウェルに足りる十分な量を用いて混合することにより、BCA試薬を調製する。100μlのこの新しく調製したBCA試薬をマルチウェルピペットを用いて各ウェルに等分し、ピペット操作で3回上下することにより穏やかに混合する。96ウェルプレートに蓋をし、プレートを37℃のインキュベータ中で2時間インキュベートする。プレートを室温にて15分間冷却し、550nmにてマルチプレートリーダーを用いて読み取りを行う。
CAE活性の値を得るために、ブランクの値をテストから減じる。注意:マルチプレートリーダーにて550nmでの読み取りができない場合、その他の波長で読み取りを行うことができる。例えば、544nm、570nm、595nm。しかし、読み取りは550nm付近が最適である。
参考文献:P.J.A. Meeuwsen, J.-P. Vincken, G. Beldman and A.G.J. Voragen, J. . A Universal Assay for screening expression libraries for carbohydrases. Biosci. Bioeng. 89 (2000), pp. 107-109; Verhoef R, Beldman G, Schols HA, Siika-aho M, Ratto M, Buchert J, Voragen AG. Characterisation of a 1,4-beta-fucoside hydrolase degrading colanic acid. Carbohydr Res. 2005 Aug 15;340(11):1780-1788.
6A.プラスミドDNA調製物中のCAEの検出のための粘度アッセイ
原理:コラン酸(CA,Colanic Acid)は粘性であり、コラン酸酵素(6×His−CAE)により触媒で分解されるとその粘度が低減する。この粘度の低下は、粘度計を用いて正確に測定でき、対照反応、すなわちCAを含むが酵素を含まないものを用いて得られた値と比較することにより、CAEの活性を算出するために用いることができる。
材料及び装置
0.05Mリン酸カリウム緩衝液pH6.5中のコラン酸(CA)1.2mg/ml
0.05Mリン酸カリウム緩衝液pH6.5中のコラン酸酵素(6×His−CAE)1.0μg/μl
緩衝液:0.05Mリン酸カリウム緩衝液pH6.5
37℃の水浴
Brookfield社製DV-I+粘度計
Brookfield社製CPE 40スピンドル
大まかな手順:
600μgのCAを、1μgのCAEと、0.05Mのリン酸カリウム(Pot Phosphate)緩衝液pH6.5の存在下で、500μlの合計容量中で混合した。混合し、水浴を用いて37℃にてインキュベートする。RTまで10分間冷却し、粘度計を用いて読み取る。これを、CAEを含まない対照反応と比較する。
詳細な手順:
対照について、1.5mlのエッペンドルフチューブに、0.5mlの1.2mg/mlのCA+50μlの0.05Mリン酸カリウム緩衝液pH6.5を等分する。
テストについて、1.5mlのエッペンドルフチューブに、0.5mlの1.2mg/mlのCA+1μlの6×His−CAE(1.0μg/μl)+49μlの0.05Mリン酸カリウム緩衝液pH6.5を等分する。
穏やかにピペット操作で上下することにより混合し、37℃にて1時間、水浴を用いてインキュベートする。水浴からチューブを取り出し、RTまで10分間冷却する。
テスト及び対照の粘度を、100rpmに設定したBrookfield社製DV+粘度計を用いて30秒間、CPE 40スピンドル中に等分したそれぞれの反応混合物0.5mlを用いて測定する。
テスト及び対照の両方について、センチポアズ(cP,CentiPoise)としての粘度の値を書きとめ、CAE活性を、cPの値を用いて以下のように算出する。計算は、粘性を有さない水が1.00のcP値を有することに基づく。CAEが100%活性であれば、CAの粘度を1.00のcP値まで減少させる。よって、例えば、対照が1.57のcP値を有する場合、我々は、そこから1.00を減じて、1.57−1.00=0.57の値を得て、これが100%活性を表す(すなわち、cP値がこの試験において0.57低下する場合、100%のCAE活性を有する)。テストが1.05のcP値を有する場合、我々は、同様に、このcP値を対照の値から減じ、すなわち1.57−1.05=0.52、この値を用いて実際のCAE活性は以下のように算出される:0.57が100%活性であるので、0.52は何%活性であるか?0.52に100を乗じ、0.57で除する=91.22%のCAE活性。
6B.CAE活性の同定のための粘度試験
コラン酸試料の粘度の変化を測定するバイオアッセイを用いて、CAEを検出した。コラン酸試料の粘度の低下は、CAE活性の指標となった。酵素フラクションとのインキュベーションの前後のコラン酸試料の粘度を、CPE-40コーンを有するWells-Brookfieldコーンプレート型粘度計を用いて測定した。この粘度計は、約500ulの少ない容量での粘度の変化の最も高感度の測定を提供した。粘度計の精度は、鉱油標準物質の粘度を測定し、読み取り値を鉱油についての既知の粘度と比較することによりモニターした。
CAEアッセイは、1.5%コラン酸溶液の500ul試料を用いた。50〜100ulの希釈した酵素試料又は対照試料を1.5%コラン酸溶液に加えた。酵素アッセイのための対照は、希釈酵素試料を緩衝液に加え、非タンパク質様試料を1.5%コラン酸溶液に加えることにより調製した。各試験試料(酵素試料又は対照試料)を1時間、37℃にてインキュベートした。1時間のインキュベーションの後に、試験試料を室温に10分間調整した。
全ての試験試料の粘度を、室温にて30秒間、100rpmにて測定した。上記のようにして単離して精製したCAE活性を有する全ての試験試料は、粘度の変化を示さなかった対照試料と比較して、著しい粘度の低下を示した。CAE試験試料は、1.5%コラン酸溶液の粘度を1.51から0.99まで減少させ、0.99は、Wells-Brookfieldコーンプレート型粘度計を用いて得ることができる最低の粘度読み取り値であり、かつ緩衝液対照の粘度読み取り値に等しかった。
よって、本発明は、プラスミドDNA試料中の多糖の検出及び定量の方法と、プラスミドDNA試料から多糖を、臨床的に著しい毒性を生じるレベル未満の多糖のレベルまで除去するための方法との両方を提供する。
本発明は、その他の実施形態が可能であり、種々の様式で実施し、行うことができると理解される。また、本明細書で用いる語法及び用語は説明を目的とし、限定とみなされるべきでないと理解される。
本明細書に開示され、請求される全ての組成物及び方法は、本開示に鑑みて過度の実験を行うことなく作製して実行できる。本発明の組成物及び方法を、好ましい実施形態に関して記載したが、本発明の概念、精神及び範囲を逸脱することなく、本明細書に記載される組成物及び/又は方法並びに方法のステップ若しくはステップの順序を変動させ得ることが当業者には明確である。より具体的には、化学的及び生理的に関連するある作用物質は、同じ又は同様の結果を達成しつつ、本明細書に記載される作用物質を置換できることが明確である。当業者にとって明確な全てのこのような同様の置換物及び改変物は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であるとみなされる。

Claims (1)

  1. コラン酸分解酵素で処理された、グラム陰性菌のプラスミドDNAと、前記グラム陰性菌のプラスミドDNA1mg当たり0.1mg未満のコラン酸とを含む、グラム陰性菌のプラスミド組成物。
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