JPH09510354A

JPH09510354A - 真核細胞を処理する方法

Info

Publication number: JPH09510354A
Application number: JP7524369A
Authority: JP
Inventors: マシューコッテン; アダムベイカー; ミハエルブッシュル; エルンシュトワーグナー; タマスシュヴァイヒホッファー
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムインターナショナルゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1994-03-18
Filing date: 1995-03-17
Publication date: 1997-10-21
Also published as: EP0750677A1; CA2183647A1; WO1995025808A1; MX9603866A; DE4415001A1

Abstract

(57)【要約】真核細胞を処理する方法であって、リポ多糖類の毒性は有害な効果を有し、リポ多糖類に結合し、その毒性を中和する物質がトランスフェクションの間、又は外来物質を精製するために用いられる。外来物質が細胞内に導入されるとき、特に遺伝し転移法において、この方法は特に有益である。リポ多糖類結合物質を含有する組成物は、培地として細胞培養への応用、及び薬剤として薬学的応用に用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】真核細胞を処理する方法本発明は、真核細胞を処理する方法に関する。培養中、又はin vivo で真核細胞に関する仕事をしているとき、しばしば起こる１つの問題は、エンドトキシンの存在である。グラム陰性細菌の細胞壁の主要成分である、エンドトキシン（リポ多糖類、ＬＰＳ）はしばしば見出される。これは、例えば、通常の方法でプラスミドＤＮＡを調製すると、プラスミドＤＮＡ調製物中の異物として、E.coliの表面ＬＰＳの４０％までが遊離してくるためである。負の電荷のために、ＬＰＳは陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂の上でＤＮＡと同様の挙動でふるまうが、そのミセル構造におけるサイズのため、ＬＰＳはサイズ排除樹脂上で大きいＤＮＡ分子のようにふるまう。ＣｓＣｌ中におけるＬＰＳの密度は、プラスミド／臭化エチジウム複合体と同じであり、これは、ＣｓＣｌ中のＤＮＡが容易に汚染されることを意味する。従って、ＤＮＡのトランスフェクションが実施されるとき、細胞はＬＰＳと接触する。ＬＰＳ分子は有毒で、哺乳類動物の免疫系の強力な刺激剤であるので、細胞の処理中におけるその存在は好ましくない。このような理由により、ＬＰＳの検出において、この分子又はグラム陰性細菌を除くか、この分子によって引き起こされる有害な影響の効力を中和するための多くの試みがすでになされている(Cordl eら、1993；Elsbach 及びWeiss、1993；Golenbock ら、1993；Haziotら、1993a ；Lynnら、1991；Pereraら、1993；Rustici ら、1993；Tobiasら、1988；Tobias ら、1989；Ziegler-Heitbrock 及び Ulevitch、1993）。本発明の目的は、特に、外来物質、特にＤＮＡの細胞内への導入に関連する、真核細胞の処理においてＬＰＳの存在に関連する毒性の問題を克服することである。アデノウイルスに補助されるレセプターに仲介されるエンドサイトーシス(ade novirus-aided receptor-mediated endocytosis)によってプラスミドＤＮＡを、初代培養ヒト皮膚繊維芽細胞又は初代培養ヒトメラノーマ細胞に導入する実験の際、毒性の問題が生じることは確認されており、この問題の解決法を見つけることが、中でもWO 93/07283 and by Wagner ら、1992；Cottenら、1992；Curi elら、1991；Cottenら、1993；Cristiano ら、1993a；Cristianoら、1993bにおいて行われていた。ＤＮＡを含有するＬＰＳ又は純粋なＬＰＳを用いた実験により、この問題はＬＰＳの存在に由来していた。毒性は、１００ｎｇ／ｍｌの量のフリーのＬＰＳで生じ、ポリリシン／アデノウイルス複合体にＬＰＳが混入していれば、１００ｐｇ／ｍｌの量で生じる。本発明の範囲で、ＬＰＳに由来する毒性が、アデノウイルスに依存しない遺伝子転移法(gene transfer methods)においても見つけられた。ポリリシンと関連する毒性の可能性も除去された。この知見をもとに、まず第一に、ＤＮＡからＬＰＳ不純物を取り除き毒性を除去する方法が開発された。ＬＰＳを除去する、簡便かつ効果的な方法は、洗剤Tr iton X-114を使用する。Triton X-114は２０℃未満の温度で水溶液に混和し、２０℃を超えると層が分離する(Bordier(1981))。この現象は、蛋白質溶液(Aida と Pabst(1990))又はＤＮＡ調製液(Manthorpeら(1993))から親油性のＬＰＳ分子を抽出するのに利用される。ＬＰＳを分離する代替案は、ＬＰＳのリピドＡ／ケトデオキシオクトロン酸(k etodeoxyoctolonic acid)成分と高い親和力で結合する環状鋳型ペプチド抗生物質であるポリミキシンＢを用いる(Ka = 1.15×10⁷M^-1；、Rustici ら、1993；Ly nn及びGolenbock、1992；Schindler 及びOsborn(1979))。蛋白質からＬＰＳを除去するためにポリミキシンが用いられた。これを行うために、ポリミキシンは、クロマトグラフィーカラムで樹脂と結合した形式で用いられる。純粋なＤＮＡを用いた実験は、ＤＮＡ調製物からのＬＰＳの除去が遺伝子発現を増加させることを示す。けれども、ＬＰＳは、ＤＮＡ調製物の好ましくない付随物であるだけでなく、中でも、通常に用いられる細胞培養培地に存在する汚染物である。血清調製物のＬＰＳ含有量は広い範囲で変動する。もし、汚染された調製物を排除するために特別な段階を経なければ、含有量は１０〜５０ｎｇ／ｍｌとなるかもしれない。問題は、慣例通りに使用された、細菌と接触したガラス製器具に関連しても起こる。全ての試薬及びガラス製容器中のＬＰＳ含有量を監視することは非常に骨のおれることであるから、上述した問題（真核細胞の処理中ＬＰＳの存在と関連する問題）を解決するために、試みは始めから、特に外来物質を細胞内に導入するときに除去しようとする方法を見つけるようにされた。本発明は、真核細胞を処理する方法に関し、特に、外来物質を取り込み、細胞が、リポ多糖類と結合しそれの細胞に対する毒性を妨害する物質で処理される方法、及び／又は細胞内に導入される外来物質が、材料が細胞内に導入される前にＬＰＳを除去するために精製されたものである方法に関する。この性質を有する物質が、以下わかりやすさのために「ＬＰＳ結合物質」として言及される。該物質は単一の物質又は混合物として生じ得る。本発明は、ＬＰＳの存在が方法の効率に対する消極的な影響のある毒性を引き起こす細胞に、外来物質を取り入れる全ての方法に応用できる。中でも、薬剤、薬剤のコンジュゲート又は毒素の細胞への導入を含有する。好ましくは、該方法は外部ＤＮＡ又はＲＮＡを細胞内に導入するための、トランスフェクション及びインフェクション方法、例えば、組み換えウイルスを用いる方法だけでなく、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション及びＤＥＡＥ法、リポソーム又は陽イオン脂質と操作する方法に適用される。受容体に仲介されるエンドサイトーシスに基づく遺伝子転移法に関連してこの方法を用いることは特に好ましい。例えば、この方法の要約がCotten及びWagner(1993)によって提供される。細胞のトランスフェクションの際に本発明を用いる必要性は、ＬＰＳの存在又は不存在下で、他の条件を同一にしてこの方法を実施し、得られた結果を比較することによって決定される。ＬＰＳ結合物質は、十分な親和力でＬＰＳと結合すること、及び毒性の原因となる細胞成分との相互作用を遮断することの両方が必要である。（これらの要求を満足する物質と対比して、例えば、実際にＬＰＳと高い親和力で結合するがＬＰＳ毒性に対する細胞の反応を活性化する急性期蛋白質である、リポ多糖類結合タンパク等のタンパクがある。そのような影響は、本発明の範囲をもって好ましくない）。外来物質、特に、ＬＰＳを除去するために精製されたＤＮＡが細胞内に取り込まれる本発明の具体例において、ＤＮＡは、ポリミキシンと、特にポリミキシン樹脂を通したクロマトグラフィーによって処理され、又はTriton X-114等の適当な洗剤で抽出される。トランスフェクションの間細胞を処理するために、ＬＰＳの存在が少なくとも飽和しており、物質自身が毒性を有さないように意図した使用に関する毒性が中和されるような量で、ＬＰＳ結合物質が用いられる。基質の適合性及びそれの最適濃度を決定するために、トランスフェクション実験、例えば、問題の細胞において特有のトランスフェクションが行われることを目的として、適当に実施された。滴定によって、物質が、それ自身細胞における有害な影響を有することのない遺伝子発現の増加を引き起こすことで適当な濃度が見出される。トランスフェクション系に加え、細胞の形態に対するＬＰＳ結合物質の影響が顕微鏡下で研究できる。更に、検定は、ＬＰＳに対する反応として生じているネクローシス又はアポトーシスの測定により、細胞成分の放出の測定に用いることができる。これらの例は、大規模に臨床上用いられる、商業上入手可能なラクテートデヒドロゲナーゼ、又は最近記載された、カルセイン−ＡＭ及びヨウ化プロピジウム(propidium iodide)で染色した後のエピ蛍光法である(Lor enzoら(1994))。そのような方法を用いると、本発明の範囲内で、ポリミキシンＢの場合、培地は、好ましくは１００μｇ／ｍｌ未満含有すべきであり、低濃度の限界は３μｇ／ｍｌ又はそれ未満である。ポリミキシンによって達成された中性化は１μｇ／ｍｌ又はそれ未満の濃度で悪化する。これは、１０〜１００ｎｇのＬＰＳを中和するのにポリミキシンが２５０ｎｇ必要であることに対応する。ＬＰＳがトランスフェクション複合体に導入され、従って、ＬＰＳ結合物質への結合が絶対的に可能にならなくてもよいことは覚えておくべきである。もし、ＬＰＳを含有するトランスフェクション複合体が細胞質に遊離するなら、ＬＰＳ結合物質によつ中和が細胞内のレベルで生じることが可能である。従って、培地中の過剰の抗生物質は、中和を達成するために、ＬＰＳ結合物質の十分な細胞内濃度を確実にするために必要である。毒性を妨げるのに必要な最小濃度は滴定によって決定することができる。本発明の１つの具体例において、ＬＰＳ結合物質はポリミキシンＢである。他の具体例において、物質は、ポリミキシンＢの誘導体で１つのアミノ酸においてのみ異なるポリミキシンＥである(Stormら、(1977)。ポリミキシンＢと同様に、それはＬＰＳと結合することができるが、ポリミキシンＢと異なり、プロテインキナーゼＣ活性を阻害する能力はない。ＬＰＳと結合し中和することが知られている他の例は、以下に挙げられる： HDLs及びLDLs(Levine ら、1993；Flegelら、1993；Rothら、1993)、アポリポタンパクＡｌ(Flegel ら、1993)、本発明に要求される性質を有するＢＰＩタンパク（殺菌性透過促進タンパク）又はその断片(Dentener ら、1993；Elsbach 及び Weiss、1993）、リムラス(Limulus)タンパク(Roth 及びTobias、1993)、細胞毒性を現象するポリミキシンの誘導体、ＬＰＳと親和力のある合成ペプチド(Rusti ciら、1993)、ＬＰＳ又はリピドＡに対する抗体(Burd ら、1992)。更に、例えば、ＬＰＳと結合する性質を有することが知られている大きい分子のＬＰＳ結合領域を同定し、ペプチドを、任意には修飾された形で用いることにより、適当な物質がデザインされた。また、ポリミキシンＢに対する Rusticiら(1993)の提案と同様に、ＬＰＳと結合する性質が知られている低分子の分子の構造が、ＬＰＳと結合し無毒化するための新しい分子を調製するための最適なデザインの出発物質として用いられた。細胞を処理するためのＬＰＳ結合物質は、好ましいトランスフェクション培地の部分とすることによって容易に用いられる。一般に、ＬＰＳの毒性効果は主にトランスフェクションの間に現れるので、ＬＰＳ結合物質はトランスフェクションの間のみ存在を要求される。従って、トランスフェクションの後に培地を交換した時、この物質を加える必要はない。けれども、例えば、ＬＰＳに感受性のタイプの細胞では、トランスフェクション後の物質の存在は細胞の増殖に役立つ。この場合、トランスフェクション又はインフェクション後の細胞に加える新鮮な培地も、ＬＰＳ結合物質を含有する。本発明に基づく方法の別の具体例においては、もし必要であれば、細胞をトランスフェクション培地と処理する迄に、存在するＬＰＳと結合し除去するＬＰＳ結合物質と前処理させる。細胞のＬＰＳ結合物質との処理は、例えば、ＬＰＳに非常に感受性の細胞を培養中に、細胞に取り入れられる外来物質をもってそれらの処理をすることに関わりなく有利であり得る。他の面による、本発明は、より高度な真核細胞を処理するための組成物に関する。細胞培養への適用の場合には、この構成は、通常の成分に加え、１又はそれ以上のＬＰＳ結合物質を含有する培地である。通常の成分は、細胞のための栄養素、緩衝液成分等を含む。もし、ＬＰＳ結合物質がトランスフェクション培地の成分であるなら、これは、トランスフェクション成分、即ち、細胞内に導入される外来物質及びそれの細胞内への転移を仲介する成分（例えば、任意に遺伝子転移の効率を向上させる、エンドソーム溶菌的(endosomolytic)な試薬と関連する受容体仲介遺伝子転移のための複合体だけでなく、組み換えウイルス、陽イオン脂質、リポソーム等、中でも、WO 93/07283 に記載されたこの種の複合体）をも含有する。この種のトランスフェクション培地を調製する際、トランスフェクション成分の前にＬＰＳ結合物質を添加することが薦められる。本発明は、細胞培養における細胞の処理、及びin vivo 又はex vivo における治療への用途の両方に適用される。後者の場合には、ＬＰＳ結合物質を含有する培地は薬剤として機能する。本発明は、ＬＰＳの存在が引き起こす問題における治療への適用において有益である。遺伝子治療の分野におけるこの一例は、遺伝子が変異している嚢胞性線維症の患者への完全なＣＦＴＲ（嚢胞性線維症トランスメンブランレギュレーター）遺伝子の投与のための組み換えアデノウイルスの治療への利用である。ＣＦ患者の肺は大量のシュードモナスＬＰＳを含有している（シュードモナス感染はこの病気に付随する現象である）ので、鼻上皮を通して、又は喉頭注入法により直接肺に導入されるこの方法の１つの制限は、組み換えアデノウイルスとＬＰＳとが結合して入ることによって引き起こされる、肺上皮への毒性を含み得ることである。本発明の範囲内で、実験が気道の上皮細胞で行われ、ポリミキシンＢが、ＬＰＳによって起こる遺伝子発現の急落を妨げる能力があることが示された。従って、アデノウイルスを含有する培地へのＬＰＳ結合物質の添加は、肺上皮細胞の治療処理における重要な改善を達成することができる。他の例は、トランスフェクトすることが困難であると知られている内皮細胞への適用である；この困難さに対する１つの可能な説明が少量のＬＰＳに応答するための、これらの細胞の性質であるかもしれない(Arditi ら、1993、Haziotら、 1993b、Pugin ら、1993）。ＬＰＳに影響を及ぼされた他の細胞に対する１つの細胞の反応としての異なる細胞性因子が分泌する間、それは、自らＬＰＳと直接接触するわけではない。本発明の範囲内で、膝静脈内皮細胞のトランスフェクションは少量のＬＰＳの汚染が毒性を生じることを示す。ＬＰＳが精製されたＤＮＡを用いているので、これらの汚染は、もっぱら組織培養試薬に由来する。ポリミキシンは、少量のＬＰＳによって引き起こされる毒性でさえも中和することができる。本発明は、細胞集団が少量のＬＰＳに汚染されたとき、ex vivo における患者細胞のトランスフェクションにおいても好都合である。このような適用の一例は、患者から腫瘍細胞を取り出し、免疫賦活ポリペプチドをコードするＤＮＡをex vivo で形質転換し、ワクチン注射として患者に与えられる、癌ワクチンの製造である。治療への適用において、ＬＰＳ結合物質は、トランスフェクション又はインフェクション培地として機能する組成物成分として存在し、従って、トランスフェクション成分と共に細胞に適用される。それは、トランスフェクション前にトランスフェクション培地に添加されるか、トランスフェクション成分とは別に、例えば、トランスフェクションの前に投与される、薬剤調製物の活性成分として存在し得る。その最も単純な形態では、この種の調製物はＬＰＳ結合物質の溶液であり、該調製物は通常の添加剤を含有する；薬剤調製物を製造する方法は、当業者に知られている。それらは、関連の教科書、例えば、Remington の Pharmaceu tical Sciences(1980)に記載されている。従って、他の面によれば、本発明は、外来物質が細胞に取り込まれた治療での取り扱いのためのＬＰＳ結合物質を含有する医薬組成物に関する。外来物質は好ましくは核酸であり、特に好ましくはＤＮＡである。他の面によると、本発明は、ＤＮＡ又はＲＮＡのトランスフェクション又はインフェクションによるヒト又は動物体の処理前及び／又は同時に、及び／又は処理後に使用する医薬組成物を製造するためのＬＰＳ結合物質としての利用に関する。これらの治療処理は、好ましくは、遺伝子転移法に加え、Cotten及びWagner， 1993の論文に要約して記載されたような遺伝子治療操作を含み、それらの方法は、特に細胞機能を阻害するために用いられるアンチセンスＲＮＡ、リボザイム又はＤＮＡ分子を含有する。他の面では、本発明は、ヒト又は動物細胞に導入されたＤＮＡ（ＤＮＡはＬＰＳが除去されている）を処理する方法に関する。図面の簡単な説明図１．ヒトメラノーマ細胞におけるＩＬ−２を発現するＤＮＡのエンドトキシン含有量による影響図２．初代培養ヒト繊維芽細胞のトランスフェクションの際のポリミキシンＢによるＬＰＳ毒性の減少図３．0.03μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌの濃度におけるポリミキシンＢの活性様式図４．トランスフェクションの間、及びトランスフェクション後のポリミキシンＢの影響図５．ポリミキシンＢ存在下におけるラクテートデヒドロゲナーゼの遊離及びトランスフェクション効率の関係図６．プラスミドＤＮＡの天然ＬＰＳ汚染物によって引き起こされる毒性の、ポリミキシンＢを用いた遮断図７．初代培養ヒト気道細胞におけるＬＰＳ毒性の、ポリミキシンＢを用いた遮断図８．組織培養試薬由来のＬＰＳによって引き起こされる、膿静脈内皮細胞における毒性のポリミキシンＢによる遮断図９．ポリミキシンＢを用いた、ＬＰＳによって誘導される毒性の遮断図10．種々の遺伝子転移法を適用した場合のＤＮＡ発現に対するポリミキシンの効果本発明を詳述する以下の実施例においては、特に断らない限り、以下の材料及び方法を用いた。 a)プラスミド構築物 i)pCMVL 該プラスミド構築物は、WO 93/07283 に記載されている。 ii)pGShIL-2tet ヒトIL-2をコードする配列を含むプラスミドを得るために、pWS2ベクターを出発材料として用いた。pHβAPr-1 ベクターをBamHI 及びEcoRI で切断した(Gunni ngら、1987)。アガロースゲル精製によって、アンピシリン耐性遺伝子、pBR322 の複製オリジン及びSV40ポリアデニル化シグナルを有する2.5ｋｂのフラグメントが得られた。この断片を、pAD-CMVI(EP-A 393 438 に記載されている）から0. 7ｋｂＰＣＲフラグメントとして増幅されたＣＭＶプロモーター／エンハンサーと連結し、EcoRI/BamHI で切断した。得られたプラスミドはpWS と呼ばれる。ヒトIL-2をコードするｃＤＮＡは、ヒトIL-2をコードするｃＤＮＡを含有するヒト pIL2-50AからPCR フラグメントとして得られた(Taniguchiら、(1983)。PCRフラグメントを、SalI/BamHIによって開環されたｐｗｓベクターと連結し、このようにしてpWS2が得た。 CMV エンハンサー／プロモーター、IL-2をコードする配列、及びSV40−ポリＡ配列を含有するIL-2カセットを、pWS2を基礎とするPCR によって得た。PCR 生成物をEcoRI による制限酵素で処理し、プラスミドpUC19(Pharmacia)のEcoRI/SmaI 部位にクローニングした。得られたプラスミドはpGShIL-2として知られている。 SspI及びAvaIで切断されるプラスミドpBR327(Soberonら、(1980))を、テトラサイクリン耐性遺伝子及びβ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子）の「上流」部分との源として用いた。EcoRI/AvaIアダプターと共に、分離されたtet 配列を、pGShIL-2のEcoRI/SspI部位にクローニングした。得られたクローンpGSh IL-2tet/amp のIL-2カセットを配列した；次いで、amp 配列をEam1105IおよびSs pIで切断し、プラスミドを再連結した。得られたプラスミドをpGShIL-2tet と名付けた。 b)ＤＮＡ調製プラスミドは、先ず、細菌E.coli DH5α株中で、LB培地中、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン(pCMVL)又はテトラサイクリン(pGShIL-2tet)の存在下、培養した。一晩培養した培養物を遠心し、下記に示す通り、ＤＮＡを調製した。Cottenら (1993)によって記載された方法を用いて、CsCl密度勾配遠心を行った。これを行うため、１リットルの培養物からの細菌沈殿物を、２０％（ｗ／ｖ）ショ糖、１０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ7.5（溶液１）１０ｍｌ中で、氷上で１０分間インキュベートした。次いで、2.2ｍｌのリゾチーム（溶液１に１０ｍｇ／ｍｌに溶解したもの）を添加し、氷上で更に１０分間インキュベートし、次いで、0.2ＭＥＤＴＡ、ｐＨ7.5を１０ｍｌ添加し、試料を氷上で１０分間インキュベートし、最後に２％(ｖ／ｖ)Triton X-114、６０ｍＭＥＤＴＡ及び４００ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ7.5を添加し、氷上で１５分間インキュベートした。この溶解物を３０分遠心し(Sorvall SS34(17K))、上清に28.5ｇのＣｓＣｌ及び４０μｌの臭化エチジウム（１０μｇ／ｍｌ）を添加した（最初の量は２６ｍｌ）。この材料を、Beckman VTi50 ローターを用い、49,000rpm、２０℃で１８時間遠心した。二本のエチジウムを含むバンドの低い方のバンドを集め、Beckma n VTi65ローターを用い、63,000rpm、２０℃で４時間再遠心した。エチジウムを含むバンドを再び集め、CsCl飽和イソプロパノールでピンク色が消えるまで抽出し、ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ、0.1ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ7.4）で透析し、1/10 量の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５を加え、３倍量のエタノールで−２０℃で沈殿させた。得られたＤＮＡ沈殿物を、更にＲＮａｓｅ、プロテイナーゼＫ、フェノール／クロロホルム、及びクロロホルムで処理し、もう一度再沈殿させ、最終のＤＮＡペレットをＴＥにとり、吸光度分析により、0.05ｍｇ／ｍｌのＤＮＡが２６０ｎｍで１の吸収を有するとの仮定により定量を行った。 c)ＬＰＳのＤＮＡ精製 i)Triton X-114抽出洗剤の同質調製物を得るために、Bordier(1981)によって記載されたように、 Triton X-114(Sigma)を、０℃／３０℃の温度のサイクルに３回さらした。ＤＮＡ試料からリポ多糖類の抽出は、下記に示す公知の方法(Aida 及びPabst,1990、 Manthorpe ら、1993）の変形で行った。即ち、ＤＮＡ試料(１０ｍＭＴｒｉｓ、0.1ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ7.4（ＴＥ）中、濃度0.5〜1.5ｍｇ／ｍｌ)を0.3Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ7.5）に接触させた。次いで、Triton X-114をＤＮＡ溶液１００μｌ当たり３μｌ加え、試料をボルテックスにより力強く攪拌し、氷上で１０分間インキュベートした。溶液を２層に分離させ、試料を３０℃で５分間放置し、予備加熱しておいたエッペンドルフチューブ中で、2,000rpmで２分間遠心し、水層を新鮮なエッペンドルフ試験管に移した。抽出を２回以上行い、最終的に得られた水層を0.6倍容量のイソプロパノールで室温で沈殿させ、沈殿を遠心によって得、８０％エタノールで２回洗浄し、ＴＥに再び溶解し定量を行った。これを行うため、試料をＲＮａｓｅＡ、プロテイナーゼＫ、フェノール／クロロホルム、及びクロロホルムで処理し、再沈殿させ、最終のＤＮＡペレットをＴＥに懸濁し、２６０ｎｍの吸光度を測定し、0.05ｍｇ／ｍｌのＤＮＡが１の吸収を有するとの仮定により定量を行った（この方法は、実施例で用いられるＤＮＡのために用いられた）。 ii)ポリミキシンクロマトグラフィーＤＮＡ試料の容量に対し、等量のポリミキシン樹脂スラリー(Affi-Prep-Polym yxin,Biorad)を３倍量の0.1規定ＮａＯＨと簡単に混合し、樹脂の５倍容量のＴＥで３回洗浄した。ペレット状の樹脂を再びＤＮＡ試料（ＴＥ中、0.8〜1.2ｍｇ／ｍｌ）と溶解し、４℃で一晩攪拌した。次いで、試料を、0.1規定ＮａＯＨで前処理しＴＥで洗浄した使い捨てカラムにのせた。溶出液を集め、樹脂を別のＴＥで洗浄し、溶出液を洗浄液と混合した。この集めた試料のＤＮＡを1/10容量の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２倍量のエタノールで沈殿させた。沈殿のその後の処理及びＤＮＡの定量は上述の通り行った(この方法は予備試験で用いた)。 d)ＬＰＳの調製市販の大腸菌(Escherichia coli)由来のＬＰＳを用いた(0111:B4,Sigma)。調製物をＬＰＳを含まない水で１０ｍｇ／ｍｌの割合で溶解し、ＬＰＳを含まない水で系列希釈を調製する前に５分間超音波処理した(SONOREX bath，360W)。最終の溶液は、使用前に５分間超音波処理した。ＬＰＳ検定をBioWhittaker検定を用いて行った(chromogenic Limulus assay,I wanaga,1993）。そして、用いた試薬全てがＬＰＳを含まないことがわかった(<0 .1 エンドトキシン単位/50 μl)。 e)アデノウイルスの調製Ｅ４欠乏アデノウイルス５、d11014(Bridge 及び Ketner,1989)を、相補的細胞W162(Weinberg 及びKetner,1983)中で培養した。感染細胞のペレットを２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ7.4、１ｍＭＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルフォニル）２ｍｌに、２×１０⁷細胞を懸濁し、凍結及び解凍を３回繰り返した（液体窒素、３７℃）。次いで、懸濁液を攪拌しながら等量のフレオンと混合し、3, 000rpmで１０分間遠心した(Heraeus Sepatech，2705 Rotor)。水層（上層）を除去し、フレオン層を1/5容量の２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ7.4と混合し、再び遠心した。水層を一緒にし、Beckman VTi50 遠心管に移し(１５ｍｌ／遠心管)、１５ｍｌの1.2ｇ／ｃｍ³のＣｓＣｌ／２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ7.4及び７ｍｌの1.45ｇ／ｃｍ³のＣｓＣｌ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ7.4を下に積み重ねた。試料をBeckman VTi50 ローターで49,000rpm で、２０℃、４０分間遠心した。下層にある、1.34〜1.35ｇ／ｃｍ³（屈折率により測定）の成熟したウイルス粒子の乳白色のバンド、及び上層にあるバンド（1.31〜1.32ｇ／ｃｍ³の未成熟粒子）を別々に集め、VTi65ローターで、63,000rpm で平衡遠心（４時間以上）した。乳白色のウイルスのバンド（1.31ｇ／ｃｍ³の未成熟又は1.34ｇ／ｃｍ³の成熟）を集めた。得られたウイルスのＮ−ヒドロキシスクシミドビオチン(Pierce) によるビオチン化、８−メトキシプソラレン(8-methoxypsoralene)／ＵＶＡによる不活性化、及びＨＢＳ／４０％グリセロールで平衡化したPharmacia PD10カラムを用いたゲル濾過による精製は、WagnerらのWO 93/07283 及びCottenら(1992) に記載されたように行った。ウイルス試料を、蛋白濃度(BSAを標準物質として用いたBiorad Bradford Assay)により定量的に検出し、１ｍｇ／ｍｌの蛋白質＝3.4×１０¹²アデノウイルス粒子／ｍｌ(Lemayら、1980) の式を用いて解析した。 f)トランスフェクション複合体修飾されたアデノウイルス粒子(８μｌ、１×１０¹²粒子／ｍｌ)を１５０μｌのＨＢＳに溶解し、１５０μｌのＨＢＳに溶解した１μｇのＳｔｒｐＬ（ストレプトアビジンで修飾したポリリシン、WO 93/07283 に記載されている）と室温で３０分間混合した。６μｇのプラスミドＤＮＡを１００μｌ中の増加させた量のＬＰＳと混合した。次いで、ＤＮＡ溶液をアデノウイルス／ＳｔｒｐＬ溶液と室温で３０分間混合した。最後に、WO 93/07283に記載されているように調製した、５μｇのＴｆｐＬを含有するＨＢＳ１００μｌを試料に加え、周囲温度で３０分間混合した。このようにして、５００μｌのトランスフェクション培地が得られ、１／１０が、20,000の細胞を含む細胞培養プレートのそれぞれの穴に用いられた。 g)細胞培養外科的除去の後、皮膚生検を、4℃で、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン及びゲンタマイシンを含有するＤＭＥＭ中に置いた。生検を、組織細胞装置中で、無菌の６ｃｍのプラスチック皿の中、層流中、ピンセット及び外科用ナイフで微細に砕いた。次いで、３ｍｌの２０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン及び抗生物質を含有するＤＭＥＭを加え、培養を３７℃の孵卵器中で行った。１０日後、培地を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭと変えた。培地を週２回変えた。細胞培養開始４週後、組織断片から成長した細胞をトリプシン処理し、トランスフェクションのために新しい培養皿に移した。５〜１０週経過した初代培養細胞が用いられた。繊維芽細胞をWagnerら、1992に記載されたようにトランスフェクトを行った。 ii)ヒトメラノーマ細胞初代培養ヒトメラノーマ細胞を分離し、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％のピルビン酸ナトリウム及び１０％の加熱非活性化したＦＣＳを補ったＲＰＭＩ１６４０培地(Giboco/BRL)で培養した。 iii)ヒト気道上皮細胞ヒト気道上皮細胞を、Van Scott ら(1986)に記載されたように、鼻ポリープから分離した。細胞を、ヒト胎盤コラーゲン(Sigma、カタログ番号C 7521)で被覆した細胞皿で、気管支上皮細胞成長培地(BEGM，Promocell、カタログ番号C-2106 )中、培養した。 iv)ヒト腋静脈内皮細胞ヒト臍静脈内皮細胞(HUVECs)を細胞システム(Kirklandt，Washington)から得、0.1％ゼラチンで被覆した細胞培養皿で培養した。 h)発現の測定 i)ルシフェラーゼ検定細胞抽出物の調製、蛋白含有量の標準化、及びルシフェラーゼ活性の測定は、 Zenke ら、1990及びCottenら、1990及びEP 388 758に記載された通りに行った。 ii)IL-2検定インターロイキン−２の発現を、Karasuyama及びMelcheres,1988に記載されたバイオアッセイを用いて検出した。更に、IL-2生産量を、Becton Dickinsonによって製造されたIL-2 ELISAキット（カタログ番号30032）を用い、製造業者の指示に従って検出した。実施例１初代培養ヒトメラノーマ細胞中のIL-2発現におけるＤＮＡのエンドトキシン含有量による影響初代培養ヒトメラノーマ細胞（２×１０⁵細胞／６ｃｍ培養皿）を図１に示すデータに従って、種々の方法により精製したプラスミド６μｇでトランスフェクションを行った。精製する前のプラスミド中のエンドトキシン含有量を、暗い陰影のバーとして図中に示した。ポリミキシン樹脂による精製又はTriton X-114による抽出によって、全ての調製物は0.1ＥＵリポ多糖類／６μｇＤＮＡ未満となった。IL-2含有量は、細胞上清のＥＬＩＳＡで測定した。図１に示す値は、１０⁶ 細胞当たり及び２４時間後を示す。実施例２ポリミキシンＢによる初代培養ヒト繊維芽細胞のトランスフェクションにおけるＬＰＳ毒性の減少まず第１に、初代培養ヒト繊維芽細胞へのアデノウイルスに補助されるレセプターに仲介されるエンドサイトーシスによる遺伝子伝達の際のＬＰＳの毒性が調査された。ＤＮＡ６μｇに基づくＬＰＳ含有量を図２に示す。トランスフェクションの２４時間後、細胞を集め、ルシフェラーゼの測定を行った。ＤＮＡ中のＬＰＳ含有量が増加すると、遺伝子発現はほぼ２／１０に減少した。ＬＰＳの高濃度にさらされた、崩壊した形態は、低い発現値と一致した（図２、上表）。次に、細胞を、ポリミキシンＢの量を増加させて、同一のＤＮＡ／アデノウイルス／ＬＰＳ複合体にさらした（硫酸ポリミキシンＢ、Sigma、カタログ番号 P 4932）。ポリミキシンＢは、培地中に、トランスフェクションの最中と後に、特定の濃度存在する。即ち、トランスフェクションの３時間後に特定の濃度のポリミキシンを含有する培地と交換する。典型的なポリミキシンＢの抗生物質濃度は１，０００単位／ｍｌである。７，５００単位／ｍｇの特定の活性はポリミキシン１３３μｇ／ｍｌ濃度に対応する。３、１０及び３０μｇ／ｍｌのポリミキシンＢの存在においては、発現の実質的な相違がないことが見出された。これは、抗生物質が細胞によって許容されることを示す。用いた３種類の濃度では、ＬＰＳ汚染を含有するウイルス／ＤＮＡ複合体で成功したトランスフェクション、１００ｎｇ／６μｇＤＮＡに対して完全な保護（実施例２、５、８及び11）、及び１，０００ｎｇ／６μｇＤＮＡに対して実質的な保護効果（実施例３、６、９及び12）を示す（図に示した値は、２回のトランスフェクションの平均である。実施例３ 0.03μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌ濃度におけるポリミキシン活性の方法の分析ＬＰＳ毒性を中和するのに必要なポリミキシンの最小濃度を実施例１と同様に滴定により決定した。１００又は１０００ｎｇＬＰＳ／６μｇＤＮＡの全ての中和が１０μｇ／ｍｌのポリミキシンＢにより達成されることが示された。0.3〜３μｇ／ｍｌのポリミキシンＢでは部分的な毒性の中和しか得られず、それより低い濃度ではわずかな中和が得られた。トランスフェクション混合物の0.6μｇのＤＮＡは、１００又は１０００ｎｇ／６μｇ濃度のＬＰＳを含有するＤＮＡ複合体が、0.25ｍｌ容量当たり１０〜１００ｎｇのＬＰＳを含有することを示す。ポリミキシンによって起こる中和は、１μｇ／ｍｌ以下で悪化し始める。これは、１０〜１００ｎｇのＬＰＳを中和するのに２５０ｎｇのポリミキシンが必要であることに対応する。中和するための細胞内のポリミキシンの適切な濃度を完全にするために、培地中の過剰の過剰の抗生物質が必要であると思われる。滴定の結果を図３に示す；図に示すように、トランスフェクションの最中及び後でポリミキシンＢは存在する。この場合は、二重のトランスフェクションが行われた。ルシフェラーゼ値（トランスフェクションの２４時間後に測定）は、コントロール試料の値に対する百分率として、それぞれのポリミキシン濃度に対して表された。実施例４トランスフェクションの最中及び後におけるポリミキシンＢの影響の調査前述した実施例においては、ポリミキシンは、トランスフェクションの最中及び後に、ルシフェラーゼ検定のために細胞を集めるまで存在していた。予備試験に基づき、ＬＰＳの毒性の原因である事象がアデノウイルスと共に細胞内に入ることであると想定されるので、ポリミキシンＢの保護機能は、トランスフェクション複合体と細胞との接触の期間の間だけ必要であるべきである。この仮定を確認するために、初代培養繊維芽細胞を、ポリミキシン不存在下（試料１〜４）及び存在下のトランスフェクション複合体にさらし、一方で、トランスフェクションの最中にのみこれを行い（これを行うため、トランスフェクション後、試料をポリミキシンＢを含まない新鮮な培地と混合した；試料９〜１２）、一方で、インキュベーション後にもトランスフェクション複合体にさらした（これを行うために、試料を、トランスフェクション培地と等量のポリミキシンＢを含有する新鮮な培地と混合した；試料５〜８）。トランスフェクション２４時間後に、ルシフェラーゼの発現を測定した。結果を図４に示す；トランスフェクションの最中の３０μｇ／ｍｌのポリミキシンＢのみの存在は、実質的にトランスフェクション後の抗生物質の連続した存在と同じ保護効果があることが見出された（図に示す値は、２回のトランスフェクションの平均である）。実施例５ポリミキシンＢ存在下におけるラクテートデヒドロゲナーゼの遊離及びトランスフェクション効果の関係実施例１で行われた試験において、ＬＰＳを含有するＤＮＡ複合体でトランスフェクトした細胞の形態が遺伝子発現の減少を引き起こす細胞毒性と一致することが立証された。細胞内酵素ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）はネクローシス又はアポトーシスの進行につれ、周囲の培地の放出されるので、細胞培地内のＬＤＨ活性の測定は、細胞毒性の標識である。培地中へのＬＤＨの放出及び節フェラーゼ遺伝子の成功したトランスファーとの間に、培地中のＬＤＨの増加がルシフェラーゼ遺伝子発現の減少と明らかに一致するという逆相関が見出された (図５、試料１〜４)。実施例１及び２の結果と一致して、１０〜３０μｇ／ｍｌのポリミキシンＢの存在（ポリミキシンＢはトランスフェクションの最中にのみ存在する）はＬＰＳによって誘導される遺伝子伝達における減少を遮断した（図５、試料５〜１２）。ポリミキシンによる毒性の遮断の通り、ポリミキシンは、ＬＰＳによって誘導されるＬＤＨの遊離を遮断する（図５、試料５〜１２）（図中の値は、２回のトランスフェクションの平均である）。ＬＤＨ検定は、トランスフェクション後の特定の時間に細胞培養培地のアリコートを取り除き（５〜５０μｌ）、５００μｌのＬＤ−Ｌ試薬(Sigma、カタログ番号 228-10)と混合することにより行った。試料を３７℃で４５分間インキュベートし、ＬＤ−Ｌのコントロールと共に３４０ｎｍの吸光度を測定した。実施例６プラスミドＤＮＡの天然ＬＰＳによって引き起こされる毒性のポリミキシンＢによる遮断前述した実施例において、ＬＰＳを含まないＤＮＡに、決められた量のＬＰＳ調製物を故意に添加して用いた。この実施例では、研究は、ＤＮＡ調製物に通常に見つけられるＬＰＳ汚染物の毒性がポリミキシンＢによって遮断されるかを調べるために行った。この目的のため、ＬＰＳを含まないルシフェラーゼプラスミドを、ＬＰＳを除去する操作をしていないプラスミドＤＮＡ樹脂(Diagen)を用いたQiagen法により得られたＤＮＡプラスミドと混合した。従って、このＤＮＡはプラスミドＤＮＡ調製物に通常に見られるＬＰＳの分子を含んでいる。用いたＤＮＡ試料は、６μｇのＤＮＡ当たり１６ｎｇのＬＰＳを含有する；これは、トランスフェクションの際に、6.4ｎｇ／ｍｌに相当する。図６に見られるように、わずかのＤＮＡ転移のみが達成された（図６、試料１）が、３μｇ／ｍｌのポリミキシンＢをトランスフェクションの間に存在させると、ほとんど１０倍の増加が見られた（図６、試料２）。抗生物質の高い濃度では、更なる向上は見られなかった。３μｇ／ｍｌのポリミキシンは、トランスフェクションの際に得られるＬＰＳ濃度の約５００倍過剰の量である（図に示す値は、２回のトランスフェクションの平均である）。実施例７ポリミキシンＢを用いた、初代培養ヒト気道上皮細胞におけるＬＰＳ毒性の遮断初代培養ヒト気道上皮細胞を、前述の実施例で記載されたように、一方ではポリミキシンＢを含まず、一方では１０μｇ／ｍｌのポリミキシンＢを含むＬＰＳを含有するトランスフェクション複合体と、トランスフェクションの間処理した。トランスフェクションして４８時間後、細胞を集め、ルシフェラーゼ発現を測定した。ＤＮＡ複合体中のＬＰＳの存在は、遺伝子発現を急激に急降下させることが見出された（図７、試料１〜４）。用いられたＬＰＳの濃度によって引き起こされる毒性はポリミキシンＢによって大いに遮断される（図７、試料５〜８）（図に示す値は、２回のトランスフェクションの平均である）。実施例８膿静脈内皮細胞での、細胞培養試薬由来のＬＰＳによって引き起こされる毒性のポリミキシンＢによる遮断ヒト臍静脈内皮細胞を標準の方法を用いてトランスフェクションした。これらの細胞は複合体中のＬＰＳの存在に対して感受性であることが示された（ＬＰＳを含まない図８の試料１、ＬＰＳを１０、１００、及び１０００ｎｇ／ＤＮＡ６ μｇ含む、試料２、３及び４参照）。ＬＰＳを含まないＤＮＡを用いたときでも、トランスフェクション効率は低かった。これが、細胞培養試薬からもたらされる毒性によって引き起こされることを確認するため、図に示される特定量のポリミキシンＢをトランスフェクションの最中及び後に用いた。１０μｇ／ｍｌのポリミキシンＢの存在が遺伝子発現を５〜６倍増加させることが見出された（試料１及び５）。ポリミキシンＢの高濃度は効果があまりなかった。実施例９ＬＰＳによって引き起こされる毒性のポリミキシンＥを用いた遮断この実施例で実施される試験は、ポリミキシンＢの代わりにポリミキシンＥ（コリスチン−メタンスルホネート、Sigma、カタログ番号 C 1511）を用い、それをトランスフェクションの最中にのみ存在させたことを除き、実施例２と同様に行った。この実験の結果を図９に示す。ポリミキシンＥは、ポリミキシンＢと同様の方法で、１００ｎｇ／ＤＮＡ６μｇの量でＬＰＳを遮断する能力を有することが見出された。しかしながら、ポリミキシンＢと異なり、ポリミキシンＥは１０００ｎｇ／ＤＮＡ６μｇの濃度でＬＰＳ汚染を中和することができなかった（３０μｇ／ｍｌのポリミキシンＥ濃度（試料４〜６）における明らかな刺激は１００μｇ／ＤＮＡ６μｇを含有する試料の刺激よりもむしろコントロール試料（ポリミキシン３０μｇ／ｍｌ、ＬＰＳなし）の重大な阻害を減少することができる）。実施例１０異なる遺伝子転移法を用いた時のＤＮＡ発現に対するポリミキシンの効果この実施例において実施した実験は、アデノウイルスに補助される受容体仲介エンドサイトーシスによる遺伝子転移の際に観察される毒性がトランスフェクション複合体成分に帰するかどうかを決定するための比較の役目を果たす。 a)組み換えアデノウイルスによる遺伝子転移これらの実験は、アデノウイルス及びＬＰＳの存在下に生ずる毒性がポリリシンに帰するかどうかを示すことを意図したものである。この目的のため、ゲノム β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有する組み換えアデノウイルス(Stratford-Perri caudetら、(1992)を遺伝子転移媒体として用いた。アデノウイルスをＬＰＳの存在下、細胞に適用させた（２×１０⁴/well）。２４時間後、β−ガラクトシダーゼ発現を、アデノウイルス粒子を有する残存細胞を測定することによって検出した。この実験を図１０に示す：β−ガラクトシダーゼ発現のＬＰＳ濃度に依存する減少が見られた（図１０Ａ）。培地中へのＬＤＨの遊離の測定（実施例５）は、細胞の死及び溶菌がβガラクトシダーゼの発現の減少によることを示す。従って、毒性反応が生じるためにポリリシンが必要でないことが見出され、これは、毒性がＬＰＳの内面化の結果であるという、単純な説明を支持する。ＬＰＳによる毒性効果はポリミキシンの添加により弱められる（図１０、試料５〜８）。 b)非ウイルス系の方法による遺伝子転移次に、研究は、ＬＰＳを入れた後にアデノウイルスがシグナル伝達の役を受け持つかどうかを明らかにするために実行された。もし、アデノウイルスと細胞との相互作用が毒性の役を受け持つなら、非ウイルス系の方法による細胞内へのＤＮＡの転移はＬＰＳに誘導される毒性を必要としない。この目的のため、一方でグリセロールが、一方で陽イオン性脂質が非ウイルス遺伝子転移法として用いられる。 i)種々の濃度のＬＰＳ（図１０Ｂ、試料５〜８）の添加の結果として繊維芽細胞のトランスフェクションの間（７５μｌＨＢＳ中の0.4μｇのｐＬ又はＳｔｒｐＬを７５μｌＨＢＳ中で３μｇのｐＣＭＶＬｕｃと３０分間インキュベートし、次いで、７５μｌＨＢＳ中の３μｇのＴｆｐＬ又は２μｇのｐＬを添加し、インキュベートを更に３０分間行った。複合体に培地及び１３％グリセロールを添加した後、トランスフェクション培地を細胞と４時間接触させた。）アデノウイルスに補助されるレセプターに仲介されるエンドサイトーシスと同程度のルシフェラーゼ発現の減少が観察された。 ii)陽イオン性脂肪酸Transfectam（ＤＯＧＳ；商業的に得られる調製物が標準方法に従って用いられた。）とのトランスフェクションの間、ルシフェラーゼ活性の減少がＬＰＳ含有量の作用として観察された（図１０Ｂ、試料９〜１１）。１０００ｎｇ／ＤＮＡ６μｇのＬＰＳはルシフェラーゼ発現を、ＬＰＳを含まないＤＮＡで得られるコントロール値の約１０％減少させた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/00 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/22 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ，ＵＳ (72)発明者ブッシュルミハエルオーストリアアー2345 ブルーンアムゲビルゲヒルトルシュトラーセ 35− １−１ (72)発明者ワーグナーエルンシュトオーストリアアー2103 ランゲンツェルスドルフヴィーナーシュトラーセ 201 (72)発明者シュヴァイヒホッファータマスオーストリアアー1180 ウィーンアントンフランクガッセ３−９

Claims

【特許請求の範囲】１．特に、外来物質を導入するために真核細胞を処理する方法であって、細胞を、リポ多糖類と結合し細胞に対する毒性を遮断する物質で処理し、及び／又は細胞に導入される外来物質が、細胞に導入される前にＬＰＳを除去するために精製されていることを特徴とする方法。２．上記外来物質が核酸、特にＤＮＡであることを特徴とする、請求項１記載の方法。３．上記外来物質が細胞内に導入される際に、細胞をリポ多糖類結合物質で処理することを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。４．上記リポ多糖類結合物質が、トランスフェクション又はインフェクション成分として、細胞と接触されることを特徴とする、請求項３記載の方法。５．上記リポ多糖類結合物質がポリミキシンＢであることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。６．上記リポ多糖類結合物質がポリミキシンＥであることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法７．ＤＮＡが洗剤と共に抽出されることを特徴とする、請求項２記載の方法。８．上記洗剤としてTriton X-114が用いられることを特徴とする、請求項７記載の方法。９．ＤＮＡがポリミキシン樹脂で処理されることを特徴とする、請求項２記載の方法。 10．ポリミキシンＢが用いられることを特徴とする、請求項９記載の方法。 11．リポ多糖類結合物質を含有することを特徴とする、外来物質の導入のために細胞を処理するための組成物。 12．細胞に導入される外来物質のみならず、外来物質の細胞内への取り込みを仲介する成分を含有することを特徴とする、請求項11記載の組成物。 13．上記外来物質がＤＮＡであることを特徴とする、請求項11又は12記載の組成物。 14．細胞内にＤＮＡを取り込むための成分として、細胞リガンドとＤＮＡに結合する物質との結合体のみならず、エンドソーム溶菌的活性試薬を含有することを特徴とする、請求項１２又は１３記載の組成物。 15．上記結合体が、トランスフェリン−ポリリシン及びエンドソーム溶菌的活性試薬であることを特徴とする、請求項１４記載の組成物。 16．請求項１１〜１５の何れか１項に記載の組成物を含有することを特徴とする、医薬組成物。 17．請求項１１〜１５の何れか１項に記載の組成物を含有することを特徴とする、細胞培養培地。 18．核酸、特にＤＮＡを用いたトランスフェクション又はインフェクションによるヒト又は動物細胞の治療前及び／又は同時に、投与のための薬剤を調製するためのリポ多糖類結合物質の使用。 19．リポ多糖類結合物質がポリミキシンＢであることを特徴とする、請求項１８記載の使用。 20．ＤＮＡを精製し、ＬＰＳを除去することを特徴とする、ヒト、又は動物細胞に取り込むためにＤＮＡを処理する方法。