WO1995025808A1 - Verfahren zur behandlung von eukaryotischen zellen - Google Patents

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WO1995025808A1
WO1995025808A1 PCT/EP1995/000995 EP9500995W WO9525808A1 WO 1995025808 A1 WO1995025808 A1 WO 1995025808A1 EP 9500995 W EP9500995 W EP 9500995W WO 9525808 A1 WO9525808 A1 WO 9525808A1
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WO
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lps
dna
cells
polymyxin
transfection
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PCT/EP1995/000995
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Matthew Cotten
Adam Baker
Michael Buschle
Ernst Wagner
Tamàs SCHWEIGHOFFER
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Boehringer Ingelheim International Gmbh
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Priority to JP7524369A priority patent/JPH09510354A/ja
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to methods for treating eukaryotic cells.
  • Endotoxin lipopolysaccharide, LPS
  • LPS lipopolysaccharide, LPS
  • Endotoxin a major component of the cell wall of gram-negative bacteria, is e.g. frequently found as an impurity in plasmid DNA preparations, because up to 40% of the surface LPS is free from E. coli in the methods usually used for the preparation of plasmid DNA.
  • LPS on anion exchange chromatography resins behaves similarly to DNA
  • LPS behaves like a large DNA molecule on size exclusion resins due to the size it has in its micellar form.
  • the density of LPS in CsCl is similar to that of plasmid / EtBr complexes, so it can easily happen that the DNA in CsCl bands is contaminated. When transfecting with DNA, the cells come into contact with LPS.
  • LPS LPS
  • Eisbach and Weiss 1993
  • Golenbock et al. 1993
  • Haziot et al. 1993a
  • Lynn et al. 1991
  • Perera et al. 1993
  • Rustici et al. 1993
  • Tobias et al. 1988
  • Tobias et al. 1989
  • Ziegler-Heitbrock and Ulevitch 1993
  • ERS ⁇ ZBL ⁇ T (RULE 26)
  • the object of the present invention was to eliminate the toxicity problems in connection with the presence of LPS in the treatment of eukaryotic cells, such as those which occur in particular in connection with the import of foreign material, in particular DNA, into the cell.
  • a toxicity attributable to LPS was also found in gene transfer methods independent of adenovirus; it was also excluded that the toxicity was related to polylysine.
  • ERSA ⁇ ZBLA ⁇ (RULE 26) aqueous solutions miscible, at temperatures above 20'C it separates into a separate phase (Bordier, 1981). This phenomenon can be exploited to extract the lipophilic LPS molecule from aqueous protein solutions (Aida and Pabst, 1990) or from DNA preparations (Manthorpe et al., 1993).
  • An alternative method for LPS separation uses polymyxin B, a cyclic one
  • Lipid A / ketodeoxyoctolonic acid component of LPS binds (K a - 1.15 x 10 7 M " 1 ; Rustici et al., 1993; Lynn and Golenbock, 1992; Schindler and Osborn, 1979).
  • Polymyxin has so far been used to remove LPS from proteins Polymyxin is used in a form bound to a resin in chromatography columns.
  • LPS is not only an undesirable companion for DNA preparations, but an ubiquitous contamination that occurs, among other things, in the cell culture media commonly used.
  • the LPS content of serum preparations can vary widely; unless special measures are taken to exclude contaminated preparations, the content can be up to 10 to 50 ng / ml.
  • a problem also arises in connection with the commonly used glassware that has come into contact with bacteria. Since it is very labor-intensive to monitor the LPS content of all reagents and glass vessels, a method was found to solve the problem that was associated with the presence of LPS Counteracts problems in the treatment of eukaryotic cells, especially when transporting foreign material into the cells.
  • the present invention relates to a method for the treatment of eukaryotic cells, in particular for the uptake of foreign material, wherein the cells are treated with a substance that binds lipopolysaccharide and blocks its toxicity for the cells and / or uses a foreign material to be introduced into the cell LPS was cleaned prior to introduction into the cells.
  • LPS binding substances substances with this property are called "LPS binding substances" below; the substance can be present as a single substance or as a mixture.
  • the application of the invention can extend to all methods for introducing foreign material into the cell, provided that the presence of LPS causes toxicity which has a negative effect on the efficiency of the method. These include Methods for importing drugs or drug conjugates or toxins into the cell.
  • the method is preferably applied to transfection and infection methods for introducing foreign DNA or RNA into the cell, e.g. the calcium phosphate, microinjection and DEAE methods, methods using liposomes or cationic lipids, and methods using recombinant viruses; the method is particularly preferably used in connection with gene transfer methods based on receptor-mediated endocytosis.
  • transfection and infection methods for introducing foreign DNA or RNA into the cell, e.g. the calcium phosphate, microinjection and DEAE methods, methods using liposomes or cationic lipids, and methods using recombinant viruses; the method is particularly preferably used in connection with gene transfer methods based on receptor-mediated endocytosis.
  • An overview of such methods is e.g. by Cotten and
  • the LPS binding substances are required to both bind LPS with sufficient avidity and to block its interaction with cell components, which is responsible for the toxicity.
  • proteins e.g. the lipopolysaccharide binding protein, an acute phase protein, which bind to LPS with a high affinity, but which activate the cell's response to LPS toxicity; such an effect would be undesirable in the context of the present invention.
  • the DNA is preferably treated with polymyxin, in particular by means of chromatography over a polymyxin resin, or by means of extraction with a suitable detergent such as Triton X-114.
  • the LPS binding substances are used in amounts which saturate the existing LPS at least to an extent that its toxicity is neutralized with regard to the intended application and in which they themselves are not toxic.
  • REPLACEMENT BLUE RULE 26 In order to determine the suitability of a substance and its optimal concentration, transfection experiments are expediently carried out, for example with regard to a specific transfection to be carried out with the respective cell type. Titrations are used to determine the appropriate concentration at which the substance increases gene expression without itself having a damaging effect on the cells. In addition to the transfection system, the effect of the LPS-binding substance on the morphology of the cells can be examined microscopically. Assays can also be used to measure the release of cellular components as a measure of the necrosis or apoptosis that occurs in response to LPS toxicity.
  • polymyxin B examples of this are the commercially available, clinically used on a large scale lactate dehydrogenase assay or the recently described epifluorescence method after staining with calcein-AM and propidium iodide (Lorenzo et al., 1994). With the help of such methods, it was found in the context of the present invention in the case of polymyxin B that the medium should preferably not contain more than 100 ⁇ g / ml and the lower limit can be 3 ⁇ g / ml and below. The neutralization caused by polymyxin began to deteriorate at 1 ⁇ g / ml and below. This corresponds to a requirement of 250 ng polymyxin to neutralize 10 to 100 ng LPS.
  • the LPS can be incorporated into the transfection complexes and therefore does not necessarily have to be available for binding to the LPS substances. It is also possible that the neutralization by the LPS binding substance takes place intracellularly when the transfection complexes containing LPS are released into the cytoplasm. Therefore, the excess antibiotic in the medium may be required to maintain sufficient intracellular To ensure concentrations of LPS binding substances for neutralization. The minimum concentration required to block toxicity can be determined using titrations.
  • the LPS binding substance is polymyxin B.
  • the substance is polymyxin E (Storni et al., 1977), a derivative of polymyxin B which differs from it only by an amino acid. Like polymyxin B, it can bind LPS, but unlike polymyxin B, it is unable to block the activation of protein kinase C.
  • Suitable substances can also be designed, for example, by identifying the LPS binding domain of larger molecules whose LPS binding property is known and using the peptide, optionally in modified form.
  • the structure may be of low molecular weight Molecules with known LPS binding properties are used to provide new molecules that are optimized for binding and detoxification of LPS.
  • the LPS-binding substances for the treatment of the cells are used in a simple manner, in that they are preferably present as part of the transfection medium.
  • the presence of the LPS-binding substances is only necessary during the transfection, because the toxic effect of LPS manifests itself primarily in the transfection; the addition of this substance can thus be omitted when changing the media after the transfection.
  • the presence of the substance can also be useful for cell growth beyond transfection, e.g. the cell type used is sensitive to LPS; in this case, the fresh medium applied to the cells after the transfection or infection also contains the LPS-binding substance.
  • the cells are pretreated with the LPS-binding substances before the transfection medium is applied in order to bind and, if appropriate, remove any LPS present.
  • the treatment of cells with LPS binding substances can also be advantageous regardless of their treatment with foreign material to be imported into the cell, e.g. during the culture of cells that are very sensitive to LPS in their growth.
  • the present invention relates to compositions for the treatment of higher eukaryotic cells.
  • this composition is a medium which contains one or more LPS-binding substances in addition to the usual components.
  • the usual components include nutrients for the cells, buffer substances, etc.
  • the LPS-binding substance is part of a transfection medium, this also contains the transfection components, i.e.
  • the foreign material to be imported into the cell and the components that transport it mediate the cell eg recombinant viruses, cationic lipids, liposomes, as well as complexes for receptor-mediated gene transfer, optionally in combination with endosomolytic agents which increase the gene transfer efficiency; such complexes are described, inter alia, in WO 93/07283).
  • the LPS binding substance is expediently added before the transfection components.
  • the present invention can be used both in the treatment of cells in cell culture systems and for therapeutic applications in vivo or ex vivo; in the latter case, the medium containing the LPS binding substance has the function of a medicament.
  • the invention is advantageous, inter alia, in therapeutic applications in which problems arise due to the presence of LPS.
  • An example of this in the context of gene therapy is the therapeutic application of recombinant adenovirus vectors for the purpose of administering intact CFTR ("Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator") genes to patients with cystic fibrosis (CF) in whom these genes are mutated.
  • CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator
  • endothelial cells which are known to be difficult to transfect;
  • a possible explanation for this difficulty may be the ability of these cells to respond to very small amounts of LPS (Arditi et al., 1993; Haziot et al., 1993b; Pugin et al., 1993), the secretion of which is different cellular factors in response of a cell to LPS also affects other cells that have not directly come into contact with LPS.
  • transfections of umbilical vein endothelial cells have shown that even very small amounts of LPS contaminants produce toxicity; since LPS-purified DNA was used, it was derived exclusively from tissue culture reagents.
  • This toxicity caused by small amounts of LPS could also be neutralized by polymyxin.
  • the present invention may also be of advantage in transfecting patient cells ex vivo if the cell population is contaminated with small amounts of LPS.
  • An example of such an application is the production of cancer vaccines, in which tumor cells are removed from the patient, transformed ex vivo with a DNA coding for an immunostimulating polypeptide and administered to the patient as a vaccination.
  • the LPS-binding substance can be present as a component of the composition, which has the function of the transfection or infection medium and can therefore be applied to the cells together with the transfection components. It can also be present as an effective component of a pharmaceutical preparation which is added to the transfection medium before the transfection or also separately from the transfection composition, e.g. before transfection.
  • a pharmaceutical preparation which is added to the transfection medium before the transfection or also separately from the transfection composition, e.g. before transfection.
  • such a preparation is a solution of the LPS-binding substance, it also being possible for the preparation to contain conventional additives; Methods for formulating pharmaceutical preparations are known to the person skilled in the art. You can read relevant manuals, e.g. Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980.
  • the invention thus relates to pharmaceutical compositions containing an LPS-binding substance for use in a therapeutic treatment in which foreign material is introduced into the cell.
  • the foreign material is preferably a nucleic acid, in particular DNA.
  • the present invention relates to the use of LPS-binding substances for the production of medicaments for use before and / or simultaneously and / or after the treatment of the human or animal body by transfection or infection with DNA or RNA.
  • these therapeutic treatments preferably comprise gene therapy measures as described in the review article by Cotten and Wagner, 1993, including methods in which inhibiting nucleic acid molecules, such as antisense RNAs, ribozymes or DNA molecules coding therefor, are used To specifically inhibit cell function.
  • the invention relates to a method for treating DNA for uptake in human or animal cells, the DNA being purified from LPS.
  • Fig. 1 Influence of the endotoxin content of the DNA on the
  • Tissue culture reagents caused toxicity by polymyxin B in umbilical vein endothelial cells
  • Fig. 9 Blocking of the toxicity induced by LPS by polymyxin E
  • Fig. 10 Influence of polymyxin on the expression of DNA when using different gene transfer methods
  • the vector pWS2 was used as the starting point for the plasmid which contains the sequence coding for human IL-2: the plasmid pH ⁇ APr-1 (Gunning et al., 1987) was cut with BamHI and EcoRI. A 2.5 kb fragment containing the ampicillin resistance gene and the origin of replication of pBR322 and the SV40 polyadenylation signal was isolated by agarose gel purification. This fragment was created using the CMV Ligated promoter / enhancer, which had been amplified as a 0.7 kb PCR fragment from the vector pAD-CMVI (described in EP-A 393 438) and digested with EcoRI / BamHI. The plasmid obtained was called pWS.
  • the cDNA coding for human IL-2 was obtained as a PCR fragment from plasmid pIL2-50A (Taniguchi et al., 1983), which contains the cDNA coding for human IL-2.
  • the PCR fragment was ligated into the vector pWS opened by Sall / BamHI digestion and thus pWS2 was obtained.
  • An IL-2 cassette containing the CMV enhancer / promoter, the sequence coding for IL-2 and the SV40-PolyA sequence was obtained by means of PCR with presentation of pWS2.
  • the PCR product was subjected to restriction enzyme digestion with EcoRI and cloned into the EcoRI / Smal site of the plasmid pUC19 (Pharmacia).
  • the plasmid obtained was named pGShIL-2.
  • the plasmid pBR327 Soberon et al., 1980, which had been digested with Sspl and Aval, served as the source for the tetracycline resistance gene and parts of the "upstream" region of the ⁇ -lactanase gene (ampicillin resistance gene) .
  • the isolated tet sequence was cloned into the EcoRI / Sspl site of pGShIL-2 together with an EcoRI / Aval adapter.
  • the IL-2 cassette of the resulting clone pGShIL-2tet / amp was sequenced; the amp sequence was then cut out with Eamll05I and Sspl and the plasmid was religated.
  • the plasmid obtained was designated pGShIL-2tet.
  • the plasmids were first grown in the E. coli DH5 ⁇ bacterial strain in the presence of 100 ⁇ g / ml ampicillin (pCMVL) or tetracycline (pGShIL-2tet) in LB medium. The overnight culture was centrifuged and the DNA prepared from it as follows: The CsCl
  • ERSA ⁇ ZBLA ⁇ T (RULE 26) Density gradient centrifugation was carried out according to the method described by Cotten et al., 1993. For this, the bacterial deposit of 1 l culture in 10 ml 20% (w / v) sucrose, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 7.5 (solution 1) was incubated on ice for 10 min.
  • lysozyme (10 mg / ml in solution 1) were then added for a further 10 min on ice, then 5 ml of 0.2 M EDTA, pH 7 were added, the sample was incubated for 10 min on ice and finally 10 ml of 2% strength (vol ./Vol.) Triton X-114, 60 mM EDTA and 40 mM Tris, pH 7.5 added, followed by 15 min incubation on ice.
  • This lysate was then centrifuged for 30 min (Sorvall SS34, 17K) and 28.5 g CsCl and 400 ⁇ l ethidium bromide (10 ⁇ g / ml) were added to the supernatant (26 ml initial volume).
  • This material was centrifuged for 18 h in a Beckman VTi50 rotor at 49,000 rpm, 20 * C.
  • the lower of the two ethidium-rich bands was collected and centrifuged again, directly in a Beckman VT165 rotor, over 4 h at 63,000 rpm and 20'C.
  • the ethidium-rich band was harvested again, extracted with CsCl-saturated isopropanol until the pink color disappeared, extensively against TE (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.4) mixed with 1/10 volume 3 M sodium acetate pH 5 , dialyzed and precipitated with 3 volumes of ethanol at -20 * C.
  • the DNA precipitate obtained was further treated with RNase A, proteinase K, phenol / chloroform and chloroform, precipitated again and the final DNA pellet was taken up in TE and quantified by optical absorption, with the assumption that 0.05 mg / ml DNA at 260 nm has an absorption of 1.
  • the sample was treated with RNase A, Proteinase K, phenol / chloroform and chloroform, precipitated again and the final DNA pellet suspended in TE and the absorption at 260 nm determined, assuming that a concentration of 0.05 mg / ml DNA has an absorption value of 1. (This method was used for the DNA used in the examples.)
  • a volume of polymyxin resin sludge (Affi-Prep-Polymyxin, Biorad), which corresponded to the volume of the DNA sample, was briefly mixed with three volumes of 0.1 N NaOH, then
  • SPARE BLADE (RULE 26) was washed three times with five resin volumes of TE.
  • the pelleted resin was taken up again with the DNA samples (in TE 0.8-1.2 mg / ml) and the mixture was stirred at 4 ° C. overnight.
  • the sample was then placed on a disposable column pretreated with 0.1 NaOH and washed with TE.
  • the eluate was collected, the resin was washed with a further volume of TE and the eluate was combined with the washing liquid.
  • the DNA of this pooled sample was precipitated with 1/10 volume of 3 M sodium acetate pH 5 and 2 volumes of ethanol.
  • the further treatment of the precipitate and the DNA determination were carried out as described above. (This method was used in the preliminary test.)
  • LPS preparation from Escherichia coli (0111: B4, Sigma) was used. The preparation was dissolved in 10 mg / ml in LPS-free water and sonicated in LPS-free water for 5 minutes before making serial dilutions (SONOREX bath, 360 W). The final dilutions were sonicated for 5 minutes before use.
  • the LPS assays were carried out with the BioWhittaker assay (chromogenic Limulus assay; Iwanaga, 1993), it being found that all the reagents used were LPS-free ( ⁇ 0.1 endotoxin units / 50 ⁇ l solution).
  • the E4-deficient adenovirus 5, dll014 (Bridge and Ketner, 1989) was grown in the complementing cell line W162 (Weinberg and Ketner, 1983). Pellets from infected cells became 2 ml / 2 x 10 7 cells in
  • the aqueous phases were combined, transferred to a Beckman VT150 centrifuge tube (15 ml / tube) and with 15 ml 1.2 g / cm 3 CsCl / 20 mM HEPES, pH 7.4 and 7 ml 1.45 g / cm 3 CsCl, 20 mM HEPES pH 7.4 sub-layered.
  • the samples were centrifuged for 40 min at 20 ° C in a Beckman VT150 rotor at 49,000 rpm.
  • the lower opalescent band of mature virus particles at 1.34 to 1.35 g / cm 3 (measured by refractive index) and the upper band (immature particles at 1.31 to 1.32 g / cm 3 ) were collected separately and an equilibrium centrifugation (more than 4 h) at 63,000 rpm in a VT165 rotor.
  • the opalescent virus bands (either 1.31 g / cm 3 immature or 1.34 g / cm 3 mature) were harvested.
  • Biotinylation of the virus particles obtained with N-hydroxysuccinimide biotin (Pierce), inactivation with 8-methoxypsoralen / UVA and purification by means of gel filtration using a Pharmacia PDIO column equilibrated with HBS / 40% glycerol were carried out as in the WO 93/07283 or by Wagner et al., 1992 and Cotten et al., 1992.
  • the modified adenovirus particles (8 ⁇ l, lx lO r - 2 particles / ml) were diluted in 150 ⁇ l HBS and added with 1 ⁇ g StrpL (streptavidin-modified polylysine, prepared as described in WO 93/07283) in 150 ⁇ l HBS for 30 min Mixed room temperature. Aliquots of 6 ⁇ g plasmid DNA were mixed with increasing amounts of LPS in 100 ⁇ l. The DNA solutions were then mixed for 30 minutes with the adenovirus / StrpL solution at room temperature.
  • StrpL streptavidin-modified polylysine
  • REPLACEMENT B RE 5-10 used.
  • the fibroblasts were transfected as described by Wagner et al., 1992.
  • melanoma cells Primary human melanoma cells were isolated and cultured in RPMI 1640 medium (Gibco / BRL) supplemented with 100 I.U./ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, 1% sodium pyruvate and 10% heat-inactivated FCS.
  • Human respiratory epithelial cells have been isolated from nasal polyps as described by Van Scott et al., 1986. The cells were grown on standard cell culture plates coated with human placenta collagen (Sigma, Cat. No. C 7521) in bronchial epithelial cell growth medium (BEGM, Promocell, Cat. No. C-2106).
  • HAVECs Human umbilical vein endothelial cells
  • interleukin-2 The expression of interleukin-2 was determined using a bioassay as described by Karasuyama and Melchers, 1988. In addition, IL-2 production was carried out using the Becton Dickinson IL-2 ELISA kit (catalog No. 30032) according to the manufacturer's instructions.
  • REPLACEMENT BLA ⁇ (RULE 26) Endocytosis in primary human fibroblasts was examined.
  • the LPS content based on 6 ⁇ g DNA, is shown in FIG. 2.
  • the cells were harvested 24 h after the transfection and the luciferase measurement was carried out.
  • the tattered morphology of the cells exposed to a high LPS content was consistent with the low expression levels (Fig. 2, top panel).
  • polymyxin B polymyxin B sulfate, Sigma, Cat. No. P 4932.
  • Polymyxin B was present in the medium at the indicated concentrations both during and after the transfection, i.e. that the fresh medium exchanged 3 h after the transfection contained the respective concentration of polymyxin.
  • a typical antibiotic concentration of Polymyxin B is 1,000 units / ml. With a specific activity of 7,500 units / mg, this corresponds to a concentration of 133 ⁇ g / ml polymyxin B.
  • polymyxin B allows successful transfections with virus / DNA complexes that have LPS contaminants in all three concentrations used, with complete protection against 100 ng LPS / 6 ⁇ g DNA (cf. samples 2, 5, 8 and 11) and the Protection against 1,000 ng LPS / 6 ⁇ g DNA is almost complete (see samples 3, 6, 9 and 12). (The values shown in the figure are average values of two transfections.)
  • the minimum concentration of polymyxin required to neutralize the LPS toxicity was determined using titrations similar to those in Example 1. It was found that a complete neutralization of a content of 100 or 1,000 ng LPS / 6 ⁇ g DNA in the DNA complexes with 10 ⁇ g / ml polymyxin B is obtained. With 3 to 0.3 ⁇ g / ml polymyxin B only a partial neutralization of the toxicity was obtained, at lower concentrations only a very slight neutralization was observed. From a content of 0.6 ⁇ g DNA in the transfection batches it follows that DNA complexes which contain LPS in concentrations of 100 or 1,000 ng / 6 ⁇ g DNA in a volume of 0.25 ml 10 to 100 ng LPS.
  • the neutralization caused by polymyxin began to deteriorate at 1 ⁇ g / ml and below. This corresponds to a requirement of 250 ng polymyxin to neutralize 10 to 100 ng LPS. The excess of antibiotic in the medium may be necessary to ensure sufficient intracellular polymyxin concentrations for neutralization.
  • the result of the titration is shown in Fig. 3: where indicated in the figure, polymyxin B was present, both during and after the transfections. Double transfections were carried out in each case. Luciferase values (measured 24 hours after transfection) are expressed as a percentage of the value of the control sample for each polymyxin concentration.
  • polymyxin was contained in the culture medium both during the transfection and afterwards until the cell harvest for the luciferase assay. Since it was assumed on the basis of the preliminary experiments that the event responsible for the toxicity of LPS is its entry into the cell with the adenovirus, the protective function of polymyxin B should only be necessary during the contact of the cells with the transfection complexes.
  • SPARE BLADE (RULE 26) Relationship between the release of lactate dehydrogenase and transfection efficiency in the presence of polymyxin B.
  • Example 1 In the experiments carried out in Example 1, it was found that the morphology of cells transfected with LPS-containing DNA complexes is consistent with the cell toxicity which causes the decrease in gene expression. Since the cytoplasmic enzyme lactate dehydrogenase (LDH) is released into the surrounding medium when cells undergo necrosis or apoptosis, the simple measurement of LDH activity in the cell medium is an indicator of cell toxicity. An inverse correlation was found between the release of LDH into the medium and the successful transfer of the luciferase gene (FIG. 5, samples 1-4), increases in LDH in the medium coinciding with a considerable drop in luciferase gene expression.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • polymyxin B was only contained in the medium during transfection
  • polymyxin B blocked the LPS-induced decrease in gene transfer (FIG. 5, samples 5- 12).
  • the presence of polymyxin blocks the LPS-induced release of LDH (Fig. 5, samples 5-12). (The values shown in the figure are average values of two transfections.)
  • the LDH assay was performed by removing aliquots of the cell culture medium (5 to 50 ⁇ l) at the indicated times after the transfection and mixing with 500 ⁇ l LD-L reagent (Sigma, Cat. No. 228-10). The samples were incubated at 37 ° C for 45 min and the
  • REPLACEMENT BLA ⁇ (RULE 26) Absorbance at 340 nm measured against an LD-L blank.
  • LPS-free DNA to which known amounts of defined LPS preparations had been added was used.
  • LPS-free luciferase plasmid was mixed with an excess of DNA plasmid obtained by the Qiagen method with a plasmid DNA resin (Diagen) without treatment to remove LPS.
  • This DNA thus contained the molecular form of LPS that is typically found in a plasmid DNA preparation.
  • the DNA sample used contained approximately 16 ng LPS / 6 ⁇ g DNA; this corresponds to 6.4 ng / ml during transfection. As can be seen from FIG.
  • ERSA ⁇ -BLA ⁇ (RULE 26) To determine that this is caused by a toxicity derived from the tissue culture reagents, the amounts of polymyxin B indicated in the figure were used, which were present in the medium both during and after the transfection. It was shown that the presence of 10 ⁇ g / ml polymyxin B causes a 5-6-fold increase in gene expression (see samples 1 and 5). Higher concentrations of Polymyxin B were less effective.
  • polymyxin E was unable to neutralize an LPS contamination of 1,000 ng / 6 ⁇ g DNA (the apparent stimulation at 30 ⁇ g polymyxin E / ml (samples 4-6) is more due to a clear inhibition of the control sample (30 ⁇ g Polymyxin U / ml, no LPS) as due to stimulation of the sample containing 100 ng LPS / 6 ⁇ g DNA).
  • the next step was to investigate whether adenovirus could play a role in signal transmission after LPS. If interactions between adenovirus and the cell play a role in toxicity, then the transport of DNA into the cells using non-viral methods should not result in any LPS-induced toxicity. For this purpose, glycerin and, on the other hand, cationic lipids were used as non-viral gene transfer methods.

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Abstract

In einem Verfahren zur Behandlung von eukaryotischen Zellen werden bei Anwendungen, bei denen sich die Toxizität von Lipopolysaccharid nachteilig auswirkt, während der Transfektion bzw. zur Reinigung des Fremdmaterials Substanzen eingesetzt, die Lipopolysaccharid binden und dessen Toxizität neutralisieren. Das Verfahren ist vor allem von Vorteil, wenn Fremdmaterial in die Zellen eingebracht wird, insbesondere bei Gentransfermethoden. Zusammensetzungen, enthaltend eine Lipopolysaccharid bindende Substanz, kommen bei Zellkulturanwendungen als Medium und bei therapeutischen Anwendungen als Arzneimittel zum Einsatz.

Description

Verfahren zur Behandlung von eukaryotischen Zellen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Behandeln von eukaryotischen Zellen.
Ein beim Arbeiten mit eukaryotischen Zellen in Kultur oder in vivo häufig auftretendes Problem ist die Anwesenheit von Endotoxin.
Endotoxin (Lipopolysaccharid, LPS), eine Hauptkomponente der Zellwand gramnegativer Bakterien, ist z.B. häufig als Verunreinigung in Plasmid-DNA-Präparationen zu finden, weil bei den üblicherweise bei der Präparation von Plasmid-DNA angewandten Methoden bis zu 40 % des Oberflächen-LPS von E.coli frei werden. Aufgrund der negativen Ladungen verhält sich LPS auf Anionenaustausch-Chromatographieharzen ähnlich wie die DNA, andererseits benimmt sich LPS aufgrund der Größe, die es in seiner micellaren Form hat, auf Größenausschlußharzen wie ein großes DNA-Molekül. Die Dichte von LPS in CsCl ist ähnlich der von Plasmid/EtBr- Komplexen, sodaβ es leicht vorkommen kann, daß die DNA in CsCl-Banden verunreinigt ist. Bei der Transfektion mit DNA kommen somit die Zellen in Kontakt mit LPS.
Da das LPS-Molekül toxisch sowie ein starker Stimulator des Säugetierimmunsystems ist, ist seine Anwesenheit bei der Behandlung von Zellen unerwünscht. Daher gab es bereits zahlreiche Ansätze für den Nachweis von LPS sowie für Methoden, dieses Molekül oder gramnegative Bakterien zu beseitigen bzw. die dadurch bedingten störenden Effekte zu neutralisieren (Cordle et al., 1993; Eisbach und Weiss, 1993; Golenbock et al., 1993; Haziot et al., 1993a; Lynn et al., 1991; Perera et al., 1993; Rustici et al., 1993; Tobias et al., 1988; Tobias et al., 1989; Ziegler-Heitbrock und Ulevitch, 1993).
ERSÄΓZBLÄΓT (REGEL 26) Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die Toxizitätsprobleme im Zusammenhang mit der Gegenwart von LPS bei der Behandlung von eukaryotischen Zellen, wie sie insbesondere im Zusammenhang mit dem Import von Fremdmaterial, insbesondere DNA, in die Zelle auftreten, zu beseitigen.
Im Zuge der Experimente, die zur Lösung dieser Aufgabe durchgeführt wurden, wurde zunächst festgestellt, daß beim Transfer von Plasmid-DNA mittels Adenovirus- unterstützter Rezeptor-vermittelter Endozytose, die u.a. in der WO 93/07283 sowie von Wagner et al., 1992; Cotten et al., 1992; Curiel et al., 1991; Cotten et al., 1993; Cristiano et al., 1993a, und Cristiano et al., 1993b, beschrieben ist, in primäre humane Hautfibroblasten oder in primäre humane Melanomzellen Toxizitätsprobleme auftreten. Anhand von Versuchen mit LPS enthaltender DNA oder reinem LPS konnten diese Probleme auf die Gegenwart von LPS zurückgeführt werden. Die Toxizität trat bei Mengen von 100 ng/ml freiem LPS oder, bei Inkorporierung von LPS in die Polylysin/Adenovirus-Komplexe, bei 100 pg/ml auf.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde eine auf LPS zurückzuführende Toxizität auch bei Adenovirus- unabhängigen Gentransfermethoden festgestellt; außerdem wurde ausgeschlossen, daß die Toxizität in Zusammenhang mit Polylysin steht.
Ausgehend von den erhaltenen Befunden wurde zunächst eine Methode entwickelt, die die LPS-Verunreinigungen aus der DNA entfernt und somit die Toxizität beseitigt. Eine einfache und wirkungsvolle Methode zur Entfernung von LPS wendet das Detergens Triton X-114 an. Bei Temperaturen unterhalb von 20*C ist Triton X-114 mit
ERSAΓZBLAΓΓ (REGEL 26) wäßrigen Lösungen mischbar, bei Temperaturen über 20'C trennt es sich in eine gesonderte Phase ab (Bordier, 1981). Dieses Phänomen kann ausgenutzt werden, um das lipophile LPS-Molekül aus wässerigen Proteinlösungen (Aida und Pabst, 1990) oder aus DNA-Präparationen (Manthorpe et al., 1993) zu extrahieren.
Eine alternative Methode zur LPS-Abtrennung verwendet Polymyxin B, ein zyklisches
Schimmelpilzpeptidantibiotikum (Storm et al., 1977), das mit hoher Affinität an die
Lipid A/Ketodeoxyoctolonsäure-Komponente von LPS bindet (Ka - 1.15 x 107 M"1; Rustici et al., 1993; Lynn und Golenbock, 1992; Schindler und Osborn, 1979). Polymyxin wurde bisher zur Entfernung von LPS aus Proteinen eingesetzt; dazu wird Polymyxin in an ein Harz gebundener Form in Chromatographiesäulen eingesetzt.
Die Versuche mit gereinigter DNA haben gezeigt, daß die Entfernung von LPS aus den DNA-Präparationen eine Steigerung der Genexpression bewirkt.
LPS ist jedoch nicht nur ein unerwünschter Begleiter von DNA-Präparationen, sondern eine ubiquitäre Verunreinigung, die u.a. in den üblicherweise verwendeten Zellkulturmedien auftritt. Der LPS-Gehalt von Serumpräparaten kann in weiten Bereichen schwanken; wenn nicht besondere Maßnahmen getroffen werden, um verunreinigte Präparate auszuschließen, kann der Gehalt bis zu 10 bis 50 ng/ml betragen. Ein Problem tritt ferner im Zusammenhang mit den üblicherweise verwendeten Glasgeräten auf, die in Kontakt mit Bakterien gekommen sind. Da es sehr arbeitsaufwendig ist, den LPS-Gehalt aller Reagentien und Glasgefäße zu überwachen, wurde zur Lösung der gestellten Aufgabe nach einer Methode gesucht, die den mit der Gegenwart von LPS verbundenen Problemen bei der Behandlung von eukaryotischen Zellen, insbesondere beim Transport von Fremdmaterial in die Zellen, von vornherein entgegenwirkt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von eukaryotischen Zellen, insbesondere für die Aufnahme von Fremdmaterial, wobei man die Zellen mit einer Substanz behandelt, die Lipopolysaccharid bindet und dessen Toxizität für die Zellen blockiert und/oder ein in die Zelle einzubringendes Fremdmaterial einsetzt, das vor dem Einbringen in die Zellen von LPS gereinigt wurde.
Substanzen mit dieser Eigenschaft werden im folgenden der Einfachheit halber "LPS bindende Substanzen" genannt; die Substanz kann als Einzelsubstanz oder als Mischung vorliegen.
Die Anwendung der Erfindung kann sich auf sämtliche Verfahren zum Einbringen von Fremdmaterial in die Zelle erstrecken, sofern die Gegenwart von LPS eine Toxizität hervorruft, die sich negativ auf die Effizienz des Verfahrens auswirkt. Dazu zählen u.a. Methoden zum Importieren von Arzneimitteln bzw. Arzneimittelkonjugaten oder von Toxinen in die Zelle.
Bevorzugt wird das Verfahren auf Transfektions- und Infektionsmethoden zum Einbringen von Fremd-DNA oder -RNA in die Zelle angewendet, z.B. die Calciumphosphat-, die Mikroinjektions- und die DEAE- Methode, Methoden, die mit Liposomen oder kationischen Lipiden arbeiten, sowie Methoden, die sich rekombinanter Viren bedienen; besonders bevorzugt wird das Verfahren im Zusammenhang mit Gentransfermethoden auf Basis der Rezeptor-vermittelten Endozytose angewendet. Eine Übersicht solcher Methoden wird z.B. von Cotten und
ERSAΓZBLÄΓT REGEL 26 Wagner, 1993, gegeben. Das Erfordernis für die Anwendung der vorliegenden Erfindung während der Transfektion der Zellen kann auf einfache Weise festgestellt werden, indem die Methode unter ansonsten identischen Bedingungen in Abwesenheit von LPS oder in Gegenwart von LPS durchgeführt und die erhaltenen Ergebnisse verglichen werden.
An die LPS bindenden Substanzen wird die Anforderung gestellt, daß sie sowohl LPS mit ausreichender Avidität binden als auch dessen Wechselwirkung mit Zellkomponenten, welche für die Toxizität verantwortlich ist, blockieren. (Im Unterschied zu Substanzen, die diese Anforderungen erfüllen, gibt es Proteine, z.B. das Lipopolysaccharid bindende Protein, ein Akutphasenprotein, die mit zwar mit hoher Affinität an LPS binden, jedoch die Antwort der Zelle auf die LPS- Toxizität aktivieren; ein solcher Effekt wäre im Rahmen der vorliegenden Erfindung unerwünscht).
Bei der Ausführungsform der Erfindung, bei der das in die Zelle zu importierende Fremdmaterial, insbesondere die DNA, von LPS gereinigt wird, erfolgt die Behandlung der DNA vorzugsweise mit Polymyxin, insbesondere mittels Chromatographie über ein Polymyxin-Harz, oder mittels Extraktion mit einem geeigneten Detergens, wie Triton X-114.
Für die Behandlung der Zellen bei der Transfektion werden die LPS bindenden Substanzen in Mengen eingesetzt, die das vorhandene LPS zumindest in einem Ausmaß absättigen, daß dessen Toxizität im Hinblick auf die vorgesehene Anwendung neutralisiert wird und in denen sie selbst nicht toxisch sind.
ERSATZBLAΓΓ REGEL 26 Um die Eignung einer Substanz und deren optimale Konzentration zu ermitteln, werden zweckmäßig Transfektionsversuche durchgeführt, z.B. im Hinblick auf eine konkret durchzuführende Transfektion mit dem jeweiligen Zelltyp. Mittels Titrationen wird die geeignete Konzentration festgestellt, in der die Substanz eine Steigerung der Genexpression bewirkt, ohne selbst eine schädigende Wirkung auf die Zellen auszuüben, in Ergänzung zum Transfektionssystem kann die Wirkung der LPS bindenden Substanz auf die Morphologie der Zellen mikroskopisch untersucht werden. Ferner können Assays eingesetzt werden, mit denen die Freisetzung zellulärer Komponenten als Maß für die als Reaktion auf die LPS-Toxizität eintretende Nekrose oder Apoptose gemessen wird. Beispiele dafür sind der kommerziell erhältliche, klinisch in großem Maßstab eingesetzte Lactatdehydrogenase-Assay oder die kürzlich beschriebene Epifluoreszenz-Methode nach Färbung mit Calcein-AM und Propidiumiodid (Lorenzo et al., 1994). Mit Hilfe solcher Methoden wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung im Fall von Polymyxin B festgestellt, daß das Medium vorzugsweise nicht mehr als 100 μg/ml enthalten sollte und die untere Grenze bei 3 μg/ml und darunter liegen kann. Die durch Polymyxin bewirkte Neutralisierung begann sich bei 1 μg/ml und darunter zu verschlechtern. Das entspricht einem Erfordernis von 250 ng Polymyxin zur Neutralisierung von 10 bis 100 ng LPS. Dabei ist zu beachten, daß das LPS in die Transfektionskomplexe eingebaut sein kann und daher nicht unbedingt für die Bindung an die LPS bindende Substanzen verfügbar sein muß. Es ist auch möglich, daß die Neutralisierung durch die LPS bindende Substanz intrazellulär abläuft, wenn die LPS enthaltenden Transfektionskomplexe ins Zytoplasma freigesetzt werden. Daher könnte der Überschuß an Antibiotikum im Medium erforderlich sein, um ausreichende intrazelluläre Konzentrationen an LPS bindenden Substanzen für die Neutralisierung zu gewährleisten. Mittels Titrationen kann die für die Blockierung der Toxizität minimal erforderliche Konzentration ermittelt werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die LPS bindende Substanz Polymyxin B.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Substanz Polymyxin E (Storni et al., 1977), ein Derivat von Polymyxin B, das sich von diesem nur durch eine Aminosäure unterscheidet. Wie Polymyxin B kann es LPS binden, im Gegensatz zu Polymyxin B ist es aber nicht in der Lage, die Aktivierung von Proteinkinase C zu blockieren.
Weitere Beispiele für Substanzen von denen bekannt ist, daß sie LPS binden und neutralisieren, sind: HDLs und LDLs (Levine et al., 1993; Flegel et al., 1993; Roth et al., 1993), Apolipoprotein AI (Flegel et al., 1993), das Protein BPI ("Bactericidal/Permeability Increasing Protein") oder Fragmente davon (Dentener et al., 1993; Eisbach und Weiss, 1993), die die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erforderlichen Eigenschaften aufweisen, Limulus-Proteine (Roth und Tobias, 1993), Derivate von Polymyxin, die eine verminderte Zelltoxizität aufweisen, synthetische Peptide mit Affinität für LPS (Rustici et al., 1993), Antikörper gegen LPS oder Lipid A (Burd et al., 1992). Es können darüberhinaus geeignete Substanzen entworfen werden, indem z.B. von größeren Molekülen, deren LPS bindende Eigenschaft bekannt ist, die LPS bindende Domäne identifiziert und das Peptid, gegebenenfalls in modifizierter Form, eingesetzt wird. Alternativ kann, ähnlich wie von Rustici et al., 1993, für Polymyxin B vorgeschlagen, von der Struktur niedermolekularer Moleküle mit bekannter LPS-Bindungseigenschaft ausgegangen werden, um neue Moleküle bereitzustellen, die im Hinblick auf Bindung und Entgiftung von LPS optimiert sind.
Die LPS bindenden Substanzen für die Behandlung der Zellen werden auf einfache Weise eingesetzt, indem sie vorzugsweise als Bestandteil des Transfektionsmediums vorliegen. Im allgemeinen ist die Anwesenheit der LPS bindenden Substanzen lediglich während der Transfektion erforderlich, weil der toxische Effekt von LPS sich vor allem bei der Transfektion manifestiert; es kann somit beim nach der Transfektion vorgenommenen Medienwechsel der Zusatz an dieser Substanz entfallen. Die Anwesenheit der Substanz kann jedoch auch über die Transfektion hinaus von Nutzen für das Wachstum der Zelle sein, wenn z.B. der verwendete Zelltyp empfindlich auf LPS ist; in diesem Fall enthält auch das nach der Transfektion bzw. Infektion auf die Zellen aufgebrachte frische Medium die LPS bindende Substanz.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen vor dem Aufbringen des Transfektionsmediums mit den LPS bindenden Substanzen vorbehandelt, um vorhandenes LPS zu binden und gegebenenfalls zu entfernen.
Die Behandlung von Zellen mit LPS bindenden Substanzen kann auch unabhängig von deren Behandlung mit in die Zelle zu importierendem Fremdmaterial von Vorteil sein, z.B. während der Kultur von Zellen, die in ihrem Wachstum sehr empfindlich auf LPS reagieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt Zusammensetzungen für die Behandlung von höheren eukaryotischen Zellen. Im Falle von Zellkulturanwendungen ist diese Zusammensetzung ein Medium, das neben den üblichen Komponenten eine oder mehrere LPS bindende Substanzen enthält. Zu den üblichen Komponenten zählen Nährstoffe für die Zellen, PufferSubstanzen, etc. Für den Fall, daß die LPS bindende Substanz Bestandteil eines Transfektionsmediums ist, enthält dieses außerdem die Transfektionskomponenten, also das in die Zelle zu importierende Fremdmaterial und die Komponenten, die dessen Transport in die Zelle vermitteln (z.B. rekombinante Viren, kationische Lipide, Liposomen, sowie Komplexe für den Rezeptor-vermittelten Gentransfer, gegebenenfalls in Kombination mit endosomolytischen Mitteln, die die Gentransfereffizienz steigern; derartige Komplexe sind u.a. in der WO 93/07283 beschrieben). Bei der Herstellung eines solchen Transfektionsmediums wird die LPS bindende Substanz zweckmäßig vor den Transfektionskomponenten zugegeben.
Die vorliegende Erfindung kann sowohl bei der Behandlung von Zellen in Zellkultursystemen als auch für therapeutische Anwendungen in vivo oder ex vivo angewendet werden; in letzterem Fall hat das die LPS bindende Substanz enthaltende Medium die Funktion eines Arzneimittels.
Die Erfindung ist u.a. bei therapeutischen Anwendungen von Vorteil, bei denen durch die Anwesenheit von LPS Probleme auftreten. Ein Beispiel dafür im Rahmen der Gentherapie ist die therapeutische Anwendung von rekombinanten Adenovirusvektoren zwecks Verabreichung von intakten CFTR("Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator")-Genen an Patienten mit zystischer Fibröse (CF), bei denen diese Gene mutiert sind. Da die Lunge von CF-Patienten große Mengen von Pseudomonas-LPS enthalten kann (Pseudomonas-Infektionen sind eine Begleiterscheinung der Erkrankung), könnte eine Beschränkung in der Anwendung dieser Methode, die entweder über das Nasenepithel oder durch Instillationen direkt in die Lunge erfolgt, in einer Toxizität für das Lungenepithel gelegen sein, welche durch den gemeinsamen Eintritt von rekombinantem Adenovirus und LPS verursacht wird. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden Versuche mit Atemwegsepithelzellen durchgeführt, in denen gezeigt wird, daß Polymyxin B den durch LPS verursachten starken Abfall in der Genexpression zu blockieren vermag. Ein Zusatz einer LPS bindenden Substanz zum Adenovirus enthaltenden Medium kann somit entscheidende Verbesserungen bei der therapeutischen Behandlung von Lungenepithelzellen bringen.
Ein weiteres Beispiel ist die Anwendung auf Endothelzellen, von denen bekannt ist, daß sie schwer zu transfizieren sind; eine mögliche Erklärung für diese Schwierigkeit dürfte in der Eigenschaft dieser Zellen gelegen sein, bereits auf sehr geringe Mengen von LPS anzusprechen (Arditi et al., 1993; Haziot et al., 1993b; Pugin et al., 1993), wobei die Sekretion verschiedener zellulärer Faktoren als Reaktion einer Zelle auf LPS auch andere Zellen, die selbst nicht direkt mit LPS in Berührung gekommen sind, beeinflußt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte anhand von Transfektionen von Nabelvenenendothelzellen gezeigt werden, daß sogar sehr geringe Mengen an LPS-Verunreinigungen eine Toxizität erzeugen; da LPS-gereinigte DNA verwendet wurde, rührten diese ausschließlich von Gewebekulturreagentien her. Auch diese durch geringe LPS-Mengen hervorgerufene Toxizität konnte durch Polymyxin neutralisiert werden. Die vorliegende Erfindung kann ferner bei der Transfektion von Patientenzellen ex vivo von Vorteil sein, wenn die Zellpopulation mit geringen Mengen LPS verunreinigt ist. Ein Beispiel für eine solche Anwendung ist die Herstellung von Krebsvakzinen, bei der dem Patienten Tumorzellen entnommen, ex vivo mit einer für ein immunstimulierendes Polypeptid kodierenden DNA transformiert und dem Patienten als Impfung verabreicht werden.
Bei therapeutischen Anwendungen kann die LPS bindende Substanz als Bestandteil der Zusammensetzung vorliegen, die die Funktion des Transfektions- bzw. Infektionsmediums hat und somit zusammen mit den Transfektionskomponenten auf die Zellen aufgebracht werden. Sie kann auch als wirksame Komponente einer Arzneimittelzubereitung vorliegen, die dem Transfektionsmedium vor der Transfektion zugesetzt oder auch getrennt von der Transfektionszusammensetzung, z.B. vor der Transfektion, verabreicht wird. In ihrer einfachsten Form ist eine solche Zubereitung eine Lösung der LPS bindenden Substanz, wobei die Zubereitung außerdem übliche Zusatzstoffe enthalten kann; Methoden zur Formulierung pharmazeutischer Zubereitungen sind dem Fachmann bekannt. Sie können einschlägigen Handbüchern, z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980, entnommen werden.
Die Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend eine LPS bindende Substanz, für die Anwendung bei einer therapeutischen Behandlung, bei der Fremdmaterial in die Zelle eingebracht wird. Bevorzugt ist das Fremdmaterial eine Nukleinsäure, insbesondere DNA.
ERSATZBLÄΓT(REGEL26 Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die Verwendung von LPS bindenden Substanzen für die Herstellung von Arzneimitteln zur Anwendung vor und/oder gleichzeitig und/oder nach der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Transfektion oder Infektion mit DNA oder RNA.
Diese therapeutischen Behandlungen umfassen neben viralen Gentransfermethoden bevorzugt gentherapeutische Maßnahmen, wie sie im Übersichtsartikel von Cotten und Wagner, 1993, beschrieben sind, einschließlich solcher Methoden, bei denen inhibierende Nukleinsäuremoleküle, wie Antisense-RNAs, Ribozyme oder dafür kodierende DNA- Moleküle angewendet werden, um Zellfunktion spezifisch zu inhibieren.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Behandlung von DNA für die Aufnahme in menschliche oder tierische Zellen, wobei man die DNA von LPS reinigt.
Figurenübersicht
Fig. 1: Einfluß des Endotoxingehaltes der DNA auf die
Expression von IL-2 in humanen Melanomzellen Fig. 2: Verringerung der Toxizität von LPS bei der
Transfektion von primären humanen Fibroblasten durch Polymyxin B Fig. 3: Wirkungsweise von Polymyxin B bei
Konzentrationen von 30 μg/ml bis 0.03 μg/ml Fig. 4: Wirkung von Polymyxin B während und nach der
Transfektion Fig. 5: Zusammenhang zwischen der Freisetzung von
Lactatdehydrogenase und Transfektionseffizienz in Gegenwart von Polymyxin B
ZBLAΪT REGEL 26 Fig. 6: Blockierung der durch natürliche LPS-
Verunreinigungen von Plasmid-DNA bedingten
Toxizität durch Polymyxin B Fig. 7: Blockierung der LPS-Toxizität in primären humanen Atemwegsepithelzellen durch Polymyxin B Fig. 8: Blockierung der durch LPS aus
Gewebekulturreagentien verursachten Toxizität durch Polymyxin B in Nabelvenenndothelzellen Fig. 9: Blockierung der durch LPS induzierten Toxizität durch Polymyxin E Fig.10: Einfluß von Polymyxin auf die Expression von DNA bei Anwendung verschiedener Gentransfermethoden
In den folgenden Beispielen, die die vorliegende Erfindung illustrieren, wurden, sofern nicht anders angegeben, die folgenden Materialien und Methoden angewendet:
a) Plasmid-Konstrukte
i) pCMVL
Die Konstruktion des Plasmids ist in der WO 93/07283 beschrieben.
ii) pGShIL-2tet
Für das Plasmid, das die für humanes IL-2 kodierende Sequenz enthält, wurde von dem Vektor pWS2 ausgegangen: Das Plasmid pHßAPr-1 (Gunning et al., 1987) wurde mit BamHI und EcoRI geschnitten. Mittels Agarosegel- Reinigung wurde ein 2.5 kb Fragment isoliert, das das Ampicillin-Restistenzgen und den Replikationsursprung von pBR322 sowie das SV40-Polyadenylsierungssignal enthält. Dieses Fragment wurde mit dem CMV- Promotor/Enhancer ligiert, das als ein 0.7 kb PCR- Fragment vom Vektor pAD-CMVI (beschrieben in der EP-A 393 438) amplifiziert und EcoRI/BamHI verdaut worden war. Das erhaltene Plasmid wurde pWS genannt. Die für humanes IL-2 kodierende cDNA wurde als PCR-Fragment vom Plasmid pIL2-50A (Taniguchi et al., 1983), der die für humanes IL-2 kodierende cDNA enthält, erhalten. Das PCR-Fragment wurde in den mittels Sall/BamHI-Verdau geöffneten Vektor pWS ligiert und somit pWS2 erhalten.
Eine IL-2-Kassette, enthaltend den CMV- Enhancer/Promotor, die für IL-2 kodierende Sequenz und die SV40-PolyA-Sequenz, wurde mittels PCR unter Vorlage von pWS2 erhalten. Das PCR-Produkt wurde einem Restriktionsenzymverdau mit EcoRI unterworfen und in die EcoRI/Smal-Stelle des Plasmids pUC19 (Pharmacia) hineinkloniert. Das erhaltene Plasmid wurde pGShIL-2 genannt. Als Quelle für das Tetracyclin-Resistenz-Gen und Teile der "upstream" Region des ß-Lactanase-Gens (Ampicillin-Resistenz-Gen) diente das Plasmid pBR327 (Soberon et al., 1980), das mit Sspl und Aval verdaut worden war. Zusammen mit einem EcoRI/Aval-Adaptor wurde die isolierte tet-Sequenz in die EcoRI/Sspl-Stelle von pGShIL-2 kloniert. Die IL-2-Kassette des resultierenden Klons pGShIL-2tet/amp wurde sequenziert; daraufhin wurde die amp-Sequenz mit Eamll05I und Sspl herausgeschnitten und das Plasmid religiert. Das erhaltene Plasmid wurde mit pGShIL-2tet bezeichnet.
b) DNA-Präparation
Die Plasmide wurden zunächst im Bakterienstamm E.coli DH5α in Gegenwart von 100 μg/ml Ampicillin (pCMVL) bzw. Tetracyclin (pGShIL-2tet) in LB-Medium gezüchtet. Die Übernachtkultur wurde zentrifugiert und daraus die DNA wie folgt präpariert: Die CsCl-
ERSAΓZBLAΓT (REGEL 26) Dichtegradientenzentrifugation wurde nach der von Cotten et al., 1993, beschriebenen Methode durchgeführt. Dazu wurde der Bakterienniederschlag von 1 1 Kultur in 10 ml 20 %iger (Gew./Vol.) Saccharose, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 7.5 (Lösung 1) auf Eis 10 min lang inkubiert. Anschließend wurden 2.2 ml Lysozym (10 mg/ml in Lösung 1) für weitere 10 min auf Eis beigegeben, dann wurden 5 ml 0.2 M EDTA, pH 7 hinzugefügt, die Probe 10 min auf Eis inkubiert und abschließend 10 ml 2 %iges (Vol./Vol.) Triton X-114, 60 mM EDTA und 40 mM Tris, pH 7.5 beigegeben, gefolgt von 15 min Inkubation auf Eis. Dieses Lysat wurde dann 30 min zentrifugiert (Sorvall SS34, 17K) und dem Überstand (26 ml Anfangsvolumen) 28.5 g CsCl und 400 μl Ethidiumbromid (10 μg/ml) beigegeben. Dieses Material wurde über 18 h in einem Beckman VTi50-Rotor bei 49.000 rpm, 20*C zentrifugiert. Die untere der beiden Ethidium-reichen Banden wurde gesammelt und nochmals, direkt in einem Beckman VT165- Rotor, über 4 h bei 63.000 rpm und 20'C zentrifugiert. Die Ethidium-reiche Bande wurde wieder geerntet, mit CsCl-gesättigtem Isopropanol extrahiert, bis die rosa Farbe verschwunden war, ausgiebig gegen TE (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.4), gemischt mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5, dialysiert und mit 3 Volumina Ethanol bei -20*C gefällt. Der gewonnene DNA- Niederschlag wurde weiter behandelt mit RNase A, Proteinase K, Phenol/Chloroform und Chloroform, noch einmal gefällt und das endgültige DNA-Pellet in TE aufgenommen und mittels optischer Absorption quantitativ bestimmt, wobei von der Annahme ausgegangen wurde, daß 0.05 mg/ml DNA bei 260 nm eine Absorption von 1 aufweist.
c) DNA-Reinigung von LPS
i) Triton X-114-Extraktion
ERSATZBLÄΓΓ (REGEL 26) Um ein homogenes Präparat des Detergens zu erhalten, wurde Triton X-114 (Sigma) drei 0*C/30#C- Temperaturzyklen, wie von Bordier, 1981, beschrieben, unterworfen. Die Extraktion der Lipopolysaccharide von der DNA-Probe wurde, in Abwandlung publizierter Methoden (Aida und Pabst, 1990; Manthorpe et al., 1993) wie folgt durchgeführt: Die DNA-Probe (0.5 - 1.5 mg/ml in 10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 (TE)) wurde auf 0.3 M Natriumacetat (pH 7.5) gebracht. Dann wurde 3 μl Triton X-114 pro 100 μl DNA-Lösung beigegeben, die Proben in einem Vortex kräftig gemischt und 10 min auf Eis inkubiert. Damit sich die beiden Phasen trennen können, wurden die Proben 5 min bei 30*C aufbewahrt, in einer vorgewärmten Eppendorf-Zentrifuge 2 min bei 2.000 rpm zentrifugiert und die wässerige Phase in ein frisches Eppendorf-Röhrchen gegeben. Diese Extraktion wurde noch zweimal durchgeführt und die schließlich erhaltene wässerige Phase mit 0.6 Volumina Isopropanol bei Raumtemperatur gefällt, das Präzipitat mittels Zentrifugation gewonnen, zweimal mit 80 % Ethanol gewaschen, luftgetrocknet, in TE wieder aufgenommen und die Menge bestimmt. Dazu wurde die Probe mit RNase A, Proteinase K, Phenol/Chloroform und Chloroform behandelt, wieder gefällt und das endgültige DNA-Pellet in TE suspendiert und die Absorption bei 260 nm bestimmt, wobei von der Annahme ausgegangen wurde, daß eine Konzentration von 0.05 mg/ml DNA den Absorptionswert 1 hat. (Diese Methode wurde für die in den Beispielen einsetzte DNA verwendet. )
ii) Polymyxin-Chromatographie
Ein Volumen Polymyxinharzschlamm (Affi-Prep-Polymyxin, Biorad), das dem Volumen der DNA-Probe entsprach, wurde kurz mit drei Volumina 0.1 N NaOH versetzt, anschließend
ERSATZBLÄTT(REGEL26) wurde dreimal mit fünf Harzvolumina TE gewaschen. Das pelletierte Harz wurde mit den DNA-Proben (in TE 0.8 - 1.2 mg/ml) wieder aufgenommen und die Mischung über Nacht bei 4*C gerührt. Dann wurde die Probe auf eine mit 0.1 NaOH vorbehandelte Wegwerfsäule gegeben und mit TE gewaschen. Das Eluat wurde gesammelt, das Harz mit einem weiteren Volumen TE gewaschen und das Eluat mit der Waschflüssigkeit vereinigt. Die DNA dieser gepoolten Probe wurde mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5 und 2 Volumen Ethanol gefällt. Die Weiterbehandlung des Präzipitats und die DNA-Bestimmung wurden durchgeführt, wie oben beschrieben. (Diese Methode wurde im Vorversuch verwendet. )
d) LPS-Präparat
Es wurde ein kommerziell erhältliches LPS-Präparat aus Escherichia coli (0111:B4, Sigma) verwendet. Das Präparat wurde zu 10 mg/ml in LPS-freiem Wasser gelöst und vor der Herstellung von Serienverdünnungen in LPS- freiem Wasser 5 min lang sonikiert (SONOREX-Bad, 360 W). Die endgültigen Verdünnungen wurden vor der Verwendung 5 min lang sonikiert.
Die LPS-Assays wurden mit dem BioWhittaker-Assay durchgeführt (chromogener Limulus-Assay; Iwanaga, 1993), wobei festgestellt wurde, daß alle verwendeten Reagentien LPS-frei waren (<0.1 Endotoxineinheiten/50 μl Lösung).
e) Adenovirus-Präparation
Das E4-defiziente Adenovirus 5, dll014 (Bridge und Ketner, 1989) wurde in der komplementierenden Zellinie W162 (Weinberg und Ketner, 1983) gezüchtet. Pellets von infizierten Zellen wurden zu 2 ml/2 x 107 Zellen in
ERSÄΓZBLAΓT (REGEL 26) 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM PMSF
(Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert und drei Gefrier-/Auftauzyklen (flüssiger Stickstoff, 37*C) unterworfen. Die Suspension wurde dann mit einem gleichen Volumen Freon, im Vortex gemischt und 10 min lang bei 3.000 rpm (Heraeus Sepatech, 2705 Rotor) zentrifugiert. Die wäßrige (obere) Phase wurde aufgehoben, und die Freonphase wurde mit 1/5 Volumen 20 mM HEPES, pH 7.4 im Vortex behandelt und nochmals zentrifugiert. Die wäßrigen Phasen wurden vereinigt, in ein Beckman VT150 Zentrifugenröhrchen (15 ml/Röhrchen) überführt und mit 15 ml 1.2 g/cm3 CsCl/20 mM HEPES, pH 7.4 und 7 ml 1.45 g/cm3 CsCl, 20 mM HEPES pH 7.4 unterschichtet. Die Proben wurden 40 min lang bei 20*C in einem Beckman VT150 Rotor bei 49.000 rpm zentrifugiert. Die untere opaleszierende Bande von reifen Viruspartikeln bei 1.34 bis 1.35 g/cm3 (gemessen mittels Brechungsindex) und die obere Bande (unreife Teilchen bei 1.31 bis 1.32 g/cm3) wurden getrennt gesammelt und einer Gleichgewichtszentrifugation (mehr als 4 h) bei 63.000 rpm in einem VT165 Rotor unterworfen. Die opaleszenten Virusbanden (entweder 1.31 g/cm3 unreife oder 1.34 g/cm3 reife) wurden geerntet. Die Biotinylierung der erhaltenen Viruspartikel mit N-hydroxysuccinimid-Biotin (Pierce), die Inaktivierung mit 8-Methoxypsoralen/UVA und die Reinigung mittels Gelfiltration unter Verwendung einer Pharmacia PDIO-Säule, equilibriert mit HBS/40 % Glyzerin wurden durchgeführt, wie in der WO 93/07283 bzw. von Wagner et al., 1992, und Cotten et al., 1992, beschrieben. Die Virusproben wurden quantitativ über die Proteinkonzentration bestimmt (Biorad Bradford Assay mit BSA als Standard) analysiert, wobei die Beziehung 1 mg/ml Protein = 3.4 x 10*2 Adenoviruspartikel/ml (Lemay et al., 1980) verwendet wurde.
ERSATZBLAΓΓ (REGEL 26) f ) Transfektionskomplexe
Die modifizierten Adenoviruspartikel (8 μl, l x lOr-2 Partikel/ml) wurden in 150 μl HBS verdünnt und mit 1 μg StrpL (Streptavidin-modifiziertes Polylysin, hergestellt wie in der WO 93/07283 beschrieben) in 150 μl HBS 30 min bei Raumtemperatur gemischt. Aliquots von 6 μg Plasmid- DNA wurden mit steigenden Mengen an LPS in 100 μl gemischt. Die DNA-Lösungen wurden daraufhin 30 min mit der Adenovirus/StrpL-Lösung bei Zimmertemperatur gemischt. Abschließend wurde ein 100 μl Aliquot HBS, enthaltend 5 μg TfpL, hergestellt wie in der WO 93/07283 beschrieben, jeder Probe beigegeben, gefolgt von 30 min bei Raumtemperatur. Von den so erhaltenen 500 μl Transfektionsmedium wurde je 1/10 pro Vertiefung einer Zellkulturplatte, enthaltend 20.000 Zellen, verwendet.
g) Zellkulturen
i) Humanfibroblasten
Nach der chirurgischen Entfernung wurden Hautbiopsien in 4*C DMEM, enthaltend 10 % FCS, 2 mM Glutamin und Gentamycin, gegeben. Die Biopsien wurden in einer Gewebekultureinrichtung ausgiebig mit Pinzette und chirurgischem Messer im laminaren Luftstrom in sterilen 6 cm Plastikschalen zerkleinert. Dann wurden 3 ml DMEM, enthaltend 20 % FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika beigegeben, und die Kultur in einen 37*C Brutschrank gegeben. Nach 10 Tagen wurde das Medium durch DMEM, enthaltend 10 % FCS, ausgetauscht. Dann wurde das Medium weiter 2 x wöchentlich gewechselt. 4 Wochen nach Beginn der Kultur wurden die Zellen, die aus den Gewebsfragmenten herausgewachsen waren, trypsinisiert und für die Transfektion in neue Kulturschalen ausplattiert. Es wurden primäre Kulturen aus Passage
ERSATZB π RE 5-10 verwendet. Die Fibroblasten wurden transfiziert, wie von Wagner et al., 1992, beschrieben.
ii) Humane Melanomzellen
Primäre humane Melanomzellen wurden isoliert und in RPMI 1640-Medium (Gibco/BRL), ergänzt mit 100 I.U./ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 1 % Natriumpyruvat und 10 % hitzeinaktiviertem FCS, kultiviert.
iii) Humane Atemwegsepithelzellen
Humane Atemwegsepithelzellen wurden, wie von Van Scott et al., 1986, beschrieben, aus Nasenpolypen isoliert. Die Zellen wurden auf Standardzellkulturplatten, überzogen mit humanem Plazentakollagen (Sigma, Kat. Nr. C 7521) in Bronchienepithelzell-Wachstumsmedium (BEGM, Promocell, Kat. Nr. C-2106) gezüchtet.
iv) Humane Nabelvenenendothelzellen
Humane Nabelvenenendothelzellen (HUVECs) wurden bezogen von CellSystems (Kirklandt, Washington) und auf 0.1 % Gelatine-überzogenen Zellkulturschalen gezüchtet.
h) Expressionsmessung
i) Luciferase-Assay
Die Herstellung von Zellextrakten, die Standardisierung des Proteingehalts sowie die Bestimmung der Luciferaseaktivität wurden durchgeführt, wie von Zenke et al., 1990, Cotten et al., 1990, bzw. in der EP 388 758 beschrieben.
ERSAΓZBLAΓΓ (REGEL 26) ii ) IL-2 Assay
Die Expression von Interleukin-2 wurde mit Hilfe eines Bioassays bestimmt, wie von Karasuyama und Melchers, 1988, beschrieben. Zusätzlich wurde die IL-2 Produktion unter Verwendung des IL-2 ELISA-Kits von Becton Dickinson (Katalog Nr. 30032) nach Vorschrift des Herstellers durchgeführt.
Beispiel 1
Einfluß des Endotoxingehaltes der DNA auf die Expression von IL-2 in primären humanen Melanomzellen
Primäre humane Melanomzellen (2 x 10^ Zellen/6 cm Kulturschale) wurden mit 6 μg des nach verschiedenen Methoden gereinigten Plasmids, entsprechend den Angaben in Fig. 1, transfiziert. Der Endotoxingehalt der Plasmidpräparation vor der Reinigung ist in der Fig. jeweils als dunkel schraffierter Balken dargestellt. Nach der Reinigung mittels Polymyxinharz oder Extraktion mit Triton X-114 enthielten alle Präparate weniger als 0.1 EU Lipopolysaccharid/6 μg DNA. Der IL-2-Gehalt wurde mittels ELISA im Zellüberstand gemessen, die in Fig. 1 angegebenen Werte bedeuten Einheiten/10^ Zellen und 24 h.
Beispiel 2
Verringerung der Toxizität von LPS bei der Transfektion von primären humanen Fibroblasten durch Polymyxin B
Zunächst wurde die Toxizität von LPS beim Gentransfer mittels Adenovirus-unterstützter Rezeptor-vermittelter
ERSATZBLAΓΓ (REGEL 26) Endozytose in primäre Humanfibroblasten untersucht. Der Gehalt an LPS, bezogen auf 6 μg DNA, ist in Fig. 2 angegeben. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und die Luciferasemessung durchgeführt. Mit steigendem LPS-Gehalt der DNA sank die Genexpression um beinahe 2 Zehnerpotenzen ab. Die zerfetzte Morphologie der Zellen, die einem hohen LPS-Gehalt ausgesetzt waren, stand im Einklang mit den niedrigen Expressionswerten (Fig. 2, obere Tafel).
Als nächstes wurden die Zellen denselben DNA/Adenovirus/LPS-Komplexen in Gegenwart zunehmender Mengen Polymyxin B (Polymyxin B-Sulfat, Sigma, Kat. Nr. P 4932) ausgesetzt. Polymyxin war sowohl während als auch nach der Transfektion in den jeweils angegebenen Konzentrationen im Medium zugegen, d.h. daß das 3 h nach der Transfektion ausgetauschte frische Medium die jeweilige Konzentration an Polymyxin enthielt. Eine typische antibiotische Konzentration von Polymyxin B ist 1.000 Einheiten/ml. Bei einer spezifischen Aktivität von 7.500 Einheiten/mg entspricht dies einer Konzentration von 133 μg/ml Polymyxin B. Es zeigte sich, daß in Gegenwart von 3, 10 und 30 μg/ml Polymyxin B kaum Unterschiede in der Expression auftreten. Dies zeigt, daß das Antibiotikum von diesen Zellen toleriert wird. Polymyxin B erlaubt in allen drei verwendeten Konzentrationen erfolgreiche Transfektionen mit Virus/DNA-Komplexen, die LPS-Verunreinigungen aufweisen, wobei gegen 100 ng LPS/6 μg DNA vollständiger Schutz eintritt (vgl. die Proben 2, 5, 8 und 11) und die Schutzwirkung gegen 1.000 ng LPS/6 μg DNA beinahe vollständig ist (vgl. die Proben 3, 6, 9 und 12). (Die in der Fig. dargestellten Werte sind Durchschnittswerte von zwei Transfektionen. )
ERSATZBLAΓΓ (REGEL 26) Beispiel 3
Analyse der Wirkungsweise von Polymyxin bei Konzentrationen von 30 μg/ml bis 0.03 μg/ml
Die minimale Konzentration von Polymyxin, die erforderlich ist, um die LPS-Toxizität zu neutralisieren, wurde mittels ähnlichen Titrationen wie in Beispiel 1 ermittelt. Es wurde festgestellt, daß eine vollständige Neutralisierung eines Gehalts von 100 oder 1.000 ng LPS/6 μg DNA in den DNA-Komplexen mit 10 μg/ml Polymyxin B erhalten wird. Mit 3 bis 0.3 μg/ml Polymyxin B wurde nur eine teilweise Neutralisierung der Toxizität erhalten, bei niedrigeren Konzentrationen wurde eine nur sehr geringe Neutralisierung beobachtet. Aus einem Gehalt an 0.6 μg DNA in den Transfektionsansätzen ergibt sich, daß DNA-Komplexe, die LPS in Konzentrationen von 100 oder 1.000 ng/6 μg DNA in einem Volumen von 0.25 ml 10 bis 100 ng LPS enthalten. Die durch Polymyxin bewirkte Neutralisierung begann sich bei 1 μg/ml und darunter zu verschlechtern. Das entspricht einem Erfordernis von 250 ng Polymyxin zur Neutralisierung von 10 bis 100 ng LPS. Der Überschuß an Antibiotikum im Medium dürfte erforderlich sein, um ausreichende intrazelluläre Polymyxinkonzentrationen für die Neutralisierung zu gewährleisten. Das Ergebnis der Titration ist in Fig. 3 dargestellt: wo in der Fig. angegeben, war Polymyxin B, und zwar sowohl während als auch nach den Transfektionen, anwesend. Es wurden jeweils Doppeltransfektionen vorgenommen. Die Luciferasewerte (Messung 24 h nach der Transfektion) sind für jede Polymyxinkonzentration ausgedrückt als Prozentsatz des Werts der Kontrollprobe.
Beispiel 4 Untersuchung der Wirkung von Polymyxin B während und nach der Transfektion
In den vorangegangenen Beispielen war Polymyxin sowohl während der Transfektion als auch danach, bis zur Zellernte für den Luciferaseassay, im Kulturmedium enthalten. Da aufgrund der Vorversuche angenommen wurde, daß das für die Toxizität von LPS verantwortliche Ereignis dessen mit dem Adenovirus gemeinsamer Eintritt in die Zelle ist, sollte die Schutzfunktion von Polymyxin B lediglich während des Kontaktes der Zellen mit den Transfektionskomplexen erforderlich sein. Um diese Annahme zu bestätigen, wurden primäre Fibroblastenkulturen den LPS-enthaltenden Transfektionskomplexen in Abwesenheit von Polymyxin (Proben 1-4) sowie in Gegenwart von Polymyxin B einerseits nur während der Transfektion (dazu wurden die Proben nach der Transfektion mit frischem Medium versetzt, das frei war von Polymyxin B; Proben 9-12) und andererseits zusätzlich nach der Inkubation (dazu wurden die Proben mit frischem Medium versetzt, das identische Mengen Polymyxin B enthielt wie das Transfektionsmedium; Proben 5-8) mit den Transfektionskomplexen ausgesetzt. Die erhaltene Luciferaseexpression wurde 24 h nach der Transfektion gemessen. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 4 dargestellt: Es zeigte sich, daß die Anwesenheit von 30 μg/ml Polymyxin B ausschließlich während der Transfektion nahezu dieselbe Schutzwirkung hat wie die fortgesetzte Gegenwart des Antibiotikums über den Zeitpunkt nach der Transfektion hinaus. (Die in der Fig. dargestellten Werte sind Durchschnittswerte von zwei Transfektionen. )
Beispiel 5
ERSATZBLÄFT(REGEL26) Zusammenhang zwischen der Freisetzung von Lactatdehydrogenase und Transfektionseffizienz in Gegenwart von Polymyxin B
In den in Beispiel 1 durchgeführten Versuchen wurde festgestellt, daß die Morphologie von Zellen, die mit LPS-enthaltenden DNA-Komplexen transfiziert worden sind, mit der Zelltoxizität im Einklang steht, die die Abnahme der Genexpression hervorruft. Da das zytpplasmatische Enzym Lactatdehydrogenase (LDH) ins umgebende Medium freigesetzt wird, wenn Zellen eine Nekrose oder Apoptose durchmachen, ist die einfache Messung der LDH-Aktivltät im Zellmedium ein Indikator für die Zelltoxizität. Es wurde eine inverse Korrelation zwischen der Freisetzung von LDH ins Medium und dem erfolgreichen Transfer des Luciferasegens gefunden (Fig. 5, Proben 1-4), wobei Zunahmen von LDH im Medium mit einem beträchtlichen Abfall der Luciferasegenexpression zusammenfielen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Beispiele 1 und 2, blockierte die Gegenwart von 10 oder 30 μg/ml Polymyxin B (Polymyxin B war nur während der Transfektion im Medium enthalten) die durch LPS induzierte Abnahme des Gentransfers (Fig. 5, Proben 5-12). In Übereinstimmung der Blockierung der Toxizität durch Polymyxin blockiert die Gegenwart von Polymyxin die durch LPS induzierte Freisetzung von LDH (Fig. 5, Proben 5-12). (Die in der Fig. dargestellten Werte sind Durchschnittswerte von zwei Transfektionen. )
Der LDH-Assay wurde durchgeführt, indem Aliquots des Zellkulturmediums (5 bis 50 μl) zu den angegebenen Zeiten nach der Transfektion entfernt und mit 500 μl LD-L-Reagens (Sigma, Kat. Nr. 228-10) gemischt wurden. Die Proben wurden bei 37*C 45 min inkubiert und die
ERSATZBLAπ(REGEL26) Absorption bei 340 nm gegen einen LD-L-Blindwert gemessen.
Beispiel 6
Blockierung der durch natürliche LPS-Verunreinigungen von Plasmid-DNA bedingten Toxizität durch Polymyxin B
In den vorangegangenen Beispielen wurde LPS-freie DNA, der absichtlich bekannte Mengen von definierten LPS- Präparaten zugesetzt worden waren, verwendet. In diesem Beispiel wurde untersucht, ob die Toxizität von LPS- Verunreinigungen, wie sie in DNA-Präparaten typischerweise gefunden werden, durch Polymyxin B blockiert werden kann. Zu diesem Zweck wurde LPS-freies Luciferaseplasmid mit einem Überschuß an DNA-Plasmid gemischt, das mittels Qiagen-Methode mit einem Plasmid- DNA-Harz (Diagen) ohne Behandlung zwecks Entfernung von LPS erhalten wurde. Diese DNA enthielt somit diejenige molekulare Form von LPS, wie sie in einer Plasmid-DNA- Präparation typischerweise gefunden wird. Die eingesetzte DNA-Probe enthielt ca. 16 ng LPS/6 μg DNA; das entspricht 6.4 ng/ml während der Transfektion. Wie aus Fig. 6 ersichtlich ist, wurde mit diesem Präparat nur ein schwacher DNA-Transport erhalten (Fig. 6, Probe 1), jedoch eine beinahe lOfache Erhöhung erreicht, wenn während der Transfektion 3 μg/ml Polymyxin B zugegen waren (Fig. 6, Probe 2). Bei höheren Antibiotikumkonzentrationen wurde keine weitere Verbesserung beobachtet. Die 3 μg/ml Polymyxin bedeuten einen beinahe 500fachen Massenüberschuß gegenüber der erhaltenen LPS-Konzentration während der Transfektion. (Die in der Fig. dargestellten Werte sind Durchschnittswerte von drei Transfektionen. )
ERSATZBLAπ(REGEL26) Beispiel 7
Blockierung der LPS-Toxizität in primären humanen Atemwegsepithelzellen durch Polymyxin B
Primäre humane Atemwegsepithelzellen wurden mit LPS enthaltenden Transfektionskomplexen behandelt, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben, und zwar einerseits in Abwesenheit, andererseits in Gegenwart von 10 μg/ml Polymyxin B während der Transfektion. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und die Luciferaseexpression gemessen. Es zeigte sich, daß die Gegenwart von LPS in den DNA-Komplexen einen scharfen Abfall in der Genexpression hervorruft (Fig. 7, Proben 1-4). Die durch die verwendeten LPS- Konzentrationen hervorgerufene Toxizität kann durch Polymyxin B weitgehend blockiert werden (Fig. 7, Proben 5-8). (Die in der Fig. dargestellten Werte sind Durchschnittswerte von drei Transfektionen. )
Beispiel 8
Blockierung der durch LPS aus Gewebekulturreagentien verursachten Toxizität durch Polymyxin B in Nabelvenenendotheizellen
Humane Nabelvenenendothelzellen wurden nach dem Standardprotokoll transfiziert. Es zeigte sich, daß diese Zellen empfindlich auf die Anwesenheit von LPS in den Komplexen sind; vgl. Fig. 8, Probe 1, in der der Komplex kein LPS enthielt, mit den Proben 2, 3 und 4, in denen LPS in Mengen von 10, 100 und 1.000 ng/6 μg DNA enthalten war. Die Transfektionseffizienz war jedoch sogar bei Verwendung von LPS-freier DNA gering. Um
ERSAΠ-BLAΠ (REGEL 26) festzustellen, daß dies durch eine Toxizität verursacht wird, die von den Gewebekulturreagentien stammt, wurden die in der Fig. angegebenen Polymyxin B-Mengen eingesetzt, die im Medium sowohl während als auch nach der Transfektion zugegen waren. Es zeigte sich, daß die Gegenwart von 10 μg/ml Polymyxin B einen 5-6fachen Anstieg in der Genexpression bewirkt (vgl. die Proben 1 und 5). Höhere Konzentrationen von Polymyxin B waren weniger wirksam.
Beispiel 9
Blockierung der durch LPS induzierten Toxizität durch Polymyxin E
Die in diesem Beispiel durchgeführten Versuche wurden prinzipiell genauso durchgeführt wie die in Beispiel 2 beschriebenen, mit dem Unterschied, daß statt Polymyxin B Polymyxin E (Colistin-Methansulfonat, Sigma, Kat. Nr. C 1511) verwendet wurde und daß dieses nur während der Transfektion zugegen war. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 9 dargestellt. Es zeigte sich, daß Polymyxin E die Fähigkeit hat, LPS in einer Menge von 100 ng/6 μg DNA in ähnlicher Weise wie Polymyxin B zu blockieren. Im Gegensatz zu Polymyxin B konnte jedoch Polymyxin E eine LPS-Verunreinigung von 1.000 ng/6 μg DNA nicht neutralisieren (die scheinbare Stimulierung bei 30 μg Polymyxin E/ml (Proben 4-6) ist eher auf eine deutliche Inhibierung der Kontrollprobe (30 μg Polymyxin E/ml, kein LPS) als auf eine Stimulierung der Probe, die 100 ng LPS/6 μg DNA enthielt, zurückzuführen).
Beispiel 10
ERSATZBLÄTT(REGEL 26) Einfluß von Polymyxin auf die Expression von DNA bei Anwendung verschiedener Gentransfermethoden
Die in diesem Beispiel durchgeführten Versuche dienten als Vergleich, mit dem festgestellt werden sollte, ob die beim Gentransfer mittels Adenovirus-unterstützter, Rezeptor-vermittelter Endozytose beobachtete Toxizität auf Komponenten der Transfektionskomplexe zurückzuführen ist.
a) Gentransfer mit rekombinantem Adenovirus
Diese Versuche sollten zeigen, ob die in Gegenwart von Adenovirus und LPS auftretende Toxizität auf Polylysin zurückzuführen ist. Zu diesem Zweck wurde ein rekombinantes Adenovirus, das ein genomisches ß- Galaktosidasegen trägt (Stratford-Perricaudet et al., 1992), als Gentransfervehikel verwendet. Das Adenovirus wurde auf die Zellen (2 x 104 pro Vertiefung) in Gegenwart von LPS aufgebracht. Nach 24 h wurde die ß- Galaktosidaseexpression als Maß für das Überleben von Zellen, die die Adenoviruspartikel aufgenommen hatten, bestimmt. Diese Versuche sind in Fig. 10 dargestellt: Es zeigte sich eine LPS-dosisabhängige Abnahme der ß- Galaktosidaseaktivität (Fig. 10A). Die Messung der Freisetzung von LDH (vgl. Beispiel 5) ins Medium zeigte, daß Zelltod und Lyse für die Abnahme der ß- Galaktosidaseexpression verantwortlich sein könnten. Es ergibt sich somit, daß die Gegenwart von Polylysin für das Auftreten der toxischen Reaktion nicht erforderlich ist, was die einfache Erklärung stützt, daß die Toxizität eine Folge der Internalisierung von LPS ist. Dem durch LPS bewirkten toxischen Effekt konnte durch Zugabe von Polymyxin entgegengewirkt werden (Fig. 10A, Proben 5-8).
ERSATZBLArT(REGEL26) b) Gentransfer mittels nicht-viralen Systemen
Als nächstes wurde untersucht, ob Adenovirus eine Rolle bei der Signalübertragung nach Eintritt von LPS spielen könnte. Falls Wechselwirkungen zwischen Adenovirus und der Zelle für die Toxizität eine Rolle spielen, dann sollte der Transport von DNA in die Zellen mit nicht- viralen Methoden keine LPS-induzierte Toxizität mit sich bringen. Als nicht-virale Gentransfermethoden wurden zu diesem Zweck einerseits Glyzerin und andererseits kationische Lipide eingesetzt.
i) Bei der Transfektion der Fibroblasten (0.4 μg pL bzw. StrpL in 75 μl HBS wurden mit 3 μg pCMVLuc in 75 μl HBS für 30 min inkubiert, dann wurden 3 μg TfpL oder 2 μg pL in 75 μl HBS zugegeben und weitere 30 min inkubiert. Nach Zugabe von Medium und 13 % Glyzerin zu den Komplexen wurde das Transfektionsmedium für 4 h auf die Zellen gegeben) wurde durch Zugabe von LPS in verschiedenen Konzentrationen (s. Fig. 10B, Proben 5-8) eine Abnahme der Luciferaseexpression beobachtet, die beinahe so stark war wie bei der Methode auf Grundlage der Adenovirus-unterstützten Endozytose.
ii) Bei der Transfektion mit dem kationischen Lipid Transfectam (DOGS; es wurde ein kommerziell erhältliches Präparat nach Standardvorschrift eingesetzt) wurde eine Abnahme der Luciferaseaktivitat als Funktion des LPS- Gehalts festgestellt (Fig. 10B, Proben 9-11). Die Gegenwart von 1000 ng LPS/6 μg DNA verringerte die Luciferaseexpression auf ca. 10 % des Kontrollwerts, der mit LPS-freier DNA erhalten wurde.
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Behandlung von eukaryotischen Zellen, insbesondere für die Aufnahme von Fremdmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit einer Substanz behandelt, die Lipopolysaccharid bindet und dessen Toxizität für die Zellen blockiert und/oder daß man ein in die Zelle einzubringendes Fremdmaterial einsetzt, das vor dem Einbringen in die Zellen von LPS gereinigt wurde.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Fremdmaterial eine Nukleinsäure, insbesondere DNA ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit der Lipopolysaccharid bindenden Substanz behandelt, während man das Fremdmaterial in die Zelle einbringt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipopolysaccharid bindende Substanz als Bestandteil eines Transfektions- oder Infektionsmediums auf die Zellen aufbringt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipopolysaccharid bindende Substanz Polymyxin B ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipopolysaccharid bindende Substanz Polymyxin E ist.
ERSTZBLAπ (REGEL 26)
7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die DNA durch Extraktion mit einem Detergens behandelt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Detergens Triton X-114 einsetzt.
9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die DNA mit einem Polymyxin-Harz behandelt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man Polymyxin B einsetzt.
11. Zusammensetzung für die Behandlung von Zellen für die Aufnahme von Fremdmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Lipopolysaccharid bindende Substanz enthält.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem das in die Zelle aufzunehmende Fremdmaterial sowie die Komponenten enthält, die die Aufnahme des Fremdmaterials in die Zellen vermitteln.
13. Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Fremdmaterial DNA ist.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Komponenten für die Aufnahme von DNA in die Zelle ein Konjugat aus einem zellulären Liganden und einer an DNA bindenden Substanz sowie ein endσsomolytisch wirksames Mittel enthält.
ERTSTZBLAπ (REGEL 26)
15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat Transferrin- Polylysin und das endosomolytisch wirksame Mittel ein Adenovirus ist.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 15 enthält.
17. Zellkulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 15 enthält.
18. Verwendung von Lipopolysaccharid bindenden Substanzen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Anwendung vor und/oder gleichzeitig mit und/oder nach der Behandlung von menschlichen oder tierischen Zellen durch Transfektion oder Infektion mit einer Nukleinsäure, insbesondere DNA.
19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipopolysaccharid bindende Substanz Polymyxin B ist.
20. Verfahren zur Behandlung von DNA für die Aufnahme in menschliche oder tierische Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man die DNA von LPS reinigt.
ERSTZBLAH (REGEL 26)
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