DE60036551T2

DE60036551T2 - VERWENDUNG VON BAKTERIELLEN ParD kis/ParD kid TOXIN-ANTITOXIN SYSTEM ZUR TÖTUNG VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN

Info

Publication number: DE60036551T2
Application number: DE60036551T
Authority: DE
Inventors: Guillermo De La Cueva Mendez; Ronald Alfred Laskey; Anthony David Mills; Ramon Diaz Orejas
Original assignee: Cancer Research Ventures Ltd
Current assignee: Cancer Research Ventures Ltd
Priority date: 1999-07-16
Filing date: 2000-07-17
Publication date: 2008-06-26
Anticipated expiration: 2020-07-18
Also published as: EP1198239B1; GB9916810D0; WO2001005421A1; EP1198239A1; AU6000700A; ATE374038T1; ES2295037T3; CA2379325A1; DE60036551D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Tötung von Zellen oder zumindest die Hemmung der Zellzyklusprogression. Genauer gesagt betrifft sie Verfahren und Mittel zum Angreifen eukaryotischer Zellen, wie z. B. Tumorzellen, mit zytostatischen, zytotoxischen und/oder zytopathischen Mitteln. Insbesondere verwendet die vorliegende Erfindung das ParD-kid-Toxin- und ParD-kis-Antitoxin unter geeigneter Kontrolle für selektive Zellzyklusinhibition und/oder Tötung von Targetzellen.
Es gibt verschiedene Kontexte, in welchen es wünschenswert ist, Zellen zu töten, insbesondere selektiv, um bestimmte Zellen innerhalb einer Zellpopulation zu töten. In einigen Kontexten kann die Hemmung von Zellwachstum oder -proliferation, z. B. durch die Hemmung der Zellzyklusprogression, ausreichend sein. Zum Zwecke der Einfachheit kann hierin ein Verweis auf tötende Zellen, wenn der Kontext keine andere Möglichkeit bereitstellt, verwendet werden, um eine solche Hemmung zu umfassen.
Ein wichtiger Anwendungsbereich ist die Behandlung von Tumoren, Krebs, Psoriasis, Arteriosklerose und anderen hyperproliferativen Erkrankungen. Andere Anwendungen von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen das Abzielen auf beliebige gewünschte eukaryotische Zellen zum Töten oder zumindest Hemmen des Wachstums. Dies kann Zelllinien-Knock-outs und Zellablation, auf die abgezielt wird, umfassen, z. B. in Entwicklungskontrolle oder Organogenese-Studien. In-vitro-Anwendungen umfassen eine Studie der Kontrolle oder Replikation in prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen, das Screenen auf ein Antidot für ein Toxin oder ein Toxin, das durch ein Antidot gehemmt wird, das Entwerfen oder das Screenen auf verbesserte Toxin- und/oder Antidotfaktoren und die Analyse von physiologischen Antworten verschiedener Zelltypen auf Inhibition von Zellprogression und/oder Hemmung von DNA-Replikation.
In Pflanzen umfassen Pathogenverteidigungsantworten Zellnekrose, die z. B. an einer Stelle von Pathogeninfektion oder -eintritt ausgelöst wird. induzierte Resistenz ist stark mit der Überempfindlichkeitsreaktion (HR) korreliert, einer induzierten Reaktion, die mit lokalisiertem Zelltod an Stellen versuchten Pathogeneintritts assoziiert ist. Es besteht die Hypothese, dass durch HR die Pflanze dem Pathogen lebende Wirtszellen entzieht.
Viele Pflanzenverteidigungsmechanismen werden stark als Reaktion auf eine Provokation durch ein erfolgloses Pathogen induziert. Eine solche Induktion von erhöhter Resistenz kann systemisch sein. Es wird davon ausgegangen, dass, wenn eine Pflanze durch ein Pathogen provoziert wird, gegenüber welchem es resistent ist, es an der Stelle von versuchtem Eintritt des inkompatiblen Pathogens eine HR durchmacht. Die induzierte HR führt zu einer systemischen Verstärkung und zum Erwerb von Pflanzenresistenz gegenüber virulenten Pathogenen, die normalerweise eine Erkrankung in der nicht-provozierten Pflanze auslösen würden.
Es hat sich gezeigt, dass die künstliche Induktion von Zelltod in Pflanzen in der Lage ist, Pathogenresistenz bereitzustellen, sogar dort, wo der Mechanismus, der Zelltod induziert, nicht durch ein Pathogenresistenzgen ausgelöst wird. Zum Beispiel können Gene, die für Substanzen kodieren, die zu raschem Zelletod führen, wie z. B. BARNASE oder Diphterietoxin, verwendet werden, um die Veränderungen zu induzieren, die zu erworbener Resistenz führen, obgleich der Zelltod in letzteren Beispielen nicht durch Aktivierung des Verteidigungsmechanismus verursacht wird. BARNASE ist eine Ribonuclease von Bacillus amyloliquifaciens (Hartley, J. Mol. Biol. 202, 913-915 (1988); Hartley, Trends Biochem. Sci. 14, 450-454 (1989)), und es gibt ein entsprechendes Protein, das BARSTAR genannt wird, das BARNASE durch Bildung eines Komplexes damit hemmt.
Verwendung von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in Pflanzen kann eingesetzt werden, um Schutz gegen den Angriff von Pilzen, Bakterien, Viren oder Nematoden zu erzeugen.
Pflanzen von besonderem Interesse zur Verwendung in Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Getreide, Mais, Weizen, Gerste, Hafer, Reis, Kohl, Kürbisgewächse, Kartoffeln, Tomaten, Baumwolle, Sojabohne und Karotte.
Eine andere Verwendung von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in Pflanzen umfasst die Erzeugung von männlicher Sterilität (Mariani et al., Nature 357, 384-387). Zum Beispiel kann Toxin oder ein Toxinsystem gemäß der vorliegenden Erfindung in Pflanzen unter geeigneter Kontrolle für tapetumspezifische Expression eingeführt werden [Seurinck et al., Nucleic Acids Res. 18, 3403 (1990), Koltunow et al., Plant Cell 2, 1201-1224 (1990); Mariani et al., Nature 347, 737-741 (1990)]. Männliche Sterilität in Pflanzen erleichtert Hybridsamenerzeugung durch Prävention von Selbstbestäubung, was Landwirten ermöglicht, Vorteile aus so genannter "Heterosis" zu ziehen, durch welche Kreuzungen zwischen Inzuchtlinien oft zu Nachkommenschaft mit hoher Ausbeute und erhöhter Resistenz gegen Erkrankung führen. Bereitstellung von gartenbaulichen oder Zierpflanzen, denen die Fähigkeit fehlt, Pollen zu erzeugen, kann verwendet werden, um Allergieprobleme lokaler Bewohner zu reduzieren, oder aus ästhetischen Gründen (z. B. bei Lilien, wo Staubbeutel derzeit von Hand entfernt werden).
Eine weitere Verwendung in Pflanzen ist die Erzeugung von Leersamigkeit, die oft aus Gründen der Einfachheit und des Geschmacks in Produkten, wie Wassermelonen, Trauben, Orangen und verwandten Früchten, Tomaten, Paprika, Gurken usw., wünschenswert ist. Toxin kann unter die regulierende Kontrolle eines samenspezifischen Promotors gestellt werden, wie z. B. den Promotor eines Samenspeicherproteins [Higgins et al., Ann. Rev. Plant. Physiol. 35, 191-221 (1984); Goldberg et al., Cell 56, 149-160 (1989)]. Beispiele für samenspezifische Promotoren umfassen jene für Bohnen-β-Phaseolin [Sengupta-Gopalan et al., PNAS US 82, 3320-3324 (1985)], Bohnenlectin [Voelker et al., EMBO J. 6, 3571-3577 (1987)], Sojabohnenlectin [Ocamuro et al., PNAS USA 83, 8240-8344 (1986)], Rapsnapin [Radke et al., Theor. Appl. Genet. 75, 685-694], Maiszein [Hoffman et al., EMBO J. 6, 3213-3221 (1987)], Gersten-β-Hordein [Marris et al., Plant Mol. Biol. 10, 359-366 (1988)] und Weizenglutenin [Colot et al., EMBO J. 6, 3559-3564 (1987)].
Prokaryotische Plasmide haben verschiedene genetische Systeme entwickelt, die ihre stabile Aufrechterhaltung in bakteriellen Wirten erhöhen. Diese Systeme werden in zwei verschiedene Arten unterteilt: Verteilungssysteme, die eine gut kontrollierte Aufteilung von Plasmid-DNA-Kopien zwischen den beiden Tochterzellen sichern, und Tötungssysteme, die jene Tochterzellen aus der bakteriellen Population eliminieren, die das Plasmid während der Teilung verloren haben [Yarmolinsky, Science 267 (5199), 836-7, 10. Februar 1995]. Letztere bestehen aus zwei Komponenten: einem bakteriellen Toxin (immer ein Protein) und seinem Antidot (ein Protein oder eine Antisense-RNA, die Transkription ihrer Tötungspartner hemmt) [Jensen und Gerdes, Mol. Microbiol. 17 (2), 205-10, Juli 1995; Thisted et al., J. Mol. Biol. 223 (1), 41-54, 5. Jänner 1992]. Diese Tötungssysteme sind im Allgemeinen von einem molekularen Blickwinkel ähnlich organisiert, und mehrere Mechanismen sichern, dass ein typisches Tötungssystem nicht aktiviert wird, wenn die Stabilität ihres beherbergenden Plasmids nicht kompromittiert wird. Daher sind sowohl Proteinantidot als auch toxische Komponenten in einem bicistronischen Operon organisiert, und das System ist molekular so entworfen, dass beide Transkripitions- und Translationsverfahren optimiert werden, um es in einem stummen Zustand zu halten (d. h. einem Zustand, in welchem die toxische Komponente durch ihr Antidot neutralisiert wird) [Jensen und Gerdes, Mol. Microbiol. 17 (2), 205-10, Juli 1995; Holcik und Iyer, Microbiology 143, 3403-3416 (1997)].
Unter normalen Umständen werden beide Komponenten eines Tötungssystems in einem Grundausmaß im Wirt durch ihre beherbergenden Plasmide synthetisiert, was dem Wirt das Überleben ermöglicht. Wenn ein aufspaltendes Bakterium (d. h. ein Bakterium, das das Plasmid verloren hat) nach Zellteilung erscheint, ermöglicht eine andere Eigenschaft dieser Systeme Aktivierung des Tötungsprozesses, um diese spezifische Zelle zu gegenselektieren, d. h. die Stabilität des Antidots ist geringer als das Toxin. Ohne eine kontinuierliche Synthese des Antidots führt dessen bevorzugter Abbau daher zum Erscheinen eines nicht-neutralisierten Toxins, das dann in der Lage ist, seine tödliche Wirkung auf den Wirt auszuüben. Diese toxische Wirkung kann ausgeführt werden, indem verschiedene Zelltargets beeinflusst werden, abhängig vom spezifischen Tötungssystem, z. B. DnaB-abhängige Replikation (ParD, pem), DNA-Gyrase-Komplex (ccd), Proteinsyntheseinhibition (KicB) und Septumbildung (kil) [für Verweise siehe Holcik und Iyer, Microbiology 143, 3403-3416 (1997)]. Yar molinsky beschreibt in Science, Band 267 (1995), andere vermeintliche „Suchtmoleküle", wie die Typ-II-Restriktionsenzyme (vermeintlichen Toxine) Pae R7 und EcoRI und ihre zugehörigen Methylasen, welche die offensichtliche Stabilität ihrer beherbergenden Plasmide erhöhen (der ursprüngliche Verweis auf diese Suchtmodule ist in Naito et al., Science 267, 897 (1995), zu finden). In dieser Arbeit beschriebt Yarmolinsky auch ein Paar von vermeintlichen Tötungssystemen aus Bakteriophagen-Lambda (Rex-Protein) und ein Paar von Stämmen von E. coli, die den Gen-Cluster prr tragen, der für eine Anticodon-Nuclease kodiert, die durch ein 26-Reste-Polypeptid aus Bakteriophagen-T4 aktiviert werden kann und dann eine Transfer-RNA spalten kann, die für Lysineinführung in Proteine wichtig ist. T4 ist für dieses Protein ungefährdet, weil es für ein Paar von wiederum nicht-essentiellen Proteinen kodiert, das diesen Schaden aufhebt. Er beschreibt auch Stämme von E. coli, die defekten Prophagen e14 tragen und die den Ausschluss durch Spaltung von Elongationsfaktor Tu und Hemmen der Translation allgemein erreichen.
ParD ist eines dieser Tötungssysteme [Bravo et al., Mol. Gen. Genet. 210 (1), 101-10, Nov. 1987; Bravo et al., Mol. Gen. Genet. 215 (1), 146-51, Dezember 1988]. Gramnegatives Plasmid R1 kodiert dafür, und es besteht aus zwei Genen: Kis (für „killing suppressor", tötenden Hemmstoff) und kid („killing determinant", tötende Determinante), die für das Antidot (10 kDa) bzw. das Toxin (12 kDa) kodiert. ParD ist ein kryptisches Tötungssystem, das eng reguliert wird, um seine Aktivierung unter Umständen zu vermeiden, die R1-Stabilität nicht kompromittieren. Daher wird es durch gekoppelte Transkription kontrolliert [Ruiz-Echevarria et al., Mol. Microbiol. 5 (11), 2685-93, November 1991], durch Posttranskriptionsverarbeitung seiner bicistronischen mRNA [Ruiz-Echevarria et al., Mol. Gen. Genet. 248 (5), 599-609, 20. September 1995], durch überlappende Translation [Ruiz-Echevarria et al., Mol. Gen. Genet. 248 (5), 599-609, 20. September 1995] und durch eine sehr enge Wechselwirkung zwischen Kis und Kid, um einen nicht-toxischen Komplex zu bilden, der zur selben Zeit in der Lage ist, Transkription aus seinem eigenen Promotor zu reprimieren [Ruiz-Echevarria et al., Mol. Microbiol. 5 (11), 2685-93, November 1991]. Genetische Organisation von ParD begünstigt gekoppelte Transkription, überlappte Translation und Posttranslati onsmodifikation von einigen der erhaltenen mRNAs. Kis/Kid-Komplexe reprimieren Transkription von Kis- und Kid-Genen.
ParD-Homologe sind zumindest in Plasmid R100 (pem-System) beschrieben worden (Tsuchimoto et al., J. Bacteriol. 170 (4), 1461-6, April 1988; Tsuchimoto et al., J. Bacteriol. 174 (13), 4205-11 (1992), Tsuchimoto et al., Mol. Gen. Genet. 237 (1-2), 81-88, Februar 1993; Masuda et al., J. Bacteriol. 175 (21), 6850-6, November 1993] und in E.-coli-Chromosom (ChpA und ChpB-Systemen) [Tsuchimito et al., Mol. Gen. Genet. 237 (1-2), 81-88, Februar 1993]. Andere werden durch Datenbankrecherche gezeigt.
Kid hemmt die Initiation von Replikation des E.-coli-Genoms und von DnaB- (d. h. die replikative Haupt-Helikase von E. coli) abhängigen Replikationsplasmiden [Ruiz-Echevarria et al., J. Mol. Biol. 247 (4), 568-77, 7. April 1995], und Überexpression Letzterer titriert die toxische Wirkung Ersterer in diesem Organismus in vivo [Ruiz-Echevarria et al., J. Mol. Biol. 247 (4), 568-77, 7. April 1995], was vermuten lässt, dass DnaB in den Mechanismus der Inhibition durch Kid involviert ist. Jüngste Beobachtungen im Labor der Erfinder lassen stark vermuten, dass diese Hemmung weder auf eine Zerlegung von hexameren DnaB-Komplexen durch Kid in Lösung noch auf Inhibition der Helikase-Aktivität über eine große Reihe von Substraten, einschließlich oriC, des Replikationsstartpunkts des E.-coli-Genoms, zurückzuführen ist. Ohne durch Theorie eingeschränkt sein zu wollen, kann es sein, dass das Laden von DnaB am Replikationsstartpunkt das Verfahren ist, das durch Kid gehemmt wird, entweder durch direkte Wechselwirkung zwischen diesen und/oder vermittelt durch eine dritte Komponente (DNA oder Protein), die noch beschrieben werden muss. Die jüngsten Forschungen sind auf die Identifikation des exakten Wirkmechanismus von Kid aus einem molekularen Gesichtspunkt fokussiert.
Bis zur Arbeit der Erfinder der hierin offenbarten Erfindung war es nicht klar, dass prokaryotische Systeme, die sich für spezifische Rollen in Bakterien entwickelt haben, in eukaryotischen Zellen wirken können.
Zum Beispiel müssen beide Komponenten in einem 2-Komponenten-Tötungssystem, wie z. B. einem, das kis/kid umfasst, ihre jeweiligen Funktionen ausführen – das Toxin, Zellen in Abwesenheit von Antidot zu töten (oder wenn gegenwärtig bei einem Überschuss an Antidot), und das Antidot, sowohl das Toxin zu neutralisieren als auch kontrollierbar zu sein, z. B. durch einen Mechanismus, der schnellen Umsatz umfasst. Vorzugsweise übt das Toxin keine Nebenwirkung auf die Zelllebensfähigkeit aus. Es ist sogar bevorzugt, dass Zelltötung über einen Mechanismus des programmierten Zelltods, wie z. B. Apoptose, bevorzugt ist. In Pflanzen kann es für bestimmte Anwendungen bevorzugt sein, eine nekrotische Reaktion zu induzieren, z. B. in der Induktion oder Verstärkung der Pathogenresistenz.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, dass Bakterientoxin und Antidot in eukaryotischen Zellen, Hefe, Xenopus und Säugetier (insbesondere Menschen) funktional sind und kontrolliert werden können, um Zellzyklusprogression und Zellproliferation zu hemmen und Zellen zu töten. Es wird in den nachstehend beschriebenen Versuchen gezeigt, dass Zellen durch Apoptose getötet werden können.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 zeigt Ergebnisse von Versuchen, die zeigen, dass ein Promotor, der durch Cu²⁺ induziert wird, später für die Kontrolle von Kis-Antidot-Expression verwendet, und ein anderer Promotor, der durch Methionin reprimiert wird, später für die Kontrolle von Kid-Toxin-Expression verwendet, beide in S. cerevisiae funktional sind. Das Diagramm zeigt Einheiten von β-Galactosidase-Aktivität in verschiedenen Konzentrationen (μM) der regulierenden Faktoren Cu²⁺ (unausgefüllte Kreise) und Met (ausgefüllte Kreise).
2 zeigt Ergebnisse von Versuchen, welche die Wirkung von Doxycyclin auf die Aktivität eines durch Tetracyclin regulierbaren Promotors (Tet PR) in HeLa-Zellen zeigen (nicht ausgefüllte Balken), wobei dieser Promotor später für die Kontrolle von Expression von Antidot-Kis verwendet wird (im Vektor pTRE-Luc), und ein Fehlen der Wirkung von Doxycyclin auf die Aktivität eines frühen Cytomegalievirus-Promotors (CMV Pr) (ausgefüllte Balken), wobei dieser Promotor später für die Kontrolle von Expression von Toxin-Kid (pCMV-Luc) verwendet wird. Luciferase-Aktivität wird graphisch in willkürlichen Einheiten dargestellt.
3 veranschaulicht verschiedene Konstrukte, die für die Expression von Kis und/oder Kid in HeLa-Zellen verwendet werden.
4 zeigt Ergebnisse von Versuchen, in welchen kis-Expression durch Doxycyclin in Kulturen von HeLa-Zellen moduliert werden, die stabil mit pNATHA1i und pNATHA2i transfiziert sind (3). Kid-Expression wurde durch CMV Pr kontrolliert, das von Doxycyclin nicht beeinflusst wurde.
5 zeigt weitere Ergebnisse von Versuchen (Zahl von toten Zellen), in welchen kis-Expression durch Doxycyclin in Kulturen von HeLa-Zellen moduliert werden, die stabil mit pNATHA1i und pNATHA2i transfiziert sind (5). Kis-Expression wurde durch Tet Pr kontrolliert, der durch Doxycyclin reprimiert wird, während kid-Expression durch CMV Pr kontrolliert wurde, der von Doxycyclin unbeeinflusst blieb.
6 zeigt das Aufkommen des Apoptose-Markers Annexin-V in Zellen, die den Versuchen unterzogen werden, deren Ergebnisse in 5 dargestellt sind, was anzeigt, dass Zelltod, der durch kid verursacht ist, Apoptose umfasst.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die Folgendes umfasst:

(i) das ParD-kid-Toxin und ParD-kis-Antitoxin oder
(ii) für das ParD-kid-Toxin und ParD-kis-Antitoxin kodierende Nucleinsäure

Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung umfasst die Verwendung einer Zusammensetzung Folgendes:

Ein dritter Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Hemmung von Zellproliferation und/oder Zellzyklusprogression, wobei das Verfahren die Bereitstellung des ParD-kid-Toxins und ParD-kis-Antitoxins in eukaryotischen Zellen unter einer geeigneten Kontrolle zur selektiven Zellzyklusinhibition und/oder Tötung von Targetzellen umfasst, worin die Zellen in vitro und/oder Pflanzenzellen sind.
Ein gewisses Maß an Kontrolle der Toxinwirkung wird vorzugsweise in Aspekten der vorliegenden Erfindung verwendet. Bakterielle Zelltötungssysteme, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, verwenden natürlich das PaD-kis-Antitoxin. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, dass sowohl Toxin als auch Antitoxin in verschiedenen eukaryotischen Zellen funktional sind und dass ihre jeweiligen Aktivitäten auf selektive Inhibition der Zellproliferation oder Impedanz von Zellzyklusprogression und/oder Induktion von programmiertem Zelltod kontrolliert werden können.
Das bakterielle Zelltötungssystem, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst ein Toxin und ein Antitoxin, die beide Proteine sind. Ein solches Tötungssystem wird im Fachgebiet „proteinisches Killergensystem" genannt – Jensen & Gerdes, Mol. Microbiol. 17 (2), 205-10, Juli 1995. Das bakterielle Tötungssystem, das in der Erfindung verwendet wird, ist ein E.-coli-System.
Beispiele für bakterielle Tötungssysteme [für Verweise siehe Holcik und Iyer, Microbiology 143, 3403-3416 (1997), und Verweise darin und „Horizontal Gene Pool: Bacterial Plasmids and Gene Spread", Hrsg. C. M. Thomas, Howard Academic Publishers, Kapitel 2 (1999)] umfassen ein bakterielles plasmidgetragenes proteinisches Killergensystem, wie z. B. ParD (oder R1 oder Homologe wie oben diskutiert), ccdA (H oder let A) des F-Plasmids (Antidot) und ccdB-(G-, letB- oder LetD-)Toxin, das durch Vergiftung von DNA-Gyrasekomplexen wirkt [Jaffé et al., Bacteriol. 163, 851-849 (1985), stellen fest, dass der Wirkungsmodus des ParD-Systems jenem des Ccd-Systems bemerkenswert ähnelt], toxisches Bakteriophagen-P1-Protein Doc mit Antidot PhD [Lehnherr et al., Mol. Biol. 233, 414-428 (1993)], parDE von Plasmid RK2 [Roberts et al., J. Mol. Biol. 268, 27109-27117 (1994)] mit toxischem Protein ParE und Antidot ParD und hig von Plasmid Rts1 [Tian et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 220, 280-284 (1996)] mit Antidot higA zu Toxin higB.
Weitere Beispiele für bakterielle Tötungssysteme, wo das natürliche Antidot eine Antisense-RNA ist, umfassen parB von Plasmid R1 [Gerdes et al., New Biol 2., 946-956 (1990a)] mit Toxin Hok und Antidot Sok [Thisted et al., EMBO J. 13, 1950-1959, (1994); hok-mRNA ist sehr stabil, sok-RNA zerfällt jedoch rasch], srnB [Onishi; Science 187, 257-258 (1975)], flm [Loh et al., Gene 66, 259-268 (1988)] des F-Plasmids und pnd sowohl von IncI-Plasmid R483 als auch IncB-Plasmd R16 [Akimoto und Ohnishi, Microbiol. Immunol. 26, 779-793 (1982)], relF des chromosomalen E.coli-relB-Operons (Induktion des relF-Gens führt zur selben physiologischen Antwort wie Expression des hok-Gens – Gerdes et al., EMBO J. 5, 2023-2029 (1986a)), relB-Homologe [Gronlund und Gerdes, J. Mol. Biol. 285, 1401-1415 (1999)] und Gef (auch chromosomal), das strukturell und funktionell den Proteinen ähnlich ist, für welche hok und relF kodieren [Poulsen et al., Mol. Microbiol. 3, 1463-1472 (1989)]. Gef-Protein ist toxisch und wird durch Antisense-RNA-Sof reguliert.
Weitere Systeme umfassen SegB-Operon-Epsilon (Antidot) und -Zeta (Toxin) von pSM19035 und pDB101 [Ceglowski et al., Mol. Gen. Genet. 214 (5-6), 579-85 (1993); Ceglowski et al., Gene 136 (1-2), 1-12 (1993)], kicA (Antidot) und kicB (Toxin), die im E.-coli-Chromosom zu finden sind [Feng et al., Mol. Gen. Genet. 243, 136-147 (1984)] und die kil/kor-Systeme, die durch bakterielle Plasmide der Immunkompatibilitätsgruppen P und N durchgeführt wurden. Siehe Holcik und Iyer [Microbiology 143, 3403-3416 (1997)] für Beispiele und Verweise. Siehe auch Jensen und Gerdes [Mol. Microbiol. 17 (2), 205-210 (1995)] und Yarmolinsky [Science 267, 836-837 (1995)] für Übersichtsartikel von proteinischen Killergensystemen, wobei festgestellt wurde, dass diese auffallende Ähnlichkeit sowohl in Struktur als auch Funktion aufwiesen.
Das ParD-kid-Toxin wird hierin mit dem jeweiligen Antidot, dem ParD-kis-Antitoxin, verwendet. Zusätzlich dazu kann das Toxin mit einem oder mehreren Elementen verwendet werden, die ihre Aktivität wie diskutiert hemmen oder blockieren (die durch Hemmung oder Blockierung ihrer Produktion erfolgen kann).
Sowohl das Toxin als auch das Antidot werden in eukaryotische Zellen unter geeigneter Kontrolle zur selektiven Zellzyklusinhibition und/oder Zelltötung eingeführt.
Ein Verfahren der Erfindung kann die Bereitstellung von ParD-kid-Toxin und ParD-kis-Antitoxin gegenüber eukaryotischen Zellen und, in Targetzellen, die Entfernung oder Hemmung des Antitoxins umfassen, um dem Toxin seine Wirkung zu ermöglichen. Produktion oder Aktivität von Antitoxin kann gehemmt oder blockiert werden. Dies kann durch die Bereitstellung eines geeigneten Reizes erfolgen, z. B. Induktormolekül oder Repressormolekül eines Promotors, der Antitoxinproduktion kontrolliert, oder kann unter geeigneten Bedingungen auftreten, die in Targetzellen vorherrschen. Wie nachstehend beschrieben kann die Gegenwart einer anderen Form eines Proteins, wie z. B. p53, in Targetzellen gegen Nicht-Targetzellen (z. B. für p53-Tumor- und Nicht-Tumorzellen) als kontrollierender Reiz verwendet werden. Ein Induktor oder Repressormolekül kann an Targetzellen abgegeben werden, um Antitoxin zu hemmen oder zu blockieren und/oder Toxin hinaufzuregulieren.
Im Allgemeinen wird das Zelltötungssystem Zellen durch Nucleinsäure bereitgestellt, die für die relevanten Komponenten und, wo anwendbar, Kontrollelemente kodiert (wie nachstehend diskutiert).
Kontrollelemente können eine oder mehrere der im Fachgebiet verfügbaren Elemente umfassen, was eine selektive Variation des Verhältnisses von Toxin gegen Antitoxin ermöglicht. Beispiele umfassen einen induzierbaren, reprimierbaren, oder konstitutiven Promotor, Antisense-Konstrukte und deren Aktivator oder Suppressor, Ribozyme, Spleißsequenzen und Spleißfaktoren, Rekombinationssysteme (z. B. Cre-lox oder FLP), Wildtyp- oder modifizierte interne Ribosomeneintrittstellen (IRES) [Schmid und Wimmer, Arch. Virol. Suppl. 9, 279-89 (1994); Borman et al., EMBO J. 1, 13 (13), 3149-57 (1994)] und IRES-Inhibitoren, wie z. B. eine Hefe-RNA, die das Eintreten von Ribosomen an einem bestimmten IRES hemmt [Das et al., J. Virol. 70 (3), 1624-32 (1996); Das et al., J. Virol. 72 (2), 6638-47 (1998); Das et al., Front Biosci. 1:3, D1241-52 (1998); Venkatosan et al., Nucleic Acids Res. 15, 27 (2), 562-72 (1999]), Elemente, die Transkriptionsinterferenz zwischen Promotoren ermöglichen [Greger und Proudfoot 17, 17 (16), 4771-9 (1998), Eggermont und Proudfoot, EMBO J. 12 (6), 2539-48 (1993), Bateman und Paule, Cell 23, 54 (7), 985-92 (1998), Ponnambalam und Busby, FEBS Lett. 9, 212 (1), 21-7 (1987), Greger et al., Nucleic Acids Res. 1, 26 (5), 1294-301 (1998)], Inteine [Chong et al., J. Biol. Chem. 271 (16), 22159-68 (1996)].
Es kann ein eukaryotischer Vektor bereitgestellt werden, umfassend Nucleinsäure, die wie offenbart für ein Toxin oder Zelltötungssystem kodiert. Ein solcher Vektor kann verwendet werden, um das Toxin oder Zelltötungssystem gegenüber eukaryotischen Zellen bereitzustellen.
Nucleinsäure, die für ein bakterielles Toxin und Antidot kodiert, kann als Teil eines Vektors oder von Vektoren bereitgestellt werden, die für Transformation von eukaryotischen Zellen geeignet sind. Vorzugsweise ist der Vektor für Transformation von Targetzellen geeignet, z. B. ist er für die Transformation von Pflanzenzellen geeignet (z. B. ein Agrobacterium-Vektor). Wo zwei Komponenten eines bakteriellen Tötungs systems verwendet werden oder ein Toxin verwendet wird und ein besonders entworfenes regulierendes Element verwendet wird (z. B. Antisense oder Ribozym), sind vorzugsweise beide Komponenten und regulierenden Elemente für die Kontrolle von Expression auf demselben Vektor bereitgestellt, können aber auf separaten Vektoren bereitgestellt werden. Eine oder beide kodierenden Nucleotidsequenzen können unter der Transkriptionskontrolle eines spezifischen und/oder regulierbaren Promotors stehen. Toxin- und Antidot-kodierende Sequenzen können in einer „Ende-zu-Ende"- oder umgekehrten Ausrichtung oder in einer Anfang-zu-Ende-Ausrichtung bereitgestellt werden.
Vorteilhaft wird z. B. in Hefe Nucleinsäure, die für Toxin kodiert, auf einem Multikopienplasmid bereitgestellt, wie z. B. für Hefe 2 μ [Christianson et al., Gene 2, 110 (1), 119-22 (1992)], für Säugetierzellen ein Vektor, der oriP aus Epstein-Barr-Virus umfasst (der vom Initiationsprotein EBNA1 begleitet wird, Kirchmaier und Sugden, J. Virol. 69 (2), 1280-3 (1995); Wendelburg und Vos, Gene Ther. 5 (10), 1389-99, Oktober 1998), oder der Ursprung vom Rinderpapillomavirus (das zwei Proteine benötigt, die vom Virus kodiert werden, um aktiv zu sein [Píirsoo et al., EMBO J. 2, 15 (1), 1-11 (1996)] oder ein Virusvektor.
Monokopienvektoren, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen für Hefe ARS1 und ARSH4/CEN6 [Sikorski und Hieter, Genetics 122 (1), 19-27 (1986); Mumberg et al., Gene 14: 156 (1), 119-22 (1995)].
Geeignete Vektoren können ausgewählt oder hergestellt werden, die geeignete regulierende Sequenzen enthalten, einschließlich Promotorsequenzen, Terminatorfragmenten, Polyadenylierungssequenzen, Enhancer-Sequenzen, Markergene und andere geeignete Sequenzen. Vektoren können plasmidisch und/oder viral sein und in Zellen als Episomen oder in das Genom integriert aufrechterhalten werden. Für weitere Details siehe zum Beispiel Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989). Viele bekannte Verfahren und Protokolle zur Manipulation von Nucleinsäure, z. B. zur Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA in Zel len und Genexpression und Analyse von Proteinen, sind in Short Protocols in Molecular Biology, 2. Auflage, Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons (1992), detailliert beschrieben.
Das ParD-kid-Toxin und ParD-kis-Antitoxin können gemäß der vorliegenden Erfindung einer eukaryotischen Zelle bereitgestellt werden, die aus Säugetier, menschlichen oder nicht-menschlichen, wie z. B. Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Maus oder einem anderen Nagetier, Katze, Hund, Schwein, Schaf, Ziege, Rind oder Pferd, Vogel, wie z. B. Huhn, Hefe, Pilz, Amphibien, Fisch, Wurm und Pflanzen ausgewählt ist. Pflanzen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind zuvor schon angeführt worden.
Es kann eine eukaryotische Zelle bereitgestellt werden, die Nucleinsäure enthält, die für ein bakterielles Toxin und/oder Antidot oder Zelltötungssystem wie hierin offenbart unter geeigneter regulierender Kontrolle kodiert. Die Nucleinsäure kann in das Genom (z. B. Chromosom) der Zelle integriert werden. Integration kann durch Einführung von Sequenzen gemäß Standardverfahren gefördert werden, die Rekombination mit dem Genom fördern. Die Nucleinsäure kann sich auf einem extrachromosomalen Vektor innerhalb der Zelle befinden.
Ein Verfahren der Erfindung kann die Einführung von Nucleinsäure in eine eukaryotische Zelle umfassen. Die Einführung, die (insbesondere für In-vitro-Einführung) im Allgemeinen ohne Einschränkung als „Transformation" bezeichnet wird, kann jedes beliebige Verfahren verwenden. Für eukaryotische Zellen können geeignete Verfahren Kalziumphosphattransfektion, DEAE-Dextran, Elektroporation, liposomvermittelte Transfektion und Transduktion unter Verwendung von Retrovirus oder einem anderen Virus, z. B. Vakzinia oder, für Insektenzellen, Baculovirus, umfassen.
Der Einführung kann Verursachung oder Ermöglichung von Expression aus der Nucleinsäure folgen, z. B. durch Kultivieren von Zellen (die Zellen umfassen können, die tatsächlich transformiert worden sind, obwohl es wahrscheinlicher ist, dass die Zellen Nachkommen der transformierten Zellen sind) unter Expressionsbedingungen einer oder mehrerer Komponenten des Systems, sodass ein kodiertes Produkt produziert wird. Die Bedingungen können Zelltötung (oder Inhibition von Zellzyklusprogression, Zellwachstum oder Proliferation etc.) bereitstellen und/oder wenn geeignet Neutralisation der toxischen Wirkung.
Einführung von Nucleinsäure kann wie nachstehend beschrieben durch Gentherapie in vivo stattfinden. Eine Zelle, die Nucleinsäure enthält, die für ein System nach der vorliegenden Erfindung kodiert, z. B. als Folge einer Einführung von Nucleinsäure in die Zelle oder in einen Vorgänger der Zelle und/oder genetischen Änderung der Sequenz, die zur Zelle oder zum Vorfahren endogen ist (dessen Einführung oder Änderung in vivo oder ex vivo stattfinden kann), kann in einem Organismus (z. B. im Soma) enthalten sein, der ein Tier ist, insbesondere ein Säugetier, das menschlich oder nicht-menschlich ist, Hefe, Pilz, Amphibie, Fisch, Wurm oder Pflanze, mit Beispielen, die schon zuvor angeführt worden sind. Genetisch modifizierte oder transgene Tiere, Vögel oder Pflanzen, die eine solche Zelle umfassen, können ebenfalls bereitgestellt werden.
Daher kann ein nicht-menschliches Tier mit einer Nucleinsäure, die für ein bakterielles Zelltötungssystem (wie offenbart) kodiert, innerhalb ihres Genoms bereitgestellt werden. Das Tier kann ein Nagetier, z. B. eine Maus, sein und kann ein Tiermodell zur Untersuchung von Aspekten der Zellzykluskontrolle, Zelltötung, Apoptose oder anderer Zellprozesse und Arzneimittelscreening bereitstellen.
Eine Pflanze mit Nucleinsäure, die für ein bakterielles Zelltötungssystem kodiert, innerhalb seines Genoms, eine Pflanzenzelle (die in Kultur sein kann, z. B. Callus-Kultur, oder in einer Pflanze oder einem Pflanzenteil enthalten sein kann) oder ein Pflanzenteil (z. B. Frucht, Blatt, Samen oder eine andere Fortpflanzungseinheit) können ebenfalls bereitgestellt werden.
Zur Erzeugung von Pflanzenmaterial, das eine Nucleinsäure umfasst, die für ein bakterielles Zelltötungssystem kodiert, wie offenbart, können beliebige geeignete Mittel zur Transformation verwendet werden. Agrobacterium-Transformation wird weitge hend von Fachleuten verwendet, um sowohl Zweikeimblättler als auch Einkeimblättler zu transformieren. Mikroprojektilbeschuss, Elektroporation und direkte DNA-Aufnahme sind bevorzugt, wo Agrobacterium ineffizient oder ineffektiv ist. Alternativ dazu kann eine Kombination aus verschiedenen Verfahren verwendet werden, z. B. Beschuss mit Agrobacterium-beschichteten Mikroteilchen oder Mikroprojektilbeschuss, um Verwundung gefolgt von Co-Kultivierung mit Agrobacterium zu induzieren. Nach Transformation kann eine Pflanze regeneriert werden, z. B. aus einzelnen Zellen, Callus-Gewebe oder Blattscheiben, wie es im Fachgebiet Standard ist. Fast jede Pflanze kann vollständig aus Zellen, Geweben und Organen der Pflanze regeneriert werden.
Wo ein Bakterienzellen tötendes Toxin verwendet wird, gibt es verschiedene Strategien für die Kontrolle seiner Aktivität. Im Allgemeinen wird das relevante Antidot verwendet, um die toxische Wirkung zu neutralisieren, sofern nicht und bis Toxizität gewünscht ist. Daher können sowohl Toxin als auch Antidot in normalen Zellen exprimiert werden, wobei Antidotproduktion in Targetzellen (z. B. Tumorzellen) herabreguliert wird. Toxinproduktion kann in normalen Zellen herabreguliert werden und/oder in Targetzellen hinaufreguliert werden. Antidotproduktion kann in normalen Zellen hinaufreguliert werden und/oder in Targetzellen herabreguliert werden.
Hinaufregulierung von Toxin und/oder Antidotproduktion, abhängig vom Kontext, kann durch eine Reihe von Mitteln erreicht werden. Ein bevorzugter Ansatz ist es, einen Promotor zu verwenden oder ein anderes regulierendes Element, das unter bestimmten Bedingungen induzierbar ist, was die Kontrolle von Expression durch Anwendung eines geeigneten Reizes ermöglicht.
Es kann ein tumorspezifischer Promotor, wie z. B. Telomerase-RNA-Promotor, verwendet werden. In Pflanzennematoden können induzierbare Promotoren, wie z. B. TobRB7 [Opperman et al., Science 263, 221-223] und PRP1 [pathogeneseverwandtes Protein, siehe z. B. Payne et al., Plant Molecular Biology 12, 595-596 (1989), auch Memelink et al., Plant Molecular Biology 14, 119-126 (1990), und Payne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 98-102 (1990)] verwendet werden.
Herabregulierung von Toxin und/oder Antidot, wieder abhängig vom Kontext, kann ebenfalls durch Regulierung von Genexpression unter Verwendung eines geeigneten Promotors oder eines anderen regulierenden Elements erreicht werden, einschließlich eines Repressorelements, wie Tet Pr. Andere Ansätze, die verwendet werden können, umfassen Antisense-Regulation und Ribozyme (nachstehend weiter diskutiert).
Daher kann zum Beispiel die Antidotproduktion durch Produktion eines Antisense-Transkripts oder Ribozyms herabreguliert werden. Das Antisense-Transkript oder Ribozym kann bei Anwendung eines geeigneten Reizes hergestellt werden und kann durch Expression aus einer Sequenz unter Transkriptionskontrolle eines induzierbaren Promotors oder eines anderen regulierenden Elements produziert werden.
Unter „Promotor" versteht man eine Sequenz von Nucleotiden, aus welcher Transkription von DNA, die operabel stomab gebunden ist (d. h. in der 3'-Richtung auf dem Sense-Strang doppelsträngiger DNA), initiiert werden kann.
„Operabel gebunden" steht für gebunden als Teil desselben Nucleinsäuremoleküls, geeignet positioniert und für Transkription ausgerichtet, die vom Promotor zu initiieren ist. DNA, die operabel an einen Promotor gebunden ist, „unterliegt Transkriptionsinitiationsregulation" des Promotors.
Der Begriff „induzierbar", wie er auf einen Promotor angewendet wird, wird von Fachleuten gut verstanden. Im Wesentlichen wird Expression unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors „eingeschaltet" oder als Reaktion auf einen angewendeten Reiz erhöht (der innerhalb einer Zelle erzeugt oder exogen bereitgestellt werden kann). Das Wesen des Reizes variiert zwischen Promotoren. Einige induzierbare Promotoren verursachen wenig oder nicht-detektierbare Ausmaße an Expression (oder keine Expression) in Abwesenheit des geeigneten Reizes. Andere induzierbare Promotoren verursachen detektierbare konstitutive Expression in Abwesenheit des Reizes. Wie hoch auch immer das Ausmaß an Expression in Abwesenheit des Reizes ist, Expression aus einem induzierbaren Promotor wird in Gegenwart des korrekten Rei zes erhöht. Die bevorzugte Situation ist jene, wo das Ausmaß an Expression nach Anwendung des relevanten Reizes um eine wirksame Menge steigt, um das gewünschte Ergebnis bereitzustellen. Daher kann ein induzierbarer (oder „schaltbarer") Promotor verwendet werden, der ein Grundausmaß an Expression in Abwesenheit des Reizes verursacht, dessen Ausmaß zu gering ist, um das gewünschte Ergebnis zu erbringen (und kann sogar null sein). Nach Anwendung des Reizes wird Expression auf ein Ausmaß erhöht (oder eingeschaltet), welches das gewünschte Ergebnis erbringt.
Beispiele für induzierbare Promotoren zur Verwendung in Aspekten der vorliegenden Erfindung umfassen einen minimalen Promotor, wie z. B. minimalen CMV-Promotor, fusioniert an einen Enhancer für Wildtyp-p53-Aktivierung oder Mutant-p53-Repression, ob er die Consensus-DNA-Bindungssequenz für Wildtyp-p53, z. B. Fragment A [Kern et al., Science 252 (5013), 1708-11 (1991)] oder CON [Chen et al., Oncogene 8 (8), 2159-66 (1993)], enthält oder nicht, z. B. HIV-1-LTR [Subier et al., J. Virol. 68 (1), 103-10 (1994); Gualberto und Baldwin, J. Biol. Chem. 25, 270 (34), 19680-3 (1995); Sawaya et al., J. Biol. Chem. 7, 273 (32), 20052-7 (1998)], induzierbare oder reprimierbare Promotoren, wie z. B. wie diskutiert Tet Pr und galactoseaktivierbaren GAL10-CYC1. Für Pflanzen geeignete Promotoren umfassen den induzierbaren GTS-II-Promotor von Mais [Jepson et al., Plant Molecular Biology 26, 1855-1866 (1994)), alkoholinduzierbaren Promotor (z. B. alcr, siehe z. B. Gatz, Nature Biotechnology 16, 140 (1998)) und den Blumenkohlmosaikvirus-35S-(CaMV-35S-)Genpromotor, der in einem hohen Ausmaß in so gut wie allen Pflanzengeweben exprimiert wird [Benfey et al., EMBO J. 9, 1677-1684 (1990)].
Wie angeführt kann die Toxinproduktion in Non-Targetzellen durch Verwendung von Elementen zur Kontrolle von Expression herabreguliert werden. Alternative oder zusätzliche Herabregulierung kann Antisense-Nucleinsäure oder Ribozyme verwenden. Einer oder mehrere dieser Ansätze können zusätzlich zur Verwendung von Antitoxin zur Neutralisation von Toxinaktivität verwendet werden. Antitoxinproduktion selbst kann wie diskutiert kontrolliert werden.
In einem bevorzugten Ansatz wird Selektivität für Expression des Toxins innerhalb von Targetzellen gemäß der vorliegenden Erfindung durch eine Kombination von (i) Hinaufregulierung von Toxinproduktion in Targetzellen und (ii) Herabregulierung von Toxinproduktion in Nicht-Targetzellen und/oder Neutralisation von Toxinaktivität in Nicht-Targetzellen (z. B. durch Hinaufregulierung von Antidotproduktion in Nicht-Targetzellen) bewirkt. Wirkung (i) vermittelt die gewünschte Aktivität in Targetzellen, während Wirkung (ii) das Ausmaß an „durchlässiger" Expression der Aktivität in Nicht-Targetzellen reduziert.
Wo Targetzellen Tumorzellen sind und Nicht-Targetzellen normale Zellen sind, kann Vorteil aus der Tatsache gezogen werden, dass p53 mutiert oder seine Funktion in einem großen Anteil an Tumoren inaktiviert ist. Das p53-Protein ist ein Transkriptionsaktivator in normalen Zellen, ist aber in mutierter Form in einem wesentlichen Anteil (40-80%) von menschlichen Tumoren gegenwärtig. Sogar in Tumoren, in welchen die p53-Sequenz Wildtyp ist, kann seine normale Funktion in Zellzykluskontrolle, DNA-Reparatur, Differenzierung, Genomplastizität oder Apoptose aufgehoben werden, z. B. durch Wechselwirkung mit zellulärem Protein (z. B. mdm2) oder onkoviralem Protein (z. B. SV40-T-Antigen, menschliches Papillomavirus-E6-Protein, Adenovirus-E1B-Protein, Hepatitis-B-Virus-X-Protein und Epstein-Barr-V-BZLF-1-Protein) oder durch die Absonderung in das Cytoplasma, wo das p53-Protein nicht-funktional ist.
Dementsprechend kann Produktion des Antidots (oder der Antisense-RNA oder eines Ribozyms, das gegen das Toxin gerichtet ist) durch einen Promotor kontrolliert werden, dessen Funktion durch Wildtyp-p53 in normalen Zellen hinaufreguliert ist, aber nicht durch Mutant-p53 in Tumorzellen. Wildtyp-p53-Protein bindet sich an zwei Kopien der Consensus-Sequenz 5'-PuPuPuC (A/T) (A/T) GpyPyPy-3' (Seq.-ID Nr. 1) und transaktiviert dadurch das Ausmaß an Transkription aus einem operabel gebundenen Promotor. Die meisten Mutationen im p53-Gen führen zur Abschaffung der sequenzspezifischen transkriptionsaktivierenden Funktion.
Produktion des Toxins kann durch einen Promotor kontrolliert werden, dessen Funktion durch Wildtyp-p53-Protein in normalen Zellen unterdrückt wird, aber durch mutiertes p53-Protein nicht unterdrückt oder sogar hinaufreguliert wird, z. B. hsp70-Promotor, mdm2-Promotor und andere. Siehe zum Beispiel „The Oncogene and Tumour Suppressor Gene Facts Book", Robin Hesketh, Academic Press, 2. Auflage, Kapitel p53, 446-463 (1997) und Verweise darin.
Die Promotoren einer Reihe von zellulären Genen sind durch Wildtyp-p53 negativ reguliert, umfassen basischen FGF (wird auch durch mutiertes p53 aktiviert), Bcl-2, menschliches Interleukin 6 und PCNA. Siehe wiederum „The Oncogene and Tumour Suppressor Gene Facts Book", Robin Hesketh, Academic Press, 2. Auflage, Kapitel p53, 446-463 (1997) und Verweise darin für Beispiele. Virale Promotoren, die durch Wildtyp-p53 gehemmt werden und in manchen Fällen durch mutierte Versionen aktiviert werden, werden in Deb et al., J. Virology 66 (10), 6164-6170 (1992), beschrieben.
Dementsprechend kann ein solcher Promotor oder eine Bindungsstelle für Wildtyp-p53 aus einem solchen Promotor operabel an Nucleinsäure gebunden sein, die für das Toxin kodiert. In normalen Zellen unterdrückt Wildtyp-p53-Protein die Produktion des Toxins. In Tumoren, wo p53 nicht funktional ist und seine Bindungsstelle im Promotor nicht bindet, ist die Toxinproduktion dereprimiert.
Ähnlich kann ein Antwortelement, das durch ein mutiertes p53 aktiviert wird, aber nicht durch einen Wildtyp, wie z. B. aus HIV1-LTR-DNA-Sequenz, verwendet werden, um eine Hinaufregulierung von Toxin in Tumorzellen oder Herabregulierung von Antidot bereitzustellen, wo eine dritte Komponente verwendet wird, um Antidotproduktion in Tumorzellen zu kontrollieren. Ein Element, das durch mutiertes p53-Element (z. B.) aktiviert wird, kann verwendet werden, um eine Antisense-RNA, Ribozym oder einen anderen Faktor hinaufzuregulieren, der Antidotproduktion in Tumorzellen herabreguliert.
In Nicht-Targetzellen kann die Produktion von Toxin durch die Verwendung von geeigneter Nucleinsäure zur Beeinflussung von Expression durch Antisense-Regulation gehemmt werden. Solche Ansätze können verwendet werden, um Antidotproduktion in Targetzellen herabzuregulieren. Die Verwendung von Antisense-Genen oder partiellen Gensequenzen zur Herabregulierung von Genexpression ist nicht gut etabliert. Doppelsträngige DNA wird unter die Kontrolle eines Promotors in einer „Umkehrorientierung" platziert, sodass Transkription des „Antisense"-Strangs der DNA RNA erbringt, die zu normaler mRNA komplementär ist, die aus dem „Sense"-Strang des Targetgens transkribiert wird. Die komplementäre Antisense-RNA-Sequenz soll sich dann mit mRNA verbinden, um einen Duplex zu bilden, der Translation der endogenen mRNA aus dem Targetgen in das Protein hemmt. Ob dies der tatsächliche Wirkmodus ist oder nicht, ist immer noch unsicher. Es ist jedoch sicher, dass diese Technik funktioniert.
Eine andere Möglichkeit ist, dass die Nucleinsäure verwendet wird, die bei Transkription ein Ribozym produziert, das in der Lage ist, Nucleinsäure an einer spezifischen Stelle zu schneiden, daher also zur Beeinflussung der Genexpression nützlich ist. Hintergrundverweise für Ribozyme umfassen Kashani-Sabet und Scanlon, Cancer Gene Therapy 2 (3), 213-223 (1995), und Mercola und Cohen, Cancer Gene Therapy 2 (1), 47-59 (1995).
Daher kann eine Antisense-RNA oder ein Ribozym, die/das gegen Toxinexpression gerichtet ist, verwendet werden, um Produktion in Nicht-Targetzellen herabzuregulieren. Antisense-RNA- oder Ribozymenproduktion kann unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors platziert werden, sodass eine solche Produktion in Targetzellen herabreguliert werden kann (zum Beispiel wie oben beschrieben durch ein p53-Element).
Ein Ansatz zur Herabregulierung von Toxinproduktion in Nicht-Targetzellen (z. B. normalen Zellen) und/oder Hinaufregulierung von Toxinproduktion in Targetzellen (z. B. Tumorzellen) kann anstelle von oder zusätzlich zur Regulation von Antidotproduktion erfolgen.
Eine weitere Möglichkeit ist es, Antisense-RNA oder ein Ribozym oder einen anderen Ansatz zu verwenden, um Antidotproduktion in Targetzellen herabzuregulieren. Hinaufregulierung der Produktion in Targetzellen einer Antisense-RNA oder eines Ribozyms gegen Antidot kann verwendet werden, um Ausmaße an Antidot in Targetzellen zu reduzieren und dadurch Toxinaktivität in jenen Zellen zu erhöhen.
Kontrolle von Translation kann verwendet werden, z. B. durch eine interne Ribosomeneintrittssequenz (IRES), die unter Verwendung einer RNA aus Hefe kontrolliert werden kann (Das et al., J. Virol. 70 (3), 1624-32 (1996); Das et al., J. Virol. 72 (7), 6638-47 (1998), Das et al., Front Biosci. 1:3, D1241-52 (1998), Venkatosan et al., Nucleic Acids Res. 15, 27 (2), 562-72 (1999)), oder andere, die Ribosomenanordnung an IRES hemmen.
In weiteren Ausführungsformen wird das Tötungssystem, Toxin und/oder Antidot oder ein anderer Inhibitor Zellen als Protein bereitgestellt, z. B. durch direkte Infektion in Targetzellen, wie z. B. in einem Tumor. In einer Ausführungsform wird ein Trägermolekül verwendet, um die Aufnahme durch Zellen zu erleichtern, z. B. eine 16-aa-Peptidsequenz, die von der Homödomäne von Antennapedia (z. B. wie unter dem Namen „Penetratin" verkauft) stammt, die über einen terminalen Cys-Rest an ein Peptid gebunden werden kann. Das „Penetratin"-Molekül und seine Eigenschaften sind in WO 91/18981 beschrieben. Ein anderes Beispiel ist VP22 (Elliott und O'Hare, Gene Ther. 6 (1), 149-51 (1999); Dilber et al., Gene Ther. 6 (1), 12-12 (1999), Phelan et al., Nat. Biotechnol. 16 (5), 440-3 (1998)).
Expression und Reinigung eines Toxinantidots erfolgt unkompliziert. Jedoch macht das toxische Wesen eines Toxins, wie z. B. des Kid-Proteins, es schwieriger, dies zu überexprimieren und zu reinigen. Jedoch sind geeignete Strategien verfügbar oder können von Fachleuten ersonnen werden. Unter Verweis auf Kis/Kid in Abwesenheit eines Kid-resistenten genetischen Hintergrunds kann das Kis-Antidot zur selben Zeit in Kid-überproduzierenden Stämmen co-exprimiert werden. Die enge Wechselwirkung, die zwischen beiden Proteinen stattfindet, um einen neutralisierten Komplex zu erzeugen, ermöglicht Reinigung aus einem gesamten bakteriellen Extrakt und Tren nung der Komponenten danach durch chaotrope Denaturierung und weitere chromatographische Reinigung und Renaturierung der toxischen Komponente. Ein bakterieller auf Ein- oder Zwei-Affinitätschromatographie basierender Ansatz ist entworfen worden, um Kid und Kid-Varianten in hohen Mengen zu reinigen, und ein Umfaltungsprotokoll ist standardisiert worden, um aktive, reine und konzentrierte Formulierungen des ParD-System-Toxins zu erhalten. Siehe die nachstehend beschriebenen Versuche. Ein solcher Ansatz kann verwendet werden, um andere toxische Komponenten verschiedener Stabilitätssysteme zu reinigen.
Eine Zusammensetzung, die Nucleinsäure, Proteine oder Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, kann zumindest eine zusätzliche Komponente umfassen, wie z. B. ein(en) pharmazeutisch annehmbares/n Verdünnungsmittel, Vehikel oder Träger oder ein Lösungsmittel oder einen Träger zur Lieferung an den Targetorganismus, z. B. eine Pflanze.
Nucleinsäure, Proteine, Zellen und Zusammensetzungen wie hierin offenbart können in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie verwendet werden, z. B. zur Behandlung von Tumoren, Krebs, Psoriasis, Arteriosklerose, eine beliebige andere hyperproliferative Erkrankung oder eine andere Erkrankung. Nucleinsäure, Protein, Zellen und Zusammensetzungen können ebenfalls zur Herstellung eines Medikaments für eine solche Behandlung verwendet werden, wobei Verfahren zur Behandlung Verabreichung eines Arzneimittels und/oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Eukaryoten umfassen. Verfahren können die Behandlung von eukaryotischen Zellen mit Nucleinsäure, Protein, Zellen oder Zusammensetzungen wie hierin offenbart umfassen. Die eukaryotischen Zellen können beispielsweise eine beliebige Hefe, Säugetier, Pflanze, Amphibie, Vogel, Fisch oder Wurm sein. Zu behandelnde Zellen können in vitro oder in Kultur behandelt werden oder können in einem Säugetier-(z. B. menschlichen)Körper, einer Pflanze oder einem Pflanzenteil (z. B. Frucht, Blatt, Samen oder einer anderen Fortpflanzungseinheit) enthalten sein.
Hierin beschriebene Zusammensetzungen, Zellen und Verfahren können in Verfahren verwendet werden, in welchen Expression eines gewünschten Gens auf gewünschte Zellen ausgerichtet ist, z. B. Tumorzellen im Gegensatz zu Nicht-Tumorzellen. Solche Verfahren können in vivo (z. B. durch Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers für therapeutische Zwecke), ex vivo (z. B. auf Zellen, die aus einem menschlichen oder tierischen Körper entfernt wurden, und zwar vor Rückführung der Zellen in den Körper) oder in vitro durchgeführt werden. Zusammensetzungen und Zellen können zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung verwendet werden, in welcher Expression eines gewünschten Gens auf Targetzellen (z. B. Tumorzellen) ausgerichtet ist. Nucleinsäurekonstrukte können einen Teil eines Virusvektors bilden, zum Beispiel einen Virusvektor, der so hergestellt werden soll, dass er für die Verabreichung an eine Person, wie z. B. einen Menschen, und vorzugsweise zusätzliches Tumor-Targeting geeignet ist.
Bereitgestellte Zusammensetzungen können an Individuen verabreicht werden. Verabreichung erfolgt vorzugsweise in einer „therapeutisch wirksamen Menge", wobei diese ausreicht, um einem Patienten Nutzen zu bringen. Ein solcher Nutzen muss zumindest eine Linderung von zumindest einem Symptom sein. Die tatsächlich verabreichte Menge und Geschwindigkeit und der Zeitverlauf der Verabreichung hängt von der Natur und Schwere dessen ab, was zu behandeln ist. Verschreibung der Behandlung, z. B. Entscheidungen über Dosierung etc., liegen im Verantwortungsbereich von Allgemeinmedizinern und anderen Ärzten.
Eine Zusammensetzung kann alleine oder in Kombination mit anderen Behandlungen verabreicht werden, entweder gleichzeitig oder nacheinander, abhängig vom zu behandelnden Leiden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung und zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können zusätzlich zum aktiven Inhaltsstoff einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Träger, Puffer, Stabilisator oder andere fachbekannte Materialien umfassen. Solche Materialien sollen nicht- toxisch sein und die Wirksamkeit des Wirkstoffes nicht beeinflussen. Das genaue Wesen des Trägers oder eines anderen Materials hängt vom Verabreichungsweg ab.
Die experimentelle Unterstützung der vorliegenden Erfindung wird nun durch Veranschaulichung erklärt. Verschiedene zusätzliche Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Fachleuten offensichtlich.
Das hierin verwendete „umfassend" wird mit der Bedeutung von „einschließlich" verwendet, das heißt, es ermöglicht die Gegenwart eines oder mehrerer zusätzlicher Komponenten oder Eigenschaften.
BEISPIEL 1
Wirkung von Expression des parD-Systems in Saccharomyces cerevisiae
Mehrere Plasmide mit verschiedenen konstitutiven und/oder regulierbaren Promotoren wurden auf deren Fähigkeit getestet, beide Komponenten des parD-Systems separat in einer kontrollierten Art zu exprimieren. Die Ergebnisse waren bei all den verwendeten Promotoren ähnlich. Zusätzlich zu den Promotoren, die wie in den folgenden Versuchen detailliert beschrieben verwendet worden sind, führten die Erfinder Versuche unter Verwendung des ADH5-Promotors [konstitutiv, Mumberg et al., Gene 14, 156 (1), 119-22 (1995)] für kis und GAL10-CYC1 (galactoseaktivierbar, Guarente et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (23), 7410-4) für kid durch.
Antidottranskription in S. cerevisiae wurde durch einen Promotor kontrolliert, der durch Cu²⁺ induziert wurde, während die Toxintranskription durch einen anderen Promotor kontrolliert wurde, der durch Methionin reprimiert wurde. Mit diesem Zweck wurde Ersterer in einem Monokopienplasmid (ARSH4/CEN6-Replikationsstartpunkt) kloniert und Letzterer in einem Multikopienplasmid (2μ-Replikationsstartpunkt) kloniert, das einer transfizierten Hefe Auxotrophie für Leucin und Tryptophan verleiht (1).
Die Verwendung eines Multikopienplasmids für die Toxinexpression hat zwei Vorteile: erstens, sie reduziert die Möglichkeit der Auswahl von Zellen, die dieses Protein durch Mutation ihrer DNA inaktiviert haben, da jede Zelle alle Kopien (10-30 Moleküle pro Haploidgenom für ein 2 μ-Startpunkt-beherbergendes Plasmid) des kid-Gens, das in jeder Zelle gegenwärtig ist, inaktivieren soll. Mutation dieses Gens unter Wachstumsbedingungen, bei welchen das System durch Expression des Antidots unwahrscheinlich ist, da es in dieser Situation keinen selektiven Druck für die Zellen gibt, Mutationen zu akkumulieren. Dies wird durch die Tatsache belegt, dass Induktion des Systems eine klare hemmende Wirkung auf S.-cerevisiae-Wachstum (siehe unten) ausübt. Zweitens zeigte dieser Ansatz, dass es auch möglich ist, die Menge an mRNA jeder Komponente des Systems durch Steigerung oder Verringerung der Zahl an kodierenden DNA-Molekülen für jedes (d. h. ihre Kopienzahl) ohne Modifikation der Stärke ihrer Promotoren zu regulieren. Dies ermöglicht größere Flexibilität im Entwurf von Systemen in Eukaryoten z. B. für Hefe, Antipilzmittel etc.
Verschiedene S.-cerevisiae-Stämme, die mit (kis+/kid+)-, (kis+/kid–)- oder (kis–/kid–)-Plasmiden transfiziert sind, wurden in flüssigem selektivem Medium (-Leu/-Trp) in Gegenwart von Mengen von Cu²⁺ und Methionin gezüchtet, die das parD-System in einem inaktivierten Zustand halten, bevor verschiedene Reihenverdünnungen dieser Kulturen in festem Medium mit einer konstanten Menge von Methionin ausplattiert wurden, um eine konstante Expression von Kid (wenn es eine gibt) in allen Fällen zu ergeben, aber reduzierten Konzentrationen von Cu²⁺, um Expression seines Antidots von Platte zu Platte zu verringern. Kis- und Kid-beherbergende Zellen waren nicht in der Lage, in Medium ohne Cu²⁺ zu wachsen, und diese Wirkung wird verringert, da Cu²⁺-Konzentration steigt, bis sie etwa dieselbe Wachstumsgeschwindigkeit erreicht wie Wildtyp-(kis–/kid–)-Zellen. Hingegen waren sowohl (kis+/kid–)- als auch Wildtyp-(kis–/kid–)-Zellen in der Lage, normal unter allen getesteten Bedingungen zu wachsen.
Dieser Versuch zeigte, dass Kid und Kis als Toxin bzw. sein Antidot in Hefe aktiv sind und dass es möglich ist, deren Aktivität (und daher parD-Aktivierung oder -Inaktivierung) durch Transkriptionskontrolle seiner Komponenten in S. cerevisiae zu regulieren. Er stellt auch Hinweise darauf bereit, dass Antidotexpression alleine keine Nebenwirkungen zeigt und dass der biologische Prozess, der durch parD-Toxin gehemmt wird, unter entfernt entwickelten Organismen konserviert ist.
BEISPIEL 2
Wirkung der Proteine des parD-Systems in Xenopus laevis
Zweizell-Stadiumembryos aus Xenopus laevis wurden am animalen Pol eines der Blastomeren entweder mit Kis, Kid, beiden oder keinem davon (Puffer) injiziert, und die Wirkungen auf nachfolgende Zellteilungen wurden im Zeitverlauf verfolgt. Embryos, denen Kid injiziert wurde, teilten sich nur im nicht-injizierten Elastomer korrekt, während Embryoblastomeren, denen Kis, Kis/Kid und Puffer injiziert wurde, sich in allen Fällen auf dieselbe Art entwickelten wie jene, denen nichts injiziert wurde, entlang den embryonalen Entwicklungszuständen, die im Versuch folgten (zumindest bis zur mittleren Blastulatransition, MBT).
Dieser Versuch zeigt weiters, dass eukaryotische Zellzyklusprogression schwer von nicht-neutralisiertem Kid-Protein betroffen ist, und lässt vermuten, dass diese Wirkung in keiner der gap-Phasen (G1 oder G2) ausgeübt wird, da sie in den ersten Stadien von C.-laevis-Entwicklung nicht gegenwärtig sind. Er bestätigt auch, dass er einen konservierten biologischen Prozess bei entfernten Spezies beeinflusst, und bietet einige Hinweise in Bezug auf einen möglichen Mechanismus der Wirkung von Kid (da embryonale X.-laevis-Replikation keine spezifischen DNA-Sequenzen zur Initiation erfordert). Die Tatsache, dass Progression durch den Zellzyklus der nicht-injizierten Blastomeren in den Kid-injizierten Embryos ganz und gar nicht beeinflusst wird, zeigt gemeinsam mit dem Fehlen von Wirkungen in beiden Hälften der anderen injizierten Embryos (Kis, Kid und Puffer) klar, dass das Kid-Genprodukt für den Phänotyp in Eukaryoten verantwortlich ist und dass das Kis-Genprodukt für seine Neutralisation verantwortlich ist und keine Nebenwirkungen per se aufweist, wenn es alleine verwendet wird.
BEISPIEL 3
Wirkung des parD-Systems in menschlichen Zellen
Die obigen Ergebnisse aus Hefe und Amphibien zeigen, dass Kid in der Lage ist, Zellzyklusprogression durch den Zellzyklus in Eukaroyten in einer kontrollierten Art zu verhindern, und dass es möglich ist, in diesen Organismen die prokaryotischen regulierenden Kreisläufe zu substituieren, die das parD-System in einem stillen Zustand unter gewünschten Bedingungen aufrechterhalten, indem Transkription sowohl des Antidots als auch des Toxins mit verschiedenen Promotoren moduliert wird.
Für Versuche in menschlichen Zellen wurde eine Reihe von Plasmiden hergestellt, die pNATHA genannt werden (für „plasmids with Neutralisable Activity that Triggers HeLa Apoptosis"; Plasmide mit neutralisierbarer Aktivität, die HeLa-Apoptose auslöst). Ihr Wirkmechanismus basiert auf der Beobachtung, dass in HeLa-Tet-Off-Zellen ein früher Cytomegalieviruspromotor (CMV Pr) ein konstantes Ausmaß an Transkription eines Reportergens unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit von Tetracyclin (oder Doxycyclin) im Kulturmedium aufrechterhält. Andererseits kann ein Tetracyclin-regulierbarer Promotor (Tet Pr) unter Verwendung derselben Zelllinie das Ausmaß an Transkription des Reportergens um mehr als drei Größenordnungen bei Hinzufügung des Transkriptionsregulators verringern. Im induzierten Zustand (d. h. in Abwesenheit von Dox) ist Tet-Pr-gerichtete Transkription des Reportergens fast zwei Größenordnungen höher als jene desselben Reportergens unter Kontrolle des CMV Pr. Im nicht-induzierten Zustand (d. h. in Gegenwart von Dox) transkribiert Letzterer fast zwei Größenordnungen effizienter als Ersterer (2).
Dieses Transkriptionsverhalten bietet ein Fenster, das verwendet werden kann, um die pNATHA-Plasmide herzustellen, in welchen sowohl kis- als auch kid-Gene im selben DNA-Molekül enthalten sind, die Antidot-mRNA-Synthese durch reprimierbaren Tet-Promotor kontrolliert wird und die Toxin-Messengerausmaße durch den konstitutiven CMV-Promotor kontrolliert werden. Beide Kassetten, die Kis und Kid enthielten, wurden entweder in direkter oder umgekehrter Ausrichtung kloniert (5). Toxin und Antidot kann unter geeigneter Kontrolle in einer Ende-zu-Ende- oder En de-zu-Anfang-Ausrichtung wie üblich und um Nutzen aus Transkriptionsinterferenz zu ziehen kloniert werden. Beide können Teil derselben Transkriptionseinheit sein, wenn eine IRES zwischen die kodierenden Sequenzen platziert wird.
Zusätzliche Varianten sowohl des Antidots als auch des Toxins wurden in HeLa-Zellen getestet, nachdem ihre wildtypähnliche Aktivität in E. coli in vivo getestet wurde. Ein Kernlokalisationssignal (NLS) wurde an Kid und Kis fusioniert, um zu testen, ob es eine effizientere Wirkung zeigt (wenn überhaupt in menschlichen Zellen), die Zellzyklusprogression verhindern bzw. diese Impedanz neutralisieren.
Alle pNATHA wurden stabil in eine HeLa-Tet-Off-Zelllinie transfiziert. Die In-vivo-Wirkung von beiden Komponenten des parD-Systems auf diese Stellen wurde vor und nach Hinzufügung von Doxycyclin zu den verschiedenen Kulturen analysiert. Die erste Beobachtung dieser Reihe von Versuchen ist, dass nach Induktion des Systems die Zellwachstumsrate wieder schwer in HeLa-kis+/kid+- und -nlskis+/kidnls+-Zellen gehemmt ist. Dies lässt zwei verschiedene Dinge vermuten: erstens, dass unmittelbarer Transport des Toxins in den Kern (verifiziert durch konfokale Mikroskopie von immungefärbten Kid-Proben) seine toxische Wirkung nicht verhindert, was die mögliche Kernlokalisation seines/r zellulären Target(s) zeigt, und zweitens, dass die Wildtypkomponenten des parD-Systems so aktiv sind wie NLS-fusionierte in HeLa-Zellen, das entweder anzeigt, dass Eintritt in den Kern für die Wildtypproteine nicht verhindert wird und/oder dass Inaktivierung des/r zellulären Target(s) durch Kid im Cytosol auftreten kann. Nach ein oder zwei Tagen Wachstum in Gegenwart von Doxycyclin und bis zu zehn Tagen Behandlung ist ein induzierbarer Zustand von parD detektierbar, da kis+/kid+-Zellen die Verdopplungszeit erhöht haben, verglichen mit (kis+/kid–)-Transfektanten oder kis+/kid+-Zellen, die in Abwesenheit von Doxycyclin gezüchtet werden (4). Es sollte festgestellt werden, dass, da nur kis-Transkription direkt moduliert wird, während konstantes Ausmaß an kid beibehalten wird, die Wachstumrate für jene stabilisierten kid+/kid+-Transfektanten geringer ist als jene ihrer (kis+/kid–)-Gegenstücke unter denselben Bedingungen. Dies kann auf ein leichtes Ausweichen des Systems im Ausmaß ihrer Neutralisationsfähigkeit zu rückzuführen sein, wenn kid-Transkription zur selben Zeit nicht selektiv reduziert wird.
Die Ergebnisse zeigten progressive Reduktion der Zelleverdopplungen von stabilen kis+/kid+-Transfektanten nach kontinuierlicher Exposition gegenüber Doxycyclin (d. h. gegenüber nicht-neutralisiertem Toxin). Die Erfinder waren daran interessiert, ob es möglich wäre, eine zytostatische und/oder zytotoxische Wirkung bereitzustellen.
Prozentsatz von toten Zellen wurde nach Behandlung mit subletalen Dosen von Doxycyclin der verschiedenen stabilen Transfektanten bestimmt, die zuvor analysiert wurden. Wie zuvor angegeben zeigten (kis+/kid–)-HeLa-Zellen eine exponentielle Wachstumsrate im Zeitverlauf sowohl in Gegenwart als auch Abwesenheit von Doxycyclin. Andererseits zeigten kis+/kid+-HeLa-Zellen eine exponentielle Zellwachstumsrate nur, wenn Antidottranskription aufrechterhalten wurde (d. h. in Abwesenheit von Doxycyclin), aber nicht im gegenteiligen Fall, in welchem sie ihre Anzahl von Verdoppelungen kontinuierlich reduzierten (5). Es sollte jedoch festgestellt werden, dass die Wachstumrate für (kis+/kid–)-HeLa-Zellen, die in Gegenwart von Doxycyclin wuchsen, verglichen mit jenem derselben stabilisierten Zelllinie, die in ihrer Abwesenheit wuchsen, reduziert wurde. Diese Wirkung kann auf die lange Exposition gegenüber Doxycyclin sogar in subletalen Dosen zurückzuführen sein, und in keinem Fall führt es zu Zelltod. Wenn tote Zellen für alle Proben gezählt wurden, zeigten kis+/kid+-HeLa-Zellen, die in Gegenwart von Doxycyclin wuchsen (d. h. in Gegenwart von nicht-neutralisiertem Toxin), einen Prozentsatz von 32% bzw. 65% von toten Zellen an Tagen fünf und zehn der Behandlung, während alle anderen Proben nicht mehr als 9% sogar nach zehn Tagen Behandlung zeigten (5). Annexin-V-Färbung (d. h. ein früher apoptotischer Marker) der verschiedenen analysierten Proben zeigte, dass der beobachtete Zelltod in nicht-neutralisierten kis+/kid+-HeLa-Zelllinien auf Aktivierung von Apoptose zurückzuführen ist (6).
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Saccharomyces cerevisiae
Plasmide
Oligonucleotide Xho1Kis (5' CCGCTCGAGATGCATACCACCCGACTG 3' – Seq.-ID Nr. 2) und KisNco1 (5' CATGCCATGGTCAGATTTCCTCCTGACCAG 3' – Seq.-ID Nr. 3) wurden verwendet, um die für kis kodierende Region durch PCR aus einem Mini-R1-Derivat zu amplifizieren. Das amplifizierte Produkt wurde mit Xho1 und Nco1 verdaut und in das Plasmid pSAL1 kloniert, um pSAL1Kis herzustellen [Mascorro-Gallardo et al., Gene 172 (1), 169-70 (1996)]. Auf ähnliche Weise wurden Oligonucleotide ATGKid (5' ATGGAAAGAGGGGAAATCTG 3' – Seq.-ID Nr. 4) und KidEcoRI (5' CGGAATTCCCCATGTTCAAGTC 3' – Seq.-ID Nr. 5) dazu verwendet, die für kid kodierende Region unter Verwendung derselben Matrize zu amplifizieren, und das erhaltene Produkt wurde mit EcoRI verdaut und in das Plasmid p424Met25 kloniert [Mumberg et al., Nucleic Acids Res. 25, 22 (25), 5767-8 (1994)], mit SmaI und EcoRI verdaut, um das Plasmid p424Met25Kid herzustellen. Dieses Plasmid wurde in einem bakteriellen Stamm amplifiziert, der Kis zur selben Zeit überproduziert, um Selektion von inaktivierten Mutanten während des Klonierungsprozesses zu beseitigen.
In-vivo-Test
Saccharomyces-cervisiae-Stamm W303α [MAT α, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3, 112, his3-11, ura3, psi+) wurde mit Plasmiden pSAL1 und p424Met25 (null), pSAL1Kis und p424Met25 (kis+/kid–) und pSAL1Kis und p424Met25kid (kis+/kid+) transformiert. Diese Zellen wurden in selektivem Medium wachsen gelassen, das mit 500 μM Methionin und 200 μM CuSO₄ ergänzt war, um kis- und kid-Promotoren in einem aktivierten bzw. reprimierten Zustand beizubehalten. Die Kulturen wurden bis zur mid-log-Phase wachsen gelassen, und dann wurde ein 3-μl-Tropfen von Verdünnungen jeder Kultur, der 15000, 1500 oder 150 Zellen enthielt, in Agarplatten positioniert, die aus selektivem Medium bestanden, das mit 200 μm Methionin ergänzt war, um ein konstantes Expressionsausmaß des kid-Gens beizubehalten, und 0, 1, 5, 10, 20, 40, 80, 100 und 200 μM von CuSO₄, um das Expressionsausmaß des kis-Gens zu steigern. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 30°C inkubiert, und die Wachstumsrate jeder Kultur wurde danach auf jeder Platte analysiert.
Xenopus laevis
Kis- und Kid-Überproduzenten
MBPKis-Überproduzent
Oligonucleotide ATGKis (5' ATGCATACCACCCGACTG 3' – Seq.-ID Nr. 6) und KisEcoRI (5' TCGGAATTCAGATTTCCTCCTG 3' – Seq.-ID Nr. 7) wurden dazu verwendet, kis durch PCR unter Verwendung eines Mini-R1-Plasmids als Matrize zu amplifizieren. Das amplifizierte Produkt wurde mit EcoRI verdaut und in pMAL-c2-Plasmid [Mumberg et al., Nucleic Acids Res. 25, 22 (25), 5767-8 (1994)] zwischen den Xmn1- und EcoRI-Stellen kloniert, um MBP-(Maltosebindungsprotein)Kis-Überproduzent zu erhalten.
HisKisKid-Überproduzent
Oligonucleotide Nde1kid (5' GGAATTCCATATGCATACCACCCGACT 3' – Seq.-ID Nr. 8) und kisBamHI (5' CGGGATCCTCAAGTCAGAATAGT 3' – Seq.-ID Nr. 9) wurden dazu verwendet, die kodierenden Regionen von kis und kid in Tandem aus einem Mini-R1-Derivat zu amplifizieren. Das Produkt von PCR wurde mit Nde1 und BamHI verdaut und in pET15b (Invitrogen) zwischen diese Stellen kloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit Nco1 und BamHI verdaut, und das DNA-Fragment, das für Hiskiskid kodierte, wurde gereinigt und zwischen denselben Stellen in pRGrecA-NHis subkloniert [Giraldo et al., EMBO J. 3, 17 (15), 4511-26 (1998)].
Proteinreinigung
MBPKis-Reinigung
Kis-Protein wurde als Fusion mit dem Maltosebindungsprotein (MBP) gereinigt. Escherichia-coli-Stamm DH5α, der mit dem Plasmid pMBPKis transformiert war, wurde in 2 l von LB-Medium plus Ampicillin (100 μg/ml) inokuliert bei 0,04 Einheiten Abs_600nm inokuliert und unter Schütteln bei 37°C gezüchtet, bis 0,4 Einheiten Abs_600nm erreicht wurden. MBKis-Expression wurde dann durch Hinzufügung von 100 μM IPTG zum Kulturmedium induziert. Zellen wurden 4 Stunden lang bei 37°C wachsen gelassen und dann in einem GS3-Rotor pelletiert und in 10 ml Lyse-Puffer resuspendiert (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl) und in flüssigem Stickstoffgefroren. Nach dem Tauen von Zellen wurden 2 mg Lysozym zur Suspension von Zellen hinzugegeben und Lyse durch etwa 10-minütige Inkubation bei 37°C unter Kühlen auf Eis alle 3 Minuten beendet. Ein löslicher Anteil wurde durch Hinzufügung von 40 ml Puffer, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 600 mM NaCl und Zentrifugation bei 30.000 U/min bei 4°C während 45 min in einem 65-Ti-Rotor erhalten. MBPKis-Protein wurde durch Affinitätschromatographie durch ein Amyloseharz (BioLabs) nach den Anweisungen des Herstellers in Puffer, 20 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM DTT und 10% Ethylenglykol gereinigt. MBKis-Anteile wurden gepoolt, und Reinheit und Konzentration des Proteins wurden durch Coomassie-Färbung auf einem SDS-PAGE-Gel bzw. durch spektrophotometrische Analyse bestimmt. Anteile wurden bei –80°C aufbewahrt.
Kid-Reinigung
Escherichia-coli-Stämme C600 und TG1, die mit dem Überproduzenten pRGΔHisKisKid transformiert waren, wurden in 2 l von LB-Medium plus Ampicillin (100 μg/ml) bei 0,04 Einheiten Abs_600nm gezüchtet und unter Schütteln bei 37°C gezüchtet, bis 0,4 Einheiten Abs_600nm erreicht wurden. HisKis- und Kid-Expression wurde dann durch Hinzufügung von 25 μg/ml von Nalidixnsäure zum Kulturmedium induziert. Zellen wurden 4 Stunden lang bei 37°C wachsen gelassen und dann in einem GS3-Rotor pelletiert und in 10 ml Lyse-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl) resuspendiert und in flüssigem Stickstoff gefroren. Nach dem Tauen wurden 2 mg Lysozym zur Suspension von Zellen hinzugegeben und Lyse durch Inkubation bei 37°C beendet. Ein löslicher Anteil wurde durch Hinzufügung von 40 ml Puffer, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 600 mM NaCl und Zentrifugation bei 30.000 U/min bei 4°C während 45 min in einem 65-Ty-Rotor erhalten. Dieser lösliche Anteil wurde durch Hinzufügung von 60% Ammoniumsulfat und 60-minütige Zentrifugation bei 40.000 U/min bei 4°C präzipitiert. Der präzipitierte Anteil wurde dann in 1 ml von 20 mm Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM KCl resuspendiert und dann gegen denselben Puffer dialy siert, um das Ammoniumsulfat zu eliminieren. Der dialysierte Anteil wurde auf eine chelatisierende 5-ml-Fast-Flow-Sepharose (Pharmacia) geladen, die mit Ni²⁺ aktiviert und mit dem Dialysepuffer äquilibriert worden war, in welchem der HisKisKid-Komplex beibehalten wurde. Ein Gradient von 0 bis 6 M von Guanidiniumchlorid (GnCl) in 20 mM Tris-HCl pH 7,5 wurde auf die Säule aufgetragen, und Denaturierung des HisKis-Kid-Komplexes, der an die Säule gebunden war, führte zur Retention von HisKid und Elution von Kid bei 5,5 M des chaotropen Mittels. Denaturiertes Kid kann bei –80°C so lang wie notwendig aufbewahrt werden. Für Renaturierung wurde Kid auf 5 pmol/μl in 6 M GnCl, 150 mM CIK, 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,5, 20 mM μ-Mercaptoethanol, 0,2 mM EDTA und 1,2% CHAPS verdünnt und 5-mal während 6 Stunden bei 4°C gegen 200 ml (pro 6 ml Protein) von 100 mM Phosphatpuffer pH 6,5, 150 mM KCl, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM DTT und 10% Ethylenglykol dialysiert. Das lösliche und umgefaltete Protein wurde von dem unlöslichen (denaturierten) durch 60-minütige Zentrifugation des Gemisches bei 40.000 U/min bei 4°C in einem 65-Ty-Rotor getrennt. Der Überstand wurde in Centricon-Röhrchen (Cutoff 3 K) konzentriert und nach Bestimmung der Einheit und Konzentration des Proteins durch Coomassie-Färbung bzw. spektrophotometrische Analyse auf einem SDS-PAGE-Gel aliquotiert und bei –80°C aufbewahrt.
Embryo-Mikroinjektionen
MBPKis- und Kid-Proteine wurden gegen Puffer 20 mM Tri-HCl pH 8,0, 50 mm KCl dialysiert, und 2 μl MBPKid (160 ng/μl) und 2 μl MBPKis (720 ng/μl) wurden miteinander oder oder mit 2 μl Dialysepuffer gemischt und auf Eis 10 min lang inkubiert. 50 nl jedes Gemisches (Puffer, Kis, Kid und Kis/Kid) wurden in zwei Zellembryos von Xenopus laevis ohne Gallerte am animalen Pol einer ihrer Zellen mikroinjiziert. Mikroinjizierte und nicht-injizierte Embryos wurden dann in 4% von Ficoll-400 in MBS-Puffer bei 18°C inkubiert und dann durch embryonale Entwicklung fortschreiten gelassen, bis Stadium 8-9 (Blastula) im Fall der nicht-injizierten Kontrolle erreicht wurde (7-8 Stunden). Embryos wurden dann fotografiert und die Wirkung von Mikroinjektionen danach analysiert.
HeLa-Zellen
Plasmide (pNATHAs)
Oligonucleotide EcoRIKis (5' CGGAATTCATGCATACTACCACCCGACTG 3' – Seq.-ID Nr. 10) oder EcoRINLSKis (5' CGGAATTCATGGACAAGGTTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTAGCAGCATGCATACCACCCGACTGAAG 3' – Seq.-ID Nr. 11) und KisXba1 (5' CTCTAGATCAGATTTCCTCCTGACC 3' – Seq.-ID Nr. 12) wurden verwendet, um kis durch PCR unter Verwendung eines Mini-R1-Plasmids als Matrize zu amplifizieren. Das amplifizierte Produkt wurde mit EcoRI und XbaI verdaut und in pTRE-Plasmid (Clontech) zwischen EcoRI- und Xba1-Stellen kloniert, um die pTREKis- bzw. pTRENLSKis-Plasmide zu erhalten. Andererseits wurden die Oligonucleotide Xho1Kid (5' CCGCTCGAGATGGAAAGAGGGGAAATCT 3' – Seq.-ID Nr. 13) und KidEcoRI (Seq.-ID Nr. 5) verwendet, um Kid durch PCR unter Verwendung eines Mini-R1-Plasmids als Matrize zu amplifizieren, und EcoRIKid (5' CGGAATTCATGGAAAGAGGGGAAATCT 3' – Seq.-ID Nr. 14) und KidNLSXba1 (5' GCTCTAGATCAAACCTTCCTCTTCTTCTTAGGAGGCCTGCTGCTAGTCAGAATAGTGGACAGGCG 3' – Seq.-ID Nr. 15) wurden mit demselben Zweck verwendet, um ein NLSKid-Gen durch PCR unter Verwendung eines Mini-R1-Plasmids als Matrize zu erhalten. Diese beiden PCR-Produkte wurden mit Xho1 und EcoRI bzw. EcoRI und Xba1 verdaut und zwischen diesen Stellen in das Plasmid pClneo (Promega) kloniert, um die Plasmide pClneoKid und pClneoKidNLS zu erhalten. Diese kid+-Plasmide wurden in einem bakteriellen Stamm amplifiziert, der Kis gleichzeitig überproduziert, um Selektion von inaktivierenden Mutanten während des Klonierungsverfahrens zu beseitigen. Fragment BsTX1-Sma1 wurde aus pClneoKid und pClneo-KidNLS deletiert, um das Neomycin-Resistenzgen zu eliminieren. Die resultierenden Plasmide (pClKid und pClKidNLS) wurden mit BglII und BamHI verdaut und mit Klenow behandelt, und das Fragment, welches kid- oder kidNLS-Gene enthielt, wurde gereinigt und in die pTRE- und pTREKis-Vektoren kloniert, die mit HindlII verdaut und mit Klenow behandelt worden waren. Für jedes dieser Konstrukte wurden beide Ausrichtungen ausgewählt, und Plasmide pNATHA1 (kis+), pNATHA2 (kis+/kid+), pNATHA4 (NLSkis+) und pNATHA8 (NLSkis+/kidNLS+) wurden sowohl in kis-kid- Ende-zu-Ende-(pNATHAi) und -Ende-zu-Anfang-(pNATHAd)Ausrichtungen erhalten.
Selektion stabiler Transfektanten
5 μg jedes pNATHA wurde mit 0,5 g pTKHyg-Plasmid gemischt, und HeLa-Tet-Off-Zelllinie (Clontech) wurde mit diesen Gemischen durch das Lipofectaminverfahren (Gibco) transfiziert. Stabile Transfektanten wurden in DMEM-Medium, das mit Glutamax und 10% von Tetracyclin-genehmigtem fötalem Rinderserum (Clontech) ergänzt war, und in Gegenwart von 200 μg/ml Neomycin (Sigma) und 200 μg/ml Hygromycin (Clontech) (nicht-toxisches Medium, NTM) ausgewählt.
In-vivo-Tests
Zellwachstum und Todesratenbestimmung
HeLa-Tet-Off-Zellen, die stabil mit pNATHA1i+ und pNATHA2i+ transfiziert waren, wurden in NTM gezüchtet, bis sie etwa 80% Konfluenz erreichten. Sie wurden trypsinisiert, und 5 × 10⁴ stabil transfizierte pNATHAi1+- und 2 × 10⁴ stabil transfizierte pNATHAi2+-Zellen wurden auf 4 Wells einer 6-Multiwellplatte transferiert und 24 Stunden lang in NTM gezüchtet. Danach wurde eines der Wells pro Probe trypsinisiert und diese Zellen pelletiert und mit Trypanblau gefärbt. Alle und trypanblaugefärbte (tote) Zellen pro Well wurden mit einem Zytometer gezählt. Dann wurden 0,1 μg/ml Doxycyclin (Sigma) zum Rest der Wells hinzugegeben, und Zellen wurden in diesem toxischen Medium (TM) 2, 5, und 10 Tage lang wachsen gelassen, wobei es wenn nötig alle 4 Tage geändert wurde, aber die schwimmenden (toten und mitotischen) Zellen jedes Mal, wenn frisches TM hinzugegeben wurde, zurückgehalten wurden. Trypsinisierung, Trypanblaufärbung und Zählung von Zellen wurde für jede Probe wiederholt, um die Gesamtzahl und Anzahl toter Zellen pro Probe zu bestimmen.
Annexin-V-Färbung
HeLa-Tet-Off-Zellen, die stabil mit pNATHA1+ und pNATHA2+ transfiziert wurden, wurden in NTM gezüchtet, bis sie etwa 80% Konfluenz erreichten. Sie wurden trypsinisiert, und 10⁴ stabil transfizierte pNATHAi1+- und 5 × 10⁴ stabil transfizierte pNATHAi2+-Zellen wurden auf vier Schalen (zwei pro Probe) von 5 cm Durchmesser transferiert, in welche vier polylysinbeschichtete Deckgläser platziert wurden. Zellen wurden 24 Stunden absetzen gelassen, und dann wurde 0,1 μg/ml Doxycyclin pro Probe zu den Schalen hinzugegeben. Deckgläser wurden aus den Schalen vor (Tag 0) und 2, 5, und 10 Tage nach Hinzufügung von Doxycyclin zu einem davon herausgenommen. Frisches Medium wurde wenn notwendig alle 4 Tage hinzugegeben. Proben, die auf diesen Deckgläsern wuchsen, wurden mit FITC-Annexin-V (Clontech) wie vom Hersteller vorgeschlagen gefärbt, bevor sie fixiert wurden, und DNA wurde mit Propidiumiod und Hoeschts 33258 gefärbt. Analyse und Zählung von Annexin-V-positiven Zellen wurde durch konfokale Mikroskopie durchgeführt, und die Gesamt- und apoptotische Zahl an Zellen wurde bestimmt.

Claims

Zusammensetzung, umfassend (i) ParD-kid-Toxin und ParD-kis-Antitoxin oder (ii) für das ParD-kid-Toxin und parD-kis-Antitoxin kodierende Nucleinsäure zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren zur Hemmung der Zellproliferation und/oder Zellzyklusprogression, das auf einem menschlichen oder tierischen Körper durchgeführt wird, wobei das Verfahren die Bereitstellung des Toxins und Antitoxins in eukaryotischen Zellen im menschlichen oder tierischen Körper unter geeigneter Kontrolle zur selektiven Zellzyklusinhibition und/oder Tötung der Targetzellen umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Toxin in den Zellen durch Nucleinsäure, die für das Toxin kodiert, unter der Kontrolle geeigneter Expressionskontrollelemente bereitgestellt werden soll.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche zur Verwendung im Verfahren, das die Bereitstellung des Toxins und des Antitoxins für diese Zellen sowie die Kontrolle der Aktivität des Antitoxins auf dem Toxin umfasst, um die Aktivität des Toxins auf diesen Zellen zu kontrollieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin das Antitoxin in diesen Zellen durch Nucleinsäure, die für das Antitoxin kodiert, unter der Kontrolle geeigneter Expressionskontrollelemente bereitgestellt werden soll.
Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder 4, worin die selektive Zellzyklusinhibition und/oder Tötung durch eine Kombination von (i) Hinaufregulierung von Toxinproduktion in Targetzellen und (ii) Herabregulierung von Toxinproduktion in Nicht-Targetzellen und/oder Neutralisierung von Toxinaktivität in Nicht-Targetzellen ausgeführt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin die Neutralisierung von Toxinaktivität in Nicht-Targetzellen durch Hinaufregulierung von Antitoxinproduktion in Nicht-Targetzellen ausgeführt wird.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, worin die Targetzellen Tumorzellen sind.
Verwendung einer Zusammensetzung, die Folgendes umfasst: (i) das ParD-kid-Toxin und ParD-kis-Antitoxin oder (ii) Nucleinsäure, die für das ParD-kid-Toxin und ParD-kis-Antitoxin kodiert, zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung gemäß der Zusammensetzung aus einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Behandlung von Tumoren, Krebs, Psoriasis, Arteriosklerose oder anderen hyperproliferativen Erkrankungen.
Verfahren zur Hemmung der Zellproliferation und/oder Zellzyklusprogression, wobei das Verfahren die Bereitstellung des ParD-kid-Toxins und ParD-kis-Antitoxins in eukaryotischen Zellen unter einer geeigneten Kontrolle zur selektiven Zellzyklusinhibition und/oder Tötung von Targetzellen umfasst, worin die Zellen in vitro sind und/oder Pflanzenzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das Toxin in diesen Zellen durch Nucleinsäure, die für das Toxin kodiert, unter der Kontrolle von geeigneten Expressionskontrollelementen bereitgestellt wird.
Verfahren zur Hemmung von Zellproliferation und/oder Zellzyklusprogression, wobei das Verfahren die Bereitstellung des ParD-kid-Toxins und ParD-kis-Antitoxins in eukaryotischen Zellen umfasst, worin die Zellen in vitro sind und/oder Pflanzenzellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, das die Bereitstellung des ParD-kid-Toxins und ParD-kis-Antitoxins für die Zellen und die Kontrolle der Aktivität des Antitoxins auf dem Toxin zur Kontrolle der Aktivität des Toxins auf den Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, worin das Antitoxin in den Zellen durch Nucleinsäure, die für das Antitoxin kodiert, unter der Kontrolle geeigneter Expressionskontrollelemente bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin die Selektivität für die Expression des Toxins in Targetzellen durch eine Kombination von (i) Hinaufregulierung von Toxinproduktion in Targetzellen und (ii) Herabregulierung von Toxinproduktion in Nicht-Targetzellen und/oder Neutralisierung von Toxinaktivität in Nicht-Targetzellen erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Neutralisierung von Toxinaktivität in Nicht-Targetzellen durch eine Hinaufregulierung von Antitoxinproduktion in Nicht-Targetzellen erreicht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, worin die Targetzellen Tumorzellen sind.