JP4484941B2

JP4484941B2 - 生物活性を有する短ペプチド及び該ペプチドの使用方法

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Publication number: JP4484941B2
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Inventors: アール．オーウェン，ドナルド
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Description

本願は、２００１年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／２７９,５０５号、及び２００１年３月２８日に出願された米国特許出願第０９／８２０,０５３号の優先権を主張する。

本発明は、フェニルアラニン、ロイシン、アラニン及びリジンアミノ酸残基(Ｆ、Ｌ、Ａ及びＫ；「ＦＬＡＫペプチド」)をその一次配列の中に含有する短いペプチドに関する。特に、好ましい抗菌作用(antimicrobial)、抗真菌作用(antifungal)、抗癌作用及び他の生物学的活性を有するＦＬＡＫペプチドを開示する。

様々な生物活性ペプチドについては、科学文献及び発行済み特許の中で報告されている。ペプチドは、歴史的にも、天然のものを単離して得られ、近年では構造−機能の関係が研究対象となっている。さらに、天然ペプチドは、合成ペプチドアナログの設計の出発点としての役割を有している。
１９９７年、R.E.W.Hancockによって、ペプチド抗生物質に関するレビューが出版された［Lancet 349: 418-422］。種々な種類のペプチドについて、構造、機能及び臨床的応用が記載されている。１９９８年には、陽性(cationic)ペプチド抗生物質に関してさらなるレビューが出版された［(Hancock, R.E W. and Lehrer, R.Trends Biotechnol. 16: 82-88］。ペプチドは、典型的には、長さ１２〜４５のアミノ酸の陽性両親媒性分子である。ペプチドは細胞膜を透過し、微生物の作用物質を制御する。生体防御を行なう陽性ペプチドの臨床的使用可能性については、１９９９年、R.E.W.Hancockが記載している［Drugs 57 (4): 469-473; Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43 (6): 1317-1323］。その種ペプチドの抗菌性、抗真菌性、抗ウイルス性、抗癌性及び創傷治癒(wound healing)の特性について記載されている。

螺旋状の抗菌ペプチドの構造的特徴及びそれらペプチドの作用推定機構に関するレビューが出版されている［例えば、Dathe, M. and Wieprecht, T. Biochimica et Biophysica Acta 1462: 71-87 (1999); Epand, R. M. and Vogel H. J. Biochimica et Biophysica Acta 1462: 11-28 (1999)を参照］。活性と選択性を調節できると考えられている構造パラメータとして、螺旋構造、疎水モーメント、疎水性、親水性／疎水性の螺旋表面によって定められる角度及び電荷(charge)が挙げられる。

幅広い配列の自然発生アルファヘリカルペプチドについて報告されている。当該分野の数多くの参考文献の代表例を下記に示す。
セクロピン(Cecropin)は、昆虫から単離したα-ヘリカルペプチドである。セクロピンは、米国特許第４,３５５,１０４号及び第４,５２０,０１６号に記載されているように、抗菌特性を有することが知られている。セクロピンは抗グラム陰性細菌活性であるが、全てのグラム陰性細菌に対するものではないことは知られている。セクロピンは、抗真核細胞活性ではないと考えられている［Andreu, et al., Biochemistry 24: 163-188 (1985); Boman, et al., Developmental and Comparative Immunol. 9: 551-558 (1985); Steiner et al., Nature 292: 246-248 (1981)］。ショウジョウバエ(Drosophila)及びセクロピアサン(Hyalphora)から得たセクロピンは、様々な菌株(strains)について、抗菌活性を有することが示されている［Ekengren, S. and Hultmark, D., Insect Biochem. and Molec. Biol. 29: 965-972 (1999)］。ネッタイシマカ(Aedes aegypti)から得たセクロピンＡは、トリプトファン及びＣ末端アミド化物(C-terminal amidation)を含まない点で、大部分の昆虫セクロピンとは異なることが報告されている［Lowenberger, C. et al., J. Biol. Chem. 274 (29): 20092-20097 (1999)］。

Rana属のカエルは、幅広い配列の抗菌ペプチドを皮膚に生成する［Goraya,J. et al., Eur.J.Biochem. 267: 894-900 (2000)］。１３アミノ酸のような短いペプチドが構造ファミリーにグループ分けされることが報告されている。その配列は、マゲイニンペプチドやデルマ(derma)ペプチドのような他の属のカエルから単離されたペプチドとは、殆んど又は全く同一性を示さなかった。
米国特許第５,９６２,４１０号は、真核病原体の阻害と、セクロピンやサルコトキシン(sarcotoxins)のような溶菌性ペプチド(lytic peptides)によるリンパ球及び線維芽細胞の刺激を開示している。様々なペプチドとして、セクロピンＢ、セクロピンSB-37、セクロピンＡ、セクロピンＤ、Shiva-1、Lepidopteran(鱗翅目)、Sarcotoxin 1A、Sarcotoxin 1B及びSarcotoxin 1Cが示されている。

Shiva-1セクロピン類の溶菌性ペプチドを生成する遺伝子転換マウスについての報告がある［Reed, W.A.et al., Transgenic Res. 6: 337-347 (1997)］。遺伝子転換マウスにウシ流産菌(Brucella abortus)を感染させた結果では、遺伝子転換をしていないマウスの感染に比べて、細菌数が減少している。
マゲイニンは、アフリカ蛙Xenopus laevisの皮膚から単離して得られたαヘリカル２３アミノ酸ペプチドである［Zasloff, M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84: 5449-5453 (1987)］。
２３〜３８アミノ酸であるCathelin関連α-ヘリカルペプチドは、ヒツジ、ヒト、ウシ、ブタ、マウス及びラビットの血液細胞内で見出されている［Zanetti, M. et al., FEBS Lett. 374: 1-5 (1995)］。
buforin II、セクロピンＰ１、indolicidin、マゲイニンII、nisin及びranalexinの抗菌作用は、Giacomette,A.et al. によって報告されている［Peptides 20: 1265-1273 (1999)］。

様々な合成ペプチドが、インビトロとインビボの両方で調製され、評価されている。
米国特許第５,８６１,４７８号は、α-螺旋形態である２０〜４０アミノ酸の溶菌性合成ペプチドを開示している。このペプチドは、微生物感染、傷及び癌の治療に有効である。開示されたペプチドには、セクロピンＢ、SB-37*、LSB-37、SB-37、Shiva 1,10-12、β-フィブリン・シグナル・ペプチド、Manitou 1-2、Hecate 1-3、Anubis 1-5,8、及びVishnu 1-3,8がある。
Hecateは、メリチンの合成ペプチドアナログとして記載されている［Baghian,A.et al.Peptides 18 (2): 177-183 (1997)］。ペプチドは、電荷分布が異なるが、両親媒性アルファヘリカルの形態は同じである。Hecateは、細胞増殖及び蛋白質の合成に悪影響を与えることなく、単純ヘルペスウイルス(HSV-1)を阻害した。

合成ペプチドD2A21、D4E1、D2A22、DSC、D5C1、D4E、及びD4Bが記載されている［Schwab, U. et al., Antimicrob. Agents and Chemotherapy 43 (6): 1435-1440 (1999)］。様々な細菌の菌株について、抗菌活性が示されている。
セクロピンとメリチンペプチドから作られたハイブリッドペプチドの調製と評価が報告されている［Juvvadi,P. et al.(J. Peptide Res. 53: 244-251 (1999))］。ハイブリッドは、チャネル形成能力及び抗菌作用に対して、配列、アミド結合方向(ヘリックス双極子)、電荷、両親媒性及び疎水性の影響を調べるために合成されたものである。配列とアミド結合方向は、ハイブリッドの活性のための重要な構造的要件であると述べられている。

２６アミノ酸の昆虫セクロピン(ハチ・メリチンハイブリッド及びそれのアナログ)は、耐塩性(salt resistance)の研究の中で記載されている［Friedrich,C. et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43 (7): 1542-1548 (1999)］。活性については、第２位置のトリプトファン残基が重要であることが見出された。配列の中の適度の変化は、ペプチドの特性に実質的な変化をもたらすことが見出された。
プロリン残基のα螺旋ペプチドの抗菌特性に及ぼす影響に関する報告がある［Zhang,L. et al., Biochem. 38: 8102-8111 (1999)］。プロリンの添加により、膜挿入特性が変化することが報告されており、１個のプロリンを置換すると、抗菌性ペプチドが毒素に変わる可能性がある。

１８〜３０アミノ酸を有する一連のペプチドを調製し、配列の変化と電荷が抗菌特性に及ぼす影響を調べた報告がある［Scott,M.G., et al., Infect. Immun. 67 (4): 2005-2009 (1999)］。長さ、電荷又は疎水性と、ペプチドの抗菌作用との間に顕著な相関性は認められなかった。
合成ペプチドの一種である「Modellins」を調製し、配列と構造の関係を比較して評価した報告がある［Bessalle,R. et al. J. Med. Chem. 36: 1203-1209 (1993)］。対向する面が疎水性と親水性の１６アミノ酸と１７アミノ酸のペプチドは、溶血性及び抗菌性の高いことが報告されている。ペプチドは小さくなると、生物活性が低くなる傾向にある。

セクロピン−メリチンのハイブリッドペプチド及びアミド化されたカレイ(flounder)のペプチドは、サーモンを、インビボで魚病細菌Vibrio anguillarum感染から保護することが見出された［Jia,X. et al., Appl. Environ. Microbiol. 66 (5): 1928-1932 (2000)］。魚にどちらかのペプチドを連続投与するのに、浸透圧ポンプが用いられた。
両親媒性ペプチドは、創傷治癒能力を向上させ、インビボで線維芽細胞及びケラチノサイトの成長を刺激できると報告されている［米国特許第６,００１,８０５号及び第５,５６１,１０７号］。溶菌性ペプチドを、ユビキチンを有する融合蛋白質として発現する遺伝子転換植物について報告されている［米国特許第６,０８４,１５６号］。メチル化リジンが多く、蛋白質分解抵抗性の向上を示す溶菌ペプチドが報告されている［米国特許第５,７１７,０６４号］。
数多くの天然ペプチド及び合成ペプチドが存在しているが、生物活性ペプチド及び該ペプチドの使用方法に対する要請がある。

一次配列(primary sequence)にフェニルアラニン残基(residue)、ロイシン残基、アラニン残基及びリジンアミノ酸残基を含む短い(即ち、長さが２３アミノ酸以下)ペプチドを開示する。このペプチドは、抗細菌、抗真菌、抗癌という好ましい生物活性を有し、ヒトの線維芽細胞及びリンパ球の刺激(stimulation)と増殖(proliferation)をもたらすものである。

下記の配列表は、本願明細書の一部を構成し、本発明の幾つかの主題をさらに示すために含めるものとする。本発明は、具体的実施例の詳細な説明と共に、これら配列のうちの１又は２以上の配列を参照することにより、理解はより高められるであろう。

発明の詳細な説明
本発明は、一般的には、望ましい生物学的特性を有するペプチド及びその使用を対象としている。本発明のペプチドは、当該分野のこれまでの他のペプチドと比べて、長さが短いために有効性を有することは驚くべきことである。

［ペプチド］
本発明の一実施例として、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、アラニン残基及びリジン残基を含み、約５〜約２３アミノ酸の長さである単離されたペプチド(isolated peptide)を例示する。ペプチドは、最小長さが約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は約１８のアミノ酸である。ペプチドの最大長さは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１２、２２又は約２３のアミノ酸であってよい。ペプチドは、約５〜約２０アミノ酸の長さであってよい。該ペプチドは、本質的には、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、アラニン残基及びリジン残基から構成される。ペプチドに含まれるフェニルアラニン残基、ロイシン残基、アラニン残基及びリジン残基のアミノ酸組成物のパーセントは、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であってよい。ペプチドは、一般的には、様々なガイドラインにあるどの配列番号のものでもよいが、より望ましくは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、及びSEQ ID NO:165である。ペプチドは、hecate-1、anubis-1、anubis-2、anubis-5、anubis-8、vishnu-1、vishnu-2、vishnu-3、vishnu-8、又はshiva-10ではないことが望ましい。

ペプチドは、前記ペプチドのどれかと同様なものであってよく、望ましくは、SEQ ID NO:2(又はSEQ ID NO:16又はSEQ ID NO:126)、SEQ ID NO:4(又はSEQ ID NO:14又はSEQ ID NO:17)、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:126、又はSEQ ID NO:132と同様なものであり、パーセントアイデンティティ(percent identity)によって決められる。ペプチドどうしのパーセントの同一は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であることが望ましい。パーセントアイデンティティは、市販のCLUSTALWによる配列アライメントを用いて決定される。アミノ酸配列の数は、比較的短い長さのペプチドによって分割され、その結果に１００％を掛けて、パーセントアイデンティティが決定される。
ペプチドは、Ｄ-アミノ酸又はＬ-アミノ酸を含むことができる。ペプチドは、すべてのＤ-アミノ酸を含むことができる。ペプチドは、酸のＣ末端(-ＣＯ₂Ｈ)、又はアミドのＣ末端(-ＣＯＮＨ₂、-ＣＯＮＨＲ又は-ＣＯＮＲ₂)を有することができる。

［使用方法］
本発明のさらなる実施例として、上記記載のペプチドを使用する方法を例示する。使用方法は、非感染の正常な哺乳類細胞を損傷したり又は死に至らしめないことが望ましい。治療上の服用量で使用する場合、非感染又は非腫瘍性の正常な哺乳類細胞を損傷したり又は死に至らしめないことが望ましい。使用方法は、単一又は複数のペプチドを使用することができる。

本発明の実施例は、微生物細胞(微生物)を阻害する(inhibit)か又は死に至らしめるために、前述のペプチドを使用することである。微生物は、病原微生物に感染した細菌細胞、かび細胞、原虫、ウイルス又は真核細胞である。この方法は、一般的には、微生物をペプチドと接触させるものである。接触工程は、インビボ、インビトロ、局所投与、経口投与、経皮投与、全身投与の他、当該分野で知られた方法によって行なうことが望ましい。接触工程は、微生物を阻害又は死に至らしめるのに十分な濃度で行なうことが望ましい。ペプチドの濃度は、約０.１μＭ以上、約０.５μＭ以上、約１μＭ以上、約１０μＭ以上、約２０μＭ以上、約５０μＭ、又は約１００μＭ以上にすることができる。使用方法は、微生物細菌、例えばグラム陽性菌、グラム陰性菌、ミコバクテリア、イースト、かび類、藻、原生動物、ウイルス、及び細胞内生物などを抑制又は死に至らしめることを目的としている。具体例として、Staphylococcus(スタヒロコッカス属)、Staphylococcus aureus(黄色ブドウ球菌)、Pseudomonas(シュードモナス属)、Pseudomonas aeruginosa(緑膿菌)、Escherichia coli(大腸菌)、Chlamydia(クラミジア属)、Candida albicans(真菌)、Saccharomyces(ビール酵母)、Saccharomyces cerevisiae(出芽酵母)、Schizosaccharomyces pombe(分裂酵母)、Trypanosoma cruzi(クルーズトリパノソーマ)又はPlasmodium falciparum(熱帯熱マラリア原虫)を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。接触工程は、全身注射、経口投与、皮下投与、ＩＰ、ＩＭ、ＩＶ注射、又は局所投与によって行なうことが望ましい。注射の場合、１回の投与量は、約１ｍｇ/ｋｇ、約５ｍｇ/ｋｇ、約１０ｍｇ/ｋｇ、約２５ｍｇ/ｋｇ、約５０ｍｇ/ｋｇ、約７５ｍｇ/ｋｇ及び約１００ｍｇ/ｋｇの濃度の中で、どの濃度範囲にあってもよい。接触工程は、哺乳類、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、トリ、ニワトリ、植物、サカナ又はヒトに対して適用することができる。

抗細菌(antibacterial)用に望ましいペプチドとして、SEQ ID NO:1、SEQ ID、NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、及びSEQ ID NO:165がある。

抗真菌用に望ましいペプチドとして、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:163、及びSEQ ID NO:165がある。

本発明のさらなる実施例は、癌細胞を阻害又は死に至らしめるために、前記ペプチドのどれかを使用するものである。この方法は、一般的には、癌細胞をペプチドと接触させるものである。接触工程は、インビボ、インビトロ、局所投与、経口投与、経皮投与、全身投与の他、当該分野で知られた方法によって行なうことが望ましい。接触工程は、癌細胞を阻害又は死に至らしめるのに十分な濃度で行なうことが望ましい。ペプチドの濃度は、約０.１μＭ以上、約０.５μＭ以上、約１μＭ以上、約１０μＭ以上、約２０μＭ以上、約５０μＭ、又は約１００μＭ以上にすることができる。癌細胞は、一般的には、どんな種類の癌細胞でもよい。癌細胞は、肉腫、リンパ腫、悪性腫瘍、白血病、乳癌細胞、結腸癌細胞、皮膚癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、睾丸癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞及び皮膚癌細胞であってよい。接触工程は、皮下投与、ＩＰ注射、ＩＭ注射、ＩＶ注射、腫瘍への直接注射又は局所投与によって行なうことが望ましい。注射の場合、１回の投与量は、約１ｍｇ/ｋｇ、約５ｍｇ/ｋｇ、約１０ｍｇ/ｋｇ、約２５ｍｇ/ｋｇ、約５０ｍｇ/ｋｇ、約７５ｍｇ/ｋｇ及び約１００ｍｇ/ｋｇの濃度の中で、どの濃度範囲にあってもよい。接触工程は、哺乳類、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、トリ、ニワトリ、植物、サカナ、ヤギ、ヒツジ又はヒトに対して行なうことができる。癌細胞の阻害は、一般的には、ペプチド治療を行わない癌細胞と比較して、癌細胞の増殖がどのように阻害されるかによって示される。阻害は、増殖の約１０％、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上、理想的には１００％阻害することが望ましい。阻害は、癌細胞の溶解によって又は他の手段によって達成される。癌阻害ペプチドは、他の癌化学療法剤と共に使用することにより、相乗効果を有する。

抗癌用に望ましいペプチドとして、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:152及びSEQ ID NO:162がある。

本発明のさらなる実施例は、細胞の刺激及び／又は増殖を促進する方法に関するものである。この方法は、細胞と、ペプチドを含む組成物を接触させることを含んでいる。ペプチドは、前記ペプチドのどれでもよい。組成物中のペプチドの濃度は、約０.０１μＭ〜約５００μＭ、約０.１μＭ〜約１００μＭ、約１μＭ〜約５０μＭ又は約１μＭ〜約１０μＭであってよい。細胞は、一般的には、どんな種類の細胞でもよいが、哺乳類の細胞が望ましく、その例として、リンパ球細胞及び食細胞を含む線維芽細胞と白血球細胞とを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。細胞の代謝性刺激及び／又は増殖は、前記組成物と接触していない同種細胞と比して、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上、約１２５％以上、約１５０％以上、約１７５％以上又は約２００％以上向上することが望ましい。前記組成物は、増殖因子(growth factor)をさらに含んでいる。一部のＦＬＡＫペプチドの刺激及び増殖特性は、スキンケア、創傷治癒、及び哺乳類の免疫不全の免疫調整への適用が期待される。

刺激と増殖用に望ましいペプチドとして、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、及びSEQ ID NO:165がある。

本発明のさらなる実施例は、標準的な加齢、病気、外傷により、又は外科その他の医療処置によって損傷した皮膚又は眼及び体内組織の創傷治癒を促進する方法に関するものである。この方法は、動物の創傷部に、上記ペプチドのどれかを含む組成物を投与することを含んでいる。組成物中のペプチドの濃度は、約０.０１μＭ〜約５００μＭ、約０.１μＭ〜約１００μＭ、約１μＭ〜約５０μＭ、又は約１μＭ〜約１０μＭである。組成物の創傷部への投与は、局所的又は全身送達によって行なうことができる。動物は、一般的には、どんな種類の動物でもよいが、哺乳類が望ましく、その中でも、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジがより望ましい。創傷治癒の促進は、前記組成物との接触がない創傷部と比べて、約１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、１２５％以上、１５０％以上、１７５％以上、又は２００％以上が望ましい。

創傷治癒用に望ましいペプチドとして、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:162、及びSEQ ID NO:164がある。

本発明のさらなる実施例は、治療剤の活性を付加的又は相乗的に向上させる方法に関するものである。この方法は、ペプチドと治療剤を含む組成物を調製することを含んでいる。この方法は、１種又は複数種のペプチドを他のペプチドと共に使用する併用治療(co-therapy treatment)を含んでいる。ペプチドは、上記記載のどのペプチドでもよい。治療剤は、一般的には、どんな治療剤でもよいが、抗生剤(antibiotic)、抗菌剤、増殖因子、化学治療剤、抗菌剤、リゾチーム、キレート剤、又はＥＤＴＡであることが望ましい。この組成物の活性は、治療剤を含有するがペプチドを含まない同じ組成物の活性より高いことが望ましい。組成物つまり併用治療剤は、インビトロ、インビボ、局所投与、経口投与、ＩＶ、ＩＭ、ＩＰ、及び経皮投与にて用いられる。治療剤とペプチドを含有する組成物の活性は、治療剤単独の場合の活性と比べて、約１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、１２５％以上、１５０％以上、１７５％以上、又は２００％以上向上することが望ましい。
一般的に、ターゲットに対して単独で活性作用を有するペプチドが望ましく、前記ターゲットの別の治療剤の活性を付加的又は相乗的に向上させるのに当該ペプチドを使用することができる。所定の相乗効果を得るのに数種類のペプチドが候補として存在する場合、毒性の少ないペプチドがより好ましいと考えられる。

本発明のさらに他の実施例は、嚢胞性線維症(ＣＦ)と診断された患者の治療方法に関するものである。ＣＦがもたらす影響として、とりわけ、肺の炎症と感染がある。本発明の前記ペプチドは、P.aeruginosa(非発酵グラム陰性桿菌)によってしばしば引き起こされる肺感染症の治療に用いることができる。本発明のペプチドは、抗炎症特性を有しており、それゆえ、ＣＦ患者の肺感染症の治療にも有用である。ペプチドのＣＦ患者への投与は、吸入法又は全身送達法等の如く適当な方法によって行なうことができる。ペプチドの投与は、１回のみ、複数回、又は連続的送達のどれでも可能である。

本発明のさらなる実施例は、性感染症(Sexually transmitted disease; ＳＴＤｓ)を治療する方法に関するものである。ＳＴＤｓの原因である真菌種の多くは、本発明の前記ペプチドによって阻害又は致死させることができる。そのような真菌種の例として、C.Albicans、C.glabrata及びC.tropicalisがある。本発明のペプチドは、さらにまた、真菌種の他にも、ＳＴＤｓを引き起こすウイルスや細菌等に対しても使用することができる。ペプチドの患者へのＳＴＤ患者への投与は、例えば、局所投与、経口投与又は全身送達のように適当な方法で行なうことができる。ペプチドの投与は、１回のみ、複数回、又は連続的送達のどれでも可能である。ペプチドの投与は、クリーム、ゲル又は液体のように適当な形態で行なうことができる。

本発明のさらに別の実施例は、座瘡(にきび)を治療する方法に関するものである。本発明のペプチドは、座瘡の跡から単離して得た細菌、Propinibacterium acnes(プロピオン酸菌属アクネ)に対して抗細菌活性を有しており、また、さらなる抗炎症性を有している。ペプチドは、臨床治療用組成物又は化粧品用組成物の中に存在させることもできる。ペプチドの投与は、クリーム、ゲル又は液体のように適当な形態で行なうことができる。ペプチドの投与は、局所投与のような適当な方法で行なうことができる。ペプチドは、座瘡の治療の他、それを低減又はなくすための予防法としても使用することができる。

さらに別の実施例は、化粧品用組成物に関するものである。本発明のペプチドは、コラーゲン及び線維芽細胞を刺激し、創傷治癒を促進することがわかった。本発明のペプチドを含む化粧品は、老化防止及び若返りの市場に有用である。
本発明のさらなる実施例は、創傷治癒の促進にペプチドを使用するものである。本発明のペプチドは、外傷感染に関連する細菌、S.aureus(黄色ブドウ球菌)、S.pyogenes(Ａ群溶連菌)、P.aeruginosa(緑膿菌)に対して高い作用を有している。ペプチドはまた、創傷治癒を促進し、炎症を低減する。ペプチドの投与は、クリーム、ゲル又は液体のように適当な形態で行なうことができる。ペプチドの投与は、局所投与又は全身投与のような適当な方法にて行なうことができる。

以下の供試例は、本発明の望ましい実施例を例示するためのものである。当該分野の専門家であれば、以下の供試例で開示された技術は、発明を実施する際に発明者が発見した技術を示したものであり、それゆえ、実施のための好ましい形態を構成するものと考えるべきである。しかしながら、当該分野の専門家であれば、ここでの開示を考慮に入れて、開示された具体的実施例に多くの変更を加えることは可能であり、発明の精神及び範囲から逸脱することなく同じ様な結果を得ることができるであろうことは理解されべきである。

[供試例]
供試例１：菌株(Microbial strains)
以下の表は、供試例の中で用いた様々な微生物を掲げたものである。

供試例２：抗菌アッセイＩ
ペプチドの下記抗菌アッセイに対するデータは、インビトロの細胞培養実験において、ペプチドを添加したものと添加しないものについて、ＯＤ測定値を求めて得たものである。実施したプロトコルは次の通りである。
細胞株には、Staphylococcus aureus ATCC 3568又は25923、Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027又は27853が含められている。使用した培地(medium)は、Antibiotic Medium 3(Difco)、Antibiotic Medium 2(Difco)及び０.８５％生理食塩水であった。使用した対照(controls)は、生理食塩水と、５０ppm、２５ppm、１０ppm、５ppm、１ppm及び０.１ppmのゲンタマイシンであった。

培地、ストック溶液及び希釈の調製は全て、汚染防止のために層流フード(laminar flow hood)の中で行なった。細菌細胞は、抗生物質検定用培地２(antibiotic medium 2)の傾斜寒天の上で生育させた(ｐＨ７.０、２５℃)。細菌は、抗生物質検定用培地３の中で懸濁させ、１０⁴ｃｆｕ/ｍｌまで希釈して、接種材料として使用した。プレートレイアウトに基づいて、試料溶液(１００μｌ/ウェル)をプレートに加えた。接種材料(１００μｌ/ウェル)を添加し、最終濃度５×１０³ｃｆｕ/ｍｌを得た。１００μｌの生理食塩水及び１００μｌの増殖培地を陰性対照として用いた。また、１００μｌの生理食塩水及び１００μｌの接種材料を陽性対照として用いた。細菌を、プレート上で３７℃、２４時間培養した。
細胞をシェークして再懸濁した後、６２０ｎｍにおける吸光度(absorbance)を求めた。最小発育阻止濃度(ＭＩＣ)は、供試生物の発育を完全に阻止するペプチドの最低濃度として規定した。

酵母アッセイは、ＲＰＭＩ１６４０培地(２５℃、ｐＨ７.０)にて行なった。
表３のデータは、上記プロトコルにより得たものである。一方、表４のデータは、修正プロトコルを用いて得たもので、培地はトリプシンの大豆培養液、摂取材料の強度は１ｍｌにつき約１０⁴ＣＦＵであり、最小発育濃度は、細菌最小殺菌濃度(ＭＢＣ又はＭＦＣ)とした。
次の表３では、ペプチドの抗菌特性をＭＩＣ又はＭＦＣ値として測定し、μｇ/ｍＬで表している。Staph6538は、Staphylococcus aureusでATCC登録番号は6538、paerug9027は、Pseudomonas aeruginosaでATCC登録番号は9027、酵母はSaccharomyces(ビール酵母)である。

次の表４は、ペプチドの抗菌特性を、細菌の最小殺菌濃度又は菌類(Candida)の最小殺菌濃度として測定した。ＭＢＣ又はＭＦＣ値はμｇ/ｍＬで表している。E.Coloは、Escherichia coliでATCC登録番号は25922、P.aerugは、Pseudomonas aeruginosaでATCC登録番号は27853、S.aur.は、Staphylococcus aureusでATCC登録番号は25923、Candidaは、Candida albicansでATCC登録番号は10231である。

供試例３：抗菌アッセイII
供試例２の試験よりも広範囲の病原体(臨床分離株(clinical strains)を含む)について、抗菌作用を調べた。供試例２と供試例３では、アッセイに用いたプロトコルは幾分異なっていることは留意されるべきである。

この供試例では、前述(Steinberg et al., AAC 41: 1738, 1997)したＮＣＣＬＳ(National Committee for Clinical Laboratory Standards)の微量液体希釈法に若干の変更を加えた方法を用いて、ＭＩＣを測定した。簡単に説明すると、抗菌剤は、最も適当な溶剤の中で１０倍濃縮物として調製した。ペプチドについては、０.２％ウシ血清アルブミン含有の０.０１％酢酸を輸送蛋白質(carrier protein)として使用した。接種材料の調製は、培地中でＢＡＰからコロニーを再懸濁し、その懸濁液が０.５マクファーランド標準(McFarland standard)の濁度に一致するように調節することにより行なった。有機物に対してＮＣＣＬＳが推奨するように、懸濁液を新たな培地の中に希釈し、バクテリアについては２×１０⁵〜７×１０⁵ＣＦＵ/ｍｌ、Candidaについては２×１０³〜７×１０³ＣＦＵ/ｍｌを得た。細菌の入った懸濁液を１００μｌずつ、９６ウエルのポリプロピレン製マイクロタイタープレートの各ウェルの中に分配した後、供試物質１１μｌを添加した。３５℃にて、１６〜２０時間(細菌の場合)又は４６〜５０時間(Candidaの場合)経過後、肉眼で濁りが観察できなかった薬物の最低濃度を、ＭＩＣとして規定した。通性嫌気性菌の培養は、７％二酸化炭素中で行い、偏性嫌気性菌については、標準の嫌気ジャーを用いて無酸素環境中で培養した。ＭＩＣの測定は全て３回行い、平均値を求めた。

次の表は、ペプチドの代表的試料について、抗真菌(anti-fungal)特性と抗細菌(anti-bacterial)特性を比較している。

ここに示したＦＬＡＫペプチドの多くは、多様な微生物に対して抗微生物活性を有している。次の表は、ペプチドの代表的試料におけるこれら特性を示している。

ＦＬＡＫペプチドは、数多くの微生物のターゲットに対して一般的に抗微生物活性であるが、全てのペプチドが、全ての微生物に対して等しく有効であるというわけではない。次の表は、活性に乏しいことが観察されたペプチドと微生物の幾つかの組合せ例を示している。

供試例４：抗癌アッセイ
癌細胞アッセイでは、ＭＴＴ染色プロトコルを用いたこと以外は、前記抗菌アッセイと同じ要領にて行なった。細胞の生存性(viability)は、染色反応によって求めた。下記の手順では、１ウェルにつき約１.５×１０⁴個の細胞を加え、生存性は、半分コンフルエント状態の細胞により決定した。アッセイは、９６ウェルのマイクロタイタープレートの中で行なった。ペプチドの添加後、プレートを２４時間放置した。ＭＴＴ(フェノールレッド不含RPMI-1640の中に５ｍｇ/ｍｌ、２０μｌ)を、ペプチド処理をしていない陽性対照があるウェルを含む各ウェルに添加した。プレートは３７℃で４時間培養した。各ウェルの液体分を取り除き、イソプロパノールを０.１Ｍ HCｌ(１００μｌ)と共に各ウェルに加えた。プレートは、イソプロパノールの蒸発を防止するために、パラフィルムで密封した。プレートは、析出物を溶解するために５〜１０分間放置した。精製水(１００μｌ)を各ウェルに加えた。吸光度は、ELISA用リーダ器具により求めた。５４０ｎｍでの色強度(color intensity)は、細胞の生存数に比例する。ペプチドの各濃度の結果については、処理なしの対照と比較してプロットし、ＬＤ５０の値はグラフから求めた。

ＷＩ３８(ATCC No. CCL75)は、肺の２倍体細胞の正常な線維芽細胞株であり、ＭＣＦ７(ATCC No. HTB22)は乳腺癌の腫瘍細胞株、ＳＷ４８０(ATCC No. CCL228)は結腸腺癌の腫瘍細胞株、ＢＭＫＣ(ATCC No. HTB22)はボーズ(Bowes)メラノーマ株に由来するクローン化メラノーマ株、Ｈ１２９９(ATCC No. CRL5803)は肺の大型細胞癌腫瘍株、ＨｅＬａＳ３(ATCC No. CCL2.2)は子宮頸部上皮癌の腫瘍細胞株、ＰＣ３(ATCC No. CRL1435)は前立腺癌の腫瘍細胞株である。数字は、ＬＤ₅₀値(μｇ/ｍＬ)を表している。６種類のターゲットのデータを、次の表１６及び１７に示す。

表１６及び表１７を参照すると、全てのターゲットは、１種又は２種以上のペプチドにより、相当程度(ＬＤ５０が５０μｇ/ｍＬより少ない)まで阻害されることを示している。次の表１８は、試験したペプチド１５０のうち４４(２９％)のペプチドは、ＬＤ５０値が５０以下で活性であり、ペプチドのうち２６は、ＬＤ５０値が２５以下で幾つかのターゲットに対して活性であり、１６のペプチドは、ＬＤ５０値が１０以下で１種又は２種以上のターゲット菌株に対して非常に活性であった。

次の表１９は、様々な活性ペプチドについて、６種類の癌細胞に対する広域スペクトル活性を示している。各ターゲット(標的)は、ＬＤ５０値が１０以下で細胞増殖阻害作用をもつリード候補ペプチドを１種又は２種以上有することは留意されるべきである。

供試例５：白血球の刺激と増殖
ヒト白血球細胞のインビトロ生存性は、異なる濃度の異なるペプチドの存在下で、アラマーブルー(Alamar Blue)プロトコルにより求めた。アラマーブルー(Promega, Madison, WI)は、細胞の増殖と細胞毒性を定量測定するために調製された指示色素である。色素は、酸化還元(レドックス)指示体からなり、該指示体は、細胞の代謝活性に反応して色変化及び蛍光信号を生じる。

アッセイプロトコル：５０歳男性の血液を採取し、１５００ｒｐｍで１５分間室温にて遠心分離した。血漿−赤血球の界面における軟膜細胞を吸引した。軟膜細胞(主にリンパ球)を、RPMI-1640培地５ｍｌ＋１０％Fatal Bovine Serum(ウシ胎仔血清)(Gibco, Grand Island, NY)を含む１５ｍｌ遠心分離管に移した。追加の培地を前記遠心分離該管に加え、体積を１０ｍｌとした。次に、軟膜懸濁液を５ｍｌのHistopaque(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)へ慎重に重層し、３０分間室温にて１５００ｒｐｍで遠心分離した。大部分がＰＢＭＣs(末梢単核球)である境界面を吸引し、１５ｍｌの円錐状遠心分離管に移し、２ｍｌの低温RPMI-1640の中で再懸濁して、低温RPMI-1640培地を用いて１５ｍｌにした。細胞を１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次に、表面の浮遊物を吸引し、これを廃棄した。細胞ペレットを１ｍｌの低温RPMI 1640の中で再懸濁し、RPMI-1640培地を用いて１５ｍｌにした。この工程を２回繰り返した。但し、最後の工程では、細胞を１ｍｌの低温RPMI 1640の中で再懸濁し、細胞数は、Sigmaの細胞培養用カタログに基づく血球計算板を用いた。

陽性対照及び陰性対照と共に、ヤマゴボウマイトジェン(pokewood mitogen)を対照として使用した。陰性対照細胞は、７０％メタノールで死亡した。陽性(＋)の対照細胞は、RPMI培地(ペプチド処理なし)の中で培養した。２０ｍｌのアラマーブルーを細胞に添加し、２４時間後、４８時間後、７２時間後及び９６時間後に、蛍光計(励起５４４/透過５９０ｎｍ)を用いて測定した。

下記の式を用いて計算した。ペプチドで処理した試料と陽性対照を、陰性対照に合わせて調節した。
被処理細胞の増殖に対する刺激のパーセンテージは、ペプチド処理試料を陽性対照で割り算し、これに１００を掛けたものとして与えられる。

前記プロトコルを用い、約１００〜１５０ペプチドについて、ヒト白血球(「ＷＢＣ」)細胞の増殖におけるペプチドの刺激及び／又は阻害作用を調べ、ペプチド処理なしの陽性対照細胞の増殖と比較した。次の表２０のデータは、選択された様々なペプチドは、低濃度(０.１〜１.０μｇ/ｍｌ)では刺激作用を有するが、一部のペプチドは、高濃度では阻害作用を有する(細胞死を招く)ことを示している。数種類のペプチド(即ち、SEQ ID NOS:5,143及び160)は、５００μｇ/ｍｌまでの全ての濃度で刺激作用(及び／又は増殖作用)を有している。

プロトコルで使用したアラマーブルー染色液は、細胞と核膜の両方に浸透し、ミトコンドリア内で代謝して色に変化を生じる。それゆえ、生じた蛍光反応は、細胞刺激及び／又は有糸分裂(細胞増殖)によって生じた全ミトコンドリア活性を表す。培養時間の増加(１２０時間と４８時間)による値の増加(非処理の細胞に関しては、非処理細胞の値のパーセントとして)は、ペプチドによって引き起こされた細胞代謝活性の刺激の他に、細胞増殖の増加によるものである。

表２０は、選択されたＦＬＡＫペプチドの存在下において、ペプチド処理された細胞の刺激／増殖を、ヒトの白血球(ＷＢＣ)に対する非処理の陽性対照のパーセントとして表している。この表はまた、これらペプチドの夫々について、ヒト赤血球(ＲＢＣ)とヒト線維芽細胞(ＷＩ３８)に対する毒性(ＬＤ５０値)を示している。それらペプチドの中で、低ペプチド濃度(即ち、１０μｇ/ｍｌ以下)ではＷＢＣｓの刺激作用を有するが、高濃度ではＷＢＣを阻害するか又は有毒であるペプチドは、５００μｇ/ｍｌの高濃度でもＷＢＣ増殖を刺激するが阻害しないペプチドと比べて、ＲＢＣ及び線維芽細胞に対する毒性はかなり大きい。

上記のプロトコルでアラマーブルー以外のものを用いた限定された実験において、白血球の刺激及び増殖を生じさせるペプチドは、哺乳類のリンパ系の食細胞成分及びリンパ球成分の両方に活性であることが定量的に特定された。それゆえ、治療レベルの投与量で哺乳類細胞に対して無毒性の刺激性ＦＬＡＫペプチドのものを、免疫不全のヒト又は他の哺乳類を治療するための免疫調整剤として使用できる。そのような治療は、インビボの全身投与で行なうこともできるし、ドナーに再注入されるべき血液全体又は血液成分を体外治療することにより行なうことができる。そのような治療法は、加齢、疾病又は化学療法によって引き起こされる好中球減少症患者の免疫不全を抑える役割を有しており、病原感染及び特定の癌細胞株の増殖を防ぐか又は減少させるために、又はリンパ系を含む創傷治癒プロセスを向上させるために、自然免疫応答を刺激する。表２１は、濃度と時間が白血球の刺激、増殖及び阻害に影響を及ぼす現象について、より詳細な供試例(１種類のペプチドSEQ ID NO:10を含む)である。

供試例６：線維芽細胞の刺激と増殖
cyQUANT細胞増殖アッセイは、簡便で、迅速且つ高感度にて、培養液中の細胞密度を決定する方法を提供する。このアッセイは、単一色素濃度を用いて、２００μｌ中、５０細胞以下から５００００細胞以上の直線検出範囲を有している。アッセイは、細胞増殖研究や細胞数のルーチン検査にも理想的であり、細胞の表面への接着を監視するために用いることができる。

手順：異なる細胞株を、ATCCに基づく様々な培地で維持した。細胞は、８ｍｌのトリプシン(０.２５％, Fisher, Pittsburgh, PA)でトリプシナイズした。細胞の懸濁液は、１０分間１００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットをかき乱さずに、浮遊物を取り除き、これを廃棄した。濃縮した細胞懸濁液を１.０ｍｌの培地の中で調製し、１ｍｌあたり約１０⁵〜１０⁶個の密度を有する細胞を得た。実際の細胞密度は、Trypan Blue(トリパンブルー)法で血球計算板を用いて計算した細胞数により求めた。細胞数は、２００μｌ中の細胞数が等しくなるように調節した。細胞は、０％ＦＢＳ、２％ＦＢＳ、３％ＦＢＳ及び５％ＦＢＳでプレート培養した。プレート培養は、３７℃にて、細胞が接着するのに十分な時間行なった。長期間に亘る増殖の研究のため、１００μｌの培地を毎日各ウェルから除去し、新たな培地と取り替えた。

所定時間に達した時に、９６ウェルプレートの中の接着細胞から培地を取り除いた。これらの細胞は既に試薬で処理済みである。プレート内の細胞を、−７０℃で３０分間かけて凍結させた。細胞を室温で解凍した。各試料細胞に、CyQuant GR dry/Cell Lysis Buffer(２００μｌ)を加えた。細胞を光から保護しながら、室温で１５分間培養した。蛍光は、４８５〜５３８ｎｍでｆｍａｘを用いて測定した。

上記CyQuantプロトコルを用いて、線維芽細胞に関して起こり得るペプチドの刺激及び／又は増殖を試験した。次の表２２は、選択されたペプチドのデータであり、ヒトの線維芽細胞(ＷＩ３８)に与える影響を示している。この表では、選択されたペプチドの刺激及び／又は増殖特性は、濃度の関数であることを明確に示している。表２３は、特定のペプチドについて、線維芽細胞刺激及び／又は増殖効果は、他の増殖因子の存在下で向上することを示している。これは、Fetal Bovine Serum(ＦＢＳ)を培地に加えることによって示される。表２２及び表２３に示す数値は、細胞の刺激／増殖活性を、対照(非処理の細胞)のパーセントとして表したものである。対照細胞とペプチド処理細胞は、示された培地とＦＢＳを有している。１００％(対照)より下の値は、特に１０μｇ/ｍｌを超える濃度においてペプチドの阻害作用を示している。

供試例７：毒性アッセイ−赤血球(ＲＢＣ)の溶血性並びに白血球(ＷＢＣ)及び線維芽細胞の阻害
次の表２４は、典型的なＦＬＡＫペプチドに関するＲＢＣ、ＷＢＣ及びＷＩ３８の毒性データをまとめたものである。ＲＢＣ、ＷＢＣ及びＷＩ３８の３つの値(ＬＤ５０)は、ペプチドの毒性について、ほぼ一貫した方向性指数(directional indicators)である。与えられた表示について可能性のある治療のためにペプチドを選ぶ際、ペプチドの治療活性及び特異性を、その考えられる有害特性と一致させることが重要である。SEQ ID NO:5ペプチドはＦＬＡＫペプチドではなく、むしろSB-37であり、セクロピンＢに近いそのホモログである。それは、これまで、抗菌剤としてＦＬＡＫペプチドほどの活性はないとされていたが、インビボのラットモデルで示されたような創傷治癒特性を有している。これは、哺乳類の白血球と線維芽細胞の両方に対するペプチドの刺激及び増殖効果によるものと考えられる。
ＷＢＣ及びＷＩ３８を刺激するためのプロトコルについて説明した。ＲＢＣプロトコルを表２４に示している。

ＲＢＣのプロトコルは次の通りである。希釈対照と非処理対照の夫々について、ウェルの位置は、９６ウェルプレートの蓋の上に記録されている。細胞がコンフルエントに達すると、培地を取り除いて、新たに調製した試験希釈剤と置換し、最終体積の２００μｌにする。試薬を９６ウェルプレートの指定されたウェルに加える。２００μｌの新たな培地を陽性対照のウェルに加え、２００μｌの７０％エタノールを陰性対照のウェルに加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ₂及び９０％湿度以上の条件で一晩培養した。室温のアラマーブルー溶液(２０μｌ)を全てのウェルに加えた。プレートを、分光蛍光光度計で測定した(励起５４４ｎｍ、放射５９０ｎｍ)。プレートを３７℃、５％ＣＯ₂及び９０％以上の湿度条件で３時間培養した。３時間及び２４時間培養後、プレートを測定した。ＬＤ５０終端はグラフから求め、５０％の位置が用量反応曲線(Dose Response Curve)を遮る位置からｘ軸上の濃度まで読み取った。その濃度がＬＤ５０の値である。試薬の相対的毒性の順位をつけたり、インビボのデータと相関させるために、単一試薬クラス範囲内の試薬に対するＬＤ５０値を用いることができる。

この溶血性アッセイは、Journal of Peptide Research 53: 82-90 (1999)で示されたアッセイに基づいている。全ての培地、ストック溶液及び希釈剤の調製は、汚染を最小限にするか又は防ぐために層流フードの中で行なった。全ての工程は、ヒトの体液の取扱い及び処理に関する安全性プロトコルに基づいて行なった。

赤血球(ＲＢＣｓ)をＰＢＳ(３５ｍＭリン酸塩緩衝液０.１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７.０)で３回洗浄した。ＰＢＳ(０.４％(ｖ/ｖ)；１５ペプチドにつき約１０ｍｌ)中に懸濁したＲＢＣｓを調製した。懸濁液(１００μｌ)を各試料及び対照の管に分配した。連続希釈したペプチド溶液(１００μｌ)を、ピペットによって試料管に入れた。陰性対照の管にはＰＢＳを１００μｌ含み、陽性対照の管には１％Triton-X洗浄剤を１００μｌ含んでいた。全ての管を３７℃で１時間培養した。管をインキュベータから取り出し、１０００Ｇで５分間遠心分離した。ピペットを用いて、浮遊物(１００μｌ)を９６ウェルのポリ塩化ビニール製プレートに入れた。４１４ｎｍでの吸光度(Ａ₄₁₄)を測定し、これを用いて、次式により溶血率(percent pemolysis)を計算した。
(ペプチド溶液中のＡ₄₁₄−ＰＢＳ中のＡ₄₁₄)／(Triton-X100中のＡ₄₁₄−ＰＢＳ中のＡ₄₁₄)×１００％

溶血率をペプチド濃度に対してプロットし、５０％溶血の濃度を求めた(ＬＤ₅₀)。次の表２５は、ここで記載したペプチドを用いた溶血性アッセイの結果を示している。

供試例８：バリン置換の効果
第１アミノ酸がバリンであるペプチド配列を変えることは、特に第１アミノ酸をフェニルアラニンからバリンに変えるときには、望ましい特性を得ることができる。赤血球と線維芽細胞(ＷＩ３８)の毒性は、他の望ましい特性を実質的に損なうことなく、低下させることができる。表２６は、ペプチドの毒性を低下させる数多くの例(14)を示しており、この例から、ペプチド処理したとき、赤血球と線維芽細胞は両方共、生存率(viability)は増大することを示している。ＬＤ５０値はμｇ/ｍｌで表している。

バリン置換による哺乳類細胞に対する毒性低下効果により、微生物病原体や癌細胞に対する治療活性もある程度低下するけれども、バリン置換によって治療活性が向上する場合がある。これは次の表２７の中でも認められ、バリン置換により、グラム陰性細菌Pseudomonas(シュードモナス属)に対するペプチドの抗細菌活性が増加することが示されている。
溶血とＷＩ３８の数値は、ＬＤ５０値を表す。P. aerug値は、ATCCアクセション番号9027のPseudomonas aeruginosaに対するＭＩＣ値(μｇ/ｍｌ)を表したものである。

供試例９：チロシン置換の効果
第２アミノ酸がチロシンであるペプチド配列を変えることにより、望ましい特性を得ることができる。ＦＬＡＫ９８(P-146, SEQ ID NO:108)は、第２位置にチロシン(Ｙ)が存在しており、非定型(atypical)のＦＬＡＫペプチドである。この変更とペプチド全体の配列の意義は、作られた構造が、中性ｐＨでアルファヘリックスに容易に混ぜ込まれることである[Montserret et al., Biochemistry 39: 8362-8373, 2000]。中性のｐＨでアルファヘリカル構造になり得ることは、このペプチドがポテンシー(potency)と広域スペクトル活性を有すると考えられる。これらの配列が混合の駆動力となるのは、疎水性だけではなく、静電気にもよることが示されている[Montserret et al.]。ＦＬＡＫペプチド中で、チロシンがアミノ酸と置換すると、特性が一般的に改良される。

供試例１０：望ましいペプチド
望ましいペプチドは、前述の実験データから選択することができる。グラム陽性細菌又グラム陰性細菌の望ましい抗菌ペプチドは、約１０μｇ/ｍｌ以下のＭＩＣ値を有するもの、約２５μｇ/ｍｌ以下のＭＢＣ値を有するものを選択することができる。望ましい抗真菌ペプチドは、ＭＩＣ又はＭＢＣ値が約２５μｇ/ｍｌ以下のものを選択することができる。望ましい抗癌ペプチドは、ＬＤ５０値が約２５μｇ/ｍｌ以下のものを選択することができる。

次の表２８は、望ましいペプチドの代表的なものを挙げており、「Ｘ」印は、そのペプチドが、該当する特性について望ましいことを表している。ペプチドの「長さ」とは、配列の中のアミノ酸残基の数のことである。

刺激及び増殖のために望ましいペプチドを選択することもできる。次の表２９は、望ましいペプチドの例を掲げており、「Ｘ」印は、そのペプチドが、前記表の項目欄に記載した特性に対する望ましいペプチドであることを表している。ペプチドは０.１μｇ/ｍｌ〜１.０μｇ/ｍｌの濃度で白血球を刺激するペプチドが好ましい。この濃度では、前記ペプチドは、赤血球、ＷＩ−３８線維芽細胞又はヒトの白血球に対して非毒性だからである。ペプチドは０.１μｇ/ｍｌ〜１.０μｇ/ｍｌで線維芽細胞を刺激するペプチドが好ましい。この濃度では、前記ペプチドは非毒性だからである。
表２９の中に、P146(SEQ108)(長さ＝13)及びP97(SEQ165)(長さ＝13)を追加する。これらのペプチドは、両方とも、白血球の欄及び線維芽細胞の欄に「Ｘ」印が付されるものとする。

供試例１１：リゾチームとの相乗効果
溶菌性ペプチドとリゾチームとの相乗効果を検定した。殺菌したミルクに、１ｍｌ当たり５×１０⁵の細菌を接種した。細菌致死率を調べた。

セクロピンSB-37(SEQ ID NO:5)とリゾチームとの相乗効果を、Pseudomonas syringae pv. tabaci (PSPT)、Pseudomonas solanacearum (PS)(青枯病菌)、Erwinia caratovora subsp. carotova (EC)(軟腐病菌)、及びXanthomonas campestris pv. campestris (XC)(黒腐病菌)について調べた。ＬＤ５０値(μＭ)を求めた。

Shiva-1とリゾチームとの相乗効果を調べた。Pseudomonas aeruginosa(緑膿菌)の生存率を、ブランク対照と比較して求めた。リゾチームは、ペプチドと同じモル濃度で使用した。

Shiva-1とリゾチームとの相乗効果を調べた。グラム陽性のS.intermedius 19930、S.intermedius 20034及びS.aureusの生存率は、ブランク対照と比較して求めた。リゾチームは、ペプチドの１０倍のモル濃度で使用した。

相乗効果の実験は、ペプチドを追加的又は相乗的に増強するＥＤＴＡの存在下で、ペプチドを使用して行なうこともできる。

供試例１２：抗生物質との相乗効果
ペプチドShiva-10(SEQ ID NO:4)と様々な抗菌剤との相乗効果を、Escherichia coli 25922について調べた。次の表は、ペプチドと抗菌剤との組合せによる効果を示しており、数字は最小殺菌濃度(ＭＢＣ；μｇ/ｍｌ)である。

ペプチドShiva-10(SEQ ID NO:4)と様々な抗菌剤との相乗効果を、Stapｈ.aureus 29213について調べた。次の表は、ペプチドと抗菌剤との組合せによる効果を示しており、数字は最小殺菌濃度(ＭＢＣ；μｇ/ｍｌ)である。

ペプチドＦＬＡＫ２６ＡＭ(P35; SEQ ID NO:17)と様々な抗菌剤との相乗効果を、Staph.aureus 29213 ＭＢＣについて調べた。次の表は、ペプチドと抗菌剤との組合せによる効果を示しており、数字は最小殺菌濃度(ＭＢＣ；μｇ/ｍｌ)である。この実験では、抗菌剤が存在しない場合のペプチドＭＢＣと、抗菌剤が指定された濃度で存在する場合のペプチドＭＢＣを求めた。

ドクササイクロン(doxacycline)と様々なペプチドとの相乗効果を、P.aeruginosa 27853について調べた。次の表は、doxacyclineと抗菌剤の組合せによる効果を示しており、数字は最小殺菌濃度(ＭＢＣ；μｇ/ｍｌ)である。ペプチドと共に使用するdoxacyclineの濃度は１０ｐｐｍである。

テトラサイクリンと様々なペプチドとの相乗効果を、Escherichia coli 25922 ＭＢＣについて調べた。次に表は、テトラサイクリンと抗菌剤の組合せによる効果を示しており、数字は最小殺菌濃度(ＭＢＣ；μｇ/ｍｌ)である。ペプチドと共に使用するテトラサイクリンの濃度は１.５ｐｐｍ濃度である。

供試例１３：化学療法剤との相乗効果
癌細胞を阻害する溶菌性ペプチドは、従来の癌用化学療法剤と相乗的に作用することが他の研究者らによって報告されている。ＦＬＡＫペプチドも例外でない。次の表４１は、選択されたＦＬＡＫペプチドがタモキシフェン(Tamoxifen)と相乗作用して、乳癌細胞のＭＣＦ７細胞株を阻害することを示している。表４２は、タモキシフェン又は他の癌用治療剤とさらなる相乗作用の可能性を有する他の抗癌ペプチドを挙げている。

表４１及び表４２はまた、選択されたペプチドについて、ＲＢＣｓ、ＷＢＣｓ及びＷＩ３８細胞に対する毒性を示している。毒性が非常に少ない場合、選択された抗癌ペプチドにより、他の化学治療剤との相乗効果が高められると、化学治療剤の投与量を少なくすることができるので、副作用はより少なくなる。

供試例１４：増殖因子との相乗効果
供試例１７と表２３では、ＦＬＡＫペプチドの中の幾つかは、他のマイトジェン又は増殖因子と相乗作用し、ペプチドを刺激及び／増殖する特性を有することが示されている。

供試例１５：ナリジクス酸及びクロラムフェニコールとの相乗効果
本発明のペプチドと、クロラムフェニコール又はナリジクス酸との相乗効果を、Pseudomonas aeruginosa(緑膿菌)の排出用突然変異体(efflux mutants)について調べた。ナリジクス酸又はクロラムフェニコールの何れか一方のＭＩＣ値をベースラインとして測定した。ペプチドは、その１／４ＭＩＣ濃度で添加し、ナリジクス酸又はクロラムフェニコールのどちらかがＭＩＣ値に達したときの濃度を求めた。表４３は、P.aeruginosa H374に関して、ペプチドとナリジクス酸の相乗効果を示しており、表４４は、P.aeruginosa H774に関して、ペプチドとナリジクス酸の相乗効果を示しており、表４５は、P.aeruginosa H374に関して、ペプチドとクロラムフェニコールの相乗効果を示している。ペプチドと抗生物質との相乗作用を判定するのに、部分的阻害濃度(Fractional Inhibitory Concentration; ＦＩＣ)指数を用いた。抗生物質の２倍連続希釈物を、一定量のペプチド、即ちペプチドの４分の１ＭＩＣに等しいペプチドの存在下で試験した。ＦＩＣ指数は、ＦＩＣ＝０.２５＋ＭＩＣ抗生剤併用/ＭＩＣ抗生剤ノミ。ＦＩＣ指数が０.５以下のとき、相乗作用を有すると考えられる。

供試例１６：薬剤耐性菌株に対する抗菌活性
トブラマイシン感受性及び耐性菌株に対するペプチドの抗菌活性を調べた。次の表４６に示されるように、ペプチドP56 (SEQ ID NO:36)、P74 (SEQ ID NO:50)及びP125 (SEQ ID NO:87)のトブラマイシン耐性(tr)Pseudomonas ATCC 13096に対する抗菌活性は、トブラマイシン感受性(ts)Pseudomonas ATCC 27853に対する抗菌活性よりも大きい。３種類の同じペプチドは、臨床トブラマイシン耐性菌株960890198-3c(表４６)に対して、より大きな抗菌活性を示した。

供試例１７：創傷治癒
本発明のペプチドは、創傷治癒のための局所的送達又は全身送達用組成物に用いることができる。組成物は、液体、クリーム、ペースト、その他の薬学的に許容される形態であってよい。組成物は、他の生物学的活性物質を含むこともできる。組成物は、薬学的に許容される担体を含むこともできる。
ＦＬＡＫペプチドは、創傷治癒との関連性が大きい細菌、S.aureus、S.pyogenes及びP.aeruginosa(例えば、表５、表６及び表７)に対して、有効性が高いことを示した。このペプチドは、創傷の治癒を促進し、炎症を低減させることができることを示した。これらの特性は全て、傷及び傷感染治療剤に必須である。
創傷治癒用として好ましいペプチドを次の表４８に示している。これらは、白血球及び線維芽細胞の一方又は両方を刺激するために、また、抗細菌特性のために望ましいペプチドである。

供試例１８：インビボのＦＬＡＫペプチドによる創傷治癒
米国特許第５,８６１,４７８号は、ペプチドLSB-37をラットモデルの治療剤に使用し、インビボの創傷治癒を開示している。LSB-37は、この明細書では、SEQ.NO.150(ペプチドP306)に対応しており、本発明の主題である小さなＦＬＡＫペプチドと比較して評価されている。供試例１７で示したように、ＦＬＡＫペプチドは、広範囲のインビトロアッセイに基づいて、創傷治癒剤としての適用可能性を提案している。これは、小動物の局所傷治癒モデルにおいて、選択されたＦＬＡＫ(及びその他のもの)ペプチドのインビボ試験で示されている。

この研究の目的は、選択されたペプチドについて、(i)傷口閉鎖速度、(ii)炎症反応、及び(iii)化学的に引き起こされた皮膚のやけど傷の表皮腫脹(epidermal thickening)に及ぼす影響を評価することであった。適当な試験モデルとしてヘアレスラットを選択した。研究で用いられたものは、雌のヘアレスレットで、生後８〜１２週、体重１００〜１５０グラムであった。

文献及び私的通信物の中で、フェノールを主に含むスキンピール(skin peels)が報告されているが、この研究で用いられたものは全身的毒性であることが分かった。この研究では、１匹の動物に対し、全表面積が＞２平方インチの試験用パッチ(ピール)６枚が用いられた。別の方法として、皮膚の腐食パッチを誘導するのに、７０％エタノールに溶解された７０％トリクロロ酢酸(ＴＣＡ)が利用されている。ピールを３０分密閉すると、３度の火傷となり、表皮と真皮が完全に焼損(erosion)した。化学的火傷剤として、ラットにＴＣＡを施したものは、フェノールの場合と比べて、外傷と死亡率ははるかに少なかった。

実験プロトコルの工程は以下の通りである。
１．動物に麻酔をかけた(４０ｍｌ/ｋｇのフェノバルビタール)。
２．毎日、処理の前後に、動物の背部(６枚の独立したピール)のカラー写真を撮った。
３．処理前、ラットの皮膚表面は、７０％エタノールで拭いておいた。紙製のフィルターディスク(直径１.１ｃｍ)を７０％ＴＣＡ/エタノールの中に浸漬した。
４．ディスクをヘアレスラットの背部に載せ、３０分間放置した。[６枚のディスクの内訳は、２枚が対照(ペプチド処理なし)、４枚がペプチド処理を施すためのピール用である]。
５．３０分かけて火傷を引き起こした後、ディスクを取り除いた。２４時間後、４枚のピールには、異なるペプチド溶液(生理食塩水中１５００ｐｐｍ)を施し、２枚の対照用ピールには生理食塩水を施した。
６．その後の毎日、６つの傷部に対し、柔らかいブラシを用いてペプチド溶液(対照については生理食塩水)を施した。
７．傷が治癒(皮膚閉鎖が完了し、表皮が安定)に約１ヶ月かかり、その後、動物は死亡した。
８．処理後の皮膚を採取し、一部分をトリクロムで染色した後、スライドに載せた。

各ピール(６)について、傷口閉鎖のパーセンテージを、動物が死亡するまで毎日測定した。閉鎖率は、動物の写真上で、火傷による最初の傷痕の面積に対する残部かさぶた(scab)の面積を測定することによって求めた。これらの測定は、Sigma Plot ProScan 4のプログラムを用いて、ピールをデジタル化し、分析することにより行なった。
傷口が完全に閉鎖した後、各ピールのまだ赤く腫れた部分について、動物写真をSigma Plot分析することによって定量化し、治癒した傷痕全体のパーセントとしてを求めた。これは、各ピール部分における炎症反応について、ＴＣＡによる火傷後の治療手段として供された。

各ピール部分における表皮腫脹(角質増殖)の程度については、様々な傷部の染色部のスライドと、ピール周囲の正常な皮膚部分(ペプチド処理なしの対照)に対し、Sigma Plotプログラムを用いて測定することにより求めた。１００倍乃至３２０倍の倍率で、カラースライドのマイクロ写真は、各ピールに存在する角質増殖(hyperkeratosis)の程度を定量化するための強力な手段として供された。
スライドを選択的に染色することにより、傷部に白血球と繊維芽細胞の両細胞が存在するかどうかを特定した。これもまた、Sigma Plotプログラムを利用して定量化した。これは、異なるペプチドが傷治癒工程で影響を及ぼすインビボ機構を決定するのに有効な手段であることがわかった。この機構には、白血球の刺激／増殖、繊維芽細胞の刺激／増殖、インビボでの創傷治癒におけるペプチドの化学走化性効果が含まれる。

上述した動物モデル及びプロトコルは、創傷治癒に望ましいＦＬＡＫペプチドとして、表４８に掲げた約２０のペプチド(及び比較のための他のペプチド)を試験するのに用いた。一例として、一匹の動物において４種類のペプチドを用いて評価した実験の結果を、表４９に示している。これらのペプチドは、SEQ ID NO:66 (P102)、SEQ ID NO:71 (P107)、SEQ ID NO:115 (P153)、及びSEQ ID NO:119 (P157)である。SEQ ID NO:71 (P107)は、ＦＬＡＫペプチドではないが、LSB-37(SEQ ID NO:150; P06)の誘導体である。先の実験において、これらの２種類のペプチドは、インビボの創傷治癒特性が非常に似ていることを示している。SEQ ID NO:119 (P157)は、ＦＬＡＫではないペプチドであり、文献では比較用ペプチドとして報告されている。

表４９の結果より、幾つかのペプチドは、ＴＣＡによる火傷生成後の炎症反応を抑える能力を有することを示しており、傷生成後の処置用として適用可能と評価される。SEQ ID NO:71 (P107)と、SEQ ID NO:115 (P153)は、この能力に優れており、また、角質増殖(表皮腫脹)についても最も少なかった。実験は、その後、傷口が完全に閉鎖するまで２６日間行なった。前記２つのペプチドは、傷生成後の傷口閉鎖率については、他のペプチド及びペプチドなしの場合と比べて、僅かにすぐれるにとどまった。これらの２つのペプチドはまた、ＴＣＡによる火傷生成処理なしの対照と比べて、角質増殖は実質的になかった。

全体の中で、最もすぐれた創傷治癒活性を示したのは、前述の２つのペプチドであった。しかしながら、実験は無菌状態で行われたものであり、このような状況は、実生活で動物が傷を有するときには起こらない。そのような局部傷は感染され易いから、SEQ ID NO:66 (P102)とSEQ ID NO:115 (P153)のように抗細菌特性に優れるものも、創傷治癒用の候補となり得ることは考慮されなければならない。

供試例１９：嚢胞性線維症(ＣＦ)の治療
ＣＦは、北米で最も多く見られる常染色体性劣性遺伝病であり、アメリカ合衆国では年間３０００人もの子供が肺に炎症や感染を引き起こしている。ＣＦ肺感染症の９０％以上は、P.aeruginosaによって引き起こされ、これらの患者の９５％以上が肺損傷により死亡している。ＦＬＡＫペプチドの中には、多剤耐性緑膿菌株(Pseudomonas aeruginosa)に対して抗菌活性、ＣＦ患者からの臨床分離株に対して抗菌活性のものがある(表９、４３及び４４)。これらには、この条件に合わせて選択されたＴＯＢＩ耐性菌株がある。また、これのペプチド(アルファヘリカルペプチド)は、以前に、抗炎症特性を有することが示されており[Scott et al., J.Immunol. 165: 3358-3365, 2000]、ＦＬＡＫペプチドもこの特性を示したとしても驚きではない。抗炎症作用と抗感染作用を組み合わせると、これらペプチドは、ＣＦ肺感染症の新規な治療薬の候補として、非常に優れている。

供試例２０：性感染症(ＳＴＤｓ)の治療
性感染症(ＳＴＤ)は、北米で重大な問題であり、アメリカ合衆国だけで治療費に年間１００億ドルかかっている。主たる問題の１つは、抗真菌性、主としてフルコナゾールに耐性のCandida株の発生が増加していることである。このCandida株には、C.albicans、 C.glabrata及びC.tropicalisのような種がある。ＦＬＡＫペプチドの中には、これら３種の全てに対して著しい抗真菌活性を示すものがあり(表１３及び表１０)、真菌性疾患の発生を防止するための局所的抗真菌剤を開発できる実現可能性は非常に高い。文献の中で、ＦＬＡＫペプチドは、ウイルスや細菌などの他のＳＴＤ因子に対して抗ウイルス又は抗細菌活性を有する証拠が示されており、広域スペクトルの用途への適用も可能であることが示唆されている。ＦＬＡＫペプチドの中には、広域スペクトル活性を示すものがある(表１２及び表１３)。

供試例２１：座瘡(にきび)の治療
座瘡は、感染と炎症の両者によって生じ、組織の損傷を招き、傷跡が残る。ＦＬＡＫペプチドは、座瘡の炎症部(acne sores)から単離された主細菌、Propionibacterium acne(ニキビ桿菌)に対して抗細菌活性を示しており、抗炎症作用を有する[Scott et al., J.Immunol. 165: 3358-3365, 2000]。また、ＦＬＡＫペプチドは、創傷治癒の速度及び効果を高め、繊維芽細胞の増殖を促進し、コラーゲン及びラミニンの生成を高める傾向を示した。これらの特性は全て、ＦＬＡＫペプチドを、臨床治療薬又は美容食品として座瘡の治療に使用するための有力な証拠となるものである。

供試例２２：化粧品への適用
コラーゲン刺激、繊維芽細胞刺激及び創傷治癒のようなＦＬＡＫペプチドの特性は、そのようなペプチドを老化防止及び若返り用の化粧品への使用可能性を示すもので、大変魅力的である。

供試例２３：食品産業におけるＦＬＡＫペプチドの使用
食品産業に関係する疾病の主な原因は、Salmonella typhimurium(ネズミチフス菌)及びEscherichia coli(大腸菌)のようなグラム陰性細菌である。多くのＦＬＡＫペプチドは、これらの生物(organisms))に対して特異的な抗生物活性を示した(表７及び表１２)。そのようなペプチドを食品媒介疾病の治療と予防に適用することは、それゆえに魅力的な用途である。例えば、そのようなペプチドを食品の汚染除去に使用することは、特異的且つ潜在的に新規な用途である。

供試例２４：ペプチドの血清中での全身送達
一連のペプチドを１２８０μｇ/ｍｌでヒツジ血清に導入し、３７℃で３０分間又は２時間、培養した(表５０)。その後、Pseudomonas aeruginosa(緑膿菌)の抗血清ＭＩＣｓを用いて、ペプチドの血清不活性化の程度を求めた。試験したペプチドのうち、２つのペプチド(P153及びP508)を７０％血清中で１２８０μｇ/ｍｌ溶解させた。血清への曝露によって、それらの活性はごく緩やかに低下するだけであった。これは、P153及びP508は、血清中で機能することができること示唆し、全身送達用に適用可能であることを示している。

供試例２５：ＦＬＡＫペプチドによるコラーゲン及びラミニン刺激
線維芽細胞株を標準状態で培養し、Panvera (Madison, WI)製のELISAシステムを使用してコラーゲン及とラミニンを検定した。コラーゲンとラミニンの抗体は、日本の宝酒造株式会社によって製造されたものを使用した。次の表５１は、４種類のペプチドのうちの１つが、コラーゲンとラミニンの生成を著しく刺激することを示している。試験した他の３種類のペプチドは、生成を刺激することも阻害することもなかった(即ち、効果は観察されなかった)。

この明細書の中で開示した組成物及び／又は方法は全て、開示を参照することにより、必要以上の実験を行なうことなく製造し、実行することができる。本発明の組成物及び方法の望ましい実施例を記載したが、当該分野の専門家であれば、発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、組成物及び／又は方法並びに本明細書に記載した工程若しくは工程のシーケンスに変更を加えることができることは明白であろう。より具体的には、化学的且つ生理学的に関係する薬剤の中には、ここに記載した物質に代えて使用し、同一又は同様な結果を達成できるものもあることは明らかであろう。当該分野の専門家にとって明らかであれば、そのような置換及び変更は全て、本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であると見なされるべきである。

Claims

細胞の刺激又は増殖活性を有する単離されたペプチドであって、該ペプチドは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、アラニン残基及びリジン残基からなる配列を含み、５〜１３アミノ酸の長さであり、SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142又はSEQ ID NO:143である、単離されたペプチド。
ペプチドは、SEQ ID NO:129である請求項１に記載のペプチド。
ペプチドは、SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140又はSEQ ID NO:142である請求項１に記載のペプチド。
ペプチドは、SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142又はSEQ ID NO:143である請求項１に記載のペプチド。
ペプチドは、SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140又はSEQ ID NO:142である請求項４に記載のペプチド。
ペプチドは、SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142又はSEQ ID NO:143である請求項１に記載のペプチド。
ペプチドは、SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140又はSEQ ID NO:142である、請求項６に記載のペプチド。
細胞の刺激又は増殖活性は、リンパ球又は線維芽細胞に関するものである請求項１に記載のペプチド。
細胞の刺激及び／又は増殖を促進するための薬剤の製造において、請求項１乃至８の何れかに記載のペプチドを使用する方法。
インビトロで、哺乳類の細胞の刺激又は増殖を促進させるために請求項１乃至８の何れかに記載のペプチドを使用する方法。
哺乳類の細胞は、リンパ球又は線維芽細胞である請求項１０の方法。
増殖因子の活性を高める方法であって、請求項１乃至８の何れかに記載のペプチドと増殖因子を含む組成物を調製することを含んでおり、前記組成物は、増殖因子を含むがペプチドを含まない組成物よりも高い活性を有している、方法。
薬剤中のペプチドの濃度は、０.０１μＭ〜５００μＭである請求項９に記載の方法。