DE69836139T2

DE69836139T2 - Verfahren zur behandlung von vaskulären proliferativen erkrankungen mit p27 und fusionen davon

Info

Publication number: DE69836139T2
Application number: DE69836139T
Authority: DE
Inventors: J. Gary Washington NABEL; G. Elizabeth Washington NABEL
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 1997-07-21
Filing date: 1998-07-21
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2018-07-22
Also published as: CA2295199A1; WO1999003508A2; US6177272B1; ATE342067T1; DE69836139D1; US6884431B1; WO1999003508A3; EP0998307B1; WO1999003508A9; JP2001510028A; AU8502198A; EP0998307A2; CA2295199C

Description

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung proliferativer Gefäß-Erkrankungen in vivo durch Verabreichung eines p27 kodierenden Gens bereit.
Vaskuläre beziehungsweise Gefäß-Erkrankungen sind gekennzeichnet durch eine proliferative (Vermehrungs-)Antwort des Bindegewebes auf Verletzungen, welche sich aus einer Proliferation von glatten Muskelzellen und Migration als auch einer Bildung von Bindegewebe zusammensetzt. Der Mechanismus, durch welchen glatte Gefäßmuskelzellen (VSMC) als Antwort auf mitogene Signale proliferieren ist wohlbekannt, wobei jedoch die Rolle zellulärer Genprodukte, die VSMC dazu veranlassen von einem proliferativen beziehungsweise sich vermehrenden zu einem nicht proliferativen Zustand während der G1 Phase des Zellzyklus zu wechseln, nicht gut verstanden ist.
Es ist bekannt, dass Übergänge zwischen Phasen des Zellzyklus durch eine Familie von Cyclin-abhängigen Kinasen (Nurs, P., Nature 344 (1990), 503–508; Hartwell, L. et al., Science 183 (1974), 46–51) katalysiert werden. In vielen Zellen erfordert ein Durchgang durch G1 des Zellzyklus und Eintritt in die S Phase eine Bindung und Aktivierung von Cyclin/Cyclin abhängigen Kinase-Komplexen (CDK), hauptsächlich Cyclin D-cdk4, 6 und Cyclin E-cdk2 (Sherr, C.J. Cell 79 (1994), 551; Sherr, C.J. Science 274 (1996), 1672).
Die Cyclin abhängigen Kinase-Hemmstoffe (CKIs) stellen natürlich vorkommende Genprodukte dar, die die Cyclin-CDK Aktivität und Phosphorylierung von Retinoblastom (Rb) hemmen, was zu einem Stehen bleiben beziehungsweise Arrest des Wachstums führt (Morgan, D.O. Nature 374 (1995), 171; Sherr C.J. & Roberts J.M. Genes Dev. 9 (1995), 1149). Die CKIs, die unmittelbar mit einer CDK-Regulierung in Beziehung gebracht werden, sind p21^cip1/Waf1 (Xiong, Y. et al., Nature 366 (1993), 701; Harper, J.W. et al., Cell 75 (1993), 805), p27^Kip1 (Pyoshima, H. Hunter, T. Cell 78 (1994), 78; Polyak K. et al. Cell 78 (1994), 59; Coats et al., Science 272 (1996), 877) und p16/p15^INKN (Serrano, M. et al., Nature 366 (1993), 704).
Kürzlich durchgeführte Untersuchungen dieser CKIs konzentrierten sich auf deren mögliche Rolle bei einer bösartigen Transformation. So wird beispielsweise wird in der WO 95/18824 (Anmelder Sloan-Kettering Institute for Cancer Research) ein Verfahren beschrieben, bei dem Mittel identifiziert werden, die die Fähigkeit von p27 modulieren können, welche die Aktivierung des Cyclin E-Cdk2 Komplexes hemmen. Diese PCT-Veröffentlichung stellt weiterhin Verfahren einer Behandlung von Subjekten bereit, die mit einer hyperproliferativen Erkrankung, wie beispielsweise Krebs und Hyperplasie, unter Verwendung dieser Mittel diagnostiziert wurden. Derartige Agentien können sowohl Protein- als auch nicht Protein-Reste sein. Bedauerlicherweise wurde die Beziehung von CKIs bei cardiovaskulären beziehungsweise Herz-Gefäß-Erkrankungen, einschließlich Atherosklerose, Angiogenese und Restenose nicht gut untersucht.
Gegenwärtig kommen einige Verfahren zum Einsatz, um cardiovaskuläre Erkrankungen zu behandeln, die darauf gerichtet sind, die Zellproliferation zu hemmen. Die mit den verfügbaren Therapien assoziierten Hauptprobleme drehen sich um ein Dirigieren des das Hemmstoff-Mittels zu den proliferierenden Zellen, die abgetötet werden müssen. Die Durchführung des Zielens bzw. Dirigierens wurde gewöhnlich unter Verwendung von an Antikörper gekoppelten chemotherapeutischen oder radiotherapeutischen Mitteln versucht. Kürzlich wurden Gentherapie-Ansätze zum Einsatz gebracht, die auf proliferierende Zellen gerichtet sind, indem Genprodukte bereitgestellt werden, die für spezifische Zelltypen schädlich sind. Die diese Genprodukte kodierenden Gene sind als Selbstmord-Gene bekannt. Die Genprodukte werden entweder ortspezifisch eingebracht, in spezifischen Zellen unter Verwendung von Vektoren, die auf spezifische Zellen gerichtet sind, exprimiert oder unter der Kontrolle eines Zelltyp-spezifischen Promoters exprimiert.
Das HSV-1 Thymidinkinase-Gen (TK) ist das am weitesten verbreitete Selbstmord-Gen in Säugersystemen. TK phosphoryliert wirksam die Guanosinanaloge Ganciclovir (GCV) und Acyclovir (ACV), welche anschließend durch zelluläre Enzyme in deren Triphosphat-Formen phosphoryliert werden. Diese Endprodukte werden in die wachsende DNA-Kette eingebaut, was zu einer Beendigung der Verlängerung (ACV) oder einer drastischen Verlangsamung bei der DNA-Synthese (GCV) führt. Der Tod erfolgt gewöhnlich durch einen Mechanismus, der in einigen Zelllinien als Apoptose identifiziert wurde. Der den Zelltod auslösende Mechanismus ist nicht bekannt. Im Fall von GCV kann eine andere Wirkung als auf der Ebene der Hemmung der DNA-Polymerase vorkommen, da keine Korrelation zwischen der Hemmung mutierter viraler DNA-Polymerase durch GCV und dem Wachstum dieser Mutanten in der Gegenwart von GCV beobachtet wurde.
Eines der besonderen Merkmale des TK-GCV Systems besteht in der Zuschauerwirkung, die den Tod nicht transduzierter Zellen kennzeichnet. Zwei Mechanismen wurden vorgeschlagen, um dieses Phänomen zu erklären. Freeman und Kollegen nahmen 1993 an, dass die Aufnahme von phosphoryliertem GCV durch Zuschauerzellen über die Endozytose apoptotischer Vesikel erfolgt, die von den TK transduzierten Zellen stammen und das toxische Arzneimittel enthalten. Zunehmende Indizien jedoch legen nahe, dass die Zuschauerwirkung über Lückenverbindungen, interzelluläre Übertragungswege, vermittelt wird, die phosphoryliertem Ganciclovir ermöglicht von TK⁺ zu TK^– Zellen zu translozieren. Fick und Kollegen stellten 1995 unter Verwendung eines Durchflusszytometrie-Tests zum Quantifizieren einer zellulären Kopplung fest, dass eine Tumortoxizität der Zuschauer während einer GCV Behandlung mit dem Ausmaß einer Lückenverbindung vermittelten Kopplung hoch korreliert. In einer TK exprimierenden Neuro-2a Neuroblastom-Zelllinie der Maus, die normaler Wiese keine Zuschauerwirkung zeigt, konnte gezeigt werden, dass eine Adenovirus vermittelte Überexpression von Connexin-43 ein Zuschauerwirkung vermitteltes Zelltöten übertrug.
Das TK-GCV System wurde bereits erfolgreich in Krebsmodellen als auch bei Restenose in vivo (Plautz et al., Circulation 83 (1991), 578; Ohno et al., Science 265 (1994), 781) angewendet. Die Wirksamkeit einer Genabgabe beziehungsweise -zuführung in vivo bleibt jedoch sehr gering, wobei eine Erhöhung eines TK vermittelten Abtötens auf anderen Ebenen berücksichtigt werden muss. In einem Versuch die TK vermittelte Tumorunterdrückung und das Immunsystem zu verbinden, wurden retrovirale Vektoren konstruiert, die sowohl die HSV-TK als auch Interleukin-2 Gene tragen. Unter Verwendung eines 9L Gliosarcom-Models der Ratte wurde jedoch keine Erhöhung einer Tumorausrottung mit diesem Vektor beobachtet.
Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Verwendung eines ersten Gens, das p27 kodiert und eines zweiten Gens, das ein zweites Polypeptid kodiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer vaskulären proliferativen Erkrankung oder zur Hemmen des Zellwachstums von glatter Muskulatur der Intima beziehungsweise Gefäßinnenhaut in einem Patienten, der es benötigt, bereitgestellt, wobei das zweite Polypep tid direkt oder indirekt die Transkription in eukaryotischen Zellen aktiviert, wobei die vaskuläre proliferative Erkrankung Restenose ist, wobei die vaskuläre proliferative Erkrankung Atherosklerose ist, wobei die vaskuläre proliferative Erkrankung Angiogenese ist.
Die hier genannten Erfinder stellten fest, das p27 in Arterien so wirkt, dass es die Antwort beziehungsweise Reaktion auf eine akute Verletzung und Zellproliferation steuert. Die hier genannten Erfinder liefern den ersten direkten Nachweis, dass eine p27-Expression und Überexpression ausreichend ist, um eine Hemmung von Zellwachstum der vaskulären glatten Muskulatur in vivo zu erzeugen. Daher betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des p27 Gens als ein anti-proliferatives Gen, um vaskuläre proliferative Erkrankungen, einschließlich koronarer und peripherer Restenose, zu behandeln.
Die hier beschriebenen Verfahren sind darauf gerichtet, die Zuschauerwirkung zu erhöhen. Da der Wirkungsmechanismus von TK wahrscheinlich auf der Ebene der DNA-Replikation liegt, macht ein Arretieren der sich vermehrender Zellen sie vorübergehend für ein TK-GCV vermitteltes Abtöten unempfindlich, verlängert deren Leben und die Dauer einer TK Expression, wodurch die Translokation von phosphoryliertem GCV an Zuschauerzellen erhöht wird.
1 sind Histogramme, die das DNA-Profil der 293 Zellen darstellen, die mit (i) p21, p27, p16, Vpr oder hAP exprimierenden Vektoren unter der Kontrolle eines CMV Enhancer/Promoter und (ii) einem CD-2 exprimierenden Plasmid transformiert sind. Die Fraktion von Zellen in der jeweiligen Phase des Zellzyklus wird über der entsprechenden Spitze angezeigt. Der prozentuale Anteil von DNA-positiven Zellen wird in der oberen rechten Ecke des jeweiligen Diagramms gezeigt, um die Variabilität bei der Transfektionseffizienz darzustellen.
2A stellt eine schematische Darstellung der p27- und TK-exprimierenden Konstrukte dar. 2B stellt ein Histogramm dar, das die DNA Profile von 293 Zellen zeigt, die mit den oben beschriebenen Plasmiden und einem CD-2 exprimierenden Plasmid transfiziert wurden. Die Fraktion von Zellen in jeder Phase des Zellzyklus wird über der entsprechenden Spitze angezeigt. Die prozentualen Anteile von CD-2 positiven Zellen werden in der oberen rechten Ecke jeden Diagramms angezeigt, um die Variabilität der Transfektionseffizienz anzuzeigen. 2C stellt ein Histogramm dar, das das Wachstum von 293 Zellen zeigt, die mit den oben beschriebenen Plasmiden in der Anwesenheit oder in der Abwesenheit von 5 μM GCV transfiziert wurden. Die Proliferation wurde unter Verwendung eines kolorimetrischen Assays ermittelt. Die Daten stellen den Durchschnitt von 3 Erfassungen dar.
3A stellt eine schematische Darstellung der p27- und TK-exprimierenden Konstrukte dar. 3B ist ein Histogramm, das die DNA-Profile von 293 Zellen darstellt, die mit den vorstehend beschriebenen Plasmiden und einem CD-2 exprimierenden Plasmid transfiziert wurden. Die Fraktion von Zellen, die sich in der G1 Phase des Zellzyklus befinden, wird über der entsprechenden Spitze angezeigt. Die prozentualen Anteile von CD-2 positiven Zellen wurden in der oberen rechten Ecke eines jeden Diagramms angezeigt, um die Variabilität bei der Transfektionseffizienz anzuzeigen. Alle Werte stellen den Durchschnitt von zwei Experimenten dar. 2C stellt den Zuschauer-Assay dar. Renca-Zellen wurden mit den verschiedenen Plasmiden transfiziert und mit nicht transfizierten Zellen verdünnt. Eine Zugabe von 5 μM GCV zu dem Kulturmedium und ein Zellproliferations-Assay wurden 1 beziehungsweise 5 Tage nach Transfektion ausgeführt.
4A stellt ein Histogramm dar, das zeigt, dass Mutation der cdc2 Kinase Konsensusstelle TPKK zu GGAA p27 Aktivität moderat erhöht. 4B ist ein Histogramm, dass die internen Deletionen innerhalb des p27 kodierenden Bereichs zeigt, welche die p27 Aktivität erhöhen. 4C zeigt, dass eine Fusion der N-terminalen Domänen von p21 und p27 den Zellzyklus-Arrest in G1 nicht erhöht. Alle Experimente wurden unter Verwendung von 293 Zellen wie in 2B und 3B ausgeführt.
5 stellt die DNA- und Protein-Sequenzen von p27 (SEQ ID NO:1–2) dar.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines ersten Gens, das p27 kodiert und eines zweiten Gens, das ein zweites Polypeptid kodiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer vaskulären proliferativen Erkrankung oder zur Hemmung des Zellwachstums der glatten Muskulatur der Intima in einem Patienten, der es benötigt, bereit, wobei das zweite Polypeptid direkt oder indirekt die Transkription in eukaryotischen Zellen aktiviert.
I. p27 und Fusionsproteine davon
Die Aminosäuresequenz von p27 (das erste Polypeptid) ist in 5 (SEQ ID NO: 2) gezeigt. Jede DNA, die dieses Protein kodiert, kann erfindungsgemäß dazu verwendet werden. cDNAs, die p27 kodieren, werden in WO 95/18824, WO 96/02140 (Anmelder: Sloan-Kettering Institute for Cancer Research), Toyoshima et al. (Cell 78 (1994), 67–74) und Polyak et al., (Cell 78 (1994), 59–66) beschrieben. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "p27" sowohl natives p27 als auch mutiertes p27 sowie Fusionsproteine davon.
Der Begriff "mutiertes p27" umfasst Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die ähnlich ist zu einem Wild-Typ p27, die jedoch mindestens eine von dem Wild-Typ p27 verschiedene Aminosäure aufweist. Der/Die Aminosäureunterschied(e) zwischen einem mutierten p27 und einem Wild-Typ p27 kann/können Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren, Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren sein. Bevorzugte Stellen für Mutationen umfassen die letzten vier Carboxy-terminalen Aminosäurereste oder mindestens zwölf Basenpaare an dem 3'-Terminus, der das Protein kodierenden DNA. Vorzugsweise werden die Basenpaare manipuliert, um so eine Restriktionsstelle für eine Endonuklease an diesem Terminus der DNA einzufügen.
In einer alternativen Ausführungsform ist p27 operativ mit einem zweiten Polypeptid verbunden, das direkt oder indirekt die Transkription in eukaryotischen Zellen aktiviert. Um die ersten und zweiten Polypeptide operativ zu verbinden, werden gewöhnlich Nukleotidsequenzen, die die ersten und zweiten Polypeptide kodieren, im Leseraster aneinander ligiert, um ein chimäres Gen zu erzeugen, welches ein Fusionsprotein kodiert, obwohl die ersten und zweiten Polypeptide durch andere Mittel operativ verbunden werden können, die die Funktion jedes Polypeptids (beispielsweise chemisches Vernetzen) bewahren.
Das zweite Polypeptid kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus HSV Thymidin-Kinase (McKnight, Nucleic Acids Res. 8 (1980), 5949; Mansour et al., Nature 336 (1988), 348–352), β-Galactosidase, p16 (Chan et al., Mol. Cell. Biol. 15 (1995), 2682-26-88; Guan et al., Genes&Dev. 8 (1994), 2939–2952), p21 (Harper et al., Cell 75 (1993), 805; Xiong et al., Nature 366 (1993, 701), p57 (Lee et al., Genes&Dev. 9 (1995), 639–649; Matsuoka et al., Genes&Dev. 9 (1995), 650–662), Retinablastom (Rb) (siehe Chang et al., Science 267 (1995), 518) oder dessen Mutanten (siehe beispielsweise Hamel et al., Mol. Cell. Biol. 12 (1992), 3431), Cytosin-Deaminase (WO 94/28143; Wang et al., Can. Soc. Petrol. Geol. Mem. 14 (1988), 71), Stickoxid und Stickoxid-Synthase.
II. Expressionssysteme
Geeignete Expressionsvektoren, die erfindungsgemäß nützlich sind, umfassen eukaryotische und virale Vektoren. Nützliche eukaryotische Vektoren umfassen pRcRSV und pRcCMV. Vorzugsweise werden virale Vektoren verwendet.
Virale Vektorsysteme wurden beim Transfizieren von Genen in Säuger, die fehlerhafte Gene behalten, als hoch wirksam angegeben. Siehe beispielsweise Crystal, Am. J. Med. 92(6A) (1992), 44S–52S; Lemarchand et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(14) (1992), 6482–6486. Vorzugsweise werden retrovirale Vektoren mit einer beeinträchtigten Fähigkeit zu replizieren und transformieren verwendet. Geeignete p21 exprimierende virale Vektoren, die erfindungsgemäß nützlich sind, umfassen adenovirale Vektoren, Ad5-360 in Kombination mit pAd-BghVI wie durch Davidson et al., Nature Gen. 3 (1993), 219, beschrieben. Vorzugsweise werden adenovirale Vektoren verwendet.
Bevorzuge adenovirale Vektoren umfassen: ADV, beschrieben durch Davidson et al., Nature Gen. 3 (1993), 219; oder andere Adenovirus-Typen, einschließlich der Typen 7001, oder Typen 1 oder 12 (wie beschrieben durch Yang et al., Nat. Med. 1 (1995), 1052 und Ohno et al., Science 265 (1994), 781).
Das p27 kann in diese Expressionsvektoren eingefügt und unter Verwendung herkömmlicher rekombinanter Techniken, wie beispielsweise durch Sambrook; Fritsch, & Maniatis in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (2. Ausgabe): pp. E5 (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) beschrieben zur Zelltransformation verwendet werden, wobei deren Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Alternativ können die Expressionsvektoren unter Verwendung homologer Rekombinationstechniken, wie durch Davidson et al., Nature Gen. 3 (1993), 219–223 oder Lemarchant et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(14) (1992), 6482–6486 beschrieben, hergestellt werden.
Die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung können zusätzlich regulatorische Elemente, wie beispielsweise Promotoren, und Enhancer und Selektionsmarker, wie beispielsweise Antibiotika-Resistenz-Gene beinhalten.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren andere therapeutisch nützliche Gene unter Kontrolle der gleichen regulatorischen Elemente wie p27 oder unter einer unabhängigen Regulation enthalten.
Es ist wohlbekannt, dass virale Vektoren in Zellen in vivo aufgenommen und in diese integriert werden, und deren DNA, einschließlich beliebig eingefügter Konstrukte, exprimieren. (Siehe beispielsweise Yoshimura et al., J. Biol. Chem. 268(4) (1993), 2300–2303; Crystal, Am. J. Med. 92(6A), (1992), 445–525; Lemarchant et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(14) (1992), 6484–6486; die hier durch Bezugnahme aufgenommen werden.
In einer alternativen Ausführungsform ist ebenfalls klar, dass neben Expressionsvektoren andere Zuführungssysteme verwendet werden können, um p27 Protein zu liefern. Prinzipiell wird erwartet, dass diese Techniken einschließlich der Verwendung von Liposomen und DNA-Konjugaten ähnliche Abgabeausbeuten bereitstellen, wie die durch die vorstehend beschriebenen Expressionsvektoren gelieferten. Das heißt, das neben einer Expression des p27-Gens über einen Expressionsvektor es ebenfalls möglich ist, eine therapeutische Menge eines p27 kodierenden Gens in ein Liposom einzuschließen.
Außerdem zeigten Kombinationstherapien viraler Vektoren und Liposomen ebenfalls eine große Aussicht und werden ebenfalls zur Verwendung in der Erfindung erwogen. Yoshimura et al., J. Biol. Chem. 268(4) (1993), 2300–2303.
Liposomen liefern bekanntermaßen aktive Mittel höchst wirksam an erkrankte Gewebe. So wurden beispielsweise pharmakologische oder andere biologisch aktive Mittel wirksam in Liposomen eingebaut und an Zellen geliefert. Daher können erfindungsgemäße Konstrukte ebenfalls in Liposomen geeignet ausgeformt sein und an bestimmte Gewebe geliefert werden. Liposomen, die aus kationischen Lipiden hergestellt werden, wie beispielsweise solche unter dem Markennamen LIPOFEKTIN (Life Technologies, Inc., Bethesda, Md.) erhältlichen, werden bevorzugt. Besonders ansprechend bei Liposomen basierenden Behandlungen ist die Tatsache, dass Liposomen relativ stabil sind und über eine relativ lange Haltbarkeit verfügen vor deren Passage von dem System oder deren Metabolismus. Außerdem erzeugen Liposomen keine größeren Immunantworten.
Daher wird in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ein Vektor, der ein p27 kodierendes Gen enthält in ein Liposom eingeschlossen und zur Abgabe des Konstrukts an ein spezifisches Gewebe verwendet. Das Liposom wird das Konstrukt beim Transfizieren einer Zelle fördern und wird durch die Zelle exprimiert, wobei schließlich p27 Protein erzeugt wird.
III. Therapeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist eine therapeutisch wirksame Menge eines Gens, das p27 exprimiert und ein pharmazeutisch verträglicher Träger. Um das Gen zu verabreichen, können geeignete Vektoren und Träger in die Formulierungen eingebaut werden, um eine verbesserte Expression von p27 bereitzustellen.
Jede der vorhergehenden Formulierungen kann bei der Behandlung mit viralen Vektoren geeignet sein, vorausgesetzt, dass die viralen Teilchen in der Formulierung inaktiviert sind und die Formulierung physiologisch verträglich ist.
Die von p27 zu verabreichende Menge wird von der Größe des Patienten und dem Stadium, zu dem die Erkrankung vorgeschritten ist, abhängig sein. Durch Modifizieren der regulatorischen Elemente des Gens kann unter Verwendung herkömmlicher DNA-Rekombinationsverfahren oder durch Variieren der Menge eines verabreichten Gentiters die Menge einer p27-Expression an die Erfordernisse des Patienten angepasst werden. Gewöhnlich ist es wünschenswert ungefähr 50 virale Vektoren pro zu behandelnde Zelle abzugeben. Bei dem Adenovirus sollten die Formulierungen im Allgemeinen in der Größenordnung von 10¹⁰ viralen Infektionseinheiten pro ml liegen. Beim Retrovirus können geringfügig unterschiedliche Titer einsetzbar bzw. passend sein. Siehe Woo et al., Enzyme 38 (1987), 207–213. Zusätzlich Unterstützung beim Bestimmen geeigneter Dosierungsniveaus können bei Kay et al., Hum. Gene Ther. 3 (1992), 641–647; Liu et al., Cell Molec. Genet. 18 (1992), 89–96 und Ledley et al., Hum. Gene Ther. 2 (1991), 331–358 gefunden werden.
Abhängig von der besonderen Formulierung, die für die Verabreichung des Expressionsvektors hergestellt wird, kann die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen durch eine Vielzahl von Verfahren erreicht werden. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden vorzugsweise durch direkte Injektion des Expressionsvektors (oder diesen enthaltende Liposom) in das Gewebe verabreicht oder durch Implantation eines Ballonkatheters in die Blutgefäßwand, wie beispielsweise in der US-P-5,328,470 beschrieben. In einer weniger bevorzugten Ausführungsform können Zellen eines Patienten gewonnen, mit p27 in vitro transformiert und in den Patienten wieder zurückgegeben werden.
IV. Anwendungen der Erfindung
Die Erfindung kann insbesondere für Zwecke einer Gentherapie bei Behandlungen von vaskulären proliferativen Erkrankungen nützlich sein. Der allgemeine Ansatz einer Gentherapie schließt das Einbringen einer Nukleinsäure in Zellen ein, so dass ein oder mehrere Genprodukte, die durch das eingebrachte genetische Material kodiert werden, in den Zellen gebildet werden, um eine funktionelle Aktivität wiederherzustellen oder zu erhöhen beziehungsweise zu verstärken. Für Übersichten über Gentherapieansätze siehe Anderson W.F. Science 256 (1992), 808–813; Miller A.D. Nature 357 (1992), 455–460; Friedman T. Science 244 (1989), 1275–1281 und Cournoyer D. et al., Curr. Opin. Biotech. 1 (1990), 96–208.
Vaskuläre proliferative Erkrankungen, die durch die Verwendungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, sind durch ein Zellwachstum der glatten Muskulatur der Intima als Reaktion auf eine Gefäßverletzung gekennzeichnet. Beispiele vaskulärer proliferativer Erkrankungen umfassen Atherosklerose, Angiogenese und Restenose.
Atherosklerose ist eine Atherosklerose, die durch ungleichmäßig verteilte Lipidablagerungen in der Intima und durch mittelgroße Arterien gekennzeichnet ist. Atherosklerose ist ein mehrstufiger Prozess, der in Gang gesetzt wird, wenn die die Arterien auskleidenden Zellen als ein Ergebnis hohen Blutdrucks, Rauchen, toxischer Substanzen in der Umgebung und anderer Mittel geschädigt werden. Diese Erkrankung ist durch einen Plaque-Aufbau beziehungsweise eine Plaque-Bildung gekennzeichnet falls sich die Lipoproteine hoher Dichte an der Stelle einer Arterienschädigung anhäufen und Blutplättchen bewirken, dass eine fibröse Kappe über diesen Fettkern ausgebildet wird.
Angiogenese ist die Entwicklung neuer Blutgefäße.
Eine Arterienverletzung von einer Angioplastie leitet eine Reihe proliferativer, vasoaktiver und entzündlicher Reaktionen ein, die zu einer Restenose führen. Obwohl einige Faktoren definiert wurden, die diesen Prozess in vivo fördern, ist die Rolle von spezifischen zellulären Genprodukten beim Begrenzen der Reaktion nicht gut verstanden. Die hier genannten Erfinder haben jetzt festgestellt, dass p27 bewirkt, dass die proliferative Antwort auf eine Verletzung durch Ballonkatheter begrenzt wird. Das Zellwachstum vaskulären Endothels und vaskulärer glatter Muskulatur wurde durch die Fähigkeit von p27 CKI arretiert, das Cyclin-abhängige Kinasen und den Durchgang durch die G1-Phase des Zellzyklus hemmt. Restenose ist eine Klinischer Zustand beziehungsweise Stadium, der diagnostiziert und wie bei Epstein et al., JACC 23(6) (1994), 1278 und Landau et al., Medical Progress 330(14) (1994), 981 beschrieben, überwacht werden kann.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können verwendet werden, um alle Säuger, insbesondere Menschen zu behandeln.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in Kombination mit immuntherapeutischen Mitteln, genetischen Therapien (beispielsweise HLA-B7), Proteinen (wie beispielsweise Zytokinen, vorzugsweise GM-CSF, IL-2 und/oder IL-12) und Antikrebs-Arzneimitteln, wie cis-Platin verabreicht werden. Alternativ können die Zusammensetzungen während einer adoptiven Zellübertragungs-Therapie verabreicht werden.
Nachdem diese Erfindung im Allgemeinen beschrieben wurde, kann ein weiteres Verständnis durch Bezugnahme auf bestimmte Beispiele erhalten werden, die hier lediglich zu Erläuterungszwecken bereitgestellt und nicht als beschränkend vorgesehen sind.
BEISPIEL 1
Die Wirkung einer p27 Überexpression auf den Zellzyklus wurde untersucht.
Zellkultur und Transfektion
1. Plasmide
p21, p16, p27, HSV-1 Thymidinkinase (tk), menschliche alkalische Phosphatase (hAP) und menschliches CD2 exprimierende cDNAs wurden in VR1012, einen eukaryotischer Expressionsvektor, eingefügt, der einen sehr frühen Gen-Promotor, Enhancer und Intron des Zytomegalie-Virus enthält, und ein Polyadenylierungssignal des Wachstumshormons des Rinds. Ein Plasmid, das HIV-1 Vpr unter der Kontrolle eines sehr frühen Gen-Promotors und eine SV40 Polyadenylierungssignal exprimiert, wurde durch Dr. E. Cohen ()Universität von Montreal, Kanada) bereitgestellt. (Siehe Yang et al., Nat. Med. 1 (1995), 1052 und Ohno et al., Science 265 (1994), 781)
Es wurde ein bi-cistronisches Konstrukt hergestellt, dass p27 und tk (pCMVp27CITEtk) exprimiert, indem das EcoRI-NcoI Fragment von pCITE-1 (Novagen, WI) zwischen einer XbaI-Stelle, die unmittelbar stromabwärts von der p27 kodierenden Sequenz angeordnet ist und einer NcoI-Stelle, die das Startcodon des tk Gens umfasst, eingefügt wurde. Dieses EcoRI-NcoI Fragment ("CITE") enthält eine Kopie der Encephalomyocarditis-Virus (EMC) RNA 5'-nicht kodierenden Region, die als eine interne Eintrittsstelle für den Beginn einer Translation durch eukaryotische Ribosomen fungiert. Als eine Kontrolle für die p27 Aktivität wurde ein die p27 kodierende Region jedoch in umgekehrter Richtung bezüglich des CMV-Promotors enthaltender Vektor auf ähnliche Weise hergestellt. Um die Größe der Expressionskassette zu verringern, wurde das SacII-EcoRV Fragment, das das CMV-Intron enthält, in beiden Vektoren deletiert beziehungsweise entfernt.
Ein Fusionsprotein zwischen p27 und tk wurde durch Entfernen eines AatII-NcoI Fragments von pCMVp27CITEtk hergestellt, was zu dem Plasmid pCMVp27tk führt. Dem erhaltenen Protein wurden die vier letzten Aminosäuren von p27 (PROT; SEQ ID NO: 8) entfernt und ein zusätzlicher Serinrest wurde vor das erste Methionin der Thymidinkinase eingefügt.
Eine Mutation der p27 cdc2-Kinase Konsensus-Stelle "TPKK" (SEQ ID NO:6) zu "GGAA" (SEQ ID NO:7) wurde unter Verwendung überlappender, auf PCR-basierender Verfahren ausgeführt, wobei Plasmid pCMVp27CITEtk als Matrize verwendet wurde. Auf einer Seite wurden Sequenzen, die Nukleotiden 186 bis Nukleotiden 576 von dem Start der p27 kodierenden Region entsprechen, unter Verwendung der Oligonukleotide #26 (5'-CGAT TTTCAGAATCACAAACCCC-3') (SEQ ID NO:2) und #24 (5'-GCCAGGCCCCCCGCCGCCTGCTCCACAGAACC-3') (SEQ ID NO:3) als Primer vermehrt. Auf der anderen Seite wurden Sequenzen, die Nukleotiden 554 von dem Start der p27 kodierenden Region bis zu der BgII Stelle entsprechen, die in den stromabwärts CITE Sequenzen angeordnet sind, unter Verwendung der Oligonukleotide #23 (5'-GAGCAGGCGGCCGGGGGGCCTGGCCTCAGAAG-3') (SEQ ID NO:4) und #27 (5'-TTTGGCCGCAGAGGCACCTGT-3') (SEQ ID NO:5) vermehrt. Mutationen in den Oligonukleotiden #23 und #24 unterscheiden sich von Wild-Typ in den relevanten Positionen. Beide PCR-Produkte wurden in einer Einzelreaktion unter Verwendung der Oligos #26 und #27 als Primer mit 6 Zyklen (94°C, 15 Sek/45°C, 30 Sek./72°C, 45 Sek.) gefolgt durch 30 Zyklen (94°C, 15 Sek/65°C, 30 Sek/72°C, 45 Sek) vermehrt. Das so erhaltene DNA Fragment wurde mit SacII und XbaI verdaut und in pCMVp27CITEtk eingefügt, um das entsprechende Fragment zu ersetzten. Die Integrität der Sequenzen wurde durch Sequenzieren bestätigt.
Eine Fusion zwischen dem N-terminalen Teil der kodierenden Region des p27 und der Sequenzen, die die Thymidinkinase kodieren, wurde durch entfernen des SacII-NcoI Fragments von pCMVp27citetk erzeugt, was das Plasmid pCMVp27SNtk ergibt. In ähnlicher Weise wurden pCMVp27SFtk und pCMVp27NFtk durch Entfernen der SacII-FspI beziehungsweise NarI-FspI Fragmente von pCMVp27tk konstruiert.
Einfügen des N-terminalen Teils von p21 stromabwärts der Cyclin-cdk2 Bindungsdomäne von p27 wurde durch Ligieren eines NcoI-HindIII Fragments von Plasmid VR1012-p21N zwischen die SacII und FspI Stellen von pCMVp27tk ausgeführt, was zu dem plasmid pCMVp27Sp21Ftk führt. VR1012-p21N enthält eine Kopie der Sequenzen, die für die ersten 75 Aminosäuren von p21 kodieren. In ähnlicher Weise wurde pCMVp27Np21Ftk durch Einfügen des gleichen NcoI-HindIII Fragments zwischen die NarI und FspI Stellen von pCMVp27tk konstruiert.
2. Transfektionen von 293 Zellen und FACS-Analyse
293 Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagles's Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt war, bei 37°C und 5% CO₂ gezüchtet. Die am vorherigen Tag in 10-cm Durchmesser Kulturschalen ausgesäten Zellen (2 × 10⁶), wurden mit 15 mg Plasmid DNA unter Verwendung des CaPO₄ Verfahrens, wie vorstehend beschrieben, transfiziert. Für eine Zellzyklus-Analyse wurden 293 Zellen gewöhnlich mit 3 μg eines CD2 exprimierenden Plasmids von 12 mg eines Zellzyklushemmstoff exprimierenden Plasmids transfiziert.
Einen Tag nach der Transfektion wurden die Zellen von der Gewebekulturschale mit 2 mM EDTA enthaltendem PBS abgelöst. Zellcluster wurden durch einige Male Ein- und Auspipettieren der Zellsuspension getrennt und 10⁶ Zellen wurden auf eine Schale mit einem Durchmesser von 15 cm erneut ausgesät. Am folgenden Tag wurden die Zellen geerntet und durch Durchflusszytometrie, wie vorstehend beschrieben (Shmid et al., 1991) gleichzeitig auf Zelloberflächen CD2 und DNA-Gehalt getestet. In Kürze, 10⁶ Zellen wurden mit 50 ml eines anti-CD2 Hybridomüberstandes der Maus (ATCC No HB222) für 20 Min. auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden anschließend zweimal mit 1 ml PBS-2% fötalem Kälberserum gewaschen und mit 0,2 mg Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) konjugiertem Anti-Maus Immunglobulin vom Schaf in 50 ml von PBS-2% fötalem Kälberserum für 20 Min. auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden mit 1 ml PBS-2% fötalem Kälberserum gewaschen und in 0,25% Paraformalhehyd-PBS für eine Std. auf Eis fixiert. Die fixierten Zellen wurden mit 0,2% Tween 20-PBS für 15 Min. bei 37°C permeabilisiert. Die Zellen wurden erneut mit 1 ml PBS-2% fötalem Kälberserum gewaschen und für 1 Stunde bei 37°C in 1 ml PBS, welches 30 mg Propidiumiodid und 2 Einheiten DNAse freie RNAse (Boehringer Mannheim) pro ml enthält, inkubiert. Die Fluoreszenz wurde auf einem FACSCAN (Becton Dickinson) Durchflusszytometer analysiert. Die Daten stellen mindestens 10,000 Ereignisse dar, die Zellen mit den höchsten CD2-Mengen entsprechen. Die DNA-Profile wurden unter Verwendung der ModFit-Software (Verity Software House, Inc. Analysiert.
3. Zuschauer-Assay
Renca-Zellen wurden in RPMI-Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt war bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden in Schalen mit einem Durchmesser von 10 cm gezüchtet, bis diese 90% Konfluenz erreichten und dann mit 25 mg DNA transfiziert, die mit 100 mg Lipfectamin (Gibco BRL) kompexiert waren. Für die Zuschauer- Experimente wurden die Renca-Zellen gewöhnlich mit 5 mg eines CD2-exprimierenden Plasmids und 30 mg eines tk-exprimierenden Plasmids transfiziert.
Ein Tag nach der Transfektion wurden die Zellen geentert und mit ansteigenden Mengen nicht-transfizierter Zellen verdünnt. 10⁴ Zellen pro Vertiefung wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausgebracht wurden und für 6 Stunden bei 37°C inkubiert, um eine Adhärenz der Zellen an die Platte zu ermöglichen. Die Medien wurden dann durch frische Medien ersetzt, die 5 mM BCV enthielten. Die Züchtung wurde am Tag 5 eingestellt und die Zell-prolifertaion wurde unter Verwendung eines colorimetrischen Assays bestimmt. Um Transfektion-Effinzienzen zu bestimmen wurden 0,5 10⁶ Zellen in einer Kulturschale mit einem Durchmesser von 10 cm ausgebracht und für einen weiteren Tag bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann geerntet und mittels FACS auf CD2-Expression, wie vorstehend beschrieben, analysiert.
Ergebnisse
1. Überexpression von p27 arretiert verschiedene Zelllinien stärker als p21, p16 oder Vpr
Vier Cyclin-abhängige Kinaseinhibitoren (p21, p27, p16 und Vpr) wurden in 293-Zellen, einer mit Adenovirus transformierten, embryonischen Nieren-Zelllinie untersucht. Vektoren, die p21, p27, p16, VPr oder hAP unter der Steuerung des CMV-Enhancer/Promotors exprimieren, wurden in 293-Zellen zusammen mit einem Cd2-exprimierenden Plasmid transfiziert. Alle Inhibitoren wurden unter der Steuerung des CMV-Promotors exprimiert, um vergleichbare mRNA-Mengen aus allen Konstrukten zu erhalten. Nach 2 Tagen Expression wurden die Zellen geerntet und gleichzeitig mit einem ant-CD2-Antikörper und Propidiumiodid gefärbt. Nach Cotransfektion dieser Plasmide mit einem anderen Vektor, der den Zelloberflächenmarker CD2 (CMV-CD2) exprimiert, wurden die Zellen mittels Strömungszytometrie sortiert und auf deren DNA-Inhalt untersucht.
In mit p21- und p27-transfizierten 293-Zellen betrug der Anteil der Zellen in der G1-Phase 58% bzw. 76%, im Vergleich zu 27% für die Kontrolle.
2. Optimierung von p27-vermitteltem G1-Arrest
Ein Vektor, der p27 und TK exprimiert, wurde konstruiert. Beide codierenden Sequenzen wurden in eine einzige Transkriptionseinheit inseriert, um die Grösse des Vektors zu reduzieren und einen Wettbewerb zwischen zwei benachbarten Promotoren zu verhindern. Ein Vektor kleiner Größe ist in der Tat ein wichtiges Merkmal für einen optimale Gentransfer, insbesondere wenn dieser in gegenwärtig verwendete adenovirale Vektoren überführt werden muss, die eine Kapazität von 4,5 kbp aufweisen, wenn lediglich die E1-Region entfernt wurde. p27 wurde stromabwärts des CMV-Promotors inseriert, gefolgt von einer internen Encephalomyocarditis-Virus (EMCV) Ribosomen-Eintrittsstelle (CITE), der codierenden tk-Sequenz und einem Polyadenylierungssignal aus dem bovinem Wachstumshormon-Gen, was CMVp27CITETK ergibt.
Um die Fähigkeit dieses Vektors zur Arretierung des Zellzyklus in G1 zu untersuchen, wurden 293-Zellen mit einem Gemisch von CMVp27CITETK und CMVCD2 als eine interne Kontrolle transfiziert. Zwei Tage nach Transfektion wurden die Zellen gleichzeitig auf DNA-Gehalt und CD2-Expression analysiert. Alle Plasmide wurden mit ähnlichen Effizienzen transfiziert, da die prozentualen Anteile CD2-exprimierender Zellen für alle Proben vergleichbar waren.
Eine Mutation der cdc2 Kinase-Konsensusstelle TPKK (SEQ ID NO:6) in GGAA (SEQ ID NO:7) erhöhte die p27-Aktivität moderat. Interne Deletionen innerhalb der p27 kodierenden Region erhöhte die p27-Aktivität ebenfalls. Eine Fusion der N-terminalen Domänen von p21 und p27 erhöhten den Zellzyklusarrest in G1 nicht.
BEISPIEL 2
Um zu bestimmen, ob eine CKI-Expression mit einer Arterienreparatur einhergeht, wurden an normalen und verletzten Schweinearterien Western-Blot-Analysen ausgeführt. Eine Verletzung einer Schweinearterie stellt ein gut untersuchtes Tiermodel einer menschlichen Gefäßerkrankung dar, in dem folgend auf Gefäßverletzung die Proliferation glatter Muskelzellen der Intima nach 1–2 Tagen beginnt, schnell ansteigt und bei 15–18% der Intimazellen an Tag 7 gipfelt und auf 1–2% nach 14 Tagen abfällt.
Es wurden Femoralarterien des Schweins mit einem Ballonkatheter (Bard, C.R. Billerica, MA) bei einem Druck von 500 mm Hg für 5 Minuten verletzt und am Tag 1, 4, 7, 14, 21 und 60 nach Verletzung isoliert. Unverletzte Femoralarterien des Schweins und Koronararteien des Schweins wurden ebenfalls isoliert. Die Probenanzahl betrug zwischen 2 bis 4 für die unterschiedlichen Zeitpunkte. Unverletzte menschliche Koronararterien wurden von sich einer Herztransplantation unterziehenden Patienten erhalten. Es wurden acht Proben mit einer diffusen Intimaverdickung, sieben Proben mit beginnender Atherosklerose und zwanzig Proben mit fortgeschrittener Atherosklerose erhalten. Alle Proben wurden in Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, auf Polylysin beschichteten Objektträgern angeordnet, Paraffin mit drei Wechseln von Xylen entzogen und rehydriert in 100%, 95% und 75% Ethylalkohol.
Immunhistochemische Untersuchungen wurden mit Antikörpern gegen p27 (1:100 Verdünnung, monoklonaler Antikörper der Maus, Pharmingen), p21 (1:500 Verdünnung, polyklonale Antikörper des Kaninchens, Santa Cruz), p16 (1:5000 Verdünnung, polyklonaler Antikörper des Kaninchens, Santa Cruz), α-Aktin des glatten Muskels (1:500 Verdünnung, monoklonaler Antikörper der Maus, Boehringer), CD68 (1:100 Verdünnung, monoklonaler Antikörper der Maus, DAKO) ausgeführt. Die Objektträger wurden in 0,3% Wasserstoffperoxid für 30 Minuten inkubiert bis die endogene Peroxidaseaktivität verbraucht war. Primäre Antikörper wurden in PBS mit 1% BSA verdünnt und auf die Objektträger für 12 Stunden bei 4°C aufgetragen. Nach verschiedenen Waschschritten wurde ein sekundäres biotinyliertes Pferd Anti-Maus IgG oder Pferd Anti-Kaninchen IgG (1:400 Verdünnung, ZYMED) auf die Objektträger für 30 Minuten bei Raumtemperatur aufgetragen. Die Proben wurden mit einem alkalische Phosphatase-Reagenz (Vector Laboratories) für 30 Minuten bei Raumtemperatur entwickelt, was zu einem roten Reaktionsprodukt führt und eine Gegenfärbung mit Methylgrün erfolgt.
L293 Zellen wurden durch das Calciumphosphat-Verfahren mit RcCMVp 16, RcCMVp21, RcCMVp27, RcCMVβ-Galactosidase oder RcCMV Kontroll-Plasmid transfiziert. Die Zellen wurden 48 Stunden nach Transfektion in PBS gewaschen und die Pellets wurden für die Immunhistochemie vorbereitet. Die Antikörper gegen p27, p21 und p16 wurden an mit der entsprechenden cDNA transfizierten Zellen als auch an Zellen getestet, die mit dem Kontroll-Plasmid transfiziert waren. Färben von Zellen, die mit der entsprechenden cDNA transfiziert waren, war vergleichbar zu der Transfektionseffizienz, die durch die β-Galactosidase-Expression bestimmt war, wohingegen mit Kontroll-Plasmid transfizierte Zellen nicht angefärbt wurden. Maus IgG wurde für die monoklonalen Antikörper und Kaninchenserum für die polyklonalen Antikörper als Negativ-Kontrolle verwendet. Diese primären Kontroll-Antikörper färbten weder transfizierte Zellen noch Arterienproben. Die Antikörper wurden mit einem Lysat von L293 Zellen prä-absorbiert, die mit einer der Cyclin abhängigen Kinase-Hemmstoff cDNAs oder dem Kontroll-Plasmid transfiziert waren. Die positiven Lysate heben die Anfärbung von transfizierten Zellen und Arterienproben durch entsprechenden Antikörper auf, während das Kontroll-Lysat diese Wirkung nicht aufweist.
Eine gut gekennzeichnete Arterienprobe aus vorherigen Untersuchungen diente als Positiv-Kontrolle für den Antikörper gegen α-Aktin des glatten Muskels und menschliche Mandel für CD68 Antikörper. Eine immunhistochemische Doppelfärbung für Cyclin abhängige Kinase-Hemmstoffe plus α-Aktin des glatten Muskels oder Cyclin abhängige Kinase-Hemmstoffe plus CD68 wurde entsprechend des Protokolls der Vector Laboratories ausgeführt. Es wurde ein rotes Reaktionsprodukt für p21 und p27, ein blaues Reaktionsprodukt für α-Aktin des glatten Muskels und CD68 gewählt, wobei die Gegenfärbung mit Methylgrün für die Einzelmarkierungsuntersuchungen ausgeführt wurde.
Die Expression von p16, p21 und p27 wurde für die Intima, die Mittelschicht und die Adventitia getrennt quantifiziert. Es wurde ein Durchschnittswert für jeden Zeitpunkt bestimmt, indem die/der für die einzelnen Proben erhaltene/n Punktzahl beziehungsweise Score addiert und durch die Summe der Probenanzahl geteilt wurden. Intima- und Mittelschicht-Bereiche wurden durch digitale Planimetrie (Image One System, Universal Imaging, West Chester, PA) erfasst, wobei die Verhältnisse Intima- zu Mittelschicht berechnet wurden.
Es wurde ein Western-Blot von Schweinezelllinien normaler und verletzter Arterien ausgeführt. Die Neointima war nach 21 Tagen vollständig ausgebildet. In ruhenden Arterien wurde eine konstitutive p27 Expression festgestellt, Expression war am Tag 1 vermindert, während eine p27-Expression 7 Tage später beobachtet wurde, die nach 21 Tagen anstieg. Es wurde der p27 exprimierende Zeitverlauf und der Zell-Typ durch Immunhistochemie untersucht. Verglichen mit der p21-Expression war p27 in Zellen des glatten Muskels einer normalen Arterienintima und Mittelschicht und in der Adventitia exprimiert. Nach Verletzung wurde in < 1% dieser Zellen p27 festgestellt und blieb bis nach 7 Tagen niedrig, als Expression in sich entwickelnder Neointima festgestellt wurde. War die Neointima vollständig ausgebildet (21 Tage), dann war die p27 Expression in den unteren Regionen der Intima, benachbart zu der Lamina elastica interna, ausgeprägt.
Die Expression von Cyclin abhängigen Kinase-Hemmstoffen wurde ebenfalls nach Arterienverletzung erfasst. In unverletzten Arterien war p27 auf hohem Niveau, 7 Tage nach Verletzung auf niedrigem Niveau und an Tag 21 nach Verletzung erneut auf einem hohen Niveau exprimiert. Die Expression von p21 variierte während dieser Zeit geringfügig. Die Expression von p16 konnte in unverletzten Arterien nicht festgestellt werden,, war nach 4 Tagen Verletzung vorhanden und war zu späteren Zeitpunkten nicht mehr vorhanden.
p27 wurde in ruhenden Arterien und von Tag 21 nach Verletzung an auf hohem Niveau exprimiert, wohingegen die Expression während der ersten 14 Tage nach Verletzung merklich abnahm. p21 wurde in ruhenden Arterien exprimiert, wobei die Expression nach der Verletzung nicht beachtlich variierte. p16 konnte abgesehen von Tag 1 und 4 nach Verletzung nicht festgestellt werden. Ähnliche Änderungen bei der Expression wurden für die Intima und für die Mittelschicht beobachtet.
Im Gegensatz zu p21 war p27 Protein in allen Arterienschichten 60 Tage später, einem Zeitpunkt markant, als der Reparaturprozess vollendet war. Die Expression von p27 war mit der Zellvermehrung umgekehrt korreliert, die vorhergehend durch BrdC-Einbau bestimmt wurde. In Gegensatz wurde eine p16 Expression in ruhenden oder verletzen Arterien weder durch Western-Analyse noch Immunhistochemie festgestellt.
Beispiel 3
Die Infektion von VSMC durch rekombinanten Adenovirus wurde untersucht.
Es wurden VSMC vom Schwein und dem Menschen und HeLa-Zellen mit dem β-Galactosidase-Adenovirus mit einer Infektionsmultiplizität von 300 pfu/Zelle infiziert. Es wurden lediglich 12 ± 3% Schweine und 10 ± 2% menschlicher VSMC positiv auf β-Galactosidase gefärbt. Dieser Prozentsatz stieg auf 40 ± 4% für Schweine und auf 35 ± 4% für menschliche VSMC bei einer Infektionsmultiplizität von 1500 pfu/Zelle.
Dagegen waren 92 ± 1% der HeLa-Zellen positiv für β-Galactosidase bei einer Infektionsmultiplizität von 300 pfu/Zelle und bei 1500 pfu/Zelle alle der Zellen. In ähnlicher Weise waren 76 ± 3% der A549 Zellen positiv bei einer Infektionsmultiplizität von 300 pfu/Zelle und bei 1500 pfu/Zelle alle der Zellen. Es waren sehr hohe Infektionsmultiplizitäten für eine effektive Infektion von VSMC (95 ± 2% Schweinezellen und 95 ± 1% menschlicher Zellen positiv für β-Galactosidase bei einer Infektionsmultiplizität von 15000 pfu/Zelle) notwendig.
Beispiel 4
Es wurden die Wirkungen von p27, p21 und p16 bei der VSMC-Vermehrung in vitro untersucht. Adenovirus-Vektoren, die p27, p21 und p16 kodieren, wurden konstruiert und die Wirkungen einer CKI-Expression auf das VSMC Wachstum untersucht. Es wurden Kontrollexperimente ausgeführt, wobei einem Adenovirus-Vektor, dem ein Insert in der E1 Region (ADV ΔE1) fehlt und mit keinem Virus.
Wirkung von Cyclin abhängigen Kinase-Hemmstoffen auf die Vermehrung von vaskulären Zellen des glatten Muskels der Schweineaorta. Es wurden 10.000 Zellen pro Gruppe mit p16, p21 oder p27 Adenovirus bei einer Infektionsmultiplizität von 5000 pfu/Zelle (rechte Tafel) oder 10000 pfu/Zelle (linke Tafel) infiziert. Zellen, die mit Kontrollvirus (ΔE1) infiziert waren dienten wie nicht infizierte Zellen als Negativ-Kontrolle. Die Zellzahl wurden alle zwei Tage bis zu 8 Tagen unter Verwendung eines Hämozytometers bestimmt.
Die cDNAs für menschliches p27, p21 und p16 wurden in das RcCMV (Invitrogen) Plasmid ligiert und durch das Dideoxy-Kettenabbruch-Verfahren sequenziert. Es wurden durch Cotransfektion verkürzter viraler DNA (Ad5 sub360) und eines Plasmids, das eine der cDNAs aufweist, die durch Adenovirus-Karteneinheit 0–1 für virale Propagierung als auch Karteneinheit 9–16 für eine homologe Rekombination flankiert wird, rekombinante Adenoviren konstruiert. Die so erhaltenen Adenoviren wiesen eine Deletion in der E1 und E3 Region auf und enthielten eine der cDNAs unter der Kontrolle des Cytomegalo-Virus-Promotors und der Polyadenylierungsstelle des Wachstumshormons vom Rind. Es wurden einzelne Plaques isoliert und rekombinante Viren wurden mindestens zwei Runden einer Plaque-Reinigung unterzogen. Die Viren wurden in einem doppel-bandigen Cäsiumchlorid-Gradienten gereinigt und auf die Anwesenheit des Transgens durch Southern-Blot-Analyse, Western-Blot-Analyse und die Hemmung der Vermehrung mehrerer Zelllinien analysiert. Auf identische Weise wurde ein β-Galactosidase exprimierender Virus und ein Virus gereinigt, das in E1 deletiert ist, dem jedoch ein Transgen (ΔE1) fehlt. Der Titer gereinigter Viren wurde durch einen Plaque-Assay an 293 Zellen unter Verwendung einer Absorptionszeit von 24 Stunden bestimmt, wobei die Anzahl der Plaques 12 Tage nach Infektion gezählt wurden. Die Titer aller Präparationen reichten von 5 × 10¹¹ bis 2 × 10¹¹ pfu/ml. Der Titer des Virus vom Wild-Typ in den gereinigten Präparationen wurde durch Plaque-Assay an A549 Zellen unter Verwendung der gleichen Bedingungen wie für 293 Zellen bestimmt und betrug für alle Präparationen unter 1 in 10⁹ pfu.
Vaskuläre Zellen des glatten Muskels der Schweineaorta wurden durch das Explantatverfahren isoliert und in DMEM, ergänzt mit 20% FCS, aufrechterhalten, beziehungsweise gepflegt. Vaskuläre Zellen des glatten Muskels der menschlichen Aorta wurden von Clonetics erhalten und in M199, ergänzt mit 20% FCS, gezüchtet. Vaskuläre Zellen des glatten Muskels (VSMC) wurden für die Experimente zwischen Passagenanzahl 2 und 10 verwendet. Die 293 Zellen, die A549 Zellen und HeLa-zellen wurden von ATCC erhalten und wie empfohlen gezüchtet. Die Infizierbarkeit von A54 Zellen, HeLa-Zellen und VSMC wurde unter Verwendung des β-Galactosidase-Adenovirus mit zunehmender Infektionsmultiplizität (MOI), die von 300 bis 15000 pfu/Zelle reicht, analysiert. Die β-Galactosidase-Expression wurde 24 Stunden nach Infektion durch Fixieren der Zellen in 1,25% Glutaraldehyd und Färben mit X-Gal für 1 Std. bei 37°C analysiert. Der Prozentsatz infizierter Zellen wurde durch Zählen der gefärbten Zellen als auch der Gesamtzahl der Zellen auf 5 zufälligen Mikroskopfeldern bei einer 200 × Vergrößerung bestimmt. Zellen, die mit ΔE1 Virus infiziert sind als auch nicht infizierte Zellen wurden als Negativ-Kontrollen für alle diese Experimente verwendet.
Um zu bestimmen in welcher Phase des Zellzyklus der Wachstumsarrest stattfand, wurden p27, p21 oder p16 überexprimierende glatte Muskelzellen mit Propidiumiodid gefärbt und durch Durchflusszytometrie analysiert. Eine Überexpression von p27 und p21 folgend auf Transduktion und Erhaltung in 20% FCS führte zu einer Hemmung des Zellwachstums. Dagegen erzeugte eine Überexpression von p16 eine teilweise Hemmung der Vermehrung des glatten Muskels. Es lag eine äquivalente Expression der CKIs vor, so dass Unterschiede bei der Wachstumshemmung qualitativ, nicht quantitativ, waren.
BEISPIEL 5
Die Wirkung von Cyclin abhängigen Kinase-Hemmstoffen auf die Zellzyklusaufteilung von vaskulären Zellen des glatten Muskels der Schweineaorta wurde untersucht. Die Zellen wurden mit p16 oder p21 oder p27 Adenovirus mit einer Infektionsmultiplizität von 5.000 pfu/Zelle oder 10.000 pfu/Zelle infiziert. Die mit Kontrollvirus (ΔE1) infizierten Zellen sowie auch nicht infizierte Zellen dienten als Negativ-Kontrolle. Die Zellzyklusaufteilung wurde 48 Stunden nach Infektion durch Färben mit Propidiumiodid bestimmt.
Für eine Analyse der Proliferation wurden VSMC mit einer Dichte von 10.000 Zellen pro 35-mm Schale ausgesät und für 24 Stunden gezüchtet, bevor sie Adeno virus mit einer Infektionsmultiplizität von 5.000 oder 10.000 pfu/Zelle infiziert wurden. Die Zellen wurden auf Infektion in dem normalen Medium gehalten und die Zellzahl wurde alle zwei Tage bis zu 8 Tagen unter Verwendung eines Hämozytometers bestimmt. Um die Zellzyklusaufteilung und Zellgröße zu untersuchen, wurden VSMC mit einer Dichte von 250.000 Zellen pro 15-cm Schale ausgesät und für 24 Stunden gezüchtet, bevor sie mit einer Infektionsmultiplizität von 5000 oder 10000 pfu/Zelle mit Adenovirus infiziert wurden. Die Zellen wurden 24 Std. nach Infektion in einem Verhältnis von 1:2 aufgeteilt und für zusätzliche 24 Std. gezüchtet, was zu einer 40 bis 60% Konfluenz zu dem Zeitpunkt der Analyse führte. Die Zellzyklusaufteilung wurde nach Fixierung in 2% Paraformaldehyd, Permeabilisierung in 0,2% Tween-20, Färben mit Propidiumiodid mit einer Endkonzentration von 30 μg/ml und Analyse des DNA-Gehalts bei einer Anregung mit 493 nm unter Verwendung eines Durchflusszytometers (FACscan, Becton Dickinson) untersucht. Die Zellgröße wurde durch das Durchflusszytometer unter Verwendung der Vorwärts-Winkelstreuung (forward angle scatter) bestimmt, wobei arithmetische als auch geometrische Mittelwerte mit der Zytometer-Software (CELLQuest, Becton Dickinson) berechnet wurden. Als Negativ-Kontrollen für alle diese Experimente dieses Beispiels wurde mit ΔE1 Virus infizierte Zellen als auch nicht infizierte Zellen verwendet.
Eine Überexpression von p27, p21 und p16 förderte verglichen zu nicht transduzierten Zellen oder Zellen, die mit ADV-ΔE1 Vektoren transduziert waren, einen G1-Arrest. Die Zellgröße, die durch durchflusszytometrische Analyse der Zellgröße bestimmt wurde, war verglichen mit Kontrollzellen bei p27, p21 und p16 transduzierten Zellen größer.
Beispiel 6
Es wurde die Wirkung von Wachstumsfaktoren auf die Zellzyklusaufteilung von VSMC des Schweins untersucht. Es wurden die in Beispiel 5 beschrieben Zellen in der Gegenwart von Rinderserumalbumin oder fötalem Kälberserum gezüchtet. Wurden Zellen in der Gegenwart von 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) gezüchtet, dann wurde die Population in G1 arretiert. In der Gegenwart von 20% fötalem Kälberserum (FCS) vermehrten sich die Zellen, was durch dir höhere Anzahl der Zellen in den S und G2/M Phasen zeigte.
Beispiel 7
Es wurde die Wirkung von Wachstumsfaktoren auf den p27 Proteinpegel und funktionelle Konsequenzen untersucht. Die in der Gegenwart von 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) (linke Tafel) gezüchteten primären VSMC wurden in der G1-Phase arretiert. In Gegenwart von 20% fötalem Kälberserum (FCS) wurden die VSMC dazu angeregt, sich zu vermehren, wobei die Anzahl von in G1/S Phase arretierten Zellen wesentlich abgenommen hatte. Primäre VSMC der Schweineaorta wurden durch ein Explanations- beziehungsweise Explantatverfahren (Ohno et al., Science 265 (1994), 781) isoliert und in 20% FCS enthaltendem M199 gehalten. Die VSMC wurden 24 Stunden vor der Zellzyklusanalyse in M199 mit 0,2% BSA oder DMEM mit 20% FCS übertragen. Zur Analyse des Zellzyklus wurden die Zellen 24 Stunden später geerntet, zweimal in Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen, und in 2% Paraformaldehyd für 60 Min. fixiert und in 0,2% Tween-20 permeabilisiert. Die Zellen wurden mit 1 Einheit DNAse freier RNAse in 1 ml PBS für 30 Min. bei 37°C behandelt, in 0,03 mg/ml Propidiumiodid-Lösung resuspendiert und durch Durchflusszytometrie unter Verwendung eines FACScan-Models (Becton Dickinson) analysiert.
Der p27 Proteinpegel war, wie durch die Western-Blot-Analyse bestimmt, in der Gegenwart von 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) höher als bei fötalem Kälberserum (FCS), was eine umgekehrte Beziehung des p27 Proteinpegels und der Wachstumsfaktorkonzentration anzeigt. Dagegen änderte sich der cdk2-Proteinpegel in der Gegenwart von FCS, wie durch Western-Blot-Analyse bestimmt, nicht viel. p27 in Verbindung mit cdk2 Kinase wurde auf ähnliche Weise geändert wie der gesamte p27 Pegel in der Gegenwart von BSA gegenüber FCS. Übereinstimmend mit dieser Beobachtung war die cdk2 Kinase-Aktivität verglichen mit FCS bei BSA geringer.
Beispiel 8
Das Expressionsmuster von p27, p21 und p16 in menschlichen Blutgefäßen wurde untersucht, um zu bestimmen, ob dieses CKI-Model eines Zellwachstumsarrests vaskulärer glatter Muskulatur auf Gefäßerkrankung des Menschen anwendbar ist.
Es wurden von Herzen, die von 25 Patienten (18 Männern, 7 Frauen, Alter 21–67) entfernt wurden, welche sich einer Herztransplantation unterzogen, vierzig Proben von Aorten und Koronararterien erhalten. Diese Segmente wurden durch klassische histologische Kriterien in drei Gruppen klassifiziert: diffuse Intima-Hyperplasie, welche für alternde menschliche Arterien ohne klinisches oder morphologisches Anzeichen von Atherosklerose kennzeichnend ist; frühe Atherosklerose, die durch eine gewisse Lipidablagerung und fokale Nekrose gekennzeichnet ist und fortgeschrittene Atherosklerose, die durch eine fibröse Kappe, einen nekrotischen Kern, Lipidablagerung, fokale Nekrose und Calcifizierung gekennzeichnet ist. Die Gewebe wurden für eine Western-Blot-Analyse in flüssigem Stickstoff Schnappgefroren und bei –70°C gelagert, oder in 10% gepuffertem Formalin für 4 Stunden fixiert, gefolgt durch 70% Ethanol für 18 Stunden und Parafineinbettung. Schnitte (6 μm dick) wurden auf Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgern angeordnet und eine Immunfärbung wurde ausgeführt. Sowohl p27 als auch p21 wurden in allen Stadien der Atherogenese exprimiert, wohingegen p16 in keiner der proben festgestellt werden konnte.
Atherosklerotische Koronararterien des Menschen wurden mit Anti-p27 oder Anti-p21 Antikörpern und einem Zellmarker des glatten Muskels, α-Aktiv doppelt markiert, wobei eine p27 und p21 Expression in der Intima mit glatten Muskelzellen colokalisiert ist. Eine Immunfärbung mit Doppelmarkierung wurde mit p27 und p21 Antikörpern und einem Zellmarker des glatten Muskels, α-Aktiv, unter Verwendung von Standardverfahren ausgeführt. Für p21 und p27 wurde ein rotes Reaktionsprodukt, für α-Aktiv des glatten Muskels wurde ein blaues Reaktionsprodukt gewählt und es wurde eine Gegenfärbung mit Methylgrün ausgeführt. α-Aktiv positive glatte Muskelzellen (blau) exprimieren p21 (rot) als auch p27 (rot).
P27 als auch p21 lagen in der Intima, der Mittelschicht und der Adventitia vor, wohingegen p16 in diesen Arterien nicht festgestellt werden konnte. Die Expression von p27 und p21 war in Arterien mit diffuser Intima-Hyperplasie als auch in atherosklerotischen Proben vorhanden. Die Expression von p27 und p21 war mit α-Aktiv positiven Zellen und CD68 positiven Zellen assoziiert, was deren Identität als Zellen des Glatten Muskels und Makrophagen bestätigt. Diese CKIs waren mit Zellen assoziiert, die den Zellvermehrungsmarker Ki67 exprimieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass p27 und p21 in menschlichen Arterien mit diffuser Intima-Hyperplasie als auch während der Atherogenese exprimiert werden. Dagegen scheint p16 auf sehr niedrigem Niveau exprimiert zu werden.
Tabelle 1 – Expression von p27 in Koronararterien des Menschen
Beispiel 9
Das Expressionsmuster von p27, p21 und p16 wurde in menschlichen Koronararterien mit diffuser Intima-Verdickung, beginnender Atherogenese und fortgeschrittener Atherogenese untersucht.
Ein Durchgang durch G1 des Zellzyklus und Eintritt in die S Phase erfordert die Bindung und Aktivierung von Cyclin/Cyclin abhängigen Kinase (CDK)-Komplexen, hauptsächlich von Cyclin D-cdk4 und Cyclin E-cdk2. Die Cyclin abhängigen Kinase-Hemmstoffe (CKIs) p27 und p21 hemmen die Cyclin-cdk-Aktivität, was zu einem G1/S Wachstums-Arrest führt. Um zu bestimmen welche Expression dieser CKIs eine VSMC Vermehrung hemmt, wurden Schweine VSMC mit adenoviralen Vektoren transfiziert, die p27, p21 oder p16 oder ein Kontrollvirus AdΔE1 exprimieren. Die Expression von p27 und p21 führte verglichen zu AdΔE1 transfizierten Zellen (p < 0,01) zu einer vollständigen Hemmung der VSMC Proliferation, wohingegen die p16 Expression eine teilweise Hemmung des VSMC Wachstums (63%) verglichen zu Kontrollen hervorruft. Eine Färbung mit Propidiumiodid und FACS-Analyse zeigten einen G1-Arrest. Kinase-Assays und Untersuchungen mit Hilfe einer Immunpräzipitation zeigten eine Hemmung der cdk2 Aktivität durch p27 und p21 jedoch nicht durch p16. Um die Wirkungen einer CKI Expression in vivo zu untersuchen, wurde ein adenoviraler Gentransfer von p27 und p16 in mit einem Ballon verletzten Schweinearterien ausgeführt. Sieben Tage nach dem Gentransfer war die VSMC Vermehrung der Intima verglichen mit p16 und AdΔE1 Kontrollarterien (p < 0,05) in den p27 Arterien verringert. Diese Verringerung der Proliferation war mit einer Hemmung eines Intimabereichs in p27 Arterien (0,5 ± 0,06 mm²) verglichen mit p16 (1,13 ± 0,09 mm²) und AdΔE1 Kontrollarterien (0,98 ± 0,8 mm²) (p < 0,5). Daher regulieren KIP/CIP CKIs p27 und p21 verglichen zu dem INK CKI p16 die VSMC Vermehrung negativ. Diese Untersuchungen legen KIP/CIP und INK CKIs unterschiedliche Rollen bei der Regulierung des G1-Arrests beim Zellzyklus in VSMC nahe.

Claims

Verwendung eines ersten Gens, das p27 kodiert, und eines zweiten Gens, das ein zweites Polypeptid kodiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer vaskulären proliferativen Erkrankung oder zur Hemmung von Zellwachstum der glatten Muskulatur der Intima in einem Patienten, der es benötigt, wobei das zweite Polypeptid direkt oder indirekt Transkription in eukaryotischen Zellen aktiviert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei p27 und das zweite Polypeptid ein Fusionsprotein bilden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–2, wobei das p27 Mutationen enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, wobei das zweite Polypeptid eine Thymidin-Kinase ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das erste und zweite Gen in einem Expressionsvektor enthalten sind.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Expressionsvektor ein eukaryotischer oder viraler Vektor ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei der virale Vektor ein adenoviraler Vektor ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der adenovirale Vektor replikationsdefizient ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–8, wobei das erste Gen und das zweite Gen in einem Liposom eingeschlossen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6–9, wobei das erste Gen und das zweite Gen in einem viralen Vektor enthalten sind, und der virale Vektor ungefähr 10⁶ bis 10¹¹ PFU/ml von zu verabreichendem viralen Vektor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–10, wobei die vaskuläre proliferative Erkrankung Restenose ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–10, wobei die vaskuläre proliferative Erkrankung Arteriosklerose ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–10, wobei die vaskuläre proliferative Erkrankung Angiogenese ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–13, wobei der Patient ein Mensch ist.
Fusionsprotein, bei dem p27 funktionsfähig mit einem zweiten Polypeptid verbunden ist, worin das zweite Polypeptid direkt oder indirekt Transkription in eukaryotischen Zellen aktiviert.
Fusionsprotein nach Anspruch 15, worin das zweite Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Thymidin-Kinase, β-Galactosidase, p16, p21, p57, Retinoblastom-Gen-Produkt oder dessen Mutanten, Cytosin-Deaminase und Stickoxid-Synthase.
Fusionsprotein nach Anspruch 15 oder 16, worin das zweite Polypeptid eine Thymidin-Kinase ist.