JP2003523722A

JP2003523722A - 抗新生物性組成物およびその使用

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Publication number: JP2003523722A
Application number: JP2000602794A
Authority: JP
Inventors: サリルパテル，; ジェイムズマカーサー，; ジェノギュリス，; マイケルジェイ．メンデス，; ミッチェルフィナー，
Original assignee: セルジェネシスインコーポレイテッド; ジーピーシーバイオテックインコーポレイテッド
Priority date: 1999-03-01
Filing date: 2000-03-01
Publication date: 2003-08-12
Also published as: AU3389700A; CA2362995A1; WO2000052184A9; IL145067A0; EP1157122A1; US6521602B1; WO2000052184A1

Abstract

(57)【要約】キメラＣＤＫｉタンパク質をコードする第一核酸配列、およびアデノウイルスＥ４タンパク質をコードする第二核酸配列から本質的になる核酸組成物が開示される。ここで、第一および第二の核酸配列は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結される。本発明はまた、このような核酸組成物、およびその組成物を用いた新生物を有する動物を処置するための方法に関する。この方法において、導入された細胞が、分泌可能なインターナリゼーション可能形態のキメラＣＤＫｉタンパク質を分泌し、そして分泌可能なインターナリゼーション可能形態のアデノウイルスＥ４タンパク質を分泌する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）本発明は、新生物、特に癌の治療のための治療法に関する。

【０００２】米国において、すべての男性の半数およびすべての女性の三分の一は、かれら
の寿命の間にいくつかの新生物を発生する。例えば、現在、数百万人の米国人が
癌に罹患して生活しているか、またはその疾患が治癒している。癌は、しばしば
致命的であるが、その疾患の迅速な処置は、回復のためのより良好な予後を生じ
る。

【０００３】新生物は、体内における細胞の異常な増殖（ｇｒｏｗｔｈａｎｄｐｒｏｌ
ｉｆｅｒａｔｉｏｎ）によって引き起こされる。正常な身体の細胞は、順序正し
い様式で増殖、分裂、および死滅するが、新生物性細胞は、無秩序な様式で増殖
および分裂する。新生物の間のこのような無秩序な増殖は、細胞周期の異常な調
節不全によって引き起こされ得、細胞の過剰増殖をもたらす（Ｓｈｅｒｒ（１９
９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：１６７２−１６７７）。

【０００４】真核生物細胞において、細胞周期の進行は、機能的に別個のサイクリン依存性
キナーゼ（ＣＤＫ）によって統合される。複合体は、異なる触媒ＣＤＫドメイン
および調節サイクリンサブユニットの会合を介して形成される。ＣＤＫ４／サイ
クリンＤおよびＣＤＫ６／サイクリンＤ複合体は、Ｇ₁期を通して進行を調節す
る；ＣＤＫ２／サイクリンＥキナーゼは、Ｇ₁／Ｓ移行を調節する；ＣＤＫ２／
サイクリンＡ複合体は、Ｓ期を通して細胞を駆動する；そしてＣＤＣ２／サイク
リンＢ複合体は、有糸分裂に入ることおよび有糸分裂の終了を制御する（Ｓｈｅ
ｒｒ（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：１６７２−１６７７）。ＣＤＫの活
性は、種々の細胞外または細胞内シグナルに応答して密接に調節されており、そ
してリン酸化事象およびサイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫｉ）（
Ｍｏｒｇａｎ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ３７４：１３１−１３４）との結合の
組合せを通して媒介される。細胞周期の間の異なるＣＤＫ／サイクリン複合体間
のＣＤＫｉの再分配は、キナーゼ活性の活性化および不活性化のタイミングと協
調する（ＳｈｅｒｒおよびＲｏｂｅｒｔｓ（１９９５）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ
．９：１１４９−１１６３）。

【０００５】構造的に別個のＣＤＫｉの２つのクラスである、ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーお
よびＩＮＫ４ファミリーが、哺乳動物細胞において同定された。ＣＩＰ／ＫＩＰ
ファミリーは、ｐ２１／ＣＩＰ１／ＷＡＦ１、ｐ２７／ＫＩＰ１、およびｐ５７
／ＫＩＰ２を含む（ＳｈｅｒｒおよびＲｏｂｅｒｔｓ、前出）。ＣＩＰ／ＫＩＰ
ファミリーメンバーは、約６０アミノ酸の長さを有するＮ末端領域の保存された
阻害ドメインを共有する。ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーのメンバーは、ＣＤＫ４キ
ナーゼ、ＣＤＫ２キナーゼ、およびＣＤＣ２キナーゼの強力なインヒビターであ
るが、それらのインビボでの過剰発現は、細胞周期のＧ₁期での停止を優勢にも
たらす。ＩＮＫ４ファミリーのメンバーは、ｐ１５／ＩＮＫ４ａ、ｐ１６／ＩＮ
Ｋ４ｂ、ｐ１８／ＩＮＫ４ｃ、およびｐ１９／ＩＮＫ４ｄを含む（Ｓｅｒｒａｎ
ｏら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６６：７０４−７０７；Ｈａｎｎｏｎおよ
びＢｅａｃｈ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３７１：２５７−２６１；Ｈｉｒａｉ
ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：２６７２−２６８１；Ｃｈ
ａｎら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：２６８２−２６８８；
Ｇｕａｎら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．７：５７−７０）。ＩＮ
Ｋ４タンパク質は、ほぼ独占的に共通の構造モチーフの反復である、アンキリン
反復（Ｂｏｒｋ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ１７：３６３−３７４）から構
成され、そしてＣＤＫ４およびＣＤＫ６の関連キナーゼの高度に特異的なインヒ
ビターである。

【０００６】ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーおよびＩＮＫ４ファミリーインヒビターのメンバー
の生化学的な分析は、それらの作用の様式が異なるということを示唆する。ｐ１
６は、ＩＮＫ４ファミリーのプロトタイプ的なメンバーであり、これは、単量体
ＣＤＫ４およびアセンブルされた、完全に活性であるＣＤＫ４／サイクリンＤ１
キナーゼの両方に結合する。ｐ１６のＣＤＫ４への結合は、ＣＤＫ４／サイクリ
ンＤ複合体の形成を妨害するようであるが、アセンブルしたＣＤＫ４／サイクリ
ンＤ複合体へのｐ１６の結合は、触媒的に不活性な３成分複合体を生成する（Ｐ
ａｒｒｙら（１９９５）ＥＭＢＯＪ．１４：５０３−５１１）。ｐ２７は、主
に活性なＣＤＫ２／サイクリンＡ複合体およびＣＤＫ２／サイクリンＥ複合体に
結合し、これは、触媒的に不活性な３成分複合体の形成をもたらす（Ｐｏｌｙａ
ｋら（１９９４）Ｃｅｌｌ７８：１１５６−６６；Ｐｏｌｙａｋら（１９９４
）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．８：９−２２）。

【０００７】細胞周期の進行を阻害するために、個々のＣＤＫｉレベルは、活性なＣＤＫ／
サイクリン複合体の濃度を超えなければならない。細胞増殖の制御は、種々のＣ
ＤＫｉのレベルの調節を通して作用することが示されてきた。例えば、細胞増殖
の停止を誘導する増殖条件下で、ｐ２７の量が増加する（Ｆｉｒｐｏら（１９９
４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：４８８９−４９０１；Ｋａｔｏら（１
９９４）Ｃｅｌｌ７９：４８７−４９６；Ｎｏｕｒｓｅら（１９９４）Ｎａｔ
ｕｒｅ３７２：５７０−５７３、Ｓｌｉｎｇｅｒｌａｎｄら（１９９４）Ｍｏ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：３６８３−３６９４）。細胞が、細胞周期に
再び入るために刺激される場合に、ｐ２７のレベルは、迅速に減少する。同様に
、細胞が老化した場合には、ｐ１６は徐々に増加する（Ａｌｃｏｒｔａら（１９
９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１３７４２−１
３７４７）。

【０００８】多くのヒトの死が新生物に起因するならば、新生物（過形成および癌を含む）
を処置または予防するための有用な方法および組成物を開発する必要性が存在す
る。さらに、いくつかの疾患の表現型において、細胞周期が重要な役割を果たす
ならば、細胞増殖を停止させる試薬は、培養中の細胞の増殖を同期化および制御
することについての細胞周期のさらなる研究を可能にする際に有用である。

【０００９】（発明の要旨）本発明は、新規なキメラサイクリン依存性キナーゼインヒビター（キメラＣＤ
Ｋｉ）を特徴とし、これは、アデノウイルスＥ４タンパク質（またはその活性フ
ラグメント）と合わされる場合に、新生物性細胞の増殖を阻害するのみでなく、
驚くべきことにまた、新生物性細胞においてアポトーシスを誘導する。キメラＣ
ＤＫｉタンパク質であるＷ９を使用して、新生物性細胞のｐ５３、Ｒｂ、ｐ２７
、またはｐ１６の状態にかかわらず、新生物性細胞においてアポトーシスを誘導
した。キメラＣＤＫｉとアデノウイルスＥ４タンパク質との組合せは、大部分の
正常な細胞においてはアポトーシスを誘導せず、むしろ細胞増殖の阻止を誘導す
るのみである。これらの驚くべき発見を利用して、本発明の抗新生物性組成物お
よび方法を提供した。

【００１０】従って、第一の局面において、本発明は、核酸組成物であって、キメラＣＤＫ
ｉタンパク質をコードする第一核酸配列、およびアデノウイルスＥ４タンパク質
をコードする第二核酸配列から本質的になり、ここで、この第一および第二の核
酸配列は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結される、核酸組成物を特
徴とする。このような核酸配列は、細胞において発現され得る。特定の実施形態
において、このキメラＣＤＫｉタンパク質は、Ｗ９タンパク質である。特定の実
施形態においては、このアデノウイルスＥ４タンパク質は、Ｅ４ｏｒｆ６により
コードされる。

【００１１】別の局面において、本発明は、本発明の第一の局面によるキメラＣＤＫｉタン
パク質／アデノウイルスＥ４タンパク質をコードする核酸組成物および薬学的に
受容可能なキャリアを含有する、組成物を特徴とする。１つの実施形態において
、この組成物は、細胞による上記組成物のインターナリゼーションを容易にする
送達系をさらに含有する。好ましくは、この送達系は、組換えウイルス粒子であ
る。別の実施形態において、この組換えウイルス粒子は、アデノウイルス、レン
チウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、および
ワクシニアウイルスからなる群から選択される。好ましくは、この組換えウイル
ス粒子は、アデノウイルス（例えば、Ｅ４領域全体を欠くアデノウイルス）であ
る。別の実施形態において、この送達系は、リポソームである。

【００１２】なお別の局面において、本発明は、核酸組成物であって、分泌可能なインター
ナリゼーション可能形態のキメラＣＤＫｉタンパク質をコードする第一核酸配列
、および分泌可能なインターナリゼーション可能形態のアデノウイルスＥ４タン
パク質をコードする第二核酸配列を含有し、ここで、この第一および第二の核酸
配列は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結される、核酸組成物を特徴
とする。特定の実施形態において、このキメラＣＤＫｉタンパク質は、Ｗ９タン
パク質である。特定の実施形態においては、このアデノウイルスＥ４タンパク質
は、Ｅ４ｏｒｆ６によりコードされる。

【００１３】別の局面において、本発明は、核酸組成物であって、分泌可能なインターナリ
ゼーション可能形態のキメラＣＤＫｉタンパク質をコードする第一核酸配列、お
よび分泌可能なインターナリゼーション可能形態のアデノウイルスＥ４タンパク
質をコードする第二核酸配列を含有する、核酸組成物、ならびに薬学的に受容可
能なキャリアを含有する組成物を特徴とし、ここで、この第一および第二の核酸
配列は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結される。１つの実施形態に
おいて、この組成物は、細胞による上記組成物のインターナリゼーションを容易
にする送達系をさらに含有する。好ましくは、この送達系は、組換えウイルス粒
子である。別の実施形態において、この組換えウイルス粒子は、アデノウイルス
、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、
およびワクシニアウイルスからなる群から選択される。好ましくは、この組換え
ウイルス粒子は、アデノウイルス（例えば、Ｅ４領域全体を欠くアデノウイルス
）である。別の実施形態において、この送達系は、リポソームである。

【００１４】別の局面において、本発明は、精製されたキメラＣＤＫｉタンパク質および精
製されたアデノウイルスＥ４タンパク質を含有する、タンパク質組成物を特徴と
する。特定の実施形態において、このキメラＣＤＫｉタンパク質は、Ｗ９タンパ
ク質である。特定の実施形態においては、このアデノウイルスＥ４タンパク質は
、Ｅ４ｏｒｆ６によりコードされる。

【００１５】別のなお局面において、本発明は、精製されたキメラＣＤＫｉタンパク質およ
び精製されたアデノウイルスＥ４タンパク質を含有するタンパク質組成物ならび
に薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物を特徴とする。１つの実施形
態において、この組成物は、細胞による上記組成物のインターナリゼーションを
容易にする送達系をさらに含有する。

【００１６】なお別の局面において、本発明は、精製されたインターナリゼーション可能形
態のキメラＣＤＫｉタンパク質および精製されたインターナリゼーション可能形
態のアデノウイルスＥ４タンパク質を含有する、タンパク質組成物を特徴とする
。特定の実施形態において、このキメラＣＤＫｉタンパク質は、Ｗ９タンパク質
である。特定の実施形態においては、このアデノウイルスＥ４タンパク質は、Ｅ
４ｏｒｆ６によりコードされる。

【００１７】別の局面において、本発明は、精製されたインターナリゼーション可能形態の
キメラＣＤＫｉタンパク質および精製されたインターナリゼーション可能形態の
アデノウイルスＥ４タンパク質を含有する、タンパク質組成物ならびに薬学的に
受容可能なキャリアを含有する、組成物を特徴とする。

【００１８】なお別の局面において、本発明は、新生物を有する動物を処置するための方法
を特徴とする。この方法は、この動物に、治療有効量の本発明による組成物を投
与する工程を包含する。

【００１９】別の局面において、本発明は、核酸組成物を含む細胞を特徴とし、この核酸組
成物は、分泌可能なインターナリゼーション可能形態のキメラＣＤＫｉタンパク
質をコードする第一核酸配列、および分泌可能なインターナリゼーション可能形
態のアデノウイルスＥ４タンパク質をコードする第二核酸配列を含有し、ここで
、この第一および第二の核酸配列は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連
結される。特定の実施形態において、このキメラＣＤＫｉタンパク質は、Ｗ９タ
ンパク質である。特定の実施形態においては、このアデノウイルスＥ４タンパク
質は、Ｅ４ｏｒｆ６によりコードされる。

【００２０】なお別の局面において、本発明は、新生物を有する動物を処置するための方法
を特徴とし、この方法は、この動物の細胞に、核酸組成物であって、分泌可能な
インターナリゼーション可能形態のキメラＣＤＫｉタンパク質をコードする第一
核酸配列、および分泌可能なインターナリゼーション可能形態のアデノウイルス
Ｅ４タンパク質をコードする第二核酸配列を含有し、ここで、この第一および第
二の核酸配列は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結される、核酸組成
物を導入する工程を包含し、ここで、この導入された細胞は、分泌可能なインタ
ーナリゼーション可能形態のキメラＣＤＫｉタンパク質を分泌し、そして分泌可
能なインターナリゼーション可能形態のアデノウイルスＥ４タンパク質を分泌す
る。

【００２１】最後の局面において、本発明は、新生物を有する動物を処置するための方法を
特徴とし、この方法は、この動物の細胞に、核酸組成物であって、分泌可能なイ
ンターナリゼーション可能形態のＷ９タンパク質をコードする第一核酸配列、お
よび分泌可能なインターナリゼーション可能形態のアデノウイルスＥ４タンパク
質をコードする第二核酸配列を含有し、ここで、この第一および第二の核酸配列
は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結される、核酸組成物を導入する
工程を包含し、ここで、この導入された細胞は、分泌可能なインターナリゼーシ
ョン可能形態のＷ９タンパク質を分泌し、そして分泌可能なインターナリゼーシ
ョン可能形態のアデノウイルスＥ４タンパク質を分泌する。

【００２２】（好ましい実施形態の説明）本明細書中でいわれる特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立
する。本明細書中に引用される、刊行された米国特許、特許査定された出願、公
開された外国出願、および参照（ＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む）は、
各々が参考として援用されることが詳細かつ個別に示されるのと同様に同じ程度
に、本明細書によって参考として援用される。

【００２３】本発明は、新生物性細胞の増殖を阻害し、かつ新生物性細胞におけるアポトー
シスを誘導するための組成物および方法を提供する。「新生物性細胞」によって
、異常な細胞増殖（例えば、細胞増殖の増大）を示す細胞が意味される。新生物
性細胞は、過形成細胞、インビトロでの増殖の接触阻害の欠損を示す細胞、イン
ビボで転移し得ない腫瘍細胞、またはインビボで転移し得る癌細胞であり得る。

【００２４】本発明の組成物および方法は、アデノウイルスＥ４タンパク質と組み合わせら
れる場合に、キメラＣＤＫｉタンパク質（例えば、Ｗ９）が相乗的に作用して、
新生物性細胞において選択的にアポトーシスを誘導し、そしてこれらの細胞にお
ける細胞増殖を阻害するという発見に基づく。好ましくは、アデノウイルスＥ４
タンパク質またはその活性なフラグメントと組み合わされる場合、キメラＣＤＫ
ｉタンパク質は、非新生物性細胞においてアポトーシスを誘導するに必要とされ
る濃度よりも低い濃度で、新生物性細胞においてアポトーシスを誘導する。

【００２５】本発明に従って、核酸またはタンパク質を含む組成物が、提供される。本発明
はさらに、本発明の組成物のインビトロでの使用およびインビボでの使用のため
の方法を提供する。

【００２６】１つの実施形態において、本発明は、キメラサイクリン依存性キナーゼインヒ
ビター（キメラＣＤＫｉ）タンパク質をコードする第一の核酸配列、およびアデ
ノウイルスＥ４タンパク質をコードする第二の核酸配列から本質的になる核酸組
成物を提供する。

【００２７】本発明に従って、「〜から本質的になる」とは、示された組成物が、組成物の
特徴に物質的に影響する成分を排除することを意味する。従って、本発明のこの
実施形態の組成物は、例えば、組成物の特徴に物質的に影響するアデノウイルス
タンパク質を含まない。組成物の特徴に物質的に影響するアデノウイルスタンパ
ク質の例は、アデノウイルスＥ１タンパク質である。「核酸」とは、一本鎖また
は二本鎖のポリヌクレオチド（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸
（ＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかのアナログ）をいう。第一
および第二の核酸配列は、調節配列に作動可能に連結されて、これらの核酸配列
が導入された細胞において、それぞれキメラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウ
イルスＥ４タンパク質へのそれらの転写および翻訳を保障する。

【００２８】「導入」とは、任意の手段（トランスフェクション、形質導入、感染、および
形質転換を含むがこれらに限定されない）によって細胞中に外因性核酸を導入す
ることを意味する。用語「トランスフェクション」によって、物理的手段によっ
て、細胞中に外因性核酸を導入することが意味される。本明細書中で使用される
場合、「形質導入」によって、ウイルス粒子、好ましくは遺伝的に改変された（
すなわち、組換え）ウイルス粒子を使用して、細胞中に外因性核酸を導入するこ
とが意味される。哺乳動物細胞を操作する種々の技術に関しては、Ｋｅｏｗｎら
（１９９０）ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５：５２７〜
５３７を参照のこと。

【００２９】本明細書中で使用される場合、「作動可能に連結される」とは、ポリヌクレオ
チドをコードする核酸配列および転写調節配列をコードする核酸配列が、細胞中
に導入された場合に、核酸配列の発現を可能にするような様式で連結されること
をいう。「調節配列」とは、核酸配列（例えば、開始シグナル、ＩＲＥＳ配列、
ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、プロモーター、およびそれらが作動可能に
連結されている、タンパク質をコードする配列の細胞発現を制御するエンハンサ
ー）を意味する。タンパク質またはポリペプチドフラグメントをコードする核酸
配列の「発現」とは、ｍＲＮＡのようなその核酸を細胞中で発現させること、お
よびそのタンパク質またはポリペプチドフラグメントを産生することを意味する
。

【００３０】第一および第二の核酸配列は、組換え感染性ウイルス粒子を作製するために使
用されるウイルスベクター上にあり得る。有用な組換え感染性ウイルスとしては
、アデノウイルス、Ｅ４領域全体を欠損するアデノウイルス、レンチウイルス、
レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス
、およびＲＮＡウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の第一お
よび第二の核酸配列はまた、プラスミド（例えば、エプスタイン−バーウイルス
ベースのプラスミド）上にあり得る。あるいは、本発明の第一および第二の核酸
配列は、非核酸送達系（例えば、リポソーム）と組み合わされ得る。

【００３１】核酸配列は、発現のために配置されるように調節配列に作動可能に連結される
。次いで、核酸配列は、細胞によりインターナライズされるプラスミド中に取り
込まれ得る。調節配列に作動可能に連結された核酸配列はまた、その膜が細胞と
融合し得るリポソーム中に取り込まれ得、その結果、核酸配列は、細胞の細胞質
に貯蔵され、従って細胞によってインターナライズされる。次いで、細胞によっ
てインターナライズされた核酸配列は、核に侵入し、そこでこの核酸配列は、キ
メラＣＤＫｉタンパク質（Ｗ９）およびアデノウイルスＥ４タンパク質として発
現される。従って、「発現のために配置される」とは、ポリペプチドをコードす
る核酸配列が調節配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結され、その結
果、この核酸配列が細胞中で転写および翻訳されてポリペプチドを産生すること
を意味する。

【００３２】さらなる局面において、本発明は、分泌可能なインターナライズ可能な形態の
キメラＣＤＫｉタンパク質をコードする第一の核酸配列、および分泌可能なイン
ターナライズ可能な形態のアデノウイルスＥ４タンパク質をコードする第二の核
酸配列を含む核酸組成物であって、この第一および第二の核酸配列が、少なくと
も１つの調節配列に作動可能に連結されている、組成物を提供する。「分泌可能
なインターナライズ可能な形態」とは、タンパク質を産生する細胞によって破棄
または放出され得るように、かつ細胞によって細胞の細胞質および／または核に
取り込まれ得、そこでタンパク質が細胞内機能に関与し得るように、標準的な分
子生物学技術を使用して改変されたタンパク質の形態を意味する。

【００３３】１つの局面において、本発明は、精製キメラＣＤＫｉタンパク質および精製ア
デノウイルスＥ４タンパク質を含むタンパク質組成物を提供する。好ましくは、
このキメラＣＤＫｉタンパク質および精製アデノウイルスＥ４タンパク質は、細
胞によって細胞の細胞質および／または核に取り込まれ得、そこでタンパク質が
細胞内機能に関与し得るように改変される。

【００３４】本明細書中で使用される場合、「精製」とは、タンパク質に天然に付随する成
分から分離されているか、または組換え生物学的技術により生成されるタンパク
質の場合には、改変された細胞またはウイルス中でタンパク質に付随する成分か
ら分離されているタンパク質を意味する。もちろん、タンパク質化学における当
業者は、水、緩衝液、および他の低分子が精製されたタンパク質調製物中にさら
に存在し得ることを理解する。代表的には、精製タンパク質は、他の付随するタ
ンパク質および有機分子（例えば、核酸）を少なくとも６０重量％含まない場合
には純粋である。好ましくは、精製タンパク質は、付随するタンパク質および有
機分子を、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、さら
により好ましくは少なくとも９５重量％、および最も好ましくは少なくとも９９
重量％含まない。好ましくは、本発明の精製タンパク質は、タンパク質をコード
する核酸配列を細胞中に発現させることによって得られる。純度は、任意の適切
な方法（カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および
ＨＰＬＣ分析を含むがこれらに限定されない）によって測定され得る。

【００３５】本発明はさらに、新生物を処置または予防する際の使用のための組成物を提供
する。これらの組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、本発明
に従う核酸組成物またはタンパク質組成物を含む。「薬学的に受容可能なキャリ
ア」としては、任意かつ全ての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌剤および抗
真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに細胞に対して非毒性でありかつ核酸
またはタンパク質の治療活性を減少しない、細胞による組成物のインターナリゼ
ーションを改善する薬剤が挙げられるがこれらに限定されない。任意の従来の培
地または薬剤が活性成分と適合しないような程度を除いて、本発明の治療組成物
において薬学的に受容可能なキャリアとしてのその使用が、意図される。

【００３６】上記の核酸組成物およびタンパク質組成物は、例えば、アポトーシスが読み出
しとして使用される機能アッセイにおいてインビトロでの使用を見出す。別の例
において、これらの組成物はまた、正常に培養された細胞の細胞周期を同調させ
る方法においてインビトロでの使用を見出す。

【００３７】インビボでは、本発明の組成物は、抗新生物治療剤としての使用を見出す。例
えば、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わされた、上記の核酸組成物を含む
組成物は、新生物性細胞の増殖を阻害するために、遺伝子治療アプローチにおい
て使用され得る。上記のタンパク質組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリア
と組み合わされ得、そしてその増殖を阻害するために、腫瘍に送達され得る。

【００３８】なお別の実施形態において、本発明は、分泌可能なインターナライズ可能なＷ
９タンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質をコードする核酸配列を含む
細胞であって、ここでこれらの配列が細胞中で発現されるように調節配列に作動
可能に連結されている、細胞を特徴とする。この細胞は、インビボで本発明のパ
ラクリン作用性タンパク質を細胞に送達するために、ビヒクルとしての使用を見
出す。好ましくは、この細胞は、本発明のタンパク質で処置されている動物に由
来する。

【００３９】本発明に従って、組成物（およびその成分）は、以下に詳細に記載される。さ
らに、本発明の組成物（およびその成分）を調製するために使用され得る方法が
、提供される。

【００４０】（Ｉ．本発明の組成物の成分の調製）本発明の組成物は、１つの成分として、キメラＣＤＫｉタンパク質、またはキ
メラＣＤＫｉタンパク質をコードする核酸配列を必要とする。第二の成分として
、本発明の組成物は、アデノウイルスＥ４タンパク質、またはアデノウイルスＥ
４タンパク質をコードする核酸配列を必要とする。

【００４１】（Ａ．キメラＣＤＫｉタンパク質）「キメラＣＤＫｉタンパク質」とは、ＣＤＫｉタンパク質のＩＮＫ４ファミリ
ー由来のタンパク質の少なくとも活性フラグメント、およびＣＤＫｉタンパク質
のＣＩＰ／ＫＩＰファミリー由来のタンパク質の少なくとも活性フラグメントを
含む融合タンパク質を意味する。本発明の「融合タンパク質」は、第一のタンパ
ク質の少なくとも活性フラグメント、および第二のタンパク質の少なくとも活性
フラグメントを含む単一のポリペプチド鎖である。ここで２つのフラグメントは
、ペプチド結合により直接または間接的にのいずれかで結合される。

【００４２】ＣＤＫｉタンパク質のＣＩＰ／ＫＩＰファミリー由来のタンパク質としては、
限定はしないが、ヒトｐ２７^kip1（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１０９０６、Ｐｏ
ｌｙａｋら（１９９４）Ｃｅｌｌ７８：５６〜６６）；ｍｕｒｉｎｅｐ２７^ki ^p1 （ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０９９６８、Ｐｏｌｙａｋら（１９９４）Ｃｅｌ
ｌ７８：５６〜６６）；ラットｐ２７^kip1（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ８６９
２４およびＤ８３７９２、Ｎｏｍｕｒａら（１９９７）Ｇｅｎｅ１９１（２）
：２１１〜２１８）；ヒト２７^KIP2（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００７
６、Ｍａｔｓｕｏｋａら（１９９５）ＧｅｎｅＤｅｖ．９（６）：６５０〜６
６２）；ｍｕｒｉｎｅｐ２７^KIP2（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ２０５５３、Ｌｅ
ｅら（１９９５）ＧｅｎｅＤｅｖ．９（６）：６３９〜６４９）；ｃａｎｉｎ
ｅｐ２１^Waf1/Cip1（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０７６４６９）；およびヒト
ｐ２１^Waf1/Cip1（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ２５６１０；Ｈａｒｐｅｒら（１
９９３）Ｃｅｌｌ７５：８０６〜８１６、１９９３）が挙げられる。ＣＤＫｉ
タンパク質のＩＮＫ４ファミリーとしては、限定はしないが、ヒトｐ１８^CDKN2C （ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０４１２４８、およびＮＭ＿００１２６２、Ｂｌ
ａｉｓら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ
．２４７（１）：１４６〜１５３）；ヒトＣｄｉ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｎ
Ｍ＿００５１９２、Ｇｙｕｒｉｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ７５（４）：７９１
〜８０３）；ヒトｐ１９^INK4d（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１８００、
Ｇｕａｎら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ７（１）：５７〜７０）
；ヒトｐ１５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ７５７５６、Ｊｅｎら（１９９４）Ｃ
ａｎｃｅｒＲｅｓ．５４（２４）：６３５３〜６３５８）；ｍｕｒｉｎｅｐ１
５^INK4b（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８０４１５、Ｕ７９６３４、およびＵ７９
６３９）；ｍｕｒｉｎｅｐ１６^Ink4/MTS1（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０４
４３３６およびＡＦ０４４３３５、Ｚｈａｎｇら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５（５）：２４２９〜２４３４）；およびヒ
トｐ１６^INK4（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００７７；Ｓｅｒｒａｎｏら
（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６６（６４５６）：７０４〜７０７およびＯｋａ
ｍｏｔｏら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１
（２３）：１１０４５〜１１０４９）が挙げられる。

【００４３】本発明に従う例示的なキメラＶＤＫｉタンパク質は、本明細書に記載される、
そしてＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／０６５４０（参考として本明細書に援用される
）に記載される融合タンパク質である。好ましくは、キメラＣＤＫｉは、以下の
実施例１に記載のように、以下に記載される以下のタンパク質の１つから選択さ
れる：Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５、Ｗ６、Ｗ７、Ｗ８、Ｗ９、Ｗ１０、またはＷ１１。最
も好ましくは、本発明のキメラＣＤＫｉタンパク質は、Ｗ９である。

【００４４】本明細書において用いる場合、「活性フラグメント」とは、示されたＣＤＫｉ
により標的される適切なサイクリン依存性キナーゼの阻害に必要なアミノ酸配列
を少なくとも包含するポリペプチドを意味する（例えば、ヒトｐ２７については
、Ｒｕｓｓｏら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９５：２３７〜２４３を参照のこ
と）。好ましい実施形態において、このキメラサイクリン依存性キナーゼインヒ
ビターは、哺乳動物（例えば、ヒト）由来である。

【００４５】本明細書において用いる場合、「Ｗ９タンパク質」とは、ヒトｐ１６（ＩＮＫ
４）タンパク質全体を含むＣ末端部分に結合したペプチドを介して共有結合した
ヒトｐ２７のＣＤＫ阻害ドメイン（アミノ酸残基２５〜９３）を含むＮ末端部分
から構成されるＷ９タンパク質、およびＷ９タンパク質と等価な活性を有するか
、またはＷ９タンパク質のアミノ酸配列に比較した場合、少なくとも１つの保存
的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有するかのいずれかである、任意の等価
なタンパク質を意味する。Ｗ９タンパク質は、好ましくは図２Ｂで提供されたア
ミノ酸配列を有する。Ｗ９の核酸配列およびアミノ酸配列（ＨＡタグおよび６つ
のヒスチジン残基なし）は、それぞれ、配列番号２３および２４に提供される。

【００４６】アデノウイルスＥ４タンパク質の存在下で、キメラＣＤＫｉタンパク質は、新
生物細胞において細胞増殖の停止を誘導し、そして新生物細胞をアポトーシスに
誘導する。好ましくは、アデノウイルスＥ４タンパク質の存在下で、キメラＣＤ
Ｋｉタンパク質は、新生物細胞を殺傷するが、非新生物細胞は殺傷しない。

【００４７】本発明のキメラＣＤＫｉタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列は、以下の
実施例に提供される。しかし、遺伝子コードの縮重特性を考慮すれば、キメラＣ
ＤＫｉタンパク質をコードする任意の核酸配列は、キメラＣＤＫｉコード核酸配
列の定義内である。キメラＣＤＫｉタンパク質をコードする核酸配列はまた、こ
の核酸配列およびアミノ酸配列、ならびに標準的技術に従って本明細書において
提供された説明から作製され得る。例えば、ヒトｐ２７の核酸配列およびアミノ
酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１０９０６（Ｐｏｌｙａｋら（１９９４）
Ｃｅｌｌ７８：５６〜６６）として入手可能である。ヒトｐ１６の核酸配列お
よびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ２７２１１（Ｓｅｒｒａｎｏら
（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６６：７０４〜７０７；Ｏｋａｍｏｔｏら（１９
９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１１０４５〜１
１０４９）として入手可能である。キメラＣＤＫｉタンパク質コード核酸配列を
作成するための技術としては、限定はしないが、以下が挙げられる：ＣＤＫｉの
ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーのメンバーをコードする核酸配列のＰＣＲによる増幅
、およびＣＤＫｉのＩＮＫ４ファミリーのメンバーをコードする核酸配列のＰＣ
Ｒによる増幅、本明細書に提供される配列から精製されたプローブを用い、次に
適切なインフレーム連結による、ＣＤＫｉコード核酸配列を含有するｃＤＮＡク
ローンの同定、ならびに重複するオリゴヌクレオチドを用いてキメラＣＤＫｉコ
ード核酸配列を生成するＰＣＲ。これらの技術の全ては周知である（例えば、Ａ
ｕｓｕｂｅｌら（１９９４）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと）。

【００４８】キメラＣＤＫｉタンパク質は、当業者に周知の任意の標準的方法により作製さ
れ得る。好ましくは、キメラＣＤＫｉタンパク質は、精製される。精製されたキ
メラＣＤＫｉタンパク質は、化学合成により生成され得る（例えば、Ｓｏｌｉｄ
ＰｈａｓｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版（１９８４）ＴｈｅＰｉｅｒｃｅ
ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬを参照のこと）。キメラ
ＣＤＫｉタンパク質は、キメラＣＤＫｉコード配列を発現プラスミドにサブクロ
ーニングすること、そのプラスミドを適切な細胞にトランスフェクトすること、
および抗ｐ２７または抗ｐ１６抗体を用いて、この細胞から、合成されたキメラ
ＣＤＫｉタンパク質を精製することにより作製され得る。タンパク質精製のため
の代替方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；例えば、Ｆｉｓ
ｈｅｒ（１９８０）ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｗｏｒ
ｋａｎｄＢｕｒｄｏｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）が挙げられる。

【００４９】キメラＣＤＫｉタンパク質は、当業者に周知の組換え技術により、細菌、昆虫
、または哺乳動物を含む任意の適切な細胞型において、合成され得る。例えば、
キメラＣＤＫｉコード核酸配列は、バキュロウイルスベクターに挿入され得、そ
の結果、この配列は、このベクター中の発現のために配置される。次いで、この
ベクターは、組換えバキュロウイルス粒子を生成するために用いられ得る。組換
えバキュロウイルスを形質導入された昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）は、キメラ
ＣＤＫｉタンパク質を発現する。溶解後、このキメラＣＤＫｉタンパク質は、精
製され得る。キメラＣＤＫｉコード核酸配列が、分泌されたタンパク質をコード
するように標準的分子生物学の技術を用いて改変された場合（以下参照）、この
分泌されたキメラＣＤＫｉタンパク質は、形質導入された昆虫細胞の馴化増殖培
地から単離され得、そして精製され得る。

【００５０】本発明に従う「キメラＣＤＫｉタンパク質」は、さらに、キメラＣＤＫｉタン
パク質の全ての等価物を包含する。キメラＣＤＫｉタンパク質等価物は、等価で
あるキメラＣＤＫｉタンパク質の活性に対して等価な活性を有するか、または等
価であるキメラＣＤＫｉタンパク質のアミノ酸配列に比較した場合、少なくとも
１つの保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有する。このような保存的置
換は、代表的には、以下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン、バリン、イ
ソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタ
ミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チ
ロシン。

【００５１】キメラＣＤＫｉタンパク質等価物は、ＩＮＫ４ファミリーメンバーＣＤＫｉ（
例えば、ｐ１６）に結合したＣＤＫ阻害性ドメインの融合タンパク質であり得る
。「ＣＤＫ阻害性ドメイン」とは、ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーメンバーサイクリ
ン依存性キナーゼインヒビター（キナーゼおよびサイクリン結合サブユニットの
両方に接触し、そしてキナーゼ阻害に十分である）のドメインを意味する。好ま
しくは、ＣＤＫ阻害性ドメインは、核局在化シグナルおよびＱＴドメインを欠失
する。ＣＤＫ阻害性ドメインおよびＩＮＫ４の１つまたは両方は、哺乳動物由来
であり得、そして好ましくは両方は、処置されている哺乳動物（例えば、マウス
はマウスタンパク質配列から構成されるキメラＣＤＫｉタンパク質等価物で処置
される）由来である。キメラＣＤＫｉタンパク質がＷ９である場合、好ましくは
Ｗ９タンパク質等価物は、そのＮ末端部分にＣＤＫ阻害性ドメインを含み、そし
てそのＣ末端にＩＮＫ４ファミリーメンバータンパク質またはそのフラグメント
を含む。

【００５２】キメラＣＤＫｉタンパク質等価物をコードする核酸配列は、標準的技術により
作製され得る。この技術としては、ＣＤＫｉの種々のＣＩＰ／ＫＩＰファミリー
メンバーのＣＤＫ阻害性ドメインをコードする公知の核酸配列と、ＩＮＫ４タン
パク質をコードする核酸配列のインフレームの連結が挙げられる。これらのタン
パク質のヒトバージョンをコードする核酸配列は、公知である（例えば、ヒトｐ
１５、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ７５７７５６；ヒトｐ１６、ＧｅｎＢａｎｋ受
託番号２７２１１；ヒトｐ１８、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦＯ４１２４８；ヒ
トｐ１９、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ２０４９８；ヒトｐ２１、ＧｅｎＢａｎｋ
受託番号Ｌ４７２３２；ヒトｐ２７、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ１０９０６）。

【００５３】キメラＣＤＫｉタンパク質等価物が非ヒトタンパク質配列から構成される場合
、キメラＣＤＫｉタンパク質等価物をコードする核酸配列は、非ヒト動物由来の
遺伝子配列を用いることにより作製され得る。例えば、キメラＣＤＫｉタンパク
質等価物は、全長マウスｐ１６に融合されたマウスＣＩＰ／ＫＩＰファミリーメ
ンバー由来のＣＤＫ阻害性ドメインから構成され得る。これらの配列の細胞への
トランスフェクションは、この配列がその細胞中での発現のために配置される場
合、コードされたキメラＣＤＫｉタンパク質等価物の産生および精製を可能にす
る。

【００５４】さらに、本発明のキメラＣＤＫｉタンパク質等価物は、２つの異なる種から、
タンパク質、またはそれらのフラグメントを融合すること（または核酸をコード
すること）により、作製され得る（例えば、ヒトｐ１６に結合されたマウスｐ２
７ＣＤＫ阻害性ドメイン）。好ましくは、動物を処置するために用いられるキメ
ラＣＤＫｉタンパク質等価物は、その動物由来のタンパク質から誘導される。例
えば、イヌのキメラＣＤＫｉタンパク質等価物をコードする核酸配列は、イヌの
ｐ１６分子をコードする核酸配列に、イヌのＣＤＫ阻害性ドメインをコードする
核酸配列を融合することにより作製され得る。この核酸配列は、細胞中で発現さ
れる場合、例えば、家庭内のイヌの新生物を処置するために用いられ得るキメラ
ＣＤＫｉタンパク質等価物を生成する。

【００５５】キメラＣＤＫｉタンパク質等価物はまた、合成され得る。さらに、ＣＤＫ阻害
性ドメインは、共有ペプチド結合または化学的架橋を介してＩＮＫ４ファミリー
メンバータンパク質に結合され得る。

【００５６】好ましくは、キメラＣＤＫｉタンパク質等価物は、ｐ２７タンパク質のＣＤＫ
阻害性ドメインおよびｐ１６タンパク質またはそのフラグメントの融合タンパク
質である。より好ましくは、キメラＣＤＫｉタンパク質等価物（またはコードす
る核酸）は、アデノウイルスＥ４タンパク質の存在下で投与された場合、キメラ
ＣＤＫｉタンパク質（またはキメラＣＤＫｉタンパク質コード核酸）の活性に（
同じ条件下で等しく投与される場合）匹敵する抗新生物活性を有する（例えば、
Ｗ９タンパク質等価物は、Ｗ９タンパク質の活性に匹敵する抗新生物活性を有す
る）。最も好ましくは、キメラＣＤＫｉタンパク質等価物は、アデノウイルスＥ
４タンパク質またはその活性なフラグメントと組み合わせた場合、非新生物細胞
においてアポトーシスを誘導するのに必要な濃度より低い濃度で新生物細胞にお
いてアポトーシスを誘導する。アポトーシスは、例えば、Ａｎｎｅｘｉｎおよび
／またはプロピジウムヨージド（ＰＩ）を用いる細胞染色、またはＴｄｔＴＵ
ＮＥＬアッセイを用いることにより、容易に評価され得る。これらのアポトーシ
スアッセイは、周知である（例えば、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら（１９９５）Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：６４９〜６５５；Ｐｅｐｐｅｒら（１９９８）Ｌｅｕｋ
Ｒｅｓ．２２（５）：４３９〜４４；およびＷａｌｓｈら（１９９８）Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２１７（１−２）：１５３〜６３を参照のこと
）。

【００５７】（Ｂ．アデノウイルスＥ４タンパク質）本明細書において用いる場合、用語「アデノウイルスＥ４タンパク質」は、ア
デノウイルスのＥ４領域によりコードされる少なくとも１つのタンパク質、また
はアデノウイルスＥ４タンパク質の活性フラグメント、またはアデノウイルスＥ
４タンパク質の等価物を包含する。アデノウイルスのＥ４領域には少なくとも６
つの異なるオープンリーディングフレーム（ｏｒｆｓ）が存在し、これには少な
くとも４２の血清型が存在する。従って、アデノウイルスＥ４タンパク質は、ア
デノウイルスの任意の血清型由来のアデノウイルスＥ４ｏｒｆタンパク質の任意
の１つ以上であり得るが、全てではないかもしれない。アデノウイルスＥ４タン
パク質の活性なフラグメントは、Ｗ９タンパク質とともに投与された場合、単独
で投与されたキメラＣＤＫｉタンパク質の抗新生物活性よりも大きい抗新生物活
性を提供する、アデノウイルスＥ４タンパク質のフラグメントである。アデノウ
イルスＥ４タンパク質またはその活性なフラグメントの等価物とは、Ｗ９タンパ
ク質とともに投与された場合、アデノウイルスＥ４タンパク質またはアデノウイ
ルスＥ４タンパク質の活性なフラグメントにより提供される活性に匹敵する抗新
生物活性を提供する、化学物質（例えば、限定はしないが、タンパク質、脂質、
または炭水化物）である。

【００５８】１つの例示的アデノウイルスＥ４タンパク質は、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ６
によりコードされるＥ４ｏｒｆ６タンパク質である。第二の例示的アデノウイル
スＥ４タンパク質は、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ３によりコードされるＥ４ｏｒ
ｆ３タンパク質である。このアデノウイルスＥ４タンパク質は、アデノウイルス
の任意の血清型由来であり得、そして任意の種の動物（例えば、ヒト、ウシ、ト
リ）から単離されたアデノウイルス由来であり得る。

【００５９】種々のアデノウイルス血清型のＥ４領域の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデ
ータベースから公的に入手可能であり、そして限定はしないが、以下を含む：Ｇ
ｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０１９６６、Ｊ０１９８０、Ｋ０２３６８、Ｘ０２９９
８、およびＹ０９５９８（５型）；ＡＦ０３０１５４およびＡＦ０８３１３２（
３型）；Ｌ１９４４３（４０型）；Ｙ０９５９８（トリＥＤＳ）；Ｘ７３４８７
およびＸ５１８００（１２型）；Ｕ７７０８２およびＪ０１９１７（２型）；Ｓ
８２５０８（９型）；ＡＦ１０８１０５（１７型）；ならびにＹ０７７６０およ
びＵ５５００１（１型）（これらのそれぞれは、参考として本明細書において援
用される）。これらのアデノウイルスＥ４領域含有配列は、Ｅ４プロモーターと
ともに選り抜かれたベクターまたはプラスミド（例えば、Ｅ４領域全体を欠失す
るアデノウイルス移入ベクター）に挿入され得る。あるいは、アデノウイルスＥ
４領域含有配列は、外因性プロモーターに作動可能に連結された、選り抜かれた
ベクターまたはプラスミド（例えば、構成的に活性なプロモーター（例えば、Ｃ
ＭＶまたはＳＶ４０早期プロモーター）、または誘導性プロモーター（例えば、
ＭＭＴＶプロモーター））に挿入され得る。

【００６０】アデノウイルスのＥ４領域の少なくとも一部を含有する核酸配列は、細胞に導
入され、Ｅ４タンパク質を生成し得る。アデノウイルスＥ４タンパク質の過剰発
現は細胞にとってしばしば毒性であるので、細胞へのトランスフェクションの前
に、誘導性プロモーターにアデノウイルスＥ４領域含有核酸配列を作動可能に連
結することが所望され得る。アデノウイルスＥ４タンパク質を発現するには任意
の細胞型が用いられ得る；しかし、好ましくは、選択される細胞は、アデノウイ
ルスＥ４タンパク質が適切に折り畳まれ、そして翻訳後改変され得る細胞である
。組換え方法により生成されたアデノウイルスＥ４タンパク質は、標準的な方法
（例えば、ＨＰＬＣ）に従って精製され得る。

【００６１】キメラＣＤＫｉタンパク質とともに相乗作用して（ｓｙｎｅｒｇｉｚｅ）新生
物細胞においてアポトーシスを誘導するのに十分な、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ
６タンパク質、またはタンパク質のＥ４ｏｒｆタンパク質の活性フラグメントお
よび／または等価物を同定するためには、種々の方法が使用され得る。「アデノ
ウイルスＥ４タンパク質の活性なフラグメント」とは、キメラＣＤＫｉタンパク
質とともに投与された場合、単独で投与されたキメラＣＤＫｉタンパク質の抗新
生物活性よりも大きい抗新生物活性を提供する、アデノウイルスＥ４タンパク質
のフラグメントを意味する。好ましくは、アデノウイルスＥ４タンパク質の活性
なフラグメントは精製される。

【００６２】特定のキメラＣＤＫｉタンパク質（例えば、Ｗ９）と相乗作用して、新生物細
胞においてアポトーシスを誘導し得る、アデノウイルスＥ４タンパク質、または
その活性フラグメントを同定するために、欠失分析（ｄｅｌｅｔｉｏｎａｌａ
ｎａｌｙｓｉｓ）を使用し得る。非限定的方法として、特異的キメラＣＤＫｉタ
ンパク質をコードする組換えアデノウイルスは、Ｅ４領域の部分が欠失するよう
に、改変され得る。この様式では、Ｅ４ｏｒｆタンパク質の全ては産生されず、
そして欠失したＥ４ｏｒｆタンパク質は、欠失マッピング（ｄｅｌｅｔｉｏｎａ
ｌｍａｐｐｉｎｇ）により同定され得る。例えば、キメラＣＤＫｉタンパク質
をコードする組換えアデノウイルスの１つは、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質のみをコ
ードし、他のＥ４ｏｒｆタンパク質をコードしない。キメラＣＤＫｉタンパク質
をコードする別の組換えアデノウイルスは、Ｅ４ｏｒｆ３タンパク質およびＥ４
ｏｒｆ６タンパク質のみをコードするが、いずれの他のＥ４ｏｒｆタンパク質も
コードしない。キメラＣＤＫｉタンパク質をコードするなお別の組換えアデノウ
イルスは、Ｅ４ｏｒｆ６のフラグメントのみをコードし、そして他のＥ４ｏｒｆ
タンパク質のフラグメントはコードしない。このウイルスのＥ４ｏｒｆ６フラグ
メントは、当然ながら、ＡＴＧおよび終止配列を含み、そしてポリペプチドフラ
グメントを産生する。

【００６３】Ｅ４領域の部分が新生物細胞におけるアポトーシスに必要であるか否かを決定
するために、特定のキメラＣＤＫｉタンパク質（例えば、Ｗ９）およびＥ４領域
タンパク質の種々のフラグメントをコードする異なる組換えアデノウイルスを力
価測定し、そして各組換えアデノウイルスの同じＭＯＩユニットを用いて、実施
例ＩＶおよびＶＩにおいて下記するように、種々の正常な細胞および新生物細胞
を形質導入する。これらの組換えアデノウイルスが新生物細胞においてアポトー
シスを誘導する能力は、Ｗ９タンパク質をコードし、かつ実施例ＩＩＩに下記す
るＥ４領域全体を含むアデノウイルス（ＡＶ−Ｗ９）に匹敵する。従って、特定
のキメラＣＤＫｉタンパク質（例えば、Ｗ９）であって、かつＥ４ｏｒｆタン
パク質（またはそのフラグメント）の全てより短いタンパク質をコードする組換
えアデノウイルスが、新生物細胞においてアポトーシスを誘導するのに十分であ
る場合、その組換えアデノウイルスによりコードされるＥ４またはタンパク質（
またはそのフラグメント）は、その特定のキメラＣＤＫｉタンパク質（この場合
、Ｗ９）と相乗作用して新生物細胞において選択的にアポトーシスを誘導するの
に十分である、それらのＥ４タンパク質（またはその活性なフラグメント）を同
定する。

【００６４】キメラＣＤＫｉタンパク質のアポトーシス誘導能力を増強するのに必要な、ア
デノウイルスＥ４タンパク質、またはその活性フラグメントを同定するための別
の方法において、アデノウイルスＥ４ｏｒｆタンパク質の全てから誘導された
重複するペプチドライブラリーが生成され得る。次いで、ライブラリーメンバー
のプールをキメラＣＤＫｉタンパク質を発現する正常細胞または新生物細胞に導
入し、このプール内のペプチドがその細胞においてアポトーシスを誘導したか否
かを決定する。アポトーシスが誘導されれば、このプールは小分割され、その結
果最終的に、特定のＣＤＫｉタンパク質と相乗的に作用して、細胞中でアポトー
シスを誘導し得るペプチド（単数または複数）が同定される。

【００６５】キメラＣＤＫｉタンパク質と相乗作用して本発明の抗新生物組成物を産生する
能力を有するポリペプチドまたは化学物質は、アデノウイルスから誘導される必
要はないことが理解される。アデノウイルスＥ４タンパク質の等価物、またはそ
の活性なフラグメントは、別のウイルス由来の、任意の型の細胞（例えば、細菌
、昆虫、トリ、哺乳動物）由来の、真菌由来のタンパク質、脂質もしくは炭水化
物であり得るか、または合成化学物質であり得る。

【００６６】例えば、アデノウイルスＥ４タンパク質（またはその活性なフラグメント）の
等価物を同定するため、キメラＣＤＫｉタンパク質をコードする核酸配列、およ
びアデノウイルスＥ４タンパク質をコードしない核酸配列を、その核酸配列を細
胞中での発現のために配置するように、新生物細胞にトランスフェクトする。好
ましくは、キメラＣＤＫｉタンパク質をコードするこの核酸配列は、新生物細胞
に安定にトランスフェクトされる。次いで、アデノウイルスＥ４タンパク質（ま
たは活性なフラグメント）の等価物を含むと考えられる化合物のプールをトラン
スフェクトされた新生物細胞に投与する。トランスフェクトされた新生物細胞に
おいてアポトーシスを誘導する化合物のプールを小分割し、そして精製された化
合物（または混合物）が、キメラＣＤＫｉタンパク質でトランスフェクトされた
新生物細胞にアポトーシスを誘導し得ることが確認されるまで、小分割したプー
ルをトランスフェクトされた新生物細胞に投与する。

【００６７】陽性コントロールとして、アデノウイルスＥ４領域全体、アデノウイルスＥ４
タンパク質、またはアデノウイルスＥ４タンパク質の活性フラグメントを含む核
酸配列を、これらの配列を細胞中での発現のために配置するように、キメラＣＤ
Ｋｉタンパク質発現細胞にトランスフェクトする。アデノウイルスＥ４領域全体
、アデノウイルスＥ４タンパク質、またはアデノウイルスＥ４タンパク質の活性
フラグメントを含む核酸配列でトランスフェクトされたキメラＣＤＫｉタンパク
質発現細胞で観察された速度と匹敵する速度で、キメラＣＤＫｉタンパク質発現
新生物細胞がアポトーシスを被るように誘導する化合物は、アデノウイルスＥ４
タンパク質の等価物である。

【００６８】（ＩＩ．本発明のタンパク質組成物の調製）キメラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質は、インビト
ロで生成され得、精製され得、そして全身的にまたは罹患した領域に局所的にの
いずれかで投与され得る（例えば、腫瘍に直接投与される）。好ましくは、キメ
ラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質は、転位配列（ｔｒ
ａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み、それによりそれらのタン
パク質はインターナリゼーションされ得る。タンパク質の「インターナリゼーシ
ョン可能（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｂｌｅ）」形態は、本発明の第一の局面にお
いて上記されるように、細胞によってインターナリゼーションされるように改変
される（例えば、転位配列を含むように改変される）。

【００６９】例えば、キメラＣＤＫｉタンパク質のインターナリゼーション形態をコードす
る核酸は、このタンパク質が細胞での発現のために配置されるように、インビト
ロで原核生物細胞または真核生物細胞にトランスフェクトされ得る。このタンパ
ク質はまた、分泌され得る（すなわち、分泌可能である）この場合、このタンパ
ク質はトランスフェクトされた細胞の馴化された培養培地から精製され得る。あ
るいは、タンパク質のインターナリゼーション可能な形態が、分泌されずに内部
タンパク質であるである場合、この場合、このトランスフェクトされた細胞はま
ず溶解されて、インターナリゼーション可能なキメラＣＤＫｉタンパク質を放出
し、次にこれは標準的な方法に従って精製され得る。キメラＣＤＫｉタンパク質
をコードする（例えば、キメラＣＤＫｉのインターナリゼーション可能な形態を
コードする）組換えウイルスは、また真核生物細胞を形質導入するために用いら
れ得る。次いで、このキメラＣＤＫｉタンパク質は、馴化された培養培地から（
分泌されたタンパク質の場合）か、または細胞の溶解によって（非分泌タンパク
質の場合）のいずれかにより、形質導入された細胞から精製され得る。本明細書
において記載されるように、キメラＣＤＫｉタンパク質をコードする核酸配列は
、タンパク質コード配列へのシグナル配列の結合を通じて容易に改変され、分泌
可能なキメラＣＤＫｉタンパク質をコードし得る。同様に、キメラＣＤＫｉタン
パク質をコードする核酸配列は、タンパク質コード配列への転位配列の結合によ
り改変され、インターナリゼーション可能なキメラＣＤＫｉタンパク質をコード
し得る。

【００７０】アデノウイルスＥ４タンパク質は、キメラＣＤＫｉタンパク質を発現する同じ
細胞により、または異なる細胞により、インビトロで同様に発現され得る。アデ
ノウイルスＥ４タンパク質を発現する細胞およびキメラＣＤＫｉタンパク質を発
現する細胞は、同じ型の細胞である必要はない。例えば、アデノウイルスＥ４タ
ンパク質は、細菌細胞により発現されそして細菌細胞から精製され得る。そして
キメラＣＤＫｉタンパク質は、昆虫細胞により発現されそして昆虫細胞から精製
され得る。

【００７１】本発明のタンパク質組成物の成分（例えば、キメラＣＤＫｉおよびアデノウイ
ルスＥ４タンパク質）は、ペプチドシンセサイザーで完全に合成されそして生成
され得ることが理解される。例えば、小さいアデノウイルスＥ４タンパク質、ま
たはその活性なフラグメントが、キメラＣＤＫｉタンパク質の抗新生物効果を補
完することが見出される場合、このような小さいタンパク質またはポリペプチド
フラグメントは、ペプチドシンセサイザーにより化学的に合成され得る。

【００７２】本発明の精製されたタンパク質組成物は、任意の適切な方法により、インビト
ロまたはインビボで標的細胞に投与され得る。例えば、インターナリゼーション
可能なタンパク質を含む組成物は、培養培地中で稀釈され得、そしてインビトロ
で培養された細胞に添加され得る。同様に、インビボ送達については、インター
ナリゼーション可能なタンパク質を含む組成物は、薬学的に受容可能なキャリア
（例えば、緩衝化生理食塩水（以下参照））と組み合わされ得、そしてシリンジ
またはカテーテルでの注射により（例えば、腫瘍の部位に）投与され得る。

【００７３】標的細胞によりインターナリゼーションされ得ないように転位配列を欠くタン
パク質を含むタンパク質組成物の送達のために、この組成物は好ましくはまず、
細胞による組成物のインターナリゼーションを容易にする送達系と組み合わされ
る。例えば、この組成物はまず、表面に正の電荷を有するリポソームにパッケー
ジングされ得る。インビトロまたはインビボのいずれかでの細胞への送達の際、
リポソームは、細胞膜と融合し、そしてリポソーム内に含まれるタンパク質組成
物を細胞の細胞質内に沈着させる。

【００７４】（ＩＩＩ．本発明の核酸組成物の調製）本発明は、キメラＣＤＫｉタンパク質をコードする核酸配列およびアデノウイ
ルスＥ４タンパク質をコードする第二の核酸配列を含む、核酸組成物を提供する
。

【００７５】（Ａ．ウイルスベースの核酸組成物）キメラＣＤＫｉタンパク質をコードする核酸配列は、アデノウイルスＥ４領域
の少なくとも一部を含み、そしてキメラＣＤＫｉタンパク質および少なくとも１
つのアデノウイルスＥ４タンパク質（例えば、Ｅ４ｏｒｆ６）をコードする、組
換えウイルス粒子（例えば、アデノウイルス）を作製するために用いられ得る、
ウイルスベクター中に組み込まれ得る。

【００７６】ウイルスが組換えアデノウイルスである場合、アデノウイルスは、任意の血清
型のアデノウイルスであり得る。好ましくは、アデノウイルスは、Ｅ４領域全体
を欠き、その結果、Ｅ４ｏｒｆタンパク質の全てがアデノウイルスによってコ
ードされるわけではない。キメラＣＤＫｉタンパク質コード配列は、除去しても
致死的でないアデノウイルスゲノムの領域のうちの１つに挿入され得る。非致死
的に除去され得る、アデノウイルスゲノムのうちの１つの公知の領域はＥ１領域
であり、これは、アデノウイルス複製を制御する。この領域に、標準的分子生物
学技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃ
ｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ
＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹを参照のこと）を用いてプロモーターお
よび／またはエンハンサー配列が挿入され得る。このようなプロモーター／エン
ハンサー配列は、構成的に活性（例えば、ＣＭＶプロモーターまたはＥＦ１αプ
ロモーター）、細胞型特異的（例えば、平滑筋細胞において特異的に発現される
ＳＭ２２α遺伝子プロモーター）または誘導性（例えば、サイトカイン刺激誘導
性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）遺伝子プロモーター）であり得る。多数の
プロモーター／エンハンサー配列が周知であり、そしてそれらの配列は、例えば
、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎ
ｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）において入
手可能である。次いで、挿入されたプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター
）は、キメラＣＤＫｉタンパク質をコードする核酸配列に、そしてポリＡシグナ
ル配列（例えば、ＳＶ４０ウイルス由来）に作動可能に連結されて、導入遺伝子
が作製され得る。「導入遺伝子」によって、導入遺伝子が細胞中に導入されたと
きに核酸配列が転写および翻訳されるように、調節配列に作動可能に連結された
所望のタンパク質またはポリペプチドのフラグメントをコードする核酸配列を意
味する。導入遺伝子は代表的に、プロモーター／エンハンサー：：タンパク質コ
ード核酸配列：：ポリＡシグナルを含む。ＩＲＥＳ配列によって隔てられた２つ
のタンパク質コード核酸配列を含むポリシストロン性導入遺伝子もまた、この定
義内にある；従って、ＩＲＥＳもまた、本明細書中で使用される場合、「調節配
列」である。

【００７７】送達ウイルスが組換えアデノウイルスであり、一方、導入遺伝子が、Ｅ４領域
の少なくとも一部を含むアデノウイルスベクターのＥ１領域中に挿入され得る実
施形態では、導入遺伝子が、アデノウイルスゲノム中の任意の非致死的位置に挿
入されて、キメラＣＤＫｉタンパク質および少なくとも１つのアデノウイルスＥ
４タンパク質またはそれらの活性なフラグメントをコードし得ることが理解され
る（例えば、キメラＣＤＫｉタンパク質コード導入遺伝子は、Ｅ３領域中に挿入
され得る）。キメラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質を
コードする組換えアデノウイルスを作製する１つの非限定的な方法は、ＣＭＶプ
ロモーター／エンハンサーおよびＳＶ４０ポリＡシグナルに作動可能に連結され
たキメラＣＤＫｉタンパク質コード核酸配列を含むキメラＣＤＫｉタンパク質コ
ード導入遺伝子、ならびにＣＭＶプロモーター／エンハンサーおよびＳＶ４０ポ
リＡシグナルに作動可能に連結されたアデノウイルスＥ４タンパク質コード核酸
配列を含むアデノウイルスＥ４タンパク質コード導入遺伝子を、Ｅ１領域および
Ｅ４領域の両方を欠く、組換え複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）ベクター
のＥ１領域に挿入することである。次いで、キメラＣＤＫｉタンパク質およびア
デノウイルスＥ４タンパク質をコードする導入遺伝子を含む組換えレトロウイル
スベクターは、２９３細胞中でパッケージングされて、感染性組換えアデノウイ
ルス粒子を産生する。

【００７８】キメラＣＤＫｉタンパク質および少なくとも１つのＥ４タンパク質をコードす
る組換えアデノウイルスを用いて、細胞をインビボまたはインビトロで形質導入
し得る。このような投与は、組換えアデノウイルスの感染多重度（ＭＯＩ）を決
定することによって、またはウイルスＤＮＡの量に基づいてウイルス粒子の実際
の数を決定することによって、標準化され得る。ウイルス粒子のこのような標準
化は慣用的であり、そして一般に、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｏｎら（１９７５）Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙＭｏｎｏｇｒａｐｈ，ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ
に記載されている。

【００７９】別の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス配列を全く含まない。例えば
、ウイルスがレンチウイルスである場合、組換えレンチウイルスを作製するため
に用いられるウイルスベクターは、キメラＣＤＫｉタンパク質および少なくとも
１つのアデノウイルスＥ４領域によってコードされるタンパク質（例えば、Ｅ４
ｏｒｆ６）をコードする核酸配列を含むように遺伝的に改変され得る。遺伝子治
療送達ビヒクルとしての、組換えレンチウイルスの使用は、当該分野で周知であ
る（例えば、Ｄｕｌｌら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７
１を参照のこと）。一方または両方の挿入された核酸配列は、外因性プロモータ
ー／エンハンサーおよびポリＡシグナル配列（例えば、Ｅ４領域プロモーターま
たはＣＭＶプロモーター）へと作動可能に連結され得る。あるいは、核酸配列は
、その発現が、レンチウイルスプロモーターおよびポリＡシグナルによって指向
されるように挿入され得る。標準的レンチウイルス移入ベクターは、７ｋＢの収
容力を有する。従って、キメラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タ
ンパク質の両方をコードする組換えレンチウイルスを作製するために、両方の核
酸配列（すなわち、キメラＣＤＫｉタンパク質をコードする配列およびアデノウ
イルスＥ４タンパク質をコードする配列）は、両方のタンパク質（すなわち、キ
メラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質）をコードするポ
リシストロン性ｍＲＮＡが、同じレンチウイルスまたは外因性プロモーター／エ
ンハンサーによって作製され得るように、ＩＲＥＳ配列（ＪａｎｇおよびＷｉｍ
ｍｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．４：１５６０−１５７２）によっ
て隔てられ得る。このようなポリシストロン性ｍＲＮＡは、挿入される導入遺伝
子（すなわち、キメラＣＤＫｉタンパク質コード核酸配列およびアデノウイルス
Ｅ４タンパク質コード核酸配列に作動可能に連結された、プロモーター／エンハ
ンサーおよびポリＡシグナルを含む挿入される核酸配列）のサイズを低減する。
適切なパッケージングおよび力価測定後、少なくとも１つのアデノウイルスＥ４
タンパク質およびキメラＣＤＫｉタンパク質をコードする感染性組換えレンチウ
イルスを用いて、細胞を形質導入し得る。アデノウイルスＥ４タンパク質と対に
なったキメラＣＤＫｉタンパク質の抗新生物性効力は、インビボまたはインビト
ロのモデル系において試験され得る。

【００８０】アデノウイルス配列を欠くウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である場
合、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて、アデノウイルスＥ４タンパク質およびキ
メラＣＤＫｉタンパク質（例えば、Ｗ９）をコードする組換えＡＡＶを作製し得
る。組換えＡＡＶは、プロデューサー細胞を、２つのトランス補完性プラスミド
でトランスフェクトすることによって作製され得、一方のプラスミドは、ｒｅｐ
タンパク質およびｃａｐタンパク質をコードし、そして他方のプラスミドは、Ａ
ＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列とともに導入遺伝子をコードする。次いで、
トランスフェクトされたプロデューサー細胞株は、組換えＡＡＶ感染性ウイルス
粒子を産生し、この粒子は、細胞を形質導入するために用いられ得る。ＡＡＶ導
入遺伝子−ＩＴＲプラスミドの導入遺伝子のサイズ収容力は代表的に、約４．５
ｋＢである。本発明の好ましいキメラＣＤＫｉタンパク質であるＷ９は、０．７
ｋＢ未満の核配列によってコードされる。従って、例えば、ＣＭＶプロモーター
／エンハンサー：：Ｗ９コード核酸配列：：ＩＲＥＳ配列：：アデノウイルスＥ
４タンパク質コード核酸配列：：ＳＶ４０ポリＡシグナルを含む導入遺伝子は、
標準的ＡＡＶ導入遺伝子−ＩＴＲプラスミドによって容易に収容され得、そして
アデノウイルスＥ４タンパク質およびＷ９タンパク質の両方をコードする組換え
ＡＡＶ粒子を生成するために用いられ得る。

【００８１】アデノウイルス配列を欠くウイルスが標準的レトロウイルス、例えば、モロニ
ーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）である場合、キメラＣＤＫｉタンパク質お
よびアデノウイルスＥ４タンパク質をコードする組換えＭＭＬＶが作製され得る
。標準的ＭＭＬＶ移入ベクター、例えば、ｒｋａｔ４３．３ベクター（Ｆｉｎｅ
ｒら（１９９４）Ｂｌｏｏｄ８３：４３−５０）では、導入遺伝子は、ｇａｇ
コード領域と３’ＬＴＲとの間に挿入される。標準的ＭＭＬＶ移入ベクターは、
７ｋＢの導入遺伝子収容力を有する。

【００８２】本発明の核酸組成物をパッケージングおよび送達するために用いられ得る他の
型のウイルスとしては、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルスおよび種々のＲ
ＮＡベースのウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。組換えウイルスは
、形質導入された細胞による、保有する核酸のインターナリゼーションを促進す
るために用いられるので、これらの組換えウイルスは、送達系と呼ばれる。

【００８３】本発明の核酸組成物を組換えウイルス中にパッケージングするための上記の方
法の全てにおいて、感染性ウイルス粒子は、Ｗ９およびアデノウイルスＥ４タン
パク質をコードする核酸配列を含むように改変されたウイルスベクターでトラン
スフェクトされたパッケージング細胞株（またはこれらの細胞を培養する培地）
から収集される。最初に、キメラＣＤＫｉタンパク質（例えば、Ｗ９）およびア
デノウイルスＥ４タンパク質をコードする核酸配列は、ウイルスベクター中での
発現のために配置されるような様式でウイルスベクター中に挿入される。次いで
、適切なパッケージング細胞は、ウイルスベクターを用いてトランスフェクトさ
れる。次いで、トランスフェクトされたパッケージング細胞は、挿入された核酸
配列を保有する感染性組換えウイルス粒子を産生する。感染性ウイルス粒子は、
トランスフェクトされたパッケージング細胞が培養される、馴化培地から精製さ
れ得る。あるいは、感染性組換えウイルス粒子は、一般に、迅速な凍結／融解サ
イクルの繰り返しを用いて細胞を溶解し、そして遠心分離して細胞の破片を除去
することによって精製され得る。細胞破片からの分離後、ウイルス粒子は単離さ
れ、標準的方法（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｏｎら，前出；Ｓｙｎｄｅｒら（１９９６）
ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ，
ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）に従って力価
測定され、そして−７０℃にて保存される。使用するために、ウイルス粒子は融
解され、（適切な場合）薬学的に受容可能なキャリア（例えば、緩衝化生理食塩
水）を用いて希釈され、そして投与される。

【００８４】（Ｂ．非ウイルスベースの核酸組成物）別の実施形態では、本発明の核酸組成物は、非ウイルスベクター（例えば、キ
メラＣＤＫｉタンパク質コード核酸配列およびアデノウイルスＥ４タンパク質コ
ード核酸配列を含むプラスミド）を特徴とし得る。ここで、送達される配列は、
このプラスミドでトランスフェクトされた細胞中で発現されるように、プラスミ
ド中に発現のために配置される。１つの非限定的な例では、非ウイルスベクター
は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ベースのプラスミドである。ＥＢＶベ
ースのプラスミドもまたＥＢＶの複製起点（ｏｒｉＰ）を含み、そしてＥＢＶ核
タンパク質ＥＢＮＡ−１をコードする場合、得られるプラスミドは、トランスフ
ェクトされた細胞内で自律複製し得る。このような自律複製能は、ＥＢＶプラス
ミドを用いてトランスフェクトされた細胞によって発現される、キメラＣＤＫｉ
タンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質の量を増強するのに役立つ。

【００８５】所望の場合、キメラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質
をコードする導入遺伝子は、他のプラスミド配列から分離され得、そして投与さ
れ得る。例えば、導入遺伝子は、稀切断制限エンドヌクレアーゼの認識部位に隣
接するように改変され得る。稀切断制限エンドヌクレアーゼを用いた消化後、キ
メラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質をコードする導入
遺伝子は、アガロースゲルでの電気泳動分離によって残りのプラスミド配列から
分離され得、標準的技術に従って精製され得、そしてアポトーシスを誘導するた
めに新生物性細胞へと送達され得る。

【００８６】非ウイルスプラスミド中の、または導入遺伝子上の本発明の核酸組成物を送達
するための上記の方法では、プラスミドまたは導入遺伝子は好ましくは、送達系
と合わされて、新生物性細胞によるインターナリゼーションを促進する。好まし
くは、この送達系は、標的細胞による核酸組成物のインターナリゼーションをエ
ンドサイトーシス経路に頼る。例示的な送達系としては、リポソーム由来系、ポ
リリジン結合体および人工ウイルスエンベロープが挙げられる。

【００８７】本発明の核酸組成物は、多数の異なる送達系を介して細胞または組織へと送達
され得る。このような系は一般に、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／０６５４０号（本明
細書中に参考として援用される）に記載される。

【００８８】１つの好ましい、非限定的な例では、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー：：
Ｗ９コード核酸配列：：ＩＲＥＳ：：アデノウイルスＥ４ｏｒｆ６コード核酸配
列：：ＳＶ４０ポリＡシグナルからなる導入遺伝子は、その表面に正電荷を保有
するリポソーム（例えば、リポフェクチン）中に封入される。本発明の核酸組成
物を含むこのようなリポソームはまた、標的組織の細胞表面抗原を特異的に見出
す、抗体を用いてタグ化され得る。例えば、Ｂ細胞リンパ腫が、特定のイディオ
タイプを有するＢ細胞レセプターを発現することが公知である場合、リポソーム
は、抗イディオタイプ抗体を用いてコーティングされ得、抗体でコーティングさ
れたリポソームがＢ細胞リンパ腫の細胞に結合し、従って、インターナリゼーシ
ョンされるのを可能にする。

【００８９】（Ｃ．パラクリン送達のための核酸組成物）キメラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質をコードする
、ウイルスベクターおよび非ウイルスプラスミドを用いて、細胞がキメラＣＤＫ
ｉおよびアデノウイルスＥ４タンパク質を発現および分泌し、周囲の細胞によっ
てインターナリゼーションされることによってこれらのタンパク質がパラクリン
様式で作用するように、ウイルスまたはプラスミド配列を細胞中に導入し得る。
「パラクリン」によって、あるタンパク質が合成されなかった細胞に対する、そ
のタンパク質による作用を意味する。

【００９０】例えば、ウイルスベースの遺伝子治療アプローチを用いて、組換えウイルスは
、２つの異なる形態のキメラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タン
パク質をコードするように改変され得る。

【００９１】１つの形態では、キメラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパ
ク質は、細胞によるそれらの分泌を可能にする配列を欠く。それゆえ、これらの
タンパク質は、これらのタンパク質が生成される細胞においてオートクリン様式
で作用する。「オートクリン」によって、あるタンパク質が合成された細胞に対
する、そのタンパク質による作用を意味する。

【００９２】第二の形態では、キメラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパ
ク質の両方が、小胞体、ゴルジ装置への局在、そして細胞からの最終的な分泌を
指向する、リーダー（分泌）配列を含むように改変される。リーダー配列は、分
泌タンパク質をコードする任意の核酸配列に由来する任意のリーダー配列であり
得る。さらに、これらの分泌形態のキメラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイ
ルスＥ４タンパク質は、第二の細胞の細胞膜を横切るタンパク質のトランスロケ
ーションを促進する、トランスロケーション配列を必要とし、このタンパク質が
この細胞によってインターナリゼーションされるのを可能にする。これらのタン
パク質は、「分泌可能なインターナリゼーション可能な形態」のタンパク質と呼
ばれる。タンパク質のインターナリゼーションを指向するに充分なこのようなト
ランスロケーション配列は公知であり、そしてこのような配列としては、Ｄｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａａｎｔｅｐｅｎｎｅｐｅｄｉａタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登
録番号Ｅ０１９１１；Ａｓａｔｏら（１９８９）日本国特許第１９８９０８５０
９２−Ａ１号；Ｄｅｒｏｓｓｉら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１
：１８１８８−１８１９３；Ｄｅｒｏｓｓｉら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６９：１０４４４−１０４５０；Ｐｅｒｅｚら（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｓｃｉ．１０２：７１７−７２２）、ＨＩＶトランスアクチベーター（ＴＡ
Ｔ）タンパク質（Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１７：３５５１−３５６１；ＦｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏ（１９８９
）Ｃｅｌｌ５５：１１８９−１１９３；ＧｒｅｅｎおよびＬｏｗｅｎｓｔｅｉ
ｎ（１９８９）Ｃｅｌｌ５５：１１７９−１１８８）、およびマルトパラン（
ｍａｓｔｏｐａｒａｎ）（Ｈｉｇａｓｈｉｊｉｍａら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６５：１４１７６−１４１８６０）の一部が挙げられる。好まし
くは、トランスロケーション配列は、全長ＨＩＶｔａｔタンパク質のアミノ酸
４８〜６０またはアミノ酸４７〜７２をコードする配列である。

【００９３】図１は、パラクリン作用性Ｗ９コード核酸配列の非限定的な例を示す模式図で
ある。図１のＷ９コード核酸配列は、任意の供給源由来のリーダー（分泌）配列
およびＨＩＶｔａｔ配列由来のトランスロケーション配列を有するように改
変される。リーダー配列は、コードされるＷ９タンパク質が分泌されるのを可能
にし、一方、ＨＩＶｔａｔトランスロケーション配列は、隣接細胞によるＷ９
タンパク質のインターナリゼーションを可能にし、そしてさらにＷ９タンパク質
をその細胞の核へと誘導する。

【００９４】１つの実施形態では、本発明の分泌可能なインターナリゼーション可能な形態
のキメラＣＤＫｉタンパク質または分泌可能なインターナリゼーション可能な形
態のアデノウイルスＥ４タンパク質は、以下の配列を有する：Ｎ末端−（リーダ
ーペプチド）結合（ＨＩＶｔａｔアミノ酸１〜７２ペプチド）結合（キメラＣ
ＤＫｉタンパク質またはアデノウイルスＥ４タンパク質）−Ｃ末端。なおさらな
る実施形態では、ここで、本発明の分泌可能なインターナリゼーション可能な形
態のＣＤＫｉタンパク質またはアデノウイルスＥ４タンパク質が、プロインスリ
ン由来のシグナル（リーダー）配列およびＨＩＶｔａｔアミノ酸１〜７２由来
のトランスロケーション配列を有する。例えば、プロインスリン由来のシグナル
（リーダー）配列およびＨＩＶｔａｔアミノ酸１〜７２由来のトランスロケー
ション配列を有する分泌可能なインターナリゼーション可能な形態のＷ９タンパ
ク質は、配列番号２９に提供される核酸配列および配列番号３０に提供されるア
ミノ酸配列を有する。

【００９５】さらに、シグナルペプチドおよびトランスロケーション配列は、（Ｇｌｙ₄Ｓ
ｅｒ）₃リンカーのようなリンカーを有する、キメラＣＤＫｉタンパク質または
アデノウイルスＥ４タンパク質から分離され得る。分泌可能なインターナリゼー
ション可能な形態のＷ９タンパク質の場合、リンカーが（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃リン
カーであるとき、トランスロケーション配列はＨＩＶｔａｔアミノ酸１〜７２
であり、そしてシグナル（リーダー）配列はプロインスリン由来であり、その核
酸配列は、配列番号３１に提供され、そしてアミノ酸配列は配列番号３２に提供
される。

【００９６】パラクリン作用性キメラＣＤＫｉおよびアデノウイルスＥ４タンパク質の新生
物性細胞への送達のための遺伝子治療アプローチの非限定的例では、分泌可能な
インターナリゼーション可能なアデノウイルスＥ４タンパク質および分泌可能な
インターナリゼーション可能なＷ９タンパク質をコードする、非ウイルス複製欠
損プラスミドは、非新生物性細胞をトランスフェクトするために用いられる。プ
ラスミドは、選択マーカー遺伝子（例えば、ｎｅｏ）を含んで、そのマーカー（
例えば、Ｇ４１８）に曝露された、トランスフェクトされた細胞へのその安定な
組込みを可能にし得る。プラスミドのサイズを小さくするために、２つのタンパ
ク質コード核酸配列は、二方向性でプラスミド上に配置され得、各々は、同じポ
リＡシグナルを共有するが、それ自体のプロモーターを有する。次いで、トラン
スフェクトされた非新生物性細胞は、分泌可能なインターナリゼーション可能な
アデノウイルスＥ４タンパク質および分泌可能なインターナリゼーション可能な
Ｗ９タンパク質を分泌し、これは、新生物性細胞によってインターナリゼーショ
ンされ、そしてこれらにより、パラクリン様式で作用して、トランスフェクトさ
れていない新生物性細胞においてアポトーシスを誘導する。

【００９７】（ＩＶ．本発明の治療組成物の調製）本発明の核酸およびタンパク質の組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと組
み合わされて、インビボで使用するための治療組成物を生成し得る。従って、本
発明の核酸およびタンパク質の組成物は、薬学的に受容可能なキャリア（例えば
、水、緩衝化生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリ
コール、液体ポリエチレングリコール）またはそれらの適切な混合物）とともに
投与するために処方され得る。１つの実施形態では、本発明の核酸またはタンパ
ク質は、天然の細胞膜の脂質組成に極めて似ている液体処方物（例えば、ミセル
またはリポソーム）中に分散される。薬学的に受容可能なキャリアおよびそれら
の処方物を作製するための方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版），Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編
（１９９０）ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ
，ＰＡに見出される。

【００９８】非経口投与のための処方物は、例えば、滅菌水または生理食塩水、ポリアルキ
レングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）、植物起源の油または水素
添加したナフタレンを含み得る。生体適合性の、生分解性のラクチドポリマー、
ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピ
レンコポリマーは、キメラＣＤＫｉおよびアデノウイルスＥ４タンパク質の放出
を制御するために用いられ得る。他の潜在的に有用な非経口送達系としては、エ
チレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入系およびリ
ポソームが挙げられる。

【００９９】（Ｖ．本発明の細胞の調製）任意の細胞、しかし好ましくは動物細胞は、分泌可能なインターナリゼーショ
ン可能な形態のキメラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質
をコードする本発明の核酸配列を用いてトランスフェクトまたは形質導入され得
る。インビトロでトランスフェクトまたは形質導入された細胞は、細胞を収集し
た動物へと移植して戻され得る。インビボでは、本発明の核酸配列を含む細胞は
、キメラＣＤＫｉおよびアデノウイルスＥ４タンパク質を発現および分泌し、こ
れらは、周囲の細胞によってインターナリゼーションされる。分泌可能なインタ
ーナリゼーション可能な形態のキメラＣＤＫｉおよびアデノウイルスＥ４タンパ
ク質をインターナリゼーションする細胞が新生物性である場合、アポトーシスが
、その細胞に誘導される。分泌可能なインターナリゼーション可能な形態のキメ
ラＣＤＫｉおよびアデノウイルスＥ４タンパク質をインターナリゼーションする
細胞が非新生物性である場合、このタンパク質は、アポトーシスを誘導しないが
、増殖の阻止を誘導し得る。最終的に、分泌可能なインターナリゼーション可能
な形態のキメラＣＤＫｉおよびアデノウイルスＥ４タンパク質を分泌する細胞は
、これらのタンパク質を充分にインターナリゼーションしてそれ自体アポトーシ
スし得るかまたは増殖を阻止し得る。

【０１００】１つの非限定的な例では、動物細胞は、直鎖化されたプラスミドを用いてトラ
ンスフェクトされ得る。このプラスミドは、分泌可能なインターナリゼーション
可能な形態のＷ９タンパク質および分泌可能なインターナリゼーション可能な形
態のアデノウイルスＥ４タンパク質をコードする核酸配列を含み、ここで、この
配列は、細胞における発現のために配置される。このプラスミドはまた、選択マ
ーカー（例えば、薬物に対する耐性）をコードする導入遺伝子を含み得る。トラ
ンスフェクション後、細胞は、非プラスミド含有細胞を殺傷するに充分な量の薬
物を含む培養培地中でインキュベートされる。プラスミド含有細胞は、このよう
にして選択される。細胞は、インターナリゼーション可能な形態のＷ９タンパク
質およびインターナリゼーション可能な形態のアデノウイルスＥ４タンパク質を
分泌するので、これらのタンパク質は、細胞の馴化培地から容易に入手され得る
。好ましくは、安定にトランスフェクトされるべき細胞は、非新生物性細胞であ
り、その結果、トランスフェクトされた細胞がその細胞が分泌した任意のＷ９タ
ンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質をインターナリゼーションするべ
きである場合、その細胞は増殖が阻止されるが、新生物性細胞においてアポトー
シスを誘導するために必要とされるよりもずっと高い濃度のタンパク質がインタ
ーナリゼーションされない限り、アポトーシスを受けるように誘導されない。

【０１０１】本発明の細胞を生成するために使用するプラスミドは、分泌可能な、インター
ナリゼーション可能な形態のキメラＣＤＫｉタンパク質および分泌可能な、イン
ターナリゼーション可能な形態のアデノウイルスＥ４タンパク質をコードする核
酸配列を含み得る。この配列は、構成プロモーターまたは誘導プロモーターに作
動可能に連結されている。分泌可能な、インターナリゼーション可能な形態のキ
メラＣＤＫｉタンパク質および分泌可能な、インターナリゼーション可能な形態
のアデノウイルスＥ４タンパク質は、同じ型の制御配列を共有することを必要と
しないことが理解される。例えば、分泌可能な、インターナリゼーション可能な
キメラＣＫＤｉタンパク質をコードする核酸配列は、構成プロモーター作動可能
に連結され得、そして分泌可能な、インターナリゼーション可能なアデノウイル
スＥ４タンパク質をコードする核酸配列は、誘導プロモーターに作動可能に連結
され得る。

【０１０２】本発明の細胞はまた、１つのプラスミド単独および／または組換えウイルスで
トランスフェクトおよび形質転換されることを必要としないことも理解される。
例えば、始めに、細胞は分泌可能な、インターナリゼーション可能な形態のキメ
ラＣＤＫｉタンパク質およびハイグロマイシン耐性マーカーをコードするプラス
ミドでトランスフェクトされ得る。分泌可能な、インターナリゼーション可能な
形態のキメラＣＤＫｉタンパク質を発現および分泌する、適切な細胞株を確立し
た後、その細胞株は、分泌可能な、インターナリゼーション可能な形態のアデノ
ウイルスＥ４タンパク質およびネオマイシン耐性マーカーを分泌する複製欠損ウ
イルスで、形質導入され得る。

【０１０３】さらに、本発明の細胞は、全体のプラスミドでトランスフェクトされる必要は
ない。例えば、キメラＣＤＫｉタンパク質、アデノウイルスＥ４タンパク質、お
よび耐性マーカー遺伝子をコードする核酸配列を含む導入遺伝子は、細胞へのト
ランスフェクションの前にプラスミドから切り出される。次いで、導入遺伝子は
単独でトランスフェクトされた細胞に取り込まれ、その導入遺伝子はキメラＣＤ
Ｋｉタンパク質、アデノウイルスＥ４タンパク質、および耐性マーカー遺伝子を
発現する。

【０１０４】本発明に従って、本発明の組成物は、以下のインビトロおよびインビボでの方
法において使用され得る。

【０１０５】（Ｉ．本発明の組成物のインビトロでの使用）本発明の核酸およびタンパク質組成物は、種々のインビトロでの方法論におけ
る使用を見出す。例えば、これらの組成物は、培養細胞の特定の部分集団を除去
するアッセイにおいて使用され得る。さらに、本発明の組成物は、どの型の新生
物性細胞が、本発明の組成物での処置に対して感受性を有するかを決定するアッ
セイにおいて使用され得る。本発明の組成物はまた、培養細胞において細胞増殖
を同調させるためのアッセイにおける使用を見出す。

【０１０６】核酸組成物は、例えばインビトロでの細胞に基づいたアッセイにおいてアポト
ーシスによる細胞の部分集団を除外するために使用され得る。例えば、これらの
アッセイは、特定のシグナル伝達経路を阻害する試薬についてのスクリーニング
に使用され得る。この実施例において、ホルモンによって誘導されるシグナル伝
達経路をブロックする分子を同定することが望まれ得る。Ａ５４９細胞は、プラ
スミドで安定にトランスフェクトされ得る。このプラスミドは、キメラＣＤＫｉ
タンパク質をコードする核酸配列およびアデノウイルスＥ４タンパク質をコード
する核酸配列の両方を含み、ここでこの配列は、このホルモンによって誘導可能
なプロモーターに作動可能に連結されている。トランスフェクトされた細胞が、
このホルモンで処理される場合、それらはアポトーシスを受けるように誘導され
る。しかし、ライブラリー由来のペプチド（ホルモンによって誘導されるシグナ
ル伝達経路を阻害する）を含む細胞は死なない。従って、生存によって単離され
たこれらの細胞は伸長し得、そしてライブラリーメンバーを、ホルモンによって
誘導されるシグナル伝達経路を阻害し得るペプチドを単離するためにレスキュー
した。

【０１０７】別の例において、インビトロアッセイは、新生物性細胞の遺伝子型を決定する
ために使用され得る。この遺伝子型は、本発明の核酸組成物のインビトロでの投
与後、アポトーシスの誘導に最も感受性である。以下の実施例ＩＶおよびＶに記
載される方法と同様な方法の後、多くの異なる正常および新生物性細胞を、アデ
ノウイルス（ＡＶ−Ｗ９）で形質転換した。このアデノウイルスは、全体のＥ４
領域を含み、そして特定のキメラＣＤＫｉタンパク質（すなわちＷ９）をコード
する。形質転換の３日後、アポトーシスをＡｎｎｅｘｉｎ／ｐＩアポトーシス検
出アッセイを使用して評価した。生じた異なる新生物性細胞を異なる組織に基づ
いた形質転換について選択した。さらに、ヒト腫瘍の大部分は、腫瘍抑制遺伝子
、ｐ５３の正常な遺伝子の発現を欠き、そして網膜芽細胞腫感受性遺伝子Ｒｂの
不活性化は、いくつかのヒト癌の病因と関連するので、これらの細胞のｐ５３お
よびＲｂの状態を考慮した。また考慮したのは、これらの細胞の内因性ｐ１６お
よびｐ２７遺伝子の状態であった。

【０１０８】表ＩＡおよびＩＢは以下に、それぞれ新生物性細胞および正常細胞におけるア
ポトーシスを誘導するＡＶ−Ｗ９の能力を示す。

【０１０９】

【表１】上記の表ＩＡおよびＩＢに示されるように、正常細胞および新生物性細胞の両
方において細胞の増殖の停止を誘導することに加えて、ＡＶ−Ｗ９は、種々の細
胞型由来の腫瘍においてアポトーシスを誘導した。しかし、種々の非腫瘍形成性
原発性細胞型において、ＡＶ−Ｗ９媒介性の細胞病理学が観察されることは、ほ
とんどないか、全くない。

【０１１０】本発明の非限定的なアデノウイルス、Ｗ９（ＡＶ−Ｗ９）（全体のＥ４領域を
含み、そしてキメラＣＤＫｉをコードする）は、種々の組織由来の新生物性細胞
におけるアポトーシスを誘導した。これらの組織としては、結腸、肺、肝臓、膵
臓、および前立腺の腫瘍が挙げられる。ＡＶ−Ｗ９は、非新生物性細胞（動脈、
静脈、肺、肝臓、膵臓および前立腺に由来する）のアポトーシスを誘導しなかっ
た（または最小限に誘導した）。驚くべきことに、ＡＶ−Ｗ９による腫瘍細胞の
アポトーシスの誘導は、標的細胞のｐ１６、ｐ２７、ｐ５３およびＲｂの状態に
非依存である。例えば、Ａ５４９肺癌細胞は、ＡＶ−Ｗ９によってアポトーシス
を誘導された（正常Ｒｂ、ｐ５３、ｐ１６およびｐ２７を有するにもかかわらず
）。ＰＣ３前立腺腫瘍細胞は機能的に不活性なｐ５３遺伝子および正常Ｒｂ、ｐ
１６およびｐ２７遺伝子を有し、この細胞は、Ｙ７９網膜芽細胞腫細胞（Ｒｂ遺
伝子のホモ接合欠失、および正常ｐ５３、ｐ１６およびｐ２７を有する）のよう
にＡＶ−Ｗ９によって殺された。

【０１１１】別の実施例において、本発明のタンパク質組成物は、正常培養細胞を同調する
ために使用され得る。このような同調化は、例えばＤＮＡの複製を研究するため
に有用であり得る。この実施例において、精製されたインターナリゼーション可
能な形態のキメラＣＤＫｉタンパク質および精製されたインターナリゼーション
可能な形態のアデノウイルスＥ４タンパク質を、培養細胞に添加した。投与後、
この細胞の増殖を停止させ、次いで再刺激の際に、例えば血清に富んだ培地また
はタンパク質（例えば、中和抗体）の添加によって細胞周期の特定の時間点で同
調化され得る。

【０１１２】（ＩＩ．本発明の組成物のインビボでの使用）本発明の核酸およびタンパク質組成物は、抗新生物性治療剤としてのインビボ
での使用を見出した。

【０１１３】遺伝子治療アプローチは、インビボで新生物性細胞に対して本発明の核酸組成
物を導入するために使用され得る。これらの遺伝子治療アプローチは、ウイルス
（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイ
ルス、ワクチニアウイルス、ＲＮＡウイルス、またはヘルパスウイルス）を利用
し得るか、または非ウイルス性核酸（例えば、プラスミド）を、キメラＣＤＫｉ
タンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質をコードする核酸配列を、細胞
に導入するために利用し得る。

【０１１４】核酸組成物を動物（新生物を有するか、または有すると推測される）に送達す
るための好ましい遺伝子治療アプローチは、組換え感染性ウイルス（例えば、ア
デノウイルス）内の組成物のパッケージングによる。一旦、体内に送達されると
（例えば、注射によって）、感染性ウイルス粒子は、細胞を形質転換可能であり
、本発明の形質転換された細胞核酸組成物に送達可能である。適切なウイルスベ
クターでのウイルス粒子のトランスフェクション後、ウイルス粒子は、パッケー
ジング細胞より収集され得る。

【０１１５】本発明の核酸組成物を含む非ウイルスプラスミドまたは導入遺伝子は、インビ
トロまたはインビボで細胞に送達され得、好ましくは送達系と組み合わされ得る
。例えば、この送達系は、標的細胞によるインターナリゼーションのためのエン
ドサイトーシス経路を開発する。この型の例示的な遺伝子送達系としては、リポ
ソーム由来の系、ポリリジン系および人工ウイルスエンベロープが挙げられる。
標準トランスフェクション手順（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カル
シウム沈澱、遺伝子銃形質転換、およびＤＥＡＥデキストラン沈澱）は、インビ
トロで細胞に本発明の核酸組成物を送達するために使用され得る。インビボでの
非ウイルス性プラスミドまたは導入遺伝子の送達、好ましくは、核酸は薬学的に
受容可能なキャリアと組み合わされ、そして標的細胞による核酸のインターナリ
ゼーションを可能にするために、遺伝子送達系と組み合わされる（例えば、Ｗｕ
およびＷｕ、米国特許第５，１６６，３２０に記載されるように）。

【０１１６】タンパク質組成物は、好ましくは送達系と組み合わせて投与され得る。この送
達系は、標的細胞による組成物のインターナリゼーションを容易にする。

【０１１７】組成物のインターナリゼーションを容易にする送達系と組み合わされない治療
的タンパク質組成物は、好ましくは精製されたインターナリゼーション可能なキ
メラＣＤＫｉタンパク質（例えば、Ｗ９）および精製されたインターナリゼーシ
ョン可能なアデノウイルスＥ４タンパク質を含む。例えばこのタンパク質組成物
は、緩衝化生理食塩水中で希釈され得、そして患者の静脈内に投与され得る。

【０１１８】本発明の抗新生物性組成物、キメラＣＤＫｉタンパク質を含むタンパク質組成
物、およびアデノウイルスＥ４タンパク質、またはキメラＣＤＫｉタンパク質を
コードする核酸を含む核酸組成物およびアデノウイルスＥ４タンパク質をコード
する核酸は、任意の適切な手段によって投与され得る。例えば、本発明の抗新生
物性組成物は、従来の薬学的慣習に従ったユニット用量形態で薬学的に受容可能
な希釈剤、キャリア、または賦形剤中で動物に投与され得る。投与は、動物が同
調化される前に開始され得る。

【０１１９】任意の投与の適切な経路が使用され得、それらとしては、非経口静脈、動脈内
、皮下、筋肉内、腹腔内、エアロゾル、座剤によってか、または口の投与が挙げ
られるが、これらに限定されない。治療剤は、溶液または懸濁液の形態であり得
る；なぜなら、口の投与、処方物は錠剤またはカプセルの形態であり得るから；
そして鼻腔内処方物については、散剤の形態、鼻のドロップまたはエアロゾルで
。抗新生物性組成物は、影響された領域に（例えば、直接に腫瘍の塊に）対して
局所的に投与され得るか、または全身に投与され得る。なぜなら、少しの除外を
含み、本発明の抗新生物性組成物は新生物性細胞を殺すが、正常細胞は殺さず、
例えば本発明の組成物は癌が体全体に転移している状況で全身に投与され得る。

【０１２０】例えば、本発明の抗新生物性組成物が、核酸配列（例えば、キメラＣＤＫｉタ
ンパク質をコードする核酸配列および少なくとも１つのＥ４タンパク質）である
場合、これらの配列をコードするプラスミドは、速度駆動（ｖｅｌｏｃｉｔｙ‐
ｄｒｉｖｅｎ）方法（例えば、速度駆動微量噴出（例えば、タングステンまたは
金粒子）を使用して外来分子を細胞に導入するための微粒子銃形質転換）によっ
て局所的に投与され得る。他の速度駆動方法は、圧力バースト（ｐｒｅｓｓｕｒ
ｅｂｕｒｓｔ）に由来する。圧力バーストとしては、ヘリウム駆動、空気駆動
、および火薬駆動技術が挙げられるが、これらに限定はされない。微粒子銃形質
転換は、インタクトな組織（例えば、癌患者のインタクトな腫瘍）に適応され得
る。

【０１２１】同様に、キメラＣＤＫｉタンパク質（例えば、Ｗ９）およびアデノウイルスタ
ンパク質は、直接の注射によって、腫瘍塊に局所的に投与され得る。好ましくは
、タンパク質それ自体が注射される場合、そのタンパク質は精製され、薬学的に
受容可能なキャリア（例えば、生理食塩水）を用いて投与され、そして腫瘍細胞
にインターナリゼーション可能である。

【０１２２】導入遺伝子（キメラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質
をコードする）を保有するウイルス粒子（例えば、組換えレトロウイルス）は、
血流またはリンパ系を介して薬学的に受容可能な処方物中で全身に投与され得る
か、またはプログラム可能なミクロシリンジ（例えば、ＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）より市販されるミクロシリンジ）を使用して腫瘍部
位に対して局所的に投与され得る。他の装置（例えば、カニューレおよびウイル
ス粒子を動脈（標的腫瘍の塊を供給する）に供給する静脈内ライン）はまた、本
発明の抗新生物性ウイルス粒子の局所投与に使用され得る。

【０１２３】所望の場合、本発明の抗新生物性組成物を用いた癌患者の処置は、より伝統的
な治療（例えば、手術、ステロイド治療、放射治療、または化学療法）と組み合
わされ得る。

【０１２４】以下は、本発明の組成物を、肝臓、膵臓、および頭ならびに首に送達する、列
挙された方法である。もちろん、本発明の組成物は、他の器官（例えば、腎臓）
に送達され得、そして例えば、肝臓の静脈または動脈を介して肝臓に送達され得
るか、または体の任意の主要な血管を介して全身に送達され得る。

【０１２５】肝細胞癌または結腸腫瘍転移を有する患者について、本発明の組成物は、肝臓
内送達系と組み合わされて投与され得る。

【０１２６】非限定的な例において、本発明の試薬がアデノウイルス（Ｅ４領域の全てまた
は一部を含み、そしてＷ９タンパク質をコードする）（例えば、以下に記載され
るＡＶ−Ｗ９組換えアデノウイルス）である場合、約５×１０¹²のウイルス粒子
／用量が肝臓カニューレに連結されたポンプ（例えば、ＳＩＭＳＤｅｌｔｅｃ
Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮより市販のポンプ、約１００ｍｌの用量で３
０〜６０分）を介して送達される。用量の投与は、必要なだけ繰り返され得る。

【０１２７】膵臓癌を有する患者について、本発明の組成物がアデノウイルス（少なくとも
１つのＥ４タンパク質およびＷ９タンパク質をコードする）である場合、治療有
効量の組換えアデノウイルスは、ＣＴ誘導投与を介して脾臓血管系に送達され得
る。好ましくは、アデノウイルスは、全体のＥ４領域を欠き、この結果、全ての
アデノウイルスＥ４タンパク質がアデノウイルス感染細胞においてコードおよび
／または発現されるわけではない。

【０１２８】頭および／または首の固形腫瘍を有する患者について、例えば本発明の試薬が
ＡＶ−Ｗ９である場合、治療有効量の組換えアデノウイルスは、直接注射を介し
て多数の点で腫瘍に送達され得る。

【０１２９】新生物を有するか、または有すると推測される動物に投与された場合、本発明
の抗新生物性組成物は、治療有効量で送達される。「動物」とは、任意の動物、
好ましくは温血動物、より好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトを意
味する。本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」とは、意味のある患
者の利益を十分に示す治療組成物の総量の各活性成分を意味する。固形の腫瘍が
動物に投与される場合、治療有効量は、腫瘍の増殖を遅くするのに、より好まし
くは腫瘍の増殖を停止するのに、そして最も好ましくは腫瘍のサイズを減少する
のに十分な量である。新生物が非固形腫瘍である場合、新生物細胞は、数えられ
、そして治療有効量の本発明の組成物は、新生物細胞の数を増加を遅らせ、より
好ましくは、新生物細胞の数の増加を妨げ、そして最も好ましくは新生物細胞の
数を減少する。

【０１３０】単独で投与された個々の活性な成分が適応される場合、治療有効量は成分単独
をいう。組み合わせて投与された場合、この用語は、治療効果を生じる活性成分
の組み合わされた量をいい、成分は連続的にか、または同時にかのいずれかで組
み合わせて投与される。治療有効量を構成するものは当業者の中にあり、そして
ヒト患者の使用の前に非ヒト哺乳動物において容易に決定され得る。

【０１３１】本発明の抗新生物性組成物が、精製されたキメラＣＤＫｉタンパク質および精
製されたＥ４タンパク質である場合、治療有効量は多くの因子に依存して異なり
得る。これらの因子としては、細胞によってインターナリゼーションされるか、
されないタンパク質、および固形腫瘍に直接注射されるか、または全身に送達さ
れるタンパク質が挙げられるが、これらに限定はされない。治療有効量は、等量
のキメラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質から必ずしも
なるわけではないことが理解される。例えば、治療有効量で、各々１つのアデノ
ウイルスＥ４タンパク質分子についての、２つのキメラＣＤＫｉタンパク質分子
が存在し得る。

【０１３２】本発明の抗新生物性試薬が、キメラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルス
Ｅ４タンパク質をコードする組換えウイルス粒子である場合、例えば治療有効量
は、全身にかまたは腫瘍に直接送達されるウイルス、および複製欠失であるかま
たは複製可能であるウイルスに依存する。また、組換えウイルスの治療有効量は
異なり得る。タンパク質が、形質転換された細胞内のみで作用するか、またはタ
ンパク質がまたリーダー配列および転座配列を含む場合に、異なり得る。従って
、タンパク質が分泌され、そしてパラクリン様式で周囲の細胞に作用することを
可能にする。治療有効量の１つの非限定的な例において、本発明の試薬は、複製
欠損アデノウイルスＷ９（以下でＡＶ−Ｗ９と記載される）であり、このアデノ
ウイルスは全体のＥ４領域を含み、そしてキメラＣＤＫｉタンパク質をコードす
る。そして本発明の試薬は、約４０ｍｍ³に直接に投与され、１日に約１×１０¹ ¹ のウイルス粒子／注射が、３日間投与される。多数のウイルス粒子および／ま
たは３日以上の投与は、約４０ｍｍ³より大きい固形腫瘍に使用される。

【０１３３】（ＩＩＩ．本発明の細胞のための使用）分泌可能な、インターナリゼーション可能な形態のキメラＣＤＫｉタンパク質
およびアデノウイルスＥ４タンパク質をコードする導入された核酸を含む細胞は
、分泌可能な、インターナリゼーション可能なキメラＣＤＫｉタンパク質および
インターナリゼーション可能なアデノウイルスＥ４タンパク質の持続性供給源と
してインビトロで使用され得る。タンパク質をコードする核酸配列が、構成プロ
モーターに作動可能に連結される場合、細胞によるタンパク質のインターナリゼ
ーションを防ぐために頻繁に培地を回収することは得策であり得る。

【０１３４】分泌可能な、インターナリゼーション可能な形態のキメラＣＤＫｉタンパク質
および分泌可能な、インターナリゼーション可能な形態のアデノウイルスＥ４タ
ンパク質をコードする核酸で導入された本発明の細胞はまた、例えば、新生物を
有する動物におけるパラクリン作用性分泌可能な、インターナリゼーション可能
なキメラＣＤＫｉタンパク質および分泌可能な、インターナリゼーション可能な
アデノウイルスＥ４タンパク質の送達ビヒクルとしてのインビボでの使用を見出
した。好ましくは、この細胞は、処置された動物と同じＭＨＣ遺伝子型を有する
。より少なく好ましくは、この細胞は処置された動物と同じ種である。

【０１３５】本発明の細胞の使用は、前立腺癌と診断された患者の場合を用いて例示され得
る。患者が他の治療で処置される場合、例えば、本発明の核酸組成物を用いる遺
伝子治療は、正常上皮細胞を患者より採取され得、そしてインビボで伸長させ得
る。次いで伸長された細胞は、分泌可能な、インターナリゼーション可能な形態
のキメラＣＤＫｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質をコードする
核酸配列で安定にトランスフェクトされ得、ここでこの配列は、薬剤誘導性プロ
モーターに作動可能に連結され、そしてトランスフェクトされた細胞において発
現のために配置される。分泌可能な、インターナリゼーション可能なキメラＣＤ
Ｋｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質を発現する十分な数の安定
にトランスフェクトされた細胞を得た後、これらの細胞を患者に、好ましくは癌
性細胞の近くの部位に移植する。次いで誘導薬剤を患者に投与し、そして安定に
トランスフェクトされた細胞はパラクリン様式で作用するタンパク質を発現し、
そして癌性細胞近くにおいてアポトーシスを誘導するために役立つ。一旦癌が静
まったら、もはや患者は誘導薬剤を投与されない。

【０１３６】第二の実施例において、患者は、任意のＭＨＣ発現を欠く安定にトランスフェ
クトされた細胞の移植を受けた癌を有すると診断された。安定にトランスフェク
トされた細胞は、分泌可能な、インターナリゼーション可能な形態のキメラＣＤ
Ｋｉタンパク質およびアデノウイルスＥ４タンパク質をコードする核酸配列を含
み、ここでこの配列は、構成プロモーターに作動可能に連結され、そしてトラン
スフェクトされた細胞における発現のために配置される。一旦移植されると、安
定にトランスフェクトされた細胞は発現し、そしてパラクリン作用性キメラＣＤ
ＫｉおよびアデノウイルスＥ４タンパク質を分泌する。一旦癌が静まったら、安
定にトランスフェクトされた細胞は、外科的に除去され得る。

【０１３７】以下の実施例は、本発明の作製および実行の好ましい形態を例示するが、本発
明の範囲の限定を意味しない。なぜなら、代替方法は、同様の結果を得るために
利用され得るからである。

【０１３８】（実施例Ｉ）（ｐ２７／ｐ１６融合タンパク質の産生）ｌＮＫ４（ｐ１６）およびＣＩＰ／ＫＩＰ（ｐ２７）ファミリーの両方の活性
を有するより強力な抗増殖性分子を作製するために、親ヒトｐ１６およびｐ２７
分子またはそれらの誘導体と融合された多数の組換えＣＤＫｉ’ｓを作製した。
改変されたＣｄＫｉ’ｓは、５’および３’短縮ｐ２７分子に融合されたｐ１６
融合タンパク質を含んだ。これらの融合タンパク質は、タンパク質の半減期を増
加し、ＣＤＫｉ活性のネガティブな調節を強力なリン酸化部位をを除去するため
に設計された。ｐ２７−ｐ１６融合タンパク質は、ＣＤＫ４／サイクリンＤ、Ｃ
ＤＫ２／サイクリンＡ、およびＣＤＫ２／サイクリンＥ複合体相互作用し、そし
て細胞周期の進行を複数の点で阻害した。

【０１３９】以下の非限定的な、代表的な本発明のＣＤＫｉ融合タンパク質（およびこれら
のタンパク質をコードする核酸配列）を産生するためにヒトｐ１６およびｐ２７
分子の公開された配列を使用した。ヒトｐ２７の核酸配列（配列番号２５）およ
びアミノ酸（配列番号２６）配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１０９０６（Ｐ
ｏｌｙａｋら、（１９９４）Ｃｅｌｌ７８：５６〜６６）として利用可能であ
る。ヒトｐ１６の核酸（配列番号２７）およびアミノ酸（配列番号２８）配列は
、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２７２１１（Ｓｅｒｒａｎｏら、（１９９３）Ｎａ
ｔｕｒｅ３６６：７０４〜７０７；Ｏｋａｍｏｔｏら、（１９９４）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１１０４５〜１１０４９として
利用可能である）。代表的な、非限定的な本発明のＣＤＫｉ融合タンパク質を構
築するために、一般的に、ＰＣＲプライマーを使用して、ＮｄｅＩクローニング
部位、次いで６×Ｈｉｓをコードする配列、およびインフルエンザウイルス赤血
球凝集素タンパク質由来のエピトープタグ（ＨＡタグ）を全長ｐ２７の５’末端
にか、または短縮ｐ２７_25-93ならびｐ２７_12-178に挿入した。各場合において
、ＣＤＫｉ遺伝子は、ＳａｌＩクローニング部位を有するアンバー停止コドンに
続いた。ＮｄｅＩ−ＳａｌＩフラグメントをＤｅｅｐＶｅｎｔポリメラーゼ（
ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡより市販され
ている）によって増幅し、そしてプラスミドｐＴ７−７（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ（ＵＳＢ）、Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、ＭＡより市販されている）にクロー
ン化し、ｐＴ７−Ｈｉｓ６−ＨＡ−ｐ２７、ｐＴ７−Ｈｉｓ６−ＨＡ−ｐ２７₂₅ _-93 およびｐＴ７−Ｈｉｓ６−ＨＡ−ｐ２７_12-178を得た。停止コドンおよび（
Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃リンカーを含まないフラグメントを産生するために、３’ＰＣ
Ｒプライマーの代替のセットを使用して、３’末端のＳａｌＩクローニング部位
を用いて停止コドンの位置に（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃リンカーをコードする配列を挿
入した。次いでこれらのＮｄｅＩ−ＳａｌＩ増幅フラグメントを全長ｐ１６を含
むＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ消化ｐＫＳプラスミドにサブクローン化し、開始ＡＴ
Ｇを除去し、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）３、ヒスチジンおよびアスパラギン酸によって
種々のｐ２７誘導体および全長ｐ１６が連結されたオープンリーディングフレー
ムを産生した。代表的な、非限定的なこの実施例のＣＤＫｉタンパク質を概略的
に図２Ａに示し、そして以下のように構築した。

【０１４０】ｐ２７とｐ１６部分との間に（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃ヒンジ領域を有するｐ２７−
ｐ１６融合タンパク質（すなわち、Ｎ末端がｐ２７、そしてＣ末端がｐ１６）を
コードする核酸分子（Ｗ３）を構築するために、ｐ２７コード配列を、以下のプ
ライマーを用いてまずＰＣＲ増幅した：Ｎ末端プライマー、これは、ＮｄｅＩ部位および６個のヒスチジンコドンを有
し、このヒスチジンコドンは、ＡＴＧとｐ２７の第二のアミノ酸との間に挿入さ
れ（配列番号１）：

【０１４１】

【化１】および、Ｃ末端プライマー、これは、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃反復ならびにＥｃｏＲ
Ｉ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有し、そしてｐ２７の終止コドンを排
除する（配列番号２）：

【０１４２】

【化２】ｐ２７のＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＮｅｄ
ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで直線化されたｐＴ７−７の中に挿入した。生じた構築
物を、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、全長ｐ１６のＰＣＲ産物を、Ｅｃｏ
ＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントとして挿入した。ＥｃｏＲＩ部位の位置によって、
ｐ１６のインフレームの挿入が可能となる。ｐ２７とｐ１６コード配列との間の
残りのヒンジ領域は、ｐ１６ｃＤＮＡの５’末端から誘導される。Ｗ３の核酸
配列およびアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号３および配列番号４に提供され
る。

【０１４３】第二のｐ２７−ｐ１６融合タンパク質をコードする核酸配列（Ｗ４）を作製し
た（ここで、ｐ２７およびｐ１６部分は、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃ヒンジ領域によっ
て分離されていない。Ｗ４をコードする核酸配列構築物は、５’ＥｃｏＲＩ部位
を含み、加えてＮ末端ＨＡタグ、および３’ＮｏｔＩ部位に対するコード配列を
含む。Ｗ４の核酸配列およびアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号５および配列
番号６に提供される。

【０１４４】２つのｐ１６−ｐ２７融合タンパク質（すなわち、Ｎ末端がｐ１６、そしてＣ
末端がｐ２７）である、Ｗ５（ｐ１６とｐ２７部分との間に位置する（Ｇｌｙ₄
Ｓｅｒ）₃ヒンジ領域を有する）およびＷ６（（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃ヒンジ領域を
有さない）を、同様に作製した。Ｗ５の核酸配列およびアミノ酸配列が、それぞ
れ、配列番号７および配列番号８に提供される。Ｗ６の核酸配列およびアミノ酸
配列が、それぞれ、配列番号９および配列番号１０に提供される。

【０１４５】さらに、タンパク質半減期を増加するように設計された一連のｐ２７の短縮型
の一連は、Ｎ末端で全長ｐ１６に融合された。１つのｐ２７短縮（ｐ２７₁₂〜₁₇ ₈ ）において、最初の１２個のＮ末端および最後の２０個のＣ末端アミノ酸が、
全長ｐ２７から除去され、アミノ酸１８７〜１９０におけるＣＤＫコンセンサス
リン酸化部位（ＴＰＫＫ）、プロリン指向性キナーゼに対する２つの他の潜在的
なリン酸化部位（アミノ酸１７８〜１８１（ＳＰＮ））、およびアミノ酸１０〜
１３における弱いＣＤＫリン酸化部位（ＳＰＳＬ）を除去した（Ｓｈｅａｆｆら
（１９９７）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１１：１４６４−１４７８；Ｍｏｒｉｓａｋ
ｉら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２
４０：３８６−３９０）。この短縮ｐ２７タンパク質（１２ａａ〜１７８ａａ）
の核酸配列およびアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１１および配列番号１２
に提供され、これは、式ＥｃｏＲＩ−ＡＴＧ−ＨＡエピトープ−ｐ２７（１２〜
１７８ａａ）−Ｓｔｏｐ−ＮｏｔＩのポリペプチドを提供する。

【０１４６】Ｗ７は、全長ｐ１６に融合したｐ２７のアミノ酸１２〜１７８を含み、ここで
ｐ２７およびｐ１６部分は、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃ヒンジ領域によって分離されて
いる。Ｗ７のの核酸配列およびアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１３および
配列番号１４に提供される。Ｗ８は、全長ｐ１６に融合したｐ２７のアミノ酸１
２〜１７８を含み、ここでｐ２７およびｐ１６部分は、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃ヒン
ジ領域によって分離されていない。Ｗ８の核酸配列およびアミノ酸配列が、それ
ぞれ、配列番号１５および配列番号１６に提供される。

【０１４７】ｐ２７の第二の短縮（ｐ２７₂₅〜₉₃）において、ｐ２７のＣＤＫ阻害ドメイン
（アミノ酸２５〜９３）のみが、保持される。このドメインは、ＣＤＫおよびサ
イクリン結合サブユニットの両方と接触し、キナーゼ活性に十分であるが、アミ
ノ酸１５２〜１６６の各局在化シグナルおよびアミノ酸１４４〜１９４のタンパ
ク質相互作用に潜在的な部位であるＱＴドメインを欠く（Ｒｕｓｓｏら（１９９
８）Ｎａｔｕｒｅ３９５：２３７−２４３）。従って、ｐ２７₂₅〜₉₃ＣＤＫｉ
は、親のｐ２７分子を標的化しユビキチンプロテオソーム分解経路に役割を果た
し得るかまたはｐ２７リン酸化に役割を果たし得るアミノ酸残基を除去するよう
に作製された。この短縮されたｐ２７タンパク質（２５ａａ〜９３ａａ）の核酸
配列およびアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１７および配列番号１８に提供
され、これは、式ＥｃｏＲＩ−ＡＴＧ−ＨＡエピトープ−ｐ２７（２５〜９３ａ
ａ）−Ｓｔｏｐ−ＮｏｔＩのポリペプチドを提供する。

【０１４８】ｐ２７₂₅〜₉₃フラグメントは、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃ヒンジ領域を伴ってか（Ｗ
１０）または伴わずに（Ｗ９）、ｐ１６のＮ末端に融合された（図２Ａ）。Ｗ９
の核酸配列およびアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１９および配列番号２０
に提供される。Ｗ１０の核酸配列およびアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号２
１および配列番号２２に提供される。

【０１４９】Ｗ３、Ｗ８およびＷ１０はさらに、改変されたｐＧＥＸ４Ｔ−１プラスミド（
ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（ここ
で、ＮｄｅＩクローニング部位は、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位との間に挿入
された）に、ＮｄｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてサブクローニングされ、グ
ルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ化された融合タンパク質を作
製する。同様の戦略が、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃リンカーを伴わない融合タンパク質
（すなわち、Ｗ４（ｐ２７−ｐ１６）、Ｗ７（ｐ２７₁₂〜₁₇₈−ｐ１６）および
Ｗ９（ｐ２７₂₅〜₉₃−ｐ１６）を作製するために使用された。ＨＡタグおよび６
個のヒスチジン残基を伴わないｐ２７₂₅〜₉₃−ｐ１６融合タンパク質ＣＤＫｉ（
Ｗ９）の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２３および配列番
号２４、ならびに図２Ｂに提供される。

【０１５０】ｐ２７、ｐ２７₂₅〜₉₃およびｐ２７₁₂〜₁₇₈タンパク質は、上記のｐＴ７プラ
スミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１菌株中で発現された。タンパク質発現
に関して、細胞を、ＬＢ＋５０ｍｇアンピシリン中、３７℃でＯＤ₆₀₀＝０．８
まで増殖させ、そしてタンパク質発現は、ＩＰＴＧ（最終濃度：２０ｍＭ）によ
って３７℃で４時間誘導した。細胞を回収し、そしてペレットを−８０℃で凍結
した。細胞溶解物の調製およびＮｉ²⁺の荷電したセファロース樹脂（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎＣｏｒｐ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ；カタログ番号Ｒ８０１）へ
の結合は、製造者らに指示書に従って行った（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｈｏｃｈ
ｕｌｉら（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ４１１：１７７〜１
８４；Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８８：８９７２−８９７６をまた参照のこと）。結合したタンパク
質は、５０ｍＭ、２００ｍＭ、３５０ｍＭおよび５００ｍＭのイミダゾールで溶
出し、そしてこの分画を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析した。２００ｍＭ、３５０ｍ
Ｍおよび５００ｍＭのイミダゾール分画を収集し、１×ＰＢＳ（１ｍＭＫＨ₂
ＰＯ₄、１０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、１３７ｍＭＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ
、ｐＨ７．４）＋１０％グリセロールに対して透析し、そして、等分して−８０
℃で貯蔵した。約２５％の調製物（ｐｒｅｐ）が、タンパク質であった。

【０１５１】ｐ２７₂₅〜₉₃およびｐ２７₁₂〜₁₇₈をさらに、ＰＢＳ中１０％グリセロールで
平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ＦＰＬＣカラムを用いた、ゲル濾過カラムクロ
マトグラフィーによって精製した。ＧＳＴタグ化Ｗ３、Ｗ４、Ｗ７、Ｗ８、Ｗ９
およびＷ１０融合タンパク質の発現および精製は、基本的に記載（Ｇｙｕｒｉｓ
ら（１９９３）Ｃｅｌｌ７５：７９１−８０３）された通りであった。次いで
、精製されたＧＳＴ融合タンパク質は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．
０、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ₂への透析によって緩衝液を交換
した。ＧＳＴドメインは、１ユニット（ＵＳＢユニット）のタンパク質／時間の
トロンビン／ｍｇ（トロンビンは、ＵＳＢから市販される）で酵素的に切断する
ことによって融合タンパク質から除去した。切断に続いて、トロンビンを、２倍
過剰モル濃度のＰＰＡＣＫ（ＵＳＢ）で不活性化した。次いで、切断されたＧＳ
Ｔ部分を、グルタチオン−セファロースのカラムに対してタンパク質溶液を通過
させることによって除去した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ
）を標準として用いるタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
、ＭＡ）を使用して測定した。より正確に各調製物中の特定のタンパク質の濃度
および純度を測定するために、タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、
そしてクマシーブルーで染色した。染色されたゲルを、ＧｅｌＤｏｃ１００
０イメージ分析システムおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒＡｎａｌｙｓｔソフトウェ
ア（ＢｉｏＲａｄ）を用いて分析した。

【０１５２】ｐ２７およびｐ１６ＣＤＫｉは、全ての融合タンパク質ＣＤＫｉにおいて正確
に折り畳んでいるようであった。なせなら、生物学的データにより、ｐ２７部分
が機能的であることが示され、そして抗ｐ１６抗体を用いた細胞内染色により、
少なくとも肉眼レベルにおいて、ｐ１６分子は正確に折り畳まれているとが示さ
れたからである。

【０１５３】（実施例ＩＩ）（ＣＤＫｉタンパク質のインビトロキナーゼ阻害活性）ｐ２７およびｐ１６ＣＤＫｉに対する天然の基質は、サイクリン依存性キナー
ゼ（ＣＤＫ）複合体であり、この複合体は、異なる触媒ＣＤＫおよび調節サイク
リンサブユニット結合を介して形成される。ＣＤＫ４／サイクリンＤおよびＣＤ
Ｋ６／サイクリンＤ複合体は、Ｇ１期を介した進行を調節し、ＣＤＫ２／サイク
リンＥキナーゼは、Ｇ１／Ｓ移行を調節し、ＣＤＫ２／サイクリンＡ複合体は、
Ｓ期を介して細胞を駆動させ、そして有糸分裂への侵入および退出は、ＣＤＣ２
／サイクリンＢ複合体によって制御される（Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．（１９９６）
Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：１６７２−１６７７）。ＣＤＫｉは、リン酸化事象と
物理的関連の組み合わせを介して、ＣＤＫ複合体の活性を調節する（Ｍｏｒｇａ
ｎ，Ｍ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ３７４：１３１−１３４）。細胞周期の間
の異なるＣＤＫ／サイクリン複合体間のＣＤＫｉの再分布は、活性化のタイミン
グおよびそれらのキナーゼ活性の非活性化を調整する（ＳｈｅｒｒおよびＲｏｂ
ｅｒｔｓ（１９９５）ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖ．９：１１４９−１１６３）
。

【０１５４】本発明のＣＤＫｉの能力を測定するために、ＣＤＫ４／サイクリンＤ１、ＣＤ
Ｋ２／サイクリンＥおよびＣＤＣ２／サイクリンＢ複合体のインビトロキナーゼ
活性を阻害するそれらの能力を測定した。種々のｐ２７−ｐ１６融合タンパク質
、ｐ２７およびｐ１６調製物の大部分は、ｐ１６およびｐ２７の特異的抗体を用
いて標準化した。

【０１５５】活性なＣＤＫ４／サイクリンＤ１、ＣＤＫ２／サイクリンＥおよびＣＤＣ／サ
イクリンＢ複合体が、組み換えサイクリンおよびＣＤＫを発現するバキュウロウ
イルスでトランスフェクトされたＳｆ９昆虫細胞から得られた。簡単に言うと、
このアッセイは、適切なＣＤＫおよびサイクリン発現構築物で同時に感染された
細胞から作製されたＳｆ９細胞抽出物を使用した。代表的には、以下：５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴ、２
５ｍＭＡＴＰ、１０ｍＣｉ ³²Ｐ−γ−ＡＴＰの５０ｍｌ中の４４ｍｇのＳｆ
９抽出物を、特定のインヒビター（インヒビター濃度は、２５ｎＭと１ｍＭとの
間であった）の非存在下で使用した。ＣＤＫ４／サイクリンＤ１の部分精製は、
細胞溶解物の２０〜４０％硫酸アンモニウム調製によって達成し、そしてこのア
ッセイに使用した。ＣＤＫ２／サイクリンＥは、９０％より高く精製し、そして
完全な活性化のために、ＣＤＫ活性化キナーゼ（ＣＡＫ）を用いて前処理した（
Ｍｏｒｇａｎ，Ｍ．、前出）。ＣＤＣ２／サイクリンＢは、ＧＳＴ融合タンパク
質（ＣＤＣ２／ＧＳＴ−サイクリンＢ）として発現され、そしてグルタチオン−
セファロースカラム上で精製し、トロンビンによって切断し、続いて切断された
ＧＳＴの除去のために別のグルタチオン−セファロース分離をした。ＧＳＴ融合
されたＲｂ（ｐＲＢのＣ末端由来のアミノ酸３７９〜９２８有するグルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼ融合物；ＧＳＴ−Ｒｂ）を、ＣＤＫ４／サイクリンＤ１
およびＣＤＫ２／サイクリンＥアッセイの基質として使用し；ヒストンＨ１は、
ＣＤＣ２／サイクリンＢに対する基質であった。反応は、２ｍｇの基質を用いて
、３０℃で３０分間実施した。これらのアッセイは、９６ウェルプレート（Ｎｕ
ｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）上で実施し、そしてγ−³²ｐ−ＡＴＰ取り
込みによってモニターした。

【０１５６】この反応は、昆虫細胞発現されたＣＤＫ（例えば、ＣＤＣ２／サイクリンＢ）
およびＥ．ｃｏｌｉ発現されたＣＤＫｉ（例えば、ｐ２７およびＷ９）の添加に
よって開始した。ＧＳＴ−ＲｂおよびヒストンＨ１の濃度は、それぞれ、４．４
ｍＭおよび１９ｍＭであり、そしてＡＴＰの濃度は５０〜６０ｍＭであった。反
応混合物は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂
および１ｍＭＤＴＴを、５０または１００μｌの全容量で含んだ。３０℃での
１０〜２０分間のインキュベーション後、この反応を、ＥＤＴＡを含む停止溶液
の添加によって終了した。リン酸化基質は、ＧＳＴ−セファロースまたはＴＣＡ
沈澱のいずれかによって捕らえ、次いで放射能をモニターした（Ｍｉｃｒｏｐｌ
ａｔｅＳｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎＣｏｕｎｔｅｒ，Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅ
ｒｉｄｅｎ，ＣＴ）。

【０１５７】５０％のキナーゼ活性が阻害されたＣＤＫｉタンパク質の濃度（ＩＣ₅₀）を、
種々のサイクリン／ＣＤＫ対に対して計算した。結果を、表ＩＩ（下記）および
図２Ａ（ＣＤＫ４／サイクリンＤ１（ｎＭ）、ＣＤＫ２／サイクリンＥ（ｎＭ）
およびＣＤＣ／サイクリンＢ（ｎＭ）で表示された３つの列）に示す。さらに、
ＣＤＫ４／サイクリンＤ１のｐ２７／ｐ１６融合タンパク質による阻害に対する
阻害定数、Ｋ_iは、２３ｎＭに対して測定し、同じＣＤＫ４複合体のｐ１６阻害
に関する７５ｎＭのＫ_iと比較した。

【０１５８】

【表２】表ＩＩおよび図２Ａに示すように、ｐ１６は、ＣＤＫ４／サイクリンＤ１キナ
ーゼの強力なインヒビターあった。対照的に、ｐ２７は、３つ全てのキナーゼ複
合体の強いインヒビターであった。種々のｐ２７改変体は、単量体または融合タ
ンパク質のＣＤＫｉのインビトロ阻害活性に、明確に影響しなかった（図２Ａを
参照のこと）。一般的に、融合ＣＤＫｉ中のｐ１６およびｐ２７ＣＤＫの順序は
、融合ＣＤＫｉの活性に影響を与えないようである。さらに、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ
）₃ヒンジ領域は、融合ＣＤＫｉにおけるｐ２７機能を保持するのに必要ではな
い。

【０１５９】従って、インビトロキナーゼ阻害実験により、精製されたｐ２７₁₂〜₁₇₈、ｐ
２７₂₅〜₉₃または融合ｐ２７／ｐ１６タンパク質（Ｗ３、Ｗ４、Ｗ７、Ｗ８、Ｗ
９およびＷ１０）の強さは、全長ｐ２７またはｐ１６およびｐ２７の等モル濃度
混合物の強さと、認めるほどに異ならないことが示された。ＣＤＫ４／サイクリ
ンＤ１複合体の活性は、ｐ１６およびｐ２７の両方によって阻害された。

【０１６０】（実施例ＩＩＩ）（ｐ１６、ｐ２７およびｐ２７／ｐ１６融合タンパク質をコードする組換えア
デノウイルスの構築）複製欠損、Ｅ１領域欠失およびＥ３領域欠失、アデノウイルス５（Ａｄ５）組
換え体を含むＥ４領域の構築に使用されるアデノウイルスベクター系は、Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｘＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉ
ｏ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。６個のヒスチジン残基、ＨＡ−タグ化インヒ
ビターは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーおよびＳＶ４０ポリＡシグナルの
制御下での発現に対して位置付けられた。

【０１６１】Ｅ４領域を含みかつｐ２７をコードするアデノウイルス（ＡＶ−ｐ２７）は、
製造者らの指示書（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）に従って、２９３細胞中のインビボ組換
えによって構築した。ＡＶ−ｐ２７ＤＮＡは、増幅させたウイルスから単離し、
そしてＣｌａＩで消化した。この消化により、ｐ２７発現カセット、ならびにＡ
ｄ５の左の逆方向末端反復（ＩＴＲ）およびパッケージングシグナルを取り除い
た（図３を参照のこと）。ＨＡ−タグ化ｐ１６、ｐ２７₂₅〜₉₃、ｐ２７₁₂〜₁₇₈
、Ｗ３、Ｗ７およびＷ９分子を、プラスミド（ｐＫＳ−ＩＴＲ−ＣＭＶ）中にク
ローニングした。このプラスミドは、発現カセット、ならびに隣接するＥｃｏＲ
ＶおよびＣｌａＩ制限部位を有する、左のＩＴＲおよびパッケージングシグナル
を含む。機能的エレメントの順序は、５’から３’へ以下のように続く：Ｅｃｏ
ＲＶ−左のＩＴＲ−パッケージングシグナル−ＣＭＶエンハンサー／プロモータ
ー−ＣＤＫｉ挿入物−ＳＶ４０ポリＡ−ＣｌａＩ。ＣＤＫｉ挿入物を含むＥｃｏ
ＲＶ−ＣｌａＩフラグメントを、インビトロで、欠失された大きなＡｄ５ＤＮＡ
に連結し、そしてこの連結されたＤＮＡを、２９３細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴ
ｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａ
ｓ，ＶＡから市販される）にトランスフェクトした。

【０１６２】感染性組換えウイルス粒子を、２９３細胞からレスキューした。連結されてい
ない大きなＡｄ５フラグメントは、感染性ウイルス単独を産生することはできな
かった。なぜなら、ウイルス複製に必須である左のＩＴＲおよびパッケージング
シグナルを欠くからである。感染性組換え体は、小さなＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩフ
ラグメント（これは、左のＩＴＲ、パッケージングシグナル、発現カセットおよ
びＣＤＫｉ挿入物を含む）が、Ａｄ５ＤＮＡのＣｌａＩ消化された末端に連結さ
れた場合のみに形成され、感染性Ａｄ５組換えウイルスＤＮＡを再び作り出す。

【０１６３】（実施例ＩＶ）（Ｅ４領域全体を含むアデノウイルスによって送達されるｐ１６、ｐ２７およ
びｐ２７／ｐ１６融合タンパク質の安定性）ｐ２７は、増殖性細胞における、寿命が短いタンパク質であると報告された（
Ｐａｇａｎｏら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９：６８２−６８５；Ｈｅｎ
ｇｓｔおよびＲｅｅｄ（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：１８６１−１８６
４）。ＣＡＳＭＣ中の種々のＣＤＫｉの半減期を測定するために、パルス−チェ
イス実験を、ＣＡＳＭＣを用いて実施し、このＣＡＳＭＣは、Ｅ４領域全体を含
みかつ種々のＣＤＫｉをコードするアデノウイルス（ＡＶ−ＣＤＫｉ）で形質導
入されていた。

【０１６４】ヒト冠状動脈平滑筋細胞（ＣＡＳＭＣ）は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅ
ｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。少ない継代（１０継代未満）のＣＡＳＭＣを
、完全ＳＭＣ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（５％ＦＢＳおよび増殖因子を加えた）
）中、３５００細胞／ｃｍ²でプレートし、そして一晩回復させた。増殖性細胞
に関して、培養は、全て完全ＳＭＣ中で維持した。休止細胞に関して、培養は、
低い血清培地（０．０５％ＦＢＳおよび１：１００の増殖因子を有するＳＭＣ
培地）中、４８時間血清飢餓させた。

【０１６５】増殖停止された（Ｇ₀）および増殖性（Ａ_s）ＣＡＳＭＣは、５０の感染多重度
（ＭＯＩ）で、種々の組換えアデノウイルスを用いて形質導入し、この組換えア
デノウイルスは、Ｅ４領域を含みかつＣＤＫｉをコードした。２４時間後、細胞
を、³⁵Ｓ−メチオニンを含む培地中で、２時間、放射性標識した（「パルスした
」）。次いで、³⁵Ｓ−メチオニンを含む培地を除去し、そして過剰の非放射性標
識アミノ酸を含む培地で交換し、その細胞を、０、１、３、９、１８時間、そし
て０、１、２、３、４および５日間、「チェイス」した。細胞ペレットを、５０
ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ７．５、２５０ｍＭＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−
４０、５０ｍＭＮａＦ、５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭバナ
ジン酸ナトリウム、およびプロテアーゼインヒビター中に溶解した。タンパク質
濃度は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として用いたタンパク質アッセイ
（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して測定した。次いで、細胞からの全タンパク質の相当
量を、プロテインＡ−セファロースに結合した抗体を用いて免疫沈降した。使用
した抗体は、ｐ２７（Ｋｉｐ１、ＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹから市販される）、およびｐ１６−Ｃ２０
（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ．，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡから
市販される）であった。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして
このゲルを吸引乾燥させ、そしてフィルムに露出させた。オートラジオグラフィ
上の放射性標識されたタンパク質は、ＧｅｌＤｏｃ１０００イメージ分析シ
ステムおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒＡｎａｌｙｓｔｓソフトウェア（Ｂｉｏｒａ
ｄ）を用いて分析した。

【０１６６】発現されたＨＡエピトープタグ化されたタンパク質の観察された分子量は、予
想サイズに一致した：ｐ２７、約３０ｋＤ；ｐ２７₁₂〜₁₇₈、約２８ｋＤ；ｐ２
７₂₅〜₉₃、約１０ｋＤ；ｐ１６、約１９ｋＤ；Ｗ３、約４８ｋＤ；Ｗ７、約４６
ｋＤ；およびＷ９、約３０ｋＤ（図には示さず）。

【０１６７】免疫沈降されたＣＤＫｉ由来のシグナル崩壊の運動性は、特定の時間点におけ
るオートラジオグラフィによって評価した（図２Ａを参照のこと）。ＣＤＫｉの
半減期は、残存する最初のＣＤＫｉタンパク質シグナルを半分にする時間点とし
て評価した。休止ＣＡＳＭＣ（Ｇ₀細胞）において、ｐ１６、ｐ２７、Ｗ３、Ｗ
７およびＷ９タンパク質全ては、２〜３時間の半減期を有した（図２Ａ）。有意
な差違は、増殖性細胞（Ａ_s）にのみ観察さ、ここでＷ７タンパク質は、２０時
間の半減期を示した。

【０１６８】（実施例Ｖ）（ＡＶ−Ｗ９は、新生物性細胞において強力な抗増殖活性を有する）ＡＶ−Ｗ９は、ＡＶ送達される親分子のｐ１６またはｐ２７、ＡＶ−Ｗ７およ
びＡＶ−Ｎｕｌｌよりも低いＭＯＩにおいて、ＳＷ４８０結腸癌腫細胞（図４Ａ
）およびＡ５４９肺癌腫細胞（図４Ｂ）の細胞増殖を阻害した。ｐ１６、ｐ２７
、Ｗ７およびＷ９に対するウイルス粒子／プラーク形成ユニットの比率は、類似
していた（それぞれ、３０５ｖｐ／ｐｆｕ、２６７ｖｐ／ｐｆｕ、１４１ｖｐ／
ｐｆｕおよび１９７ｖｐ／ｐｆｕ）。これらの実験に関して、６ウェルプレート
中、１ウェル当たり１×１０⁵細胞をプレートした。細胞接着の後、培地を部分
的に吸引し、そしてウイルスを示されたＭＯＩで添加した。２時間後、新鮮な培
地を各ウェルに添加し、そしてこの細胞を１〜３日間インキュベートした。分析
のために、細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、そして製造者らの指示書に従って、
ＴｄＴＴＵＮＥＬアッセイ（ＰｈｅｏｎｉｘＦｌｏｗＳｙｓｔｅｍｓ，Ｓａ
ｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）および／またはアネキシン結合アッセイ（Ｒ＆ＤＳｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いてアポトーシスに対して評
価した。細胞はまた、トリパンブルー標識を用いて生存能力を分析し、そして生
細胞の数を計数することによって細胞周期停止を分析し、細胞増殖（ｃｅｌｌ
ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を評価した。

【０１６９】（実施例ＶＩ）（新生物性細胞におけるＡＶ−Ｗ９誘導アポトーシス）新生物性細胞においてアポトーシスを誘導するＡＶ−Ｗ９の能力を、実験した
。まず、Ａ５４９肺癌腫細胞を、相当量のアデノウイルス（これは、Ｅ４領域を
含み、そしてβ−ｇａｌまたはＷ９のいずれかをコードする）で形質導入した（
それぞれ、図５Ａおよび５Ｂ）。形質導入された細胞を、２日後収集し、そして
アポトーシスのレベルをアネキシン−ＰＩ染色によって確認した。この２重染色
によって、非アポトーシス細胞は、ヒストグラムの下の左象限に現れ；死細胞か
らの核は、このヒストグラムの上の左象限に現れる。アポトーシス細胞は、この
ヒストグラムの右半分に現れ、後期のアポトーシス性／壊死性細胞は、このヒス
トグラムの頂部右隅に現れ、中期段階のアポトーシス細胞はこのヒストグラムの
右半分の中央に現れ、そして初期段階のアポトーシス細胞は、このヒストグラム
の下の右隅に現れる。

【０１７０】ＡＶ−β−ｇａｌを用いて形質導入された細胞中にいくつかの壊死が存在した
（図５Ａ）が、ＡＶ−Ｗ９を用いた形質導入は、肺癌腫細胞において、初期、中
期、および後期段階のアポトーシスを誘導する（図５Ｂ）。

【０１７１】ＰＣ３前立腺腫瘍細胞、ＳＷ４８０結腸癌腫細胞、およびＡ５４９肺癌腫細胞
においてアポトーシスを誘導するＡＶ−Ｗ９の能力をまた、試験した。これを実
施するために、ＰＣ−３、ＳＷ４８０またはＡ５４９細胞を、前出のように、１
、１０、５０および１００の感染多重度（ＭＯＩ）で、示されたＡＶ−ＣＤＫｉ
を用いて形質導入し、そしてアポトーシスを、３日後、製造者らの指示書（Ｐｈ
ｅｏｎｉｘＦｌｏｗＳｙｓｔｅｍｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）に従うＴ
ｄＴＴＵＮＥＬベースのアポトーシスアッセイを用いて評価した。

【０１７２】図６Ａに見出され得るように、ＡＶ−Ｗ９は、ＡＶ−ｐ１６、ＡＶ−ｐ２７ま
たはＡＶ−Ｗ７よりも、ＰＣ３前立腺腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導にお
いて、より効果的であった。図６Ａに示されるアポトーシスデータは、１０より
大きいＡＶ−Ｗ９のＭＯＩにおいて、形質導入の３日後に測定したので、ＴｄＴ
ＴＵＮＥＬ法を用いてほとんどのアポトーシス細胞が検出されなかったことに
注意すべきである。なぜなら、これは、顕微鏡分析によって評価されるように、
多くの細胞が死に、そして分解し始めたからである。図６Ｂは、ＡＶ−Ｗ９が、
ＡＶ−ｐ１６、ＡＶ−ｐ２７またはＡＶ−Ｗ７よりも、ＳＷ４８０結腸癌腫細胞
におけるアポトーシスの誘導において、より効果的であったことを示す。図６Ｃ
は、Ａ５４９肺癌腫細胞において、ＡＶ−Ｗ９が、ＡＶ−ｐ１６、ＡＶ−ｐ２７
またはＡＶ−Ｗ７よりもアポトーシスの誘導においてより効果的であったことを
示す。

【０１７３】（実施例ＶＩＩ）（ＡＶ−Ｗ９の効力）ＡＶ−Ｗ９の強力なアポトーシス誘導能力が細胞内での増強されたレベルの発
現に起因したか否かを決定するために、Ｅ４領域を有し、そしてＷ９（ＡＶ−Ｗ
９）、ｐ１６（ＡＶ−ｐ１６）、ｐ２７（ＡＶ−ｐ２７）をコードするか、また
はインサートを有さない（ＡＶ−Ｎｕｌｌ）アデノウイルスを滴定した。次いで
、ＤＵ１４５前立腺腫瘍細胞を、当量の各ウイルスで形質導入した。形質導入に
続いて、これらの組換えアデノウイルスの各々の発現のレベル、およびそれらが
ＤＵ１４５細胞においてアポトーシスを誘導する能力を試験した。発現を測定す
るために、形質導入した細胞を透過性にし、そして抗ｐ１６抗体または抗ｐ２７
抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから市販）で、細胞内で染色した。アポトーシスを
、ＴｄＴＴＵＮＥＬＦＡＣＳに基づくアッセイを使用して、製造業者の指示
（ＰｈｅｏｎｉｘＦｌｏｗＳｙｓｔｅｍｓ）に従って、測定した。

【０１７４】おおよそ同じ量のウイルス単位が、ＤＵ１４５細胞内での同レベルの発現を達
成するために必要とされた（図７Ａ）；しかし、親株（ＡＶ−ｐ１６およびＡＶ
−ｐ２７）と比較した場合に、より低い量のウイルス単位のＡＶ−Ｗ９が、ＤＵ
１４５細胞においてアポトーシスを誘導するために必要とされた（図７Ｂ）。図
７Ａおよび７Ｂにおいて、同じＤＵ１４５細胞が、ＡＶ−Ｗ９、ＡＶ−ｐ１６、
およびＡＶ−ｐ２７により形質導入された。形質導入に続く２日間、アポトーシ
スのレベル（図７Ｂ）および摘出されたＣＤＫｉの発現のレベル（図７Ａ）を評
価した。ＡＶ−Ｗ９により惹起されるアポトーシスは、ＡＶ−ｐ１６またはＡＶ
−ｐ２７より３倍少ないウイルスを必要とした。このことは、ＡＶ−Ｗ９が、ア
ポトーシスの惹起において、いずれの親分子よりもより効果的であることを実証
する。従って、より低い投薬量のＡＶ−Ｗ９は、ＡＶ−ｐ１６またはＡＶ−ｐ２
７のいずれよりも、より強力なアポトーシスの誘発因子である。

【０１７５】ＡＶ−Ｗ９およびＡＶ−ｐ１６の発現レベルもまた、Ａ５４９肺細胞において
評価した。Ａ５４９細胞を、当量のＡＶ−Ｗ９またはＡＶ−ｐ１６で形質導入し
、そして発現のレベルを、抗ｐ１６抗体（これは、Ｗ９融合タンパク質のＣ末端
ｐ１６部分に結合する）を用いて評価した。図７Ｃに見られ得るように、８０％
の形質導入細胞がｐ１６およびＷ９を２日後に発現したが（グラフの線を比較の
こと）、Ｗ９発現細胞の数は、３日目まで、ｐ１６発現細胞より有意に高かった
。このことは、Ｗ９が、親ｐ１６分子よりさらに安定であることを実証する。さ
らに、形質導入した細胞におけるＷ９の発現のレベルは、ｐ１６のレベルより高
かった（グラフの棒を比較のこと）。従って、ＡＶ−Ｗ９およびＡＶ−ｐ１６は
、Ａ５４９細胞を形質導入するための等しい能力を有したが、Ｗ９タンパク質の
発現レベルはこれらの細胞においてより高く、これらの細胞内においてｐ１６よ
りＷ９がさらに安定であることを示した。

【０１７６】（実施例ＶＩＩＩ）（インビトロでＡＶ−Ｗ９を用いて形質導入した新生物性細胞はインビボで腫
瘍を形成しなかった）免疫欠損マウスヌードマウスへの移植の前に、ＡＶ−ＣＤＫｉでインビトロで
形質導入したヒト新生物性細胞の腫瘍形成能力もまた、試験した。１×１０⁶の
Ａ５４９肺癌細胞またはＰＣ３前立腺腫瘍細胞を、５千万感染単位の、Ｗ９、ｐ
１６、ｐ２７、Ｗ７をコードするか、または挿入物なし（ＰＢＳ；ＣＭＶプロモ
ーターのみを保有して挿入物を有さないアデノウイルス）のアデノウイルスで形
質導入した。次いで、これらの細胞を収穫し、そして洗浄した。形質導入の１６
時間後、百万の予備処置した細胞を、６〜８週齢の、混合した性のＢＡＬＢ／ｃ
ヌードマウス（ＴａｃｏｎｉｃＬａｂｓ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）に皮
下移植した。腫瘍形成を、キャピラリーを用いて２〜３ヶ月間追跡した。

【０１７７】移植に続いて、ＡＶ−Ｗ９で形質導入したヒト新生物性細胞は、腫瘍を生成し
なかったが、ｐ２７、ｐ１６、または改変ｐ２７−ｐ１６融合分子、Ｗ７をコー
ドするＡＶで形質導入した新生物性細胞を受容したマウスは、腫瘍を発生させた
。従って、図８Ａに示すように、１２週間後、いずれの動物も、インビトロでＡ
Ｖ−Ｗ９により形質導入したＡ５４９細胞から腫瘍を発生させなかった。同様に
、ＡＶ−Ｗ９で形質導入したＰＣ３細胞の移植後、いずれの動物も、１３週間で
腫瘍を発生させなかった（図８Ｂ）。

【０１７８】従って、Ｅ４領域を含むアデノウイルス（ＡＶ−Ｗ９）から誘導されるＷ９の
みが、ＰＣ３細胞およびＡ５４９細胞の両方による、免疫不全マウスにおける腫
瘍形成を完全に予防した。ＡＶ−ｐ１６は、これらのマウスの８０％において形
成を予防し、一方でＡＶ−Ｗ７、ＡＶ−ｐ２７、またはＡＶ−ｎｕｌｌ（すなわ
ち、ＰＢＳ）で処置したマウスの少なくとも７０％は、腫瘍で死んだ（図８Ａお
よび８Ｂ）。

【０１７９】（実施例ＩＸ）（予め存在する腫瘍へのインビボでのＡＶ−Ｗ９の直接注射は腫瘍増殖を阻害
した）次に、ＡＶ−Ｗ９が腫瘍増殖を阻害する能力を、予め存在する腫瘍へのインビ
ボでの直接注射に続いて試験した。このために、１×１０⁶のＤＵ１４５ヒト前
立腺腫瘍細胞を、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスに皮下注射した。７〜１０日後、樹
立した腫瘍を観察および測定した。腫瘍は、約４０ｍｍ³であった。腫瘍を、１
．２５×１０¹¹粒子のＡＶ−Ｗ９、ＡＶ−ｐ１６、またはインサートなし（ＰＢ
Ｓ；Ｅ４領域を含み、インサートを有さないＣＭＶプロモーターを保有するアデ
ノウイルス）で処置し、直接注射によって、１日目、３日目、および５日目に、
１分間あたり３０マイクロリットルを注射するようフォーマットされたプログラ
ム可能なポンプマイクロシリンジ（ＫＤＳ１００注入ポンプ、ＫＤＳｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、腫瘍内に導入した。腫瘍を、
２〜３ヶ月間追跡した。

【０１８０】図９に示すように、ＡＶ−Ｗ９の、予め存在する腫瘍への送達は、「ＰＢＳ」
（すなわち、インサートを有さないアデノウイルス）を注射した腫瘍と比較して
、腫瘍増殖の後退または抑制を生じた。ＡＶ−ｐ１６での予め存在する腫瘍の処
置は、あまり効果的ではなかった。

【０１８１】第二の実験において、２０匹の動物に、百万のＡ５４９新生物性細胞を移植し
、そして１グループあたり５匹の動物に、１．２５×１０¹¹粒子のＡＶ−Ｗ９、
ＡＶ−ｐ１６、ＡＶ−ｐ２７、およびＡＶ−Ｎｕｌｌを、１日目、３日目、およ
び７日目に注射した。表ＩＩＩは、注射されたＡＶ−ＣＤＫｉが存在する腫瘍の
腫瘍増殖を阻害する能力からの全体的な結果を示し、ここで、「完全な応答」と
は、注射後の腫瘍の完全な軽減を意味し、「部分的な応答」とは、Ｎｕｌｌ腫瘍
と比較した腫瘍の増殖の遅延を意味し、そして「応答なし」とは、Ｎｕｌｌ注射
腫瘍と同程度に増殖し続けた腫瘍を意味する。

【０１８２】

【表３】従って、図９および表ＩＩＩに示すように、本発明のＡＶ−Ｗ９抗新生物性試
薬は、インビボでの局所投与に続いて腫瘍増殖を阻害し得、そして同様に送達さ
れる親分子（すなわち、ＡＶ−ｐ１６およびＡＶ−ｐ２７）のいずれよりも優れ
ていた。

【０１８３】（実施例Ｘ）（アデノウイルスＥ４タンパク質の非存在下でＷ９融合タンパク質をコードす
る組換えレンチウイルスは新生物性細胞においてアポトーシスを誘導しなかった
）Ｗ９融合タンパク質のための、第二のウイスルに基づく送達ビヒクルを生成し
た。ここで、以前に記載されたレンチウイルスベクター（Ｄｕｌｌら（１９９８
）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１を参照のこと）を使用して、Ｗ９
、Ｗ７、ｐ１６、およびｐ２７をコードする組換えレンチウイルスを生成した。
実施例Ｉに記載した導入遺伝子に類似の導入遺伝子（すなわち、ＣＭＶエンハン
サー／プロモーター−ＣＤＫｉインサート−ＳＶ４０ポリＡからなる導入遺伝子
）を、レンチウイルス移入ベクターであるｐＲＲＬ．ｓｉｎ−１８に、スプライ
スアクセプター部位と３’ＬＴＲとの間に挿入した（Ｄｕｌｌら、前出）。しか
し、これらのレンチウイルスにコードされるＣＤＫｉは、６Ｈｉｓ、ＨＡタグを
有さなかったことに、注目するべきである。

【０１８４】組換えレンチウイルスを、本質的に、Ｄｕｌｌら、前出に記載されるように、
パッケージした。組換えレンチウイルスを使用して、組換えアデノウイルスに関
して一般的に上記の方法に従って、新生物性細胞を形質導入した。例えば、Ａ５
４９細胞については、これらの細胞を１０⁵細胞／ウェルで１２ウェルプレート
内に、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ^high中で播種した。翌日、この培地を吸
引し、そして新たな培地（１ｍｌ／ウェル）を、最終濃度８ｐｇ／ｍｌのポリブ
レンありまたはなしで、添加した。次いで、これらの細胞を、Ｗ７、Ｗ９、ｐ１
６、またはｐ２７をコードするレンチウイルスの等数のウイルス粒子で形質導入
した。形質導入の２４時間後、この細胞の培地を交換し、そして４８時間後（す
なわち、形質導入の３日後）に、アポトーシスを試験した。

【０１８５】これらの試験は、アデノウイルスＥ４領域にコードされるタンパク質の非存在
下でレンチウイルスによって送達されたＷ９が、新生物性細胞においてアポトー
シスを誘導せず、これらの細胞の細胞増殖を阻害したことを示した（データは示
さない）。

【０１８６】（実施例ＸＩ）（アデノウイルスＥ４領域はＷ９のアポトーシス誘導能力を容易にするために
必要とされる）レンチウイルスによりコードされるＷ９は、新生物性細胞において発現される
場合にアポトーシスを誘導しなかったので、Ｗ９をコードする複製欠損組換えア
デノウイルス（ただし、Ｅ１領域のみでなくＥ４領域もまた欠く）を生成した。
これらのＥ４領域を欠失したアデノウイルスによりコードされる唯一のアデノウ
イルスＥ４領域タンパク質は、Ｅ４ｏｒｆ４タンパク質であり、これは、非常に
少量のＥ４領域欠失アデノウイルスに感染した細胞において発現された。これら
の組換えアデノウイルスを、ＭｃＡｒｔｈｕｒら、「ＡｄｅｎｏｖｉｒａｌＤ
ｅｌｉｖｅｒｙｏｆＮｏｖｅｌＣＤＫＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓｆｏｒ
ＰｒｅｖｅｎｔｉｎｇＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＳｍｏｏｔｈＭ
ｕｓｃｌｅＣｅｌｌｓ」、米国特許出願番号６０／１２２，９７４、１９９９
年３月１日出願（本明細書中に参考として援用される）に一般に記載される方法
および細胞を使用して、生成した。アデノウイルスＥ４領域の欠質はアデノウイ
ルスに対して致死変異であるので、これらの組換えアデノウイルスを、誘導プロ
モーターの制御下でアデノウイルスＥ４領域全体を含む核酸で安定に形質転換し
た細胞２９３−Ｅ４内にパッケージした。このＷ９をコードするアデノウイルス
（Ｅ１領域およびＥ４領域の両方を欠く）を使用して細胞を形質導入した場合に
は、アポトーシスの誘導は起こらなかった（図１０、Ｗ９）。従って、アデノウ
イルスのＥ４領域、またはそれによりコードされるタンパク質（もしくは活性フ
ラグメント）は、Ｗ９タンパク質と相乗して本発明の抗新生物性試薬を生成する
ために必要かつ十分な、アデノウイルスの領域である。さらに、Ｅ４領域欠失ア
デノウイルスは、少量のＥ４ｏｒｆ４タンパク質を、感染した細胞内において発
現したので、Ｗ９と協同して新生物性細胞においてアポトーシスを誘導するに必
要かつ十分であるアデノウイルスＥ４タンパク質は、Ｅ４ｏｒｆ４ではないよう
である。

【０１８７】Ｗ９のアポトーシス誘導能力を容易にするに十分であるアデノウイルスＥ４領
域内のフラグメントを決定するために、Ｅ１領域およびＥ４領域の両方を欠き、
そしてＷ９をコードするアデノウイルスを構築し、そして３つの細胞株（ＭＭＴ
Ｖ（ＭＭＴＶプロモーターの制御下でアデノウイルスＥ４ｏｒｆ６タンパク質を
発現する細胞であって、薬物デキサメタゾンにより誘導可能である）；２９３−
Ｅ４（プロモーターの制御下でアデノウイルスＥ４領域全体を発現する２９３細
胞であって、薬物３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＭＸ、カタログ番
号Ｉ−７０１８、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、
ＭＯ）により誘導可能である）；および３４Ｘ（プロモーターの制御下でアデノ
ウイルスＥ４ｏｒｆ６を発現する２９３細胞であって、ＩＭＸにより誘導可能で
ある））を形質導入するために使用した。これらの細胞株の各々において、ＭＭ
ＴＶプロモーターおよびＩＭＸ誘導プロモーターの漏出（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）
に起因して、いくらかの低レベルのＥ４またはＥ４ｏｒｆ６発現が、薬物誘導な
しで生じ得る。

【０１８８】この研究のために、１×１０⁵の細胞を、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連
結したＷ９コード核酸配列を含む、Ｅ１領域欠失アデノウイルス、Ｅ４領域欠失
アデノウイルス由来の溶解液で形質導入した。これらの細胞を、ＩＭＸまたはデ
キサメタゾンのいずれかの存在下（＋ｄｒｕｇ）または非存在下（ｎｏｄｒｕ
ｇ）において、形質導入した。ＩＭＸを、１０ＮＮａＯＨで１滴ずつ溶解する
まで滴定した水中に、４５ｍＭストック溶液として、調製した。２９３−Ｅ４細
胞および３４Ｘ細胞の形質導入の時点で、ＩＭＸ（最終濃度０．５ｍＭ）の存在
下でウイルスを添加した。ＭＭＴＶ細胞（２９３ＭＭＴＶｏｒｆ６）について
は、デキサメタゾン（１０００Ｘ＝３ｍＭ；カタログ番号Ｄ−２９１５、Ｓｉｇ
ｍａ）を、感染の時点で、最終濃度３μＭで添加した。

【０１８９】細胞を２日後に収穫し、そしてＡｎｎｅｘｉｎ／ｐＩ二重染色によって分析し
、アポトーシスのレベルを評価した。

【０１９０】Ｗ９をコードする、Ｅ１領域欠失アデノウイルス、Ｅ４領域欠失アデノウイル
スでの形質導入の非存在下では、２９３−Ｅ４細胞は、薬物を追加してさえも、
アポトーシスを示さなかった（図１０、２９３−Ｅ４）。しかし、細胞を形質導
入した場合には、薬物の非存在下でさえもアポトーシスが見られ、これは恐らく
、低レベルの漏出性のＥ４発現に起因した。しかし、形質導入した細胞における
アポトーシスのレベルは、薬物の存在下では増加した。このことは、Ｗ９および
アデノウイルスＥ４タンパク質が相乗的にアポトーシスを誘導することを実証す
る。

【０１９１】アデノウイルスＥ４ｏｒｆ６発現株（ＭＭＴＶおよび３４Ｘ）の場合には、Ｗ
９をコードする、Ｅ１領域欠失アデノウイルス、Ｅ４領域欠失アデノウイルスに
よる細胞の形質導入の非存在下において、低レベルのアポトーシスが存在した。
このアポトーシスは、プロモーターの漏出、およびＥ４ｏｒｆ６がアポトーシス
を惹起する既知の能力に起因するようであった。しかし、細胞が形質導入された
場合には、アポトーシスのレベルは上昇し、遅いアポトーシス細胞のレベルは劇
的に増加した（図１０、ＭＭＴＶおよび３４Ｘ）。

【０１９２】試験した細胞株は不死化されているので、これらはインビボの新生物性細胞に
似ている。これらの結果は、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ６タンパク質がＷ９と相
乗的に作用して、新生物性細胞においてアポトーシスを誘導することを実証する
。

【０１９３】（均等物）当業者は、慣用的にすぎない実験を使用して、本明細書中に特に記載した特定
の実施形態の多数の均等物を理解するか、または確かめ得る。このような均等物
は、添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることが意図される。

【図面の簡単な説明】

本発明の上記の目的および他の目的、本発明の種々の特徴、ならびに本発明自
体は、上記の説明を、添付の図面とともに読む場合に、より完全に理解され得る
。

【図１】図１は、Ｗ９タンパク質（本発明の制限されない、例示的なキメラＣＤＫｉ）
の分泌型のインターナリゼーション化形態をコードする核酸配列の模式図である
。この配列は、発現のためにベクター中に配置され、そして細胞に導入される場
合に、分泌されるタンパク質をコードする。次いで、分泌型タンパク質は、別の
細胞、またはそれが発現され、そして分泌される細胞によりインターナリゼーシ
ョンされる。

【図２Ａ】図２Ａは、インビトロキナーゼアッセイにおいて試験された本発明の制限され
ない、例示的な組換えＣＤＫインヒビター、およびこれらのアッセイの結果を示
す模式図である。ｐ１６分子は、白い四角で示され；ｐ２７分子およびその誘導
体は、斜線の四角で示され；そしてｐ１６部分とｐ２７部分との間の１５のアミ
ノ酸の長さ（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃のリンカーは、黒い四角で示される。各分子につ
いての上記の該略図は、親分子由来の対応する５’および３’のアミノ酸である
。中央の表は、インビトロでのキナーゼアッセイにより決定される場合、精製さ
れたインヒビターのＩＣ₅₀（ｎＭ）を示す。このアッセイは、ＣＤＫ４／サイク
リンＤ１キナーゼ、ＣＤＫ２／サイクリンＥキナーゼ、およびＣＤＣ２／サイク
リンＢキナーゼを利用した。図２Ａの右側に、パルス追跡実験（実施例ＩＶを参
照のこと）により測定した場合のアデノウイルスコード化ＣＤＫｉタンパク質の
およその発現の半減期（時間）を列挙する。

【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｗ９タンパク質（本発明の制限されない、例示的なキメラＣＤＫｉ
タンパク質）の核酸配列（上）およびアミノ酸配列（下）の模式図である。

【図３】図３は、ＣＤＫｉをコードする、本発明の制限されない、例示的複製欠損組換
えアデノウイルス（ＡＶ−ＣＤＫｉ）の構造を示す模式図である。これらの組換
えアデノウイルスは、完全なＥ４領域を含む。Ｅ４領域は、欠失したＥ３領域（
ΔＥ３）と左のＩＴＲとの間に配置される；従って、これらのアデノウイルスは
また、全てのＥ４領域タンパク質をコードする。ＣＤＫｉの発現は、ＣＭＶエン
ハンサーおよびプロモーターおよびＳＶ４０ポリＡ配列により調節される。各Ｃ
ＤＫｉを、ＨＡエピトープタグに融合した。このＡＴＧは、最適なコザック配列
の中にある。ＣｌａＩは、組換えウイルスの構築のために用いられる制限部位で
ある。

【図４Ａ】図４Ａは、本発明の制限されない、例示的ＡＶ−ＣＤＫｉのＳＷ４８０結腸癌
種細胞の増殖を阻害する能力を示す線グラフの図である。完全なＥ４領域および
挿入物なし（Ｎｕｌｌ、青い丸）、ｐ１６（紫の四角）、ｐ２７（黄色の三角）
、Ｗ７（赤の四角）、およびＷ９（緑の菱形）に作動可能に連結されたＣＭＶプ
ロモーターを含むアデノウイルスを用いる形質導入の後の、細胞増殖の阻害の割
合を示す。

【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の制限されない、例示的ＡＶ−ＣＤＫｉのＡ５４９肺癌種細
胞の増殖を阻害する能力を示す線グラフの図である。完全なＥ４領域（ＡＶ）お
よび挿入物なし（Ｎｕｌｌ、青い丸）、ｐ１６（紫の四角）、ｐ２７（黄色の三
角）、Ｗ７（赤の四角）、およびＷ９（緑の菱形）に作動可能に連結されたＣＭ
Ｖプロモーターを含むアデノウイルスを用いる形質導入の後の、細胞増殖の阻害
の割合を示す。

【図５Ａ】図５Ａは、完全なＥ４領域を含み、かつβ−ｇａｌ（ＡＶ−β−ｇａｌ）をコ
ードするアデノウイルスによる、Ａ５４９肺癌腫細胞におけるアポトーシスの誘
導の欠如を示すＦＡＣＳヒストグラムの図である。Ａ５４９細胞を、ＡＶ−β−
ｇａｌを用いて形質導入し、２日後に収集し、そしてアポトーシスのレベルを、
アネキシン−ＰＩ染色により確認し、次いでＦＡＣＳ分析をした。

【図５Ｂ】図５Ｂは、完全なＥ４領域を含み、かつＷ９（ＡＶ−Ｗ９）をコードする本発
明の制限されない、例示的なアデノウイルスによる、Ａ５４９肺癌腫細胞におけ
るアポトーシスの誘導を示すＦＡＣＳヒストグラムの図である。Ａ５４９細胞を
、ＡＶ−Ｗ９を用いて形質導入し、２日後に収集し、そしてアポトーシスのレベ
ルは、アネキシン−ＰＩ染色により確認し、次いでＦＡＣＳ分析をした。

【図６Ａ】図６Ａは、本発明の制限されない、例示的アデノウイルスであるＡＶ−Ｗ９が
、ＰＣ３前立腺腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導において、ＡＶ−ｐ１６、
ＡＶ−ｐ２７、またはＡＶ−Ｗ７よりも、より有効であることを示す線グラフの
図である。アポトーシスを、等価なＭＯＩで示されるＡＶ−ＣＤＫｉを用いて形
質転換した３日後に測定された。完全なＥ４領域（ＡＶ）を含み、かつｐ１６（
紫の四角）、ｐ２７（黄色い三角）、Ｗ７（赤の四角）、Ｗ９（緑の菱形）、ま
たは挿入物を含まないＣＭＶプロモーター（Ｎｕｌｌ；青い丸）をコードするア
デノウイルスにより形質転換した後に、アポトーシスを受けるように誘導された
細胞の割合を示す。

【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明の制限されない、例示的アデノウイルスであるＡＶ−Ｗ９が
、ＳＷ４８０結腸腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導において、同様に送達さ
れたｐ１６、ｐ２７、またはＷ７よりも、より有効であることを示す線グラフの
図である。アポトーシスは、等価なＭＯＩで誘導されたＡＶ−ＣＤＫｉを用いて
形質転換した３日後に測定された。完全なＥ４領域を含み、かつｐ１６（紫の四
角）、ｐ２７（黄色い三角）、Ｗ７（赤の四角）、Ｗ９（緑の菱形）、または挿
入物を含まないＣＭＶプロモーター（Ｎｕｌｌ；青い丸）をコードするアデノウ
イルスにより形質転換した後に、アポトーシスを受けるように誘導された細胞の
割合を示す。

【図６Ｃ】図６Ｃは、本発明の制限されない、例示的アデノウイルスであるＡＶ−Ｗ９が
、Ａ５４９肺腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導において、同様に送達された
ｐ１６、ｐ２７、またはＷ７よりも、より有効であることを示す線グラフの図で
ある。アポトーシスは、等価なＭＯＩで示されるＡＶ−ＣＤＫｉを用いて形質転
換した３日後に測定された。完全なＥ４領域を含み、かつｐ１６（紫の四角）、
ｐ２７（黄色い三角）、Ｗ７（赤の四角）、Ｗ９（緑の菱形）、または挿入物を
含まないＣＭＶプロモーター（Ｎｕｌｌ；青い丸）をコードするアデノウイルス
により形質転換した後に、アポトーシスを受けるように誘導された細胞の割合を
示す。

【図７Ａ】図７Ａは、本発明の制限されない、例示的アデノウイルスであるＡＶ−Ｗ９が
、同様に送達された親のｐ１６およびｐ２７と比較して、新生物細胞において類
似したレベルで発現されることを示す線グラフの図である。ＤＵ１４５前立腺腫
瘍細胞は、ＡＶ−Ｗ９（緑の菱形）、ＡＶ−ｐ１６（紫の四角）、ＡＶ−ｐ２７
（黄色の三角）、およびＡＶ−挿入物なし（Ｎｕｌｌ；青い丸）を用いて形質導
入される。２日後、細胞は、抗ｐ１６抗体および抗ｐ２７抗体を用いて細胞内染
色することにより、発現について評価された。

【図７Ｂ】図７Ｂは、本発明の制限されない、例示的アデノウイルスであるＡＶ−Ｗ９が
、同様に送達された親のｐ１６およびｐ２７よりも、新生物細胞においてアポト
ーシスを誘導する際に、有効であることを示す線グラフの図である。形質導入さ
れ、そして図７Ａ由来のＷ９，ｐ１６、およびｐ２７の細胞内発現について評価
された、同じＤＵ１４５前立腺腫瘍細胞はまた、形質導入の２日後に、ＦＡＣＳ
−ベースのＴｄＴＴＵＮＥＬアッセイにより、アポトーシスについて評価した
。

【図７Ｃ】図７Ｃは、ＡＶ−Ｗ９およびＡＶ−ｐ１６形質導入型Ａ５４９細胞中の、Ｗ９
およびｐ１９の発現効率および発現のレベルの時間経過をそれぞれ示す、線／棒
グラフの図である。Ａ５４９細胞を、等量のＡＶ−９Ｗ（緑の丸）またはＡＶ−
ｐ１６（紫の四角）を用いて形質導入し、そして抗ｐ１６抗体を用いて４日間に
わたって、ＣＤＫｉ発現について評価した。線グラフは、Ｗ９またはｐ１６のい
ずれかを発現する多数の形質導入された細胞を示し、一方、棒グラフは、形質導
入された細胞中のＷ９およびｐ１６の発現のレベルを示す。

【図８Ａ】図８Ａは、本発明の制限されない、例示的アデノウイルスであるＡＶ−Ｗ９が
、肺癌腫異種移植モデルにおける腫瘍形成を防止したことを示す生存チャートの
図である。１×１０⁶個のＡ５４９細胞は、ＡＶ−挿入物なし（ＰＢＳ；青い丸
）、および種々のＡＶ−ＣＤＫｉ（ＡＶ−ｐ２７、黄色い四角；ＡＶ−ｐ１６、
紫の四角、ＡＶ−Ｗ７、赤い四角；ＡＶ−Ｗ９、緑の菱形）を用いて、５０のＭ
ＯＩで形質導入した。形質導入された細胞を、Ｂａｌｂ−ヌードマウス（ｎ＝１
０）に皮下導入し、そして腫瘍形成を１２週間追跡した。

【図８Ｂ】図８Ｂは、本発明の制限されない、例示的アデノウイルスであるＡＶ−Ｗ９が
、肺癌腫異種移植モデルにおける腫瘍形成を防止したことを示す生存チャートの
図である。１×１０⁶個のＰＣ３細胞は、ＡＶ−挿入物なし（ＰＢＳ；青い丸）
、および種々のＡＶ−ＣＤＫｉ（ＡＶ−ｐ２７、黄色い四角；ＡＶ−ｐ１６、紫
の四角、ＡＶ−Ｗ７、赤い四角；ＡＶ−Ｗ９、緑の菱形）を用いて、５０のＭＯ
Ｉで形質導入した。形質導入された細胞を、Ｂａｌｂ−ヌードマウス（ｎ＝１０
）に皮下導入し、そして腫瘍形成を１３週間追跡した。

【図９】図９は、本発明の制限されない、例示的アデノウイルスであるＡＶ−Ｗ９が、
前立腺異種移植癌腫モデルにおける腫瘍の増殖を遅らせたことを示す線グラフの
図を示す。皮下ＤＵ１４５前立腺腫瘍異種移植片（１００万個の細胞を用いて誘
導される）を、１回の注射あたり１．２５×１０¹¹個のウイルス粒子を用いる、
１、３、および５日目の腫瘍内注射により、ＡＶ−Ｗ９、ＡＶ−ｐ１６、または
ＡＶ挿入物なし（ＰＢＳ）を用いて処理した。腫瘍の平均開始容積は４０ｍｍ³
（ｎ＝１０）であった。腫瘍サイズを、１０週間追跡した。

【図１０】図１０は、Ｗ９タンパク質と共に発現される完全アデノウイルスＥ４領域（ま
たは、単に、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ６タンパク質のみ）のアポトーシス誘導
能力を示す、一連のＦＡＣＳヒストグラムの図である。「薬物なし」は、添加さ
れる薬物がない非形質導入型細胞を示し（ネガティブコントロール）；「＋薬物
」は、（ＭＭＴＶ細胞に対する）デキサメタゾンまたは（２９３−Ｅ４細胞およ
び３４Ｘ細胞に対する）ＩＭＸの添加を用いる非形質導入型細胞を示し；「Ｗ９
」は、薬物の非存在下での、完全なＥ４領域を欠き、かつＷ９をコードするアデ
ノウイルスを用いる細胞の形質導入を示す；「Ｗ９＋薬物」は、デキサメタゾン
（ＭＭＴＶ細胞）またはＩＭＸ（２９３−Ｅ４細胞および３４Ｘ細胞）存在下で
の、完全Ｅ４領域を欠き、かつＷ９をコードするアデノウイルスを用いる細胞の
形質導入を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 35/76 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 37/52 (31)優先権主張番号６０／１２８，５１５ (32)優先日平成11年４月９日(1999．4．9) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者パテル，サリルアメリカ合衆国カリフォルニア 95014，キュパーティーノ，ホームステッドロードナンバー10 21230 (72)発明者マカーサー，ジェイムズアメリカ合衆国カリフォルニア 94070，サンカルロス，ホワイトオークスウェイ 2056 (72)発明者ギュリス，ジェノアメリカ合衆国マサチューセッツ 01890，ウィンチェスター，スワントンストリート 171 (72)発明者メンデス，マイケルジェイ．アメリカ合衆国カリフォルニア 94018，エルグラナダ，エルグラナダブールバード 471 (72)発明者フィナー，ミッチェルアメリカ合衆国カリフォルニア 94062，ウッドサイド，オークヘブン 21 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA02 CA07 CA20 DA02 EA02 EA04 GA11 HA17 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA22 CA53 DC25 NA10 ZB212 ZB262 ZC192 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA10 ZB21 ZB26 ZC19 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA01 CA40 EA28 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸組成物であって、キメラＣＤＫｉタンパク質をコードす
る第一核酸配列、およびアデノウイルスＥ４タンパク質をコードする第二核酸配
列から本質的になり、ここで、該第一および第二の核酸配列は、少なくとも１つの調節配列に作動可
能に連結される、核酸組成物。
【請求項２】前記キメラＣＤＫｉタンパク質が、Ｗ９タンパク質である、
請求項１に記載の核酸組成物。
【請求項３】前記アデノウイルスＥ４タンパク質が、Ｅ４ｏｒｆ６により
コードされる、請求項１に記載の核酸組成物。
【請求項４】請求項１に記載の核酸組成物および薬学的に受容可能なキャ
リアを含有する、組成物。
【請求項５】細胞による前記組成物のインターナリゼーションを容易にす
る送達系をさらに含有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】前記送達系が、組換えウイルス粒子である、請求項５に記載
の組成物。
【請求項７】前記組換えウイルス粒子が、アデノウイルス、レンチウイル
ス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニ
アウイルスからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】前記組換えウイルス粒子がアデノウイルスである、請求項７
に記載の組成物。
【請求項９】核酸組成物であって、分泌可能なインターナリゼーション可
能形態のキメラＣＤＫｉタンパク質をコードする第一核酸配列、および分泌可能
なインターナリゼーション可能形態のアデノウイルスＥ４タンパク質をコードす
る第二核酸配列を含有し、ここで、該第一および第二の核酸配列は、少なくとも１つの調節配列に作動可
能に連結される、核酸組成物。
【請求項１０】前記キメラＣＤＫｉタンパク質が、Ｗ９タンパク質である
、請求項９に記載の核酸組成物。
【請求項１１】前記アデノウイルスＥ４タンパク質が、Ｅ４ｏｒｆ６によ
りコードされる、請求項９に記載の核酸組成物。
【請求項１２】請求項９に記載の核酸組成物および薬学的に受容可能なキ
ャリアを含有する、組成物。
【請求項１３】細胞による前記組成物のインターナリゼーションを容易に
する送達系をさらに含有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】前記送達系が、組換えウイルス粒子である、請求項１３に
記載の組成物。
【請求項１５】前記組換えウイルス粒子が、アデノウイルス、レンチウイ
ルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシ
ニアウイルスからなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】前記組換えウイルス粒子がアデノウイルスである、請求項
１５に記載の組成物。
【請求項１７】タンパク質組成物であって、精製されたキメラＣＤＫｉタ
ンパク質および精製されたアデノウイルスＥ４タンパク質を含有する、タンパク
質組成物。
【請求項１８】前記キメラＣＤＫｉタンパク質が、Ｗ９タンパク質である
、請求項１７に記載のタンパク質組成物。
【請求項１９】前記アデノウイルスＥ４タンパク質が、Ｅ４ｏｒｆ６によ
りコードされる、請求項１７に記載のタンパク質組成物。
【請求項２０】請求項１７に記載のタンパク質組成物および薬学的に受容
可能なキャリアを含有する、組成物。
【請求項２１】細胞による前記組成物のインターナリゼーションを容易に
する送達系をさらに含有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】タンパク質組成物であって、精製されたインターナリゼー
ション可能形態のキメラＣＤＫｉタンパク質および精製されたインターナリゼー
ション可能形態のアデノウイルスＥ４タンパク質を含有する、タンパク質組成物
。
【請求項２３】前記キメラＣＤＫｉタンパク質が、Ｗ９タンパク質である
、請求項２２に記載のタンパク質組成物。
【請求項２４】前記アデノウイルスＥ４タンパク質が、Ｅ４ｏｒｆ６によ
りコードされる、請求項２２に記載のタンパク質組成物。
【請求項２５】請求項２２に記載のタンパク質組成物および薬学的に受容
可能なキャリアを含有する、組成物。
【請求項２６】新生物を有する動物を処置するための方法であって、該方
法は、該動物に、治療有効量の請求項４に記載の組成物を投与する工程を包含す
る、方法。
【請求項２７】新生物を有する動物を処置するための方法であって、該方
法は、該動物に、治療有効量の請求項１２に記載の組成物を投与する工程を包含
する、方法。
【請求項２８】新生物を有する動物を処置するための方法であって、該方
法は、該動物に、治療有効量の請求項２０に記載の組成物を投与する工程を包含
する、方法。
【請求項２９】新生物を有する動物を処置するための方法であって、該方
法は、該動物に、治療有効量の請求項２５に記載の組成物を投与する工程を包含
する、方法。
【請求項３０】新生物を有する動物を処置するための方法であって、該方
法は、請求項９に記載の核酸組成物を該動物の細胞内に導入する工程を包含し、
ここで、該導入された細胞は、前記分泌可能なインターナリゼーション可能形態
のキメラＣＤＫｉタンパク質を分泌し、そして前記分泌可能なインターナリゼー
ション可能形態のアデノウイルスＥ４タンパク質を分泌する、方法。
【請求項３１】新生物を有する動物を処置するための方法であって、該方
法は、請求項１０に記載の核酸組成物を該動物の細胞内に導入する工程を包含し
、ここで、該導入された細胞は、前記分泌可能なインターナリゼーション可能形
態のＷ９タンパク質を分泌し、そして前記分泌可能なインターナリゼーション可
能形態のアデノウイルスＥ４タンパク質を分泌する、方法。