JP2006524712A - カテプシンの阻害のための方法および組成物 - Google Patents

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Abstract

Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物と細胞を接触させることによって細胞死を調整するための方法および組成物が開示される。加えて、被検体にSpi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を含む組成物を提供することによって被検体を治療する方法が開示される。Spi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物は遺伝子治療技術に使用して被検体に送達することができる。被検体は、敗血症性ショックまたは心筋梗塞などの異常な割合の細胞死と関係する疾患の患者であることができる。また、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物とドナー顆粒球を接触させることを含む、ドナー顆粒球を調製し、貯蔵する方法が開示される。

Description

1.発明の分野
本発明は、一般に分子生物学、細胞生物学、および薬理学の分野に関する。より詳細には、セリンプロテアーゼ阻害剤2A（Spi2A）ポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を使用する細胞死を調整するための方法および組成物に関する。なお、本出願は、2003年2月19日に出願した米国特許仮出願第60/448,285号の利益を主張し、その全体が参照として組み入れられる。政府は、国立衛生研究所から助成金番号AI45108に従って本発明に権利を所有する。
2.関連技術の説明
広い多様性の因子が細胞の生存の制御に関与している。これらの因子のいくつかは、特定の細胞小器官内で開始されることが示された。たとえば、ミトコンドリアは、細胞死のカスパーゼを媒介したアポトーシスの経路に関与する。腫瘍壊死因子受容体1（TNF-R1）などの「デスレセプター」のライゲーションにより、細胞の細胞質にミトコンドリアのタンパク質の放出を生じる。細胞へのミトコンドリアのタンパク質の放出は、カスパーゼ・プロテアーゼ・カスケードをトリガーし、アポトーシスを引き起こす（Budihardjo et al., 1999）。
ミトコンドリアに加えて、リソソームも、細胞死を調整する際に役割を果たす（Ferri and Kroemer, 2001）。システインプロテアーゼであるカテプシンは、リソソーム内に位置する。現在、配列のレベルで11種のヒト・カテプシン（B、H、L、S、C、K、O、F、V、XおよびW）が既知である（Turk et al., 2002に概説）。TNF-R1は、カスパーゼとは独立に、リソソームに細胞質にカテプシンBを放出させることによって細胞死を誘発することができる。放出されたカテプシンBは、優性の実行プロテアーゼとして作用する（Foghsgaard et al., 2001）。
従って、アポトーシスの細胞死には、2つの経路がある。カスパーゼ非依存的な（リソソームの）経路では、カテプシンのリソソームの放出によって細胞死が媒介される。カスパーゼ依存的な経路では、カスパーゼ・プロテアーゼ・カスケードによって細胞死が媒介される。
NF-κBは、TNF-α経路を完全に遮断して、保護遺伝子の活性化によってアポトーシスに至る（Beg and Baltimore, 1996）。これは、NF-κBが細胞死のカスパーゼおよびリソソームの両方の経路を阻害することを意味する。それにもかかわらず、細胞死の両経路を阻害することができる薬物は、1つも同定されていない。
セリンプロテアーゼ阻害剤2A（Spi2A）は、元来、奇形癌株化細胞EB22に示されていた（Inglis et al., 1991）。マウスSpi2Aは、細胞内セルピン（serpins）のいくつかの特徴を有するが、ヒト抗キモトリプシンに最も密接に関連している（Hampson et al., 1997）。奇妙なことに、本来のcDNAは、選択的スプライシング・イベントの結果として、5'末端で切断されていた。このセルピンは、ヒト染色体14q32.1とシンテニックな座位でマウスの第12染色体上に少なくとも9つのセルピンの多重遺伝子群の一部であったことがその後に示された（Inglis and Hill, 1991）。ヒトの座位は、抗トリプシン、抗キモトリプシン、プロテインC阻害剤、およびコルチゾール結合グロブリン（CBG）をコードする遺伝子を含む。その本来の記載の後、Spi2Aは、多能性の造血性株化細胞FDCP-Mix A4に発現される遺伝子として同定され、これは分化により劇的にダウンレギュレートされた（Hampson et al., 1997）。同様に、顆粒球マクロファージ-コロニー形成細胞（GM-CFC）は、マウスの骨髄から単離して分化を誘導したときに、発現のダウンレギュレーションが示され得る。FDCP-Mix A4細胞にSpi2Aを安定にトランスフェクトすると、これらは分化の遅延を示し、クローン原性潜在能を増大した（Hampson et al., 1997）。ノーザンブロット研究では、リンパ組織のSpi2Aメッセージおよび発現がT細胞活性化により初代脾細胞培養において著しくアップレギュレートされたことを示した。
細胞死のカスパーゼ依存的およびカスパーゼ非依存的な両方の経路の阻害剤により、種々の薬剤で両経路を標的化する必要が克服されたので、細胞死を阻害する新規手段を提供することができる。加えて、これらの薬剤は、細胞死と関係する疾患および症状の治療に適用することもできる。たとえば、これらの薬剤は、敗血症（Bochud and Calandra, 2003）、肝炎および肝硬変（ウイルスおよび化学物質で誘導される）（Crawford, 1999）などの炎症性疾患と関係する細胞死を防止するために適用することができる。加えて、これらの薬剤は、心筋梗塞などの虚血で誘導される細胞死によって生じる疾患を治療するために使用することができる。（Itoh et al., 1995； Kajstura et al., 1996）。また、これらの薬剤は、その後にレシピエントに輸血するために顆粒球の調製プロセスの間に、ドナー顆粒球に共通に生じるアポトーシスの細胞死を防止するために使用することができる（Brach et al., 1992）。
カスパーゼ活性の非存在下では、細胞質に放出されるカテプシンBが細胞死を促進する1つの可能性のある方法は、Bidの活性化を介しており、ミトコンドリアの機能障害および損害を与える活性酸素種（ROS）の産生に至る（Ferri and Kroemer, 2001）。リソソーム統合性の減少およびカテプシンの放出およびその他の消化酵素は、アポトーシスだけでなく凝固壊死の誘導にも重要なイベントである（Ferri and Kroemer, 2001； Wyllie et al., 1981）。従って、細胞死の両経路を阻害することができる薬剤は、また、壊死、リソソームの不安定性、並びにROSに関連する細胞死および機能障害に対する保護の新規手段を提供することができる。
また、細胞死の両経路を阻害する薬剤は、異常なリソソームのシステインプロテアーゼ活性と関係する疾患の治療において治療薬として適用することができる。分泌されると、リソソームのシステインプロテアーゼは、これらの環境に非常に有害であり、病的状態を生じるであろう。システインプロテアーゼは、慢性関節リウマチおよび骨関節炎（Mort et al., 1984； Mort et al., 1998； Baici et al, 1988； Baici et al., 1995）、アルツハイマー病（Cataldo and Nixon, 1990）、多発性硬化症（Bever and Garver, 1995）、および筋ジストロフィー（Takeda et al., 1992、 Kominami et al., 1987）などの多くの疾患（一般的には、Turk et al., 2002を参照されたい）に関与することが観察された。これらの疾患の多くにおいて、リソソーム酵素は、プロフォームで細胞外／リソソーム外の環境に存在し、実質的に成熟した酵素よりも安定であることが見いだされた。また、リソソームのシステインプロテアーゼは、ニューロンのアポトーシスに関与するという証拠もある（Nixon and Cataldo, 1993）。
また、システインプロテアーゼ、特にカテプシンBは、悪性腫瘍と関係することが示された（Poole et al., 1980； Sloane et al., 1981； Turk et al., 2002）。その他の研究では、カテプシンB、H、およびLが、細胞外基質の直接分解によって、またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子などのその他のプロテアーゼの活性化によって、癌進行に関与することを示した（Turk et al., 2002に概説）。この関与は、分泌、mRNAおよびタンパク質のレベル並びに活性の増加によって達成され得る。
従って、カスパーゼ依存的およびカスパーゼ非依存的な機構の両方のモジュレーターが同定されれば、アポトーシス、壊死、リソソームの不安定性、ROS、およびその他の関連した機構による細胞死と関係する疾患および症状の治療の新たな形態に適用することができよう。また、細胞死の両方の経路の阻害剤である薬剤は、レシピエントへ投与するために収集し、調製した後にドナー顆粒球において共通に生じるアポトーシスを防止するために用いることができる。加えて、これらの薬剤は、また、異常なシステインプロテアーゼ活性（例えば癌）と関係する症状をもつ患者を治療するために使用することができる。
発明の概要
本発明者は、Spi2Aが細胞死のカスパーゼ経路およびカスパーゼ非依存的な経路の両方を阻害することを発見した。特に、NF-κB複合体が細胞死のカテプシンB経路を阻害すること、およびSpi2Aがこの阻害のメディエーターであることを発見した。細胞死のカテプシンB経路の阻害がTNF-R1の活性化の結果であることを示した。TNF-R1は、NFκB依存的な、システインカテプシンの強力な阻害剤のSpi2Aのアップレギュレーションを誘導することを示した。その他のNF-κBの標的遺伝子について記載されているように、Spi2Aの発現は、アポトーシスのカスパーゼ依存的な経路に拮抗する（Baldwin, 2001）。しかし、リソソームのカテプシンBは、カスパーゼ活性化を伴わずに細胞死を誘導することができるので、Spi2Aもカスパーゼ非依存的な細胞死（Borner and Monney, 1999）に対して保護をもたらす。従って、NF-κBが細胞死のリソソームの経路をブロックする新たな機構が同定された。これらの知見からみて、Spi2AおよびSpi2A同等物は、標的細胞の細胞死を調整するために新規薬剤として使用することができ、疾患治療の新たな形態並びに細胞死、リソソームの不安定性、および異常なシステインプロテアーゼ活性と関係する症状において使用することができる。
本発明のある態様は、通常、細胞の細胞死を調整する方法に関係し、およびそれはSpi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を有する標的細胞を接触させることによって達成される。本明細書に使用されるものとして、「Spi2A」は、マウスのSpi2Aをいい、下記の明細書にさらに論議してある。Spi2Aポリペプチドは、マウスのSpi2Aの配列に基づいたポリペプチドに属する。Spi2Aの全長アミノ酸配列に基づいたポリペプチドを含むいずれの長さのポリペプチドも本発明によって想定される。
下記の明細書において詳述する「Spi2Aポリペプチド同等物」は、本明細書において記載される使用状況において、ポリペプチドが実質的に同様の活性を保持する限り、いずれのSpi2Aポリペプチドをも含み、いくつかの、またはほとんどのアミノ酸が置換されてもよい。
たとえば、Spi2Aポリペプチド同等物は、セルピンB1、セルピンB2、セルピンB3、セルピンB4、セルピンB6、セルピンB8、またはセルピンB9に由来するポリペプチドを含む。本発明のある特定の態様において、Spi2Aポリペプチド同等物は、セルピンB9ポリペプチドである。
許容されるレベルの同等のSpi2Aの生物活性を有することが予想されるSpi2Aポリペプチド同等物のその他の例は、アミノ酸配列MAGVGCCAを有するポリペプチド（SEQ ID NO：10）、またはアミノ酸配列FVVAECCMを有するポリペプチド（SEQ ID NO：11）を含む。これらのアミノ酸配列は、それぞれSpi2AおよびPI9の一部である。Spi2Aポリペプチド同等物は、これらのアミノ酸配列の全部または一部を含んでいてもよい。たとえば、Spi2Aポリペプチド同等物は、これらのアミノ酸配列のいずれかから、前方または後方の向きで8、7、6、5、もしくは4つの連続したアミノ酸を含んでもよい。多くのさらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドのC末端またはN末端で位置してもよい。
さらなる態様において、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、細胞の細胞内コンパートメントへのポリペプチドの組み込みを容易にするようにデザインされたアミノ酸配列を含む。当業者であれば、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を細胞内コンパートメントに内部移行するのを容易にすることが既知の何らかのアミノ酸配列に融合させることができるものと理解するが、特定の態様では、HIV由来のアミノ酸TAT配列をコードするポリペプチドの使用を含む。もう一つの態様において、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、Antpアミノ酸配列をコードするポリペプチドに融合される。さらに別の態様では、HSV由来のVP22アミノ酸配列をコードするポリペプチドに対するSpi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物の融合を含む。
本発明は、細胞死を調整するためにSpi2AポリペプチドおよびSpi2A同等物ポリペプチドの使用が必要とされる態様であって、細胞死が何らかの既知の細胞死の機構に関連する態様を想定する。
本発明のある態様において、細胞死を調整するための方法は、アポトーシスを調整するための方法としてさらに定義される。いくつかの態様において、アポトーシスを調整するための方法は、Tリンパ球の細胞死を調整するための方法としてさらに定義される。Tリンパ球の死の調整は、リンパ球の記憶Tリンパ球への分化を容易にする方法に向けられる本発明の態様に適用することができる。
本発明のいくつかの態様において、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、ワクチンに含まれる。ワクチンは、たとえば、病原体に感染した腫瘍細胞または細胞などの被検体の標的細胞に対して向けられてもよい。たとえば、腫瘍細胞は、乳癌、肺癌、卵嚢癌、脳癌、肝癌、子宮頚癌、大腸癌、腎癌、皮膚癌、頭部および頚部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、リンパ性の癌、胃癌、膵癌、精巣癌、リンパ腫、または白血病に由来する細胞であってもよい。ウイルスは、当業者に既知のいずれのウイルスであることもできる。たとえば、いくつかの態様において、ウイルスは、HIV、HSV、またはADVである。ワクチンは、腫瘍もしくは病原体による感染症の治療または予防に有用であるさらなる薬剤を含んでもよい。
アポトーシスは、細胞での増大されたリソソームの透過性の結果として生じるアポトーシスであってもよい。リソソームの透過性の増大は、リソソームのプロテアーゼの放出を生じ得る。従って、本発明の態様は、細胞の少なくとも1つのリソソームのプロテアーゼの放出による細胞死としてさらに定義される細胞死を調整する方法に属する。いずれのリソソームのプロテアーゼも本発明によって想定されるが、好ましい態様において、リソソームのプロテアーゼは、システインプロテアーゼである。たとえば、システインプロテアーゼは、カテプシンB、カテプシンH、カテプシンL、カテプシンS、カテプシンK、カテプシンO、カテプシンF、カテプシンV、カテプシンX、またはカテプシンWであることができる。また、本発明は、自己貪食性の細胞死による細胞死、TNF-αを媒介した細胞死、活性酸素種（ROS）による細胞死、および壊死による細胞死を調整する方法に属する。
当業者であれば、本発明によっていずれの細胞も想定されることを理解するであろうが、好ましい態様において、細胞は、被検体において位置する。より詳細には、被検体は、ヒトであることができる。ヒトは、潜在的な疾患を有する患者であってもよく、またはなくてもよい。いずれの疾患も本発明によって想定されるが、一定の特定の態様において、疾患は、異常な割合の細胞死と関係する疾患である。たとえば、患者は、血管疾患を有し得る。血管疾患は、閉塞性の血管疾患または循環器疾患であってもよい。循環器疾患は、心筋梗塞であることができる。より詳細には、心筋梗塞は、急性心筋梗塞症であることができる。
また、患者は、感染症を有し得る。特定の態様では、感染症は、敗血症性ショックを生じる。感染因子は、グラム陰性もしくはグラム陽性細菌または真菌であってもよい。また、敗血症を引き起こす感染因子は、炭疽菌（Bacillus anthracis）（皮膚、吸入、もしくは腸炭疽を引き起こす）またはペスト菌（Yersinia pestis）（鼠蹊腺腫、敗血症、もしくは肺炎性疫病を引き起こす）などの生物兵器であってもよい。
また、疾患は、壊死、活性酸素種、またはリソソームの不安定性による細胞死と関係する疾患であることができる。これらは、A、B、C、D、E、またはG型肝炎ウイルス、リファマイシンまたはイソニアジドなどの抗結核薬、抗うつ薬のモノアミンオキシダーゼ阻害薬、四塩化炭素などの化成物、またはアルコールによって生じる劇症の肝不全を含む。疾患は、A、B、C、D、EもしくはG型肝炎ウイルス、リファマイシンもしくはイソニアジドなどの抗結核薬、抗うつ薬のモノアミンオキシダーゼ阻害薬、四塩化炭素などの化成物、またはアルコールによって生じる肝炎または肝硬変などの炎症性疾患であってもよい。また、炎症性疾患は、慢性関節リウマチ、または骨関節炎であってもよい。また、疾患は、肺気腫または骨粗鬆症であることができる。
もう一つの例において、疾患または症状は、異常なシステインプロテアーゼ活性と関係するものであってもよい。たとえば、疾患は、骨疾患、神経変性疾患、アルツハイマー病、HIVなどのウイルス疾患、多発性硬化症、筋ジストロフィー、または慢性関節リウマチおよび骨関節炎を含む関節炎であることができる。免疫不全が異常なシステインプロテアーゼ活性と関係していたために、患者は、また、免疫不全を有し得る。免疫不全は、自己免疫不全または異常な抗原提示と関係する障害であることができる。上記のように、異常なシステインプロテアーゼ活性は、癌と関係していた。
従って、ある態様において、被検体は、癌患者である。癌患者は、二次抗過形成療法（secondary anti-hyperplastic therapy）を受けている癌患者であることができる。このような二次抗過形成性療法の例は、化学療法、放射線療法、免疫療法、光線療法、寒冷療法、毒素療法、ホルモン療法、または手術を含む。
本発明のなおさらなる態様において、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、細胞において活性な、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターをさらに含む発現カセットに含まれる。特定の態様において、発現カセットは、細胞において活性な、Spi2Aポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む。もう一つの特定の態様において、発現カセットは、細胞において活性な、Spi2Aポリペプチド同等物をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む。Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物をコードするポリヌクレオチドは、ワクチンに含まれていてもよい。
いずれのSpi2Aポリペプチド同等物も想定されるが、ある態様において、Spi2Aポリペプチド同等物は、先に述べたヒト同等物のうちの一つのである。発現カセットは、ウイルスベクターに保有されることができる。当業者であれば、いずれのウイルスベクターも本発明によって想定され、ウイルスベクターの例には、アデノウイルス・ベクター、レトロウイルス・ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターを含むことを理解するであろう。また、発現カセットは、リポソームなどの非ウイルスベクターに保有されることができる。細胞内で発現できるいずれのプロモーターの使用も本発明によって想定されるが、プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターであることができる。ある態様において、発現カセットは、複製開始点、ポリアデニル化シグナル、または選択可能なマーカー遺伝子をさらに含む。
本発明のなおさらなる態様において、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、培養細胞の培地から得られ、細胞の表面に適用される。培養細胞は、発現カセットを含んでもよく、または含んでいなくてもよい。発現カセットは、先に述べたいずれの特徴を含むこともきる。
本発明のその他の態様は、被検者を治療する方法であって、（1）該被検体に送達するために適した製剤にSpi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を含む組成物を提供する段階；および、（2）被検体に組成物を投与する段階を含む方法に属する。特定の態様において、組成物は、Spi2Aポリペプチドを含む。その他の特定の態様において、組成物は、先に述べたヒトSpi2A同等物のいずれかなどのSpi2Aポリペプチド同等物を含む。
治療の方法は、被検体の細胞死を調整する方法としてさらに定義することができる。細胞死を調整する方法は、以前に本明細書に記載したいずれの細胞死の機構による細胞死を調整する方法であることもできる。
なおさらなる態様において、治療方法は、被検体の疾患または症状を治療する方法として定義される。好ましい被検体は、ヒトである。ヒトは、いずれの疾患を有する患者であることもできる。特定の態様において、疾患または症状は、細胞死または異常なシステインプロテアーゼ活性と関係する。これらの疾患の例は、先に述べた。特定の態様において、疾患は、敗血症性ショックである。もう一つの特定の態様において、疾患は、心筋梗塞である。心筋梗塞は、急性心筋梗塞症であることができる。
一部の態様において、治療方法は、記憶Tリンパ球の分化を容易にする方法であって、記憶Tリンパ球が被検体の疾患細胞に向けられる方法としてさらに定義される。一部の態様において、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、ワクチンに含まれる。疾患細胞は、腫瘍細胞または病原体に感染した細胞であってもよい。たとえば、腫瘍細胞は、乳癌、肺癌、卵嚢癌、脳癌、肝癌、子宮頚癌、大腸癌、腎癌、皮膚癌、頭部および頚部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、リンパ性の癌、胃癌、膵癌、精巣癌、リンパ腫、または白血病からの細胞であってもよい。病原体は、HIV、HSV、またはADVなどのウイルスであってもよい。ワクチンは、下記の明細書においてさらに詳細に論議してある。
ある態様において、組成物は、全身に送達される。送達の方法のその他の例は、血管内送達、および腫瘍などの病変に対する局部的な送達を含む。
さらなる態様は、被検体を治療する方法であって、Spi2Aポリペプチドまたは細胞内侵入のためのタンパク質／ポリペプチドを優先して標的化するアミノ酸配列をさらに含むSpi2Aポリペプチドを投与することを含む方法に属する。細胞内侵入のための、Spi2AポリペプチドもしくはSpi2A同等物ポリペプチドを標的化する配列は、以前に記載されたいずれのアミノ酸も、または当業者に既知のいずれのこのような配列も含むことができる。
組成物は、上記したものと同様の発現カセットを含むことができる。当業者であれば、発現カセットを使用して、請求した本発明を実施するために種々の実験法を利用できることを理解するであろうし、そのいくつかは後でさらに詳細に論議してある。
本発明のさらなる態様は、顆粒球供与を必要とする被検体に送達するためのドナー顆粒球を調製する方法であって：（1）適切なドナーからドナー顆粒球を得る段階；（2）ドナー顆粒球を単離する段階；（3）Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を含む組成物およびドナー顆粒球に送達するために適した製剤とドナー顆粒球を接触させる段階；並びに、（4）ドナー顆粒球を必要とする被検体にドナー顆粒球を投与する段階を含む方法を含む。特定の態様において、組成物は、Spi2Aポリペプチドを含む。その他の特定の態様において、組成物は、以前に記載したヒトSpi2Aポリペプチド同等物などのSpi2A同等物ポリペプチドを含む。
ドナー顆粒球を調製する方法は、ドナー顆粒球のアポトーシスの減少を生じる調整法としてさらに定義することができる。また、本調整法は、顆粒球壊死の減少、リソソームの不安定性の減少、およびROSによる細胞死の減少を生じさせることができる。ドナー顆粒球のレシピエントは、任意の被検体であることができる。しかし、ある態様において、被検体は、顆粒球に関与する障害を有する被検体である。例えば、被検体は、好中球減少を有する被検体であることができる。好中球減少は、化学療法、放射線療法、骨髄抑制性の薬物療法白血病、再生不良性貧血、または特発性の好中球減少の結果として生じる好中球減少であってもよい。好中球減少は、敗血症または敗血症性ショックと関係していてもよく、または関係していなくてもよい。その他の態様において、被検体は、好中球の質的な異常を有する被検体である。例えば、好中球の質的な異常は、慢性肉芽腫症であることができる。
本発明のある態様において、ドナー顆粒球は、顆粒球数をブーストするためにG-CSFによって治療されたであろうドナーから収集される。一定のその他の態様において、顆粒球は、白血球搬出法によって精製される。
本発明のある態様において、ドナー顆粒球と接触する組成物は、被験者の細胞において活性な、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターをさらに含む発現カセットを含む。上記したように、発現カセットを使用する実験法は、当業者に周知である。これらの実験法は、後述してある。特定の態様において、組成物は、被験者の細胞において活性な、Spi2Aポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。その他の態様において、組成物は、被験者の細胞において活性な、先に述べたヒトSpi2Aポリペプチド同等物などのSpi2Aポリペプチド同等物をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。さらなる態様において、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、タンパク質またはポリペプチド配列の細胞内送達を容易にすることが既知である先に述べたアミノ酸配列のうちの1つなどのアミノ酸配列を含む。
本発明の一定のその他の態様は、貯蔵のためにドナー顆粒球を調製する方法であって：（a）適切なドナーからドナー顆粒球を得る段階；（b）ドナー顆粒球を単離する段階；（c）Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物およびドナー顆粒球の送達のために適した製剤を含む組成物と該ドナー顆粒球を接触させる段階；並びに、ドナー顆粒球を貯蔵する段階を含む方法を提供する。その他の態様において、貯蔵のために顆粒球を調製する方法は、ドナーから顆粒球を得る前にC-GSFでドナーを治療する段階を含む。さらに他の態様において、貯蔵のために顆粒球を調製する方法は、顆粒球の単離に続いて白血球搬出法によって顆粒球を精製する段階をさらに含む。
組成物は、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を含むことができる。
たとえば、Spi2Aポリペプチド同等物は、セルピンB1、セルピンB2、セルピンB3、セルピンB4、セルピンB6、セルピンB8、またはセルピンB9に由来するポリペプチドであることができる。特定の態様において、貯蔵のためにドナー顆粒球を調製する方法は、ドナー顆粒球のアポトーシスの減少を生じる。さらに他の態様において、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、HIV由来のアミノ酸TAT配列をコードするポリペプチド、Antpアミノ酸配列をコードするポリペプチド、またはHSV由来のVP22アミノ酸配列をコードするポリペプチドを含むことができる。
例示態様の記載
本発明では、Spi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペ プチド擬態を使用して、細胞死のカスパーゼ経路およびカスパーゼ非依存的な経路の両方を同時に阻害するための方法並びに組成物を提供することにより、本発明者の発見を利用しようと努力する。これらの方法および組成物は、多種多様な治療状況で使用することができる。たとえば、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を使用する細胞死の阻害は、敗血症性ショックおよび心筋梗塞などの細胞死と関係する疾患の治療に使用することができる。もう一つの例において、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、レシピエントに送達するために調製してあるドナー顆粒球のアポトーシスを阻害するために用いることができる。
A. Spi2A
1. Spi2Aポリペプチドおよび融合タンパク質
本発明は、種々の状況におけるSpi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物の使用に属する。たとえば、本発明の種々の態様は、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物と細胞を接触させる段階を含む細胞死を調整するための方法に属する。その他の態様は、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物をさらに含む組成物を被検体に投与する段階を含む被検体を治療する方法に属する。本発明のさらなる態様は、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を含む組成物とドナー顆粒球を接触させる段階を含む、被検体に送達するためのドナー顆粒球を調製する方法に関する。
本出願を通じて、「Spi2Aポリペプチド」の用語は、マウスのSpi2Aポリペプチドをいうことが企図される。マウスSpi2Aの全長アミノ酸配列は、本明細書に提供されており、SEQ ID NO：2で示される。
Spi2Aポリペプチドは、SEQ ID NO：2の連続したアミノ酸セグメントであり、これは、SEQ ID NO：2の全長配列を含む任意の長さである。たとえば、Spi2Aポリペプチドは、SEQ ID NO：2の4、5、10、15、20、25、30、50、100、200、300、400、500、1000、または多くの連続したアミノ酸を含むポリペプチドであることができる。当業者であれば、SEQ ID NO：2の開示からみて、当業者に周知の多くの実験法のいずれかを使用するSpi2Aポリペプチドを作製する方法を理解するであろう。
固有の「Spi2Aポリペプチド同等物」の定義は、定義された分子の部分内になされてもよい変更の数に制限があり、かつなおも許容されるレベルの同等の生物活性、たとえばSpi2Aが細胞死を調整する能力を有する分子を生じるという概念であることが当業者には周知である。したがって、「Spi2Aポリペプチド同等物」は、本明細書において、ポリペプチドが本明細書に記載される使用の状況で実質的に同様の活性を保持する限り、いくつかの、またはほとんどのアミノ酸が置換されていてもよい何らかのSpi2Aポリペプチドとして定義される。
いずれの長さのアミノ酸配列も、ポリペプチドが許容されるレベルの同等の生物活性を保持する限り、Spi2Aポリペプチド同等物の定義内であることが想定される。たとえば、Spi2Aの許容されるレベルの同等の生物活性を有することが予想されるSpi2Aポリペプチド同等物は、アミノ酸配列MAGVGCCA（SEQ ID NO：10）を有するポリペプチドまたは、アミノ酸配列FVVAECCM（SEQ ID NO：11）を有するポリペプチドを含む。これらのアミノ酸配列は、それぞれSpi2AおよびPI9の一部である。Spi2Aポリペプチド同等物は、これらのアミノ酸配列の全部または一部を含んでいてもよい。たとえば、Spi2Aポリペプチド同等物は、これらのアミノ酸配列のいずれかに由来する8、7、6、5、または4つの連続したアミノ酸を含んでいてもよい。Spi2Aポリペプチド同等物において、これらの連続したアミノ酸の配向は、前方または後方であってもよい。さらに、Spi2Aポリペプチド同等物は、C末端またはN末端のいずれかの末端に付加アミノ酸を有するこれらのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。たとえば、Spi2Aポリペプチド同等物は、許容されるレベルのSpi2Aの同等の生物活性が残っている限り、合計1000、500〜1000、400〜499、300〜399、200〜299、100〜199、80〜99、60〜79、50〜59、40〜49、30〜39、20〜29、10〜19、9、8、7、6、5、または4を超えるアミノ酸残基を含んでいてもよい。
もちろん、異なる置換を有する複数の異なったタンパク質／ポリペプチド／ペプチドも、本発明に従って容易に製作され、使用されるであろう。加えて、本発明の状況において、Spi2Aポリペプチド同等物は、ヒト・ポリペプチドを含むが、これらに限定されず、いずれの種または生物体に由来するSpi2A相同体ポリペプチドであることもできる。当業者であれば、多くのSpi2Aポリペプチド同等物が存在する可能性があり、共通に利用できる技術を使用して同定することができることを理解するであろう。ヒトSpi2A同等物の特定の例は、セルピンB1（M/NEI；GenBankアクセッション番号AAC31394；本明細書においてSEQ ID NO：3）、セルピンB2（PAI-2；GenBankアクセッション番号NP002566；本明細書においてSEQ ID NO：4）、セルピンB3（SCCA-1；GenBankアクセッション番号AAA86317；本明細書においてSEQ ID NO：5）、セルピンB4（SCAA2；GenBankアクセッション番号XP209106；本明細書においてSEQ ID NO：6）、セルピンB6（PI6；GenBankアクセッション番号NP004559；本明細書においてSEQ ID NO：7）、セルピンB8（PI8；GenBankアクセッション番号NP002631；本明細書においてSEQ ID NO：8）、およびセルピンB9（PI9；GenBankアクセッション番号AAH02538；本明細書においてSEQ ID NO：9）を含む。もちろん、いずれのSpi2A相同体ポリペプチドも、いくつかの、さらにほとんどのアミノ酸が置換されていてもよく、さらにポリペプチドが本明細書に記載した使用状況で実質的に同様の活性を保持する限り、「Spi2Aポリペプチド同等物」であってもよい。
これらのヒトアミノ酸配列は、マウスSpi2A（SEQ ID NO：2）と約40%のアミノ酸同一性を有し、約60〜70%の化学的同一性（同一または化学的に類似するアミノ酸の存在）を有し、これらが生物学的にSpi2Aに対する同等物ポリペプチドであることを示す。従って、これらのヒト・ポリペプチドは、Spi2Aと比較したときに一定のアミノ酸だけが置換されているるので、Spi2A同等物ポリペプチドである。
本発明は、天然の供与源から、または組換えで産生された物質から精製されたSpi2AポリペプチドもしくはSpi2Aポリペプチド同等物を利用してもよい。当業者には、組換えで産生された物質からこれらのポリペプチドを産生する方法が既知であろう。この物質は、天然に合成されたタンパク質の20個の一般的なアミノ酸、または1つもしくは複数の修飾がされたか、または普通でないアミノ酸を使用してもよい。通常、「精製された」は、分画に供されて種々のその他のタンパク質（ポリペプチド、またはペプチド）が除去されたSpi2A組成物であって、実質的にその活性を保持している組成物をいう。精製は、Spi2Aポリペプチドもしくは同等物が主な種である点で実質的であるか、または均質性について、その精製レベルが正確な分解シーケンシングが可能である。
また、Spi2Aのアミノ酸配列変異体も、本発明に包含され、「Spi2Aポリペプチド同等物」の定義に含まれる。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、置換変異体または挿入変異体であることができる。挿入変異体は、典型的にはペプチドの末端以外の位置への物質の付加を含む。これは、数個の残基；免疫応答性のエピトープ；または単に単一の残基の挿入を含んでいてもよい。付加される物質は、メチル化、アセチル化などによって修飾されてもよい。または、さらなる残基がペプチドのN末端またはC末端の末端に付加されてもよい。
アミノ酸置換は、通常、アミノ酸側鎖の置換基の相対的な類似性、または例ではこれらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。アミノ酸側鎖の置換基のサイズ、形状、およびタイプの解析により、アルギニン、リジン、およびヒスチジンは、全て正に荷電した残基であり；アラニン、グリシン、およびセリンは、全て同様のサイズであり；並びにフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、全て一般に同様の形状を有することが明らかである。従って、これらの考慮に基づいて、アルギニン、リジン、およびヒスチジン；アラニン、グリシン、およびセリン；並びにフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン；は、本明細書において、生物学的に機能的同等物であると定義される。
アミノ酸置換は、通常、アミノ酸側鎖の置換基の相対的な類似性、または例ではこれらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。アミノ酸側鎖の置換基のサイズ、形状、およびタイプの解析により、アルギニン、リジン、およびヒスチジンは、全て正に荷電した残基であり；アラニン、グリシン、およびセリンは、全て同様のサイズであり；並びにフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、全て一般に同様の形状を有することが明らかである。従って、これらの考慮に基づいて、アルギニン、リジン、およびヒスチジン；アラニン、グリシン、およびセリン；並びにフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン；は、本明細書において、生物学的に機能的同等物であると定義される。
変化を作製する際に、アミノ酸のヒドロパシーのインデックスを考慮してもよい。それぞれのアミノ酸は、これらの疎水性および電荷の特徴に基づいてヒドロパシーのインデックスが割り当てられており、それらは以下の通りである：イソロイシン（+4.5）；バリン（+4.2）；ロイシン（+3.8）；フェニルアラニン（+2.8）；システイン／シスチン（+2.5）；メチオニン（+1.9）；アラニン（+1.8）；グリシン（-0.4）；スレオニン（-0.7）；セリン（-0.8）；トリプトファン（-0.9）；チロシン（-1.3）；プロリン（-1.6）；ヒスチジン（-3.2）；グルタミン酸（-3.5）；グルタミン（-3.5）；アスパラギン酸（-3.5）；アスパラギン（-3.5）；リジン（-3.9）；およびアルギニン（-4.5）。
タンパク質の相互作用的な生物学的機能を与える際のヒドロパシーのアミノ酸インデックスの重要性は、一般に当技術分野において理解されている（Kyte and Doolittle, 1982、本明細書に参照として組み入れられる）。特定のアミノ酸が、類似のヒドロパシーのインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸で置換されてもよく、そして依然として類似の生物学的活性を保持することが知られている。ヒドロパシーのインデックスに基づいた変化を作製する際に、ヒドロパシーのインデックスが+2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、+1以内であるものが特に好ましく、+0.5以内のものは特にさらに好ましい。
アミノ酸は、同様の親水性値を有する別のものと置換することができ、なおも生物学的に等価なタンパク質を得ることが理解される。U.S. Patent 4,554,101に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（+3.0）；リジン（+3.0）；アスパラギン酸（+3.0+1）；グルタミン酸（+3.0+1）；セリン（+0.3）；アスパラギン（+0.2）；グルタミン（+0.2）；グリシン（0）；スレオニン（-0.4）；プロリン（-0.5+1）；アラニン（-0.5）；ヒスチジン（-0.5）；システイン（-1.0）；メチオニン（-1.3）；バリン（-1.5）；ロイシン（-1.8）；イソロイシン（-1.8）；チロシン（-2.3）；フェニルアラニン（-2.5）；トリプトファン（-3.4）。
同様の親水性値に基づいて変化を作製する際に、親水性値が+2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、+1以内であるものは特に好ましく、+0.5以内のものは特にさらに好ましい。
本発明の一定の態様は、優先して生体膜を通って転位置される融合タンパク質を利用する。特に、Spi2Aポリペプチド、機能的なSpi2A同等物、または変異体Spi2Aは、標的細胞への容易な融合タンパク質の細胞内送達を促進する特定のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド配列に融合されてもよい。細胞内送達を促進する性質を有するいずれの融合タンパク質も本発明によって想定されるが、具体例は、HIV TAT配列（Nagahara et al., 1998）、アンテナペディア・ホメオドメイン（Antennapedia homeodomain：Antp）の第3ヘリックス（Derossi et al., 1994）、およびHSV-1構造タンパク質VP22（Elliott and O’Hare, 1997）を利用する融合タンパク質を含む。
2. Spi2Aをコードするポリヌクレオチド
本発明の種々の側面では、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物をコードするポリヌクレオチドを必要とする。たとえば、種々の態様は、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物のいずれかをコードするポリヌクレオチドに動作可能な状態で連結された、細胞内で活性なプロモーターを含む発現カセットと細胞を接触させる段階を含む細胞死を調整するための方法を含む。その他の態様において、本発明は、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物のいずれかをコードするポリヌクレオチドに動作可能な状態で連結された発現カセットを含む組成物を被検体に投与する段階を含む被検体を治療するための方法に属する。さらに他の態様において、本発明は、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物のいずれかをコードするポリヌクレオチドに動作可能な状態で連結された、顆粒球内で活性なプロモーターを含む発現カセットを有するドナー顆粒球を接触させる段階を含む被検体に送達するためのドナー顆粒球を調製する方法を含む。
マウスSpi2Aの全長アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、本明細書においてSEQ ID NO：1として提供される。本発明に従ったポリヌクレオチドは、完全なSpi2A配列（たとえば、SEQ ID NO：2のアミノ酸配列）、機能的なSpi2Aタンパク質ドメイン、Spi2Aポリペプチド、またはSpi2Aポリペプチド同等物をコードしていてもよい。ポリヌクレオチドは、ゲノムDNAに由来してもよく、すなわち、特定の生物体のゲノムから直接クローン化される。
しかし、その他の態様において、ポリヌクレオチドは、相補DNA（cDNA）であってもよい。cDNAは、テンプレートとしてメッセンジャーRNA（mRNA）を使用して調製されるDNAである。従って、cDNAは、いずれの断続性コード配列も含まず、通常対応するタンパク質のコード領域をほぼ排他的に含む。その他の態様において、ポリヌクレオチドは、合成により産生されてもよい。
特異的な構築物を作製するためにゲノムDNAの部分をcDNAまたは合成配列と組み合わせることも有利であろう。たとえば、イントロンが最終的な構築物において要求される場合、ゲノムクローンを使用することが必要となる。イントロンは、Spi2Aに加えてその他の遺伝子に由来してもよい。cDNAまたは合成されたポリヌクレオチドは、構築物の残りの部分により都合のよい制限部位を提供してもよく、従って、配列の残りに対して使用される。
本発明は、SEQ ID NO：1（すなわち、マウスSpi2Aをコードするポリヌクレオチド）に限定されず、いずれのSpi2Aポリペプチド同等物（上で論議したもの）もコードするポリヌクレオチドを含む。Spi2Aポリペプチド同等物をコードするこれらのポリヌクレオチドは、その他の生物体に由来する天然に存在する相同的ポリヌクレオチド配列であってもよい。たとえば、Spi2Aポリペプチド同等物をコードするポリヌクレオチドは、以前に記載したヒト・アミノ酸の機能的な同等物の配列（すなわちSEQ ID NO：3〜SEQ ID NO：9）をコードするポリヌクレオチドを含む。これらの配列は、例証として提供され、利用できるSpi2Aポリペプチド同等物の全ての総括であることは意味されない。当業者であれば、その他のSpi2Aポリペプチド同等物をコードするポリヌクレオチドを同定または合成するために、共通に利用できる実験法を使用することができることを理解するであろう。また、本発明は、これらの配列の化学的に合成された変異体も含む。
別の種類の配列の変種は、コドンの変化によって生じる。20個の通常のアミノ酸のほとんどについていくつかのコドンがあるので、多くの異なるDNAsが、Spi2Aをコードすることができる。以下の表を参照し、このような変種を同定することができる。
（表１）
Figure 2006524712
遺伝暗号の縮重を可能にするためには、本明細書に開示されるヌクレオチドと約50%〜約75%の間、または約76%〜約99%の間のヌクレオチドの配列が同一であることが好ましい。「Spi2Aポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」または「機能的な同等物Spi2Aポリペプチド」の範囲内の配列は、細胞内条件下で上記したポリヌクレオチド・セグメントと塩基対合ができるものである。
上述のとおり、Spi2Aをコードする配列は、ゲノムの全長もしくはcDNAコピー、またはこれらの大きな断片であってもよい。また、本発明は、Spi2Aのより短いオリゴヌクレオチドを使用してもよい。12の塩基の長さの配列は、ヒトゲノムで一度しか生じないはずであり、従って、独特の標的配列を特定するために十分であるはずである。短いオリゴマーであるほど、作製することが容易であり、インビボでのアクセスしやすさが増大するが、多数のその他の因子が、塩基対合の特異性の決定に関与する。オリゴヌクレオチドのその相補標的に対する結合親和性および配列特異性は、長さの増加と共に増大する。たとえばSpi2A変異体の調製において、およびPCR反応において、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20塩基対のオリゴヌクレオチドを使用することが、想定される。
ある態様において、その他のエレメント、例えばC-5プロピン・ピリミジンを含むものを含む構築物を使用することが望まれるであろう。ウリジンおよびシチジンのC-5プロピン類似体を含むオリゴヌクレオチドは、高い親和性でRNAに結合することが示された（Wagner et al., 1993）。
B. 標的化される疾患および症状
本発明は、被検体に対する送達のために適した製剤中のSpi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を含む組成物を被検体に投与する段階を含む被検体を治療する方法を想定する。被検体は、病態生理学において細胞死が顕著な役割を果たす疾患の患者であることができる。細胞死は、いずれの機構によるものであることもできる。たとえば、細胞死は、アポトーシス、壊死、リソソームの不安定性、ROS、および異常なシステインプロテアーゼ活性の結果として生じることができる。
好ましい態様において、Spi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物は、アポトーシスまたは壊死による細胞死を防止するために使用される。壊死およびアポトーシスは、形態学的に異なった細胞死の形態であり、全ての疾患の病因の根底にある。アポトーシスは、ひどく傷害性であり、潜在的に危険であり、感染し、および不必要な細胞を除去するために、固有の細胞自殺プログラムの活性化を介して生じる。しかし、不適当に活性化されたプログラムにより、癌、神経変性障害、エイズ、自己免疫性障害、およびウイルス感染などの多くの病的状態に至る可能性がある（Turk et al., 2002； Steller, 1995）。壊死は、細胞恒常性の機構の不可逆的破壊（distruption）の際に生じる何らかの侵害性の刺激によって生じる（Kerr et al., 1972）。壊死に付随した形態学的変化は、致死的に損傷した細胞に対して進行性の酵素の分解作用によって生じる。病理学に関して、壊死とアポトーシスの重要な違いは、前者のものはそれ自体の消滅の際に細胞の活発な関与が必要でないということである。多くの疾患において、組織傷害は、アポトーシスおよび壊死によって生じる。従って、Spi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物は、広範囲にわたる疾患の細胞死を防止するために使用される。加えて、Spi2AおよびSpi2A同等物は、生体外の正常細胞のアポトーシスおよび壊死を防止するために使用することができる。例えば、これらの薬剤は、輸血および貯蔵のための顆粒球の調製のプロセスの間に、ドナー顆粒球の細胞死を防止するために使用することができる。
細胞死が過剰な割合で存在する任意の疾患または症状が想定される。例には心筋梗塞（MI）、敗血症性ショック、および肝疾患を含む。
1. 心筋梗塞
急性MIは、重篤な虚血に続く、心筋細胞の凝固性の壊死によって生じる。急性のMIの患者は、彼らが心筋虚血症を軽減するために血栓溶解療法を受けるのと同じ時に、TAT-Spi2AポリペプチドまたはTAT-Spi2Aポリペプチド同等物での静脈内注射もしくは直接の心臓注射によって治療される（White and Van der Werf, 1998）。患者を凝固性の壊死から保護して、梗塞サイズを減少させるためには、これは、患者が現れた後24時間以内が至適である。TAT-Spi2AポリペプチドまたはTAT-Spi2Aポリペプチド同等物による慢性のMIの治療は、同じプロトコルに従う。薬剤への反応は、心筋の虚血性壊死の減少を測定することによってモニターされる。従って、血清レベルは、筋細胞タンパク質：クレアチンキナーゼ、トロポニンI、およびトロポニンTの低下によってモニターされる（Schoen, 1999）。梗塞サイズの減少は、以下の心エコー、放射性同位元素研究、核磁気共鳴、および灌流シンチグラフィーの少なくとも1つによって検査される。
MIのための標準的な治療は、心筋への血流を回復すること（再灌流）によって虚血性の凝固壊死を軽減することである。これは、ROSの生産を介してさらなる傷害を生じさせ、壊死を生じさせる（Kloner et al., 1998）。また、上記の通りのTAT-Spi2AポリペプチドまたはTAT-Spi2Aポリペプチド同等物の投与は、心筋組織の再灌流損傷を治療するために使用してもよい。
2. 敗血症性ショック
敗血症は、細菌または真菌による全身感染に対する炎症性の白血球、特にマクロファージの反応によって生じる。マクロファージによるプロ炎症性サイトカインTNF-α、IL-1、およびIL-6の全身性の産生は、敗血症および敗血症性ショックを生じる。重要なイベントは、TNF-αによる内皮細胞の壊死およびアポトーシスによる死によって引き起こされる血管傷害である。これにより、血管内に過剰な凝固および生命器官に対する血流の制限に至る。重篤な敗血症の治療をせずに、心血管虚脱および全身性の低灌流（敗血症ショック）を生じると、生命器官のシャットダウンおよび患者の死亡に至る。本発明の一定の態様は、重篤な敗血症患者の治療におけるTAT-Spi2AポリペプチドおよびTAT-Spi2Aポリペプチドの全身投与に属する。たとえば、患者を選択するための基準および投与プロトコルは、敗血症薬の使用について記載したとおりであってもよい（Sollet and Garber, 2002； Laterre and Heiselman, 2002）。これにより、血管の血液の凝固を防止して、内皮細胞を死から保護することによって生命器官に貢献し、血流が障害された器官における虚血性壊死を防止するであろうことが予想される。薬剤への反応は、正常血圧のレソレーション（resoration）および患者の罹患率の減弱によってモニターすることができる。
3. 肝臓疾患
肝不全および肝硬変は、大量の肝細胞の壊死およびアポトーシスによって生じる。肝細胞壊死には、劇症のウイルス性肝炎（A、B、C、D、E、およびG型肝炎ウイルスによる）、薬物、化学製品、およびアルコールを含む、いくつかの原因がある（Crawford, 1999）。本発明の態様は、静脈内注射によるSpi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物の投与によって肝不全並びに肝硬変を治療することに属する。治療の目標は、肝細胞の壊死およびアポトーシスを減少させ、肝不全および肝硬変を防止することである。薬剤の効果は、トランスアミナーゼおよび患者の黄疸の減少などの肝細胞タンパク質の血清レベルの低下によって測定される。
4. 異常なリソソームのシステインプロテアーゼ活性に関係した疾患
Spi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物は、ヒト・システイン・カテプシンB、L、V、K、およびHを阻害するために使用することができるという本発明者の発見を考慮すると、本発明は、異常なシステインプロテアーゼ活性と関係する何らかの疾患または症状の治療に適用することができる。本明細書に前述したように、多くの疾患がリソソームのシステインプロテアーゼと関係する。例にはエストクラスト（oestoclasts）を生じさせるエストポロシス（oestoporosis）におけるカテプシンK、並びに肺気腫を生じさせる炎症細胞のカテプシンK、L、およびSを含む（Turk et al., 2002）。これらの症状の治療は、Spi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物の静脈内適用によって達成されると考えられる。従って、リソソームのシステインプロテアーゼと関係するいずれの疾患の治療も、本発明によって想定される。
5. ドナー顆粒球を調製する方法
また、顆粒球の供与を必要とする被検体に送達するためのドナー顆粒球を調製する方法も本発明によって想定される。輸血のためにドナー顆粒球を調製する現法は、アポトーシスによる顆粒球の死と関係することが既知である（Brach et al. 1992）。本発明は、輸血のためのドナー顆粒球の調製および貯蔵に関係したアポトーシスの細胞死を軽減することに向けられる（Leavy et al., 2000）。48時間以上後の貯蔵の間の保存では、細菌および真菌による感染のための顆粒球機能および顆粒球療法の臨床的な有効性を改善することが予期される。特に、本方法は、ドナー顆粒球を得ることと、ドナー顆粒球を単離することと、次いでドナー顆粒球を必要とする被検体にドナー顆粒球を投与するより前にSpi2AポリペプチドまたはSpi2A同等物を含む組成物とドナー顆粒球を接触させることとを含む。必要のある被検体は、ドナー顆粒球によって治療されることが既知のいずれの疾患または症状を有する被検体であることもできる。このような疾患および症状の例は、好中球減少（化学療法、放射線療法、骨髄抑制性の薬物白血病、特発性の好中球減少、または再生不良性貧血による（Hubel et al., 2001））、新生児の敗血症、および慢性肉芽腫症などの好中球の質的な異常と関係する疾患を含む。特に、本発明は、用量集中的な化学療法（輸血療法を受け入れ、その他の療法は受け入れない）による好中球減少の治療に特に有用である（Liles et al., 1995）。
C. 発現カセット
1. 概要
本発明の一定の態様は、発現カセットを含む組成物を利用する方法に属する。特に、細胞における細胞死を調整するための方法は、発現カセットをさらに含むSpi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物と細胞を接触させる段階を含んでもよい。被検体を治療する方法は、被検体に発現カセットを含むSpi2Aポリペプチドまたはポリペプチド同等物の組成物を投与する段階を含んでもよい。加えて、必要のある被検体へ供与するためのドナー顆粒球を調製する方法は、発現カセットを含むSpi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物の組成物とドナー顆粒球を接触させる段階を含んでいてもよい。当業者であれば、細胞または被検体にポリヌクレオチド配列を送達するための発現カセットの使用に関する技術を理解するであろう。これらの技術の特定の側面は、本明細書に要約してある。当業者であればこれらの技術に精通しているので、この簡単な概要が、発現カセットに関連した利用できる実験法の全ての網羅的な概要であることは決して意図されていない。
本出願を通じて、「発現カセット」の用語は、配列をコードする核酸の一部または全体を転写することができる遺伝子産物をコードする核酸を含むいずれのタイプの遺伝子の構築物も含むことが意図される。転写物は、タンパク質またはポリペプチドに翻訳されてもよいが、必要とされない。従って、ある態様において、発現は、遺伝子のポリペプチドへの転写およびmRNAの翻訳を含む。
発現カセットがポリペプチドの発現を生じさせるために、ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターの転写制御下にあると考えられる。「プロモーター」は、制御配列であり、転写の開始および割合を制御する核酸配列の領域である。RNAポリメラーゼおよびその他の転写因子などの、調節タンパク質および分子が結合するであろう遺伝的エレメントを含んでいてもよい。「機能的に連結される」の句は、プロモーターが、その配列の転写開始および／または発現を制御するための核酸配列に関して、適切な機能的な位置および／または配向にあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作動性の制御配列をいう「エンハンサー」とともに使用してもよく、または使用しなくてもよい。当業者であれば、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物の発現を促進するためにプロモーターまたはエンハンサーを使用する方法を理解するであろう。
本発明のある態様において、細胞内への発現カセットの送達は、発現ベクターにマーカーを含めることによって、インビトロまたはインビボで同定してもよい。マーカーにより、トランスフェクトされた細胞に同定可能な変化が生じて、発現を簡単に同定することができる。使用される選択可能なマーカーは、発現カセットのポリヌクレオチドと共に発現することができる限り、重要であるとは考えられない。選択可能なマーカーの例は、当業者に周知である。
また、コード配列の効果的な翻訳のために、特異的な開始シグナルが必要とされてもよい。これらのシグナルは、ATG開始コドンまたは隣接した配列を含む。ATG開始コドンを含む外来性の翻訳制御シグナルが提供されることを必要としてもよい。当業者であれば、容易にこれを決定し、必要なシグナルを提供することができるであろう。
本発明のある態様において、内部リボソーム導入部位（IRES）エレメントの使用は、多重遺伝子、または、多シストロン性のメッセージを作製するために使用される。IRESエレメントは、5'メチル化Cap依存的な翻訳のリボソーム走査デルをバイパスし、内部部位で翻訳を開始することができる（Pelletier and Sonenberg, 1988）。当業者であれば、発現カセットにおけるIRESの使用に精通しているであろう。
発現カセットは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、そのいずれかを標準的な組換え技術と組み合わせて使用して、ベクターを消化することができるマルチクローニングサイト（MCS）を含むことができる。Carbonelli et. al. （1999）； Levenson et al. （1998）； Cocea （1997）を参照されたい。「制限酵素消化」は、核酸分子の特定の位置においてのみ機能する酵素による核酸分子の接触切断をいう。制限酵素および結合反応を含む技術は、組換え技術分野の当業者に周知である。
発現において、典型的には転写物の適当なポリアデニル化を行うためのポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の良好な実施に重要であると考えられず、および／またはいずれのこのような配列を使用してもよい。当業者であれば、転写物の適当なポリアデニル化を行うためにこれらのシグナルを使用する方法を理解するであろう。
本発明のある態様において、発現カセットは、ウイルスまたはウイルスゲノムに由来する操作された構築物を含む。一定のウイルスが、受容体を媒介したエンドサイトーシスを経て細胞に入り、場合によっては、宿主細胞染色体に組み込まれる能力により、これらは哺乳類細胞中に遺伝子導入するための魅力的な候補となった。しかし、裸のDNAの直接の取り込み、並びに受容体を媒介したDNA複合体の取り込みが可能であることが証明されたので、発現ベクターは、ウイルスである必要はなく、その代わりに、pUCまたはBluescript（商標）プラスミドシリーズなどの、哺乳類細胞内でコードされた遺伝子の発現を補助することができるいずれのプラスミド、コスミド、またはファージ構築物であってもよい。当業者であれば、ポリペプチドの発現を促進するためのツールとしてウイルスの使用に精通しているであろう。
本発明のある態様において、治療される細胞は、発現ベクター内にマーカーを含めることによって、インビトロまたはインビボで同定されてもよい。このようなマーカーにより、同定可能な変化が生じて、発現ベクターを含む細胞の簡単な同定が可能になる。通常、選択可能なマーカーは、選択することができる性質を与えるものである。ポジティブ選択可能なマーカーは、マーカーの存在によりその選択ができるが、ネガティブ選択可能なマーカーは、その存在により、その選択が防げられるものである。ポジティブ選択可能なマーカーの例は、薬剤耐性マーカーである。
通常、薬物選択マーカーを含むことにより、形質転換体のクローニングおよび同定の際の助けとなり、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシン、およびヒスチジノールに対する抵抗を与える遺伝子は、有用な選択可能なマーカーである。条件の実施に基づいて形質転換体を識別することができる表現型を与えるマーカーに加えて、GFP（比色分析に基づく）などのスクリーン可能なマーカーを含むその他のタイプのマーカーも想定される。または、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（tk）またはクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（CAT）などのスクリーン可能な酵素を利用してもよい。当業者には、おそらくFACS解析と連動して、免疫マーカーを使用する方法も既知であろう。使用するマーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現することができる限り、重要であるとは考えられない。選択可能で、かつスクリーン可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
D. 遺伝子導入
1. ウイルスベクター
ある態様において、発現カセット内にSpi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を含む発現カセットを利用する本発明の方法および組成物は、ベクターに保有される。これらの実験方法は、当技術分野において周知であるので、当業者であれば、ベクターの使用を理解するであろう。特に、「ウイルスベクター」を使用する技術は、当技術分野において周知である。ウイルスベクターは、（a）発現カセットのパッキングを補助するため、および（b）その中にクローン化された組換え遺伝子構築物を最終的に発現するために十分なウイルス配列を含む構築物を含むことが意味される。
組換えDNAの送達のための一つの方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノウイルス・ベクターは、ゲノムDNAに組込む能力が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによって提供される高効率の遺伝子導入によって相殺される。
アデノウイルスは、臨床的な設定において現在最も一般的に用いられる遺伝子導入ベクターである。これらのウイルスの利点の中には、これらが非分裂細胞および分裂細胞の両方に対する遺伝子送達で効率的であること、および多量に産生できることがある。ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作された形態を含む。遺伝子構成またはアデノウイルスの、36kbの、直鎖状の、二本鎖DNAウイルスという知識により、7kbまでの外来配列でアデノウイルスのDNAの大部分を置換することができる（Grunhaus et al., 1992）。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスのDNAは、潜在的遺伝毒性を伴わずにエピソーム方法で複製することができるので、宿主細胞のアデノウイルスの感染は、染色体組込みを生じない。また、アデノウイルスは、構造的に安定であり、広範な増幅後にも、ゲノム再編成は検出されなかった。
アデノウイルスは、特にその中型のゲノム、操作の容易さ、高力価、広範な標的細胞範囲、および高い感染力のために、遺伝子導入ベクターとして使用するために適している。当業者であれば、アデノウイルス・ベクターを使用する実験法に精通しているであろう。
アデノウイルス・ベクターは、複製欠損か、または少なくとも条件つきで欠損があるものであってもよく、アデノウイルス・ベクターの性質は、本発明の良好な実施にとって重要であるとは考えられない。アデノウイルスは、42種の異なる既知の血清型またはサブグループA〜Fのいずれであってもよい。サブグループCのアデノウイルス5型は、本発明に使用される条件つきの複製欠損アデノウイルス・ベクターを得るための好ましい出発材料である。これは、アデノウイルス5型が多くの生化学的および遺伝的情報について既知であるヒトアデノウイルスであり、ベクターとしてアデノウイルスを使用する大部分の構築のために歴史的に使用されてきたという理由による。
アデノウイルスの増殖および操作は、当業者に既知であり、インビトロおよびインビボで広範な宿主範囲を示す。この群のウイルスは、高い力価で、たとえば、1mlにつき109〜1011個のプラーク形成単位で得ることができ、これらは非常に感染性である。アデノウイルスのライフサイクルは、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。アデノウイルス・ベクターによって送達される外来遺伝子は、エピソームであり、従って、宿主細胞に対して低い遺伝毒性を有する。野生型アデノウイルスでのワクチン接種の研究において、副作用は報告されておらず（Couch et al., 1963； Top et al., 1971）、これらのインビボでの遺伝子導入ベクターとしての安全および治療的な潜在性を証明する。
レトロウイルスは、逆転写プロセスによって感染細胞中でそれらのRNAを二本鎖DNAに変換する能力によって特徴づけられる一群の一本鎖RNAウイルスである（Coffin, 1990）。次いで、生じるDNAは、プロウイルスとして安定に細胞染色体に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を命令する。組込みにより、受容細胞およびその子孫にウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスのゲノムは、それぞれカプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をコードする3つの遺伝子、gag、pol、およびenvを含む。gag遺伝子からの上流で見いだされる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含む。2つの末端反復（LTR）配列は、ウイルスゲノムの5'および3'末端に存在する。これらは、強力なプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、また、宿主細胞ゲノムへの組込みに必要とされる（Coffin, 1990）。
レトロウイルス・ベクターを構築するために、関心対象の遺伝子をコードする核酸をウイルスゲノムに、一定のウイルス配列の場所に挿入して、複製欠損であるウイルスを産生する。当業者であれば、レトロウイルス・ベクターを構築するために利用できる周知の技術に精通しているであろう。
アデノ随伴ウイルス（AAV）は、高い頻度での組込みを有し、かつ非分裂細胞に影響を与えることができ、したがって組織培養の際に哺乳類細胞へ遺伝子を送達するために有用となるので（Muzyczka, 1992）、本発明に使用される魅力的なベクター系である。AAVは、感染力に関して広い宿主域を有し（Tratschin, et al., 1984； Laughlin, et al., 1986； Lebkowski, et al., 1988； McLaughlin, et al., 1988）、これは、それを本発明の用途に適用できることを意味する。rAAVベクターの生成および使用に関する詳細は、U.S. Patent 5,139,941、およびU.S. Patent 4,797,368に記載されており、それぞれ参照として本明細書に組み入れられる。
AAVは、これが別のウイルス（アデノウイルスまたはヘルペスウィルス・ファミリーのメンバー）と同時感染して、培養細胞において増殖性の感染を受けることが必要であるという点で、依存的なパルボウイルスである（Muzyczka、1992）。ヘルパーウイルスとの同時感染がないと、野生型AAVゲノムは、ヒト第19染色体にその末端を介して組み込まれ、ここでプロウイルスとして潜在的な状態で存在する（Kotin et al., 1990； Samulski et al., 1991）。しかし、rAAVは、AAV Repタンパク質も発現されない限り、組込みに関しては第19染色体に制限されない（Shelling and Smith, 1994）。AAVプロウイルスを有する細胞が、ヘルパーウイルスによって重感染されると、AAVゲノムは、染色体から、または組換えプラスミドから「レスキュー」されて、正常な増殖性感染が確立される（Samulski et al., 1989； McLaughlin et al., 1988； Kotin et al., 1990； Muzyczka, 1992）。
典型的には、組換えAAV（rAAV）ウイルスは、2つのAAV末端反復に隣接する関心対象の遺伝子を含むプラスミド（McLaughlin et al., 1988； Samulski et al., 1989；それぞれ参照として本明細書に組み入れられる）、末端反復を有さない野生型AAVコード配列を含む発現プラスミド、例えばpIM45（McCarty et al., 1991；参照として本明細書に組み入れられる）を同時形質移入することによって作製される。当業者であれば、AAVウイルスを使用してベクターを作製するために利用できる技術に精通しているであろう。
単純ヘルペスウイルス（HSV）は、そのニューロン細胞に対する向性により、神経系障害を治療する際にかなりの関心がもたれたが、このベクターは、その広宿主域によりその他の組織に対して利用することもできる。HSVベクターを魅力的にしているもう一つの要因は、ゲノムのサイズおよび構成である。HSVは大きいので、複数の遺伝子または発現カセットを組み込んでも、その他のより小さなウイルス系よりも問題が少ない。加えて、様々な性能（時間的、強度、その他）を有する種々のウイルス制御配列の有効性により、その他の系におけるよりも広範囲に発現を制御することができる。また、本ウイルスは、スプライスされたメッセージが比較的少なく、さらに遺伝子操作が容易になることも利点である。
また、HSVは、操作が比較的容易であり、高力価に培養することができる。従って、十分なMOIを達成するために必要な体積に関して、および繰り返しの投薬を少なくする必要がある際に、送達の問題がより少ない。遺伝子治療ベクターとしてのHSVの総説については、Glorioso et al. （1995）を参照されたい。当業者であれば、ベクターとしてHSVを使用するための周知の技術に精通しているであろう。
ワクシニアウイルスベクターは、これらを構築することが容易で、比較的高レベルの発現が得られ、広い宿主域で、およびDNAを保有するための能力が大きいために、広範囲に使用されてきた。ワクシニアは、約186kbの直鎖状の、二本鎖DNAゲノムを含み、顕著な「A-T」選択を示す。約10.5kbの逆位の末端反復は、ゲノムに隣接する。大部分の必須遺伝子は、中心領域に位置するように見え、ポックスウイルスで最も高度に保存されている。ワクシニアウイルスで推定されるオープンリーディングフレーム数は、150〜200である。両方の鎖がコードしているが、読み枠の広範な重なりは、一般的でない。
その他のウイルスベクターを本発明の構築物として使用してもよい。たとえば、ポックスウイルスなどのウイルスに由来するベクターを使用してもよい。ベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスの分子的にクローン化された株は、異種ウイルスタンパク質の発現のための複製コンピテント・ワクチン・ベクターとして遺伝的に精製された（Davis et al., 1996）。研究では、VEE感染症が有力なCTL反応を刺激したことを証明し、VEEが免疫化のための極めて有用なベクターであろうことを示唆した（Caley et al., 1997）。本発明においても、VEEウイルスが樹状細胞を標的化する際に有用であろうことが想定される。
ポリヌクレオチドは、特異的に結合するリガンドを発現するように設計されたウイルスベクターに収納されていてもよい。したがって、ウイルス粒子は、標的細胞の同族の受容体と特異的に結合し、細胞に内容物を送達する。新規のアプローチでは、ラクトース残基をウイルス外被に化学的に付加することによるレトロウイルスの化学修飾に基づいて、レトロウイルス・ベクターの特異的なターゲティングを開発することができるようにデザインした。この修飾により、シアロ糖タンパク質受容体を介して肝細胞の特異的な感染を行うことができる。
組換えレトロウイルスをターゲティングするためのもう一つのアプローチがデザインされ、その中では、レトロウイルスの外被タンパク質に対する、および特異的な細胞受容体に対するビオチン化された抗体を使用する。抗体は、ストレプトアビジンを用いてビオチン成分を介して結合された（Roux et al., 1989）。主要組織適合複合体クラスIおよびクラスII抗原に対する抗体を使用して、彼らは、インビトロでのエコトロピックウイルスによる、これらの表面抗原を有する種々のヒト細胞の感染を証明した（Roux et al., 1989）。
2. 非ウイルス・ベクター
また、発現ベクターを細胞に導入するためのいくつかの非ウイルス法が、本発明によって想定される。これらには、リン酸カルシウム沈殿（Graham and Van Der Eb, 1973； Chen and Okayama, 1987； Rippe et al., 1990）、DEAE-デキストラン（Gopal, 1985）、電気穿孔法（Tur-Kaspa et al., 1986； Potter et al., 1984）、直接の微量注入（Harland and Weintraub, 1985）、DNA充填リポソーム（Nicolau and Sene, 1982； Fraley et al., 1979）およびリポフェクトアミン-DNA複合体、細胞超音波処理（Fechheimer et al., 1987）、高速度微粒子を（microprojectiles）使用する遺伝子照射（Yang et al., 1990）、ポリカチオン（Bousssif et al., 1995）および受容体を媒介したトランスフェクション（Wu and Wu, 1987； Wu and Wu, 1988）を含む。これらの技術のいくつかは、インビボまたはインビボで使用するためにうまく適応されているであろう。当業者であれば、非ウイルス・ベクターの使用に属する技術に精通し、本明細書に開示されるもの以外のその他のタイプの非ウイルス・ベクターが本発明によって想定されることを理解するであろう。
本発明のさらなる態様において、発現カセットは、リポソームまたは脂質製剤にエントラップされていてもよい。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水溶媒質によって特徴づけられる小胞構造である。多重膜リポソームは、水溶媒質によって分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁される時に自発的に形成される。脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自己再構成を受け、脂質二重層間に水および溶解した溶質をエントラップする（Ghosh and Bachhawat, 1991）。また、リポフェクトアミン（Gibco BRL）と複合体を形成した遺伝子構築物も想定される。当業者であれば、リポソームおよび脂質製剤を利用する技術に精通しているであろう。
脂質に基づいた非ウイルス製剤は、アデノウイルスの遺伝子療法に変形例を提供する。多くの細胞培養研究では、脂質に基づいた非ウイルス遺伝子導入が実証されているが、脂質に基づいた製剤を介した全身性の遺伝子送達は、制限されていた。非ウイルス脂質に基づいた遺伝子送達の主な制限は、非ウイルス送達媒体を含む陽イオン性脂質の毒性である。リポソームのインビボ毒性は、インビトロとインビボの遺伝子導入の間の結果の矛盾を部分的に説明する。この矛盾するデータに寄与するもう一つの要因は、血清タンパクの存在下および非存在下でのリポソーム安定性の相違である。リポソームと血清タンパクの間の相互作用は、リポソームの安定性の特徴に対して劇的な影響を有する（Yang and Huang, 1997）。陽イオン性リポソームは、負に荷電した血清タンパクを引きつけて結合する。血清タンパクによっておおわれたリポソームは、溶解されるか、またはマクロファージによって吸収され、循環からこれらが除去されることとなる。現在のインビボでのリポソームの送達法では、循環における陽イオン性脂質と関係する毒性および安定性の問題を回避するために、皮下、皮内、腫瘍内、または頭蓋内の注射を使用する。リポソームと血漿タンパク質の相互作用は、インビトロ（Felgner et al., 1987）およびインビボでの遺伝子導入の効率の相違の原因となる（Zhu et al., 1993； Solodin et al., 1995； Thierry et al., 1995； Tsukamoto et al., 1995； Aksentijevich et al., 1996）。
脂質製剤の生産は、（I）逆相蒸発、（II）脱水再水和、（III）洗浄剤の透析、および（IV）薄膜水和の後に、リポソーム混合物の超音波処理または連続押出によって達成されることが多い。一旦製造されると、脂質構造は、循環するときに有毒な（化学療法学）または不安定な（核酸）カプセル化化合物を使用することができる。リポソームのカプセル化は、このような化合物に対してより低い毒性およびより長い血清半減期を生じさせる（Gabizon et al., 1990）。多くの疾患治療では、脂質に基づいた遺伝子導入ストラテジーを使用して、従来の療法を増強し、または新規の療法、特に高増殖性疾患を治療するための療法を確立する。
E. ワクチン
本明細書に使用されるものとして、「ワクチン」は、細胞、組織、または動物（たとえば、ヒト）の抗原に対する免疫応答を誘導することができる抗原性の組成物である。本明細書に使用されるものとして、「抗原性の組成物」は、抗原（たとえば、ペプチドもしくはポリペプチド）、抗原をコードする核酸（たとえば、抗原発現ベクター）、または抗原を発現するか、もしくは提示する細胞を含んでもよい。本発明の特定の態様において、抗原性の組成物は、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物の全部もしくは一部を含むか、またはコードする。抗原性の組成物は、1つもしくは複数のさらなる免疫賦活性の薬剤、またはこのような1つもしくは複数の薬剤をコードする核酸を含む混合物の一部であってもよい。免疫賦活性の薬剤は、さらなる抗原、免疫調節物質、抗原提示細胞、またはアジュバントを含むが、これらに限定されない。その他の態様において、さらなる薬剤の1つまたは複数が、いずれかの組み合わせで、抗原または免疫賦活性の薬剤に対して共有結合で結合される。
ある態様において、抗原性の組成物または免疫学的に機能的な同等物は、被検体において腫瘍またはウイルス病に対する体液性および／または細胞性の免疫応答を誘導する際に有効なワクチンとして使用されてもよい。本発明のワクチンは、被検体の癌もしくはウイルス感染の予防、または被検体の癌もしくはウイルス疾患の治療に適用することができる。いずれのタイプの腫瘍も、本発明のワクチンを使用した治療または予防が想定される。たとえば、癌は、乳癌、肺癌、卵嚢癌、脳癌、肝癌、子宮頚癌、大腸癌、腎癌、皮膚癌、頭部および頚部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、リンパ性の癌、胃癌、膵癌、精巣癌、リンパ腫、または白血病であってもよい。同様に、いずれのタイプのウイルス疾患も、本発明のワクチンによる治療が想定される。たとえば、ウイルス疾患は、HIV、HSV、ADV、または当業者に既知のその他のいかなるウイルス疾患であってもよい。
ある態様において、免疫応答は、記憶Tリンパ球の発生を含む長期免疫応答である。Spi2Aは、被検体の長期免疫の発生を促進することが示された（下記の例3を参照されたい）。本発明は、能動的および受動的な免疫化態様の両方に使用される1つもしくは複数の抗原性の組成物またはワクチンを想定する。
本発明のワクチンは、タンパク質、核酸、および／または細胞の成分のその組成が異なっていてもよい。非限定の実施例において、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物をコードする核酸は、タンパク質アジュバントと共に処方されてもよい。もちろん、本明細書に記載されている種々の組成物は、さらなる成分をさらに含んでいてもよいことが理解される。たとえば、1つまたは複数のワクチンの成分が、脂質またはリポソームに含まれていてもよい。もう一つの非限定の実施例において、ワクチンは、1つまたは複数のアジュバントを含んでいてもよい。本発明のワクチン、およびその種々の成分は、本明細書に開示されたいずれの方法によって調製してもよく、および／または投与してもよく、または本開示を考慮して、当業者には既知であろう。
1. タンパク質抗原
本発明の抗原性の組成物は、固相合成による化学合成、およびHPLCによる化学反応のその他の生成物からの精製、またはインビトロ翻訳系もしくは生細胞におけるSpi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物をコードする核酸配列（たとえば、DNA配列）の発現による産生を含む（しかし、これらに限定されない）当技術分野において周知の方法によって作製されてもよいことが理解される。好ましくは、抗原性の組成物は、単離され、広範囲に透析して、1つもしくは複数の望まれない小分子量の分子を除去し、および／または所望の媒体により容易に製剤化するために凍結乾燥される。ワクチン成分に作製されるさらなるアミノ酸、突然変異、化学修飾その他は、あるとしても、好ましくは実質的にエピトープの配列の抗体認識を妨害しないことがさらによく理解される。
2. 遺伝子ワクチン抗原
ある態様において、免疫応答は、1つもしくは複数のSpi2Aポリペプチドまたは1つもしくは複数のSpi2Aポリペプチド同等物をコードする核酸を動物にトランスフェクトするか、または接種することによって促進させてもよい。次いで、標的動物内に含まれる1つまたは複数の細胞は、動物への核酸の投与の後に、核酸によってコードされる配列を発現する。従って、ワクチンは、免疫化プロトコルに有用な「遺伝子ワクチン」を含んでいてもよい。また、ワクチンは、たとえば抗原のペプチドまたはポリペプチド配列の全部もしくは一部をコードする核酸（たとえば、cDNAまたはRNA）の形態であってもよい。核酸によるインビボでの発現は、たとえばプラスミドタイプのベクター、ウイルスベクター、またはウイルス／プラスミド構築物ベクターによるものであってもよい。
好ましい側面において、核酸は、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物をコードするコード領域を含む。もちろん、核酸は、1つまたは複数の免疫調節物質、アジュバント、または癌もしくはウイルス疾患の治療に適用することができる治療薬を含む（しかし、これらに限定されない）さらなる配列を含み、および／またはコードしてもよい。当業者であれば、本発明のワクチンに使用するためのこれらの核酸の調製のための技術に精通しているであろう。
3. 細胞ワクチン抗原
もう一つの態様において、抗原を発現する細胞は、ワクチンを含んでいてもよい。細胞は、培養、組織、器官、または生物体から単離されてもよいし、細胞ワクチンとして動物に投与されてもよい。従って、本発明は、「細胞ワクチン」を想定する。細胞は、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物をコードする核酸をトランスフェクトされていてもよい。もちろん、細胞は、また、免疫調節物質、アジュバント、またはウイルス感染などの癌もしくは感染症の治療に適用することができる治療薬などの1つまたは複数のさらなるワクチン成分を発現していてもよい。ワクチンは、細胞の全部または一部を含んでいてもよい。
F. 薬学的製剤
被検体に対する投与のためのSpi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物の薬学的製剤が、本発明によって想定される。加えて、ドナー顆粒球を必要とする被検体に投与するためのドナー顆粒球を調製する際に使用するためのSpi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物の薬学的製剤が、本発明によって想定される。
1. 製剤
いずれのタイプのSpi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物の薬学的製剤も、本発明によって想定される。当業者であれば、利用できる製剤の多様なタイプに精通し、これらの薬学的製剤を作製するために必要な技術に精通しているであろう。
本発明のある態様において、薬学的製剤は、水性組成物である。本発明の水性組成物は、薬学的に許容されるキャリアまたは水性媒体に溶解され、または分散されたSpi2Aポリペプチド、もしくはSpi2Aポリペプチド同等物などの有効な量を含む。また、前述のいずれかを発現する遺伝子治療ベクターの水性組成物も想定される。「送達のために適した薬学的製剤」または「薬理学的に有効な」または「薬学的に許容される」の句は、動物または適切であればヒトに投与されるときに、有害な、アレルギー性の、またはその他の有害反応を生じない分子実態および組成物をいう。
本明細書において使用されるものとして、「薬学的製剤」は、あらゆる、および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、等張薬および吸収遅延薬などを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。いずれの従来の媒体または薬剤も、活性成分と不適合でない以外は、治療組成物におけるその使用が想定される。また、サプリメントの活性成分も、組成物に組み入れることができる。ヒト投与については、製剤は、FDA事務所の生物学的基準（FDA Office of Biologics standards）による要求に応じて、無菌性、発熱原性、一般的な安全性、および純度基準を満たすべきである。
生物物質は、望まれない小さな分子量分子を除去するために広範に透析されるべきであり、および／または適切な場合は、所望の媒体に容易に処方するために凍結乾燥されるべきである。次いで、活性化合物は、通常、非経口投与などの何らかの既知の経路によって投与するために処方される。成分または活性成分として本明細書に開示された本発明の活性な薬剤を含む水性組成物の製剤は、本開示を考慮して、当業者には既知であろう。
本発明の薬剤または物質は、中性または塩の形態の組成物に処方することができる。薬学的に許容される塩類は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）を含み、これは、たとえば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、蓚酸、酒石酸、およびマンデル酸などの有機酸で形成される。当業者であれば、塩形態の生成のための技術に精通しているであろう。また、キャリアは、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であることができる。
本発明は、血管内注射のための、または他のいずれかの経路にもよる適用のための、無菌液である薬学的製剤中のSpi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物を想定する。当業者であれば、注射または他のいずれかの経路による適用のための無菌液を作成するための技術に精通しているであろう。無菌の注射用溶液は、必要とされる量の活性化合物を、当業者に知られた種々のその他の成分と共に、適切な溶媒中に組み入れることによって調製される。
処方に続き、溶液は、用量製剤に適合した方法で、および治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、上記で記載されている注射用溶液のタイプなどの種々の剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどを使用することもできる。
水溶液での非経口投与のためには、たとえば、溶液を必要に応じて適切に緩衝化して、最初に液体希釈液を十分な塩類またはグルコースで等張性にするべきである。これらの特定の水溶液は、特に静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内の投与のために適している。この点について、使用することができる無菌の水性媒体は、本開示を考慮して、当業者に既知であろう。
本明細書において開示される活性薬剤は、1用量につき約0.0001〜1.0ミリグラム、または約0.001〜0.1ミリグラム、または約0.1〜1.0またはさらに約10ミリグラムなどを含むように治療混合物中に処方されてもよい。また、多回投与により、投与することができる。
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与のために処方される化合物に加えて、その他の薬学的に許容される形態には、たとえば経口投与のためのタブレットまたはその他の固体；リポソーム製剤；徐放性カプセル；およびクリームを含む現在使用されるその他のいかなる形態をも含む。また、本発明の鼻腔溶液またはスプレー、エアロゾルまたは吸入薬を使用してもよい。
経口製剤は、たとえば、マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウム・サッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの薬学的等級など、通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、タブレット、ピル、カプセル、徐放製剤、または粉末の形をとる。当業者であれば、経口製剤の調製のための周知の技術に精通しているであろう。このような組成物および製剤は、少なくとも0.1%の活性化合物を含むべきである。組成物および製剤の割合は、もちろん多彩であってもよく、便利には、用量の重量の約2〜約75%の間、好ましくは25〜60%の間であってもよい。このような治療的に有用な組成物の活性化合物の量は、適切な用量が得られるような量である。
また、宿主細胞に細胞死のモジュレーターまたは遺伝子治療ベクターを導入するために、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用が想定される。リポソームの形成および使用は、一般に当業者に公知である。
2. 用量
治療薬または予防薬の有効な量は、企図された目標、例えば細胞死の阻害に基づいて決定される。投与される量は、治療の数および用量の両方に従って、治療される被検体、被検体の状態、および要求される保護に依存する。また、治療組成物の正確な量は、開業医の判断に依存し、それぞれの個体に特有である。
ある態様において、患者に対して治療組成物の連続供給を提供することが望ましいであろう。たとえば、心筋梗塞後の治療薬の連続的な血管内の投与では、定義された期間投与されてもよい。局所的な投与のためには、反復適用が使用される。種々のアプローチのためには、長期間にわたって、限定された一定量の治療薬を提供する遅延性製剤を使用することができる。関心領域（心筋梗塞後の心臓など）の連続灌流も好ましいであろう。これはカテーテル法に続いて、治療薬の連続投与することによって達成することができる。投与は、冠状動脈バイパス移植後など、手術後であることができる。重篤な敗血症、MI、および肝機能不全などの疾患を治療するために、本発明者らは、静脈内注射によってTAT-Spi2AポリペプチドまたはTAT-Spi2Aポリペプチド同等物を投与するであろう。患部器官を薬剤によって灌流し、TATペプチドSpi2Aを介して細胞の細胞質への取り込みにより、細胞をアポトーシスまたは壊死性の死から保護することが予期される。灌流のための時間は、特定の患者および状況に対して臨床家によって選択されるが、時間は、少なくとも約1〜2時間まで、2〜6時間まで、約6〜10時間まで、約10〜24時間まで、約1〜2日まで、約1〜2週までの範囲であることができる。通常、連続灌流を経た治療組成物の用量は、1回または複数回の注射によって与えられるものと同等であり、用量が投与される期間にわたって調整される。
当業者であれば、遺伝子送達をインビボおよび生体外の状況に適用する方法をよく知っているであろう。ウイルスベクターについては、ウイルスベクター株を一般的に調製するであろう。ウイルスの種類および達成できる力価に応じて、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、または1×1012の感染性粒子を患者に送達する。同様の形状により、相対的な取り込み効率を比較することによって、リポソームまたはその他の非ウイルス製剤に対して外挿してもよい。薬学的に許容される組成物としての製剤を論議してある。
3. 投与後の遺伝子発現をモニターするためのトレース
本発明の一定の態様では、発現カセットを使用して、関心対象の標的領域へのSpi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチドの送達を使用する。例えば、関心対象の標的領域は、腫瘍であることができる。癌細胞などの細胞の顕微鏡的な病巣の滅失は観察することができないので、標的部位が発現カセットと効率的に接触したどうかを決定することは重要である。これは、発現構築物が所望のポリペプチド産物を活発に産生する細胞を同定することによって達成してもよい。しかし、治療領域において、外来ポリペプチドと腫瘍および非腫瘍細胞に存在するものとの間を区別できることが重要である。追跡エレメントで外来ポリペプチドをタギングすることにより、その分子の発現についての最終的な証拠がもたらされるが、これらの内因性バージョンではもたらされない。従って、請求の範囲の本発明の方法および組成物は、追跡エレメントを有する発現カセットによってコードされるポリペプチドのタギングを含んでもよい。当業者であれば、コードされたポリペプチドにタグを付けるこれらの方法に精通しているであろう。
4. 二次治療
請求の範囲の本発明の一定の態様は、癌を有する被検体の細胞死を調整する方法を提供する。その他の態様は、癌を有する被検体を治療する方法を提供する。いずれのタイプの癌の治療も本発明によって想定される。このような癌の例は、乳癌、肺癌、前立腺癌、卵嚢癌、脳癌、肝癌、前立腺癌、子宮頚癌、大腸癌、腎癌、皮膚癌、肝癌、前立腺癌、頚部癌、大腸癌、腎癌、皮膚癌、肝癌、前立腺癌、子宮頚癌、大腸癌、腎癌、皮膚癌、肝癌、前立腺癌、頚部癌、大腸癌、腎癌、皮膚癌、頭頚部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、リンパ性の癌、胃癌、膵癌、精巣癌、および白血病を含む。
当業者に既知の多様な癌療法を、請求の範囲の本発明の組成物と組み合わせて使用してもよい。いくつかの既存の癌療法および化学療法薬の例は、放射線療法、化学療法、外科的療法、免疫療法、および遺伝子治療を含む。その他の癌療法の例は、光線療法、寒冷療法、毒素療法、またはホルモン療法を含む。当業者には、このリストが癌およびその他の過形成性の病変に対して利用できる治療様式のタイプを網羅したものでないことが既知であろう。
当業者であれば、発現カセットを含む組成物と抱合させて使用することができるその他の抗癌治療の存在および開発を認識し、請求の範囲の本発明の二次療法の使用が、下記の薬剤に制限されないことをさらに認識するであろう。
細胞死を調整するポリペプチドをコードする発現構築物の有効性を増大するためには、これらの組成物を悪性腫瘍の治療に有効なその他の薬剤と組み合わせることが望ましいであろう。これらの組成物は、細胞を死滅させ、または増殖を阻害するために有効な組み合わせの量で提供される。このプロセスは、発現構築物および薬剤または第2の因子と細胞を同時に接触させることを含んでいてもよい。これは、単一の組成物もしくは両方の薬剤を含む薬理学的製剤を細胞と接触させることによって、または2つの異なる組成物もしくは製剤であって、一方の組成物が発現構築物を含み、他方が第2の薬剤を含む組成物もしくは製剤細胞を同時に接触させることによって達成されるであろう。
または、遺伝子治療は、数分から数週までの範囲の間隔で、その他の薬剤治療に先行して、または続いてもよい。その他の薬剤および発現構築物が別々に細胞に適用される態様において、通常、薬剤および発現構築物がなおも細胞に対して都合よく併用効果を及ぼすことができるように、それぞれの送達時間に有意な期間がとぎれないことを確実にする。このような場合には、互いに約12〜24h以内に、およびより好ましくは、互いに約6〜12h以内に、両様式で細胞を接触させてもよいことが想定される。しかし、一部の状況においては、治療のための時間を有意に延長し、それぞれの投与の間に数日（2、3、4、5、6、または7）〜数週間（1、2、3、4、5、6、7、または8）が経過することが望ましいであろう。
患者に対する本発明の治療的発現構築物の投与は、あるとしたらベクターの毒性を考慮して、化学療法薬の投与のための一般的なプロトコルに従う。治療サイクルは、必要に応じて繰り返されることが予想される。また、種々の標準療法、並びに手術介入を、記載されている高増殖性の細胞療法と組み合わせて適用してもよいことが想定される。
G. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を証明するために含まれる。以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施においてうまく機能することが発明者らによって発見された技術を表しており、したがって、その実施のための好ましい態様を構成するとみなすことができることが当業者によって認識されるはずである。しかし、当業者であれば、本開示を考慮して、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、開示された特定の態様に多く変更を行うことができ、さらに同様のまたは類似の結果を得ることができることを認識するべきである。
実施例1
NF-κBによる細胞死のリソソームの経路の保護
材料および方法
Spi2A mRNAの発現
TNF-α（0.2ng/ml）（R&D）およびシクロヘキサミド（CHX）（0.1μg/ml）で処理後に、製造業者の説明書（Invitrogen）に従ってTrizol Reagentを使用して総RNA（4μg）を抽出し、標準的方法（Sambrook et al., 2001）を使用してノーザンブロットを調製した。ブロットは、[α-32P] dCTP-六量体でラベルしたSpi2AをコードするcDNAプローブによってプローブした（Hampson et al., 1997）。ブロットを取り出し、IκBαまたはGAPDH（De Smaele et al., 2001）をコードする同じようにラベルされた対照プローブで再プローブした。
Spi2A-アンチセンス実験では、Spi2A mRNAのレベルは、Spi2A
Figure 2006524712
およびサイクロフィリンAハウスキーピング対照遺伝子（Medhurst et al., 2000）
Figure 2006524712
に特異的なプライマーおよびプローブを使用するリアルタイムPCRによって定量化した。プローブは、蛍光レポーター色素FAMでラベルした。CHX（10μg/ml）およびTNF-α（10ng/ml）での処理の4時間後に、RNAをTrizol Reagent（Invitrogen）を使用してRelA+/+MEFsから抽出し、次いでRT-PCRのためにSuperscript First-Strand Synthesis System（Invitrogen）を使用してcDNAを作製した。リアルタイムPCR反応は、製造業者の推薦プロトコル（PE Applied Biosystems）に従ってTaqMan Universal PCR Master Mixを用いて行い、ABI Prism 7700 Sequence Detection System（PE Applied Biosystems）で解析した。データは、Sequence Detector software（PE Applied Biosystems）を使用して捕獲して解析した。検量線の傾きは、リアルタイムPCRの効率を記載し、これにより、本発明者らはリアルタイムPCR反応が一貫して＞90%の効率で実行されたことを確認することができた。Spi2A RNAの相対濃度は、サイクロフィリンA対照遺伝子のものによりSpi2A RNAの濃度を割ることによって算出した（Hasel and Sutcliffe, 1990）。
MEFsのレトロウイルスによる形質導入
ヒトRelA（p65）のcDNAをフォワード向きでMIGR1レトロウイルスのベクターのHpa1制限部位にサブクローニングした（Franzoso et al., 1996； Zhang and Ren, 1998）。Spi2Aのオープンリーディングフレーム（ORF）は、精製したT細胞から調製したcDNAから、
Figure 2006524712
を使用してPCRによって増幅した。これらのプライマーには、5' Bam HIおよび3' EcoR1制限部位を導入し、3xFLAG-CMV-14発現ベクター（Sigma-Aldrich）へのクローニングの後にSpi2AおよびC末端の3xFLAG（22アミノ酸）との間のフレーム融合タンパク質の作製を容易にするために、Spi2A ORFの終止コドンを変異させた。同じフォワード・プライマーおよびEcoRI制限部位を導入した3xFLAG DNAに特異的なリバース・プライマー
Figure 2006524712
を用いて、Spi2A-3xFLAG ORFをPCRによって増幅し、次いでフォワードまたはリバース向きのMIGR1レトロウイルス・ベクターのEco R1部位にサブクローニングした。MIGR1レトロウイルスのベクターは、GFPをコードする2シストロンのmRNAとして、RelA、Spi2A-3xFLAG、またはSpi2A-3xFLAGアンチセンスmRNAの発現に向けられた。
レトロウイルスは、以前に記載されているように（Burns et al., 1993）作製した。簡単には、293 GPパッケージ株（4×106）細胞を製造業者の説明書（Invitrogen）に従って、リポフェクトアミンPLUS試薬を使用して、MIGR1-Spi2A-3xFLAG DNA（6μg）およびDNAをコードする水疱性口炎ウイルス（Vesticular Stomatis）ウイルス（VSV）糖タンパク質（6μg）を一過性にトランスフェクトした。48および72h後、レトロウイルスを含む上清を集めて、濾過し、必要になるまで、-80℃で貯蔵した。MEFs（1〜2×105）を6穴プレートにまき、室温で1h遠心分離（1000g）することによってポリブレン（8μg/ml）を含む4mlsのレトロウイルスの上清と共に導入し、続いて24h間37℃でインキュベーションした。48h後、FACSによってGFP陽性のMEFsの割合を測定することによって、形質導入効率を決定し、これは通常96〜98%であった。GFP発現の上位5%の導入されたMEFsをFACSによって精製し、クローン化した。
蛍光顕微鏡観察
Rel A-/- MEFsには、Spi2A-3xFLAGをコードするレトロウイルスまたは空のベクターを導入し、DMEMを含む10%のFCS中で、チャンバーにつき10,000細胞で一晩チャンバースライド（Lab-Tek, Nalge Nunc）にまいた。Spi2Aの免疫蛍光局在化を、抗FLAG抗体（Sigma）を使用して行った。簡単には、細胞を冷却したPBSで3回洗浄し、室温（RT）で15分間、4%のパラホルムアルデヒド（PFA）-PBS中で固定し、0.5%のTriton-X-100（RTで15分）を使用して透過化し、続いて冷却したPBSによって5回洗浄した。スライドを2%の正常なマウス血清（NMS）のPBS溶液でブロックし（RTで45分）、続いてビオチン化した抗FLAG抗体と共にインキュベーションした（RTで10μg/ml、90 min）。結合していない抗体を洗浄した後に、スライドをStreptavidin（SA）-Alexa 546（1μg/ml、RTで60 min、Molecular Probes）と共にインキュベートし、続いて冷却したPBSによって洗浄した。最後に、核染色として、細胞をDAPIを含むベクタシールド（Vectashield）封入剤（Vector labs）中にマウントした。細胞は、Photometrics CoolSNAP HQデジタル・カメラ（Roper Scientific）を装備するLeica DMIRE2倒立顕微鏡で観察し、撮像した。各々のフルオロフォアの蛍光イメージは、以下のChroma filter cubes； DAPI-cube #31000（Ex. 340-380 nm, Em. 435-485 nm）およびFLAG-cube #41004（Ex. 535-585, Em. 610-680 nm）を使用して経時的に獲得した。イメージを獲得し、次いでMeta Imaging Series software version 4.6.5（Universal Imaging Corporation）を使用してオーバーレイした。FLAGが細胞質（原形質膜に結合するのではなく）の全体にわたって分配されたかどうか決定するために、個々の細胞のZ-シリーズを取り込み、MetaMorphを使用して逆重畳積分した。3DモデルをZ-シリーズから再建し、次いでスライスして、回転して側面図を得た（再び、MetaMorphを使用）。
タンパク質の発現
Spi2Aペプチドに特異的な抗血清
Figure 2006524712
を標準的な方法を使用してウサギに生じさせた（Coligan et al., 1995）。簡単には、2匹のウサギをKLHに結合させたそれぞれのペプチドを免役し、次いで免疫原で3月の期間にわたって2回追加免疫した。抗Spi2A抗体は、免疫するペプチドのカラムでアフィニティー精製して、3MのKSCNに溶出し、次いでPBSに対して透析した。
対照またはSpi2Aをコードするレトロウイルスを導入したRelA-/- MEFsからの洗浄剤抽出物をSDS-PAGEによって分離し、次いで標準的なプロトコル（Coligan et al., 1995）を用いて、免疫ブロットし（レーンにつき25μg）、ペプチド1またはペプチド2のいずれかに特異的な抗Spi2A抗体（10μg/ml）でプローブした。Spi2Aは、2μg/mlで西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）に結合したヤギ-抗ウサギIgG（Sigma-Aldrich）でプローブし、化学発光（ECL-kit, Amersham）の後に検出した。ペプチド1または2のいずれかを免役したウサギの両方から精製される抗体は、Spi2A細胞からの抽出物中に52kDタンパク質としてSpi2Aを検出したが、GFP細胞では検出しなかった。同等の充填に制御するために、ブロットを取り除き、0.5μg/mlの抗アクチンモノクローナル抗体クローンACTN05（RDI Research Diagnostics, Inc）、および2μg/mlの抗マウスIgG-HRP（Sigma-Aldrich）でアクチン（42kD）を再度プローブした。
生存アッセイ法
RelA-/- MEFsは、RelA+/+ MEFsと比較して、TNF-αに対して著しく感受性であるが、低レベルのCHX（0.1μg/ml）を生存アッセイ法に使用した。これは、RelA-/- MEFs（図4）に存在する構成的に活性な非RelA NF-κB分子による何らかの保護活性を抑制するためのものである。従って、別に示されていない場合は、RelA-/- MEFsをCHXおよびTNF-α（R&D）によって処置し、生きているGFP陽性な接着細胞の数を16h後にフローサイトメトリーによって計数した。生存細胞は、ヨウ化プロピジウム（PI陰性）を除外し、前方および側方散乱の特徴によって定義して適切なサイズを有したものとして定義した（Coligan et al., 1995）。RelA+/+ MEFsについては、別に示されていない場合は、TNF-αの細胞障害性をCHX（10μg/ml）で16h後に決定した。カテプシンB活性は、CA-074 Me（30μM）（Peptide Institute）でMEFsを1h前処理することによって阻害した。カテプシンB活性の完全な阻害は、酵素アッセイ法によって検証した。RelA-/- MEFsを（10〜50μM）スフィンゴシン（Calbiochem）で処理し、生きているGFP陽性な接着細胞の数を2h後にフローサイトメトリーによって計数した。
デス・エフェクター・アッセイ法
デス・エフェクター経路を、TNF-α（0.2ng/ml）およびCHX（0.1μg/ml）処理によってRelA-/- MEFsに誘導した。執行プロテアーゼ（カスパーゼおよびカテプシンB）のアッセイは、粗細胞質の抽出物で行った（Stegh et al., 2000）。簡単には、MEFs（106）を10mMのトリス-Cl、pH7.5、100mMのNaCl、1mMのEDTA、0.01%のトリトンX-100（50μl）に氷上で30min間溶解し、次いで4℃において15,000gで30min間遠心して、上清を回収した。タンパク質濃度をローリー・アッセイ法（DCタンパク質アッセイキット、Biorad）によって決定した。標準的なプロトコルを使用して、粗サイトゾルの抽出物（レーンにつき50μg）でウェスタン免疫ブロットを行い、以下の抗体でプローブした：ヤギ抗マウスBid抗血清（1μg/ml；R&D systems）、ウサギ抗ヒト・カスパーゼ9抗血清（2μg/ml；Cell Signaling Technology）、ウサギ抗ヒト・カスパーゼ3抗血清（2μg/ml；Cell Signaling Technology）、マウス抗ヒト・カスパーゼ8モノクローナル抗体12F5クローン（1μg/ml；Axxora）。以下の二次抗体を使用した：抗ヤギのIgG HRP（0.5μg/ml；Santa Cruz Technology）、抗ウサギIgG HRP（0.5μg/ml；Amersham）、抗マウスのIgG HRP（0.5μg/ml；Santa Cruz Technology）。特異的なタンパク質は、化学発光（ECL-kit, Amersham）を使用して視覚化した。
カスパーゼための比色アッセイ法は、反応緩衝液（50mMのHEPES、pH7.4、100mMのNaCl、10mMのDTT、1mMのEDTA、10%のグリセロール、0.1%のCHAPS）中で、カスパーゼ3および7（Ac-DEVD-pNA）、カスパーゼ8（Ac-IETD-pNA）、カスパーゼ9（Ac-LEHD-pNA）に特異的なp-ニトアニリン（p-Nitoaniline：pNA）ラベルした基質（Calbiochem）をそれぞれ0.2mMで使用して、粗細胞質の抽出物に対して37℃で行った。比活性は、50μM（ICN Biomedicals Inc）でパンカスパーゼ（pancaspase）阻害剤Z-VAD.fmkと共に抽出物を1hプレインキュベーションした後で検出される明らかな活性を減算し、タンパク質の量に対して基準化することによって決定した。粗細胞質の抽出物中のカテプシンB活性のアッセイ法は、反応緩衝液（100mMのKHPO4、pH6.1、2mMのDTT、1mMのEDTA）中で、カテプシンBに特異的であるがリソソーム由来のその他のシステインカテプシンには特異的でないZ-RR-pNA基質（Barrett and Kirschke, 1981）を0.4mM（Calbiochem）で使用して、37℃で行った。比活性は、30μM（Peptide Institute）でカテプシンB阻害剤CA-074 Meと共に37℃で抽出物を30minプレインキュベーションした後に検出される明らかな活性を減算し、次いでタンパク質の量に対して基準化することによって決定した。
ミトコンドリア膜電位およびROS産生は、それぞれ蛍光色素JC-1（3μg/ml）およびジヒドロ・エチジウム（HE）（5μM）（Molecular Probes）、並びに製造業者の説明書に従ってフローサイトメトリーを使用して測定した。
Spi2Aのプロテアーゼ特異性
RelA-/- MEFsには、C末端3x FLAGエピトープ・タグを有するSpi2Aをコードするレトロウイルスを形質導入し、以前に記載されている方法（Cooley et al., 1998）を使用してSpi2A-3xFLAGを精製した。簡単には、細胞（3×109）を溶解し、Spi2A-3xFLAG（75μg）を、160〜220mMのNaClで溶出後にバッチQ-Fast Flowイオン交換クロマトグラフィー（Pharmacia Biotech）で、続いて抗FLAG抗体カラムによって精製し、製造業者の説明書に従って行った（Sigma-Aldrich）。Spi2A-3xFLAGをPBSに透析し、必要になるまで-80℃で一定分量として貯蔵した。
プロテアーゼは、記載されているように（Hanna et al., 1993）グランザイムAおよびBを精製し、記載されているように（Bromme et al., 1999； Linnevers et al., 1997）カテプシンVおよびKを精製した以外は、製造業者（Calbiochem or Athens Research and Technology）からの購入品であった。プロテアーゼ（20nM）を200nMのSpi2A（擬一次条件を維持するために、少なくとも10倍過剰の阻害剤）と共に適切なアッセイ緩衝液中で37℃において1h間インキュベートした。対照試料は、阻害剤を含まずに酵素のみを含んだ。1hの終わりに、プロテアーゼ活性をアッセイした。セリンプロテアーゼに対しては、以下の基質（Calbiochem）を1mMで使用した（Al-Khunaizi et al., 2002； Cooley et al., 2001）：ヒト・カテプシンG-Suc-AAPF-pNA；ヒト・エラスターゼ-MeOSuc-AAPV-pNAアッセイ緩衝液（20mMのトリス-HCl、pH7.4、500mMのNaCl、0.1%のPEG）溶液；ヒト・グランザイムB-IETD-pNA；ヒト・グランザイムA-BLT-pNA。システインカテプシンに対しては、以下の基質（Molecular Probes）を5μMで使用した：ヒト・カテプシンB、L、KおよびV（Z-FR）2-R110；ヒト・カテプシンH、（Z-PR）2-R110のアッセイ緩衝液（50mMのNaAc pH5.4、4mMのDTT、1mMのEDTA）溶液（Al-Khunaizi et al., 2002）。基質の加水分解は、蛍光マイクロタイタープレートリーダー（Spectramax Gemini XS, Molecular Devices）で測定した。阻害割合は、Spi2Aのない対照と比較した、残留する酵素活性から算出した。同じ条件下でのC末端3x FLAG（Sigma-Aldrich）でタグを付けたアルカリホスファターゼとのインキュベーションでは、プロテアーゼ活性に対して効果を有さなかった。
RelAをコードするレトロウイルスをRelA-/- MEFsに導入するとRelAの発現を生じる
転写因子のRelファミリーのメンバーの過剰発現は、細胞分裂を阻害することが既知である（Bash et al., 1997）。従って、野生型よりも大きいレベルのRelAの発現を回避するために、RelA-/- MEFsを形質導入の24h後にのみ解析した。RelAは、RelAをコードするレトロウイルスを形質導入した24h後に、ウサギ抗RelA（1μg/ml）（Sressgen Biotechnologies）での免疫ブロット（レーンにつき50μg）をプロービングすることによって、RelA-/- MEFsで検出された。
Spi2Aは、NF-κB活性化に影響を及ぼさない
Spi2Aが、NF-κBを直接活性化することにより、TNF-αで誘導されるアポトーシスを保護する可能性を検査した。従って、電気泳動易動度変化アッセイ法（EMSAs）を使用して研究を行って、Spi2A自体が、Spi2Aを導入したRelA-/- MEFsからの核内のNF-κB活性化を促進するかどうか、またはSpi2Aアンチセンス・メッセージによるSpi2A mRNAアップレギュレーションの消失が、RelA+/+ MEFsのNF-κB活性化を阻害するかどうかを決定した。RelA-/- MEFsにおいて、特異抗体による核分画のスーパーシフト解析により、p50/p50ホモ二量体の存在並びにp50およびRelA以外のRel関連タンパク質のヘテロ二量体が明らかになった。以前から周知であったように、p50/p50ホモ二量体ではなくp50/Relヘテロ二量体がTNF-αによって誘導された（Franzoso et al., 1993； Franzoso et al., 1992）。重要なことに、Spi2Aの発現は、これらのNF-κB複合体の発現に影響を及ぼさなかった。RelA+/+ MEFsにおいて、スーパーシフト解析により、TNF-αによるp50/RelAの誘導を確認した。Spi2A-A細胞におけるSpi2A mRNA誘導の阻害は、TNF-αによるNF-κBの誘導を抑止しなかった。Spi2Aは、TNF-αによる刺激に続くNF-κB転写因子の活性化に直接影響を及ぼさないと結論づけられた。従って、Spi2Aの抗アポトーシス活性は、NF-κB活性化の調整を媒介していないようである。
Spi2AによるカテプシンB阻害の速度論
Spi2AによるカテプシンBの阻害の二次結合速度定数は、10倍過剰の阻害剤の存在下および非存在化（擬一次条件）で、カテプシンB基質（Z-FR）2-R110の連続加水分解を行うことによって測定した。簡単には、20nMのカテプシンBを、200または400nM（それぞれ10倍または20倍過剰）のSpi2Aの活性化緩衝液溶液の存在下または非存在下で、5μMの基質に添加した。反応は、96穴マイクロタイタープレートで行った。最終的な反応堆積は、200μlであった。基質加水分解の速度は、3min間連続してモニターした。測定の不感時間（基質に対する酵素の添加（阻害剤の有無にかかわらず）と最初の分光光度法の測定の間の時間）は、30sであった。
阻害反応は、速すぎて本発明者らの従来の分光光度計を使用して測定することができなかった。酵素は、測定の不感時間内に完全に阻害された。これは、二次結合速度定数が拡散限定速度（diffusion limited rates）（＞106M-1s-1）に近づいたことを示した。
TNF-αは、リソソームのpHを崩壊させる。リソソーム内部のpHは、弱い塩基性の、リソソーム作用染料のアクリジンオレンジ（AO）で染色してフローサイトメトリーによって測定した（Zhao et al., 2000）。リソソームのpHの増加は、AOの赤色蛍光およびAOの低い細胞の出現に対応した減少を生じる。TNF-R1の架橋により、対照レトロウイルス（GFP）を導入したRelA-/- MEFsにAOの低い細胞が出現されることが示された（補充、図4）。Spi2Aを導入したRelA-/- MEFsは、より少ないAOの低い細胞の出現を示した。AOの低い細胞の出現はリソソームの破裂と解釈することができ、したがってSpi2Aは、何らかの方法でTNF-αによって誘導されるダメージからリソソームを保護するかもしれない。
結果
NF-κBは、細胞死のリソソームの経路に拮抗する
NF-κBは、アポトーシスのカスケードをいくつかの異なる位置で阻害する保護遺伝子のアップレギュレーションを介して、TNF-αを媒介した死から細胞を保護する。CA-074 MeなどのカテプシンBの特異的な阻害剤を使用して、数種類の腫瘍細胞のTNF-R1で誘導される死において、カテプシンBの役割が証明された（Foghsgaard et al., 2001）。CA-074 Me（30μM）によるカテプシンB活性の完全な阻害により、RelA-/- MEFsをTNF-αで誘導される死から保護した（図1A）。従って、カテプシンB活性は、TNF-αで誘導されるアポトーシスに対するRelA-/- MEFsの感受性に寄与している。
初代細胞および腫瘍細胞の研究では、TNF-R1の活性化により、リソソームから細胞質へカテプシンBが放出されて、そこでこれがアポトーシスをトリガーすることが証明された（Foghsgaard et al., 2001； Guicciardi et al., 2000； Werneburg et al., 2002）。RelA-/- MEFsを用いて、TNF-α処理後のサイトゾルのカテプシンB活性の誘導に対するRelA補完の効果を検査した。RelA-/- MEFsには、GFPをコードするポリシストロン性mRNA上のRelAをコードするレトロウイルスを導入した（Zhang and Ren, 1998）。以前に示したように、RelA-/- MEFsにおけるRelAの発現は、NF-κB機能を回復させ、TNF-α-細胞障害性からの完全な保護をもたらした（図1B）（Beg and Baltimore, 1996）。次に、TNF-αで処理後のサイトゾルにおけるカテプシンB活性の誘導に対するNF-κB/RelAの影響を検査した。TNF-αで処理後2時間という早い時期に、対照RelA-/- MEFsからのサイトゾル抽出物のカテプシンB活性の増大が観察され、次いで時間とともに増大した（図1C）。対照的に、RelAでの形質導入では、TNF-α（図1C）で処理後8時間ほどの間、RelA-/- MEFsの細胞質におけるカテプシンB活性は、消滅した。従って、NF-κBは、サイトゾルにおけるカテプシンB活性を阻害する遺伝子をアップレギュレートするのであろう。
NF-κBによるSpi2Aの誘導は、TNF-αを媒介した細胞死を防ぐ
Spi2Aの転写は、炎症性の刺激によって誘導され、NF-κ-結合に依存する（Hampson et al., 1997； Hampson et al., 2001； Inglis et al., 1991）。最初に、Spi2AがNF-κBの生理的な標的であるかどうかを決定するための研究を行った。Spi2A mRNA（2.3kb）は、RelA+/+ MEFsにおいてTNF-αによって強く誘導されたが、この誘導は、NF-κB/RelA-/- MEFs（Beg and Baltimore, 1996）（図2A）では完全に消失した。劇的であるが、Spi2A発現の誘導は、ikbα（NF-κBの既知の標的）の発現と比較して、より緩徐な動態で生じた（De Smaele et al., 2001）。これらの結果は、Spi2AがNF-κBの生理的標的であることを示す。
細胞生存の制御は、NF-κB転写因子による保護遺伝子の誘導にきわめて依存的である（Karin and Lin, 2002）。Spi2AがTNF-αで誘導される死からRelA-/- MEFsを保護することができるかどうかを検査するために、研究を行った。RelA-/- MEFsには、GFP遺伝子を有するポリシストロン性mRNA上にSpi2Aをコードするレトロウイルスを導入した（Zhang and Ren, 1998）。Spi2Aを導入した安定なクローンに由来する細胞（Spi2A細胞）は、TNF-αに対して著しく改善された生存を示したが、ベクター単独を導入したクローン化細胞（GFP細胞）は、示さなかった（図2B）。TNF-αからのRelA-/- MEFsの保護は、Spi2Aタンパク質の発現と相関した（図2C）。低濃度のTNF-αでは、Spi2Aによる保護が実質的に完全であり（図2Bを参照されたい、0.5ng/mlのTNF-α）、高濃度では16時間後にさえも劇的であったことから、Spi2AがTNF-αで誘導されるアポトーシスを阻害する際に、NF-κB複合体を一過性に置換することができることを示す。
Spi2Aによって媒介される細胞保護作用が過剰発現によるものではなかったことを確かめるために、本発明者らは、アンチセンス配向のSpi2Aを発現する野生型（RelA+/+） MEFs（Spi2A-A細胞）を作製した。TNF-αで処理後、リアルタイムPCRによる解析により、内因性Spi2A mRNAのアップレギュレーションがSpi2A-A細胞の安定なクローンでは消失していることが明らかになった（Medhurst et al., 2000）（図3A）。これらのNF-κBを活性化する能力にもかかわらず、Spi2A-A細胞は、TNF-αで誘導される細胞死に対する顕著な感受性を示した（図3B）。また、TNF-αに対するSpi2-A細胞の感受性は、シクロヘキサミド（cyclohexamide：CHX）の非存在下でも観察され、TNF-αの細胞障害性が、RelA+/+ MEFsにおけるタンパク質合成の阻害によるものではなかったことを示した（図4）。従って、Spi2Aは、TNF-αで誘導されるアポトーシスに拮抗するために必要とされ、死からの保護は、Spi2Aの生理機能である。
Spi2Aは、アポトーシスから保護する
NF-κBは、アポトーシスのミトコンドリアの経路に拮抗する遺伝子の発現をアップレギュレートすることによってTNF-αによって誘導される死から細胞を保護する（Baldwin, 2001； Beg and Baltimore, 1996）。TNF-αから保護する際にSpi2AがNF-κB複合体を置換する能力を考えるために、Spi2Aがアポトーシスのミトコンドリアの経路を阻害することができるどうか決定するための研究を行った。RelA-/- MEFsにおいて、カスパーゼ-8、9、および3、並びにプロアポトーシスBcl-2ファミリーのメンバーBidのTNF-α活性化をウエスタンブロット（図5A）、およびインビトロでの酵素アッセイによって評価した（Budihardjo et al., 1999； Stegh et al., 2000）（図5B）。意外なことに、アピカルおよび執行カスパーゼの両者の活性化、並びにBidは、高レベルのSpi2Aを発現したRelA-/- MEFsで抑制された。これらの細胞では、ミトコンドリアの脱分極-アポトーシスの重要な指標-が、Spi2Aによって実質的に消失された（Budihardjo et al., 1999）（図5C）。重要なことに、Spi2Aは、TNF-αの細胞障害性を媒介する活性酸素種（ROS）の生産も抑制した（Goossens et al., 1995）（図5D）。従って、Spi2Aは、NF-κBヌル細胞においてTNF-αで誘導されるカスパーゼ活性化、ミトコンドリアの脱分極、およびROS生産を消失させ、これによりアポトーシスに対する転写因子の効果を要約している（Wang et al., 1998）。
Spi2Aは、リソソームのシステインカテプシンを阻害する
Spi2Aがアポトーシスに拮抗する機構を決定するために、インビトロでSpi2Aのプロテアーゼ特異性を検査するための研究を行った。エピトープ・タグを付けたSpi2をコードするレトロウイルスを導入したRelA-/- MEFsからSpi2Aを精製した（Cooley et al., 2001）（図6A）。Spi2Aは、セルピン、SQN-5と同様にセリンおよびシステインプロテアーゼを阻害した（Al-Khunaizi et al., 2002）。Spi2Aは、キモトリプシン様の、セリンプロテアーゼ・カテプシンGを阻害したが、エラスターゼまたはグランザイムBもしくはグランザイムAのいずれも阻害しなかった（図6B）。システインプロテアーゼに対するSpi2Aの特異性は、リソソームの、パパイン様のプロテアーゼ（検査したカテプシンB、V、L、K、およびH）の全てに拡張された。Spi2Aは、＞106 M-1 s-1の速度定数kでカテプシンBを阻害し、従ってインビボにおける生理的に関連した阻害剤である可能性が高い（Silverman et al., 2001）。しかし、Spi2Aの阻害作用は、試験したいずれのカスパーゼ（3、8、または9）にも拡張されなかった（図6B）。従って、Spi2Aは、セリンプロテアーゼおよびリソソームのシステインカテプシンのクロス-クラス特異的な阻害剤である。
Spi2Aは、細胞質および核に局在化する
Spi2Aは、これが分泌シグナル配列を欠いており、従って細胞内に位置する可能性が高いという点で（Hampson et al., 1997）、セルピンのキモトリプシン様ファミリーの通常のメンバーではない。TNF-αで誘導されるアポトーシスからの保護におけるSpi2Aをさらに検査するために、本発明者らは、まずFLAGタグを付けたSpi2Aの細胞内位置を、安定に導入されたRelA-/- MEFsにおいて決定した（図2B）。免疫蛍光研究により、細胞質および核内での抗FLAG抗体による染色が明らかになった。Z断面解析では、原形質膜中よりもむしろ細胞質の全体にわたって抗FLAG染色の一様な分布が確認された。Spi2Aは、細胞質および核に存在すると結論づけれれた。これらの研究によって明らかにされたSpi2Aの核原形質の局在化は、免疫蛍光研究（Morris et al., 2002）においてSpi2A抗血清を使用したマクロファージ細胞株およびCOS細胞での他者の知見とも一致する。細胞質の局在化により、Spi2Aがリソソームから放出された後にカテプシン活性の阻害を介してアポトーシスから保護するであろう可能性が高くなる（図1C）。
Spi2Aは、細胞死のリソソームの経路に拮抗する
NF-κBによるSpi2Aのアップレギュレーションは、TNF-R1の結合に続くアポトーシスから細胞を保護する（図2）。Spi2Aは、インビトロでカテプシンBを阻害することができ（図6B）、サイトゾルに位置する。従って、Spi2Aの誘導およびこれが細胞質に放出された後のカテプシンBの阻害は、NF-κBが細胞死のリソソームの経路に拮抗する機構によるであろう（図1）。
RelA補完によって観察されたとおり（図1B）、Spi2Aは、TNF-αでRelA-/- MEFsを処理した後のサイトゾルのカテプシンB活性の誘導を阻害した（図7A）。スフィンゴシンでの細胞の直接の処理は、リソソームからのカテプシンBの放出およびアポトーシスの誘導を生じさせる（Foghsgaard et al., 2001； Kagedal et al., 2001； Werneburg et al., 2002）。リソソームを媒介したアポトーシスから保護する役割と整合して、Spi2Aは、RelA-/- MEFsをスフィンゴシンで処理した後に死から保護することができる（図7B）。全体的に、これらの結果は、Spi2AがNF-κBヌル細胞において、TNF-αで誘導される細胞質のカテプシンBの活性化を消失され、これによりアポトーシスのリソソームの経路に対する転写因子の効果を要約することを示す。
重要なことに、アンチセンスSpi2Aによる内因性Spi2A mRNA発現の阻害により、TNF-αでRelA+/+ MEFsを処理した後に細胞質のカテプシンB活性の誘導を生じた（図7C）。これらの結果は、Spi2AによるサイトゾルにおけるカテプシンB活性の阻害が、NF-κBがアポトーシスのリソソームの経路から細胞を保護することによる生理的に関連した機構であることを示す。
実施例2
Spi2Aは、カスパーゼ非依存的な細胞死を阻害する
材料および方法
TNF-αの死アッセイ法
NIH3T3細胞には、以前に記載されているように（Liu et al., 2003）、GFP単独、またはフォワード（センス）もしくはリバース（アンチセンス）のSpi2AのいずれかをコードするMIGR1レトロウイルス（Zhang and Ren, 1998）を導入し、安定なクローンを作製した。細胞をTNF-αで処理し（R&D）、16h後、生きているGFP陽性な接着細胞の数をフローサイトメトリーによって計数した（Liu et al., 2003）。生細胞は、ヨウ化プロピジウム（PI陰性）を排除し、前方および側方光散乱の特徴によって定義される適切なサイズを有したものとして定義される。カスパーゼ活性は、細胞または抽出物をZ-VAD.fmkで1h間前処理することによって阻害された（ICN Biomedicals Inc；50μM）。カスパーゼ活性の完全な阻害は、酵素アッセイ法によって検査した（Liu et al., 2003）。アンチセンス実験では、以前に記載したおとり（Liu et al., 2003）、Spi2A mRNAのレベルを、Z-VAD.fmk（50μM）およびTNF-α（10ng/ml）で処理して4h後に、Spi2Aに特異的なプライマーおよびプローブ（Inglis et al., 1991）およびシクロフェリン（cyclofilin）A対照mRNA（Medhurst et al., 2000）を使用するリアルタイムPCRによって定量化した。
デス・エフェクター・アッセイ法
デス・エフェクター経路は、TNF-α（10pg/ml）およびZ-VAD.fmk（50μM）でNIH3T3細胞を処理することによって誘導した。カテプシンBの比色アッセイ法は、粗細胞質抽出物に対して行った（Stegh et al., 2000）。簡単には、NIH3T3細胞（106）を10mMのトリスCl、pH7.5、100mMのNaCl、1mMのEDTA、0.01%のトリトンX-100（50μl）に氷上で30min間溶解し、次いで4℃において15,000×gで30min間遠心して、上清を回収した。タンパク質濃度をローリー・アッセイ法（DCタンパク質アッセイキット、Biorad）によって決定した。カテプシンBは、p-Nitoaniline（pNA）ラベルした基質Z-RR-pNA（Calbiochem）（Barrett and Kirschke, 1981）を使用して反応緩衝液中でアッセイした。比活性は、カテプシンB阻害剤CA074-Me（30μM）阻害剤（Peptide Institute）の存在下において検出される明らかな活性を減算することによって決定した（Liu et al., 2003）。ミトコンドリアの膜電位およびROS生産は、それぞれ蛍光色素JC-1（3μg/ml）およびジヒドロ・エチジウム（HE）（5μM）（Molecular Probes）、並びに製造業者の説明書に従ってフローサイトメトリーを使用して測定した。
結果
Spi2Aは、カスパーゼ非依存的なPCDから保護する
Z-VAD.fmkによるカスパーゼ活性の完全な阻害は、野生型レベルのNF-κBを有する通常の抵抗性の細胞を、TNF-αで誘導されるPCDに対して感受性にすることができる（Vercammen et al., 1998； Khwaja and Tatton, 1999）。図9Aでは、予想されたとおり（Khwaja and Tatton, 1999）、Z-VAD.fmkによるカスパーゼ活性の完全な阻害により、NIH 3T3線維芽細胞の、TNF-αによるPCDに対する感受性を高めたことが示された。
カテプシンBなどのリソソームのカテプシンは、カスパーゼ活性の非存在下でPCDを誘導することができる（Foghsgaard et al., 2001）。これにより、Spi2AがカテプシンBの強力阻害剤であるので、これがカスパーゼ非依存的なプログラム細胞死から保護されるのであろうという可能性が高くなる（Borner and Monney, 1999）。これに対処するために、NIH 3T3細胞には、緑色蛍光タンパク質（GFP）を有するポリシストロン性mRNA上にSpi2Aをコードするレトロウイルス（Spi2A細胞）を導入して、高レベルのSpi2Aを発現する安定なクローンを作製した（Liu et al., 2003； Zhang and Ren, 1998）。カスパーゼ活性の非存在下で、Spi2A細胞は、GFP単独（GFP細胞）（図9B）を導入したクローン化された細胞と比較して、TNF-αに対する生存が著しく改善したことを示した。従って、Spi2Aは、カスパーゼ非依存的なPCDから保護することができる。
Spi2Aは、カスパーゼ非依存的なPCDの生理的阻害剤である
Spi2Aによって媒介されるカスパーゼ非依存的なPCDからの細胞保護作用は、過剰発現によるものではなかったことを確かめるために、Spi2Aをアンチセンス配向で発現するNIH3T3細胞（Spi2A-A細胞）のクローンを作製した（Liu et al., 2003）。TNF-αによる事前の処理により、NF-κB依存的な様式でSpi2Aの発現を誘導することが示された（Liu et al., 2003）。予想されたとおり、リアルタイムPCRにより、Z-VAD.fmkの存在下において、TNF-αで処理すると、対照NIH3T3細胞においてSpi2A mRNAのアップレギュレーションを生じることが明らかになった（Medhurst et al., 2000）（図10A）。重要なことに、TNF-αで処理後の、内因性Spi2A mRNAのアップレギュレーションは、Spi2A-A細胞の安定なクローンでは消失した（図10A）。
カスパーゼ活性の非存在下において、アンチセンス・メッセージによる内因性Spi2A mRNA発現の阻害により、TNF-αで誘導されるPCDに対する細胞の感受性の顕著な増大を生じた（図10B）。Spi2Aは、NF-κB活性化に対して直接の効果を有さないことが以前に示されており、従って、Spi2A発現のノックダウンが、NF-κB機能の障害によってPCDを増大した可能性はない（Liu et al., 2003）。従って、Spi2Aは、カスパーゼ活性の非存在下で、TNF-αで誘導されるPCDに拮抗することが必要とされる。
Spi2Aは、カスパーゼ活性の非存在下で、PCDのミトコンドリアの経路を抑制する
ミトコンドリアの外膜の透過化は、大部分のカスパーゼ非依存的な死のプログラムの中心である（Jaattela and Tschopp, 2003）。ダメージを受けたミトコンドリアの1つの重要な結果は、活性酸素種（ROS）の放出であり、これは、特にTNF-αの細胞障害を媒介する際に重要であると考えられる（Goossens et al., 1995）。Spi2Aがカスパーゼ非依存的なPCDから保護する能力を考えて、Spi2Aがミトコンドリアの脱分極およびROS生産から細胞を保護することができるかどうかを決定するための研究を行った。Spi2A発現のノックダウンにより、Z-VAD.fmkおよびTNF-αでSpi2A-A細胞を処理した後に、ミトコンドリアの脱分極（図11A）およびROS生産（図11B）の開始を生じた。従って、これらの結果は、Spi2AがPCDのカスパーゼ非依存的な機構の生理的阻害剤であることを示す。
Spi2Aは、カスパーゼ活性の非存在下における死のリソソームの経路の生理的阻害剤である
システインカテプシン、特にカテプシンBは、カスパーゼ依存的およびカスパーゼ非依存的なPCDの両者の強力な誘導因子である（Guicciardi et al., 2000； Foghsgaard et al., 2001； Liu et al., 2003）。Spi2Aは、細胞質に位置し、従って、これがリソソームから放出された後に、細胞質のカテプシンB活性を抑制することによってカスパーゼ依存的なアポトーシスから保護することができる（Liu et al., 2003）。Spi2Aによる細胞保護作用のこの機構が、カスパーゼ非依存的なPCDの阻害に拡張されるかどうかを決定するために、研究を行った。カスパーゼ活性の非存在下では、アンチセンスSpi2Aによる内因性Spi2A mRNA発現の阻害により、TNF-αでのNIH3T3細胞の処理の後に細胞質のカテプシンB活性の誘導を生じた（図12A）。従って、Spi2AによるサイトゾルのカテプシンBの阻害は、Spi2Aがカスパーゼ活性の非存在下での細胞死のリソソームの経路をブロックすることによる生理的に関連した機構である。
Spi2Aは、NIH3T3細胞を活性酸素種による死から保護する
対照レトロウイルスを有する独立したクローン（GFPクローン#18、12、および2）またはSpi2Aを発現するもの（Spi2Aクローン#6、4、および2）からのNIH3T3線維芽細胞を活性酸素種（ROS）の既知のイニシエーターのナファゾリンと共にインキュベートした。16時間後に、生細胞の割合を、Liu et al., 2003に記載したようにフローサイトメトリーによって決定した。GFP対照と比較して、Spi2Aを発現する全3種のクローンからの細胞の有意な生存の増大が観察された（図12B）。
実施例3
記憶Tリンパ球の分化を容易にする保護遺伝子としてのSpi2Aの同定
材料および方法
マウス
野生型C57BL/6、RAG1-/- C57BL/6（Mombaerts et al., 1992）、CD8-/- C57BL/6マウス（Fueng-Leung et al., 1991）（The Jackson Laboratoryから得た）、RAG1+/+ B6.2.16（Kisielow et al., 1988）およびRAG1-/- B6.2.16トランスジェニック・マウス（Opferman et al., 1999）（129/SvJ x C57BL/6）を維持し、標準的な特定病原体除去（SPF）の条件下で繁殖させた。
抗HY記憶CD8細胞
ナイーブB6.2.16 CD8細胞（＞85%純粋）を雌RAG1欠損B6.2.16マウスのリンパ節（LN）から単離した（Opferman et al., 1999）。抗HYエフェクターは、前述のとおり、雌のRAG1欠損B6.2.16マウス由来の脾細胞をHYペプチドと4d間培養することによって作製した（Markiewicz et al., 1998）。抗HYエフェクター（＞95%純粋）は、雌のRAG1欠損マウスに養子性に導入した。200d後、記憶B6.2.16 CD8細胞（＞80%純粋）は、抗thy1.2ビーズでの磁気ビーズ・ソーティングによって脾臓およびLNから回収した（Miltenyi Biotec）。
LCMV感染
LCMVアームストロング（Armstrong）は、前述のように高力価貯蔵物で貯蔵した（Lin and Welsh, 1998）。初感染のためには、C57BL/6マウスには、2×105プラーク形成単位（PFU）のLCMVの腹腔内（i.p）注射によって感染させ、二次感染のためは、106PFUのi.pによって感染させた。脾臓から一次CTLエフェクターを得るために、マウスを8d後に屠殺して記憶CD8細胞を得て、またマウスは、感染後の80日よりも前には屠殺しなかった。二次エフェクターは、C57BL/6マウスの再感染の5d後に脾臓から得られた（これは以前には60d前にLCMVであった）。
フローサイトメトリー解析
以下のmAbsを使用した：抗CD8α（アロフィコシアニン[APC]ラベル）、抗B220（R-フィコエリトリン[PE]ラベル）、抗CD44-PE、抗-IFN-γ-PE（ラットIgG1）およびラットIgG1-PEアイソタイプ対照（Pharmingen）。H-2Db-四量体を以下のLCMVペプチドによってリフォールディングし：
Figure 2006524712
以前に記載されているように（Ober et al., 2000）、ストレプトアビジンPEでラベルした。脾細胞の懸濁液は、赤血細胞溶解およびフィコール精製の後に調製し（Coligan et al., 1995）、前述のように、染色緩衝液中で4℃において30min間、全3種のPEのラベルが付いた四量体（それぞれ5μg/mlで）および抗CD8α mAbまたはその他のmAbsの組み合わせを含むカクテルで染色した（Murali-Krishna et al., 1998）。FACSによる精製の前に、抗thy1.2ビーズでの磁気ソーティングによってT細胞を濃縮した（MoFlo； DakoCytomation）。ナイーブ細胞（CD44low CD8+）は、抗-CD8α-APCおよび抗CD44-PE抗体での染色によって、非感染C57BL/6マウスの脾臓からFACSで精製した。
機能的な免疫記憶細胞を検出するために、脾細胞（0.2mlに5×106/ml）を製造業者の説明書（Pharmingen）に従って、ゴルジブロック（Golgi-block）の存在下において、全3種のLCMVペプチド抗原（それぞれ10-7M）と共に5hインキュベートした。細胞は、1%のパラホルムアルデヒドに固定し、0.3%のサポニンによって透過化させて、製造業者の説明書に従って抗IFN-γまたは、アイソタイプ対照（ラットIgG1）mAbで染色した。
遺伝子発現の解析
B6.2.16 CD8細胞からのRNAをTrizol（登録商標）試薬（Invitrogen）を使用して単離し、会社の説明書に従ってアフィメトリックス・ジーン・アレイ（Affymetrix Gene Arrays）（登録商標）（Mul 1KAおよびMu1 1KB）とのハイブリダイゼーションのためのcRNAを作製するために使用した。抗LCMV CD8細胞からのRNAは、Trizol（登録商標）試薬（Invitrogen）を使用して精製し、次いでcDNAをRT-PCR（Invitrogen）のためのSuperscript（商標）ファースト鎖合成システムを使用して作製した。それぞれのプライマーセットおよびプローブの独特の特異性は、配列をGen Bankデータベース（これは、インターネットの上の国立衛生研究所ウェブサイトで見いだされるであろう）と照合することによって検証した。プローブは、蛍光レポーター色素FAM、および失活剤（MegaBases, Inc.）としてTAMRAまたはQSY7のいずれかを含んだ。リアルタイムPCR反応は、TaqMan（登録商標）ユニバーサル PCRマスター・ミックス（PE Applied Biosystems）を使用して行い、ABI Prism 7700配列検出系で行った。検量線の傾斜は、リアルタイムPCRの効率を記載し、これにより、本発明者らがリアルタイムPCR反応で一貫して＞90%の効率を実行したことを確実にすることができた。相対的なRNA濃度は、サイクロフィリンA対照遺伝子の濃度によって候補遺伝子RNAの濃度を分けることによって算出した（Medhurst et al., 2000）。
レトロウイルスにより導入された骨髄キメラ
ドナーC57BL/6マウス（8〜10w）には、5-フルオロウラシル（150mg/Kg；Sigma）を腹腔内注射し、5d後、骨髄を集めて、条件培地[15%の熱不活性化したウシ胎児血清、ペニシリン（10U/ml）、ストレプトマイシン（10μg/ml）、L-グルタミン（2mM）、およびβ-メルカプトエタノール（5×10-5M）、組換え（r）-マウスIL-3（20ng/ml、Biosource International）、IL-6（10ng/ml、R&D）、r-マウス幹細胞因子（50ng/ml、Biosource International）、およびr-人flt3リガンド（50〜100ng/ml、R&D）を含むDMEM]中で48h間、24穴プレート（106/ウェル）にまいた。次いで幹細胞を集めて、MIGR1 MuMLV（Zang and Ren, 1998）を導入した。GFPを有するメッセージ上に空のMIGR1対照ウイルス（GFP）またはセンス（Spi2A）もしくはアンチセンス配向（Spi2A-A）でSpi2Aをコードするウイルスの産生が、以前に記載されている（Liu et al., 2003）。形質導入のためには、骨髄幹細胞（1.5×106）を、ポリブレン（8μg/ml）を含む条件培地中で、レトロウイルス上清（2ml/ウェル）と共に24穴プレート中に再懸濁し、4℃で3h間遠心した（1000xg）。2日後に、C57BL/6 CD8欠損マウス（6〜8w）をγ線照射し（1200ラド）、次いで導入した骨髄（1.5〜2.0×106細胞/マウス）を静脈内に注射（i.v.）した。
結果
記憶CD8細胞でアップレギュレートした遺伝子の同定
記憶細胞とナイーブCD8細胞との間の遺伝子発現の違いを広く調査するために、遺伝子アレイ技術を使用した。この研究では、H-2Dbによって提示される雄に特異的なHYペプチドを認識する（Markiewicz et al., 1998）B6.2.16トランスジェニックTCRを発現するCD8細胞（Kisielow et al., 1988）を使用した。ナイーブ抗HY CD8細胞は、雌のRAG1欠損B6.2.16マウスのリンパ節から直接に得られた（Opferman et al., 1999）。抗HY CTLsは、HYペプチドと共にB6.2.16 CD8細胞のインビトロ培養によって作製し、次いで抗原のない、RAG1欠損マウスに養子性に導入した。以前に記載されているように（Markiewicz et al., 1998； Opferman et al., 1999）、200日後に記憶B6.2.16 CD8細胞をこれらのレシピエントの脾臓から精製した。ナイーブおよび記憶B6.2.16 CD8細胞から単離されるRNAを使用する約11,000マウス遺伝子の解析により、241遺伝子が記憶CD8細胞において少なくとも2倍にアップレギュレートされたことが明らかになった（表2および表3）。
（表２）B6.2.16 CD8細胞における遺伝子発現のDNA 11KAアレイ解析
Figure 2006524712
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（表３）B6.2.16 CD8細胞における遺伝子発現のDNA 11KBアレイ解析
Figure 2006524712
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ナイーブおよび記憶B6.2.16 CD8細胞は、材料および方法にて説明したように精製した。cRNAは、Affymetrix Gene Chips（Mu11KAおよびMu11KB）とハイブリダイズさせた。記憶CD8細胞とナイーブCD8細胞の間の遺伝子の発現レベルの違いは、変化倍数（Fold Change）およびソート・スコア（Sort Score）によって評価し、これを表2および表3に示した下降順で一覧表に記載してある。記憶/ナイーブの比率＞=2.0およびソート・スコア>=1.0を有する遺伝子は、記憶細胞において有意にアップレギュレートされるとみなした。
野生型マウスのLCMVアームストロングでの感染により、活発なCTL反応を生じ、これにより、ウイルスをクリアして抗LCMV記憶CD8細胞の安定なプールを生じる（Lau et al., 1994； Murali-Krishna et al., 1998）。B6.2.16記憶CD8細胞においてアップレギュレートされる候補遺伝子の生理的関連を確認するために、LCMVへの感染の後に記憶CD8細胞においてアップレギュレートされたかどうかを決定するための研究を行った。野生型C57BL/6マウスは、LCMVアームストロングに感染して8日後にエフェクターCD8細胞（E）を、または80日以上後に記憶CD8細胞（M）を生じた（Lau et al., 1994）。抗LCMV CD8細胞は、3種の免疫優性LCMV抗原ペプチドおよび抗CD8抗体を添加したH-2Db-四量体を使用するFACSによって、脾臓から精製した（図13A）（Murali-Krishna et al., 1998）。ナイーブCD8細胞（N）は、CD44low D8+染色（図13A）に基づいて、FACSによって非感染C57BL/6マウスの脾臓から直接精製した。エフェクターおよびメモリからのRNAの2つの別々の単離体は、2つの独立したLCMV感染から精製し、一方でナイーブ細胞のRNAは、2つの異なる単離体に由来する。リアルタイムPCRを使用して、CD8集団間の所与の遺伝子のmRNAの発現の相対的な差異を決定した（図13B）（Medhurst et al., 2000）。
B6.2.16 CD8免疫記憶細胞においてアップレギュレートされた43の候補遺伝子のうちの8つは、抗LCMV免疫記憶細胞でもアップレギュレートされた（図13B、表4および表5）。
（表４）CD8細胞集団における差次的な遺伝子発現のリアルタイムPCR解析
Figure 2006524712
表4は、図13Aからの、FACSで精製したナイーブ、エフェクター（感染後8d）、および記憶（感染後＞=80d）CD8細胞における遺伝子発現の相対レベルを示す。データは、図13Bからの2つの独立した実験からのものである。記憶／ナイーブの比較のために、B6.2.16 CD8細胞のDNAアレイ解析からの相対的発現レベルを括弧内に与えてある。集団間のmRNAレベルの統計的な相違は、nsdでは示されない。
（表５）ナイーブCD8細胞と比較した、記憶CD8細胞における候補遺伝子の相対的な発現
Figure 2006524712
表5において、抗HYトランスジェニックTCR B6.2.16またはLCMVに特異的な内因性のTCRのいずれかを発現するナイーブと記憶CD8細胞は、材料および方法に記載したとおりに精製した。所与の遺伝子について、記憶／ナイーブ細胞のmRNAレベルの比率を下降順に一覧表に記載してある。B6.2.16 CD8細胞については、発現レベルは、DNAアレイ解析からのものであり、抗LCMV CD8細胞については、発現レベルは、2つの独立した実験からのCD8細胞のリアルタイムPCR解析からの平均比率である（図13B；表4）。記憶B6.2.16 CD8において明らかにアップレギュレートされたいくつかの候補遺伝子の発現は、ナイーブおよび抗LCMV記憶CD8細胞でのリアルタイムPCRによって信頼できる検出レベル（b.r.d.）以下であったことから、これらの遺伝子の増幅は、標準的な40サイクルのリアルタイムPCRの間には対数期に達しなかったことを示す。加えて、リアルタイムPCRによって解析したときに、記憶B6.2.16 CD8細胞においてより高い多くの候補遺伝子の発現は、抗LCMV記憶細胞では全く高くなかった。本研究において、および他者の知見で（Grayson et al., 2001； Grayson et al., 2000； Kaech et al., 2002）、B6.2.16 CD8記憶と抗LCMV記憶の間のこれらの遺伝子の発現レベルの矛盾は、種々の因子によるものであろう。これらには、抗原性の刺激のタイプの相違、CD8細胞群の純度、および解析がトランスジェニックまたは内因性のTCRを発現する細胞で行われたかどうかを含むであろう。いくつかの候補遺伝子は、抗LCMV記憶CD8細胞においてアップレギュレートされた。抗LCMV記憶CD8細胞（M/E mRNA比<1.7）においてアップレギュレートされなかった候補遺伝子は、さらなる考慮から除外した。いくつかの候補遺伝子（8）は、リアルタイムPCRによって信頼できる検出限界以下の発現レベルを有し、同様にCD8集団間の発現の明らかな相違を誤らないように回避するために除外した（Marrack et al., 2000）。
また、本発明者らの二段階スクリーンによって同定されるいくつかの遺伝子は、記憶CD8細胞でアップレギュレートされることが他者によっても見いだされた（Grayson et al., 2001； Kaech et al., 2002）。これらは、エフェクター分子のグランザイムBおよびFas L（Russell and Ley, 2002）、記憶細胞マーカー遺伝子Ly6C（Walunas et al., 1995）およびケモカイン受容体遺伝子C-Cケモカイン受容体5（CCR5）（Bleul et al., 1997）などのCTL特異的な遺伝子を含む（図13B、表4）。抗LCMV記憶CD8細胞において候補遺伝子の発現レベルの明らかな増大が非T細胞の混入によるかどうかを決定するために、クラスII組織MHC遺伝子IAα b（MHC II）の発現を検出するためのリアルタイムPCRを行った。FACSで精製したCD8細胞の集団の間にMHC IIの発現の相違はなかった（図13B）。従って、二段階アッセイ法により、生理的に関連した記憶CD8細胞においてアップレギュレートされた遺伝子を同定することができた。
これらの解析により、記憶CD8細胞（表5）においてアップレギュレートされることが以前に既知でないその他の遺伝子を同定することができる。記憶CD8細胞分化における保護遺伝子の候補を選択するために、2つの基準―記憶細胞の発生および抗アポトーシス機能と遺伝子発現との相関を使用した。検査した遺伝子の中で、FasLおよびSpi2Aが、記憶細胞へのナイーブ細胞の発生の間に、最も大きな程度でアップレギュレートされた。重要なことに、これらの両方の遺伝子のアップレギュレーションは、CTLの記憶細胞への分化とも相関した（表2）。しかし、2つのうち、Spi2AだけがPCDから保護することができるが、FasLは、PCDの周知のイニシエーターである（Kagi et al., 1994b； Liu et al., 2003）。記憶CD8細胞における抗アポトーシスの、FasLのドミナントネガティブ形態（Chinnaiyan et al., 1996）のアップレギュレーションが検出されたという可能性は、無視することができない。しかし、Fas-FasLの死の経路が、抗LCMV記憶CD8細胞の発生の間に、PCDで役割を果たしていないという以前の知見を考えると、これはありそうにない（Razvi et al., 1995）。グランザイムBと同様に、FasLの発現によって、記憶CD8細胞は、PCDのエフェクター経路を使用して直接感染細胞を殺すことができるようになる（Russell and Ley, 2002）。これは、CTLにおけるSpi2Aのアップレギュレーションにより、記憶細胞前駆体がPCDから逃れるのを容易にすることを示唆する。
記憶CD8細胞の発生の際のSpi2Aの役割を評価するためのモデル
Spi2Aのアップレギュレーションが記憶CD8細胞の分化を容易にするかどうかを直接試験するために、CD8細胞のSpi2A発現をLCMVへの感染の後に調整した。組換えレトロウイルスにより、LCMVへの感染の後にCD8細胞におけるSpi2A mRNAの発現の評価およびノックダウンが可能となった。
C57BL/6マウス由来の骨髄前駆細胞には、ポリシストロン性mRNA上にSpi2Aおよび緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするレトロウイルスを導入した（Liu et al., 2003； Zang and Ren, 1998）。致死的に照射を受けさせたC57BL/6 CD8欠損マウス（Fueng-Leung et al., 1991）に導入した骨髄を養子移入した後に、空のベクター（GFPマウス）またはSpi2A（Spi2Aマウス）をコードするレトロウイルスを収容する骨髄キメラを作製した。アンチセンスSpi2A mRNAの発現は、NF-κB依存的な内因性のSpi2A mRNAのアップレギュレーションを消失することが示された（Liu et al., 2003）。Spi2AをアップレギュレートすることができるCD8細胞を作製するために、レトロウイルス（Spi2A-Aマウス）によってコードされるアンチセンスSpi2A mRNAを発現した骨髄キメラを作製した。
骨髄形質導入およびその後の移植の効率は、いずれのレトロウイルスについても少しも異ならなかった（表6）。
（表６）レトロウイルスで形質導入した骨髄キメラの作製
Figure 2006524712
レトロウイルスにより形質導入された野生型C57BL/6骨髄を、致死的に照射を受けさせた（1200ラド）C57BL/6 CD8欠損マウスに養子移入した（1.5〜2.0×106細胞/マウス）。8週後に、レトロウイルスにより導入された（GFP陽性）Bリンパ球（B220陽性）およびCD8細胞の移植について、PBLを解析した。C57BL/6 CD8欠損マウスにおけるCD8細胞のレベルは、FACSによる検出レベル以下であった（＜0.1%のPBL）。括弧内には、それぞれのリンパ球集団の平均パーセンテージ±SEMおよび範囲を示してある。C57BL/6欠損骨髄キメラにおけるCD8細胞の平均レベルは、年齢がマッチした野生型C57BL/6マウスのレベルの約50%であったのに[8.36±0.41%（8.07〜8.94%）]、B細胞のレベルは、匹敵していた[44.5±1.47%（40.4〜47.7%）]。異なるキメラの実験群の間には、レトロウイルスによって導入されたPBL（GFP陽性）におけるCD8細胞およびB細胞のレベルに有意差はなかった。
8週後、C57BL/6 CD8欠損キメラのPBLにおけるCD8細胞のレベルは、野生型C57BL/6対照レベルの約50%であった。伝達されたPBL集団（GFP陽性な）の中で、GFP、Spi2A、またはSpi2A-Aマウスの間にCD8細胞の割合の相違はなかった（表6）。従って、骨髄前駆体におけるセンスまたはアンチセンスSpi2Aの発現は、ナイーブCD8細胞の発生または恒常性に対して影響を及ぼさなかった。Spi2AおよびSpi2A-Aマウスの脾臓からのGFP+ CD8+細胞をLCMVへの感染の8日後に精製した（図14A）。リアルタイムPCR解析により、Spi2Aマウス由来のCD8細胞のSpi2A mRNAの有意な増加が明らかになった（図14B）。重要なことに、アンチセンスSpi2Aの発現は、LCMVで感染後のCD8細胞における内因性Spi2A mRNAの発現をノックダウンした（図14B）。これらの結果は、レトロウイルスでコードされるSpi2AセンスおよびアンチセンスmRNAの発現が、LCMV特異的なCTLにおけるSpi2A mRNAの発現を調整することを示す。
Spi2Aは、LCMVで感染後の抗原特異的CD8細胞のレベルを決定する
プログラム細胞死は、感染後の抗原特異的なCD8細胞のレベルおよび生じる抗原特異的な記憶CD8細胞のレベルを決定する際に重要である。Spi2Aは、PCDの阻害剤をコードし、記憶CD8細胞においてアップレギュレートされる。従って、Spi2Aは、感染後に記憶細胞前駆体をPCDから保護することによって、記憶CD8細胞の発生を促進するのであろう。CD8細胞におけるSpi2A発現の調整は、記憶期の前と間に抗LCMV CD8細胞のレベルに対して重要な影響を有する。
各々の組換えレトロウイルスを同範囲に導入し（10〜35%のGFP陽性なPBL）、かつ全てが50%の野生型C57BL/6レベルのCD8細胞まで再構成された骨髄キメラを感染させて、LCMV特異的なCD8細胞の割合を、LCMV抗原ペプチドを添加したH-2Db-四量体でPBL染色することによって決定した。
以前に観察されたとおり、野生型C57BL/6をLCMV（2×105 pfu/マウス）に感染させたときに、PBLにおける抗LCMV CD8細胞のピーク数が8日後に観察された（図15）（Murali-Krishna et al., 1998）。
図16Aの代表的な実験では、GFP対照キメラの感染では、50%の野生型CD8レベルを有し（図15）、抗LCMV CD8細胞の迅速な拡張を生じ、14日後にピークレベルを生じた。組換えSpi2Aの発現では、最初の拡張期の間に抗LCMV CD8細胞のレベルを増大せず、Spi2Aマウスのピーク反応の大きさに影響を及ぼさなかった。しかし、引き続いて起こる収縮期の間に、Spi2Aマウスにおける抗LCMV CD8細胞のレベルのかなりの増大が観察され、記憶期の間に高レベルの抗LCMV CD8細胞を生じて、これが少なくとも14週間安定であった（図16A；図17）。Spi2Aマウスにおいて、最大レベルの割合として残余のレベルを基準化することにより、抗LCMV CD8細胞レベルの収縮の程度が有意に減少することが明らかになった（図16B；図18）。また、PBL中の総GFP+ CD8+細胞群の割合として測定される抗LCMV CD8細胞のレベルは、Spi2Aマウスにおいて有意に上昇した（図16C）。従って、Spi2Aの発現は、抗原特異的なCD8細胞のレベルを特異的に増大した。骨髄キメラでは、組換えレトロウイルスがCD8細胞以外の白血球に発現される（表6）。しかし、GFP陰性の数に相違はなく、Spi2Aマウスにおいて抗LCMV CD8細胞が観察された（図16D）。従って、CD8細胞以外のGFP陽性な白血球に生じたSpi2A発現をどのように調整しても、ウイルス特異的CD8細胞のレベルに影響を及ぼさなかった。全体として、これらの結果は、CD8細胞におけるSpi2Aの発現が、抗LCMV CD8細胞の収縮期の程度を軽減し、記憶期におけるウイルス特異的細胞のレベルの増大を生じることを示す。
記憶CD8細胞の発生とSpi2Aの生理的関連を決定するために、LCMV感染に対するCD8細胞の反応における、Spi2Aアップレギュレーションを消失させることの効果を検査した。アンチセンス・メッセージによるCTLにおけるSpi2A mRNA発現のノックダウンにより、ピークレベルの減少（図16A；図17）およびより低い基準化された残余レベルによって証明されるように、より激しい収縮期（図16B；図18）の両方を生じた。従って、抗LCMV CD8のレベルは、収縮期および生じる記憶期を通じて減弱された（図17）。Spi2Aは、抗LCMV CD8細胞のピークレベルおよび収縮期の程度を決定すると結論することができる。免疫応答後に、PCDは、抗原特異的なCD8細胞の数を制限させることが長く認識されてきた（Ahmed and Gray, 1996）。従って、PCDの阻害剤としての役割と整合して（Liu et al., 2003）、これらの結果は、Spi2Aのアップレギュレーションが記憶CD8細胞の発生の間にCTLをPCDから保護することが必要とされることを示す。
Spi2Aは、抗LCMV記憶CD8細胞の数を決定する
記憶CD8細胞の特徴は、抗原に対する一次曝露のずいぶん後に、これらが直ちに抗原による再刺激に反応する能力である。長期持続記憶細胞の発生におけるSpi2Aの役割を検査するために、この表現型の定義を使用して、LCMVで感染後の、組換えレトロウイルスの骨髄キメラの脾臓における記憶CD8細胞の数を定量化した。CD8細胞におけるSpi2A発現の調整は、抗LCMV CD8記憶細胞の数に対して有意な効果を有した。
典型的には、抗LCMV記憶CD8細胞は、抗原ペプチドでの刺激の5時間以内にインターフェロン-γ（IFN-γ）などのサイトカインを生じることができる（Murali-Krishna et al., 1998）。このアッセイ法を使用して、LCMVでの感染の75日以上後に脾臓において持続した記憶CD8細胞（IFN-γ+ CD8+）を定義し、定量化した（図19）。Spi2Aの発現は、2回の独立した実験において、Spi2Aマウスの抗LCMV CD8細胞の割合（図19および図20A）および絶対数（表7）を増大した。
（表７）骨髄キメラの感染後の脾臓における抗LCMV CD8細胞の数
Figure 2006524712
Exp.=実験数
C57BL/6 CD8欠損マウスは、GFPを有する多シストロン性メッセージ内に、GFP単独（GFP）、センス（Spi2A）またはアンチセンス（Spi2A-A）の向きでSpi2Aをコードするレトロウイルスが形質導入された骨髄前駆体で再構成し、次いでLCMVを感染させた。絶対細胞数を導入された（GFP+）、または導入されなかった（GFP-）脾細胞について決定した。実験1および3のデータを図20にさらに記載してある。細胞数は、個々の感染したマウスの解析の平均値（±SEM）である（n=解析したマウスの数）。括弧の中の数は、それぞれの実験においてGFP対照と比較した抗LCMV CD8細胞の比例変化を示す。実験1および2において、マウスには一度だけ感染させ、二次感染後の時には適用されない（n/a）。
加えて、Spi2Aの効果は、抗原特異的なCD8細胞に特異的であった（図20B）。Spi2AマウスにおけるGFP陰性の、記憶CD8細胞の数は、LCMVで感染後のGFP対照と比較したが、相違はなかった（図20C）。従って、骨髄キメラの非CD8細胞で生じたかもしれないSpi2A発現のいずれの調整も、記憶CD8細胞の回復において観察される相違の原因とならなかった。
Spi2Aによって容易になる記憶CD8細胞の発生が過剰発現によるものではなかったことを確かめるために、Spi2A-Aマウスにおけるアンチセンス・メッセージによってSpi2Aのアップレギュレーションを抑制する効果を検査した。2回の独立した実験において、Spi2A-Aマウス由来の抗LCMV記憶CD8細胞の割合（図19および図20A）および絶対数（表7）に有意な減少が観察された。全体として、CD8細胞におけるSpi2Aのアップレギュレーションは、長期持続記憶CD8細胞の発生を促進する生理的過程であると結論することができる。
Spi2Aは、LCMVに対する免疫復活反応の能力に影響を及ぼす
抗原に対する強い二次復活反応は、免疫応答の記憶期の特徴であり、記憶T細胞の数および表現型によって決定される（Ahmed and Gray, 1996）。記憶CD8細胞の発生におけるSpi2Aの役割をさらに検査するために、レトロウイルス骨髄キメラにおけるLCMVに対する免疫復活反応を検査した。一次記憶CD8細胞の発生と同様に、Spi2Aは、LCMVによる再感染に対するCD8細胞の免疫復活反応に劇的な効果を有した。
マウスにはLCMVを感染し、一次記憶CD8細胞を生じさせた。60日後、マウスをLCMVで再チャレンジし、5日後に脾臓において、生体外IFN-γ生産アッセイ法（図19）でLCMV反応性のCD8細胞の頻度を決定することによって、免疫復活反応を測定した。予想されたように、対照一次記憶CD8細胞（GFP陰性）をLCMVで再チャレンジすることにより、抗LCMV CD8細胞の10倍の増大を生じた（Blattman et al., 2000； Lin and Welsh, 1998）（表7）。二次抗LCMV CD8細胞の割合および絶対数は、Spi2Aマウスにおいて有意に増大した（図19、図20Dおよび表7）。加えて、Spi2Aの効果は、抗原特異的なCD8細胞に特異的であった（図20E）。Spi2AマウスのGFP陰性の、二次抗LCMV CD8細胞の数に相違はなかった（図20F）。従って、非CD8細胞におけるSpi2A発現のいずれの調整も、CD8細胞の免疫復活反応に対するSpi2Aの効果の原因とはならなかった。
重要なことに、Spi2Aアップレギュレーションの消失は、厳格にSpi2A-AマウスのLCMVに対する免疫復活反応を減弱させた（図19、図20D、および表7）。従って、Spi2Aは、LCMVに対するCD8細胞の免疫復活反応の生理的に関連した決定要素であった。免疫復活反応の大きさは、記憶CD8細胞の数および表現型によって決定されるので、これらの知見は、ウイルスにCD8細胞の記憶を決定する際に、Spi2Aに対して重要な役割を指示する。
実施例4
Spi2Aポリペプチド同等物を同定するためのアッセイ法
明細書の教示および当業者の知識を使用して、Spi2Aポリペプチド同等物を同定するためのアッセイ法を行うことができる。「Spi2Aポリペプチド同等物」の用語は、以前にこの明細書において定義されている。異なる置換を有する複数の異なるタンパク質／ポリペプチド／ペプチドは、本発明に従って容易に製作し、使用することができる。Spi2Aポリペプチド同等物は、ヒト・ポリペプチドを含むいずれの種または生物体に由来するポリペプチドであることもできる。加えて、Spi2Aポリペプチド同等物は、天然に存在し、または合成ポリペプチドであることができる。当業者であれば、多くのSpi2Aポリペプチド同等物が、当技術分野において存在する可能性が高く、共通に利用できる実験法を使用して同定することができることを理解するであろう。例えば、SEQ ID NO：2との比較のために、既知のアミノ酸配列のライブラリーのスクリーニングにより解析することができる。当業者に既知の実験法を使用して、Spi2Aの一定の（ほとんど、または全てでない）アミノ酸が置換されたポリペプチドを合成することができる。1つの方法は、大腸菌において、pET（商標）（Novaegen）発現カセットを使用して、6ヒスチジン（Hisペプチド）と、Spi2Aポリペプチドまたは同等物ポリペプチドとのペプチド間の融合ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子が発現される。これらの融合ポリペプチドは、ニッケル・カラムで精製して、プロテアーゼでの切断によってHisペプチドが除去される。この方法は、TAT-Spi2Aポリペプチドまたは同等物ポリペプチドを作製するために用いることができる。
実施例5
Spi2Aポリペプチド同等物の試験
明細書の教示および当業者の知識を使用して、Spi2Aポリペプチド同等物がカスパーゼ依存的およびカスパーゼ非依存的な細胞死の経路から保護することができるかどうかを決定する試験を行うことができる。例えば、Spi2Aポリペプチド同等物が、TNF-αでRelA+/+ MEFを処理後のカテプシンB活性を阻害することができるかどうかを決定することができる。加えて、Spi2Aポリペプチド同等物を、インビトロでのアッセイ法においてシステインプロテアーゼを阻害する能力についてスクリーニングすることができる。たとえば、カテプシンB阻害について評価することができるSpi2Aポリペプチド同等物は、上で論議したヒト・セルピン・アミノ酸配列に基づいたポリペプチド（すなわち、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、およびSEQ ID NO：9）を含んでもよい。
実施例6
Spi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物を使用する腫瘍発症のインビボ予防
明細書の教示および当業者の知識を使用して、Spi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物がヒト癌のマウスモデルの癌を阻害する能力を決定するためにインビボ研究を行うことができる。インビボ試行の最初のラウンドにおいて、ヒトで見られる腫瘍に似ている組織学的特徴および転移能を有するヒト癌のマウスモデルを使用することができる（Katsumata et al., 1995）。動物を本発明のSpi2Aポリペプチドおよび／またはSpi2Aポリペプチド同等物で処理して、腫瘍発症の抑制を決定してもよい。
たとえば、マウス白血病株化細胞L1210、P388、または当業者に既知のその他の癌のマウスのいずれのモデルに対する抗腫瘍活性についても、インビボでSpi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物を試験することができる。これらの研究とともに、典型的にはマウスの急性および亜急性の毒性を研究してもよい（LD10、LD50、LD90）。より進んだ試験の相では、ヒト異種移植に対するSpi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物の抗腫瘍活性を評価することができ、心毒性研究をラットまたはウサギ・モデルにおいて行うことができる。
簡単には、適切な癌モデルの2群のマウスをSpi2Aポリペプチドおよび／またはSpi2Aポリペプチド同等物の用量で処理することができる。いくつかの組み合わせおよび濃度のSpi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を試験することができる。対照マウスは、緩衝液のみで処理するべきである。
次いで、治療されたマウスに対し対照群の癌の発症に対するSpi2Aポリペプチドおよび／またはSpi2Aポリペプチド同等物の効果を、腫瘍サイズの調査並びにヘマトキシリンおよびエオジンで染色した腫瘍組織の組織病理学的な調査によって比較することができる。
実施例7
Spi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物を用いたヒト被験者の心筋梗塞の治療
明細書の教示および当業者の知識を使用して、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を使用するヒト被験者の急性心筋梗塞症の治療を容易にするために使用することができるプロトコルをデザインすることができる。たとえば、急性心筋梗塞症と臨床的に一致する徴候および症状を呈する患者を、以下のプロトコルを使用して治療してもよい。
本発明の組成物は、典型的には、望まれるとおり、標準的な、周知の無毒の生理的に許容されるキャリア、アジュバント、および媒体を含む単位剤形で経口的または非経口的に投与することができる。非経口的の用語は、本明細書において使用されるものとして、皮下注射、静脈内、筋肉内、動脈内の注射、または注入技術を含む。Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、単独で、または実際には心筋梗塞のためのその他の療法と組み合わせて患者に送達することができる。併用療法が想定される場合、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、薬剤の前に、後に、または並行して投与することができる。本療法は、心臓カテーテル法または血管形成術の前に、後に、または並行して投与することができる。
たとえば、治療過程は、約6用量を含み、1〜6日間にわたって送達することができる。臨床家による選出に応じて、本療法は、より多くのまたは少ない頻回の基盤で続けてもよい。もちろん、これらは、治療のための例示的のみの時間であり、当業者であれば、多くのその他の時間経過が可能であることを容易に認識することができる。
一つの態様において、投与は、単に静脈内に治療組成物を注射することを必要としてもよい。もう一つの態様において、カテーテルを体に挿入することができ、心臓が所望の期間連続して灌流される。
臨床反応は、当業者に既知のいずれの許容される測定法によっても定義することができる。たとえば、完全寛解は、当業者には周知の臨床研究に基づいて、心機能の改善によって定義してもよい。当業者であれば、この明細書において開示される情報を利用し、治療法を最適化することができる。
実施例8
Spi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物を用いたヒト被験者の敗血症性ショックの治療
明細書の教示および当業者の知識を使用して、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を使用するヒト被験者の敗血症性ショックの治療を容易にするプロトコルをデザインすることができる。たとえば、敗血症性ショックと臨床的に一致する徴候および症状を呈する患者を、以下のプロトコルを使用して治療してもよい。
本発明の組成物は、典型的には、望まれるとおり、標準的な、周知の無毒の生理的に許容されるキャリア、アジュバント、および媒体を含む単位剤形で経口的または非経口的に投与することができる。非経口的の用語は、本明細書において使用されるものとして、皮下注射、静脈内、筋肉内、動脈内の注射、または注入技術を含む。Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、単独で、または実際には非経口的抗生物質などの敗血症性ショックのためのその他の療法と組み合わせて患者に送達することができる。併用療法が想定される場合、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、薬剤の前に、後に、または並行して投与することができる。
たとえば、治療過程は、約6用量を含み、7〜21日間にわたって送達してもよい。臨床家による選出に応じて、本療法は、より多くのまたは少ない頻回の基盤で続けてもよい。もちろん、これらは、治療のための例示的のみの時間であり、当業者であれば、多くのその他の時間経過が可能であることを容易に認識することができる。
投与は、静脈内に、または、当業者に既知のその他の方法により、治療組成物を注射することを必要とする。患者および投与プロトコルを選択するための基準は、重篤な敗血症薬のXigrisに記載されているとおりである（Sollet and Garber, 2002； Laterre and Heiselman, 2002）。
臨床反応は、当業者には周知な臨床的な結果の改善によって定義されてもよい。これらは、正常血圧の回復および患者の罹患率の減少を含んでもよい。当業者であれば、この明細書において開示される情報を利用して、治療制度を最適化することができる。
実施例9
Spi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物を用いたヒト被験者の癌の治療
本実施例は、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を用いたヒト癌患者の治療を容易にするためのプロトコルの例を記載する。患者は、以前に化学療法、放射線療法、または遺伝子治療的な治療を受けていてもよいが、受けている必要はない。至適には、患者は、十分な骨髄機能を示してもよい（＞2000/mm3の末梢絶対顆粒球カウントおよび100,000/mm3の血小板カウント、十分な肝機能（ビリルビン1.5mg/dl）および十分な腎機能（クレアチニン1.5mg/dl）として定義される）。
組成物は、1つまたは複数のSpi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を含むことができ、望まれる標準的な、周知の無毒の生理的に許容されるキャリア、アジュバント、および媒体を含む単位剤形で非経口的に投与されてもよい。非経口的の用語は、本明細書において使用されるものとして、皮下注射、静脈内、筋肉内、動脈内の注射、または注入技術を含む。組成物は、腫瘍血管に直接投与されてもよく、単独で、または実際にはその他の療法と組み合わせて患者に送達されてもよい。併用療法が想定される場合、組成物は、その他の抗癌剤の前に、後に、または並行して投与されてもよい。
一つの例において、治療過程は、約6用量を含み、7〜21日の期間にわたって送達することができる。臨床家による選出に応じて、本療法は、3週ごとに連続して6用量またはより少ない頻回（毎月、隔月、毎季、その他）の基盤で行ってもよい。もちろん、これらは、治療のための例示的のみの時間であり、当業者であれば、多くのその他の時間経過が可能であることを容易に認識することができる。
一つの態様において、投与は、腫瘍内への治療組成物の注射を伴ってもよい。もう一つの態様において、カテーテルを腫瘍部位に挿入することができ、腔を所望の期間連続して灌流してもよい。
臨床反応は、当業者に既知の許容される測定法によって定義することができる。たとえば、完全寛解は、少なくとも1ヶ月間全ての測定可能な疾病が消失することによって定義されてもよい。他方では、部分反応は、全ての評価できる腫瘍小結節の垂直直径の産物の合計の50%以上の減少または少なくとも1ヶ月間腫瘍部位が拡大を示さないことによって定義されてもよい。同様に、混合反応は、1つまたは複数の部位において進行している、全ての測定可能な病変の垂直直径の産物が50%以上減少することによって定義されてもよい。当業者であれば、この明細書において開示される情報を使用して、治療法を最適化することができる。
実施例10
顆粒球の供与を必要とする被検体に送達するためのドナー顆粒球の調製法
上記明細書において論議したとおり、本発明のいくつかの態様は、ドナー顆粒球の調製におけるSpi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物の使用に属するであろう。たとえば、当業者に共通に既知の手段によって適切なドナーからドナー顆粒球を得ることによって、ドナー顆粒球を調製することができる。次いで、当業者に周知の顆粒球単離法を使用して、顆粒球を単離することができる。次いで、単離に続き、顆粒球を、1つまたは複数のTAT-Spi2AポリペプチドまたはTAT-Spi2Aポリペプチド同等物を含む組成物によって処理することができる。
処理した顆粒球の生存を、未処理の対照と比較するために、インビボでの研究を行うことができる。血液は、健常なドナーから収集することができる（これは、顆粒球数をブーストするためにG-CSFによって処理されたか、またはされていなくてもよい）。顆粒球は、アポトーシスおよび好中性の機能を軽減するために、貯蔵の間に、白血球搬出法によって精製し、TAT-Spi2AポリペプチドまたはTAT-Spi2Aポリペプチド同等物を添加することができる（Hubel et al., 2001）。さらなる研究をヒト被験者で行うことができる。必要のある被検体は、ドナー顆粒球によって治療されることが既知のいずれの疾患または症状を有する被検体であることもできる。このような疾患および症状の例は、好中球減少（化学療法、放射線療法、骨髄抑制性の薬物、白血病、特発性の好中球減少、または再生不良性貧血による（Hubel et al., 2001）、新生児の敗血症、および慢性肉芽腫症などの好中球の質的な異常と関係する疾患を含む。特に、本発明は、輸液による療法が適用され、その他の療法が適用されない用量集中的な化学療法による好中球減少の治療において特に有用であろう（Liles et al., 1995）。臨床試験は、Hubel et al., 2001に記載されているように行われてもよい。典型的には、好中球減少性の患者には、4〜17×109顆粒球/m2（これは、Spi2Aまたは同等物によって保存されていたであろう）で10〜15回の輸液を受けさせてもよい。薬剤の有効性は、患者に導入された好中球の数および生体外機能、並びに細菌または真菌への感染の減少を決定することによって測定される。
実施例11
一般の疾患治療におけるSpi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物の使用の臨床試験
本実施例は、一般にこの明細書において先に述べたものなどの疾患治療において、Spi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物を使用するヒト治療プロトコルの開発に関する。特に、このような薬物療法は、細胞死およびリソソームの不安定性が役割を果たす種々の疾患の臨床的な治療に有用であろう。これらの疾患の例は、心筋梗塞、および敗血症性ショックを含む。癌に関連するより詳細な例は、次の実施例で論議してある。
患者の治療およびモニタリングを含む、臨床試験を行うための種々のエレメントは、本開示を考慮して当業者に既知であると考えられる。以下の情報は、臨床試験においてSpi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物の確立に使用される一般的な指針として使用することができる。
標的化される疾患を有する患者は、既存の疾患を有すると新たに診断された患者であることができる。既存の疾患を有する患者には、従来の療法の少なくとも1経過に応答することができなかった人々を含んでもよい。
Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて投与してもよい。薬剤は、静脈内に、経口的に、局所的に、または、治療される疾患に特異的な別の機構によって投与してもよい。血管内であるならば、薬剤は、心臓カテーテル法または冠動脈再建術などの血管内手技の過程の間に投与してもよい。また、薬剤は、手術中に投与されてもよい。たとえば、薬剤は、冠状動脈バイパス移植の過程の間に心臓または冠状血管に直接投与されてもよい。
開始用量は、たとえば0.5mg/kg体重であってもよい。3人の患者を、定義された毒性レベルのないそれぞれの服用レベルで治療してもよい。用量の増大は、薬物に関連した特定レベルの毒性が生じるまで、100%増加まで（たとえば、0.5mg、1mg、2mg、4mg）行ってもよい。その後に、用量増大は、25%増加まで進めてもよい。投与される用量は、分割してもよい。
Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、短い注入時間を通じて、または数日の期間にわたって安定した注入割合で投与されてもよい。Spi2A注入は、単独で、またはその他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。いずれの服用レベルでなされる注入も、それぞれの後に達成される毒性に依存すると考えられる。
治療される疾患に特異的な身体調査、臨床検査、およびその他の臨床研究は、もちろん、治療の前に、および約3〜4週後の間隔で行ってもよい。検査には、CBC、ディファレンシャルおよび血小板カウント、検尿、SMA-12-100（肝臓および腎機能検査）、凝固プロフィール、および疾患の程度を決定するための、または存在する症状の原因を決定するための何らかのその他の適切な化学研究を含むことができる。必要に応じて、血清中の適切な生物学的マーカーをモニターすることができる。
実施例12
癌治療におけるSpi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物の使用の臨床試験
本実施例は、癌治療におけるSpi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物を使用するヒト治療プロトコルの開発に関する。患者の治療およびモニタリングを含む、臨床試験を行う種々のエレメントは、本開示を考慮して当業者に既知であると考えられる。以下の情報は、癌治療法に関連する臨床試験においてSpi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物の確立に使用される一般的な指針として使用することができる。
臨床研究のために選択した癌患者は、典型的には、従来の療法の少なくとも1過程に反応することができなかった。測定可能な疾患は、必要とされない。
Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、単独で、または別の化学療法薬と組み合わせて投与されてもよい。投与は、静脈内、直接腫瘍内に、局所的に、または当業者に既知のその他のいかなる方法であってもよい。開始用量は、0.5mg/kg体重であってもよい。3人の患者を、等級＞3毒性ではないそれぞれの服用レベルで治療されてもよい。用量の増大は、毒性が検出されるまで、100%増加まで（0.5mg、1mg、2mg、4mg）行ってもよい。その後に、用量増大は、25%増加まで進めてもよい。
Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物、および／または抗癌剤の組み合わせは、短い注入時間を通じて、または7〜21日の期間にわたって安定した注入割合で投与されてもよい。Spi2A注入は、単独で、または抗癌剤と組み合わせて投与されてもよい。いずれの服用レベルでなされる注入も、それぞれの後に達成される毒性に依存すると考えられる。約60%の患者が容認できない毒性を示すまで、抗癌剤と組み合わせてSpi2Aの用量を増大して患者群に投与される。この値の2/3である用量を安全な用量として定義することができる。
身体調査、臨床検査、およびその他の臨床研究は、もちろん、治療の前に、および約3〜4週後の間隔で行うことができる。検査には、CBC、ディファレンシャルおよび血小板カウント、検尿、SMA-12-100（肝臓および腎機能検査）、凝固プロフィール、および疾患の程度を決定するための、または存在する症状の原因を決定するための何らかのその他の適切な化学研究を含むことができる。また、血清中の適切な生物学的マーカーをモニターすることができる。
疾病経過をモニターし、抗腫瘍反応を評価するために、初めに異常がある場合には、患者を4週ごとに適切な腫瘍マーカーについて検査してもよいことが想定される。CBC、ディファレンシャルおよび血小カウント、凝固プロフィール、および／またはSMA-12-100などの検査は、毎週行われるであろう。腫瘍反応を評価するために、放射線学的研究などの適切な臨床試験が行われるべきであり、8週ごとに繰り返されるべきである。
臨床反応は、許容される測定法によって定義されてもよい。たとえば、完全寛解は、少なくとも1ヶ月間全ての測定可能な疾病が消失することによって定義されてもよい。他方では、部分反応は、全ての評価できる腫瘍小結節の垂直直径の産物の合計の50%以上の減少または少なくとも1ヶ月間腫瘍部位が拡大を示さないことによって定義されてもよい。同様に、混合反応は、1つまたは複数の部位において進行している、全ての測定可能な病変の垂直直径の産物が50%以上減少することによって定義されてもよい。
実施例13
アルツハイマー病の治療におけるSpi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物の使用の臨床試験
本実施例は、本発明において開発されたSpi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物を使用するアルツハイマー病の治療および予防のためのヒト治療プロトコルの開発に関する。たとえば、本発明のSpi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、単独で、またはプラークに関連した疾患のためのその他の治療と組み合わせて、アミロイド症を防止するために使用することができる。
患者の治療およびモニタリングを含む、臨床試験を行う種々のエレメントは、本開示を考慮して当業者に既知であると考えられる。以下の情報は、臨床試験において単独で、または他剤と組み合わせて、アミロイド症の治療に使用するための一般的な指針として使用することができる。
アミロイド形成的疾患を有するか、またはこのような疾患になる危険がある患者は、臨床研究のために選択することができ、従来の療法の少なくとも1過程に反応することができてなかった患者であってもよい。測定可能な疾患は、必要とされない。唯一の基準は、これらの患者がアミロイド形成プラークを有し、かつ原線維形成があり、もしくは原線維形成を受けたか、またはこれらが疑われることである。
例示的な臨床プロトコルにおいて、患者は、腔において、本発明の治療化合物送達する有効な手段を提供し、およびプラークを形成するアミロイド形成ペプチドの存在について個体の試料を採取するために、カテーテルまたはその他の適切な送達装置の設置を経験していてもよい。同じ手技において、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、単独で、またはアルツハイマー病およびその他のアミロイド形成疾患の治療において共通して使用されるその他の治療薬と組み合わせて投与されてもよい。投与は、局所の原線維形成性のプラーク内に直接、または全身的な方法であってもよい。
開始用量は、0.5mg/kg体重であってもよい。3人の患者は、等級＞3毒性がないそれぞれの服用レベルで治療されてもよい。薬物に関連した等級2毒性が検出されるまで、用量増大は、100%増加まで（0.5mg、1mg、2mg、4mg）行ってもよい。その後に、用量増大は、25%増加まで進めてもよい。投与される用量は、何らかの所与の患者のために第2の薬物と組み合わせる場合、2回の注入に均等に分けて、6時間の間隔で離してもよい。
Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物および組み合わせて使用するいずれのその他の抗アミロイド形成薬も、短い注入時間を通じて、または、7〜21日の期間にわたって安定した注入割合で投与されてもよい。Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、単独で、またはその他の抗アミロイド形成薬と組み合わせて注入によって投与されてもよい。いずれの用量レベルでなされる注入も、それぞれの投与の後に達成される毒性に依存する。それ故、何らかの一回注入の後に、または安定な割合での注入のための特定の期間に、等級IIの毒性に達した場合、毒性が改善されない限り、さらなる投与を差し控え、または安定な割合での注入を止まめるべきである。Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物は、単独で、または別の抗アミロイド形成薬と組み合わせて、約60%の患者が何らかのカテゴリーに容認できない等級IIIまたはIVの毒性を示すまで、用量を増大して患者群に投与される。この値の2/3である用量を安全な用量として定義することができる。
身体調査、プラーク測定、および臨床検査は、もちろん、治療の前に、および約3〜4週後の間隔で行うことができる。検査には、CBC、ディファレンシャルおよび血小板カウント、検尿、SMA-12-100（肝臓および腎機能検査）、凝固プロフィール、および疾患の程度を決定するための、または存在する症状の原因を決定するための何らかのその他の適切な化学研究を含むことができる。また、血清中の適切な生物学的マーカーをモニターすることができる。
疾病経過をモニターし、抗プラーク反応を評価するために、初めに異常がある場合には、患者を4週ごとに疾患の適切なプラークおよびマーカーについて検査することができることが想定される。測定可能な疾患が存在するときには、プラーク・サイズ測定が4週ごとに記録される。プラーク反応を評価するために、適切なCATスキャニング研究（CAT scanning study）を8週ごとに繰り返すべきである。検尿を4週ごとに行ってもよい。
臨床反応は、当業者に既知のいずれの許容される測定法によって定義されてもよい。たとえば、たとえば、完全寛解は、少なくとも1ヶ月間全ての測定可能な疾病が消失することによって定義されてもよい。他方では、部分反応は、全ての評価できる腫瘍小結節の垂直直径の産物の合計の50%以上の減少または少なくとも1ヶ月間腫瘍部位が拡大を示さないことによって定義されてもよい。同様に、混合反応は、1つまたは複数の部位において進行している、全ての測定可能な病変の垂直直径の産物が50%以上減少することによって定義されてもよい。
実施例14
肝疾患の治療におけるSpi2AポリペプチドおよびSpi2Aポリペプチド同等物の使用の臨床試験
肝不全および肝硬変は、TAT-Spi2AポリペプチドまたはTAT-Spi2Aポリペプチド同等物の静脈内注射による投与によって治療することができる。治療は、肝細胞壊死およびアポトーシスを減少させ、肝不全および肝硬変を防止するかもしれないことが予期される（Crawford, 1999）。劇症ウイルス性肝炎（A、B、C、D、E、およびG型肝炎ウイルスによる）、薬物、化学製品、およびアルコールによって生じる急性の肝機能不全および肝硬変を治療するための治験を企てることができることが予測される。加えて、TAT-Spi2AポリペプチドおよびTAT-Spi2Aポリペプチド同等物は、ウイルス性肝炎（A、B、C、D、E、およびG型肝炎ウイルスによる）、薬物、化学製品、およびアルコールによって生じる慢性肝疾患および肝硬変を治療するために使用することができる。薬剤の効果は、トランスアミナーゼなどの幹細胞タンパク質の血清レベルの低下および患者の黄疸の減少によって測定することができる。
本明細書に開示され、請求される全ての組成物および方法は、本開示を考慮して過度の実験なしに作製し、実施することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して記載したが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている組成物および方法並びに方法の工程および工程の順序にバリエーションを適用してもよいことが、当業者には明らかであろう。より詳細には、それは、化学的および生理的に関連する一定の薬剤を、本明細書に記載されており、一方で同じまたは同様の結果が達成されるであろう薬剤と置換してもよいことが明らかであろう。当業者に明らかな全てのこのような同様の置換および修飾は、添付の請求の範囲に記載の本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であると考えられる。
参照文献
以下の参照文献は、これらが本明細書において記載されるものに対して例示的な手順、またはその他の詳細な補充を提供する範囲で、具体的に参照として本明細書に組み入れられる。
Figure 2006524712
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Figure 2006524712
Figure 2006524712
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、一定の本発明の側面をさらに証明するために含まれる。本発明は、本明細書に示される特定の態様の詳細な説明と合わせて、これらの図面の1つまたは複数を参照することで、よりよく理解されるであろう。
図1A〜1CはNF-κBの、細胞死のリソソーム経路の拮抗を示す。図1Aは、CA-074Me（30μM）の存在下（TNF+CA-074Me）または非存在下（TNF）におけるTNF-α（0.5ng/ml）およびCHX（0.1μg/ml）で処理したRelA-/- MEFsの生存率。細胞の回復は、CHX単独（100%回復）とインキュベートしたものと比較して回復率を決定した。図1B：GFP単独またはRelAをコードするレトロウイルスを導入したRelA-/- MEFsの生存率。16h後の細胞の回復は、CHX単独（0.1μg/ml）とインキュベートしたものと比較して、回復率を決定した（100%回復）。図1C：TNF-α（0.2ng/ml）およびCHX（0.1μg/ml）で処理後の、GFP単独またはRelAをコードするレトロウイルスを導入したRelA-/- MEFsからの粗細胞質の抽出物中のカテプシンB活性。この実験は、2つの独立した実験を代表する。 図2A〜2Cは、NF-κBによるSpi2Aの誘導が、TNF-αを媒介した死から保護することを示す。図2A：TNF-α（0.2ngml-1）およびCHX（0.1μg/ml）で処理したMEFs由来のmRNAのノーザンブロット。図2B：GFP単独またはSpi2Aをコードするレトロウイルスを導入したRelA-/- MEFsの生存率。16h後の細胞の回復をCHX単独（100%回復）とインキュベートしたものと比較して、回復率を決定した。図2C：RelA-/- MEF細胞のGFPおよびSpi2AクローンからのSpi2Aのウエスタンブロット検出、並びにTNF-α（1ng/ml）およびCHX（0.1μg/ml）で処理後の生存との相互関係。 図3A〜3Bは、野生型MEFsをTNF-αで誘導される死から保護するためには、Spi2Aが必要とされることを示す。図3A：TNF-α（10ng/ml）およびCHX（10μg/ml）で処理した4h後の、GFP単独またはアンチセンスSpi2A（Spi2A-A）をコードするレトロウイルスを導入したクローン化RelA+/+ MEFsにおける、リアルタイムPCRによる内因性Spi2A mRNAレベルの定量化。図3B：TNF-αおよびCHX（10μg/ml）で処理した16h後の、RelA+/+ MEFsのGFPクローンおよびSpi2A-Aクローンの生存率。 TNF-α（100ng/ml）で処理した24h後の、RelA+/+ MEFSのGFPおよびSpiA-Aクローンの生存率を示す。 図5A〜5Dは、Spi2Aが、TNF-αによって誘導されるアポトーシスを阻害することを示す。図5A：TNF-α（0.2ng/ml）およびCHX（0.1μg/ml）で処理後の、RelA-/- MEFs-GFP（11クローン）またはSpi2A（4クローン）からのエフェクター分子のタンパク室分解活性を示すウエスタンブロット。黒矢印は、不活性なプロフォームを示し、白矢印は、それぞれのタンパク質の活性型を示す。RelA-/- MEFs-GFP（11クローン）またはSpi2A（4クローン）を上記のとおり、TNF-αおよびCHXで処理し、その後に測定した：図5B：カスパーゼ活性；図5C：ミトコンドリアの脱分極；および図5D：ROS 図6A〜6Bは、Spi2Aのプロテアーゼ特異性を示す。図6A：Spi2A-3xFLAGをコードするレトロウイルスを導入したRelA-/- MEFsの可溶化液（レーンL）から精製したSpi2A（レーンP-53kD）を示すSDS-PAGE。図6B：Spi2Aによるプロテアーゼの阻害。Spi2Aとプレインキュベーション後のプロテアーゼの活性を単独（0%の阻害）でインキュベートしたプロテアーゼからの活性と比較し、複製して行ったアッセイの3〜4回の独立した実験からの±SEMとした。 図7A〜7Cは、Spi2Aの、細胞死のリソソームの経路の拮抗を示す。図7A：前述のように、TNF-αおよびCHXで処理後の、GFP単独またはSpi2Aクローンをコードするレトロウイルスを導入したRelA-/- MEFsからの粗細胞質の抽出物中のカテプシンBの活性。図7B：スフィンゴシンで処理した2h後の、RelA-/- MEFsのGFPおよびSpi2Aクローンの生存率。図7C：TNF-α（10ng/ml）、およびCHX（10μg/ml）で処理後の、GFP単独またはアンチセンスSpi2A（Spi2A-A）をコードするレトロウイルスを導入したRelA+/+ MEFsからの粗細胞質の抽出物中のカテプシンB活性。 Spi2Aが、RelA+/+ MEFs中のリソソームの脱酸化の部分的保護を引き起こすことを示す。RelA-/- MEFsには、TNF-α（0.2ng/ml）およびCHX（0.1μg/ml）で処理後に、AOの低い細胞の割合によって示したように、GFP単独またはSpi2Aをコードするレトロウイルスを導入した。以前に記載したように（Zhao et al., 2000）、無処理のリソソームの割合をAOでの染色によって決定した。簡単には、細胞をAO（5μg/ml）と共にインキュベートして洗浄し、赤い蛍光（FL3チャネル）によって示される、無処理のリソソームへの取り込みのフローサイトメトリーによる評価を収集した。 図9A〜9Bは、Spi2Aが、TNF-αで誘導されるカスパーゼ非依存的な死からNIH3T3細胞を保護することを示す。図9A：Z-VAD.fmk（50μM）単独もしくはTNF-α（10ng/ml）単独、または両方で処理後の、NIH3T3細胞の生存率。16h後の細胞の回復は、単独でインキュベートしたもの（100%の回復）と比較して、回復率を決定した。図9B：TNF-α+Z-VAD.fmk（50μM）で処理後の、GFP単独（GFP）またはSpi2A（Spi2A細胞）をコードするレトロウイルスを導入したNIH3T3細胞のクローンの生存率。 図10A〜10Bは、Spi2Aが、カスパーゼ非依存的な死の生理的阻害剤であることを示す。図10A：Z-VAD.fmk（50μM）またはZ-VAD.fmk+TNF-α（10ng/ml）での処理の4h後に、GFP単独（GFPクローン）またはアンチセンスSpi2A（Spi2A-Aクローン）をコードするレトロウイルスを導入したクローン化NIH3T3細胞のリアルタイムPCRによる内因性Spi2A mRNAレベルの定量化。図10B：TNF-α+Z-VAD.fmk（50μM）で処理後の、クローン化GFPまたはSpi2A-A NIH3T3細胞の生存率。 図11A〜11Bは、Spi2Aが、カスパーゼ活性の非存在下でミトコンドリアのPCDを阻害することを示す。クローン化GFPまたはSpi2A-A NIH3T3細胞をTNF-α（10pg/ml）+Z-VAD.fmk（50μM）で処理し、次いで図11A：ミトコンドリアの脱分極および図11B：ROS生産を時間とともに測定した。 図12A〜12Bは、Spi2Aが、カスパーゼ活性の非存在下で死のリソソームの経路を阻害することを示す。図12A：TNF-α+Z-VAD.fmk（50μM）で処理前の（time=0h）、または後の（time=8h）、クローン化GFPまたはSpi2A-A NIH3T3細胞からの細胞質の粗抽出物におけるカテプシンB活性。図12B：Spi2Aは、NIH3T3細胞を活性酸素種による死から保護する。対照レトロウイルス（GFPクローン#18、12、および2）またはSpi2Aを発現するもの（Spi2Aクローン#6、4、および2）を有する独立したクローンに由来するNIH3T3線維芽細胞化を既知の活性酸素種（ROS）のイニシエーターのナファザリン（Naphazarin）と共にインキュベートした。16時間後に、有効な細胞の割合は、Liu et al. （2003）に記載されたように、フローサイトメトリーによって決定した。GFPと比較して、Spi2Aを発現する3種のクローン全てに由来する細胞の有意な生存の増加が観察された。 図13A〜13Bは、CD8細胞群の遺伝子発現を示す。図13A：脾細胞を非感染性のC57BL/6マウス（ナイーブ）またはLCMVへ感染後8d（エフェクター）もしくは＞=80d（記憶）から単離した。ナイーブ（CD44low CD8+）細胞は、直接脾細胞から単離し、FACSを使用して抗体によって精製した。感染したマウスから単離した脾細胞を、まずT細胞に濃縮し、次いで、3つ全ての免疫優性のLCMVペプチドおよび抗CD8αmAbを積んだH-2Db四量体で染色した。FACSの前の、およびの後のそれぞれの集団の割合を示してある。図13B：リアルタイムPCR解析を精製したCD8細胞から作製したcDNAで行った。データは、ハウスキーピング・サイクロフィリンA対照遺伝子のものと比較して、候補遺伝子の発現量の比率として報告してある。所与の候補遺伝子について、白黒のヒストグラムは、2つの独立した実験から精製した細胞からのRNA比率を表す。遺伝子名の略語は、以下の通りである：グランザイムB（GmB）、Fasリガンド（FasL）、C-Cケモカイン受容体5（CCR5）、リポポリサッカライドで誘導される腫瘍壊死因子活性化因子（LITAF）、セリンプロテアーゼ阻害剤2A（Spi2A）、C-Cケモカインリガンド9（CCL9）、プレセリニン2（PS2）、腫瘍組織適合性複合体IAα b（MHCII）。対のヒストグラムを接続するブラケットは、CD8集団間の遺伝子発現の統計学的有意差を示す（***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05）。 図14A〜14Bは、骨髄キメラのSpi2A発現の調製を示す。CD8欠損C57BL/6マウスを、組換えMIGR1を導入した骨-髄前駆体によって再構成した（GFP、Spi2A、またはSpi2A-Aマウス）。導入した白血球を高レベルで有するキメラ（40%＞末梢血リンパ球GFP+）には、LCMVを感染させた。図14A：LCMVによるGFP-マウスの感染後8dのGFP+ CD8+脾細胞のFACSでの精製。図14B：FACS精製したCD8細胞からのSpi2A mRNAの相対的レベル。バーは、複数の個々のマウス由来のSpi2A mRNAの平均レベルを示す。センスSpi2A mRNAの相対的レベルを決定するためにリアルタイムPCRを使用した。Spi2AおよびSpi2A-AマウスからのCD8細胞のSpi2A mRNAの平均レベルは、GFPマウスからのCD8細胞と比較して、それぞれ有意に高く、および低かった。 骨髄キメラにおける抗LCMV CD8細胞伸縮の動態を示す。野生型C57BL/6骨髄には、対照GFPレトロウイルスを導入し、致死的に照射を受けた（1200rads）C57BL/6 CD8欠損マウス（1.5-2.0×106細胞／マウス）に養子性に導入した。8または16週後に、PBL中のCD8細胞の割合を測定することによって、再構成レベルを決定した。8週後に、キメラは年齢がマッチした野生型の対照C57BL/6マウスのレベルの約50%まで再構成され、16週後に、キメラは完全に再構成された（対照レベルの100%）。キメラ（8週または16週）および対照野生型C57BL/6マウスには、LCMVアームストロングを感染させて（2×105pfu／マウス）、抗LCMV CD8細胞のレベルをH-2Db-四量体カクテルによるPBL染色および次いでFACSで決定した。野生型C57BL/6マウスの抗LCMV CD8細胞伸縮の動態は、他で観察されたものと同じであった（Murali-Krishna et al., 1998； Murali-Krishna et al., 1999）。すなわち、8日後に約18%のLCMV特異的なCD8細胞のピークレベル、30日頃にまで持続する収縮期、および約2%のLCMV特異的なCD8細胞の残りのレベル（これは、約11%のピークレベルであった）が観察された。完全に再構成された16週の骨髄キメラは、野生型C57BL/6マウスの抗LCMV CD8細胞増殖と同じ動態を示した。部分的に再構成された8週の骨髄キメラは、遅延性での（14日）抗LCMV CD8細胞増殖の動態に変化を示したが、より高いピークレベルおよび収縮期の延長を示した。2%のLCMV特異的なCD8細胞の残りのレベルは、約4%のピークレベルであった。重要なことに、所与の感染で解析された全ての8週のキメラ（GFP、Spi2A、Spi2A-A）は、同時に同数の骨髄前駆体から生じ、CD8細胞の再構成の程度にマッチしており、従って、抗LCMV CD8細胞増殖と同様の動態を示す。8週のキメラでは、より短期間でより多くの実験を実施できたので、16週ではなく8週のキメラを感染のために選択した。 図16A〜16Dは、Spi2Aが、LCMVへの感染後に、抗原特異性のCD8細胞のレベルを決定することを示す。骨髄キメラ（GFP、Spi2A、またはSpi2A-A）をLCMVに感染させて、ウイルス特異的なCD8細胞のレベルを、末梢血リンパ球を四量体および抗CD8α mAbsで染色、次いでFACSによって決定した。図16A：GFP陽性細胞（レトロウイルスを導入した）は、FACSによって検出し、GFP陽性集団の抗LCMV CD8（四量体+ CD8+）細胞の割合をそれぞれの時点で5-6匹のマウスからの平均±SEMによって決定した。図16B：残りの抗LCMV CD8細胞のレベルは、図16Aから14日後に、最大レベルの98日後のレベルの割合として決定した。残りの抗LCMV CD8細胞のレベルは、GFP対照と比較して有意にSpi2Aにおいて高く、Spi2A-Aマウスにおいて低かった。これらのデータの全ては、2つの独立した実験のうちの1つを表す。図16C：Aパートに記載した実験からのPBLのGFP陽性集団内の総CD8+の四量体+ CD8+の割合。図16D：図16Aに記載されている実験からのGFP陰性（レトロウイルスを導入してない）集団の抗LCMV CD8細胞の割合。 Spi2Aが、LCMV特異的なCD8細胞のレベルに影響を及ぼすことを示す。骨髄キメラ（GFP、Spi2A、またはSpi2A-A）をLCMVに感染させて、PBLを四量体および抗CD8α mAbsで染色し、ついでFACSすることによってウイルス特異的なCD8細胞のレベルを決定した。GFP陽性細胞（レトロウイルスを導入した）は、FACSによって検出し、GFP陽性集団の抗LCMV CD8（四量体+ CD8+）細胞の割合をそれぞれの時点で5〜6匹のマウスからの平均±SEMによって決定した。14日のピーク反応時およびその後に、GFP対照と比較して、Spi2A-Aマウスにおいて抗LCMV CD8細胞のレベルの減少が観察された。しかし、Spi2Aマウスは、収縮および記憶期の間、高いレベルの抗LCMV CD8細胞を示した。 Spi2Aが、抗LCMV CD8細胞の収縮期に影響を及ぼすことを示す。感染の56日後に抗LCMV CD8細胞が存在するレベルを14日の最大レベルの割合として表して、残りのレベルを決定した（図17からのデータ）。GFP対照と比較して、Spi2Aマウスにおいて有意に高いレベルの残りが観察され（p<0.001）、Spi2A-Aマウスにおいて有意に低いレベルが観察された（p<0.01）。これらの知見は、図16Dのものと同じであるが、別の独立した実験とは同じでない。 LCMVへの感染後のCD8細胞の記憶および復活のレベルに対するSpi2Aの効果を示す。骨髄キメラ（GFP、Spi2A、およびSpi2A-Aマウス）をLCMVに感染させ、生体外でのIFN-γ産生アッセイ法を行い、LCMV（記憶）による初感染の101d後に記憶CD8細胞を検出した。もう一つの実験において、LCMVによる初感染の60d後に、マウスを再感染させて、5d後に二次エフェクターのレベルを決定した（復活）。GFP陽性（+）および陰性（-）集団におけるIFN-γ+ CD8+細胞の割合を示してある。IFN-γ+ CD8+細胞は、非感染性のC57BL/6マウスからの脾細胞では検出することができない。 図20A〜20Fは、Spi2Aが、抗LCMV記憶および復活のエフェクターCD8細胞のレベルを決定することを示す。骨髄キメラ（GFP、Spi2AおよびSpi2A-Aマウス）を図19にて説明したように、LCMVに感染させた。図20A：IFN-γ+ CD8+免疫記憶細胞（バー）の平均割合は、GFP対照マウス（n=6）よりもSpi2Aマウス（n=6）において有意に高く、Spi2A-Aマウス（n=5）において有意に低かった。図20B：パートAに記載されている実験からのGFP陽性の脾細胞内のCD8+細胞のIFN-γ+ CD8+の割合。図20C：図20AからのGFP陰性の脾細胞のIFN-γ+ CD8+ 免疫記憶細胞の割合は、3つのキメラ群で有意差を示さなかった。図20D：IFN-γ+ CD8+復活エフェクター細胞の平均割合は、GFP対照マウスにおいて（n=4）よりもSpi2Aマウス（n=4）において有意に高く、Spi2A-Aマウス（n=4）において有意に低かった。これらのデータは、2つの独立した実験のうちの1つを表す。図20E：図20Cに記載されている実験からのGFP陽性の脾細胞内のCD8+細胞のIFN-γ+ CD8+の割合。図20F：図20DからのGFP陰性の脾細胞のIFN-γ+ CD8+の復活細胞の割合は、3つのキメラ群で有意差を示さない。

Claims (204)

  1. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物と細胞を接触させる段階を含む、細胞の細胞死を調整するための方法。
  2. 細胞が、Spi2Aポリペプチドと接触する、請求項1記載の方法。
  3. 細胞が、Spi2Aポリペプチド同等物と接触する、請求項1記載の方法。
  4. Spi2Aポリペプチド同等物が、セルピンB1、セルピンB2、セルピンB3、セルピンB4、セルピンB6、セルピンB8、またはセルピンB9由来のポリペプチドである、請求項3記載の方法。
  5. Spi2Aポリペプチド同等物が、セルピンB9由来のポリペプチドである、請求項4記載の方法。
  6. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4〜8の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項1記載の方法。
  7. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4〜7の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項6記載の方法。
  8. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4〜6の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項7記載の方法。
  9. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの6つの連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項8記載の方法。
  10. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの5つの連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項8記載の方法。
  11. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4つの連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項8記載の方法。
  12. アポトーシスを調整する方法としてさらに定義される、請求項1記載の方法。
  13. 細胞がTリンパ球である、請求項1記載の方法。
  14. リンパ球の記憶Tリンパ球への分化を容易にするための方法としてさらに定義される、請求項12記載の方法。
  15. 標的細胞に対する被検体の免疫応答の発生を促進する方法としてさらに定義される、請求項14記載の方法。
  16. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物がワクチンに含まれる、請求項1記載の方法。
  17. 標的細胞が、腫瘍細胞または病原体に感染した細胞である、請求項15記載の方法。
  18. 腫瘍細胞が、乳癌、肺癌、卵嚢癌、脳癌、肝癌、子宮頚癌、大腸癌、腎癌、皮膚癌、頭部および頚部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、リンパ性の癌、胃癌、膵癌、精巣癌、リンパ腫、または白血病に由来する細胞である、請求項17記載の方法。
  19. 病原体がウイルスである、請求項17記載の方法。
  20. ウイルスが、HIV、HSV、またはADVである、請求項19記載の方法。
  21. アポトーシスが、細胞において増大したリソソームの透過性に起因するアポトーシスである、請求項12記載の方法。
  22. 増大したリソソームの透過性により、細胞内に少なくとも1つのリソソームプロテアーゼの放出が生じる、請求項21記載の方法。
  23. リソソームプロテアーゼが、システインプロテアーゼである、請求項22記載の方法。
  24. システインプロテアーゼが、カテプシンB、カテプシンH、カテプシンL、カテプシンS、カテプシンC、カテプシンK、カテプシンO、カテプシンF、カテプシンV、カテプシンX、またはカテプシンWである、請求項23記載の方法。
  25. 自己貪食細胞死を調整する方法としてさらに定義される、請求項1記載の方法。
  26. TNF-α媒介細胞死を調整する方法としてさらに定義される、請求項1記載の方法。
  27. 細胞内での活性酸素種に起因する細胞死を調整する方法としてさらに定義される、請求項1記載の方法。
  28. 壊死に起因する細胞死を調整する方法としてさらに定義される、請求項1記載の方法。
  29. 細胞が、被検体内にある、請求項1記載の方法。
  30. 被検体が、ヒトである、請求項29記載の方法。
  31. ヒトが、感染症患者である、請求項30記載の方法。
  32. 感染症が、グラム陰性菌、グラム陽性菌、または真菌による感染症である、請求項31記載の方法。
  33. 感染症が、生物兵器による感染症である、請求項31記載の方法。
  34. 生物兵器による感染症が、炭疽菌またはペスト菌である、請求項33記載の方法。
  35. ヒトが敗血症性ショック患者である、請求項30記載の方法。
  36. ヒトが肝不全患者である、請求項30記載の方法。
  37. 肝不全が劇症の肝不全である、請求項36記載の方法。
  38. 劇症の肝不全が、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルス、抗結核薬、抗うつ薬、化成物、またはアルコールによって引き起こされる、請求項37記載の方法。
  39. ヒトが、炎症性疾患患者である、請求項30記載の方法。
  40. 炎症性疾患が、肝疾患である、請求項39記載の方法。
  41. 肝疾患が、肝炎または肝硬変である、請求項40記載の方法。
  42. 肝疾患が、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルス、抗結核薬、抗うつ薬、化成物、またはアルコールによって引き起こされる、請求項40記載の方法。
  43. 抗結核薬が、リファマイシンまたはイソニアジドである、請求項42記載の方法。
  44. 抗うつ薬が、モノアミンオキシダーゼ阻害薬である、請求項42記載の方法。
  45. 化成物が、四塩化炭素である、請求項42記載の方法。
  46. ヒトが血管疾患患者である、請求項30記載の方法。
  47. 血管疾患が、閉塞性血管疾患である、請求項46記載の方法。
  48. 血管疾患が、循環器疾患である、請求項46記載の方法。
  49. 循環器疾患が、心筋梗塞をさらに含む、請求項48記載の方法。
  50. ヒトが、癌患者である、請求項30記載の方法。
  51. ヒトが、骨疾患患者である、請求項30記載の方法。
  52. 骨疾患が、骨粗鬆症である、請求項51記載の方法。
  53. ヒトが、肺気腫患者である、請求項30記載の方法。
  54. ヒトが、神経変性疾患患者である、請求項30記載の方法。
  55. 神経変性疾患が、アルツハイマー病である、請求項54記載の方法。
  56. ヒトがウイルス感染患者である、請求項30記載の方法。
  57. ウイルス感染が、AIDSである、請求項56記載の方法。
  58. ヒトが、免疫不全患者である、請求項30記載の方法。
  59. 免疫不全が、自己免疫不全である、請求項58記載の方法。
  60. 免疫不全が、異常な抗原提示と関係する不全である、請求項58記載の方法。
  61. ヒトが、多発性硬化症患者である、請求項30記載の方法。
  62. ヒトが、筋ジストロフィー患者である、請求項30記載の方法。
  63. ヒトが、関節炎患者である、請求項30記載の方法。
  64. 関節炎患者が、慢性関節リウマチ患者である、請求項63記載の方法。
  65. 関節炎患者が、骨関節炎患者である、請求項63記載の方法。
  66. ヒトが、二次的抗過形成療法を受けている患者である、請求項30記載の方法。
  67. 二次的抗過形成療法が、化学療法、放射線療法、免疫療法、光線療法、寒冷療法、毒素療法、ホルモン療法、または手術を含む、請求項66記載の方法。
  68. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、HIV由来のアミノ酸TAT配列をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項1記載の方法。
  69. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、Antpアミノ酸配列をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項1記載の方法。
  70. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、HSV由来のVP22アミノ酸配列をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項1記載の方法。
  71. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、細胞において活性な、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された、プロモーターを含む発現カセットをさらに含む、請求項1記載の方法。
  72. 発現カセットが、細胞において活性な、Spi2Aポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む、請求項71記載の方法。
  73. 発現カセットは、細胞において活性な、Spi2Aポリペプチド同等物をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む、請求項71記載の方法。
  74. Spi2Aポリペプチド同等物が、セルピンB1、セルピンB2、セルピンB3、セルピンB4、セルピンB6、セルピンB8、またはセルピンB9由来のポリペプチドである、請求項73記載の方法。
  75. Spi2Aポリペプチド同等物が、セルピンB9由来のポリペプチドである、請求項74記載の方法。
  76. 発現カセットが、ウイルスベクター内に保有される、請求項71記載の方法。
  77. ウイルスベクターが、アデノウイルス・ベクター、レトロウイルス・ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項76記載の方法。
  78. 発現カセットが、非ウイルスベクターに保有される、請求項71記載の方法。
  79. 非ウイルスベクターが、リポソームである、請求項78記載の方法。
  80. プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターである、請求項71記載の方法。
  81. 発現カセットが、複製開始点をさらに含む、請求項71記載の方法。
  82. 発現カセットが、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項71記載の方法。
  83. 発現カセットが、選択可能なマーカー遺伝子をさらに含む、請求項71記載の方法。
  84. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、培養細胞の培地から得られ、細胞の表面に適用される、請求項1記載の方法。
  85. 培養細胞が、細胞において活性な、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物をコードするポリヌクレオチドに連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、請求項84記載の方法。
  86. 発現カセットが、ウイルスベクター内に保有される、請求項85記載の方法。
  87. ウイルスベクターが、アデノウイルス・ベクター、レトロウイルス・ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項86記載の方法。
  88. 発現カセットが、非ウイルスベクターに保有される、請求項85記載の方法。
  89. 非ウイルスベクターが、リポソームである、請求項88記載の方法。
  90. プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターである、請求項85記載の方法。
  91. 以下を含む、被検体を治療する方法：
    （a）以下を含む組成物を提供する段階：
    （1）Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物；および、
    （2）該被検体に対する送達のために適した製剤；並びに、
    （b）該被検体に該組成物を投与する段階。
  92. 組成物が、Spi2Aポリペプチドを含む、請求項91記載の方法。
  93. 組成物が、Spi2Aポリペプチド同等物を含む、請求項91記載の方法。
  94. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4〜8の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項91記載の方法。
  95. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4〜7の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項94記載の方法。
  96. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4〜6の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項95記載の方法。
  97. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの6つの連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項95記載の方法。
  98. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの5つの連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項95記載の方法。
  99. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4つの連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項95記載の方法。
  100. Spi2Aポリペプチド同等物が、セルピンB1、セルピンB2、セルピンB3、セルピンB4、セルピンB6、セルピンB8、またはセルピンB9由来のポリペプチドである、請求項93記載の方法。
  101. Spi2Aポリペプチド同等物が、セルピンB9由来のポリペプチドである、請求項100記載の方法。
  102. 被検体において細胞死を調整する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  103. 被検体においてアポトーシス細胞死を調整する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  104. 記憶Tリンパ球の分化を容易にする方法としてさらに定義される方法であって、記憶Tリンパ球が被検体において疾患細胞に向けられる、請求項103記載の方法。
  105. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、ワクチンに含まれる、請求項91記載の方法。
  106. 疾患細胞が、腫瘍細胞または病原体に感染した細胞である、請求項104記載の方法。
  107. 腫瘍細胞が、乳癌、肺癌、卵嚢癌、脳癌、肝癌、子宮頚癌、大腸癌、腎癌、皮膚癌、頭部および頚部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、リンパ性の癌、胃癌、膵癌、精巣癌、リンパ腫、または白血病に由来する細胞である、請求項106記載の方法。
  108. 病原体が、ウイルスである、請求項106記載の方法。
  109. ウイルスが、HIV、HSV、またはADVである、請求項108記載の方法。
  110. 被検体の壊死に起因する細胞死を調整する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  111. 敗血症性ショックを治療する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  112. 肝不全を治療する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  113. 肝不全が劇症の肝不全である、請求項112記載の方法。
  114. 劇症の肝不全がA型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルス、抗結核薬、抗うつ薬、化成物、またはアルコールによって引き起こされる、請求項113記載の方法。
  115. 炎症性疾患を治療する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  116. 炎症性疾患が肝疾患である、請求項115記載の方法。
  117. 肝疾患が、肝炎または肝硬変である、請求項116記載の方法。
  118. 肝疾患が、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルス、抗結核薬、抗うつ薬、化成物、またはアルコールによって引き起こされる、請求項116記載の方法。
  119. 抗結核薬が、リファマイシンまたはイソニアジドである、請求項118記載の方法。
  120. 抗うつ薬が、モノアミンオキシダーゼ阻害薬である、請求項118記載の方法。
  121. 化成物が、四塩化炭素である、請求項118記載の方法。
  122. 循環器疾患を治療する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  123. 循環器疾患が、心筋梗塞である、請求項122記載の方法。
  124. 心筋梗塞が急性心筋梗塞である、請求項123記載の方法。
  125. 肺気腫を治療する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  126. 神経変性疾患を治療する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  127. 神経変性疾患が、アルツハイマー病である、請求項126記載の方法。
  128. 神経変性疾患が、多発性硬化症である、請求項126記載の方法。
  129. 被検体において感染を治療する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  130. 感染がウイルス感染である、請求項129記載の方法。
  131. ウイルス感染がHIV関連疾患である、請求項130記載の方法。
  132. 被検体において免疫不全を治療する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  133. 免疫不全が、自己免疫不全である、請求項132記載の方法。
  134. 免疫不全が、異常な抗原提示と関係する疾患である、請求項132記載の方法。
  135. 骨粗鬆症を治療する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  136. 被検体において、関節炎を治療する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  137. 関節炎が慢性関節リウマチである、請求項136記載の方法。
  138. 慢性関節リウマチが、骨関節炎である、請求項136記載の方法。
  139. 被検体における過剰なシステインプロテアーゼ活性に関連した疾患を治療する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  140. 被検体において骨疾患を治療する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  141. 被検体において癌を治療する方法としてさらに定義される、請求項91記載の方法。
  142. 癌が、乳癌、肺癌、前立腺癌、卵嚢癌、脳癌、肝癌、前立腺癌、子宮頚癌、大腸癌、腎癌、皮膚癌、頭部および頚部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、リンパ性の癌、胃癌、膵癌、精巣癌、リンパ腫、または白血病に由来する細胞である、請求項141記載の方法。
  143. 被検体がヒトである、請求項91記載の方法。
  144. 組成物が、全身に送達される、請求項91記載の方法。
  145. 組成物が、血管内に送達される、請求項91記載の方法。
  146. 組成物が、腫瘍塊に局部的に送達される、請求項91記載の方法。
  147. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、HIV由来のアミノ酸TAT配列をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項91記載の方法。
  148. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、Antpアミノ酸配列をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項91記載の方法。
  149. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、HSV由来のVP22アミノ酸配列をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項91記載の方法。
  150. 組成物が、被検体の細胞において活性な、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットさらにを含む、請求項91記載の方法。
  151. 発現カセットが、ウイルスベクター内に保有される、請求項150記載の方法。
  152. ウイルスベクターが、アデノウイルス・ベクター、レトロウイルス・ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項151記載の方法。
  153. 発現カセットが、非ウイルスベクターに保有される、請求項150記載の方法。
  154. 非ウイルスベクターが、リポソームである、請求項153記載の方法。
  155. プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターである、請求項150記載の方法。
  156. 発現カセットが、複製開始点をさらに含む、請求項150記載の方法。
  157. 発現カセットが、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項150記載の方法。
  158. 発現カセットが、選択可能なマーカー遺伝子をさらに含む、請求項150記載の方法。
  159. 被検体が、二次的抗過形成療法を受けている被検体である、請求項141記載の方法。
  160. 二次的抗過形成療法が、化学療法、放射線療法、免疫療法、光線療法、寒冷療法、毒素療法、ホルモン療法、または手術を含む、請求項159記載の方法。
  161. 以下を含む、顆粒球の供与を必要とする被検体に対して送達するためのドナー顆粒球を調製する方法：
    （a）適切なドナーからドナー顆粒球を得る段階；
    （b）該ドナー顆粒球を単離する段階；
    （c）Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物および該ドナー顆粒球送達のために適した製剤を含む組成物と該ドナー顆粒球を接触させる段階；並びに、
    （d）該ドナー顆粒球を顆粒球の供与を必要とする被検体に投与する段階。
  162. ドナーから顆粒球を得る前に、C-GSFでドナーを治療する段階をさらに含む、請求項161記載の方法。
  163. 顆粒球の単離に続いて白血球搬出法によって顆粒球を精製する段階をさらに含む、請求項161記載の方法。
  164. 組成物が、Spi2Aポリペプチドを含む、請求項161記載の方法。
  165. 組成物が、Spi2Aポリペプチド同等物を含む、請求項161記載の方法。
  166. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4〜8の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項161記載の方法。
  167. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4〜7の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項166記載の方法。
  168. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4〜6の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項167記載の方法。
  169. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの6つの連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項168記載の方法。
  170. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの5つの連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項168記載の方法。
  171. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4つの連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項168記載の方法。
  172. Spi2Aポリペプチド同等物が、セルピンB1、セルピンB2、セルピンB3、セルピンB4、セルピンB6、セルピンB8、またはセルピンB9由来のポリペプチドである、請求項165記載の方法。
  173. Spi2Aポリペプチド同等物が、セルピンB9由来のポリペプチドである、請求項172記載の方法。
  174. ドナー顆粒球を調製する方法により、該ドナー顆粒球のアポトーシスの減少が生じる、請求項161記載の方法。
  175. 被検体が、好中球減少を有する被検体である、請求項161記載の方法。
  176. 好中球減少が、化学療法、放射線療法、骨髄抑制性薬物、白血病、再生不良性貧血、または特発性の好中球減少に起因する好中球減少である、請求項175記載の方法。
  177. 好中球減少を有する被検体が、敗血症を有する被検体である、請求項175記載の方法。
  178. 被検体が、好中球の質的な異常を有する被検体である、請求項161記載の方法。
  179. 好中球の質的な異常が、慢性肉芽腫症である、請求項178記載の方法。
  180. 組成物が、被検体の細胞において活性な、Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットさらにを含む、請求項161記載の方法。
  181. 組成物が、被検体の細胞において活性な、Spi2Aポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、請求項180記載の方法。
  182. 組成物が、被検体の細胞において活性な、Spi2Aポリペプチド同等物をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、請求項180記載の方法。
  183. Spi2Aポリペプチド同等物が、セルピンB1、セルピンB2、セルピンB3、セルピンB4、セルピンB6、セルピンB8、またはセルピンB9由来のポリペプチドである、請求項182記載の方法。
  184. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物をコードするポリヌクレオチドが、ワクチンに含まれている、請求項180記載の方法。
  185. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、HIV由来のアミノ酸TAT配列をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項161記載の方法。
  186. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、Antpアミノ酸配列をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項161記載の方法。
  187. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、HSV由来のVP22アミノ酸配列をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項161記載の方法。
  188. 以下を含む、貯蔵のためのドナー顆粒球を調製する方法：
    （a）適切なドナーからドナー顆粒球を得る段階；
    （b）該ドナー顆粒球を単離する段階；
    （c）Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物および該ドナー顆粒球送達のために適した製剤を含む組成物と該ドナー顆粒球を接触させる段階；並びに、
    （d）該ドナー顆粒球を貯蔵する段階。
  189. ドナーから顆粒球を得る前に、C-GSFでドナーを治療する段階をさらに含む、請求項188記載の方法。
  190. 顆粒球の単離に続いて白血球搬出法によって顆粒球を精製する段階をさらに含む、請求項189記載の方法。
  191. 組成物が、Spi2Aポリペプチドを含む、請求項188記載の方法。
  192. 組成物が、Spi2Aポリペプチド同等物を含む、請求項188記載の方法。
  193. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4〜8の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項188記載の方法。
  194. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4〜7の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項193記載の方法。
  195. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4〜6の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項194記載の方法。
  196. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの6つの連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項195記載の方法。
  197. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの5つの連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項195記載の方法。
  198. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、アミノ酸配列MAGVGCCAまたはFVVAECCMの4つの連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項195記載の方法。
  199. Spi2Aポリペプチド同等物が、セルピンB1、セルピンB2、セルピンB3、セルピンB4、セルピンB6、セルピンB8、またはセルピンB9由来のポリペプチドである、請求項192記載の方法。
  200. Spi2Aポリペプチド同等物が、セルピンB9由来のポリペプチドである、請求項199記載の方法。
  201. ドナー顆粒球を貯蔵する方法により、該ドナー顆粒球のアポトーシスの減少が引き起こされる、請求項188記載の方法。
  202. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、HIV由来のアミノ酸TAT配列をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項188記載の方法。
  203. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、Antpアミノ酸配列をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項188記載の方法。
  204. Spi2AポリペプチドまたはSpi2Aポリペプチド同等物が、HSV由来のVP22アミノ酸配列をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項188記載の方法。
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