ES2208942T3 - Proteinas e4 de adenovirus para inducir la muerte celular. - Google Patents

Abstract

AGENTE FARMACEUTICO DESTINADO A INDUCIR LA APOPTOSIS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES HUMANAS QUE DAN LUGAR A LA SUPERVIVENCIA DE CELULAS INADECUADAS. DICHO AGENTE CONTIENE E4ORF4 DE ADENOVIRUS, O UN ANALOGO O FRAGMENTO BIOLOGICAMENTE ACTIVO Y/O E4ORF6 DE ADENOVIRUS O UN ANALOGO O UN FRAGMENTO BIOLOGICAMENTE ACTIVO DE E4ORF6. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNA COMPOSICION FARMACEUTICA PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES HUMANAS QUE DAN LUGAR A LA SUPERVIVENCIA DE CELULAS INADECUADAS, QUE COMPRENDE UNA CANTIDAD TERAPEUTICA DE E4ORF4 DE ADENOVIRUS, UN ANALOGO O UN FRAGMENTO BIOLOGICAMENTE ACTIVO Y/O E4ORF6 DE ADENOVIRUS, UN ANALOGO O UN FRAGMENTO BIOLOGICAMENTE ACTIVO DE E4ORF6, EN ASOCIACION CON UN EXCIPIENTE FARMACEUTICO. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNOS PROCEDIMIENTOS QUE PERMITEN LA IDENTIFICACION DE COMPUESTOS COMO ANALOGOS DE LAS PROTEINAS E4 DE ADENOVIRUS QUE LLEVAN A LA MUERTE CELULAR.

Description

Proteínas E4 de adenovirus para inducir la muerte celular.

Antecedentes de la invención (a) Campo de la invención

La invención se refiere a un agente o agentes farmacéuticos para inducir la muerte celular para uso en el tratamiento de dolencias que implican una supervivencia celular inapropiada.

(b) Descripción de la técnica anterior

La replicación de adenovirus humanos en células epiteliales diferenciadas terminalmente requiere un mecanismo eficaz para inducir la síntesis del ADN celular. Esta inducción permite la replicación del ADN viral y la producción de la progenie del virus. Los adenovirus humanos infectan y matan muy eficazmente células epiteliales. La muerte celular se produce por apoptosis y la diseminación viral tiene lugar a través de la endocitosis por las células circundantes.

Los productos de la región temprana 1A (E1A) del genoma adenoviral induce la síntesis del ADN de la célula y son en gran medida responsables de la transformación celular por los adenovirus. E1A produce dos ARNm principales de 13S y 12S que codifican proteínas de 289 y 243 restos (289R y 243R, respectivamente) que son idénticas, excepto por la falta en 243R de una secuencia central de 46 aminoácidos, denominada región conservada 3 o CR3, como se representa esquemáticamente en la figura 1A. Dos regiones adicionales presentes en la secuencia común codificada por el exón 1 de ambos ARNm de E1A están también conservadas en todos los serotipos de adenovirus humanos y se han denominado CR1 y CR2. Los productos de E1A inducen la síntesis del ADN a través de la formación de un complejo entre CR2 y CR1 y las proteínas supresoras de tumor de retinoblastoma pRB y las proteínas p107 y p130 relacionadas, o entre el extremo amino terminal y CR1 y el modulador transcripcional p300 y posiblemente proteínas relacionadas (Corbeil, H.B. et al., 1994, J. Virol. 68: 6697-6709). E1A-289R también activa la expresión de las unidades de transcripción viral tempranas E2, E3 y E4, y ciertos genes celulares, al menos en parte a través de interacciones con factores de transcripción y maquinaria de transcripción basal que requiere CR3 (Teodoro, J.G. et al., 1995, Oncogene 11: 467-474). También se ha demostrado que, además de CR3, la transactivación del promotor de E4 depende en cierto grado de dos regiones codificadas por el segundo exón del ARNm 13S, denominadas regiones auxiliares 1 y 2, o AR1 y AR2. La producción de células transformadas estables necesita la región temprana 1B (E1B) que codifica los polipéptidos de 19 y 55 kDa que son capaces, de forma individual, de cooperar con E1A a través de rutas separadas, pero aditivas (McLoire, W., et al., 1991, J. Gen. Virol. 72: 1467-1471).

Una evidencia considerable indica que la función principal de las proteínas de E1B en la infección lítica y en la transformación celular es suprimir los efectos citotóxicos y la apoptosis inducida por la expresión de E1A. Sin E1B, la toxicidad de los productos de E1A tiene como resultado la muerte de las células transformadas con E1A y una reducción en el rendimiento de la progenie debido a la muerte temprana de las células infectadas productivamente. Las proteínas de E1A pueden causar apoptosis por un proceso mediado por el supresor tumoral p53, que controla la detención del crecimiento y las rutas de muerte celular programada (Teodoro, J.G. et al., 1995, Oncogene 11: 467-474). La expresión de los productos de E1A tiene como resultado la elevación de los niveles de p53. La proteína de E1B de 55 kDa se une a p53 y bloquea la activación de la expresión génica y la apoptosis mediadas por p53 (Teodoro, J.G. et al., 1994, J. Virol. 68: 776-7869). La proteína de E1B de 19 kDa parece suprimir la apoptosis por un mecanismo que es funcionalmente análogo al del producto del protooncogen celular Bcl-2 (Nguyen, M. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 16521-16524). Las células infectadas con adenovirus mutantes que tienen un fallo en la expresión de la proteína de 19 kDa muestran un aumento de la citotoxicidad y una amplia degradación del ADN viral y celular en fragmentos del tamaño de nucleosomas (McLoire, W. et al., supra; Teodoro, J.G. et al., 1995, Oncogene 11: 467- 474). A tiempos posteriores, incluso en presencia de las proteínas de E1B, las células infectadas sufren la muerte celular por apoptosis y la progenie viral se disemina a las células vecinas a través de la endocitosis de fragmentos celulares. Además de la inducción de la síntesis de ADN y la transformación celular, la proteína grande de E1A de 289 restos (289R) también transactiva la expresión de todos los genes virales tempranos, incluyendo las regiones tempranas 1A, 1B, 2, 3 y 4 (revisado en Teodoro, J.G. et al., 1995, Oncogene 11: 467-474).

Sería muy deseable disponer de un agente farmacéutico para la inducción de apoptosis cuando tal inducción es útil en el tratamiento de enfermedades humanas que implican una supervivencia celular inapropiada.

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención, hemos utilizado una estrategia genética para identificar la función de las proteínas E4 individuales en la inducción de apoptosis independiente de p53. Nuestros resultados indican que la proteína de muerte E4, E4orf4, es responsable de la inducción de apoptosis por p53 en células transformadas, pero no en células no transformadas. De esta manera, E4orf4 es un poderoso inductor de la muerte celular independiente de p53. Este descubrimiento tiene derivaciones significativas para agentes terapéuticos inductores de apoptosis y selección de fármacos.

En un primer aspecto, la invención proporciona un método de incremento de la apoptosis en una célula in vitro mediante la administración a la célula de una cantidad inductora de apoptosis de un polipéptido de E4orf4 o un fragmento apoptótico de éste. En particular, la invención proporciona un método de incremento de la apoptosis en una célula in vitro, comprendiendo dicho método la administración a dicha célula de un péptido substancialmente purificado codificado por ADN capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 y que tiene la actividad biológica de E4orf4, donde dicho ADN esta ligado operativamente a una secuencia reguladora heteróloga para la expresión de dicho polipéptido. En una realización preferida de este aspecto, la apoptosis es independiente de p53 y dicha célula es una célula cancerosa.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un método de incremento de apoptosis en una célula in vitro, comprendiendo dicho método la expresión en dicha célula de un ADN capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 3 y teniendo la actividad biológica de E4orf4, donde dicho ADN esta ligado operativamente a una secuencia reguladora heteróloga para la expresión de dicho polipéptido. Preferiblemente, dicha secuencia reguladora es capaz de expresar dicho ADN de forma constitutiva, inducible o específica del tipo celular, y dicho ADN está en un vector adenoviral. En una realización más preferida, dicha célula es una célula cancerosa.

En un tercer aspecto, la invención proporciona el uso de un vector de expresión para la preparación de una composición farmacéutica para inducir apoptosis independiente de p53, donde el vector comprende ADN capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 3, que codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de E4orf4, y que está ligado operativamente a una secuencia reguladora heteróloga para la expresión de dicho polipéptido. En este uso, se administra a la célula una cantidad inductora de apoptosis de una composición que incluye un polipéptido de E4orf4 o un fragmento apoptótico de éste. En una realización preferida, dicha secuencia reguladora es capaz de expresar dicho ácido nucleico en una forma constitutiva, inducible o específica del tipo de célula y dicho vector de expresión es un vector adenoviral o un vector retroviral.

Preferiblemente, se puede incrementar la apoptosis en un mamífero proporcionando un primer transgen que codifica un polipéptido de E4orf4 o un fragmento de éste y un segundo transgen que codifica un polipéptido de E4orf6 o un fragmento de éste a una célula del mamífero. El primer y segundo transgenes están colocados para la expresión en una célula y, preferiblemente, codifican E4orf4 y E4orf6, respectivamente.

Además, se puede incrementar la apoptosis en una célula administrando a la célula una composición que incluye un primer compuesto que incrementa la actividad biológica de E4orf4 y un segundo compuesto que incrementa la actividad biológica de E4orf6. En diversas realizaciones preferidas, el primer compuesto es ARNm de E4orf4, o aumenta la estabilidad de E4orf4, y el segundo compuesto es ARNm de E4orf6, o incrementa la estabilidad de E4orf6.

Además, la invención presenta una composición para uso farmacéutico que comprende (i) un ácido nucleico substancialmente purificado capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 y que codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de E4orf4 y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización de este aspecto, el ácido nucleico codifica E4orf4 que tiene una substitución conservativa de aminoácidos en relación con la secuencia de E4orf4 de la fig. 16 (SEC ID Nº: 4).

Además, la invención presenta una composición farmacéutica que incluye un ácido nucleico que codifica un fragmento apoptótico de E4orf4.

Preferiblemente, el ácido nucleico está en un vector viral. En otra realización, el ácido nucleico está unido operativamente a una secuencia reguladora heteróloga para la expresión del polipéptido y la secuencia reguladora incluye un promotor. En otra realización, el promotor es un promotor constitutivo, es inducible por uno o más agentes externos o es específico del tipo celular.

En un aspecto más, la invención presenta una composición para uso farmacéutico que comprende (i) un ácido nucleico que comprende la secuencia de la figura 16 (SEC ID Nº: 3) o variantes degeneradas de éste, y que codifica la secuencia de aminoácidos de la fig. 16 (SEC ID Nº: 4), y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable, donde dicho ADN está operativamente ligado a una secuencia reguladora heteróloga para la expresión de dicho polipéptido.

Además, la invención presenta una composición para uso farmacéutico que comprende (i) un ácido nucleico que tiene una identidad de la secuencia nucleotídica con la secuencia de ácido nucleico de la figura 16 (SEC ID Nº: 3) del 50% o superior, donde el ácido nucleico codifica un polipéptido con la actividad biológica apoptótica de E4orf4, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable, donde dicho ADN está operativamente ligado a una secuencia reguladora heteróloga para la expresión de dicho polipéptido. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la identidad de la secuencia nucleotídica con la secuencia de ADN de la fig. 16 (SEC ID Nº: 3) es del 75%, 90% o superior. En las realizaciones preferidas, dicho ácido nucleico de las composiciones para uso farmacéutico es un vector adenoviral y dicha secuencia reguladora es capaz de expresar dicho ácido nucleico de una forma constitutiva, inducible o específica del tipo celular. Más preferiblemente, dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una substitución conservativa de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4.

En un aspecto más, la invención presenta una composición para uso farmacéutico que comprende (i) un polipéptido substancialmente purificado que tiene la actividad biológica de E4orf4 y una identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4 del 20% o superior, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, dicha identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de

\hbox{SEC ID Nº: 4}

es del 50%, 75%, 90% o superior. En otra realización, el polipéptido tiene una substitución conservativa de aminoácidos con respecto a la secuencia de E4orf4 de la fig. 16 (SEC ID Nº: 4).

Además, la invención presenta una composición para uso farmacéutico para la inducción de apoptosis para el tratamiento de enfermedades humanas que implican una supervivencia celular inapropiada, que incluye E4orf4, un análogo o un fragmento biológicamente activo de éste, y una composición para uso farmacéutico para el tratamiento de enfermedades humanas que implican una supervivencia celular inapropiada, que incluye una cantidad terapéutica de E4orf4, un análogo o un fragmento biológicamente activo de éste en asociación con un vehículo farmacéutico.

En particular, la invención proporciona un uso de un polipéptido substancialmente purificado codificado por un ADN capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 y con la actividad biológica de E4orf4 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades humanas que implican una supervivencia celular inapropiada. Preferiblemente, el uso además comprende un segundo polipéptido substancialmente purificado, donde dicho segundo polipéptido tiene la actividad biológica de E4orf6 y una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 1.

Además, la invención proporciona un uso de un ácido nucleico substancialmente purificado capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 3 y que codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de E4orf4 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades humanas que implican una supervivencia celular inapropiada.

En una realización, la invención proporciona un uso de un ácido nucleico capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades humanas que implican un inapropiado crecimiento celular, codificando dicho ácido nucleico un polipéptido que tiene la actividad biológica de E4orf4, y operativamente ligado a una secuencia reguladora heteróloga para la expresión de dicho polipéptido.

En una realización adicional, la invención se refiere al uso de un vector de expresión que comprende un ADN capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 3 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades humanas que implican una supervivencia celular inapropiada, codificando dicho ácido nucleico un polipéptido con la actividad biológica de E4orf4, y ligado operativamente a una secuencia reguladora heteróloga para la expresión de dicho polipéptido. Preferiblemente, dicha secuencia reguladora heteróloga es capaz de expresar dicho ácido nucleico de una manera constitutiva, inducible o específica del tipo celular y dicho vector de expresión es un vector adenoviral o un vector retroviral.

Además, la invención presenta una composición para uso farmacéutico para el tratamiento de enfermedades humanas que implican una supervivencia celular inapropiada, la cual incluye una cantidad terapéutica de un compuesto que induce la proteína fosfatasa 2a, en asociación con un vehículo farmacéutico. En una realización de este aspecto, el compuesto es un agonista de E4orf4. En otra realización, el compuesto mimetiza la actividad de E4orf4.

En un aspecto más, la invención presenta una composición para uso farmacéutico para el tratamiento de enfermedades humanas que implican una supervivencia celular inapropiada, que incluye una cantidad terapéutica de un compuesto que induce apoptosis u otro efecto citotóxico análogo a la actividad biológica de E4orf4 en asociación con un vehículo farmacéutico.

Además, la invención presenta una composición para uso farmacéutico para la inducción de apoptosis para el tratamiento de enfermedades humanas que implican una supervivencia celular inapropiada, que incluye E4orf4, un análogo o un fragmento biológicamente activo de éstos; y E4orf6, un análogo o un fragmento biológicamente activo de éstos.

Además, la invención presenta una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades humanas que implican una supervivencia celular inapropiada, que incluye una cantidad terapéutica de E4orf4, un análogo o un fragmento biológicamente activo de éstos en asociación con un vehículo farmacéutico.

Adicionalmente, la invención presenta una composición para uso farmacéutico para el tratamiento de enfermedades humanas que implican una supervivencia celular inapropiada, que incluye una cantidad terapéutica de un compuesto que induce apoptosis u otros efectos citotóxicos análogos a la actividad biológica de las proteínas de muerte E4 en asociación con un vehículo farmacéutico.

Las composiciones de la invención incluyen, pero no de forma limitante, la proteína E4orf4, la proteína E4orf6, combinaciones de éstas, ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos E4orf4 y E4orf6, análogos, miméticos y cualquier agente terapéutico agonista identificado usando cualquiera de los métodos descritos en la presente invención. Las composiciones pueden administrarse con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en forma de dosificación unitaria. Se puede emplear la práctica farmacéutica convencional para proporcionar formulaciones o composiciones adecuadas para administrar tales composiciones a pacientes.

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De acuerdo con la presente invención, la expresión "enfermedades que implican una supervivencia celular inapropiada" incluye, sin limitación, enfermedades causadas por VIH, infecciones con herpes y/u otros virus, enfermedad de Alzheimer, cáncer, artritis y lupus.

De acuerdo con la presente invención, "proteínas de muerte E4" incluyen productos codificados por ADN capaz de hibridar en condiciones de alta rigurosidad con ácidos nucleicos que codifican E4orf6 (SEC ID Nº: 1) y E4orf4 (SEC ID Nº: 3), proporcionadas en las figs. 15 y 16, respectivamente, y que también tienen la actividad biológica de E4orf6 y/o E4orf4. Los productos están codificados por ADN que tiene una longitud de al menos 500 nucleótidos, preferiblemente menos de 200 nucleótidos de longitud, más preferiblemente, menos de 150 nucleótidos de longitud, y aún más preferible menos de 100 nucleótidos de longitud. Se entenderá que las proteínas E4orf6 y E4orf4 y los ácidos nucleicos de la invención pueden obtenerse a partir de cualquier cepa de adenovirus que tenga las fases de lectura abiertas de E4orf6 o E4orf4, definidas como una fase de lectura abierta con una identidad de al menos un 20%, preferiblemente un 50%, más preferiblemente un 75%, y aún más preferiblemente de un 90% con las fases de lectura abiertas de E4orf6 (SEC ID Nº: 2) y E4orf4 (SEC ID Nº: 4), respectivamente, proporcionadas en la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, las "proteínas E4orf6" y los "polipéptidos E4orf6" incluyen productos codificados por ADN capaz de hibridar en condiciones de alta rigurosidad con ácidos nucleicos que codifican E4orf6 (SEC ID Nº:1) proporcionada en la figura 15, y que también tienen la actividad biológica de E4orf6. Los productos están codificados por ADN que tiene una longitud de al menos 500 nucleótidos, preferiblemente menos de 200 nucleótidos de longitud, más preferiblemente menos de 150 nucleótidos de longitud, y aún más preferiblemente menos de 100 nucleótidos de longitud. Se entenderá que las proteínas E4orf6 y ácidos nucleicos de la invención pueden obtenerse a partir de cualquier cepa de adenovirus que tenga la fase de lectura abierta de E4orf6, definida como una fase de lectura abierta con una identidad de al menos un 20%, preferiblemente un 50%, más preferiblemente un 75%, y aún más preferiblemente un 90% con la fase de lectura abierta de E4orf6 (SEC ID Nº: 2) proporcionada en la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, las "proteínas E4orf4" y los "polipéptidos E4orf4" incluyen productos codificados por ADN capaz de hibridar en condiciones de alta rigurosidad con ácidos nucleicos que codifican E4orf4 (SEC ID Nº: 3) proporcionada en la fig. 16, y que también tienen la actividad biológica de E4orf4. Los productos están codificados por ADN que tiene una longitud de al menos 500 nucleótidos, preferiblemente menos de 200 nucleótidos de longitud, más preferiblemente menos de 150 nucleótidos de longitud, y aún más preferiblemente, menos de 100 nucleótidos de longitud. Se entenderá que las proteínas y ácidos nucleicos E4orf4 de la invención pueden obtenerse a partir de cualquier cepa de adenovirus que tenga la fase de lectura abierta de E4orf4, definida como una fase de lectura abierta que tiene una identidad de al menos un 20%, preferiblemente un 50%, más preferiblemente un 75%, y aún más preferiblemente de un 90% con la fase de lectura abierta de E4orf6 (SEC ID Nº: 4) proporcionada en la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "condiciones de alta rigurosidad" significa condiciones que permiten la hibridación de ADN con ácidos nucleicos que codifican E4orf6 (SEC ID Nº: 1) o E4orf4 (SEC ID Nº: 3) con alta rigurosidad (por ejemplo, hibridación en SSC x 2 a 40ºC con una sonda de ADN de una longitud de al menos 40 nucleótidos). Para otras definiciones de condiciones de alta rigurosidad, véase Ausubel, F., et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 6.3.1-6.3.6.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "actividad biológica de E4orf6" significa la capacidad para inducir en células que expresan E1A-289R una muerte celular incrementada que es un 25%, más preferiblemente un 40%, y aún más preferiblemente, un 60% superior a la muerte celular observada en células que expresan E1A-289R que no expresan E4orf6, un fragmento apoptótico o análogo del mismo. La actividad biológica de E4orf6 se determina usando uno de los ensayos proporcionados en la presente invención, preferiblemente el ensayo de muerte de la luciferasa usando células 1A.A3, 1A.A6 ó 1A.A12. Se entenderá que E1A-289R puede proceder de cualquier cepa de adenovirus.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "actividad biológica de E4orf4" significa la capacidad para inducir en células que expresan E1A-289R una muerte celular incrementada que es un 50%, más preferiblemente un 75%, y aún más preferiblemente un 90% superior a la muerte celular observada en células que expresan E1A-289R que no expresan E4orf4, un fragmento apoptótico o análogo del mismo. La actividad biológica de E4orf4 se determina usando uno de los ensayos proporcionados en la presente invención, preferiblemente el ensayo de muerte de la luciferasa usando células 1A.A3, 1A.A6 ó 1A.A12. Se entenderá que E1A-289R puede proceder de cualquier cepa de adenovirus.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "promotor" significa una secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción. También se incluyen en la invención los elementos promotores suficientes para producir una expresión génica controlable dependiente de promotor, específica del tipo celular, específica de tejido o inducible por señales o agentes externos; tales elementos se pueden localizar en la región 5' o 3' del gen nativo.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "variante degenerada" significa secuencias de ácido nucleico o combinaciones de las mismas seleccionadas a partir de todas las posibles secuencias que codifican E4orf6 y E4orf4, o fragmentos polipeptídicos de ellas, basados en el código genético universal.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "operativamente ligado" significa que un gen y una o más secuencias reguladoras están conectadas de tal forma que se permite la expresión génica cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras de la transcripción) se unen a las secuencias reguladoras.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "colocado para la expresión" significa que el ácido nucleico está colocado adyacente a una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción y la traducción de la secuencia (es decir, facilita la producción de, por ejemplo, un polipéptido, una proteína recombinante o una molécula de ARN de E4orf4).

De acuerdo con la presente invención, la expresión "substancialmente idéntico" significa un polipéptido o ácido nucleico que muestra al menos un 50%, preferiblemente un 75%, más preferiblemente un 90%, y aún más preferiblemente un 95% de identidad con una secuencia de aminoácidos o ácido nucleico de referencia. Para los polipéptidos, la longitud de comparación de secuencias será generalmente de al menos 16 aminoácidos, preferiblemente de al menos 20 aminoácidos, más preferiblemente de al menos 25 aminoácidos, y aún más preferiblemente de al menos 35 aminoácidos. Para los ácidos nucleicos, la longitud de comparación de secuencias será generalmente de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente de al menos 70 nucleótidos, más preferiblemente de al menos 90 nucleótidos, y aún más preferiblemente de al menos 120 nucleótidos.

La identidad de secuencia típicamente se mide usando un software de análisis de secuencia con los parámetros de valor por defecto especificados en el mismo (por ejemplo, Sequence Analysis Software Package del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Este programa empareja secuencias similares asignando grados de homología a varias substituciones, deleciones u otras modificaciones. Las substituciones conservativas típicamente incluyen substituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina, valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.

Por "célula transformada" se entiende una célula que está inmortalizada. Por ejemplo, una célula transformada se dividirá y dará lugar a dos células hijas del mismo estado de diferenciación que la célula parental. Una célula transformada puede ser una célula en la cual (o en un ancestro de la cual) se ha introducido un gen o producto génico exógeno (por ejemplo, un oncogén) que permite la inmortalización de esa célula. Una célula transformada puede también surgir a partir de una mutación genómica en un gen endógeno, dando lugar a un producto génico mutado, o a la desregulación del producto génico endógeno. Las células transformadas se diferencian de las células madre en que las células transformadas tienen una alteración que afecta a la expresión y/o regulación génica normal. Las células transformadas ejemplares incluyen células cancerosas, tales como las encontradas en tumores sólidos.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "transgen" significa cualquier trozo de ADN que se inserta en una célula artificialmente y se convierte en parte del genoma del organismo que se desarrolla a partir de esa célula. Uno de tales transgenes puede incluir un gen que es parcial o totalmente heterólogo (es decir, extraño) al organismo transgénico, o puede representar un gen homólogo a un gen endógeno del organismo.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "transgénico" significa cualquier célula que incluye una secuencia de ácido nucleico que se inserta artificialmente en una célula y se convierte en parte del genoma del organismo que se desarrolla a partir de esa célula. Como se usa en la presente invención, las células transgénicas son generalmente células transgénicas de mamífero y el ácido nucleico (transgen) se inserta artificialmente en el genoma nuclear.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "polipéptido" significa cualquier cadena de más de dos aminoácidos, sin tener en cuenta las modificaciones postraduccionales, tales como glicosilación o fosforilación. Los polipéptidos incluyen proteínas, fragmentos polipeptídicos de las mismas, péptidos miméticos de las mismas y mutantes de las mismas.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "fragmento apoptótico" significa un fragmento polipeptídico de una proteína de muerte E4 (es decir, E4orf4 y E4orf6) que tiene una capacidad de matar células transformadas que es del 75%, más preferiblemente del 95%, o aún más preferiblemente del 100% o superior cuando se compara con la capacidad de matar células transformadas de la proteína de longitud total.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "polipéptido substancialmente puro" significa un polipéptido que se ha separado de los componentes que lo acompañan de forma natural. Típicamente, el polipéptido está substancialmente puro cuando está exento, al menos en un 60% en peso, de proteínas y moléculas orgánicas naturales con las que se asocia de forma natural. Preferiblemente, el polipéptido es un polipéptido de una proteína de muerte E4 que tiene una pureza de al menos un 75%, más preferiblemente de al menos un 90% y aún más preferiblemente de al menos un 99% en peso. Se puede obtener un polipéptido de una proteína de muerte E4 substancialmente pura, por ejemplo, mediante la extracción a partir de una fuente natural (por ejemplo, un adenovirus), por la expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de una proteína de muerte E4 o por la síntesis química de la proteína. La pureza se puede medir por cualquier método apropiado, por ejemplo, por cromatografía en columna, electroforesis en gel de acrilamida o análisis por HPLC.

Una proteína está substancialmente libre de los componentes con los que se asocia de forma natural cuando se separa de los contaminantes que la acompañan en su estado natural. De esta manera, una proteína que se sintetiza químicamente o se produce en un sistema celular diferente de la célula de la que procede de forma natural estará substancialmente libre de sus componentes asociados naturales. Por consiguiente, los polipéptidos substancialmente puros incluyen los derivados de adenovirus, pero sintetizados en E. coli u otros procariotas. Por "ácido nucleico substancialmente puro" se entiende ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que está libre de los genes que flanquean el gen en el genoma en estado natural del organismo del cual deriva el ADN de la invención. Por lo tanto, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector; en un plásmido o virus que se replica de forma autónoma; o en el ADN genómico de un procariota o eucariota; o que existe como una molécula individual (por ejemplo, un ADN o un fragmento de ADN producido por PCR o la digestión con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica una secuencia polipeptídica adicional.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "se une específicamente" significa un anticuerpo que reconoce y se une a una proteína, pero que no reconoce ni se une substancialmente a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, que incluye proteínas de forma natural. Preferiblemente, el anticuerpo de unión específica que se une específicamente a una proteína adenoviral (por ejemplo, E4orf4) no se une a otra proteína adenoviral (por ejemplo, E4orf6).

De acuerdo con la presente invención, la expresión "análogo" incluye, sin limitación, fragmentos de polipéptido, miméticos peptídicos y no peptídicos, reactivos y compuestos que mimetizan la función de muerte celular, y reactivos y compuestos que mimetizan otras funciones de las proteínas E4orf4 o E4orf6.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un vehículo que es aceptable fisiológicamente para el mamífero tratado, y que al mismo tiempo retiene las propiedades terapéuticas del compuesto con el cual se administra. Un vehículo farmacéuticamente aceptable ejemplar es solución salina fisiológica. Otros vehículos fisiológicamente aceptables y sus formulaciones son conocidos por los especialistas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, (18ª edición), ed., A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "vector viral" significa una hebra de ADN que incluye elementos tomados de un virus. Los vectores virales pueden dirigir la expresión del ADN insertado desde un promotor exógeno, o pueden dirigir la expresión de ADN insertado desde las secuencias terminales repetidas largas (LTR) del propio vector. Preferiblemente, los vectores virales son capaces de empaquetarse en virus no líticos capaces de infectar células que luego expresan el ADN insertado en el vector viral.

El agente farmacéutico de la presente invención permite la muerte selectiva de células cuya muerte se ha prevenido por un virus o como consecuencia de un estado de enfermedad. De esta manera, el agente farmacéutico de la presente invención sólo mata las células que sobreviven inapropiadamente, tales como células cancerosas o células infectadas con virus. Esto tiene como resultado una terapia substancialmente sin efectos secundarios para el paciente.

El agente farmacéutico de la presente invención incluye, sin limitación, proteínas de muerte E4 de cualquier adenovirus de cualquier serotipo, fragmentos de las mismas y miméticos peptídicos o no peptídicos de estos productos proteicos.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1A muestra las regiones que codifican las secuencias de aminoácidos de las proteínas de Ad5 E1A y mutantes de las mismas;

la fig. 1B resume los mutantes relevantes de adenovirus;

la fig. 2 es un análisis en gel de agarosa de la inducción de la fragmentación de ADN por los mutantes de Ad5 indicados en células p53-nulas 10(1);

las figs. 3A y 3B son gráficas de los análisis de exclusión por Trypan Blue^{TM} que muestran la viabilidad de células Saos-2 p53 nulas (fig. 3A) y células Saos-2 p53 nulas que expresan Bcl-2 (fig. 3B) infectadas con los mutantes de Ad5 indicados;

la fig. 4 es un análisis en gel de agarosa de la inducción de la fragmentación de ADN por los mutantes de E1A indicados en células p53 nulas 10(1);

la fig. 5 es un gráfico del análisis de exclusión por Trypan Blue^{TM} que muestra la viabilidad de las células Saos-2 p53 nulas infectadas con los mutantes de E1A indicados;

la fig. 6 es un análisis en gel de agarosa de la inducción de la fragmentación de ADN por los mutantes de Ad5 indicados en células E1A/MEF y Hy/MEF;

la fig. 7 es un gráfico del análisis de exclusión por Trypan Blue^{TM} que muestra la viabilidad de las células Saos-2 p53 nulas infectadas con los mutantes de Ad5 indicados;

la fig. 8 es un análisis en gel de agarosa de la inducción de la fragmentación de ADN por los mutantes de Ad5 indicados en células Hy/MEF y E1A/MEF;

las figs. 9A y 9B son gráficos de los análisis de exclusión por Trypan Blue^{TM} que muestran la muerte de células E1A/MEF (fig. 9A) y Hy/MEF (fig. 9B) por los mutantes de Ad5 indicados;

la fig. 10 muestra las regiones que codifican las secuencias de aminoácidos de las proteínas E4orf e indica la expresión de E4orf en mutantes de Ad5;

la fig. 11 es un gráfico del análisis de exclusión por Trypan Blue^{TM} que muestra la función de E4orf6 en la muerte celular independiente de p53 (en células Saos-2 p53 nulas);

la fig. 12 es un gráfico del análisis de exclusión por Trypan Blue^{TM} que muestra la función de E4orf4 en la muerte celular independiente de p53 (en células Saos-2 p53 nulas);

las figs. 13A y 13B son gráficos que muestran que E4orf4 y E4orf6, cuando se expresan por transfección transitoria de un plásmido que codifica E4orf4 o E4orf6, induce citotoxicidad en células p53 nulas, a juzgar por la baja expresión de un plásmido indicador cotransfectado que codifica la luciferasa, en relación con los plásmidos de control no inductores de citotoxicidad que codifican E4orf1, E4orf3 y crmA;

la fig. 14 es un gráfico que muestra que E4orf4 y E4orf6, cuando se expresan individualmente o junto con la luciferasa por la transfección transitoria de un plásmido que codifica E4orf4 o E4orf6, induce citotoxicidad en células p53 nulas, a juzgar por la baja expresión de un plásmido indicador cotransfectado que codifica la luciferasa, en relación con los plásmidos control no inductores de citotoxicidad que codifican E4orf1, E4orf2 y E4orf3. Se usaron dos concentraciones del ADN E4orf de plásmido: las barras negras indican 2,5 \mug; las barras rayadas indican 5 \mug;

la fig. 15 muestra las secuencias de ácido nucleico (arriba) (SEC ID Nº: 1) y de aminoácidos (abajo) (SEC ID

\hbox{Nº: 2)}

de E4orf6 del adenovirus tipo 5 (Ad5); y

la fig. 16 muestra las secuencias de ácido nucleico (arriba) (SEC ID Nº: 3) y de aminoácidos (abajo) (SEC ID

\hbox{Nº: 4)}

de E4orf4 del adenovirus tipo 5 (Ad5). Descripción detallada de la invención

Hemos descubierto que, en ausencia de E1B, los productos proteicos de la fase de lectura abierta (orf) de E1A también inducen apoptosis independiente de p53. Nuestros resultados indican que tal muerte celular apoptótica se induce sólo por la proteína 289R E1A. Además, cuando las células de ratón p53 nulas que expresan constitutivamente los productos de E1A son infectadas por un vector adenoviral al que le faltan las regiones que codifican E1A y E1B completas, pero que contiene las regiones tempranas E2, E3 y E4, se observa una rápida muerte celular debida a la apoptosis. Además, demostramos que 289R induce apoptosis en células de ratón y humanas p53 nulas, y que tal muerte celular independiente de p53 requiere la expresión de otro gen viral temprano. En la presente invención, describimos los análisis genéticos que indican que ni los productos de E2 ni los de E3 son necesarios para la muerte celular independiente de p53 y que dos proteínas E4 son responsables de la muerte celular independiente de p53 indducida por el producto de 289 E1A. Estos resultados indican que la función de E1A-289R puede ser transactivar la expresión de un transcrito temprano adicional cuyo producto realmente induce la apoptosis independiente de p53. En la presente invención proporcionamos dos productos génicos de E4 que son responsables de tal muerte celular y composiciones terapéuticas, métodos y selecciones de fármacos que son el resultado de este descubrimiento.

Demostramos que la proteína E1B-19kDa y Bcl-2 celular inhiben o retrasan significativamente la apoptosis independiente de p53. Ni las regiones tempranas E2 ni E3 parecen ser necesarias para tal muerte celular. El análisis de una serie de mutantes de E1A indica que mutaciones en el dominio de transactivación y otras regiones de E1A se correlacionan con la transactivación mediada por E1A de la expresión del gen E4. Además, células Saos-2 humanas deficientes en p53 infectadas con un adenovirus mutante que expresa E1B, pero ninguno de los productos del gen E4, permanecen viables durante un período considerablemente más largo de tiempo que las células Saos-2 humanas deficientes en p53 infectadas con Ad5 de tipo silvestre (wt). Además, un vector adenoviral al que le falta E1 y E4 es incapaz de inducir la degradación de ADN y la muerte celular en una línea celular que expresa E1A. Estos datos muestran que un producto de E4 era esencial para la apoptosis inducida por E1A independiente de p53.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención y no limitar la invención.

I. Materiales y métodos usados en la presente invención Células y virus

Se cultivaron células humanas Saos-2 (ATCC HTB 85) y células derivadas de fibroblastos de embrión de ratón 10(1), ambas deficientes en la expresión de p53, en placas de 60 mm de diámetro (Corning Glass Works, Corning, N.Y.) en MEM modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con un 10% de suero de ternero fetal (FCS), al igual que las células NIH-3T3 y CHO. Para este estudio, la línea celular Saos-2/Bcl-2(3g4), que expresa establemente Bcl-2, se obtuvo a partir de células Saos-2 mediante selección con G418, al igual que la línea de control Saos-2/Neo(2a2). Las líneas celulares de fibroblastos de embrión de ratón (MEF) 1A.A3, 1A.A6 y 1A.A12 que expresan proteínas E1A de Ad5, y las líneas de control seleccionadas por higromicina Hy.A3, se han descrito previamente (Lowe, S.W. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 2026-2030), y se cultivaron en DMEM que contenía un 10% de FCS y 10 mg/ml de higromicina. Normalmente, las células se infectaron con Ad5 mutante o de tipo silvestre (wt) a una multiplicidad de 100 pfu por célula. Los mutantes de E1A de Ad5 se ilustran en la fig. 1A e incluyen los mutantes de deleción dl1101 (restos 4-25 delecionados), dl1143 (38-60), dl1107(111-123), dl1108 (124-127), dl1143/08 (38-60 más 124-127) y dl1132 (224-238). Se han presentado las proteínas codificadas por algunos de los mutantes usados en los presentes estudios, incluyendo los restos eliminados en los mutantes de deleción. CR1, CR2, CR3, AR1 y AR2 también están indicados. Se generó un nuevo mutante de E1A denominado AR1^{-}/E1B^{-}, al que le falta la región AR1 entera (restos 189-200) y que tampoco puede expresar los productos de E1B, siguiendo los métodos descritos previamente en Dumont, D.J. et al. (J. Virol. 63: 987-991, 1989). Se generaron más mutantes según las técnicas convencionales de biología molecular. El mutante AR2^{-}/E1B^{-} se generó mediante la introducción de dl1132, al que le faltan los restos 224-238, en un ambiente que no expresa las proteínas de E1B. El mutante AR1^{-}/AR2^{-}/E1B^{-} representa una combinación de los dos últimos mutantes. Se produjeron mutantes adicionales de E1A que contenían substituciones de aminoácidos únicos en varios sitios en CR3 por subclonación de los fragmentos apropiados de enzimas de restricción a partir de plásmidos de ADNc de E1A mutante en ADN genómico viral, seguido del rescate en virus para formar mutantes AD147VL (Val-147 convertida en Leu), AD177CS y AD185SG. Todos los demás mutantes se han resumido en la fig. 1B, que es una lista que proporciona los nombres y defectos de E1B y otros mutantes. Dos mutantes no pueden expresar las proteínas de E1B de 19 kDa (originalmente denominada pm1716/2027, pero ahora llamada E1B/19K^{-}) y 55 kDa (originalmente pm2019/2250, ahora E1B/55K^{-}) (McLorie, W. et al., supra). El mutante 12S/E1B^{-} (originalmente dl520E1B^{-}) produce sólo la proteína E1A-243R codificada por el ARNm 12S y no los productos de E1B. El mutante E1B^{-} que expresa ambos productos principales de E1A, pero no las especies E1B de 19 kDa y 55 kDa, se describió previamente (Teodoro, J.G. et al., 1995, Oncogene 11: 467-474). Un mutante que expresa sólo 289R es ausencia de E1B, denominado 13S/E1B^{-}, se preparó de forma similar para los presentes estudios. También se produjo una serie de mutantes de E1A (dl1101/E1B^{-}, dl1107/E1B^{-}, AD147VL/E1B^{-}, etc.), que no expresan los productos de E1B, introduciendo mutaciones de E1A en un mutante E1B^{-}, que expresa los productos de E1A 289R y 243R, pero no E1A (Teodoro, J.G. et al., 1995, Oncogene 11: 467-474). La presencia de mutaciones en todos los mutantes se confirmó mediante secuenciación de ADN, digestión con enzimas de restricción o transferencia de Southern, las cuales son todas técnicas convencionales de biología molecular. Más vectores de Ad5 usados en este estudio incluían AdLacZ, en el que la región E1 (E1A + E1B) se reemplazó por el gen LacZ de E. coli bajo el promotor de CMV, y Ad5dl70-8 (F.L. Graham, McMaster University, Hamilton, Ont., Canada), que se generó mediante cotransfección de los plásmidos pAB7 y pBHG10, como se ha descrito previamente (Bett, A.J., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8802-8806), y al cual le falta E1 y la región E3 entera. Estos vectores virales y otros mutantes de E1A y E1B se cultivaron en células 293 humanas, como se ha descrito previamente (Graham, F.L. et al., 1977, J. Gen. Virol. 36: 59-72; Bett, A.J., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8802-8806). El vector adenoviral AdRSV\betagal.11, al que le faltan las regiones E1 y E4 enteras, fue un regalo de Douglas Brough (GenVec, Rockville, MD). Además, algunos experimentos se realizaron con el mutante de adenovirus humano de tipo 2 (Ad2) dl1019 que contiene deleciones que eliminan la expresión de todos los productos de E4 y que se propagó en células de mono W162, como se ha descrito previamente (Bridge, E. et al., 1989, J. Virol. 63: 631-638). Otros mutantes de E4 (Bridge, E. et al., supra) se han resumido en la figura 10.

Fragmentación de ADN

Se aisló ADN de bajo peso molecular a partir de células en las que se simuló la infección o infectadas con Ad5 como se describe en Teodoro et al. (Oncogene 11: 467-474, 1995). Para estos experimentos, se recogieron placas de 60 mm de diámetro de las células a las 40 horas después de la infección y se lisaron en tampón de lisis pronasa (Tris-HCl 10 mM (pH 8) que contenía EDTA 5 mM, NaCl 100 mM y 1 mg/ml (p/v) de pronasa a la que se añadió SDS al 0,5% p/v). Los lisados celulares después se incubaron a 37ºC durante 2 horas y luego se añadió NaCl a una concentración final de 1 M. Las muestras después se incubaron durante toda la noche a 4ºC y se centrifugaron a 15.000 x g durante 30 min. Los ácidos nucleicos extraídos se trataron con ARNasa A y se analizaron en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio.

Análisis de la viabilidad celular

Las células se infectaron con el virus de tipo silvestre (wt) o mutante en placas de 24 pocillos que contenían células aproximadamente a un 80% de confluencia. A varios tiempos después de la infección, las células adherentes y no adherentes se reunieron y se ensayó la viabilidad por exclusión con Trypan Blue^{TM}. Se contaron al menos 300 células en cada punto de tiempo.

Medición de la transactivación mediada por E1A del promotor de E4 de adenovirus

Los ensayos de transactivación CAT se realizaron usando células NIH 3T3 o CHO cultivadas a una densidad de

\hbox{2 x 10 ^{5} }

células en placas de 60 mm de diámetro. El plásmido indicador CAT E4 (E4-CAT) contenía el promotor de E4 secuencia arriba del gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Se realizaron cotransfecciones transitorias por el método de precipitación con fosfato cálcico (descrito, por ejemplo, en Ausubel, F. et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY) usando 2,5 \mug de ADN de plásmido indicador y 2,5 \mug de ADN de plásmidos que expresan los productos de E1A wt o mutante. Las células recibieron un choque de glicerol 12 horas después de la transfección y luego se recogieron 36 horas más tarde. Los ensayos de CAT se realizaron usando extractos celulares que contenían cantidades iguales de actividad \beta-galactosidasa, como se ha descrito (Ausubel, F. et al., supra). La cantidad de actividad se cuantificó a partir de placas de TLC usando Fujix Bas 2000^{TM} Phosphorimager. Ensayo de muerte de la luciferasa

Las fases de lectura abiertas (orf) de E4 se clonaron individualmente en el plásmido pCDNA3.1 (disponible en el mercado en Invitrogen) que dirige la expresión génica con el promotor de CMV. Los plásmidos se purificaron usando la purificación con CsCl dos veces y las transfecciones se hicieron mediante precipitación con fosfato cálcico. Cada plásmido que codificaba E4orf se transfectó junto con un plásmido que expresaba el gen de la luciferasa bajo el control del promotor de RSV (pRSV-luciferasa). Se usó el vector pCDNA vacío o un vector pCDNA que codificaba crmA como control negativo de muerte celular.

II. La apoptosis independiente de p53 inducida por E1A se inhibe por la proteína E1B-19kDa y por el Bcl-2 celular

Hemos demostrado recientemente que mientras que los principales productos de Ad5 E1A podían inducir apoptosis en células que expresaban p53, sólo la proteína 289R E1A podía hacerlo en células a las que le faltaba p53 (Teodoro, J.G. et al., 1995, Oncogene 11: 467-474). La fig. 2 muestra el patrón de fragmentación de ADN en células 10(1) de ratón p53^{-} infectadas con varios mutantes de Ad5. Las células 10(1), que no expresan p53, se infectaron con varios mutantes de Ad5, o se simuló la infección, y a las 40 horas después de la infección (p.i.), se analizó el ADN de bajo peso molecular mediante electroforesis en gel de agarosa. Los contenidos de las calles individuales se indican en la fig. 2. Los extractos de las células en las que se simuló la infección (fig. 2, calle 1) y las infectadas con Ad5 wt (fig. 2, calle 2), que expresa los productos de E1B, exhibían niveles reducidos de ADN de bajo peso molecular extraído y poco o ningún ADN degradado, al igual que las células infectadas con el mutante E1B/55K^{-} (fig. 2, calle 4), que produce la proteína E1B-19kDa pero no el producto E1B-55kDa. Con las células infectadas con el mutante E1B^{-}, que sintetiza ambas proteínas E1A 289R y 243R, pero que no produce los productos de E1B (fig. 2, calle 6), se extrajeron grandes cantidades de ADN y se hicieron evidentes altos niveles de fragmentos de ADN de tamaño nucleosomal. También se obtuvieron resultados similares con células infectadas con E1B/19K^{-} (fig. 2, calle 5), que produce la especie E1B-55kDa, pero no la proteína de 19 kDa. La inducción de la degradación de ADN en estas células p53^{-} no tuvo lugar tras la infección con 12S/E1B^{-} (fig. 2, calle 3), que produce sólo E1A-243R y no E1B, pero tuvo lugar con 13S/E1B^{-}(fig. 2, calle 7) que produce sólo E1A- 289R en ausencia de productos de E1B. De esta manera, E1A-289R, pero no 243R, indujeron apoptosis independiente de p53 en ausencia de proteínas de E1B. Además, estos resultados indicaron que el polipéptido de 19kDa de E1B, pero no el producto de E1B de 55kDa era capaz de proteger contra la apoptosis inducida por E1A en ausencia de p53.

Para examinar la especificidad de la inhibición de la apoptosis, se realizaron estudios adicionales para determinar si la proteína Bcl-2 celular era también capaz de prevenir la apoptosis independiente de p53, ya que varios estudios previos habían demostrado que Bcl-2 y la proteína E1B-19kDa pueden ser funcionalmente similar (Nguyen, M. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 16521- 16524). Las células Saos-2 humanas, que son defectuosas para la síntesis de p53, se transfectaron con ADNc que codificaban para la proteína Bcl-2 humana y el marcador de resistencia a neomicina y se seleccionaron varias líneas celulares usando G418. Uno de los clones que expresaba Bcl-2, denominado Saos-2/Bcl-2(3g4), y un clon Saos-2 de control, Saos-2/neo(2a2) seleccionado sólo para la resistencia a G418, se infectaron con Ad5 wt, mutantes 12S/E1B^{-} o E1B/19K^{-}, o se simuló la infección, y se realizaron los ensayos de viabilidad celular en varios tiempos tras la infección. Las células Saos-2/neo(2a2) humanas deficientes en p53 (fig. 3A) o Saos-2/Bcl-2(3g4), que expresan constitutivamente Bcl-2 humano (fig. 3B), se infectaron de forma simulada o se infectaron con wt, E1B/19K^{-} o 12S/E1B^{-} y se ensayó la viabilidad mediante un ensayo de exclusión por Trypan Blue^{TM} en varios tiempos después de la infección. Los resultados se han presentado como el logaritmo del % de células viables, y los símbolos son como se indica en las figs. 3A y 3B. La fig. 3A demuestra que a las células de control Saos-2/neo(2a2) las mató el virus E1B/19K^{-} que expresa E1A-289R, pero las infectadas con wt o 12S/E1B^{-} se mantenían casi tan viables como las células infectadas de forma simulada durante el período de ensayo. La fig. 3B demuestra que a las células Saos-2/Bcl-2(3g4) que expresan de forma estable altos niveles de Bcl-2, se les indujo poca muerte celular por el virus E1B/19K^{-}. Se obtuvieron resultados similares con otras tres líneas celulares Saos-2 de control y productoras de Bcl-2. De este modo, al igual que la proteína E1B-19kDa, Bcl-2 también bloquea la apoptosis inducida por E1A independiente de p53.

III. Función de los dominios de E1A en la apoptosis independiente de p53

Para investigar las regiones de los productos de E1A implicadas en causar la muerte celular independiente de p53, se infectaron células 10(1) de ratón p53^{-} con mutantes de Ad5 que no expresaban E1B y que portaban varios defectos en diversas regiones de la molécula de E1A. Se recogieron los extractos y se analizaron en geles para determinar la extensión de la degradación del ADN de bajo peso molecular. Se realizó un experimento en células 10(1) deficientes en p53 usando una serie de mutantes de E1A de Ad5 defectuosos en la expresión de los productos de E1B. Las células 10(1) se infectaron con diversos mutantes de Ad5, o se simuló la infección, y a las 40 horas p.i., se analizó el ADN de bajo peso molecular por electroforesis en gel de agarosa. Los contenidos de las calles individuales son como se indica en la fig. 4. La fig. 4 demuestra de nuevo que el mutante E1B/19K^{-} (fig. 4, calle 3) inducía la degradación de ADN, mientras que tal degradación de ADN no se producía con Ad5 wt (fig. 4, calle 2) o células infectadas de forma simulada (fig. 4, calle 1). Ninguno de los mutantes que afectaban a la función de transactivación de E1A asociada con CR3 pudo inducir la degradación de ADN. Éstos incluían 12S/E1B^{-} (fig. 4, calle 8), y los mutantes puntuales AD147VL/E1B^{-}, AD171CS/E1B^{-} y AD185SG/E1B^{-} (fig. 4, calles 9 a 11, respectivamente) que portan substituciones de restos únicos en restos críticos en CR3 que eliminan la actividad de transactivación de E1A. Además, la deleción de AR1 o de AR1 y AR2 (AR1^{-}/E1B^{-} y AR1^{-}/AR2^{-}/E1B^{-} en la fig. 4, calles 12 y 14, respectivamente) también eliminó la degradación de ADN, mientras que la eliminación de AR2 solo (AR2^{-}/E1B^{-}en la fig. 4, calle 13) tiene poco efecto sobre la eliminación de la degradación de ADN. Sorprendentemente, los mutantes en CR2 que eliminan la formación del complejo con pRB y proteínas relacionadas (dl1107/E1B^{-} y dl1108/E1B^{-} en la fig. 4, calles 5 y 6, respectivamente) no tuvieron ningún efecto sobre la inducción de la degradación de ADN, mientras que los que eliminaban la unión de p300 mediante la eliminación del extremo N-terminal (dl1101/E1B^{-} en la fig. 4, calle 4) o una porción de CR1, así como el sitio de unión de pRB (dl1143/08/E1B^{-} en la fig. 4, calle 7) ya no causaban este efecto de degradación de ADN. Estos resultados sugerían que la apoptosis independiente de p53 inducida por E1A requería el dominio de transactivación de CR3, AR1 y las regiones necesarias para la unión de p300, pero no proteínas relacionadas con pRB. La figura 5 demuestra que se obtuvieron resultados similares con estos mutantes en ensayos de muerte celular. Se realizó un experimento en el que se infectaron células Saos-2 con varios mutantes de adenovirus o de forma simulada y después se ensayó la viabilidad por el ensayo de exclusión por Trypan Blue^{TM} a varios tiempos después de la infección. Los resultados se han presentado como el logaritmo del % de células viables, y los símbolos son como se indica en la fig. 5. La muerte celular se indujo por el virus E1B/19K^{-}, que expresa ambos productos de E1A, y por dl1107/E1B^{-}. El mutante AR2^{-}/E1B^{-}, al que le falta AR2, también mataba, pero era sistemáticamente menos tóxico que los virus anteriores. Todos los demás mutantes que afectaban a CR3, AR1 y los sitios de unión de p300 no eran capaces de matar significativamente durante el período de ensayo.

IV. Activación de la expresión de E4 y apoptosis

Se realizaron estudios para examinar el patrón de transactivación de E1A del promotor de E4 en los que se cotransfectó ADN plasmídico que codificaba varias formas mutantes de E1A-289R en células NIH-3T3 o CHO junto con ADN de E4-CAT, una construcción que codifica CAT bajo el control del promotor de E4 de Ad5. La tabla 1 demuestra que, además de CR3, la activación del promotor de E4 requería AR1 y hasta cierto punto, AR2.

TABLA 1 Transactivación de E4 por mutantes de E1A

Mutante de E1A	Mutación	Región afectada	Actividad E4 CAT*
			(% en peso +/-S.D.)
tpo silvestre (wt)	ninguna	ninguna	100
dl1101	\Delta4-25	N-terminal	30+/-11
dl1104	\Delta48-60	CR1	40+/-5
dl1107	\Delta111-123	CR2	85+/-5
dl1108	\Delta24-127	CR2	81+/-14
dl520	\Delta140-185	CR3	10+/-7
AR1^{-}	\Delta189-200	AR1	25+/-7
AR2^{-}(pm1132)	\Delta224-238	AR2	64+/-16
* Se transfectaron células CHO o 3T3 con ADN de plásmido que codifica varios mutantes de E1A y CAT bajo
el promotor E4 de Ad5.

Se evaluó la actividad CAT de los extractos celulares, como se describe en la presente invención. La actividad CAT se ha expresado como un porcentaje de la obtenida con el tipo silvestre. Se realizaron tres ensayos independientes para cada mutante.

Además, también se descubrió que regiones en el extremo N-terminal y en el CR1 implicadas en la unión de p300 eran importantes en la activación del promotor de E4. Estos resultados se corresponden estrechamente con el patrón de apoptosis independiente de p53 inducida por E1A y sugería que los productos de E4 podrían estar implicados en esta muerte celular independiente de p53.

V. Los productos de E2 y E3 no son necesarios para la apoptosis

Dados los resultados descritos en la presente invención que resumen los requisitos para la apoptosis independiente de p53 inducida por E1A, se determinó que era poco probable que los productos de E2 fueran responsables de la inducción de apoptosis independiente de p53. En primer lugar, además de CR3, la formación del complejo, que implica CR2 y la familia de proteínas de pRB, activa la expresión de E2, y se demostró que CR2 era de escasa importancia en la muerte celular. En segundo lugar, se sabe que se inducen niveles razonablemente altos de expresión de las proteínas de E2 por la proteína E1A-243R que es completamente incapaz de inducir apoptosis independiente de p53.

Después se realizaron experimentos para determinar si cualquier producto de E3 estaba implicado en la inducción de apoptosis independiente de p53. La línea celular de fibroblastos de embrión de ratón, 1A.A3 a la que le falta p53 pero expresa las proteínas de E1A de Ad5, y las células de control p53^{-} seleccionadas con higromicina, Hy.A3 (Lowe, S.W. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 2026-2030) se infectaron con Ad5 wt (de tipo silvestre), el virus E1B/19K^{-}, el vector de adenovirus AdLacZ, que contiene LacZ en lugar de E1A y E1B, o con el vector Ad5dl70-8, al que le faltan las regiones E1 y E3 enteras. Después se ensayó la presencia de ADN degradado en los extractos celulares.

Por consiguiente, las líneas celulares que expresaban constitutivamente las proteínas 289R y 243R E1A (E1A/
MEF), o a la línea celular de control sin expresión Hy.A3 (HY/MEF) se infectaron de forma simulada o con Ad5 wt o los vectores de adenovirus AdLacZ o Ad5dl70-8. Después de 40 horas, se extrajo el ADN y se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa. Los contenidos de las calles individuales son como se indica en la fig. 6. La fig. 6 demuestra que se inducían altos niveles de degradación de ADN en las células 1A.A3 con los mutantes 19K^{-}, así como con los dos vectores de adenovirus AdLacZ o Ad5dl70-8. La fig. 6 también demuestra que en las células control a las que le falta la expresión constitutiva de E1A, únicamente el virus E1B/19K^{-} inducía la degradación de ADN. También se obtuvieron resultados similares con otras dos líneas celulares similares que expresaban E1A, 1A.A6 y 1A.A12. Estos resultados indican que los productos de E3 no eran necesarios para la inducción de apoptosis independiente de p53 por E1A en estas condiciones.

VI. Las proteínas E4 son esenciales para la apoptosis independiente de p53

Para determinar directamente si los productos de E4 estaban implicados en la inducción de muerte celular, como sugerían los experimentos descritos anteriormente, se tomaron dos estrategias. En la primera estrategia, se infectaron células Saos-2 p53^{-} humanas con Ad5 wt o adenovirus tipo 2 (Ad2) wt o con el mutante de Ad2, dl1019 que no produce proteínas E4 (Bridge, E., et al., supra), o se simuló la infección. Aunque estos virus expresan proteínas de E1B y de esta manera se protegen de la apoptosis inducida por E1A, se pensó que si los productos de E4 eran esenciales para la muerte celular independiente de p53, se debería observar alguna diferencia a largo plazo en la supervivencia celular. De esta manera, a varios tiempos hasta 10 días, se ensayó la viabilidad celular de los cultivos infectados. Para este experimento se simuló la infección de células Saos-2 o se infectaron con Ad5 o Ad2 wt, o dl1019. A varios tiempos hasta 10 días se evaluó la viabilidad celular mediante exclusión con Trypan Blue^{TM}. Los datos se han expresado como % de viabilidad celular y los símbolos son como se indica en la fig. 7. La fig. 7 demuestra que las células infectadas por virus Ad5 wt comenzaban a morir en aproximadamente 100 horas p.i., y en 240 horas p.i. casi todas las células estaban muertas. Se obtuvieron resultados similares con células infectadas con Ad2 (adenovirus tipo 2) wt. Sin embargo, éste no era el caso con células infectadas con dl1019, que se mantenían casi tan viables como las células a las que se simuló la infección incluso 10 días después de la infección. Estos resultados indicaron que un producto de E4 estaba implicado en la muerte celular en ausencia de p53. Esta idea se confirmó en experimentos que implicaban la infección de células 1A.A3 p53^{-} que expresaban E1A con el vector de adenovirus AdRSV\betagal.11 en el que las regiones de E1 y E4 se habían delecionado completamente. Para este experimento, las líneas celulares que expresaban constitutivamente las proteínas 289R y 243R E1A, o la línea celular de control sin expresión Hy.A3, se infectaron de forma simulada o se infectaron con Ad5 wt, E1B/19K^{-}, 12S/E1B^{-}, o el vector de adenovirus AdRSV\betagal.11, al que le falta E1 y E4. Tras 40 horas, se extrajo el ADN y se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa. Los contenidos de las calles individuales son como se indica en la fig. 8. La fig. 8 demuestra que en células p53^{-} Hy.A3 (Hy/MEF) de control, que no expresan E1A, sólo el mutante de Ad5 E1B/19K^{-}causaba la degradación de ADN, y ni wt, ni 12S/E1B^{-} ni el vector AdRSV\betagal.11 tenían ningún efecto significativo (es decir, no inducían la degradación de ADN). Con las células 1A.A3 (E1A/MEF), ambos virus, E1B/19K^{-} (fig. 8, calle 8) y 12S/E1B^{-} (fig. 8, calle 9) inducían degradación de ADN, pero el vector AdRSV\betagal.11 (fig. 8, calle 10) aún tenía escaso efecto en la inducción de la degradación de ADN. Se obtuvieron resultados similares con las otras dos líneas celulares hermanas, 1A.A6 y 1A.A12. La capacidad de los virus E1B/19K^{-} y 12S/E1B^{-} para inducir apoptosis en células 1A.A3 se analizó con mayor profundidad en experimentos de muerte celular. Las líneas celulares que expresaban constitutivamente las proteínas de E1A 289R y 243R (E1A/MEF-panel derecho), o la línea celular de control que no expresaba E1A, Hy.A3 (Hy/MEF) (panel izquierdo), se infectaron de forma simulada o se infectaron con Ad5 wt, E1B/19K^{-}, 12S/E1B^{-} o el vector adenoviral AdRSV\betagal.11. A varios tiempos tras la infección se evaluó la viabilidad celular mediante exclusión por Trypan Blue^{TM}. Los datos se han expresado como % de viabilidad celular y los símbolos son como se indica en las figs. 9A y 9B. La fig. 9B demuestra que en las células de control Hy.A3 (Hy/MEF), sólo el virus E1B/19K^{-} inducía muerte celular, mientras que en células 1A.A3 (E1A/MEF-mostrado en la fig. 9A), ambos virus, E1B/19K^{-} y 12S/E1B^{-}, lo hacían. Sin embargo, en ambos casos las células infectadas con AdRSV\betagal.11 se mantenían tan viables como los cultivos de infección simulada. De esta manera, estos datos confirmaban que un producto de E4 era responsable de la muerte celular independiente de p53 inducida por E1A.

VII. Identificación de las proteínas de muerte celular E4 de adenovirus

Para identificar qué producto de E4 es responsable de la inducción de la apoptosis independiente de p53 inducida por E1A, se infectaron células 10(l) de ratón p53 nulas con Ad5 wt o con mutantes que portaban deleciones en varias porciones de la región E4 (véase la fig. 10). Las células Saos-2 se infectaron con Ad5 wt, mutantes de Ad5 o se simuló la infección, y se realizaron ensayos de viabilidad celular usando Trypan Blue^{TM} a varios tiempos tras la infección. Los resultados se presentaron como el logaritmo del % de células viables, y los símbolos son los indicados en las figs. 11 y 12. La fig. 11 demuestra que las células Saos-2 infectadas por el virus wt empezaban a morir aproximadamente 125 horas después de la infección, y la muerte era prácticamente completa a las 240 horas, a juzgar por la exclusión de Trypan Blue^{TM} en células vivas. Se observaron pocas células muertas en los cultivos con infección simulada o en cultivos infectados con los mutantes dl1019 y dl1011, que carecen de la región E4 completa. Se observó una muerte celular similar a la encontrada con wt con los mutantes de E4 dl1013 que expresan E4orf6 y E4orf4, mientras que se daba poca muerte con los mutantes dl1010 que expresan todos los productos E4 excepto E4orf6 (fig. 11). Estos resultados indicaron que la muere celular se producía sólo cuando la proteína E4orf6 se expresaba y no tenía lugar durante el curso de los experimentos en su ausencia. De esta manera, está claro que la expresión de la proteína E4orf6 es esencial para la apoptosis independiente de p53 inducida por el producto 289R E1A.

Los estudios con dl1013 dejan abierta la posibilidad de que E4orf4 pueda estar implicado también en la apoptosis de p53 inducida por el producto 389R E1A, de forma que se ensayaron mutantes adicionales. Se llevaron a cabo más experimentos de exclusión por Trypan Blue^{TM} en células Saos-2 seguidos de infección con los mutantes dl1014 que sólo expresan E4orf4, dl1015 que expresa E4orf4 y E4orf3, dl1011 que no expresa productos E4, así como células infectadas de forma simulada. La fig. 12 demuestra que, de hecho, el mutante dl1014 que produce E4orf4 pero no otro producto E4, mataba de forma bastante eficaz. Estos resultados indicaban que la expresión de E4orf4 solo inducía la muerte celular. El mutante dl1015 que produce sólo E4orf4 y E4orf3 mataba de forma reproductible peor que dl1014, lo que sugiere que la proteína E4orf3 puede reducir los efectos tóxicos de E4orf4.

De ese modo, las figs. 12 y 13 demuestran que el adenovirus Ad5 produce dos proteínas, E4orf6 y E4orf4, de las que cada una tiene una función en la inducción de apoptosis independiente de p53. Esta conclusión se confirmó en un segundo tipo de experimentos en los que E4orf4 o E4orf6 se expresaron solas en ausencia de otras proteínas virales usando transfección transitoria con ADN plasmídico para E4orf4 o Eo4orf6 en combinación con un plásmido indicador que codificaba la luciferasa en células transformadas que expresaban p53 o p53 nulas.

Se cotransfectaron células 1A.A3 y 1A.A6, que carecen de p53 pero expresan constitutivamente el oncogén E1A, usando el método de fosfato cálcico con un plásmido de ADNc que codificaba la luciferasa unida operativamente con el promotor de RSV (pRSV-luciferasa) y plásmidos de ADNc que expresaban varios productos de E4 o CrmA unidos operativamente al promotor de CMV. Estas construcciones se generaron por subclonación de las secuencias de ADNc que codificaban estos productos proteicos en el plásmido de expresión pDCNA3.1 disponible en el mercado en Invitrogen. Las células se lisaron cuarenta y ocho horas después de la transfección y se midió la actividad luciferasa en un luminómetro usando los métodos y reactivos del kit del ensayo de la luciferasa disponible en el mercado en Promega. La actividad luciferasa de la fig. 13A se representa en unidades de actividad, mientras que la actividad luciferasa de la fig. 13B se representa como un porcentaje de la actividad luciferasa máxima observada en las células cotransfectadas con plásmidos que codifican la luciferasa y E4orf3. Las figs. 13A y 13B demuestran que la transfección con un vector vacío (EV), o con ADNc que expresan E4orf1, E4orf3, o CrmA tenían como resultado altos niveles de actividad luciferasa, lo que indicaba que la viabilidad no se veía afectada. Sin embargo, las figs. 13A y 13B demuestran que la actividad luciferasa se reducía parcialmente por la expresión de E4orf6 (fig. 13B) y se reducía en gran medida por la de E4orf4 (figs. 13A y 13B). La coexpresión de ambas proteínas de muerte E4 tenía como resultado una muerte celular incluso mayor, como se muestra en la fig. 14. Estos resultados proporcionaron indicios independientes de la capacidad de estas dos proteínas para matar las células p53 nulo transformadas, mientras que al mismo tiempo demuestra la incapacidad de E4orf1 y E4orf3 para matar estas células. Ciertos ensayos de muerte similares han proporcionado resultados comparables en líneas celulares p53 positivas transformadas y algunas células inmortalizadas de rápido crecimiento. En todos los ensayos de este tipo, se ha descubierto que E4orf4 induce mayores niveles de muerte que E4orf6. Sin embargo, es difícil predecir si los niveles mayores de muerte observados con E4orf4 son tan deseables o tan específicos como los obtenidos con E4orf6. Aún así, estos resultados indicaban que E4orf4 y E4orf6 tienen potencial para matar células transformadas de crecimiento rápido. Además, como se discute en la presente invención, como tal muerte no ocurría en células normales infectadas por mutantes en las que los productos E1A eran defectuosos en su capacidad para inducir síntesis de ADN no programada y transformación celular, la muerte se limitaba a las células cancerosas, dejando relativamente sin afectar las poblaciones de células normales.

Los productos E1A de adenovirus inducen la degradación de ADN, la muerte celular rápida y otros rasgos característicos de la apoptosis cuando se expresan en ausencia de productos E1B, cuya principal función en la infección lítica y la transformación es suprimir la toxicidad de E1A. Ambas proteínas E1A, 289R y 243R, son capaces de inducir apoptosis a través de las rutas dependientes de p53.

Las proteínas E1A también inducen apoptosis en células carentes de p53 (Teodor, J.G. et al., 1995, Oncogene 11: 467-474). Hemos descubierto que esta apoptosis independiente de p53 fue provocada sólo por la proteína E1A 289R, y nuestros resultados sugerían que se requería la expresión de uno o más genes virales tempranos adicionales regulados por E1A-289R para esta apoptosis. Los experimentos descritos aquí indicaban que la proteína E1B-55kDa era incapaz de bloquear este efecto, pero el producto de E1B-19kDa y el supresor celular de apoptosis, Bcl-2, inhibían esta respuesta significativamente.

El principal objetivo del trabajo que lleva a esta invención fue identificar qué unidades de transcripción viral temprana se requerían para inducir la muerte celular en ausencia de p53. Los resultados obtenidos con mutantes E1A indicaban claramente que el CR3 es importante en la capacidad del producto E1A 289R para inducir apoptosis independiente de p53. Además, parecía que se requería la actividad de transactivación mediada por CR3, ya que varios mutantes puntuales en CR3, que se sabía que eliminaban la transactivación de genes diana, eran defectuosos para la inducción de degradación de ADN y muerte celular. Fueron de gran interés los resultados con mutantes con defectos fuera de CR3. Los mutantes dl1108, que carecen del núcleo del sitio de unión para pRB y proteínas relacionadas, inducían apoptosis independiente de p53 como wt. Sin embargo, el mutante dl1101, que une pRB a niveles razonablemente normales pero fallan en la unión con el modulador transcripcional p300, fue totalmente defectuoso en su capacidad para inducir apoptosis independiente de p53. Estos resultados sugieren que las interacciones entre p300 y 289R eran esenciales para iniciar las rutas de muerte celular. Se ofreció otra posibilidad por los resultados obtenidos con dos mutantes adicionales con defectos en las regiones AR1 y AR2 codificadas por el segundo exón del ARNm 13S de E1A. El mutante defectuoso en AR1 era incapaz de inducir la apoptosis independiente de p53, y el mutante carente de AR2 también tenía alterada de alguna manera su capacidad para inducir apoptosis independiente de p53. Estos resultados correspondían exactamente con las capacidades relativas de estas moléculas de E1A mutantes para transactivar el promotor de E4. También descubrimos que dl1101 era parcialmente defectuoso para la transactivación de E4, indicando de este modo que los productos E4 no sólo están implicados en la inducción de la muerte celular, sino también que las interacciones de 289R con p300 pueden reflejar más bien un requisito para la transactivación de la transcripción de E4 que una función directa en la apoptosis.

Las regiones tempranas E2, E3 y E4 codifican varios productos que pueden tener alguna función en la muerte celular. Las proteínas E2 están implicadas en gran medida en la síntesis del ADN viral. Sin embargo, es poco probable que cualquier proteína E2 tenga una función esencial en la muerte celular. En primer lugar, la transcripción de E2 requiere no sólo CR3, sino también la formación de complejos con pRB que tienen como resultado la activación de la familia de factores de transcripción E2F y la expresión del gen E2. Nuestros resultados indicaban claramente que la formación del complejo con pRB no era esencial para la apoptosis. En segundo lugar, el vector de adenovirus AdRSv\betagal.11 contenía una región E2 wt y también era defectuoso para la inducción de apoptosis dependiente de p53 en células que expresaban E1A. La región E3 codifica varias proteínas que afectan a las interacciones del virus con el hospedador, sin embargo, el vector de adenovirus Ad5dl70-8, que carece de la expresión de E1A, E1B y E3, fue completamente capaz de inducir apoptosis en células deficientes en p53 que expresan E1A. El patrón de apoptosis que observamos con mutantes E1A sugería que las proteínas virales tempranas asociadas con la muerte celular estaban codificadas por E4. La evidencia directa de que una proteína E4 era la responsable se obtuvo de los experimentos en los que se observó el patrón de muerte en células Saos-2 p53 nulas infectadas por Ad5 wt o un mutante defectuoso en la expresión de E4. Como los productos E1B se expresaban por estos virus, la muerte celular tenía lugar sólo a tiempos tardíos, pero la observación de que las células infectadas mutantes de E4 mostraban una muerte considerablemente retardada implicaba claramente un producto de E4 en el proceso de muerte celular. La confirmación final vino de los resultados de los experimentos con el vector de adenovirus AdRSV\betagal.11 que demostraba que este vector viral era defectuoso para la muerte celular. Este virus fue incapaz de inducir la degradación de ADN o la muerte celular en células deficientes en p53 que expresan E1A.

Por lo tanto, hemos demostrado que cualquiera de las proteínas de muerte E4, E4orf6 o E4orf4, es responsable de la muerte última de las células humanas que sigue a la infección productiva por adenovirus. La muerte celular podría inducirse de forma temprana tras la infección que sigue a la expresión de proteínas E1A, sin embargo, la apoptosis dependiente de p53, que está inducida directamente por E1A, se bloquea por la expresión de las proteínas E1B 55kDa y 19kDa. Después de la expresión de las proteínas E4orf4 y E4orf6, las células infectadas que morirían por apoptosis independiente de p53 no lo harían por el producto de E1B-19kDa que bloquea la muerte celular hasta momentos posteriores en la infección. La muerte celular puede ocurrir finalmente porque los niveles de E4orf4 o E4orf6 se vuelven demasiado elevados para la supresión por E1B-19K.

Las proteínas E4orf4 y E4orf6 son de utilidad para matar células que se acumulan en varios estados de la enfermedad, incluyendo algunas enfermedades autoinmunes y cáncer. Tales células no mueren por apoptosis y, al menos en muchos cánceres, una razón es porque muchas células cancerosas carecen o expresan una forma mutante de p53. Sin embargo, estas células serían susceptibles de morir por las proteínas E4orf4 y E4orf6.

Se sabe que E4orf6 forma complejos con E1B-55K. Estos complejos regulan el transporte tardío y la estabilidad de los ARNm virales, y participan en el corte tardío del metabolismo de la célula hospedadora. Hemos descubierto que E4orf6 y E1B-55K bloquean la acumulación de p53, y que las tres proteínas interactúan directamente. Se ha descubierto que E4orf4 está unida y activa a la proteína fosfatasa 2A (PP2A), lo cual tiene como resultado un descenso de la fosforilación de E1A-289R y de algunos factores de transcripción (Muller, U. et al., 1992, J. Virol, 66: 5867-5878; Bondesson, M. et al., 1996, J. Virol. 70: 3844-3851). También hemos descubierto que el descenso de la fosforilación de E1A probablemente es el resultado de la inactivación por PP2A de la quinasa MAP que actúa en los sitos de CR3 requeridos para la transactivación eficaz de E4.

La presente invención permite la utilización de las proteínas de muerte del adenovirus E4orf4 y E4orf6 como agentes terapéuticos con la capacidad para inducir apoptosis en células tumorales para el tratamiento de cánceres humanos, incluyendo tumores p53 nulos, ya que estas proteínas son capaces de matar a las células tumorales esté presente o no p53. Además, como las células normales carecen de señales de crecimiento inadecuado tales como las suministradas por E1A u oncogenes celulares activados, estas proteínas de muerte E4 tienen poco efecto en tejidos normales.

VIII. Ensayos adicionales de muerte celular

Los especialistas en la técnica deben entender que pueden utilizarse ensayos de muerte celular además de los ensayos ya descritos en la presente invención para la identificación de regiones de E4orf4 y E4orf6 importantes para la muerte celular, así como para la identificación de otras proteínas virales de muerte y reactivos. Pueden desarrollarse ensayos adicionales de muerte en los que pueden medirse los efectos de las proteínas virales individuales en la población celular completa. Tales ensayos son especialmente críticos para determinar la selectividad de muerte de estos agentes. Los nuevos ensayos de muerte permiten un análisis valioso del potencial de muerte de las proteínas de muerte E4, de fragmentos de éstas y de otras proteínas de muerte viral, y pueden incluir: ensayos de infección viral que utilizan dobles mutantes E4/E1B de Ad5, ensayos de formación de colonias que usan selección de fármacos, ensayos de muerte celular usando vectores de adenovirus que expresan E4orf4 y E4orf6, ensayos de muerte celular usando vectores retrovirales que expresan E4orf4 y E4orf6, y la generación de líneas celulares que expresan E4orf4 y E4orf6 bajo un promotor inducible (por ejemplo, tetraciclina).

Mutantes dobles E4/E1B

Pueden introducirse mutaciones de E4 en el mutante pm1716/2072, que es defectuoso para la producción de la proteína E1B-19K (McLorie, W. et al., supra). Tales mutantes son defectuosos para la protección contra la apoptosis independiente de p53, pero la ausencia de 19K solo no afecta demasiado a los rendimientos virales. Además, la existencia de E1B-55K aumenta la eficacia de la replicación viral y protege contra la apoptosis dependiente de p53 inducida por E1A. De este modo, tales mutantes de E4 pueden crecer de forma eficaz en células W163, una línea celular de mono que expresa la región E4 entera (Bridge, E. et al., supra). Se generan mutantes virales por escisión con la endonucleasa de restricción BamH1 de pm1716/2072 y con la serie de mutantes E4, que genera fragmentos de ADN de aproximadamente 14 y 21 kDa. La mezcla y la posterior unión de estos fragmentos producirá virus recombinantes que son defectuosos en E1B-19K y en E4. Después, tales virus pueden usarse en los ensayos de muerte celular rápida descritos en la presente invención para confirmar la eficacia de muerte de los diversos productos E4 y para relacionarla con los resultados obtenidos en los ensayos de infección/muerte a largo plazo. Con esta estrategia puede valorarse rápidamente la muerte de la población celular completa.

Ensayos de formación de colonias

Una segunda estrategia es la determinación de la capacidad de las proteínas de muerte E4 para prevenir la formación de colonias celulares. Si las proteínas E4 inducen de forma eficaz la muerte celular, la formación de colonias debería reducirse, ya que se mata a las células. De ese modo, se hicieron construcciones de ADN en las que E4orf4 y E4orf6 se introdujeron en un plásmido de expresión (por ejemplo, pCDNA3.1) que llevaba un marcador de selección de fármacos (por ejemplo, neo), como se ha descrito en la presente invención. Después de la transfección, se contará el número de colonias formadas en presencia de G418. Con este sistema, las proteínas E4 pueden evaluarse en ausencia de otros productos virales y el proceso de muerte depende de la inhibición del crecimiento celular.

Vectores de adenovirus

Las proteínas E4orf4 y E4orf6 pueden introducirse en un vector para terapia génica de adenovirus, tal como Ad5dl70-8 (Bacchetti, S. et al., 1993; Inter. J. Oncol. 3: 781-788). Hemos generado varios vectores como estos usando métodos de clonación sencillos. También se prevé el uso de vectores de adenovirus en los que las proteínas de muerte E4 se expresan a través de un promotor inducible tal como la tetraciclina. Tales vectores se podrían producir usando técnicas de recombinación de ADN convencionales. Con esta estrategia, todas las células de una población pueden inducirse para expresar las proteínas de muerte E4.

Vectores retrovirales

Una estrategia preferida es introducir las proteínas de muerte E4 en el vector retroviral de ratón pBABE (Morgenstern y Lan, 1990, Nucl. Acid. Res. 18: 3587- 3596) que expresará altos niveles a partir de la LTR viral. Tales vectores también contienen marcadores de selección de fármacos que son útiles para estudios adicionales. Los ADNc de las proteínas de muerte E4 se clonaron en pBABE y los virus se prepararon en células que contenían el receptor del virus de ratón. Después, el virus se recogió del sobrenadante celular y se usó para infectar células de ratón o líneas humanas que expresaban el receptor del virus. Con esta estrategia, las proteínas de muerte pueden introducirse en todas las células del cultivo, y la expresión del vector se prolonga y podrían detectarse las funciones de muerte que requieren períodos de tiempo prolongados. Además, pueden construirse vectores pBABE en los que la inserción de ADNc está dirigida por un promotor inducible (por ejemplo, tetraciclina) por técnicas de ADN recombinante convencionales. La utilización de tal virus recombinante permite la expresión simultánea del ADN insertado.

Líneas celulares que expresan proteínas de muerte E4

Se han establecido varias líneas celulares humanas o de roedores que expresan las proteínas de muerte E4 bajo un promotor inducible, concretamente tetraciclina. En un ejemplo, existen los promotores tet que se activan por adición de tetraciclina. Estos promotores pueden amplificarse por PCR e insertarse en los vectores pCDNA que expresan las proteínas E4orf4 y E4orf6 descritas en la presente invención. Estos plásmidos después pueden utilizarse para transfectar las líneas celulares deseadas, seguido de la incubación de las líneas celulares transfectadas en medios de cultivo que contienen G418. Después pueden clonarse las células resistentes a G418 por dilución límite e inducirse los clones individuales por la adición de tetraciclina. Después pueden evaluarse los niveles de expresión de los clones individuales utilizando un antisuero específico para E4orf4 y E4orf6. La ventaja de este sistema de expresión inducible es que todas las células pueden estar expuestas simultáneamente a las proteínas de muerte tras la inducción.

Todos los ensayos de muerte celular descritos anteriormente pueden llevarse a cabo con E4orf4 y E4orf6 solos o en combinación entre sí o con proteínas adicionales, incluyendo otros productos virales, oncogenes celulares o virales activadores, o supresores de apoptosis.

IX. Selectividad de la muerte celular

Una importante característica de un agente anticancerígeno eficaz es la selectividad de muerte celular. Claramente, existen muchos agentes tóxicos, pero una propiedad clave es la capacidad de matar células cancerosas selectivamente y dejar los tejidos normales relativamente sin afectar. Una estrategia es dirigir selectivamente compuestos tóxicos a las células cancerosas mediante el uso de moléculas inmunológicas o bioquímicas de dirección. Esta estrategia se ha intentado muchas veces con un éxito limitado (Hall, S.S., 1995, Science 270:915-916). La presente invención describe una estrategia en la que se usa un agente que es biológicamente activo sólo en células cancerosas (por ejemplo, E4orf4 o E4orf6, o una combinación de éstos) para inducir selectivamente la muerte en las células cancerosas. Las proteínas E4orf4 y E4orf6 sólo matan células que expresan una señal de crecimiento inadecuada, tal como la proporcionada en células cancerosas por oncogenes activados o quizás por supresores tumorales inactivados. De ese modo, la introducción de las proteínas de muerte E4 en células normales tiene poco efecto, mientras que en células cancerosas, que poseen señales para un crecimiento celular no regulado, estas proteínas son letales.

Hemos demostrado en la presente invención que las proteínas de muerte E4 (E4orf4 y E4orf6) son selectivas. Las células infectadas con un mutante Ad5 que expresa un producto E1A defectuoso carente de la capacidad para unirse a p300/CBP y, de ese modo, incapaz de proporcionar una señal de síntesis de ADN y de crecimiento celular no regulados, no se destruyen por las proteínas de muerte E4. Este resultado permitió llegar a la conclusión de que las células deben recibir una señal de síntesis de ADN y crecimiento celular no regulados para ser receptivas a la muerte por E4. Otros dos tipos de experimentos apoyaron esta conclusión. En los ensayos de cotransfección de luciferasa, como se describe en la presente invención, mientras que varias líneas celulares humanas y de mono que muestran propiedades "normales" de crecimiento parecían relativamente no estar afectadas por la transfección con ADNc que expresaban E4orf4 y E4orf6 y mostraban altos niveles de actividad luciferasa, las células humanas tumorigénicas 293 transformadas con Ad5 expresaban una actividad luciferasa disminuida cuando se cotransfectaban con E4orf4 y con E4orf6. Como era el caso de las figs. 13B y 14, el potencial de muerte en estos ensayos fue otra vez significativamente mayor con E4orf4 que con E4orf6.

Asimismo, se llevaron a cabo ensayos de inhibición de colonias en los que las células se cotransfectaron con ADNc que expresaban una de las proteínas de muerte E4 o un control, así como una segunda construcción que codificaba los marcadores seleccionables de fármacos neo o puromicina. En células humanas 293, en células humanas Saos-2 derivadas de osteosarcoma y en células 1A.A6 de ratón transformadas con E1A, la cotransfección con el ADNc de E4orf4 reducía la formación de colonias en aproximadamente un 80% en relación con un vector de control carente de la secuencia codificante de E4orf4. La reducción fue menor con E4orf6: aproximadamente un 30% en el caso de las células Saos-2. Estos experimentos de estrategia de inhibición de las colonias demostraron además que las células transformadas eran más susceptibles de muerte inducida por E4orf4 o E4orf6 que las células no transformadas.

X. Establecimiento de la especificidad de muerte por células cancerosas

Usando los ensayos de muerte y las construcciones descritas en la presente invención, hemos podido ensayar la especificidad de muerte de las proteínas de muerte E4orf4 y E4orf6 y determinar el grado de muerte celular en células cancerosas normales y transformadas. En el caso de células de roedor, entre las células normales pueden incluirse las células epiteliales primarias de riñón de ratas normales o de ratones normales o p53 nulos. También pueden ensayarse varias células de roedor transformadas o derivadas de tumor. En el caso de los experimentos con adenovirus o retrovirus, los estudios se realizan en células de roedor inhibidas por densidad o sin suero para establecer si la tasa de crecimiento celular afecta a la muerte. En el caso de células humanas, se pueden realizar estudios similares en varias líneas celulares humanas "normales", incluyendo MRC5, IMR90, WI38 y en varias células transformadas o derivadas de tumores, especialmente aquellas en las que se ha caracterizado la expresión de p53. El número de tales líneas puede extenderse estimando la expresión de p53, por ejemplo, por técnicas de análisis de transferencia de Western usando anticuerpos específicos para p53 disponibles en el mercado (por ejemplo, en Santa Cruz Biotechnology, Inc.), incluyendo una amplia diversidad de tumores humanos para establecer el intervalo de tipos de cánceres que pueden destruirse por las proteínas de muerte E4. Estas diversas líneas celulares están disponibles en el mercado en la ATCC (Rockville, Maryland). Estos estudios proporcionan una información clara sobre la especificidad de muerte de las células neoplásicas.

Una variación particularmente importante de estos experimentos es coexpresar en las células normales varios oncogenes humanos activadas en paralelo con las proteínas de muerte E4. Tales estudios ensayan directamente el grado de mejora de la muerte celular en presencia de los productos del oncogén que alteran el crecimiento.

XI. Identificación del dominio mínimo de muerte de las proteínas de muerte E4

Para matar de forma selectiva las células cancerosas, es deseable localizar los dominios mínimos de muerte de las proteínas E4orf4 y E4orf6. Los dominios mínimos de muerte probablemente están localizados en los sitios activos conocidos de estas proteínas, aunque puede haber, hasta ahora, funciones desconocidas para estas proteínas. Se generaron fragmentos peptídicos que incluían dominios con o sin función conocida de las proteínas E4orf4 y E4orf6 y se evaluaron sus capacidades parar matar a las células.

La única función conocida de E4orf4 es unir y activar PP2A (Kleinberger y Shenk, 1993, J. Virol. 67: 7556-7560). Tal activación puede tener como resultado la desfosforilación de componentes de la ruta de muerte celular, lo que tiene como resultado la inducción de apoptosis. También se sabe que E4orf6 forma complejos con al menos dos proteínas, p53 y E1B-55K, y lleva a cabo varias funciones diferentes implicadas en el ciclo infeccioso viral (Sarnow, P. et al., 1984; J. of Virol. 49: 692-700; Dobner, T. et al., 1996, Science 272: 1470-1473).

Se construye una serie de mutantes para localizar las regiones dentro de E4orf4 y E4orf6 que son responsables de la inducción de apoptosis independiente de p53. Se generan mutantes de deleción que eliminan tramos crecientes de los extremos N- y C-terminales de estas proteínas. Además, se crean deleciones en fase de regiones hidrófilas internas seleccionadas y se generan mutantes puntuales en restos conservado críticos. Los métodos para la generación de tales mutantes son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, F. et al., supra). Por ejemplo, puede generarse un mutante de deleción eliminando el extremo N-terminal de las proteínas E4orf4 por amplificación por PCR del ADNc de E4orf4 que contiene el vector pCDNA3.2 descrito en la presente invención con los cebadores correspondientes a la porción C-terminal deseada de la proteína. Preferiblemente, los cebadores de PCR incluyen secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción en sus extremos 5' que facilitan la inserción del producto de PCR en un vector de expresión para clonación (por ejemplo, pCDNA3.1). El plásmido resultante entonces puede someterse a análisis de secuencia de ADN. La expresión puede evaluarse por transfección del plásmido que codifica el fragmento en una línea celular eucariótica (por ejemplo, células COS) seguido de la detección del fragmento deseado por análisis de transferencia de Western de los lisados de las células transfectadas con anticuerpos anti- E4orf4.

La introducción de mutantes en, por ejemplo, vectores retrovirales pBABE o la aplicación de ensayos de luciferasa convencionales permite una rápida determinación del potencial de destrucción de los fragmentos en las células, tal como se ha descrito en la presente invención, que se sabe que mueren fácilmente por estas proteínas. Una vez identificadas las regiones, se mapean en detalle a través de la generación de deleciones en fase o mutaciones puntuales más específicas. Además, en el mercado están disponibles varios kits de mutación de ADN, tal como el Kit de Clontech Transformer^{TM} de mutagénesis de localización dirigida. La identificación de tales dominios de muerte también proporciona importante información sobre los mecanismos de muerte, ya que se pueden comparar las secuencias de unión a PP2A, en el caso de E4orf4, o una de las varias actividades biológicas conocidas de E4orf6.

Otros fragmentos y sus mutantes preferidos son aquellos que incluyen la substitución de aminoácidos conservativos. Entre los fragmentos preferidos se incluyen fragmentos, o sus mutantes, que incrementan la actividad biológica (es decir, actividad de muerte celular) o la estabilidad (es decir, vida media) de las proteínas de muerte E4.

XII. Generación de anticuerpos anti-E4orf4 y anti-E4orf6

Una vez introducidos en una célula, es conveniente la determinación de la expresión de E4orf4 o E4orf6 o sus fragmentos o mutantes. Un método de determinación de la expresión es el uso de anticuerpos específicos para estas proteínas. Se han generado antisueros de alta titulación dirigidos contra los extremos N- y C-terminales de E4orf6, y también se han producido sueros similares dirigidos contra los extremos N- y C-terminales de E4orf4. Estos antisueros se producen usando productos de fusión y péptidos sintéticos correspondientes a las proteínas de muerte E4orf4 y E4orf6 como antígenos inmunizadores de acuerdo con los protocolos convencionales (véase, por ejemplo, Ausubel, F. et al., supra). La especificidad y la titulación de los antisueros puede evaluarse por técnicas de biología molecular convencionales tales como análisis de transferencia de Western, inmunoprecipitación y ELISA.

XIII. Identificación y generación de miméticos peptídicos que corresponden con los dominios de muerte de E4orf4 y E4orf6

Un método eficaz para tratar pacientes con cáncer con las funciones de las proteínas de muerte E4 es generar miméticos, que posean los efectos de muerte de las proteínas E4orf4 y E4orf6. No parece que el mecanismo de toxicidad de ninguna proteína contenga actividad enzimática, y funcionan a través de la formación de complejos con proteínas celulares.

Una vez que se han mapeado los dominios de muerte, se pueden obtener péptidos sintéticos correspondientes a estas regiones a partir de fuentes disponibles en el mercado (tales como Sheldon Biotechnology Centre, McGill University, Montreal, Que., Canada), y se puede ensayar la toxicidad en los ensayos de muerte celular descritos en la presente invención. Las células en cultivo pueden absorber directamente tales péptidos o pueden administrarse a las células por varios métodos, incluyendo vesículas lipídicas o electroporación. Además, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican estos péptidos pueden subclonarse en el sitio de clonación de un vector de expresión de clonación (por ejemplo, pCDNA3.1) y el ADN plasmídico puede introducirse en la célula de interés por diversos métodos de transfección conocidos en la técnica (por ejemplo, electroporación, DEAE-dextrano, fosfato cálccico). El ADN que codifica lo péptidos correspondientes a los dominios de muerte de E4orf4 y E4orf6 también pueden incorporarse en secuencias codificantes de proteínas de fusión y el mimético administrarse por transfección de los vectores de expresión que codifican las proteínas de fusión o vectores virales que codifican las proteínas de fusión.

Se entenderá que los miméticos peptídicos de E4orf4 y E4orf6, o el ADN que codifica estos péptidos, pueden usarse conjuntamente. Por ejemplo, pueden introducirse dos o más péptidos de E4orf4 diferentes que corresponden a regiones diferentes del dominio de muerte de E4orf4 en la misma población de células. El péptido o péptidos miméticos de E4orf4 también pueden introducirse con uno o más miméticos peptídicos que se corresponde con el dominio de muerte de E4orf6 en la misma población de células.

Los péptidos, o combinaciones de los mismos, pueden seleccionarse según la eficacia y los requisitos de dosis eficaces usando los diversos ensayos de muerte descritos en la presente invención. Por ejemplo, pueden introducirse varias concentraciones de péptidos con el plásmido de expresión de la luciferasa (pRSV-luciferasa) descrito en la presente invención en las células 1A.A3. Cuarenta y ocho horas después de la introducción, las células se lisan y se evalúa la actividad luciferasa usando el kit de ensayo de luciferasa de Promega (Catálogo Nº E1500). Un péptido que mata a la célula inducirá la muerte celular (es decir, una actividad luciferasa reducida) en las células 1A.A3 en comparación con las células 1A.A3 transfectadas con un control que no induce muerte (por ejemplo, crmA).

El ADN que codifica los miméticos peptídicos potenciales de las proteínas de muerte E4 también puede identificarse por hibridación con el ADN de las secuencias de nucleótidos que codifican E4orf6 (SEC ID Nº: 1) y E4orf4 (SEC ID Nº: 3), proporcionadas en las figs. 15 y 16, respectivamente. En un ejemplo particular de esta estrategia, los ADN pueden identificarse por la capacidad de hibridar con las secuencias de nucleótidos de adenovirus en condiciones de alta rigurosidad. Las condiciones de alta rigurosidad pueden incluir hibridación a aproximadamente 40ºC en aproximadamente SSCx2 y SDS al 1%, seguido de un primer lavado a aproximadamente 65ºC en aproximadamente SSCx2 y SDS al 1%, y un segundo lavado a aproximadamente 65ºC en aproximadamente SSCx1. En la técnica se describen otras condiciones de hibridación de alta y baja rigurosidad (véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed), CSH Press, 1989, o Ausubel, F. et al., supra).

Una vez identificado, puede usarse un ADN que hibrida con las secuencias de nucleótidos que codifican E4orf4 o E4orf6 para generar un producto polipeptídico por técnicas convencionales. Por ejemplo, el ADN puede subclonarse en pCDNA3.1 y el plásmido resultante utilizarse para transfectar, por ejemplo, células COS (disponibles en el mercado en la ATCC), para producir un polipéptido recombinante. Después, este producto polipeptídico puede seleccionarse por su actividad biológica E4orf4 o E4orf6 usando los diversos ensayos de muerte celular descritos en la presente invención.

XIV. Producción de miméticos no peptídicos

La identificación de secuencias destructoras peptídicas mínimas permite la generación de miméticos no peptídicos. Las técnicas para la generación de tales miméticos no peptídicos de los dominios de destrucción de E4orf4 y E4orf6 son técnicas químicas convencionales y bien conocidas por los especialistas en la técnica de la química combinatoria. Las eficacias de estos miméticos no eptídicos puede ensayarse de forma similar a los péptidos miméticos de los dominios de destrucción de E4orf4 y E4orf6.

XV. Selección de reactivos adicionales que mimetizan proteínas de muerte E4

Se entiende que diferentes compuestos pueden tener el mismo mecanismo de acción sin una similitud concomitante en tamaño y/o estructura. Por consiguiente, aunque los miméticos peptídicos y no peptídicos basados en los dominios de destrucción de E4orf4 y E4orf6 probablemente inducen una apoptosis similar a la de las proteínas de muerte E4 en células transformadas, ciertos reactivos no miméticos también pueden tener esta capacidad. Utilizando los ensayos de muerte celular descritos en la presente invención, se pueden identificar tales reactivos.

En una estrategia, pueden generarse células 1A.A3 que expresen de forma estable una proteína detectable (por ejemplo, la proteína fluorescente verde (GFP)) por transfección de células 1A.A3 con pCDNA3.1 (Invitrogen) que codifica GFP y, después, pueden cultivarse las células transfectadas en presencia de G418. Estas células 1A.A3 que expresan GFP después pueden ponerse en contacto con un reactivo o combinación de los mismos para ensayar la capacidad de inducir una muerte celular por proteínas de muerte E4. Tras el contacto, las células puede analizarse por citometría de flujo para detectar las células vivas que expresan GFP. Un compuesto o reactivo que induce una apoptosis similar a E4orf4 o E4orf6 reducirá el número de células vivas que expresan GFP en comparación con una célula no puesta en contacto. Las células vivas puede diferenciare de las muertas por el tamaño (es decir, perfiles de dispersión lateral y dispersión frontal en un citómetro de flujo), o por tinción con yoduro de propidio.

En otra selección basada en citometría de flujo, las células que se ponen en contacto con el reactivo y las que no se ponen en contacto puede teñirse con Anexina V junto con FITC (Endogen), seguido de análisis por citometría de flujo. Este tipo de ensayos de apoptosis se basa en la presencia de fosfatidilserina en la capa interior de la membrana celular. Mientras que una célula sana no lleva fosfatidilserina en su membrana celular, una célula en proceso de apoptosis lo hace como parte del proceso apoptótico. La anexina V se une con alta afinidad a los restos de fosfatidilserina, y la unión de anexina V con FITC permite la detección de células apoptóticas por citometría de flujo.

Debe entenderse que los análisis de muerte celular no necesitan ser por citometría de flujo. Por ejemplo, puede usarse la fragmentación de ADN como método para detectar células apoptóticas.

En una realización preferida, las selecciones de reactivos que inducen una muerte celular semejante a la de la proteína de muerte E4 son rápidas y de alto rendimiento. Por ejemplo, pueden cultivarse células 1A.A3 que expresan GFP en una placa de múltiples pocillos (es decir, una placa de microtitulación de 96 pocillos). Tras la puesta en contacto con los reactivos que se están seleccionando por su capacidad para inducir una muerte celular similar a la de las proteínas de muerte E4, donde un reactivo diferente o combinación de ellos se añade por pocillo de células, la placa pueden someterse a análisis de la presencia de GFP en un lector de placas de 96 pocillos. Un pocillo con expresión de GFP reducida en comparación con un pocillo de control no tratado indica un compuesto con capacidad para inducir muerte celular similar a la de las proteínas de muerte E4.

XVI. Reactivos inductores de apoptosis que activan la proteína fosfatasa 2A (PP2A)

Dada la función bien caracterizada de E4orf4 en la unión y activación de PP2A (Kleinberger y Shenk, 1993, J. Virol. 67: 7556-7560), los reactivos que activan PP2A son útiles para inducir muerte celular en células transformadas. Los reactivos que activan PP2A se identifican fácilmente usando reactivos disponibles en el mercado. En una estrategia, células, por ejemplo, células humanas Saos-2, se ponen en contacto con reactivos que se están seleccionando por la capacidad de activar PP2A. Tras la puesta en contacto, las células se lisan, y la PP2A se inmunoprecipita con anticuerpos anti-PP2A humana disponibles en el mercado (por ejemplo, en Upstate Biotechnology, Inc.). Después, los inmunoprecipitados pueden someterse a cualquiera de varios ensayos de fosfatos convencionales conocidos en la técnica. Un incremento de la actividad de PP2A en comparación con PP2A aislada de células no tratadas indica un compuesto que activa PP2A y es que capaz de inducir muerte celular similar a E4orf4. Estos compuestos pueden someterse a una selección secundaria por ensayo de muerte celular, como se describe en la presente invención.

XVII. Identificación de otras proteínas de muerte viral

Además de las proteínas de muerte de Ad5, E4orf4 y E4orf6, ciertas proteínas de otros virus también pueden inducir apoptosis. De este modo, también puede probarse que tales proteínas tienen actividades anticancerígenas eficaces, que pueden ser específicas o de amplio intervalo. Otras proteínas de adenovirus, o proteínas de otros virus, tales como la proteína NS del parvovirus humano B-19, que se sabe que controla la replicación y la muerte celular sólo en células que se dividen rápidamente (Ozawa, K. et al., 1988, J. of Virol. 62: 2884-2889), pueden ensayarse en los ensayos de muerte celular descritos en la presente invención con respecto a la capacidad específica de matar células transformadas.

XVIII. Análisis de las proteínas de muerte E4 de adenovirus humanos adicionales

La presente invención permite el análisis de la toxicidad de las proteínas E4orf4 y E4orf6 de adenovirus seleccionados entre los más de 40 serotipos humanos por los métodos descritos en la presente invención. Diferentes serotipos mantienen un grado de homología de secuencia, pero también poseen diferencias variadas e interesantes que pueden dar como resultado proteínas que potencialmente difieren en potencia o especificidad. Se clonan los correspondientes ADNc de E4 de serotipos de adenovirus adicionales por varias estrategias bien conocidas en la técnica de la biología molecular. Después, se evalúa la capacidad de estas proteínas para inducir muerte celular en líneas celulares transformadas usando los ensayos descritos en la presente invención.

XIX. Proteínas de muerte E4 de adenovirus para tratar el cáncer

La presente invención permite el uso de proteínas de muerte E4 de adenovirus en el tratamiento de cánceres, especialmente de los cánceres que son p53 negativos y que son difíciles de eliminar por las terapias existentes. Esta invención permite el desarrollo de miméticos no peptídicos que pueden usarse como reactivos para tratar cánceres sin el problema de la dirección específica y la complicación de la toxicidad para tejidos normales. La conversión de funciones virales altamente desarrolladas en agentes terapéuticos es novedosa, y tiene un gran potencial para regímenes de tratamiento de esta y de otras enfermedades.

XX. Administración de proteínas de muerte E4 y reactivos de éstas

Una proteína E4orf4 o E4orf6 de adenovirus, ácido nucleico o reactivo mimético puede administrase dentro de un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en una forma de dosificación unitaria. Puede emplearse la práctica farmacéutica convencional para proporcionar formulaciones o composiciones adecuadas para administrar las proteínas E4orf4 y/o E4orf6 o los reactivos que mimetizan E4orf4 o E4orf6 (por ejemplo, miméticos peptídicos o no peptídicos) a pacientes que padecen una enfermedad (por ejemplo, cáncer) causada por reducción de la apoptosis. La administración puede iniciarse antes de que el paciente presente síntomas. Puede emplearse cualquier vía de administración, por ejemplo, la administración puede ser parenteral, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intramuscular, intracraneal, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracapsular, intraespinal, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, aerosol, por supositorios o administración oral. Las formulaciones terapéuticas pueden estar en forma de soluciones o suspensiones líquidas; para administración oral, las formulaciones pueden estar en forma de comprimidos o cápsulas; y para las formulaciones intranasales, en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles.

Pueden encontrarse métodos bien conocidos en la técnica para preparar formulaciones, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (18ª edición), ed. A Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA. Las formulaciones de administración parental pueden contener, por ejemplo, excipientes, agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal o naftalenos hidrogenados. Para controlar la liberación de los componentes, pueden usarse polímeros de lactida biodegradables y biocompatibles, copolímeros de lactida/glicolida o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno. Otros sistemas de distribución parenteral potencialmente útiles para las proteínas de muerte E4orf4 o E4orf6 y los miméticos de éstas incluyen partículas de copolímero de etileno y acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables, y liposomas. Las formulaciones para inhalación pueden contener, por ejemplo, lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polioxietileno-9-lauril éter, glicocolato y desoxicolato, o pueden ser soluciones aceitosas para administración en forma de gotas nasales o como un gel.

Si se desea, el tratamiento con una proteína, gen o reactivo mimético de E4orf4 o E4orf6 puede combinarse con terapias más tradicionales para la enfermedad tales como cirugía, terapia con esteroides o quimioterapia para enfermedades autoinmunes; terapia antiviral para el SIDA; y quimioterapia para el cáncer.

Los requisitos de dosificación para la administración de las proteínas de muerte E4, o los miméticos de éstas, pueden determinarse inicialmente en los ensayos de muerte celular descritos en la presente invención (por ejemplo, en el ensayo de la luciferasa) en células cultivadas. Se entiende que células de diferentes orígenes pueden evaluarse por este método para los requisitos de dosificación. Por ejemplo, puede adquirirse de la ATCC una línea celular de carcinoma humano p53 nula y usarse para determinar la dosificación preferida para tratar a pacientes que padecen cánceres de este origen. Sin embargo, se entiende que se pueden evaluar in vivo en cada individuo otros requisitos de dosificación adicionales para el tratamiento de pacientes y pueden variar basándose en la masa corporal y en el tamaño del tumor.

XXI. Terapias

Pueden diseñarse terapias para inducir apoptosis mediada por proteínas de muerte E4 en células transformadas. Los reactivos de proteínas de muerte E4 que inducen apoptosis pueden incluir, sin limitación, proteínas E4orf4 y E4orf6 de longitud completa, fragmentos polipeptídicos, miméticos peptídicos y no peptídicos, otros análogos, o combinaciones de éstos, ARNm de E4orf4, ARNm de E4orf6, compuestos que aumentan la estabilidad de E4orf4 y/o E4orf6, o cualquier compuesto que incremente la actividad de E4orf4 y/o E4orf6 para inducir apoptosis.

a) Terapia proteica

Para introducir las proteínas E4orf4 y Eorf6 y los fragmentos polipeptídicos de éstas en las células transformadas, es necesario obtener grandes cantidades de polipéptido puro de los sistemas de células cultivadas que pueden expresar el polipéptido. La distribución del polipéptido en los tejidos afectados (por ejemplo, tejidos cancerosos) entonces puede conseguirse usando sistemas de empaquetamiento o administración apropiados. Como alternativa, pueden usarse pequeñas moléculas análogas y administrarse para que actúen como agonistas de la proteína de muerte E4 y de esta forma producir un efecto fisiológico deseado. En la presente invención se proporcionan métodos para encontrar tales análogos.

Otra estrategia terapéutica implica la administración de polipéptidos de la proteína de muerte E4 recombinantes, directamente en el lugar de un suceso de apoptosis deseado (por ejemplo, por inyección) o sistémicamente (por ejemplo, por cualquier técnica convencional de administración de proteínas recombinantes).

b) Terapia génica

La terapia génica es otra estrategia terapéutica potencial en la que copias de ADN que codifican las proteínas de muerte E4 o fragmentos de éstas se introducen en tejidos seleccionados para codificar eficazmente un producto polipeptídico abundante en los tipos celulares afectados (por ejemplo, células cancerosas). El ADN debe distribuirse a estas células de forma que pueda ser captado y codificar suficiente producto polipeptídico como para proporcionar una función eficaz.

Pueden usarse vectores retrovirales de transducción para terapia génica de células somáticas especialmente debido a su alta eficacia de infección y a la integración y expresión estables. El ADN de longitud completa que codifica E4orf4 y/o E4orf6, o porciones de los mismos, puede clonarse en un vector retroviral y dirigirse desde su promotor endógeno o desde la secuencia larga de repetición terminal retroviral o desde un promotor específico para el tipo de célula diana de interés (tal como neuronas). Otros vectores virales que pueden usarse incluyen el virus asociado a adeno, virus vaccinia, papilomavirus bovino, o un virus del herpes tal como el virus de Epstein-Barr.

La transferencia génica también puede conseguirse usando medios no virales que requieren la infección de las células cancerosas in vitro. Éstos podrían incluir fosfato cálcico, DEAE dextrano, electroporación y fusión de protoplastos. Los liposomas también pueden ser potencialmente beneficiosos para la distribución de ADN dentro de una célula. Aunque estos métodos están disponibles, muchos de ellos tienen baja eficacia.

El trasplante de ADN que codifica las proteínas de muerte E4 o fragmentos polipeptídicos de éstas en células afectadas de un paciente también puede ser una terapia útil. En ese procedimiento, el ADN que codifica una o ambas proteínas de muerte E4 se transfiere dentro de un tipo celular cultivable, de formaexógena o endógena al paciente. Después, estas células se inyectan serológicamente dentro del tejido o tejidos diana.

Pueden usarse vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores virales asociados a adenovirus u otros vectores virales con el tropismo apropiado para las células que probablemente están implicadas en enfermedades que implican una apoptosis insuficiente, como sistema de distribución de transferencia de genes para una construcción del ADN de la proteína de muerte E4 terapéutica. En general, se conocen numerosos vectores útiles para este propósito (Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244:1275-1281, 1989; Eglitis y Anderson, BioTechniques 6:608-614, 1988; Tolstoshev y Anderson, Curr. Opin. Biotech. 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991; Cornetta et al., Nucl. Acid Res. y Mol. Biol. 36:311-322, 1987; Anderson, Science 226:401- 409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Miller et al., Biotech. 7:980- 990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993; y Johnson, Chest 107:77S-83S, 1995). Los vectores retrovirales se han desarrollado particularmente bien y se han usado en situaciones clínicas (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323:370, 1990; Anderson et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.399.346). Pueden emplearse estrategias no virales. Por ejemplo, las proteínas de muerte E4 pueden introducirse en una célula por lipofección (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7413, 1987; Ono et al., Neurosci. Lett. 117:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Meth. Enz. 101:512, 1983) conjugación asialoorosomucoide-polilisina (Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem. 264:16985, 1989); o, menos preferiblemente, microinyección en condiciones quirúrgicas (Wolff et al., Science 247:1465, 1990).

Para cualquiera de los métodos de aplicación descritos anteriormente, la construcción terapéutica de ADN que codifica la proteína de muerte E4 preferiblemente se aplica en el sitio deseado para el suceso de apoptosis (por ejemplo, por inyección). Sin embargo, también se puede aplicar a tejidos cercanos al del suceso de apoptosis deseado o a los vasos sanguíneos que riegan las células (por ejemplo, células cancerosas) que se desea que experimenten la apoptosis.

En las construcciones descritas, la expresión del ADN puede estar dirigida por cualquier promotor adecuado (por ejemplo, promotores del citomegalovirus humano (CMV), virus de simio 40 (SV40) o de metalotioneína), y regulada por cualquier elemento regulador apropiado de mamíferos. Por ejemplo, si se desea, pueden usarse potenciadores de los que se sabe que preferiblemente dirigen la expresión de genes en células neurales, linfocitos o células musculares para dirigir la expresión de E4orf4, E4orf6 o fragmentos polipeptídicos de éstos. Entre los potenciadores usados pueden incluirse, sin limitación, los que se han caracterizado en su expresión como específicos de tejido o de célula. Como alternativa, la regulación de la expresión puede estar mediada por secuencias reguladoras afines o, si se desea, por secuencias reguladores derivadas de una fuente heteróloga, incluyendo cualquiera de los promotores o elementos reguladores descritos anteriormente.

La terapia génica con la proteína de muerte E4 también puede realizarse por medio de la administración directa del ARNm de E4orf4 o E4orf6 a una célula que se desee que experimente una apoptosis indeseada. El ARNm puede producirse y aislarse por cualquier técnica convencional, pero se produce más fácilmente por transcripción in vitro usando el ADN codificante bajo el control de un promotor de alta eficacia (por ejemplo, el promotor de T7). La administración de ARNm a las células puede llevarse a cabo por cualquiera de los métodos de administración directa de ácido nucleico descritos anteriormente.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Philip E. Branton et al.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas E4 de adenovirus para inducir la muerte celular

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Clark & Elbing LLP

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(B)

CALLE: 176 Federal Street

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(C)

CIUDAD: Boston

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(D)

ESTADO: MA

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(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 02110

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco

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(B)

ORDENADOR: IBM compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: DOS

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(D)

SOFTWARE: FastSEQ para Windows Versión 2.0

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 3 de julio de 1997

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 60/021.273

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 5 de julio de 1996

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 60/028.740

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 22 de octubre de 1996

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(viii)

INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Bieker-Brady, Kristina

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 39.109

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 50013/002WO1

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: 617-428-0200

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(B)

TELEFAX: 617-428-7045

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(C)

TELEX:

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 885 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

1

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 294 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

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2

200

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 345 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

3

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 114 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

4

Claims (31)

1. Un método para aumentar la apoptosis en una célula in vitro, comprendiendo dicho método administrar a dicha célula un polipéptido substancialmente purificado codificado por un ADN capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 y que tiene actividad biológica de E4orf4, donde dicho ADN está ligado operativamente a una secuencia reguladora heteróloga para la expresión de dicho polipéptido.

2. Un método para aumentar la apoptosis en una célula in vitro, comprendiendo dicho método expresar en dicha célula un ADN capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 3 y que tiene actividad biológica de E4orf4, donde dicho ADN está ligado operativamente a una secuencia reguladora heteróloga para la expresión de dicho polipéptido.

3. El método de la reivindicación 2, donde dicha secuencia reguladora es capaz de expresar dicho ADN de una forma constitutiva, inducible o específica del tipo celular.

4. El método de la reivindicación 2, donde dicho ADN está en un vector adenoviral.

5. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde dicha célula es una célula cancerosa.

6. Una composición para uso farmacéutico que comprende (i) un ácido nucleico substancialmente purificado capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia del ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 y que codifica un polipéptido que tiene actividad biológica de E4orf4, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. La composición de la reivindicación 6, donde dicho ácido nucleico está ligado operativamente a una secuencia reguladora heteróloga para la expresión de dicho polipéptido.

8. Una composición para uso farmacéutico que comprende (i) un ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEC ID Nº: 3, o variantes degeneradas de la misma, y que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable, donde dicho ADN está operativamente ligado a una secuencia reguladora heteróloga para la expresión de dicho polipéptido.

9. Una composición para uso farmacéutico que comprende (i) un ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de nucleótidos del 50% o superior con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 y codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de E4orf4, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable, donde dicho ADN está operativamente ligado a una secuencia reguladora heteróloga para la expresión de dicho polipéptido.

10. La composición de la reivindicación 9, donde la identidad de dicha secuencia de nucleótidos es del 75% o superior con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3.

11. La composición de la reivindicación 9, donde la identidad de dicha secuencia de nucleótidos es del 90% o superior con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3.

12. La composición de la reivindicación 7, 8 ó 9, donde dicho ácido nucleico está en un vector adenoviral.

13. La composición de la reivindicación 7, 8 ó 9, donde dicha secuencia reguladora es capaz de expresar dicho ácido nucleico de una forma constitutiva, inducible o específica del tipo celular.

14. La composición de la reivindicación 13, donde dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una substitución de aminoácidos conservativa con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4.

15. Una composición para uso farmacéutico que comprende (i) un polipéptido substancialmente purificado que tiene la actividad biológica de E4orf4 y una identidad de secuencia de aminoácidos de un 20% o superior con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. La composición de la reivindicación 15, donde la identidad de dicha secuencia de aminoácidos es de un 50% o superior con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4.

17. La composición de la reivindicación 16, donde la identidad de dicha secuencia de aminoácidos es de un 75% o superior con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4.

18. La composición de la reivindicación 17, donde la identidad de dicha secuencia de aminoácidos es de un 90% o superior con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4.

19. La composición de la reivindicación 15, donde dicho polipéptido tiene una substitución conservativa de aminoácidos en la secuencia de la SEC ID Nº: 4.

20. El uso de un vector de expresión para la preparación de una composición farmacéutica para inducir apoptosis independiente de p53, donde el vector comprende ADN capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 que codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de E4orf4, y que esta ligado operativamente con una secuencia reguladora heteróloga para la expresión de dicho polipéptido.

21. El uso de la reivindicación 20, donde dicha secuencia reguladora es capaz de expresar dicho ácido nucleico de una forma constitutiva, inducible o específica del tipo celular.

22. El uso de la reivindicación 20, donde dicho vector de expresión es un vector adenoviral.

23. El uso de la reivindicación 20, donde dicho vector de expresión es un vector retroviral.

24. Uso de un polipéptido substancialmente purificado codificado por un ADN capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 y que tiene la actividad biológica de E4orf4, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades humanas que implican una supervivencia celular inapropiada.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24, que además comprende un segundo polipéptido substancialmente purificado, donde dicho segundo polipéptido tiene actividad biológica de E4orf6 y una secuencia de aminoácidos codificada por ADN capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 1.

26. Uso de un ácido nucleico substancialmente purificado capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 y que codifica un polipéptido que tiene actividad biológica de E4orf4, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades humanas que implican una supervivencia celular inapropiada.

27. Uso de un ácido nucleico capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades humana que implican una supervivencia celular inapropiada, codificando dicho ácido nucleico un polipéptido que tiene la actividad biológica de E4orf4, y estando ligado operativamente a una secuencia reguladora heteróloga para la expresión de dicho polipéptido.

28. Uso de un vector de expresión que comprende ADN capaz de hibridar con alta rigurosidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades humanas que implican una supervivencia celular inapropiada, codificando dicho ácido nucleico un polipéptido que tiene la actividad biológica de E4orf4, y estando ligado operativamente a una secuencia reguladora heteróloga para la expresión de dicho polipéptido.

29. El uso de acuerdo con la reivindicación 28, donde dicha secuencia reguladora heteróloga es capaz de expresar dicho ácido nucleico de una forma constitutiva, inducible o específica del tipo celular.

30. El uso de acuerdo con la reivindicación 28, donde dicho vector de expresión es un vector adenoviral.

31. El uso de acuerdo con la reivindicación 28, donde dicho vector de expresión es un vector retroviral.